Đề tài Tổng quan về collagen

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN Giới thiệu sơ lược về Collagen Collagen là loại protein cấu trúc chính yếu, chiếm khoảng 30% tổng lượng protein trong cơ thể ở các động vật có xương sống. Collagen có nhiều trong gân, da, xương, hệ thống mạch máu của động vật và có mặt trong các lớp màng liên kết bao quanh các cơ. Khoảng 10% protein trong cơ ở động vật có vú là collagen; các protein ngoại bào (hơn 90% trong gân, xương và khoảng 50% trong da) có chứa collagen [1]. Nó có tác dụng giống như một chất keo liên kết các tế bào lại với nhau để hình thành các mô và cơ quan nền tảng trong cơ thể. Collagen cung cấp cho các mô liên kết những đặc tính nổi trội nhờ vào sự hiện diện rộng khắp và sự sắp xếp mang tính cấu trúc của nó. Nó phân bố khắp nơi trong cơ thể, từ chỗ gân nối bắp chân với gót chân cho tới giác mạc [1]. Trong gân và dây chằng, collagen có tác dụng truyền lực từ cơ sang xương và tích trữ năng lượng đàn hồi. Sự di chuyển nhịp nhàng, uyển chuyển sẽ không thể thực hiện được nếu thiếu những tính chất này. Collagen còn là chất nền hữu cơ có trong xương và men răng giúp chúng chống lại sự rạn nứt. Nó là thành phần chính trong da, mạch máu, các cơ. Collagen không chỉ có chức năng cơ học, chẳng hạn như ở giác mạc, trật tự cấu trúc của các sợi collagen tạo nên sự trong suốt [2]. Collagen được xem như một vật liệu mang tính xây dựng. Sự linh hoạt của nó là nhờ vào cấu trúc cấp bậc phức tạp, tạo nên sự đa dạng trong tính chất nhằm phục vụ những chức năng nhất định. Cấu trúc của collagen Cấu trúc phân tử của collagen [1] Phân tử collagen (hay còn gọi là tropocollagen) là một protein hình trụ, dài khoảng 300 nm, đường kính khoảng 1,5 nm. 1.5 nm 300 nm Hình 1.1 Cấu trúc của phân tử collagen (triple helix) Nó bao gồm 3 chuỗi polypeptide (gọi là chuỗi a) cuộn lại với nhau. Mỗi chuỗi a cuộn thành đường xoắn ốc theo hướng từ phải sang trái với 3 gốc trên một vòng xoắn. Ba chuỗi này xoắn lại với nhau theo hướng từ trái sang phải tạo thành đường bộ ba xoắn ốc (triple helix). Hình 1.2 Sự hình thành chuỗi xoắn ốc nội phân tử và giữa các chuỗi polypeptide Mỗi chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử khoảng 100 kDa, tạo nên tổng khối lượng phân tử của collagen khoảng 300 kDa. Chuỗi a được cấu tạo bởi khoảng 1000 amino acid. Các chuỗi a khác nhau (a1, a2 và a3) ở thành phần amino acid. Sự phân bố của các chuỗi a1, a2 và a3 trong các phân tử collagen khác nhau tùy thuộc vào sự khác nhau về gene. Collagen không có chứa tryptophan, giàu thành phần glycine, proline và hydroxyproline, là một trong số ít những protein có chứa hydroxylysine. Nó chứa khoảng 33% glycine, 12% proline và 11% hydroxyproline. Các amino acid sắp xếp trong chuỗi xoắn ốc theo các dãy với sự phân bố như sau: Bảng 1.1 Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide Triplet Tỉ lệ Gly – X – X Gly – X – I Gly – I – X Gly – I – I 0,44 0,2 0,27 0,09 Trong đó, I là imino acid (proline và hydroxyproline), X là các amino acid khác. Glycine chiếm gần 1/3 trong tổng số các amino acid và nó được phân bố một cách đều đặn tại vị trí mỗi 1/3 xuyên suốt trong phân tử collagen. Do glycine có các nhánh phụ nhỏ nhất nên sự lặp lại của nó cho phép các chuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với nhau hình thành nên một đường xoắn ốc với khoảng trống nhỏ ở phần lõi. Ngoài ra, trong phân tử collagen có những vùng gồm khoảng 9 ¸ 26 amino acid tại các điểm đầu mút amino hay carboxyl của chuỗi. Các vùng này không sáp nhập với cấu trúc xoắn ốc và được gọi là telopeptide. Hình 1.3 Cấu trúc của procollagen và sự chuyển từ procollagen sang tropocollagen Cấu trúc sợi của collagen [3] Hình 1.3 Cấu trúc của procollagen và sự chuyển từ procollagen sang tropocollagen Phần lớn collagen trong mạng lưới ngoại bào được tìm thấy ở dạng sợi, bao gồm những sợi mảnh, nhỏ. Thông qua quá trình tạo sợi, các phân tử collagen tổ hợp với nhau hình thành nên các vi sợi (microfibril) bao gồm từ 4 ¸ 8 phân tử collagen hoặc với số lượng nhiều hơn sẽ tạo thành các sợi (fibril). Những sợi này có đường kính từ 10 ¸ 500 nm tùy thuộc vào loại mô và giai đoạn phát triển. Các sợi collagen sẽ thiết lập nên các sợi lớn hơn (fiber) và cao hơn nữa là các bó sợi (fiber bundle). Chuỗi polypeptide Phân tử collagen Vi sợi Sợi Bó sợi Hình 1.4 Cấu trúc sợi của collagen Phân tử collagen, dài 300 nm, đường kính vòng xoắn 1,5 nm Chuỗi polypeptide Tổ hợp thành vi sợi Tổ hợp thành sợi Tổ hợp thành bó sợi Hình 1.5 Quá trình tổ hợp tạo sợi của các phân tử collagen Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc tạo thành các sợi với tính chu kỳ nhất định. Chúng được sắp xếp so le nhau một khoảng 67 nm và có một khoảng trống khoảng 40 nm giữa những phân tử liền kề nhau. Hình 1.6 Sự sắp xếp của phân tử collagen trong một sợi Nhờ vào cấu trúc có thứ bậc, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được chuyển sang các sợi collagen, cung cấp cho các mô độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ học riêng biệt. Có vài liên kết bên trong mỗi chuỗi triple helix và một số lượng biến thiên các liên kết ngang giữa các chuỗi để hình thành nên những tổ hợp có trật tự (như sợi collagen). Các bó sợi lớn hơn được tạo nên nhờ vào sự trợ giúp của một vài loại protein (bao gồm những loại collagen khác nhau), glycoprotein và proteolycan để hình thành các loại mô khác nhau từ sự sắp xếp luân phiên của những thành phần trên. Sự không hòa tan của collagen là một trở ngại cho việc nghiên cứu nó cho tới khi người ta phát hiện tropocollagen có thể được trích ly từ những động vật còn non do chưa xảy ra liên kết ngang hoàn toàn. Tuy nhiên, sự phát triển của kỹ thuật hiển vi (Electron Microscopy (EM) và Atomic Force Microscopy (AFM)) và sự nhiễu xạ tia X đã cho phép các nhà nghiên cứu thu được những hình ảnh chi tiết về cấu trúc của collagen. Những tiến bộ này có ý nghĩa quan trọng trong việc hiểu được cách thức mà collagen tác động lên mạng lưới tế bào; sự xây dựng, phát triển, phục hồi, thay đổi của mô trong quá trình phát triển. a b Hình 1.7 Hình ảnh của bó sợi (a) và sợi (b) collagen Sợi collagen là các tổ hợp có cấu trúc bán kết tinh của các phân tử collagen. Các vi sợi kết hợp tạo nên sợi lớn hơn. Các sợi collagen được sắp xếp với những cách thức kết hợp và mức độ tập trung khác nhau trong các mô khác nhau để cung cấp các đặc tính khác nhau của mô. Phân loại collagen Tính đến thời điểm hiện tại, có 42 loại chuỗi polypeptide được nhận dạng. Chúng được mã hóa bởi 41 loại gene khác nhau, tạo thành 27 loại collagen. Họ collagen được phân loại thành những phân họ khác nhau dựa vào sự tổ hợp của các siêu phân tử [4]. Sự phân bố trong các mô của những loại protein khác nhau thể hiện tính đa dạng và phạm vi đáng chú ý, từ những loại collagen riêng biệt như collagen II, X có trong sụn đến những loại collagen dạng sợi phân bố rộng khắp như collagen I và V. Những loại collagen khác nhau thực hiện những chức năng chuyên dụng trong các mô và có phương thức sắp xếp riêng biệt của các siêu phân tử. Một số loại được cấu tạo từ một tam phân (homotrimer), trong khi đó những loại khác được cấu tạo từ nhiều tam phân. Loại collagen phong phú nhất là những collagen dạng sợi hình thành những nền tảng cấu trúc của da, gân, xương, sụn và những loại mô khác. Hình 1.8 Một vài dạng sinh học của collagen Hiện tại, có ít nhất khoảng 13 loại collagen đã được trích chiết. Chúng khác nhau về chiều dài của chuỗi xoắn ốc cũng như bản chất và kích cỡ của những phần không xoắn ốc [1]. Bảng 1.2 Kết cấu chuỗi và sự phân bố của các loại collagen trong cơ thể người [1] Loại collagen Kết cấu chuỗi Phân bố I (a1(I))2a2(I), trimer (a1(I))3 Da, gân, xương, giác mạc, men răng, sụn, mạch máu II (a1(II))3 III (a1(III))3 Mạch máu, van tim, hạ bì, ruột, nướu răng, thành tử cung IV (a1(IV))2a2(IV) Màng nhầy V a1(V) a2(V) a3(V) hoặc (a1(V))2a2(V) hoặc (a1(V))3 Giác mạc, xương, mạch máu, sụn, nướu răng VI a1(VI) a2(VI) a3(VI) Da, cơ tim VII (a1(VII))3 Da, phổi, sụn, giác mạc, nhau VIII Chưa biết Tạo ra từ tế bào màng trong IX a1(IX) a2(IX) a3(IX) Sụn X (a1(X))3 Sụn XI a1(XI) a2(XI) a3(XI) Sụn, đĩa đệm cột sống, dịch thủy tinh XII (a1(XII))3 Gân, dây chằng XIII Chưa biết Da, xương Hơn 90% collagen trong cơ thể là các collagen loại I, II, III và IV. Những bệnh tật liên quan đến collagen là do sự khuyết tật về gene ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp, sự sắp xếp cũng như các quá trình khác trong sự sản sinh collagen một cách bình thường. Ứng dụng của collagen Ứng dụng trong công nghiệp Nếu collagen bị thủy phân thì các chuỗi polypeptide sẽ tách nhau một phần hoặc hoàn toàn, hình thành nên Gelatin. Gelatin được ứng dụng trong thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và nền công nghiệp phim ảnh. Các nhà sản xuất các chất bổ sung dựa trên nền là collagen cho chế độ ăn kiêng khẳng định rằng sản phẩm của họ có thể cải thiện chất lượng làn da, móng tay và sức khỏe xương khớp. Theo tiếng Hy Lạp, collagen có nghĩa là “người sản xuất keo hồ”, nói đến quá trình nấu da và gân của ngựa cùng những loài động vật khác để thu được hồ. Keo dán collagen đã được người Ai Cập sử dụng cách đây 4000 năm và người Mỹ sử dụng nó cách đây khoảng 1500 năm. Hình 1.9 Keo dán collagen Nó không những được dùng để giữ các dụng cụ trong gia đình mà còn rất hữu dụng trong việc sản xuất các loại nhạc cụ như violin hay guitar; những loại này thường được tháo ra để sửa chữa nên không thích hợp dùng các chất dính lâu bền, trong khi đó collagen khi đun nóng thì có thể được làm mềm một cách dễ dàng. Ứng dụng trong y học Collagen là một vật liệu có khả năng phân hủy sinh học, có tính tương thích sinh học cũng như khả năng cầm máu nên có thể được chế tạo thành những dạng khác nhau, là một loại vật liệu sinh học lý tưởng cho việc sản xuất các sản phẩm y học. Màng collagen được sử dụng cho hàng loạt những ứng dụng như làm chất bịt kín sinh học và cải thiện tính đáp ứng sinh học đối với những mô cấy. Collagen được sử dụng như một hệ thống phân hủy sinh học cho ra các loại thuốc bao gồm thuốc tránh thai, kháng sinh, insulin, hormone tăng trưởng, [5]… Collagen được sử dụng rộng rãi trong phẫu thuật thẩm mỹ, chữa lành vết thương cho các bệnh nhân bị phỏng, tái tạo xương và nhiều mục đích khác thuộc nha khoa, phẫu thuật, chỉnh hình. Collagen còn được dùng trong việc xây dựng cấu trúc da nhân tạo để chữa trị cho các vết bỏng nghiêm trọng. Đôi khi chúng được sử dụng kết hợp với silicone, glycosaminoglycan, nguyên bào sợi, các tác nhân tăng trưởng và các hợp chất khác. Collagen cũng được bán trên thị trường như một chất bổ sung, cải thiện tính linh hoạt của khớp. Ngoài ra, collagen còn là phần nền giúp tích tụ calcium trong xương. Nếu hàm lượng collagen giảm đáng kể, calcium không thể tích tụ làm cho xương giòn và dễ gãy, sụn dễ bị hao mòn tạo nên các cơn đau ở khớp gối và hông. Như vậy, để xương cứng cáp hơn, ngoài calcium cần bổ sung một lượng lớn collagen. Collagen là một polymer tự nhiên, nó được dùng trong phẫu thuật tạo hình như bơm môi, căng da mặt,… Mặc dù không thể hấp thụ qua da nhưng hiện nay collagen đang được dùng làm thành phần chính trong các sản phẩm mỹ phẩm. Hình 1.10 Collagen dùng trong phẫu thuật thẩm mỹ Hình 1.11 Collagen áp dụng trong việc điều trị vết bỏng 10 ngày sau khi sử dụng collagen Vết bỏng mới, trước khi sử dụng collagen 3 ngày sau khi sử dụng collagen Collagen dạng sợi Collagen ở dạng sợi được dùng trong việc làm lành các vết thương, vết rạch trong phẫu thuật. Sợi collagen có thể được xử lý để tạo cấu trúc sợi thẳng, dài dùng làm những sản phẩm y học cho gân và dây chằng. Những ống collagen (collagen tube) được sử dụng thay thế cho các cấu trúc như thực quản, dây thần kinh ngoại biên, niệu quản. Nó cũng được sử dụng trong việc nuôi cấy tế bào. Màng mỏng collagen Collagen dạng màng và lớp mỏng được sử dụng để giữ cố định các vật chất sinh học chẳng hạn như nhân tố XI 11 trong máu, dùng trong sự tái tạo các mô, nối kết lại võng mạc, làm màng thẩm tích máu, làm vật thay thế lớp màng cứng của não. Nó còn được dùng cho việc tái tạo dây thần kinh, khôi phục màng nhĩ, sụn và xương, kiểm soát sự chảy máu cục bộ, khôi phục tổn thương của gan, là lớp màng chắn bảo vệ não, có tác dụng phục hồi các vết thương. Những loại collagen có thể tiêm được Dung dịch và huyền phù collagen được dùng dưới dạng có thể tiêm được làm thông sự tắc nghẽn động mạch, chữa gãy xương, tái tạo tủy sống, trị đái dầm, phục hồi chức năng trượt của gân. Sự nuôi cấy tế bào trên collagen Sự phát triển của tế bào với sự hỗ trợ của collagen trong sự nuôi cấy tế bào vừa được xem xét gần đây. Việc sử dụng chất nền collagen cho sự phát triển của tế bào da đã được công bố một cách rộng rãi. Những tế bào nuôi cấy trên collagen kích thích, làm vết thương mau lành. Những nghiên cứu rộng rãi về sự phát triển của các tế bào da tự sinh và khác loại trên nền collagen chứng minh tính khả thi để tạo ra nhiều chủng loại mô và các cơ quan trong quá trình nuôi cấy. Sử dụng nguồn nguyên liệu tế bào nuôi cấy thuộc nhiều chủng loại khác nhau có tác động to lớn đến việc điều trị cho các bệnh nhân có những tổn thương về mô hoặc các cơ quan. Ứng dụng trong mỹ phẩm Tác dụng chống lão hóa, ngăn ngừa và cải thiện nếp nhăn Khoảng 70% cấu trúc của da là collagen, phân bố chủ yếu ở lớp hạ bì của da. Collagen tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ các đặc tính cơ học của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm, làm cho da được mịn màng, tươi tắn và trẻ trung. Collagen giúp duy trì độ ẩm tối ưu cho tế bào. Ngoài ra, collagen còn đảm bảo sắc tố da, làm sáng màu da. Sự suy giảm về chất lượng, số lượng collagen sẽ dẫn đến da trở nên khô, mất độ căng, đàn hồi và thúc đẩy quá trình lão hóa của cơ thể. Chính vì vậy mà collagen đóng vai trò quan trọng giúp cải thiện cấu trúc da, kích thích quá trình tái tạo của làn da, phục hồi tế bào da bị tổn thương. Sự biến đổi collagen khi cơ thể lão hóa Khi cơ thể lão hóa, protein của tế bào kết dính với nhau hoặc thay đổi hình dáng làm cho chúng không còn đảm nhận được chức năng bình thường. Collagen bị mỏng đi và tính đàn hồi giảm đi rõ rệt. Hậu quả là các nếp nhăn da xuất hiện. Để hạn chế sự hình thành của nếp nhăn da, phương pháp chống lão hóa bảo vệ collagen và tăng cường tổng hợp collagen được xem là hữu hiệu. Khi cơ thể bước qua tuổi 30, tốc độ tổng hợp collagen bị chậm lại, tốc độ phân hủy gia tăng. Trung bình mỗi năm, cấu trúc collagen bị mất đi khoảng 1,5% về khối lượng; vì thế càng lớn tuổi, làn da càng bị lão hóa nhanh. Trước độ tuổi 45, 1/3 trong số tổng lượng collagen của cơ thể có thể bị mất đi. Các nếp nhăn, nếp gấp xuất hiện ngày càng nhiều trên trán, quanh miệng và khóe mắt. Collagen mất đi cũng ảnh hưởng đáng kể đến sự định hình các đường nét trên khuôn mặt, làn da bị chùng nhão, bị chảy, điều này đặc biệt thấy rõ khi phụ nữ bước qua tuổi 40. Ngoài ra, có rất nhiều nhân tố góp phần vào sự suy giảm của collagen. Các chất ô nhiễm có chứa độc tố toxin sẽ kích thích quá trình oxy hóa, tạo ra các gốc tự do. Các gốc tự do này phá hủy tế bào bằng cách lấy đi một electron của mỗi tế bào. Chúng còn là nguyên nhân gây ra các bệnh nghiêm trọng như ung thư. Hút thuốc, chế độ dinh dưỡng không cân bằng, thiếu các nguyên tố vi lượng, các loại thực phẩm đóng gói chứa nhiều chất hóa học có hại và không tập thể dục thường xuyên là một số nguyên nhân đẩy mạnh sự mất mát collagen. Hình 1.12 Sự lão hóa da Sự lão hóa tế bào được trì hoãn nhờ collagen và hyaluronic acid. Các chất này làm phẳng và lắp đầy các nếp nhăn của biểu bì, xúc tiến quá trình tái tạo tế bào da. Những nếp nhăn ở cổ và quanh vùng mắt sẽ giảm xuống nhờ vào sự cải thiện của biểu bì. Có 2 lý do để chính để các bác sĩ và chuyên gia thẩm mỹ sử dụng collagen trong phương pháp chống lão hóa da hiện đại. Collagen có hiệu quả cao trong quá trình hồi phục và tái tạo da Điều trị collagen phục hồi: thường được sử dụng trong trường hợp da bị tổn thương hay trong giai đoạn tái tạo sau khi điều trị nám, mụn trứng cá, sẹo, rạn da và tiêu da thừa sau khi giảm béo. Sản phẩm Phials of Collagen and Elastin với các thành phần chính là collagen, elastin và vitamin F, trong đó collagen được chiết xuất từ da heo giúp kích thích tế bào và sửa chữa các khiếm khuyết của mô nhờ đó phục hồi khả năng đàn hồi của da. Ngoài ra, sản phẩm còn có thể điều trị các vết rạn do tăng cân hay mang thai. Điều trị trẻ hóa bằng collagen 25% được sử dụng cho những phụ nữ từ 35 tuổi bắt đầu có dấu hiệu lão hóa với sự xuất hiện của các nếp nhăn, da bị mất nước, chùng nhão, chảy xệ không còn căng mịn như trước nữa, màu sắc của da cũng trở nên sạm lại. Sản phẩm Beautee Collagen Cell Pure với hàm lượng collagen nguyên chất lên tới 25%, có khả năng bổ sung và duy trì độ ẩm cho da, cung cấp dinh dưỡng và bảo vệ da chống lại môi trường ô nhiễm bên ngoài. Ngoài ra, sản phẩm còn có khả năng xóa bỏ các nếp nhăn nông, cải thiện và làm mờ các nếp nhăn sâu do tuổi tác, phục hồi lại khả năng đàn hồi tự nhiên cho da, ngăn chặn sự hình thành nếp nhăn trên da, thúc đẩy trẻ hóa tế bào theo cơ chế tự nhiên. Điều trị bằng collagen có độ an toàn tuyệt đối Phần lớn các sản phẩm collagen nguyên chất đều được chiết xuất trực tiếp từ da động vật là lợn, bò, cừu và cá da trơn; đặc biệt hơn, có một số loại collagen được chiết xuất trực tiếp từ cơ thể người. chính vì vậy chúng hoàn toàn không có các chất hóa học hay độc tố, khả năng tương thích với cơ thể người có thể lên tới 100% mà không hề có phản ứng đào thải hay loại bỏ. Tất cả mọi người ở mọi lứa tuổi đều có thể sử dụng vì sự lành tính của chúng. Ngoài ra, collagen còn được đưa vào da bằng ba phương pháp chính: Thoa lên da và nhờ tác động của các công nghệ xung điện hay ánh sáng để dẫn chúng vào sâu tới vùng da cần điều trị. Tiêm trực tiếp vào da. Ăn uống. Ba phương pháp trên đều là những biện pháp rất an toàn không hề ảnh hưởng tới da và cơ thể. (a) Trước khi điều trị (b) Sau khi điều trị Hình 1.13 Tác dụng chống lão hóa của collagen Giảm thiểu sẹo mụn (a) Trước khi điều trị (b) Sau khi điều trị Collagen thúc đẩy quá trình tái tạo mô tại những vùng da bị sẹo và mụn. Một trong những chức năng của collagen là tạo ra một mạng lưới giữ cho tế bào da được nguyên vẹn và giúp chúng di Hình 1.14 Tác dụng trị sẹo mụn của collagen chuyển ra bề mặt của da. Khi các tế bào mới này di chuyển ra bên ngoài, chúng sẽ điền đầy các lỗ sâu của mô da, làm giảm sự xuất hiện của sẹo. Collagen cũng giúp củng cố tính nguyên vẹn của tế bào da bằng cách kết hợp với các mô liên kết trong da để cải thiện cấu trúc và tính đàn hồi. Các nguồn cung cấp collagen Chúng ta có thể bổ sung, làm tăng lượng collagen cho cơ thể bằng cách tiêm collagen hoặc uống các loại thuốc có bổ sung collagen. Tuy nhiên, cách tốt nhất để gia tăng lượng collagen cho da là lấy collagen từ các nguồn thiên nhiên như những phần trích từ động và thực vật. Bạn có thể tìm được collagen trong những loại thực phẩm nào? Dưới đây là một số nguồn mà bạn có thể tìm thấy collagen để duy trì và bổ sung cho cơ thể Trái cây thuộc họ cam quít: các loại trái cây và rau củ có chứa vitamin C chính là các nguồn tự nhiên sản xuất ra collagen. Bạn nên thêm vào chế độ ăn hàng ngày các loại trái cây như cam, chanh và dâu. Bông cải xanh cũng là một trong những nguồn đáng tin cậy tham gia vào việc tổng hợp collagen cho da. Nguồn collagen từ những sinh vật biển: collagen từ các loài cá mập là một nguồn cung cấp collagen cho nhu cầu của bạn. Với những người Trung Hoa thích ăn vi cá thì đây là một cách hiệu quả để bổ sung collagen. Bên cạnh đó, da và xương của các loài gia súc như lợn là những nguồn chính cung cấp collagen và gelatin dùng trong thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và công nghiệp thuộc da. Hiện nay, những phần thừa từ cá như xương, vảy và da là những nguồn thay thế cung cấp collagen. Các dạng collagen nguyên liệu thu được từ da cá Collagen dạng bột Hình 1.15 Bột collagen sản xuất từ da và vảy cá Bột collagen từ da và vảy cá biển (marine fish collagen powder): là loại bột trắng, không mùi, tan hoàn toàn trong nước ở nhiệt độ phòng, tạo thành dung dịch trong suốt; được hấp thụ một cách dễ dàng, thành phần protein cao với hơn 90%, hàm lượng tro và kim loại nặng thấp. Collagen dạng gel Collagen dạng gel được sản xuất qua một quy trình phức tạp, trích ly từ da của loài cá chép bạc (silver carp). Loài cá này chỉ ăn tảo biển nên nó rất thích hợp để làm nguyên liệu thô trong sản xuất các sản phẩm mỹ phẩm. Hình 1.16 Collagen dạng gel Một số sản phẩm collagen Collagen EX Công dụng: Collagen EX là một chất bổ sung chứa collagen cao cấp từ cá và hyaluronic acid, cùng với những thành phần làm đẹp khác như nhân sâm, mầm sen, quả lý gai Ấn Độ, tất cả hòa trộn lại tạo thành một hỗn hợp mang đến cho bạn làn da tươi trẻ và săn chắc. Xuất xứ: Shiseido, Nhật Bản. Hình 1.17 Collagen EX Collagen update (nước uống bổ dưỡng) Công dụng: Giúp cơ thể khỏe mạnh, tinh thần minh mẫn, bổ sung dinh dưỡng, duy trì các chức năng và độ dẻo dai của khớp, giúp ngăn ngừa mụn và tái sinh làn da mịn màng. Xuất xứ: Shiseido, Nhật Bản Hình 1.18 Collagen Update Ediva collagen, hộp 30 gói 2,2g (bột) Công dụng: Ediva collagen bổ sung collagen, giúp làm chậm quá trình lão hóa của da, cải thiện và làm mờ nếp nhăn trên da đặc biệt là vùng quanh mắt, ngăn chặn sự hình thành nếp nhăn trên da, tăng tính đàn hồi giúp da săn chắc, duy trì sự trẻ trung, rạng rỡ cho làn da. Ediva collagen giúp da duy trì độ ẩm và chống lại các tác nhân gây ô nhiễm của môi trường như tia UV, khói, bụi,… Ediva collagen cải thiện sự linh hoạt của khớp, cải thiện sự Hình 1.19 Ediva collagen dung nạp calcium, giúp xương cứng cáp, gân và sụn khỏe mạnh, dẻo dai. Xuất xứ: CTCP Dược Hậu Giang, Cần Thơ, Việt Nam. Viospring collagen active essence Công dụng: Viospring được làm từ collagen nguyên chất từ cá sẽ mang đến cho bạn một làn da đẹp, tươi trẻ. Những phân tử collagen nhỏ trích ly từ vảy cá bằng công nghệ cao cùng những chiết xuất từ cây cỏ và hương thơm, có tác dụng xóa đi nếp nhăn, phục hồi nét thanh xuân, sự săn chắc cho da. Thành phần chính: collagen từ cá, elastin, silk peptide, chiết xuất từ cây lô hội, cây chamomile,… Xuất xứ: Trung Quốc Hình 1.20 Viospring collagen active essence Collagen essential mask sheet Công dụng: Nồng độ collagen trong tấm collagen cho hiệu quả hấp thụ cao, đem đến làn da săn cắc, mịn màng. Xuất xứ: Hàn Quốc Hình 1.21 Collagen essential mask sheet CHƯƠNG 2 MỘT SỐ QUY TRÌNH TRÍCH CHIẾT COLLAGEN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ Da heo Ngâm Cạo lông Rửa Loại béo Trích ly Kết tủa Ly tâm Kết tủa lại Ly tâm Collagen thành phẩm Na2SO4 H2O H2O:da = 6:1 (w/w) 30 phút 1 lần 20 phút 2 lần 300C 0,5% CHĐBM không ion isopropyl 6h 2 lần (CHĐBM) 10h (isopropyl) 3% NaOH (w/v) + 1,9% monomethylamine (v/v) 200C, 1 tuần HCl 5M pH = 4,6 ¸ 4,7 10.000 vòng/ phút 30 phút CH3COOH 0,1M 40C 72h Quy trình trích ly collagen từ da heo [6] Hình 2.1 Quy trình trích ly collagen từ da heo Quy trình trích ly collagen từ gân chân gà [7] Cắt nhỏ Loại protein hòa tan và carbohydrate Trích ly Gân gà CH3COONa 0,5M Dung dịch đệm citrate 0,15M Na2HPO4 0,02M Lọc Thẩm tích Kết tinh lại Rửa Collagen ` Hình 2.2 Quy trình trích ly collagen từ gân chân gà Rửa sạch Làm khô lạnh Loại noncollagenous protein và màu Da mực Rửa Trích ly Ly tâm Kết tủa Bột collagen Sấy lạnh NaOH 0,1M, 3 ngày CH3COOH 0,5M, 3 ngày Ly tâm NaCl 0,8M 50.000 vòng/phút, 1h 50.000 vòng/phút, 1h Quy trình trích ly collagen từ da mực [8] Hình 2.3 Quy trình trích ly collagen từ da mực Quy trình trích ly collagen từ da cá tuyết (Baltic cod) [9] Nguyên liệu không tan Collagen hòa tan Cắt nhỏ Dùng máy nghiền f = 3 mm CH3COOH, 0,1 ¸ 0,5M Tỉ lệ 1:6 ¸ 1:40 Khuấy 2h 00C Đồng nhất hóa 4 phút 00C 6.000 vòng/phút Khuấy 24h 40C Đồng nhất hóa 2 phút 00C 6.000 vòng/phút Ly tâm 20 phút 100C 10.000 vòng/phút Da cá Hình 2.4 Quy trình trích ly collagen từ da cá tuyết Tình hình sản xuất collagen hiện nay Trong những năm trước đây, để đáp ứng nhu cầu trong công nghiệp, collagen được trích ly chủ yếu từ da, xương của các loại gia súc và lợn. Khoảng thời gian gần đây, sự bùng phát của các loại bệnh truyền nhiễm như bệnh bò điên (Bovine Spongiform Encephalopathy – BSE, Tranmissible Spongiform Encephalopathy – TSE) và bệnh lở mồm long móng (Food and Mouth Disease – FMD) ở lợn và gia súc đã hạn chế phạm vi sử dụng của collagen có nguồn gốc từ chúng bởi vì có khả năng lây truyền những bệnh này sang con người thông qua các mô của động vật. Thêm vào đó, collagen trích ly từ lợn không được sử dụng vì rào cản tôn giáo. Với những nguyên nhân trên, các nhà khoa học đang tập trung vào các nghiên cứu của họ để tìm ra những nguồn collagen thay thế. Da, xương, vây, vảy của cả những loài cá nước ngọt và cá biển, da gà, da ếch, da mực,…có thể được sử dụng như những nguồn thay thế [10]. Trong số những nguồn thay thế, cá cung cấp một nguồn nguyên liệu thô tốt nhất vì: Dễ tìm, sẵn có để sử dụng Không có sự lây truyền bệnh Không gặp phải trở ngại về mặt tôn giáo Có khả năng thu được collagen với hiệu suất cao Khoảng 70% tổng trọng lượng cơ thể của cá bị bỏ đi dưới dạng các phế phẩm như da, xương, vây, đầu, vảy, ruột,…trong suốt quá trình chế biến. Việc tận dụng những chất thải này có thể nâng giá trị kinh tế của các loài cá lên. Collagen có nguồn gốc từ cá Dựa vào thành phần % của tổng lượng collagen tính trên tổng lượng protein, các loài cá được chia thành 3 nhóm: Nhóm có hàm lượng collagen thấp: tổng lượng collagen chiếm đến 5 % so với tổng lượng protein Nhóm có hàm lượng collagen trung bình: tổng lượng collagen chiếm từ 5 ¸ 10 % tổng lượng protein Nhóm có hàm lượng collagen cao: tổng lượng collagen trên 10 % tổng lượng protein Thịt của những loài cá khác nhau chứa hàm lượng khác nhau của collagen hòa tan trong acid (acid soluble collagen) và collagen không hòa tan (insoluble collagen). Hàm lượng collagen tổng cộng dao động từ 0,3 ¸ 2,99 % so với trọng lượng tươi của các mô, tương ứng với phạm vi từ 1,58 ¸ 13,39 % so với tổng lượng protein. Bảng 2.1 thành phần collagen trong thịt cá Loại cá Collagen hòa tan trong acid (so với trọng lượng tươi) Collagen không hòa tan (so với trọng lượng tươi) Collagen tổng (so với trọng lượng tươi) Collagen tổng (so với protein tổng) Cá chim trắng (White pomfret) 0,19 0,11 0,3 1,58 Sardine (cá mòi) 0,36 0,09 0,45 2,42 Cá thu (Mackerel) 0,38 0,09 0,47 2,41 Cá bơn (Sole) 0,4 0,18 0,58 2,98 Cá chép (Common carp) 0,49 0,21 0,7 3,25 Cá đối (Mullet) 0,94 0,25 1,19 5,89 Cá ngừ (Tuna) 1,06 0,39 1,45 7,35 Cá mập (Shark) 2,13 0,86 2,99 13,11 Cá đuối (Ray) 2,3 0,5 2,8 13,39 Tổng lượng collagen trong cơ thể thay đổi từ 3,26 % (ở cá thu) cho đến 6,97% (ở cá chình Nhật Bản). Lượng collagen có thể hòa tan trong acid nằm trong khoảng từ 13,1 % (cá chình) đến 56,6 % (cá bơn). Hàm lượng collagen thu được sẽ thay đổi tùy theo loài và loại mô được sử dụng trong quá trình trích ly. Trong tất cả các loài, khả năng hòa tan của collagen trong thịt tương đối cao nhưng thấp đối với những loại collagen trong nội tạng. Collagen trong da, vảy, xương và vây chiếm phần lớn trong tổng lượng collagen. So sánh collagen từ cá và collagen từ các loại gia súc Cho đến nay, hầu hết các loại mỹ phẩm trên nền collagen đều có chứa protein chiết xuất từ gia súc. Bởi sự bộc phát của bệnh bò điên BSE (Bovine Spongiform Encephalopathy – mad cow disease), collagen từ gia súc đang dần rút khỏi phạm vi sử dụng, thay vào đó là nguồn collagen được trích từ cá. Nó có nhiều đặc điểm tốt hơn cho việc ứng dụng trong y học và mỹ phẩm. Mỹ phẩm trên nền collagen từ gia súc có tốc độ hấp thụ rất chậm trên da người. Đối mặt với vấn đề này, liệu pháp tiêm collagen vào da được giới thiệu. Tuy nhiên, những bất lợi của cách thức này là đắt tiền, đau đớn và đi kèm với nó là những rủi ro. Giờ đây, các nhà khoa học Phần Lan đã phát triển một tiến trình trích ly collagen từ cá. Không giống với những loại collagen thu được từ những phương pháp trước đây, collagen từ cá được hấp thụ hoàn toàn trên da người. Cá sống trong phạm vi rộng lớn với các điều kiện về nhiệt độ, độ sâu và áp suất khác nhau. Điều này có nghĩa là collagen trích từ da cá có một sức chống chịu đặc biệt với các phá hủy lý và hóa học. Đối với các thuốc hay thức uống có chứa collagen, collagen từ cá cũng được chứng minh là có tốc độ hấp thụ vào máu nhanh hơn gấp 1,5 lần so với collagen từ lợn. So sánh khả năng hấp thụ vào máu giữa collagen từ cá và collagen từ lợn Thời gian sau khi sử dụng Khả năng hấp thụ vào máu Hình 2.5 Đồ thị so sánh khả năng hấp thụ vào máu của collagen trích ly từ cá và từ lợn Nguồn nguyên liệu cá cho việc sản xuất collagen ở Việt Nam Việt Nam là một nước đang phát triển, có nền nông nghiệp với các sản phẩm phong phú. Trong đó, các sản phẩm từ cá chiếm một phần lớn trong kim ngạch xuất khẩu. Những năm gần đây, việc nuôi cá Basa rất phát triển, đặc biệt ở Đồng bằng sông Cửu Long. Trong quá trình chế biến cá, song song với những chính phẩm dùng cho việc xuất khẩu (chủ yếu là fillet) là một khối lượng lớn các phụ phẩm như da, xương, vây,… Đây là những nguồn giàu collagen, có thể sử dụng thay thế cho những nguồn cung cấp collagen cổ điển như da, xương từ lợn, bò. Việc tận dụng những nguồn này sẽ góp phần làm tăng giá trị kinh tế của loài cá Basa. CHƯƠNG 3 TỔNG QUAN VỀ CÁ BASA Giới thiệu về cá Basa Hình 3.1 Cá Basa Cá Basa Pangasius bocourti (Sauvage 1880) thuộc họ Pangasiidae, là loại cá nước ngọt có giá trị kinh tế cao, được phân bố trong một vùng địa lý hẹp ở lưu vực sông Mekong và sông Chao Phraya (Campuchia, Lào, Thái Lan, Việt Nam). Ở Việt Nam chúng được nuôi nhiều và tập trung tại Châu Đốc (An Giang) và Hồng Ngự (Đồng Tháp) với năng suất cao. Trước đây, đã có một số tác giả đã định danh tên khoa học của cá Basa là Pangasius pangasius (Hamilton) và việc phân chia này dựa vào tài liệu của Smith (1945), Taki (1974) hay Pangasius nasutus (Bleeker).. . Trong công trình nghiên cứu xuất bản năm 1991, Tyson R.Roberts và Chanvalit Vidthayanon đã định danh lại một số loài cá trong họ Pangasiiade. Theo Nguyễn Văn Trọng, Nguyễn Thanh Tùng (1996) cũng cho rằng có sự sai sót trong việc phân loại. Các tác giả trên đã thống nhất khẳng định rằng cá Basa nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long có tên khoa học là Pangasius bocourti. Về ngoại hình, cá Basa rất dễ phân biệt với các loại cá khác trong họ cá tra, có thân ngắn, hình thoi, hơi dẹp bên, lườn tròn, đặc biệt bụng to tích lũy nhiều mỡ, chiều dài tiêu chuẩn bằng 2,5 lần chiều dài thân. Đầu cá Basa ngắn hơi tròn, dẹp đứng, miệng hẹp. Cá Basa có 2 đôi râu, râu hàm trên bằng ½ chiều dài đầu, râu hàm dưới bằng 1/3 chiều dài đầu. Có 40 ¸ 46 lược mang trên cung mang thứ nhất, vây hậu môn có 31¸36 tia vây. Chiều cao của cuống đuôi hơn 7% chiều dài chuẩn. Mặt lưng màu xám xanh và nhạt dần xuống bụng, bụng có màu trắng bạc, vây lưng và vây ngực có màu xám, vây hậu môn có màu trắng trong, màng da giữa các tia vây đuôi có màu đen. Trước đây, tên loài Pangasius Pangasius được đặt cho cá Basa là không chính xác. Vì thực tế, loài Pangasius Pangasius không phân bố ở lưu vực sông Cửu Long mà chỉ giới hạn ở Ấn Độ, Pakistan, Banglades và Myanmar, là loài có thể sống ở vùng cửa sông và biển ven bờ trong môi trường nước lợ hay nước mặn, khi trưởng thành đuôi có màu vàng sáng. Điều này không thể xảy ra đối với cá Basa hiện đang nuôi ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long. Trong hệ thống phân loại, vị trí cá Basa được xác định như sau: Bộ Siluriformes Họ Pangasiidae Giống Pangasius Loài Pangasius Pangasius Đặc điểm sinh lý, sinh thái của cá Basa Đặc điểm sinh trưởng Ở thời kỳ cá giống, cá lớn rất nhanh, sau 60 ngày đã đạt được chiều dài 8 ¸ 10,5cm; sau vụ nuôi 10 ¸ 12 tháng có thể đạt 1,3 ¸ 1,5 kg/con. Một số bè nuôi cá Basa thêm 6 ¸ 9 tháng, cỡ cá có thể đạt tới 1,8 ¸ 2,2 kg/con. Năng suất nuôi hiện nay khoảng 120kg/m3 bè nuôi và sản lượng cá thu hoạch trung bình 50 ¸160 tấn/bè tùy theo cỡ bè. Đặc điểm sinh dưỡng Cá trưởng thành của hầu hết các loài trong họ Pangasiidae là ăn tạp và thức ăn chủ yếu là từ động vật, ngoại trừ 2 loài Pangasius sanitwongsei và Pangasius larnaudii ăn chủ yếu mùn bả hữu cơ. Tương tự, cá Basa cũng có tính ăn tạp thiên về thức ăn động vật, nhưng ít háu ăn và ít tranh mồi ăn hơn cá tra. Sau khi hết noãn hoàn, giai đoạn này cá ăn phù du động vật là chính. Khi cá ở giai đoạn lớn, cá Basa cũng dễ dàng thích nghi với các loại thức ăn có nguồn gốc từ động vật, thực vật, dễ kiễm như: hỗn hợp tấm, cám, rau quả, cá vụn và các phế phẩm nông nghiệp..., do đó rất thuận lợi cho việc nuôi cá trong bè. Mùa vụ sinh sản Trong tự nhiên, tuổi thành thục của cá Basa từ 4 ¸ 5 năm. Vào mùa phát dục từ tháng 4 trở đi cá có tập tính bơi ngược dòng di cư tìm đến các bãi đẻ ở thượng nguồn sông Mekong, nơi có điều kiện sinh thái phù hợp cho sự phát triển của tuyến sinh dục và đẻ trứng. Vì vậy, cá không đẻ tự nhiên ở phần sông Mekong của Việt Nam mà bãi đẻ của cá nằm ở khu vực từ địa phận tỉnh Cratie của Campuchia trở lên thượng nguồn, tại đây có thể bắt được cá bố mẹ nặng đến 15 kg. Mùa vụ sinh sản của cá Basa nuôi bắt đầu từ tháng 2 kéo dài đến tháng 7, cá đẻ rộ và tập trung từ tháng 3 đến tháng 5. Giống cá nuôi Giống cá Basa nuôi hiện nay có từ 2 nguồn: bắt từ tự nhiên và sinh sản nhân tạo. Trước đây thì cá Basa giống hoàn toàn được bắt ngoài tự nhiên tại vùng biên giới giáp Campuchia và Việt Nam bằng cách câu, lưới hoặc các hình thức thu bắt cá giống khác và thường cỡ cá giống khoảng 5 ¸ 6 g/con. Sau khi mua hoặc đánh bắt về, cá được chăm sóc trong bè nhỏ trong 3 ¸ 4 tháng cho đến khi đạt cỡ 80 ¸100 g/con mới đưa vào bè nuôi cá thịt. Hiện nay đã có sinh sản nhân tạo được cá Basa nhưng với sản lượng còn rất thấp. Theo ước tính, hàng năm ở 2 tỉnh An Giang và Đồng Tháp cần 15 triệu con giống và chủ yếu được chuyển trực tiếp từ Campuchia sang. Mật độ nuôi Số cá thả nuôi cho một bè dao động từ 20.000 ¸ 50.000 con cá giống. Mật độ thả nuôi trung bình 90 ¸ 150 con/m3 với cỡ cá giống 80 ¸ 100 g/con. Mùa vụ nuôi Với điều kiện khí hậu thuận lợi, ấm áp quanh năm ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long, nên có thể thả giống cá nuôi vào bất kì thời gian nào trong năm. Bảng 3.1 Hai vụ chính để thả cá giống vào bè Loài cá Tháng bắt đầu thả Tháng thu hoạch Basa 4 ¸ 8 5 ¸ 8 (năm sau) 11 ¸ 12 12 ¸ 3 (năm sau) Tra 4 ¸ 6 5 ¸ 8 (năm sau) 11 ¸ 12 12 ¸ 1 (năm sau) Trong quá trình nuôi khi thu hoạch nên thu hoạch 1 lần hết số cá. Vì theo kinh nghiệm, nếu thu hoạch một phần cá thì số cá còn lại dễ bị sốc, thưởng bỏ ăn dẫn đến hao hụt lớn. Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đối với cá Basa Ngưỡng oxy của cá Basa rất cao 1,1 ± 0,15 mg/l. Cá Basa có sức chịu đựng yếu không thể sống được trong môi trường nghèo oxy. Khi hàm lượng oxy trong môi trường < 1mg/l thì cá nổi đầu, có thể chết trong thời gian ngắn. Khả năng chịu mặn của cá Basa tương đối cao, cá có thể sống bình thường trong nước có độ mặn 1,2% trở xuống, khi tăng độ mặn thì thời gian sống của cá giảm xuống. Nồng độ muối trong nước đạt 3,5% thì cá chỉ sống được 1 giờ. Bảng 3.2 Sức chịu đựng của cá Basa trong môi trường nước có độ mặn khác nhau Độ mặn (%) 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Thời gian sống (giờ) 72 6 2 1,4 1 Ngưỡng nhiệt độ cá Basa chịu đựng được thấp nhất là – 18 0C và cao nhất là 39 0C. Nếu vượt quá giới hạn này thì cá Basa có thể chết. Độ pH: cá Basa có thể sống trong môi trường có độ pH từ 5,5 ¸ 11,0. Bảng 3.3 Những điều kiện môi trường để cá Basa sống và phát triển Yếu tố Tối thiểu Tối đa Oxy hòa tan (mg/l) 1,1 - Độ mặn (%) - 1,5 Nhiệt độ (oC) 18 39 pH 5,5 11 Hệ vi sinh vật trong cá Khi còn sống, ngoài da cá có một lớp nhớt và là môi trường sinh sống tốt cho vi sinh vật. Số lượng vi sinh vật trên da từ 102 ¸ 105 tế bào/1cm2 da cá. Ở đây tồn tại các loại trực khuẩn sinh và không sinh nha bào như Pseudomonas fluorescens, Proteus vulgaris, Micrococus roseus, E.Coli và một số nấm mốc, nấm men sống trong nước. Trong mang cá có rất nhiều vi sinh vật, ở đây đa số là nhóm vi sinh vật hiếu khí thường gặp là Pseudomonas fluorescens. Trong ruột cá cũng có nhiều vi sinh vật của nước, của đất và từ thức ăn mang vào, thường thấy Clostridium sporogenes, Clostridium welchii, Vibrio setique và nhóm E.Coli. Số lượng vi sinh vật trong ruột cá khoảng 103 ¸ 108 tế bào/1g chất chứa trong ruột. Lượng vi sinh vật trong tổ chức mô cơ của cá tương đối ít, thường thấy: Proteus vulgaris, Chromobacterium, E.Coli, Bac. Subtilus... Số lượng và thành phần hệ vi sinh vật của cá phụ thuộc vào điều kiện sống. Số lượng vi sinh vật nhiễm vào cá trong bảo quản và chế biến có vai trò rất quan trọng trong quá trình thối rữa. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất, chất lượng sản phẩm cá Basa Ảnh hưởng của thức ăn Thành phần và chất lượng của thức ăn tác động trực tiếp đến thành phần và chất lượng fillet cá Basa. Thức ăn cho cá phải đảm bảo đầy đủ chất dinh dưỡng phù hợp cho từng giai đoạn phát triển của cá. Ảnh hưởng của môi trường Các yếu tố nhiệt độ, hàm lượng oxy hòa tan trong nước, pH, mật độ nuôi... đều có ảnh hưởng đến sự phát triển và chất lượng cá. Giá trị thực phẩm của cá Basa Cá Basa không chỉ cung cấp nguồn thực phẩm cho con người, mà nó còn có thể được xem là một loài cá đặc sản của vùng sông nước đồng bằng sông Cửu Long vì có cơ thịt mềm mại, đặc biệt có hương vị riêng được thị trường trong và ngoài nước rất ưa chuộng, nhất là thị trường Mỹ. Cá Basa là loài cá có giá trị kinh tế cao hiện nay của Việt Nam và có khả năng cạnh tranh được với loài cá nheo của Mỹ. Tuy là loài cá quen thuộc, có giá trị... nhưng những nghiên cứu đã có về loài cá này chủ yếu tập trung các đặc điểm sinh lý, sinh thái phục vụ cho việc nuôi trồng và đánh bắt, còn những nghiên cứu có tính hệ thống về đặc tính kỹ thuật và giá trị dinh dưỡng còn rất ít, nhất là các nghiên cứu sử dụng các thành phần khác của cá Basa như mỡ cá, dầu cá... GS.TSKH Nguyễn Văn Thoa và các cộng tác viên của Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II đã thực hiện nghiên cứu về các đặc tính kỹ thuật của cá Basa như fillet, da, mỡ lá...; giá trị thực phẩm của cá Basa như protein, lipid, ẩm, khoáng... nhưng là số liệu trung bình chung cho cá Basa. Các nghiên cứu về việc chế biến các thành phần có giá trị khác của cá Basa chưa được quan tâm nhiều, nhất là việc tận dụng thành phần mỡ cá. Viện Thủy sản II và Phân viện Công nghệ Thực phẩm tại Tp.Hồ Chí Minh đã nghiên cứu về thành phần các acid béo trong mỡ cá Basa, tìm cách chế biến mỡ cá Basa thành chất béo đủ tiêu chuẩn dùng trong thực phẩm. Tuy nhiên, quá trình tinh chế thực hiện chủ yếu bằng phương pháp hóa học theo quy trình công nghệ tinh luyện cơ bản. Tất cả nghiên cứu đều mang tính thăm dò, thử nghiệm... nhằm tìm ra các giải pháp tối ưu cho việc sử dụng các thành phần khác của cá Basa ngoài thành phần rất có giá trị là fillet cá. Trong thời gian gần đây, các công trình nghiên cứu của PGS.TS Hoàng Đức Như đã cho thấy trong mỡ cá Basa có sự hiện diện của DHA (decosa hexanenoic acid), một acid béo không no gồm 22 nguyên tử cacbon, 6 nối đôi, chuỗi cacbon mạch dài, thẳng... rất cần thiết cho sự phát triển của hệ thần kinh trung ương, phát triển thông minh, phát triển não bộ và võng mạc của thai nhi. Vì vậy, bên cạnh việc khai thác hiệu quả nguồn thịt cá, cần tập trung nghiên cứu để sử dụng hiệu quả nguồn mỡ cá. Cụ thể là nghiên cứu dùng các phương pháp tinh luyện phù hợp để khắc phục các nhược điểm vốn có của mỡ cá Basa như có mùi tanh và chóng ôi... nhằm biến mỡ cá Basa thành môt nguồn chất béo có thể sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, đời sống. Đây cũng chính là mục tiêu của các nhà nghiên cứu là muốn thử nghiệm phương pháp tinh luyện vật lý đối với mỡ cá Basa để loại trừ các acid béo tự do, các hợp chất peroxyde... nhằm đảm bảo cho mỡ cá thỏa mãn các chỉ tiêu về dầu mỡ thực phẩm. Bên cạnh đó, việc khử mùi tanh của mỡ cá cũng là vấn đề được tập trung nghiên cứu vì mùi tanh tự nhiên của cá gây cản trở rất lớn cho quá trình sử dụng trong thực phẩm. Các biện pháp bảo quản nhằm kéo dài thời gian trở mùi, ôi hóa của mỡ cá cũng được tiến hành nghiên cứu để đảm bảo cho mỡ cá có thể sử dụng trong một thời gian tương đối dài. Các sản phẩm được chế biến từ cá Basa Nguồn cá Basa trong tự nhiên không thể đủ để cung cấp cho chế biến công nghiệp mà chủ yếu là nguồn cá được nuôi trong lồng bè. Cá Basa thường được sử dụng để: Nấu chua, nấu lẩu trong các nhà hàng, khách sạn.. ít được tiêu thụ phổ biến trong gia đình vì giá tương đối cao. Chế biến công nghiệp: cá Basa thường được chế biến dạng fillet đông lạnh là chính và chủ yếu phục vụ cho thị trường xuất khẩu. Ngoài sản phẩm fillet đông lạnh, các sản phẩm khác chế biến từ cá Basa có mặt trên thị trường trước đây còn rất ít, có lẽ do quy trình kỹ thuật chưa được hoàn thiện để tạo ra các sản phẩm có chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu của người tiêu thụ. Tuy nhiên, với việc ngày càng chú trọng mỡ rộng thị trường tiêu thụ nội địa nên các sản phẩm được chế biến từ cá Basa đã được đầu tư nghiên cứu và phát triển rất nhanh trong giai đoạn gần nay. Vừa qua, tại hội chợ thuỷ sản Việt Nam năm 2003, công ty Agifish An Giang (công ty xuất khẩu cá da trơn lớn nhất của Việt Nam) đã giới thiệu một loạt các sản phẩm mới được chế biến từ cá Basa như : - Dạng món ăn khai vị: cá viên Basa, cháo Basa, cháo mực Basa, chả giò Basa, chả quế Basa, bánh khoai moan nhân Basa, Basa bánh tròn tẩm bột, nấm đông cô nhân Basa, Basa cắt sợi tẩm bột, bánh chỉ Basa, hoành thánh Basa … - Dạng món ăn gia đình chế biến sẵn: cá Basa kho tộ, Basa fillet sốt cà, Basa cắt khoanh muối sả ớt, cà chua dồn Basa, khổ qua dồn Basa, ốc bươu nhồi Basa, vây cá Basa tẩm gia vị, bong bóng cá Basa tẩm gia vị, da cá Basa tẩm gia vị … - Dạng món ăn tự chế biến: Basa cắt khoanh, lẩu Basa, Basa fillet, Basa lột da rút xương, Basa xiên que, bao tử Basa, hải sản thập cẩm, chả thát lát … - Dạng sản phẩm khô: Basa nguyên con sấy khô, khô Basa, khô Basa ăn liền, chà bông Basa, lạp xưởng Basa, bánh phồng Basa … Hiện nay tình hình thị trường xuất khẩu cá Basa, cá tra Việt Nam vẫn chưa được ổn định. Vì thế cần điều chỉnh lại mục tiêu để ổn định ngành nghề và phát triển nghề nuôi loại cá này của Việt Nam. Nuôi cá Basa và cá tra trước hết dành cho xuất khẩu, nhưng đã đến lúc cần quan tâm hơn đến thị trường nội địa, ngoài dạng sử dụng cá tươi, cần nghiên cứu chế biến một số sản phẩm phù hợp với thị trường này. Nhất là nghiên cứu chế biến tận dụng các thành phần khác của cá Basa ngoài thành phần có giá trị là fillet như chế biến nguồn mỡ cá thành nguồn dầu mỡ sử dụng được trong thực phẩm, chế biến các phụ phẩm của cá Basa thành các sản phẩm khác … nhằm khai thác tối đa nguồn nguyên liệu này. CHƯƠNG 4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mục đích đề tài Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình loại màu da cá Basa: nồng độ dung dịch H2O2 trong NaOH 0,01 M, thời gian tẩy màu, tỉ lệ da/dung dịch H2O2 trong NaOH Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố lên quá trình trích chiết collagen: loại acid (citric acid và acetic acid), thời gian trích chiết và phương pháp trích chiết Đánh giá tính chất hóa lý của sản phẩm collagen thu được Hóa chất – Thiết bị Hóa chất NaOH H2SO4 Citric acid Sodium Lauryl Sulphate (LasNa) NaCl H2O2 Acetic acid Na2HPO4 Thiết bị Cân hai số Máy xay Philips HR 1361 Máy đo độ ẩm Sartorius MA 35 Máy ly tâm Hermle Z 200A Máy so màu CR - 300 Máy đo độ nhớt Brookfield HDBV – II Máy quang phổ Varian Carry Phương pháp nghiên cứu Phương pháp tiến hành thí nghiệm Phương pháp chuẩn bị mẫu Nguyên liệu da cá Basa được mua về, loại bỏ những phần mỡ thừa còn sót lại, rửa sạch sơ bộ với nước và trữ trong tủ đông ở nhiệt độ khoảng -200C để sử dụng cho các thí nghiệm. Phương pháp khảo sát Phương pháp khảo sát theo yếu tố từng phần. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, chỉ thay đổi một nhân tố còn các nhân tố khác cố định trong suốt quá trình thí nghiệm. Kết quả tối ưu của thí nghiệm trước được áp dụng cho thí nghiệm sau. Phương pháp phân tích Phương pháp phân tích nguyên liệu Xác định hàm lượng ẩm trong nguyên liệu (Moisture) Cân một lượng mẫu có khối lượng khoảng 1 gram. Cho mẫu vào đĩa nhôm và đặt vào máy đo độ ẩm Sartorius MA 35. Đọc giá trị độ ẩm trên đồng hồ hiển thị của máy. Tiến hành đo 3 lần để lấy giá trị trung bình. Hàm lượng tro tổng (Total ash content) [11] Nguyên tắc Khi nung ở 550 ÷ 600 0C, các chất hữu cơ cháy hòan toàn, chất vô cơ còn lại gọi là thành phần tro. Tiến hành Cân một lượng mẫu (G) cho vào chén nung đã được nung và cân đến khối lượng không đổi (G1). Đưa chén nung chứa mẫu vào lò nung ở 500 ¸ 600 0C trong 3 h. Lấy chén nung ra để nguội trong bình hút ẩm và cân. Tiếp tục nung và cân cho đến khi khối lượng không đổi (G2). Công thức Độ tro được xác định theo công thức: % Tro = Trong đó G : khối lượng mẫu ban đầu, g G1 : khối lượng đĩa G2 : khối lượng đĩa + thành phần tro sau khi sấy Hàm lượng béo (Fat content) [11] Nguyên tắc Dùng dung môi kỵ nước trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã được sấy khô, nghiền nhỏ. Một số thành phần hòa tan trong chất béo cũng được trích ly theo bao gồm sắc tố, các vitamin tan trong chất béo, các chất mùi…tuy nhiên hàm lượng của chúng thấp. Do có lẫn tạp chất, phần trích ly được gọi là lipid tổng hay dầu thô. Dung môi sẽ được tách khỏi dịch trích bằng cách bốc hơi và phần còn lại chính là lipid, đươc đem cân để xác định hàm lượng. Tiến hành Cân một lượng mẫu chính xác, đem sấy khô. Dùng ethyl ether để trích lượng mẫu này trong thiết bị Soxhlet. Dịch trích được cho vào một đĩa đã biết khối lượng để làm bay hơi dung môi. Sau đó, đĩa này được sấy khô, làm nguội trong bình hút ẩm và được xác định khối lượng. Công thức % Lipid tổng (dầu thô) = Trong đó W1 : khối lượng đĩa W2 : khối lượng đĩa + thành phần của dịch trích sau khi sấy khô S : khối lượng mẫu ban đầu Hàm lượng đạm (Protein content) [11] Định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl trên cơ sở xác định hàm lượng nitrogen protein (thường chiếm khoảng 16 % trong các protein khác nhau). Nhân giá trị nitrogen xác định được với hệ số 6,25 (100:16) sẽ ra hàm lượng protein tổng số. Để định lượng nitrogen protein người ta thường xác định nitrogen tổng số và nitrogen phi protein, sau đó lấy hiệu số giữa hai dạng này. Xác định nitrogen tổng Nguyên tắc: dưới tác dụng của H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất hữu cơ có chứa nitrogen bị phân hủy và bị oxy hóa đến CO2 và H2O, còn nitrogen chuyển thành amoniac và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulphate. Quy trình được tiến hành theo các bước sau: CuSO4 : K2SO4 (1:3) Vô cơ hóa nguyên liệu R-CHNH2-COOH + H2SO4 CO2 + H2O + (NH4)2SO4 Cất đạm (NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O Phản ứng xảy ra trong bình phản ứng NH3 + H2SO4 ® (NH4)2SO4 + H2SO4 dư (ở bình hứng) Chuẩn độ H2SO4 dư ở bình hứng bằng NaOH có nồng độ 0.1N. Hàm lượng Nitrogen trong mẫu được tính bằng công thức Trong đó X : hàm lượng Nitrogen tính bằng g/l A : số ml H2SO4 đem hấp thụ NH3 B : số ml NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ H2SO4 thừa V : số ml mẫu đem vô cơ hóa 0,0014 : số gram nitrogen tương ứng với 1ml H2SO4 0,1N F : hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch NaOH 0,1N (F là tỉ số giữa nồng độ thực tế và nồng độ lý thuyết của NaOH) Xác định nitrogen phi protein Dùng các dung môi thích hợp để chiết rút tất cả các dạng nitrogen phi protein, tuy nhiên trong dịch chiết vẫn còn lẫn một vài loại protein. Vì vậy, cần dùng chất kết tủa để tách phần protein hòa tan trong quá trình chiết rút. Định lượng protein trong nguyên liệu Protein(mg) = (Ntổng số - Nphi protein)6,25 Xác định tổng lượng collagen trong da cá Xác định bằng phương pháp định lượng hydroxyproline [12] Nguyên tắc Trong tổng lượng amino acid có trong collagen, hydroxyproline chiếm khoảng 14 %. Loại amino acid này gần như chỉ được tìm thấy trong collagen mà không có trong bất kỳ một loại protein nào khác của cơ thể, ngoại trừ một lượng nhỏ trong elastin. Do đó, có thể định lượng collagen thông qua định lượng hydroxyproline. Cấu trúc của hydroxyproline có chứa vòng pyrrolidine, nó có thể bị oxy hóa để hình thành vòng pyrrole. Vòng pyrrole này tác dụng với tác chất Ehrlich, 4–(N,N– dimethylamino)benzaldehyde tạo thành hợp chất quinoid có màu (màu sắc phụ thuộc vào nhóm thế và thay đổi từ màu cam đến màu hoa cà). Thực hiện phương pháp so màu để tính hàm lượng hydroxyproline. Tiến hành Chuẩn bị dung dịch chuẩn: lấy 25 mg bột hydroxyproline tinh khiết hòa tan vào 250 ml nước (100 mg/ml). Kế tiếp, lấy 50, 75, 100 và 150 ml của dung dịch này và thêm nước cất vào để đạt được tổng thể tích là 1 ml. Sự oxy hóa hydroxyproline xảy ra khi cho 1 ml Chloramine B vào mỗi ống nghiệm, hỗn hợp được lắc và giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Lượng dư Chloramine T được phân hủy bằng cách cho 1 ml dung dịch HClO4 3,15 M vào, hỗn hợp được lắc trộn. Sau 5 phút, cho 1 ml dung dịch p-dimethylaminobenzaldehyde 20 % vào mỗi ống nghiệm và tiến hành lắc một lần nữa. Các ống nghiệm được giữ trong bể điều nhiệt ở 60 0C trong 20 phút và sau đó được làm mát với nước lạnh trong vòng 5 phút. Bước kế tiếp, 5 ml Ethyl Cellosolve được thêm vào mỗi ống nghiệm để đạt tổng thể tích lá 10 ml. Ta thu được các dung dịch chứa 0,5, 0,75, 1 và 1,5 mg hydroxyproline. Độ hấp thu được đo ở bước sóng 557 nm (màu đỏ sẫm). Nước cất được dùng làm mẫu trắng. Ta xây dựng được đường chuẩn biểu diễn độ hấp thu theo các hàm lượng của hydroxyproline. Dung dịch thử được chuẩn bị với cùng một cách thức. Pha loãng dung dịch thử để nồng độ hydroxyproline nằm trong vùng từ 0,5 ¸1,5 mg/ml, tương ứng với phần tuyến tính trên phổ quang kế. Nồng độ của hydroxyproline được xác định dựa trên đường chuẩn. Lượng collagen được tính như sau: Collagen = hydroxyproline 14,7 Xác định bằng phương pháp trích ly sử dụng lactic acid [13] Da cá sau khi xử lý sẽ được trích ly bằng dung dịch lactic acid 0,5 M. Da cá được xay nhỏ, ngâm vào lactic acid với tỉ lệ 1:6. Tiến hành trích ly trong khoảng thời gian là 48 h. Phần da cá sau khi trích sẽ được tiếp tục ngâm vào dung dịch acid mới để trích ly một cách triệt để lượng collagen có trong da cá. Tổng số lần trích ly là 3, thời gian cho mỗi lần là 48 h. Theo nghiên cứu đã công bố thì lactic cho khả năng trích ly cao, hiệu suất trích sau 48 h là khoảng 90 %. Sau 3 lần trích ly trên cùng một lượng mẫu da, lượng collagen trích được là 99,99 %, xem như là tổng lượng collagen có trong da. Xác định độ sáng và màu sắc của da cá Giới thiệu không gian màu CIELAB Để tuận lợi cho việc tính toán và so sánh các màu với nhau, năm 1976 CIE giới thiệu một hệ thống sắp xếp màu sắc CIELAB. Trong đó sử dụng 3 thông số: L*: độ sáng a*: tọa độ màu trên trục đỏ - lục b*: tọa độ màu trên trục vàng – lam Trong hệ thống CIELAB, sự khác nhau giữa các điểm được biểu thị trong không gian màu tương ứng với những khác biệt có thể nhìn thấy được giữa các màu. Không gian màu CIELAB được thiết lập ở dạng lập phương. Trục L* chạy từ đỉnh xuống đáy. Giá trị cực đại của L* là 100, tương ứng với màu trắng. Giá trị cực tiểu của L* là 0, tượng trưng cho màu đen. Các trục a* và b* không có giới hạn các giá trị số cụ thể. Giá trị dương của a* biểu thị cho màu đỏ, giá trị âm biểu thị màu xanh lục. Giá trị dương của b* thể hiện màu vàng, giá trị âm thể hiện màu xanh lam. Có những giá trị delta đi kèm với hệ thống CIELAB. Các giá trị ∆L*, ∆a*, ∆b* cho biết mẫu chuẩn và mẫu thử khác nhau như thế nào về các giá trị L*, a*,b*. Những giá trị delta này thường được sử dụng cho sự quản lý chất lượng và hiệu chỉnh công thức. Cần thiết lập những mức giới hạn cho các giá trị delta này. Các giá trị delta nằm ngoài giới hạn cho biết có quá nhiều khác biệt giữa mẫu chuẩn và mẫu thử. ∆L* = : sự khác nhau về độ sáng giữa 2 màu Nếu ∆L* mang dấu +: sự lệch màu theo hướng sáng lên, mẫu thử sáng hơn mẫu chuẩn Nếu ∆L* mang dấu -: sự lệch màu theo hướng tối hơn, mẫu thử tối hơn mẫu chuẩn ∆a* = : sự khác nhau về tọa độ trên trục đỏ - lục Nếu ∆a* mang dấu +: sự lệch màu theo hướng đỏ lên, mẫu thử có sắc đỏ hơn mẫu chuẩn Nếu ∆a* mang dấu -: sự lệch màu theo hướng lục hơn, mẫu thử có sắc xanh lục hơn mẫu chuẩn ∆b* = : sự khác nhau về tọa độ trên trục vàng - lam Nếu ∆b* mang dấu +: sự lệch màu theo hướng vàng hơn, mẫu thử có sắc vàng hơn mẫu chuẩn Nếu ∆b* mang dấu -: sự lệch màu theo hướng lam hơn, mẫu thử có sắc xanh lam hơn mẫu chuẩn Giới thiệu không gian màu CIELCH Không gian màu L*C*h* sử dụng chung giản đồ với không gian màu L*a*b* nhưng thay vì sử dụng trục tọa độ vuông thì nó lại sử dụng trục tọa độ hình trụ. Trong không gian màu này, L* biểu thị độ sáng giống với L* trong không gian màu L*a*b*, C* là cường độ màu và h* là góc tông màu. Giá trị cường độ màu C* bằng 0 ngay tại tâm và gia tăng tùy thuộc khoảng cách từ tọa độ màu đến tâm. Giá trị góc tông màu được xác định khởi điểm tại trục a* và được tính bằng đơn vị độ : 00 là +a* (Đỏ) 900 là +b* (Vàng) 1800 là –a* (Lục) 2700 là –b* (Lam) Các giá trị C* và h* được xác định từ a* và b* theo công thức : Cường độ màu Góc tông màu  : sự khác nhau về độ bão hòa giữa hai màu  : sự khác nhau về tông giữa hai màu * Chú ý Mục đích chính của quá trình tẩy màu là làm cho da trắng, sáng lên. Do đó, trong quá trình này trục màu chính cần quan tâm là trục màu trắng – đen (L*). Trục a* và b* được xem là 2 trục màu phụ để khảo sát sự thay đổi của ánh màu phụ trong quá trình xử lý. Phương pháp phân tích sản phẩm Xác định sự biến tính của collagen theo nhiệt độ bằng phương pháp biến đổi độ nhớt (Denaturation temperature determined by viscosity method) [14-16] Dung dịch collagen 0,03 % trong acetic acid 0,1 M được nạp vào đĩa của máy đo độ nhớt với lượng khoảng 5 ml. Nhiệt độ của đĩa được điều chỉnh thông qua bể điều nhiệt. Cài đặt nhiệt độ của bể điều nhiệt ứng với nhiệt độ ban đầu của thí nghiệm là 30 0C và để khoảng 30 phút cho nhiệt độ của dung dịch collagen cân bằng với nhiệt độ ở bể điều nhiệt. Thí nghiệm được tiến hành trong khoảng nhiệt độ từ 30 0C đến 50 0C. Nhiệt độ được gia tăng từng bước, mỗi bước ứng với 2,5 0C và mỗi mức nhiệt độ được giữ trong 10 phút. Độ nhớt của dung dịch collagen được xác định tương ứng ở các mức nhiệt độ. Độ nhớt tương đối được tính như sau: Độ nhớt tương đối = Trong đó: ht : độ nhớt đo được tại mỗi mức nhiệt độ hmax : độ nhớt lớn nhất hmin : độ nhớt nhỏ nhất Đường cong biến tính nhiệt được xây dựng bằng cách vẽ đồ thị độ nhớt tương đối theo nhiệt độ. Phân tích nhiệt vi sai (Differential thermal analysis/ Thermogravimetry analysis (DTA/TG)) [17, 18] DTA là kỹ thuật ghi nhận sự khác biệt về nhiệt độ giữa mẫu thử và một chất đối chứng theo thời gian hoặc nhiệt độ bằng một chương trình nhiệt độ xác định trong một môi trường được đun nóng hoặc làm lạnh với mức độ được kiểm soát. (Thực hiện tại Khoa Công nghệ vật liệu, trường Đại học Bách khoa TP.HCM) Đo phổ hồng ngoại infrared (IR) spectroscopy [19] Phổ hồng ngoại IR là một trong những kỹ thuật phổ được sử dụng rộng rãi nhất, là phương pháp đo độ hấp thụ của mẫu thử ở các bước sóng khác nhau của tia hồng ngoại. Mục đích chính của việc phân tích phổ IR là xác định các nhóm chức hóa học có trong mẫu thử. Những nhóm chức khác nhau sẽ hấp thụ những bước sóng riêng biệt. Với nhiều thiết bị phụ tùng, máy phổ hồng ngoại có thể làm việc với nhiều dạng mẫu từ khí, lỏng đến rắn. Phân tích phổ IR là một công cụ phổ biến và quan trọng để làm sáng tỏ cấu trúc và xác định các hợp chất. (Thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia vật liệu Polymer và Composite, trường Đại học Bách khoa TP.HCM) Hàm lượng tro tổng (Total ash content) Thực hiện tại Trung tâm Kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3 Hàm lượng béo (Fat content) Thực hiện tại Trung tâm Kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3 Hàm lượng đạm (Protein content) Thực hiện tại Trung tâm Kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3 Sự hình thành sợi của collagen (Fibril formation experiment - Turbidity) [20] Collagen được cho vào dung dịch đệm (0,1M Na2HPO4, 0,05 Citric acid, pH = 7,2) với sự có mặt của NaCl (nồng độ cuối cùng là 0,15M) ở 4 0C. Nồng độ của mẫu collagen được điều chỉnh bằng 0,5 mg/ml trong dung dịch đệm. Mẫu được làm nóng đến 35 0C để kích thích quá trình hình thành sợi. Tiến hành ghi nhận độ hấp thu của mẫu theo thời gian, 2 phút/lần, trong vòng 30 phút. Độ hấp thu được đo ở bước sóng 313 nm. Hình thái bề mặt của collagen (Scanning Electron Microscopy - SEM) [20] Hình thái bề mặt của sản phẩm collagen thu được và mẫu gelatin chuẩn được chụp theo phương pháp SEM để quan sát được sự khác biệt về cấu trúc của chúng. (Thực hiện tại Phòng thí nghiệm chuyên sâu, Trường Đại học Cần Thơ) Quy trình thí nghiệm Quy trình loại béo Da cá Basa Ngâm x 3 lần Dd NaOH 0.2% 0,5% LasNa H2O Rửa Dd H2SO4 0.2% Ngâm x 3 lần 0,5% LasNa H2O Rửa Dd Citric 0.7% Ngâm x 3 lần 0,5% LasNa H2O Rửa Da cá đã lọai béo Hình 4.1 Quy trình loại béo Để thu được collagen không có mùi, da cá nguyên liệu cần phải được loại loại bỏ các chất béo. Ta áp dụng phương pháp của Gudmundsson và Hafsteinsson (1997), phương pháp được trình bày như sau: Da cá Basa sau khi được rửa sơ bộ với nước sẽ được tiếp tục xử lý với lần lượt 3 loại dung dịch (NaOH 0,2%, H2SO4 0,2% và Citric Acid 0,7%) với tỉ lệ da : dung dịch là 1:10 (g/ml) nhằm mục đích thu được collagen không mùi. Với mỗi loại dung dịch, da cá được xử lý qua 3 lần, mỗi lần tương ứng với thời gian là 1h. Sau mỗi lần xử lý, da phải được rửa sạch dưới vòi nước đến khi đạt pH = 7 trước khi tiến hành ngâm lần tiếp theo. 0,5% chất hoạt động bề mặt (LasNa) được thêm vào tất cả các dung dịch sử dụng trong quy trình nhằm nâng cao khả năng loại mùi. Tuy nhiên, theo lý thuyết quy trình này có thể làm mất đi một lượng collagen. Ta tiến hành thêm một quy trình dựa trên nguyên tắc của quy trình trên nhưng không sử dụng acid để rửa. 2 mẫu da của 2 quy trình xử lý (có dùng acid và không dùng acid) sẽ được đối chứng với nhau. Quy trình loại màu Áp dụng quy trình tẩy màu của Kolodziejska et al. (1999) Da cá đã loại béo Ngâm dd NaCl 10 % t(0C) = 30 0C τ = 24 h Ngâm, tẩy màu trong NaOH 0,01M Da cá đã xử lý dd 1% H2O2 Hình 4.2 Quy trình tẩy màu Da sau khi loại lipid được ngâm trong dung dịch NaCl 10 % trong vòng 24 h, tỉ lệ da : dung dịch là 1:10 (g/ml), ở nhiệt độ phòng, chuẩn bị cho quá trình tẩy màu. Việc tẩy màu được tiến hành dưới tác dụng của dung dịch H2O2 trong NaOH 0,01M. Quy trình trích collagen Ly tâm 5000 vòng/phút 1 phút acetic 0,5M hay citric 0,5M NaCl Collagen không tan 1:6 (g/ml) 4 ( 0C) Da cá đã xử lý Xay nhỏ Trích ly Lọc Ly tâm Kết tinh Ly tâm Kết tinh lại 5.000 vòng/phút 30 phút 5.000 vòng/phút 1 h Collagen thành phẩm Hình 4.3 Quy trình trích ly Quá trình trích ly collagen được thực hiện ở nhiệt độ 4 0C trong 24, 48 và 72 h với dung dịch có nồng độ 0,5 M của các acid citric và acetic. Với mỗi loại acid, collagen được trích theo phương pháp toàn phần (A) và từng phần (B). Phương pháp toàn phần (A): da cá được trích trong dung dịch acid một lần duy nhất ứng với các mốc thời gian 24, 48 và 72 h. Phương pháp từng phần (B): da cá được tiến hành trích qua nhiều lần, mỗi lần 24 h, sau đó lượng collagen thu được ở các lần trích được gộp lại để tính hiệu suất. Da cá sau khi xử lý được ngâm trong các dung dịch acid với tỉ lệ da/dung dịch là 1:6 (g/ml). Dịch trích collagen thu được từ quá trình trích ly được tinh chế theo phương pháp của Piez et al. (1963). NaCl rắn được cho vào dịch trích collagen với nồng độ 5% (w/v) để kết tinh collagen. Collagen kết tinh (collagen hòa tan trong acid) được tách ra bằng phương pháp ly tâm với vận tốc 5.000 vòng/phút trong 90 phút, sử dụng máy ly tâm Hermle Z 200A. Để thu được collagen tinh khiết hơn, phần collagen kết tinh được hòa tan lại trong acetic acid 0,5 M và kết tinh lại theo các bước miêu tả ở trên. Quá trình kết tinh lại được lặp lại 2 lần. Các thông số khảo sát trong quá trình thí nghiệm Trong quá trình xử lý nguyên liệu Nồng độ dung dịch H2O2 (%) f = f(0,5; 0,75; 1; 1,25; 1,5) Thời gian tẩy màu (h) f = f(1; 2; 3; 4; 5; 6; 24) Tỉ lệ da/dung dịch (g/ml) f (F) = f(1:10; 1:12,5; 1:15; 1:17,5; 1:20) Trong quá trình trích collagen Loại acid Citric và Acetic acid Phương pháp trích Phương pháp A (từng phần) và phương pháp B (toàn phần) Thời gian trích (h) f = f(24; 48; 72) Đáp ứng Trong quá trình xử lý nguyên liệu Đáp ứng được chọn làm đáp ứng chính là giá trị độ lệch sáng giữa da cá nguyên liệu ban đầu và da cá sau quá trình xử lý ∆L* theo các thông số nồng độ dung dịch H2O2, thời gian tẩy màu và tỉ lệ da/dung dịch. Các giá trị ∆C* và ∆h* là các đáp ứng phụ để đánh giá sự thay đổi màu sắc của da cá trong quá trình xử lý. Trong quá trình trích collagen Đáp ứng chính là hiệu suất trích ly theo các yếu tố như loại acid, phương pháp trích và thời gian trích. CHƯƠNG 5 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Đánh giá nguyên liệu Nguồn nguyên liệu Xuất xứ: da cá Basa được mua từ Công ty TNHH Thuỷ Sản Bình An (Binh An Seafood Joint Stock Company), Lô 2.17, Khu Công Nghiệp Trà Nóc II, TP. Cần Thơ. Da cá được tách ra bằng phương pháp cơ học ở nhà máy. Sau khi mua về, ta rửa sạch bằng nước, loại bỏ sơ bộ các phần mỡ còn sót lại trên da và tồn trữ ở khoảng -200C cho đến khi sử dụng. Khảo sát các thành phần của da cá Basa (Phụ lục 1) Bảng 5.1 Thành phần da cá Basa nguyên liệu Thành phần Hàm lượng (%) Protein 31,1 Lipid 6,5 Độ ẩm 58,7 Độ tro 0,1 Các thành phần khác 3,6 Đánh giá quy trình loại béo nguyên liệu (Phụ lục 1) Bảng 5.2 So sánh thành phần giữa da nguyên liệu và da sau khi xử lý của hai quy trình Chỉ tiêu Da nguyên liệu Xử lý có acid Xử lý không acid Độ ẩm (%) 58,73 66,31 62,89 Cảm quan Dạng Rắn, tươi Rắn, tươi Rắn, tươi Màu Đen Trắng Trắng Mùi Hôi Không mùi Vẫn còn mùi Lý hóa Protein (%) 75,35 39,18 64,40 Lipid (%) 15,75 3,27 15,35 Độ tro (%) 0,24 0,29 0,27 Hiệu suất loại béo Quy trình có sử dụng acid Quy trình không sử dụng acid Lượng protein mất đi sau khi loại béo Quy trình có sử dụng acid Quy trình không sử dụng acid Nhận xét Về mặt cảm quan, da cá sau khi xử lý đều có màu trắng, sáng hơn so với da cá ban đầu nhưng da chỉ qua xử lý với NaOH 0,1M sẽ cho ta cảm giác nhớp nháp khi sờ vào, đồng thời mùi hôi vẫn còn trong khi da qua quy trình xử lý có acid rất sạch và không có mùi. Quy trình loại béo có sử dụng acid có hiệu quả hơn, hiệu suất tương đối cao (đạt 79,24 %), cao gấp 31,2 lần so với hiệu suất của quy trình chỉ sử dụng NaOH 0,1 M. Tuy nhiên, một điểm bất lợi có thể thấy của quá trình loại lipid có sự tham gia của các acid đó là sự mất mát nhiều của các protein, lượng protein mất đi chiếm 48 %. Trong khi đó, quy trình không sử dụng acid chỉ làm mất đi 14,53 % protein. Một phần collagen có thể mất đi trong giai đoạn này. Þ So sánh giữa hai quy trình, ta chọn quy trình xử lý có mặt của acid vì hiệu suất loại béo cao, da sau xử lý tương đối sạch, có thể dùng làm nguyên liệu cho các bước tiếp theo để thu được collagen tinh khiết, không màu và không mùi. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tẩy màu nguyên liệu Nồng độ H2O2 và thời gian tẩy màu Diều kiện khả sát Điều kiện cố định F (g/ml) = 1:10 = 30 Khảo sát ∆L* = f, f ∆C* = f, f ∆h* = f, f Với (%) = 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5 (h) = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 24 Kết quả khảo sát (Phụ lục 2) Hình 5.1 Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của nồng độ H2O2 và thời gian lên quá trình tẩy màu Nhận xét Trong 4h đầu tiên của quá trình tẩy màu, khả năng tẩy màu đồng biến theo thời gian. Sự chênh lệch về độ sáng giữa da được tẩy màu và da ban đầu, hay nói cách khác là độ sáng của da đạt giá trị cực đại tại thời điểm 4h. Sau thời điểm này, độ chênh lệch sáng có xu hướng giảm xuống và sau đó gần như duy trì cho đến thời điểm 24h. Xu hướng trên được thể hiện rõ ở cả 5 mức nồng độ. Tuy nhiên, mức nồng độ 1% cho thấy chênh lệch về độ sáng là cao nhất. Từ kết quả trên, ta biết được 2 giá trị tối ưu của 2 thông số trong quá trình tẩy màu: Nồng độ H2O2: 1% Thời gian tẩy màu: 4h Một điểm cần lưu ý là quá trình tẩy màu nếu được kết hợp với sự khuấy trộn sẽ cho kết quả khả quan hơn. Tỉ lệ da/dung dịch Điều kiện khảo sát Điều kiện cố định (%) = 1 (h) = 4 = 30 Khảo sát ∆L* = f ∆C* = f ∆h* = f Với F(g/ml) = 1:10, 1:12.5, 1:15, 1:17.5, 1:20 Kết quả khảo sát (Phụ lục 3) Hình 5.2 Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của tỉ lệ da/dung dịch lên quá trình tẩy màu Nhận xét Từ đồ thị ta thấy chênh lệch độ sáng tăng mạnh khi tỉ lệ da/dung dịch tăng từ 1:10 đến 1:15. Sau đó, độ chênh lệch này giảm nhẹ khi ta tiếp tục tăng tỉ lệ đến mức 1:20. Da cá được tẩy màu đến mức sáng nhất tương ứng với tỉ lệ da/dung dịch là 1:15. Độ trắng của da ở mức tỉ lệ 1:17,5 không lệch nhiều so với mức 1:15. Trong khi đó, độ bão hòa màu tại tỉ lệ 1:17,5 là thấp nhất Þ chọn mức tỉ lệ 1:17,5 Tổng lượng collagen trong da cá Theo phương pháp định lượng hydroxyproline (Phụ lục 4) Hình 5.3 Đồ thị biểu diễn đường chuản của độ hấp thụ theo nồng độ hydroxyproline Bảng 5.3 Tổng lượng collagen trong da cá (xét trên 30 g da cá) (Phụ lục 5) Loại da cá Lần thí nghiệm Độ hấp thu Hàm lượng Hydroxyproline (g/ml) Giá trị trung bình (g/ml) Lượng collagen (g) Da ban đầu 1 1,342 0,315 0,317 4,66 2 1,371 0,319 Da sau khi xử lý 1 1,229 0,299 0,297 4,37 2 1,194 0.294 Da cá ban đầu Hàm lượng collagen (%) tính trên khối lượng ướt (wet weight) Hàm lượng collagen (%) tính trên khối lượng khô (dry weight) Da cá sau khi xử lý Hàm lượng collagen (%) tính trên khối lượng ướt (wet weight) Hàm lượng collagen (%) tính trên khối lượng khô (dry weight) Theo phương pháp trích ly bằng lactic acid (Phụ lục 6) Điều kiện khảo sát Điều kiện cố định mướt (g) = 30 = 4 F (g/ml) = 1:6 CLactic acid = 0,5 = 48 Kết quả Bảng 5..4 Kết quả lượng collagen trích bằng lactic acid (phụ lục 6) Lần trích ly Lần thí nghiệm Lượng collagen (g) Thu được Giá trị trung bình (g) 1 1 3,36 3,32 2 3,28 2 1 0,90 0,89 2 0,89 3 1 0,19 0,19 2 0,18 Lượng collagen tổng cộng: 3,32 + 0,89 + 0,19 = 4,4 (gram) Phần trăm collagen theo khối lượng ướt (wet weight) % collagen = Phần trăm collagen theo khối lượng khô (dry weight) % collagen = Độ chênh lệch giữa 2 phương pháp Qua so sánh, ta thấy phương pháp trích ly bằng lactic acid không chênh lệch nhiều so với phương pháp định lượng hydroxyproline. Phương pháp định lượng collagen thông qua sự định lượng hydroxyproline là phương pháp chuẩn, có tính chính xác cao, đáng tin cậy. Tuy nhiên, phương pháp này tương đối phức tạp và giá thành rất đắt. Do đó, để xác định hiệu suất của quá trình trích ly ta không sử dụng phương pháp này mà xác định lượng collagen bằng quá trình tinh chế. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích collagen Loại acid, phương pháp trích và thời gian trích Điều kiện khảo sát Điều kiện cố định mướt (g) = 30 = 4 F (g/ml) = 1:6 CAcid = 0.5 Khảo sát H (%) = f(Loại acid) H (%) = f(Phương pháp trích) H(%) = f() Với Loại acid Acetic và Citric acid Phương pháp từng phần và toàn phần (h) = 24, 48, 72 Kết quả khảo sát (Phụ lục 7) Hình 5.4 Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của loại acid, phương pháp trích và thời gian lên hiệu suất trích collagen Bảng 5.5 Lượng collagen thu được trong quá trình trích ly Loại acid Citric Acetic Phương pháp Thời gian Toàn phần Từng phần Toàn phần Từng phần 24 4,55 4,55 26,14 26,14 48 12,95 14,32 45,68 48,41 72 15,23 20,00 68,18 77,73 Nhận xét Thời gian trích: hiệu suất trích collagen đồng biến theo thời gian đối với cả 2 loại acid. Phương pháp trích: ở mỗi loại acid, lượng collagen thu được theo phương pháp trích từng phần cao hơn so với phương pháp trích toàn phần. Loại acid: từ đồ thị ta thấy Acetic acid thích hợp cho việc trích collagen hơn vì nó cho hiệu suất cao hơn rất nhiều so với Citric acid. Đánh giá tính chất sản phẩm Xác định sự bền nhiệt của collagen (Thermal stability) Phương pháp đo độ nhớt (Phụ lục 8) Hình 5.7 thể hiện sự thay đổi của độ nhớt từng phần (fractional viscosity) của collagen từ da cá Basa theo sự gia tăng của nhiệt độ. Đối với cả 3 loại collagen thu được từ phương pháp trích ly bằng 3 loại acid (acetic, citric và lactic acid), đồ thị cho thấy độ nhớt của dung dịch collagen có khuynh hướng giảm khi đun nóng. Điều này có thể được giải thích do sự biến tính của collagen. Nhiệt độ biến tính, Td, được xác định là nhiệt độ mà tại đó sự thay đổi của độ nhớt đã xảy ra được một nửa. Nhiệt độ biến tính của collagen từ da cá Basa là khoảng 37,5 0C, nhiệt độ này thay đổi không đáng kể giữa collagen trích bằng các loại acid khác nhau. Nhiệt độ ghi nhận được trong thí nghiệm này là tương đối cao so với nhiệt độ biến tính của collagen thu được từ những loài cá khác đã được báo cáo trong các nghiên cứu trước đây. Nguyên nhân lý giải cho điều này là do điều kiện môi trường sống của cá có ảnh hưởng đến cấu trúc da và qua đó ảnh hưởng lên tính chất của collagen. Collagen thu được từ các loài cá khác nhau sẽ có khả năng bền nhiệt khác nhau. Nhiệt độ (0C) Độ nhớt (cP) 30 136 32,5 128,2 35 125,6 37,5 115,1 40 99,4 42,5 78,5 45 70,6 47,5 54,9 50 47,1 Td Td Td Nhiệt độ (0C) Độ nhớt (cP) 30 125,6 32,5 115,1 35 99,4 37,5 83,7 40 66,3 42,5 54,9 45 42,8 47,5 34,9 50 32,3 Nhiệt độ (0C) Độ nhớt (cP) 30 141,3 32.5 123 35 106,4 37.5 96,8 40 89,8 42.5 75,9 45 62,8 47.5 55,8 50 53,2 Hình 5.5 Đường cong biến tính theo nhiệt độ của collagen Phương pháp DTA/TG (Phụ lục 9) Đường phân tích nhiệt DTA/TG của collagen trích bằng acetic acid Đường phân tích nhiệt DTA/TG của collagen trích bằng citric acid Đường phân tích nhiệt DTA/TG của collagen trích bằng lactic acid Hình 5.6 Đường phân tích DTA/TG của collagen Nhìn chung, đường phân tích nhiệt của collagen trích bằng 3 loại acid có xu hướng giống nhau. Đường biểu diễn của collagen (trích bằng acetic acid) có 2 peak gần sát với collagen (trích bằng lactic acid, xem như là mẫu đối chứng). Độ sạch của các collagen sau khi tinh chế là tương đối cao, nhiệt độ phân hủy vào khoảng 119,2 0C. Mẩu collagen trích bằng citric acid có lẫn tạp chất, không tinh khiết bằng collagen trích từ 2 loại acid còn lại. Nguyên nhân có thể là do các tinh thể citric chưa được thẩm tích hết. Sự hình thành sợi của collagen (Phụ lục 10) a Thời gian (phút) Collagen hòa tan Gelatin 0 0,1357 0,0046 2 0,1363 0,0046 4 0,1377 0,0046 6 0,1422 0,0046 8 0,1446 0,0046 10 0,1463 0,0046 12 0,1529 0,0046 14 0,1565 0,0046 16 0,1603 0,0046 18 0,1623 0,0046 20 0,1637 0,0046 22 0,1645 0,0046 24 0,1660 0,0046 26 0,1660 0,0046 28 0,1660 0,0046 30 0,1660 0,0046 b Thời gian (phút) Collagen hòa tan Gelatin 0 0,0087 0,0046 2 0,0095 0,0046 4 0,0105 0,0046 6 0,0114 0,0046 8 0,0136 0,0046 10 0,0141 0,0046 12 0,0149 0,0046 14 0,0149 0,0046 16 0,0149 0,0046 18 0,0149 0,0046 20 0,0149 0,0046 22 0,0149 0,0046 24 0,0149 0,0046 26 0,0149 0,0046 28 0,0149 0,0046 30 0,0149 0,0046 c Thời gian (phút) Collagen hòa tan Gelatin 0 0,0558 0,0046 2 0,0558 0,0046 4 0,0570 0,0046 6 0,0604 0,0046 8 0,0658 0,0046 10 0,0686 0,0046 12 0,0765 0,0046 14 0,0794 0,0046 16 0,0803 0,0046 18 0,0819 0,0046 20 0,0821 0,0046 22 0,0823 0,0046 24 0,0828 0,0046 26 0,0837 0,0046 28 0,0837 0,0046 30 0,0837 0,0046 Gelatin chuẩn Collagen (trích ly bằng acetic acid) Collagen (trích ly bằng lactic acid) Collagen (trích bằng citric acid) Hình 5.7 Đồ thị biểu diễn độ đục của collagen trích ly bằng acetic acid (a), citric acid (b) và lactic acid (c) theo thời gian Nhận xét Dựa vào đồ thị trên, ta thấy cường độ hấp thụ của dung dịch collagen đồng biến với thời gian. Độ hấp thụ A tăng nhanh trong khoảng 10 phút đầu tiên, sau đó tốc độ tăng chậm lại và có khuynh hướng duy trì ổn định sau một khoảng thời gian nhất định. Theo thời gian dung dịch collagen trở nên đục chúng tỏ có sự hình thành sợi xảy ra trong dung dịch. Trong khi đó, cường độ quang của dung dịch gelatin không thay đổi theo thời gian vì không có sự tạo sợi diễn ra. Collagen thu được từ quá trình trích ly sử dụng acetic acid có độ hấp thụ quang học lớn nhất so với collagen trích ly bằng citric và lactic acid Þ sự hình thành sợi diễn ra mạnh mẽ nhất đối với collagen trích ly bằng acetic acid. Cấu trúc bề mặt của collagen Kết quả phân tích Sự khác biệt về hình thái bề mặt của collagen so với mẫu gelatin chuẩn được quan sát thông qua hình chụp bằng phương pháp SEM. Dưới đây là hình ảnh SEM của collagen thu được từ da cá Basa và của mẫu gelatin chuẩn Hình 5.8 Hình thái bề mặt của A. collagen trích bằng acetic, B. collagen trích bằng citric, C. collagen trích bằng lactic và D. gelatin chuẩn Nhận xét Có sự khác biệt rất rõ ràng giữa cấu trúc của collagen và gelatin. Dựa vào hình trên ta thấy collagen có cấu trúc mạng lưới sợi với bề mặt nhám, xù xì. Trái lại, mẫu gelatin với bề mặt trơn phẳng hơn do nó không có cấu trúc mạng lưới như collagen. Cấu trúc bề mặt của collagen là giống nhau đối với cả 3 loại acid dùng trong quá trình trích ly. Phổ hồng ngoại IR Kết quả phân tích (Phụ lục 11) Phổ hồng ngoại của collagen thu đươc từ da cá Basa bằng quá trình trích ly của 3 loại acid được thể hiện qua những biểu đồ dưới đây. Phổ IR của collagen trích ly từ da cá Basa (sử dụng citric acid) Phổ IR của collagen trích ly từ da cá Basa (sử dụng acetic acid) Phổ IR của collagen trích ly từ da cá Basa (sử dụng lactic acid) Hình 5.9 Phổ IR của collagen Bảng 5.6 Vị trí các đỉnh (peak) trong phổ IR của collagen hòa tan trong acid từ da cá Basa Vùng Wavenumber (cm-1) Collagen (acetic) Collagen (citric) Collagen (lactic) Amide A 3449 3432 3459 Amide B 2925 2627 2925 Amide I 1619 1637 1645 Amide II 1560 1543 Amide III 1241 1226 1226 So sánh với collagen thu được từ các nghiên cứu khác Hình 5.10 Phổ FTIR của collagen thu được từ cá rô non và trưởng thành (young and adult Nile perch) Bảng 5.7 So sánh vị trí các đỉnh trong phổ hồng ngoại của collagen trích ly từ da cá Basa, cá rô (Lates niloticus) và cá ngừ (Thunnus albacares) Vùng Wavenumber (cm-1) Cá Basa Cá rô non Cá rô trưởng thành Cá ngừ Acetic Citric Lactic Amide A 3449 3432 3459 3434 3458 3427 Amide B 2925 2627 2925 2924 2926 Amide I 1619 1637 1645 1650 1654 1651 Amide II 1560 1543 1542 1555 1544 Amide III 1241 1226 1226 1235 1238 1240 Nhận xét Những vùng amide (bao gồm A, B, I, II và III) của collagen từ da cá Basa là tương đương nhau khi so sánh giữa 3 loại acid được sử dụng cho quá trình trích ly. Collagen thu được từ da cá Basa theo phương pháp trích ly bằng acid thể hiện kết quả phổ IR giống với phổ tu được từ những loại collagen khác (so sánh với collagen thu được từ những quy trình đã được công bố). Vùng amide I, II và III có liên quan trực tiếp đến hình dạng của chuỗi polypeptide. Nhóm amide A (3400 ¸ 3440 cm-1) liên hệ với mũi kéo N – H. Nhóm amide I (1600 ¸ 1660 cm-1) biểu thị stretching vibration của các gốc carbonyl trong các peptide, nó là thành phần quan trọng nhất trong việc khảo sát cấu trúc bậc hai của các protein. Nhóm amide II (~ 1550 cm -1) biểu thị NH bending và CN stretching. Nhóm amide III (1220 ¸ 1320 cm-1) biểu diễn CN stretching và NH, có liên quan đến cấu trúc chuỗi xoắn ốc của collagen. Trong phổ hồng ngoại thu được từ collagen của cá Basa, tất cả các đỉnh tương ứng với các dải amide trên được biểu diễn ở các bước sóng tương tự như đối với collagen từ 2 loài cá đã được nghiên cứu (cá rô và cá ngừ). Đỉnh amide I của collagen từ cá Basa có tần suất thấp hơn so với cá rô và cá ngừ. Tần suất của collagen trích bằng acetic acid nhỏ hơn so với collagen trích bằng citric và lactic acid. Vùng amide I có mối liên hệ đến mức độ tương tác giữa các phân tử collagen. Nó còn là thành phần của các chuỗi ngẫu nhiên (random coil). Từ đó ta có thể đưa ra kết luận: Collagen trong da cá Basa có ít các liên kết liên phân tử nên dễ dàng được hòa tan bằng acid hơn cá rô và cá ngừ. Acetic là dung môi trích ly hữu hiệu nhất trong 3 loại acetic, citric và lactic acid. CHƯƠNG 6 NHẬN XÉT – BÀN LUẬN Nhận xét trên nguồn nguyên liệu Cá Basa là loài cá tăng trưởng nhanh, giàu dinh dưỡng và có giá trị xuất khẩu cao. Ở nước ta, đặc biệt là vùng Đồng bằng sông Cửu Long, việc nuôi cá Basa rất phát triển. Mặt hàng xuất khẩu chủ yếu là fillet cá, lượng xuất khẩu khoảng 30.000 ¸ 35.000 tấn fillet/năm. Trong quá trình chế biến cá, da là nguồn phụ phẩm chiếm khối lượng khoảng 0,5%. Như vậy, ta có khoảng 1.500 ¸1.750 tấn da/năm. Nếu được tận dụng làm nguồn nguyên liệu dùng trong việc sản xuất collagen thì giá trị kinh tế của da cá Basa, vốn dĩ trước đây chỉ làm thức ăn gia súc hay phân bón, sẽ được nâng lên. Về mặt cấu tạo, da cá Basa cũng có lớp biểu bì (epidermis) và lớp bì (dermis) như da người nên collagen có nguồn gốc từ da cá được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống. Nhận xét trên quy trình thí nghiệm Quy trình thí nghiệm gồm các khâu chính như sau: Khâu 1: Xử lý da, da tươi được mua từ Công ty TNHH Thuỷ Sản Bình An, Khu công nghiệp Trá Nóc, TP. Cần Thơ, trải qua các giai đoạn xử lý bao gồm loại béo, tẩy màu. Sau khi xử lý, da được trữ trong tủ đông ở nhiệt độ khoảng – 20 0C cho đến khi được sử dụng cho các bước tiếp theo. Khâu 2: Trích chiết collagen, sử dụng acetic acid để lấy collagen từ da cá đã xử lý. Khâu 3: Tinh chế collagen, collagen được kết tinh và lấy ra khỏi dịch trích bằng phương pháp ly tâm. Quy trình thí nghiệm có thể tóm tắt bằng sơ đồ khối như sau: Da nguyên liệu Loại béo Tẩy màu 1 % 4 h F 1:17,5 g/ml 30 0C Trích ly mướt 30 g 0,5M 24 h 3 lần F 1:6 g/ml 4 0C Tinh chế Collagen thành phẩm Hình 6.1 Quy trình sản xuất collagen từ da cá Một điểm bất lợi cần phải đề cập đến của collagen trích ly từ da cá đó là sự lưu tồn dai dẳng của màu và mùi hôi của cá. Do đó, cần phải có giai đoạn xử lý da cá để loại bỏ các chất béo gây mùi hôi và các sắc tố để có thể thu được collagen không màu và không mùi. Quy trình loại béo Áp dụng quy trình của Gudmundsson và Hafsteinsson (1997), da cá được xử lý 3 lần với mỗi loại dung dịch sau 0,2 % NaOH, 0,2 % H2SO4 và 0,7% citric acid. Da sau khi xử lý không còn mùi hôi. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là quy trình khá phức tạp và tốn sức. Da cá được xử lý trải qua một loạt dung dịch, sau mỗi lần xử lý da phải được rửa sạch đến khi pH đạt bằng 7. Đây chính là phần tiêu tốn nhiều thời gian nhất của quy trình. Đồng thời, một lượng collagen trong da bị mất đi sau khi trải qua xử lý. Tuy nhiên, nếu loại bỏ các hợp chất non-collagen chỉ với dung dịch NaOH thì da vẫn còn rất hôi và nhớp nháp. Tất cả các dung dịch dùng trong quá trình xử lý được thêm vào 0,5% chất hoạt động bề mặt LaSNa nhằm làm tăng hiệu quả của quá trình loại mùi. Quy trình tẩy màu Áp dụng quy trình của Kolodziejska et al. (1999), nhìn chung các sắc tố đã được loại một cách khá tương đối. Độ trắng của da cá sau khi xử lý đuợc cải thiện đáng kể so với da cá ban đầu. Hai thông số quan trọng trong quá trình loại pigment của da cá là nồng độ H2O2 và thời gian tẩy màu. Một điểm cần chú ý là màu phụ trong quá trình xử lý. Nếu ngâm da cá quá lâu thì da sẽ bị ngả màu vàng. Quy trình trích ly So sánh tác chất trích ly Trong quy trình trích ly có sử dụng 2 loại acid là acetic và citric acid. Hiệu suất của quá trình trích ly sử dụng acetic acid cao hơn gấp nhiều lần so với sử dụng citric acid. Dịch collagen thu được khi trích ly bằng acetic acid gần như không màu, trong khi đó nếu trích bằng citric acid thì dịch trích có ánh màu hơi vàng. Một đặc điểm nổi trội nữa của acetic đó là ta có thể thu được collagen tinh khiết từ dung dịch collagen trong acetic bằng phương pháp sấy lạnh. Đối với trường hợp collagen trong dung dịch citric acid, sản phẩm của quá trình sấy lạnh không những chỉ có collagen mà còn lẫn các hạt tinh thể của citric. Do đó, thẩm tích để loại tinh thể citric là một việc làm cần thiết để collagen trích ly được có thể dùng cho những ứng dụng xa hơn nữa. Theo các nghiên cứu đã công bố, lactic acid cho hiệu suất trích ly cao, khoảng 90%. Trong dung dịch lactic acid, collagen được hoà tan hoàn toàn sau khi trích ly 24 h. Tuy nhiên, giá thành của lactic acid tương đối cao so với acetic acid. Từ đó có thể kết luận, acetic acid là dung môi lý tưởng nhất cho quá trình trích ly collagen từ da cá Basa. Quá trình trích ly collagen từ da cá Basa chủ yếu sử dụng các acid hữu cơ như acetic, citric hay lactic. Các acid vô cơ là những acid mạnh, chẳng hạn như HCl, có pH thấp làm giảm khả năng hoà tan của collagen vào trong dung dịch do đó hiệu suất trích ly không cao. Điều này được lý giải là do những nhóm amine mang điện tích dương của protein tạo liên kết với anion Cl-, làm cấu trúc sợi của collagen chặt chẽ hơn, khả năng tạo liên kết với nước bị hạn chế làm cho sự hoà tan của collagen giảm. Ở pH nhỏ hơn 2 các protein bị biến tính. Sợi collagen co lại làm cho sự hydrat hoá không thể xảy ra do giữa các đại phân tử có ít không gian cho phân tử nước. Các thông số quan trọng trong quá trình trích ly Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly chẳng hạn như loại acid, phương pháp trích ly, thời gian trích, tỉ lệ nguyên liệu : dung môi trích ly,… Kích cỡ nguyên liệu và tỉ lệ nguyên liệu : dung môi được xem là hai thông số quan trọng bởi vì quá trình tiếp xúc giữa hai pha rắn – lỏng càng tốt khi bề mặt tiếp xúc pha càng lớn. Nguyên liệu có kích thước nhỏ sẽ làm tăng diện tích tiếp xúc pha làm quá trình trích ly xảy ra hoàn toàn, ngược lại thì trích ly sẽ bị hạn chế do không có sự tiếp xúc tốt giữa hai pha. Tỉ lệ da : dung dịch acid lớn thì da sẽ phân tán đều trong dung dịch, nếu lượng acid quá ít thì bề mặt da không được tiếp xúc hoàn toàn với dung dịch, trích ly không hoàn toàn. Thông số thời gian quyết định hiệu suất trích ly. Nếu thời gian ngắn thì collagen hòa tan vào acid chưa nhiều nên hiệu suất thấp. Tuy nhiên, thời gian quá dài cũng không tốt vì mạch collagen có thể bị cắt sâu xuống hình thành gelatin. Trong đề tài luận văn này, quy trình trích ly còn tương đối đơn giản, chỉ có sự hỗ trợ của sự khuấy gián đoạn. Do đó, hiệu suất thu được vẫn chưa cao lắm, collagen chưa hoà tan hoàn toàn. Ta có thể nâng cao hiệu suất trích ly collagen bằng cách tiền xử lý cơ học, hóa học hay enzyme. Nguyên liệu cần được xay nhỏ để tăng khả năng tiếp xúc với dung dịch. Đồng thời trong quá trình trích ly cần kết hợp với sự khuấy trộn cơ học. Sự khuấy nhằm giúp cho sự hoà trộn giữa nguyên liệu và dung môi được tốt hơn và cung cấp năng lượng cho quá trình trích ly. Một phương pháp nữa để làm tăng lượng collagen trích ly được là áp dụng sự tiền xử lý với enzyme. Các enzyme thường được sử dụng như pepsin, trypsin, pancreatin, ficin, bromelin hay papain. Các enzyme này chỉ cắt bỏ những phần đầu mút không xoắn ốc (telopeptide) của collagen. Chính nhờ sự cắt đứt các telopeptide này đã làm đứt các liên kết giữa các phân tử do đó làm tăng khả năng hoà tan của collagen. Mức độ gia tăng của sự hoà tan collagen tuỳ thuộc vào từng loài cá. Collagen trong da của một số loài cá có thể hoà tan hoàn toàn trong dung dịch acetic acid sau khi xử lý enzyme. Tuy nhiên, ở một số loài khác, hiệu suất trích ly sau khi xử lý với enzyme chỉ tăng khoảng 5%. Sự khác biệt này được gây ra bởi sự khác nhau về vị trí cũng như loại liên kết liên phân tử của các loài cá. Đánh giá kết quả Quá trình tẩy màu Qua quá trình khảo sát, điều kiện thích hợp rút ra cho quá trình tẩy màu là: Nồng độ H2O2 1 % Thời gian tẩy màu 4 h Tỉ lệ da : dung dịch 1:17,5 g/ml Nhiệt độ 30 0C Thời gian là thông số quan trọng nhất ảnh hưởng đến quá trình tẩy màu. Trong khoảng thời gian 4 giờ đầu tiên, khả năng tẩy màu của dung dịch H2O2 đồng biến theo thời gian. Thời gian tăng thì độ trắng, sáng của da cá tăng theo và đạt giá trị cực đại tại 4 0C. Sau đó, độ trắng có khuynh hướng giảm xuống và duy trì cho đến 24 h. Hai thông số quan trọng tiếp theo là nồng độ H2O2 và tỉ lệ da : dung dịch. Giữa các mức giá trị của 2 thông số vừa nêu, độ trắng của da cá chênh lệch nhau không quá nhiều. Trong số đó thì nồng độ H2O2 và tỉ lệ 1:17,5 cho kết quả khả quan nhất. Quá trình trích ly Loại acid sử dụng có ảnh hưởng rõ rệt lên hiệu suất trích ly. Hiệu suất trích ly bằng acetic cao hơn so với citric. Khi thời gian trích ly tăng, lượng collagen hoà tan tăng nên hiệu suất cao. Ta chỉ khảo sát 3 mốc thời gian 24, 48 và 72 h mà không khảo sát trong khoảng thời gian lâu hơn nữa vì collagen có thể bị cắt mạch mạnh xuống thành gelatin. Còn nếu thời gian quá ngắn thì không đủ để cho acid lôi kéo collagen. Phương pháp trích ly từng phần với 3 lần trích ly trên cùng một lượng da, mỗi lần 24 h cho kết quả khả quan hơn phương pháp trích ly toàn phần thực hiện 1 lần trong 72 h. Nguyên nhân có thể là do nếu chỉ sử dụng cùng một lượng dung dịch acid trong một khoảng thời gian dài thì dung dịch có thể bị bão hoà không hoà tan được thêm collagen nữa. Nếu thay đổi dung dịch nhiều lần thì có thể trích ly triệt để hơn lượng collagen có trong da cá. Tuy nhiên, sự chênh lệch giữa 2 phương pháp này không nhiều lắm. Điều kiện tối ưu cho quá trình trích ly thông qua khảo sát có được là: Loại acid Acetic acid Thời gian trích ly 72 h Phương pháp trích ly Từng phần Nồng độ acid 0,5M Nhiệt độ trích ly 4 0C Tỉ lệ da : acid 1:6 g/ml Đánh giá tính chất sản phẩm Nhiệt độ biến tính (Denaturation temperature) Nhiệt độ biến tính của collagen từ da cá Basa là khoảng 37,5 0C, cao hơn so với collagen tu được từ những loài cá đã được nghiên cứu như cá tuyết (15 0C), cá thu (26,1 0C), cá chép (32,5 0C), cá rô (36,5 0C). Nhiệt độ biến tính cao của collagen từ da cá Basa là do cấu trúc da của nó có chứa nhiều thành phần imino acid (proline và hydroxyproline). Hàm lượng imino acid, đặc biệt là hydroxyproline, phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường sống của cá và nó có ảnh hưởng lên sự bền nhiệt của collagen. Collagen có nguồn gốc từ các loài cá sống trong môi trường nước lạnh có thành phần hydroxyproline thấp hơn so với những loài sống ở vùng nước ấm. Các imino acid, proline và hydroxyproline, có trong các liên kết hydrogen giữa các chuỗi. Các liên kết này góp phần làm ổn định cấu trúc chuỗi xoắn ốc của collagen. Cá Basa là loài cá sống ở vùng nước ấm nên có chứa nhiều hydroxyproline nên nhiệt độ biến tính cao. Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất của collagen Độ tuổi của động vật Độ tuổi của cá ảnh hưởng đến các mô liên kết cũng như số lượng, chất lượng của các protein cơ bản của nó. Số lượng liên kết trong collagen gia tăng theo độ tuổi. Tuy nhiên, phần lớn các mô liên kết trong cá được tái tạo hàng năm và các protein có cấu trúc với nhiều liên kết không được tìm thấy trong cá. Collagen từ những động vật còn non dễ được trích ly hơn nhưng cho cấu trúc có độ bền thấp. Ngược lại, collagen từ động vật trưởng thành khó hoà tan hơn và cấu trúc của nó có độ bền cao. Chế độ ăn uống Ở một số loài cá, lượng collagen và số lượng liên kết trong nó gia tăng cùng với sự thiếu thốn thức ăn. Theo nghiên cứu, những con cá thiếu ăn sẽ sản sinh ra nhiều collagen, đặc biệt là collagen có nhiều liên kết, hơn là những con được ăn uống đầy đủ. Thành phần imino acid Khả năng bền nhiệt của collagen liên quan đến thành phần imino acid (proline và hydroxyproline). Thành phần imino acid càng cao thì cấu trúc chuỗi xoắn ốc của collagen càng ổn định. Thành phần proteoglycan và glycoprotein cũng ảnh hưởng đến sự bền nhiệt của collagen. Sự hình thành sợi của collagen Collagen có thể kết hợp lại tạo thành sợi dưới những điều kiện sinh lý học. Quá trình tái tạo sợi trong quy mô phòng thí nghiệm có thể chia ra làm 3 bước bao gồm giai đoạn khơi mào phụ thuộc và nhiệt độ, giai đoạn phát triển phụ thuộc nhiệt độ và giai đoạn phát triển không phụ thuộc nhiệt độ. Những loại collagen khác nhau với những cấu trúc khác nhau của các chuỗi xoắn ốc ảnh hưởng đến thời gian và mức độ tạo sợi. Những quy trình điều chế khác nhau của cùng một loại collagen cũng cho những đáp ứng và điều kiện khác nhau trong quá trình tạo sợi. Sự tái tạo sợi của collagen chịu ảnh hưởng của loại collagen, phương pháp trích ly và điều kiện trong quá trình tạo sợi (chất đệm, nhiệt độ và nồng độ protein,…). Gelatin được điều chế ở điều kiện nhiệt độ cao, các nhóm amide bị thuỷ phân và cấu trúc chuỗi xoắn ốc collagen bị phá huỷ. Cấu trúc của gelatin không có trật tự và khối lượng phân tử phân bố trong một khoảng rộng là cho sự tái tạo sợi không thể xảy ra. Thêm vào đó, sự tổ hợp của các đơn phân collagen trong quá trình tạo sợi liên quan đến sự tương tác tĩnh điện, kỵ nước qua lại giữa các chuỗi collagen. Quá trình điều chế collagen dựa vào sự gia tăng của các điện tích âm, điều này góp phần làm cho sự tương tác giữa các phân tử khó khăn do lực đẩy giữa các điện tích âm. Do đó, gelatin không có khả năng hình thành sợi. Phổ hồng ngoại của collagen IR là phương pháp đo chiều dài sóng và cường độ hấp thụ bức xạ hồng ngoại của mẫu. Những thành phần polypeptide và protein cho ta 9 loại dải hấp thụ là amide A, B và I – VII. Trong số đó, amide I và II là 2 dải nổi bật nhất trong chuỗi protein. Vùng phổ nhạy nhất trong thành phần cấu trúc bậc hai của protein là dải amide I (1700 ¸ 1600 cm-1), chủ yếu dựa vào nối đôi C = O trong liên kết peptide (khoảng 80 %). Phổ hồng ngoại của collagen trích ly từ da cá Basa bằng acetic acid phản ánh sự hiện diện của dải amide A (3449 cm-1), amide B (2925 cm-1), amide I (1619 cm-1), amide II (1560 cm-1) và amide II (1241 cm-1). Dải amide I có liên đới với cấu trúc bậc hai của protein và amide chứng minh sự có mặt của cấu trúc chuỗi xoắn ốc. kết quả phổ IR cho thấy có cấu trúc xoắn ốc trong collagen thu được từ da cá Basa. Sản phẩm phụ của quy trình sản xuất collagen từ da cá Basa Sản phẩm chính của quy trình là collagen hoà tan trong acid (acid soluble collagen ASC). Phần dư còn lại còn chứa một lượng collagen và được xem như là collagen không hoà tan (insoluble collagen). Thay vì làm tan rã và chuyển thành vật liệu hòa tan, collagen với nhiều liên kết ngang có thể được phân tán thành những huyền phù sợi màu trắng sữa bằng những tác nhân biến tính nhẹ hoặc làm vụn bằng phương pháp cơ học ở điều kiện pH acid. Sợi collagen bền hơn với sự thủy phân so với những thành phần khác trong mô không phải là collagen, được tách khỏi trong suốt quá trình thủy phân và rửa. Trong những bước xử lý được bổ sung thêm vào, vật liệu collagen có thể được dùng cho những ứng dụng hóa học như sự acetyl hóa, sự methyl hóa hoặc có thể dùng để gắn kết với các polymer khác. Hình 6.2 Kết quả đo kích thuớc hạt của insoluble collagen xử lý bằng acetic acid Hình 6.3 Kết quả SEM của insoluble collagen xử lý bằng 3 loại acid A. Acetic acid, B. Citric acid, C. Lactic acid Kết luận – kiến nghị Kết luận Collagen là một loại protein cấu trúc chính của cơ thể, có rất nhiều chức năng trong cơ thể con người. nó có phạm vi ứng dụng rộng rãi trong những ngành quan trọng như y học, công nghiệp và trong mỹ phẩm. Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu trong việc tìm ra các nguồn thay thế nhằm đáp ứng nhu cầu collagen của thị trường. Những phụ phẩm từ cá đã được chứng minh là nguồn thay thế lý tưởng nhất cho việc cung cấp collagen. Cá Basa là loài cá phổ biến ở Việt Nam, có giá trị kinh tế cao với sản lượng nuôi và xuất khẩu lớn. Da là một nguồn phế phẩm của ngành công nghiệp chế biến thủy, hải sản với một khối lượng khổng lồ. Việc tận dụng nguồn phế phẩm này để điều chế collagen góp phần đem lại hiệu quả kinh tế. Trong phạm vi khảo sát của luận văn này, có thể rút ra điều kiện tối ưu cho quá trình trích chiết như sau: acetic acid là loại acid tốt nhất cho quá trình trích ly collagen từ da cá Basa. Các mức giá trị cho kết quả khả quan nhất của các thông số như nồng độ acid, tỉ lệ da : dung dịch, nhiệt độ, thời gian lần lượt là 0,5 M, 1 : 6 g/ml, 4 0C và 72 h. Phương pháp trích ly từng phần cho hiệu suất cao hơn. Kiến nghị Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn cũng như máy móc, thiết bị còn thiếu thốn nên không thể khảo sát hết tất cá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly collagen từ da cá Basa. Do đó, tôi đề nghị một số nghiên cứu cần khảo sát như sau : Khảo sát nồng độ acid, tỉ lệ da : acid Khảo sát nhiệt độ trích ly Khảo sát quá trình trích ly collagen từ xương cá Basa Khảo sát tính năng, thăm dò ứng dụng của sản phẩm collagen TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Wolfgang Friess, U.o.E., Erlangen, Germany, Collagen - biomaterial for drug delivery. 1997. 2. Fratzl, P., Collagen Structure and Mechanics. 2008. 3. Frederic M.Richards, D.S.E., John Kuriyan, Advances in Protein Chemistry. 2005. Fibrous Proteins Coiled-Coils, Collagen and Elastomers, Volume 70 4. A.de Meijere, K.N.H., Collagen Primer in Structure, Processing and Assemblyics. 2005. Topics in Current Chemistry. 5. Garg, F.H.S.a.A.K., Handbook of Biodegradable Polymers. Collagen: Characterization, Processing and Medical Applications. 6. Shuai Zhao, M.Z., Guoying Li, Preparation of collagen from the pigskin shavings by alkali extraction. 7. Rume Sakai, S.I., Toshizo Isemura, Soluble collagen of chicken leg tendon; Its denaturation temperature and Hydrodynamic properties. 1967. 8. Nagai, T., Collagen from diamondback squid. 2003. 9. Maria Sadowska, I.K.o., Celina Niecikowska, Isolation of collagen from the skins of Baltic cod (Gadus morhua). 2002. 10. L.S. Senaratne, P.-J.P., Se-Kwon Kim, Isolation and characterization of collagen from brown backed toadfish (Lagocephalus gloveri) skin. 2005. 11. Food and Agricultural Organisation - Food and Nutrition Paper. 14/7/1986. 12. N.Yu. Ignat'eva, N.A.D., Determination of Hydroxyproline in Tissues and the Evaluation of the Collagen Content of the Tissues. 2005. 13. Elzbieta Skierka, M.S., The influence of different acids and pepsin on the extractability of collagen from the skin of Baltic cod. 2006. 14. J.H. Muyonga, C.G.B.C., K.G. Duodu, Characterisation of acid soluble collagen from skins of young and adult Nile perch (Lates niloticus). 2003. 15. Phanat Kittiphattanabawon, S.B., Wonnop Visessanguan, Takashi Nagai, Munehiko Tanaka, Characterisation of acid-soluble collagen from skin and bone of bigeye snapper (Priacanthus tayenus). 2004. 16. Jin-Wook Woo, S.-J.Y., Seung-Mock Cho, Yang-Bong Lee, Seon-Bong Kim, Extraction optimization and properties of collagen from yellowfin tuna (Thunnus albacares) dorsal skin. 2007. 17. V. Vijayasundaram, V.R. and P.R. Palaniappan, The study of the changes in the thermal properties of Labeo rohita bones due to arsenic exposure. 2009. 18. Yun Shana, Y.Z., Yong Caoa,Qunhua Xua, Huangxian Jub, Zonghan Wuc, Preparation and infrared emissivity study of collagen-g-PMMA/In2O3 nanocomposite. 2003. 19. HaiYing Liu, D.L., ShiDong Guo, Studies on collagen from the skin of channel catfish (Ictalurus punctaus). 2006. 20. S.Rama, G.C., Physico - chemical characterisation and molecular organisation of hte collagen from the skin of an air - breathing fish (Ophiocephalus striatus). 1983. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc của phân tử collagen (triple helix) 2 Hình 1.2 Sự hình thành chuỗi xoắn ốc nội phân tử và giữa các chuỗi polypeptide 2 Hình 1.3 Cấu trúc của procollagen và sự chuyển từ procollagen sang tropocollagen 4 Hình 1.4 Cấu trúc sợi của collagen 4 Hình 1.5 Quá trình tổ hợp tạo sợi của các phân tử collagen 5 Hình 1.6 Sự sắp xếp của phân tử collagen trong một sợi 6 Hình 1.7 Hình ảnh của bó sợi (a) và sợi (b) collagen 7 Hình 1.8 Một vài dạng sinh học của collagen 8 Hình 1.9 Keo dán collagen 10 Hình 1.10 Collagen dùng trong phẫu thuật thẩm mỹ 11 Hình 1.11 Collagen áp dụng trong việc điều trị vết bỏng 12 Hình 1.12 Sự lão hóa da 14 Hình 1.13 Tác dụng chống lão hóa của collagen 16 Hình 1.14 Tác dụng trị sẹo mụn của collagen 16 Hình 1.15 Bột collagen sản xuất từ da và vảy cá 18 Hình 1.16 Collagen dạng gel 18 Hình 1.17 Collagen EX 19 Hình 1.18 Collagen Update 19 Hình 1.19 Ediva collagen……………………………………………………………………20 Hình 1.20 Viospring collagen active essence 20 Hình 1.21 Collagen essential mask sheet 21 Hình 2.1 Quy trình trích ly collagen từ da heo 22 Hình 2.2 Quy trình trích ly collagen từ gân chân gà 23 Hình 2.3 Quy trình trích ly collagen từ da mực 24 Hình 2.4 Quy trình trích ly collagen từ da cá tuyết 25 Hình 2.5 Đồ thị so sánh khả năng hấp thụ vào máu của collagen trích ly từ cá và từ lợn 29 Hình 3.1 Cá Basa 30 Hình 4.1 Quy trình loại béo 48 Hình 4.2 Quy trình tẩy màu 49 Hình 4.3 Quy trình trích ly 50 Hình 5.1 Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của nồng độ H2O2 và thời gian lên quá trình tẩy màu 56 Hình 5.2 Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của tỉ lệ da/dung dịch lên quá trình tẩy màu 58 Hình 5.3 Đồ thị biểu diễn đường chuản của độ hấp thụ theo nồng độ hydroxyproline 59 Hình 5.4 Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của loại acid, phương pháp trích và thời gian lên hiệu suất trích collagen 62 Hình 5.5 Đường cong biến tính theo nhiệt độ của collagen 64 Hình 5.6 Đường phân tích DTA/TG của collagen 66 Hình 5.7 Đồ thị biểu diễn độ đục của collagen trích ly bằng acetic acid (a), citric acid (b) và lactic acid (c) theo thời gian 68 Hình 5.8 Hình thái bề mặt của A. collagen trích bằng acetic, B. collagen trích bằng citric, C. collagen trích bằng lactic và D. gelatin chuẩn 69 Hình 5.9 Phổ IR của collagen 71 Hình 5.10 Phổ FTIR của collagen thu được từ cá rô non và trưởng thành (young and adult Nile perch) 72 Hình 6.1 Quy trình sản xuất collagen từ da cá 76 Hình 6.2 Kết quả đo kích thuớc hạt của insoluble collagen xử lý bằng acetic acid 83 Hình 6.3 Kết quả SEM của insoluble collagen xử lý bằng 3 loại acid A. Acetic acid, B. Citric acid, C. Lactic acid 84 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide 3 Bảng 1.2 Kết cấu chuỗi và sự phân bố của các loại collagen trong cơ thể người…….9 Bảng 2.1 Thành phần collagen trong thịt cá 27 Bảng 3.1 Hai vụ chính để thả cá giống vào bè 33 Bảng 3.2 Sức chịu đựng của cá Basa trong môi trường nước có độ mặn khác nhau 33 Bảng 3.3 Những điều kiện môi trường để cá Basa sống và phát triển 34 Bảng 5.1 Thành phần da cá Basa nguyên liệu 53 Bảng 5.2 So sánh thành phần giữa da nguyên liệu và da sau khi xử lý của hai quy trình 53 Bảng 5.3 Tổng lượng collagen trong da cá 59 Bảng 5.4 Kết quả lượng collagen trích bằng lactic acid 61 Bảng 5.5 Lượng collagen thu được trong quá trình trích ly 63 Bảng 5.6 Vị trí các đỉnh (peak) trong phổ IR của collagen hòa tan trong acid từ da cá Basa 72 Bảng 5.7 So sánh vị trí các đỉnh trong phổ hồng ngoại của collagen trích ly từ da cá Basa, cá rô (Lates niloticus) và cá ngừ (Thunnus albacares) 73