Đề tài Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố định tế bào nấm men rượu vang

ÑAÏI HOÏC QUOÁC GIA TPHCM TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC BAÙCH KHOA KHOA COÂNG NGHEÄ HOÙA HOÏC –˜™—–˜™— ÑOÀ AÙN MOÂN HOÏC COÂNG NGHEÄ THÖÏC PHAÅM TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU VEÀ CAÙC PHÖÔNG PHAÙP COÁ ÑÒNH TEÁ BAØO NAÁM MEN RÖÔÏU VANG SVTH : PHAÏM THÒ HOÀNG NGA CBHD: THS.TOÂN NÖÕ MINH NGUYEÄT BOÄ MOÂN : COÂNG NGHEÄ THÖÏC PHAÅM Naêm hoïc 2006-2007 Nhaän xeùt cuûa giaùo vieân höôùng daãn Muïc luïc Muïc luïc baûng Baûng I.1 Caùc ñaëc tính mong muoán cuûa naám men vang [15] 8 Baûng III.1 Keát quaû kieåm tra muøi vaø vò cuûa röôïu saûn xuaát töø teá baøo Saccharomyces cerevisiae coá ñònh treân mieáng taùo trong suoát quaù trình leân men lieân tuïc so saùnh vôùi röôïu thöông maïi:[19] 21 Baûng III.2. Moät soá cheá phaåm polyvinyl alcohol thöông maïi 32 Baûng III.3 AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán ñoä nhôùt cuûa dung dòch 10% polyvinyl alcohol coù phaân töû löôïng laø 115.000: 34 Baûng III.4 AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä dung dòch ñeán ñoä nhôùt cuûa dung dòch polyvinyl alcohol coù phaân töû löôïng laø 115.000: 34 Baûng III.5 So saùnh phöông phaùp nhoát trong gel vaø phöông phaùp vi bao: 54 Muïc luïc hình Hình II.1 Caùc kyõ thuaät cô baûn ñeå coá ñònh teá baøo [20] 10 Hình III.1 Hiệu suaát saûn xuaát coàn ôû nhöõng nhieät ñoä leân men khaùc nhau. 17 Hình III.2 Naêng suaát rieâng cuûa vieäc saûn xuaát coàn ôû nhöõng nhieät ñoä khaùc nhau. 17 Hình III.3 Naám men coá ñònh treân mieáng taùo trong quaù trình leân men röôïu. 20 Hình III.4 Ñaù kissiris. 25 Hình III.5 Coâng thöùc caáu taïo cuûa phaân töû polyvinyl alcohol. 30 Hình III.6 Coâng thöùc caáu taïo cuûa phaân töû polyvinyl acetate. 31 Hình III.7 Möùc ñoä thuyû phaân cuûa phaân töû polyvinyl alcohol: (a) thuyû phaân hoaøn toaøn, (b) thuyû phaân moät phaàn. 32 Hình III.8 Khaû naêng hoaø tan phuï thuoäc vaøo möùc ñoä thuyû phaân vaø nhieät ñoä. 33 Hình III.9 Caáu truùc cuûa alginate: (a) caùc monomer cuûa alginate, (b) chuoãi alginate, (c) söï phaân boá caùc block [186] 42 Hình III.10 Cô cheá taïo gel cuûa alginate theo phöông phaùp taïo gel töø beân ngoaøi 43 Hình III.11 Cô cheá taïo gel cuûa alginate theo phöông phaùp taïo gel töø beân trong 44 Hình III.12. Phöông phaùp chuaån bò bao Alg(PEG) 49 Hình III.13 Heä thoáng taïo bao coá ñònh teá baøo 50 Hình III.14 AÛnh höôûng cuûa thôøi gian taïo gel leân söï hình thaønh bao Alg(PEG). Bao Alg(PEG) ñöôïc saûn xuaát baèng caùch duøng dung dòch PEG 6000 20% (w/w) chöùa 2% CaCl2 (w/w). 51 Hình III.15. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä CaCl2 leân baùn kính vaø beà daøy cuûa lôùp gel alginate cuûa bao Alg(PEG). Bao ñöôïc saûn xuaát baèng caùch duøng dung dòch PEG 6000 30% (w/w) chöùa 2% CaCl2 . 51 Hình III.16 Söï thay ñoåi noàng ñoä PEG vaø xanthan gum trong suoát thôøi gian hoaù raén. 52 Hình III.17 Löôïng bao hình caàu theo chieàu cao loå hoång trong reactor 53 Hình III.18 Biocapsule vaø hình aûnh lieân keát cuûa naám sôïi vaø naám men. 55 Hình III.19 Bieåu ñoà hoaït ñoäng cuûa heä thoáng thieát bò phaûn öùng sinh hoïc membrane moät bình 57 Hình III.20 Bieåu ñoà hoaït doäng cuûa heä thoáng thieát bò phaûn öùng sinh hoïc membrane 2 bình 58 Lôøi môû ñaàu: Nhö chuùng ta ñaõ bieát, naám men laø moät loaøi vi sinh vaät coù nhieàu öùng duïng trong coâng nghieäp vaø saûn xuaát. Moät trong nhöõng öùng duïng phoå bieán cuûa chuùng laø trong ngaønh saûn xuaát röôïu vang, moät ngaønh saûn xuaát saûn phaåm leân men coù truyeàn thoáng laâu ñôøi. Theo caùc taøi lieäu coå, röôïu vang coù xuaát xöù töø caùc nöôùc AÛ Raäp vaøo khoaûng theá kyû 18 hay 19 tröôùc Coâng nguyeân vaø cho ñeán nay, röôïu vang ñaõ trôû neân phoå bieán khaép nôi treân theá giôùi. Röôïu vang ñöôïc öa thích tröôùc heát laø do höông vò heát söùc ñaëc tröng maø khoâng loaïi saûn phaåm naøo coù theå thay theá, sau ñoù laø do noù ñem laïi caûm giaùc saûng khoaùi vaø söùc khoûe cho ngöôøi uoáng. Trong thôøi kì ñaàu, röôïu vang ñöôïc taïo ra baèng quaù trình leân men töï phaùt vôùi nhöõng loaøi naám men coù saün trong dòch quaû. Daàn daàn, ngöôøi ta ñaõ bieát tieán haønh nuoâi caáy caùc chuûng naám men thuaàn thieát ñeå thuùc ñaåy quaù trình leân men vaø taêng chaát löôïng cuûa röôïu vang. Loaøi naám men ñoùng vai troø chính trong quaù trình leân men coàn saûn xuaát röôïu vang laø loaøi Saccharomyces cerevisiae. Tuy nhieân, vieäc söû duïng naám men töï do ñeå leân men gaëp phaûi moät soá vaán ñeà nhö thôøi gian leân men daøi, naêng suaát leân men thaáp, tieâu toán nhieàu naêng löôïng ñeå taùch naám men ra khoûi röôïu vang sau quaù trình leân men, … Ñeå giaûi quyeát caùc vaán ñeà naøy, nhieàu nghieân cöùu veà vieäc söû duïng naám men coá ñònh trong saûn xuaát röôïu vang ñaõ ñöôïc thöïc hieän. Caùc nghieân cöùu naøy ñeàu cho thaáy naám men coá ñònh coù nhieàu öu ñieåm hôn haún so vôùi naám men töï do nhö laø taêng toác ñoä söû duïng cô chaát, ruùt ngaén thôøi gian leân men, oån ñònh hoaït tính cuûa naám men, goùp phaàn taêng naêng suaát leân men, … Chính vì nhöõng lôïi ích veà kyõ thuaät vaø kinh teá do vieäc söû duïng naám men coá ñònh trong saûn xuaát röôïu vang mang laïi maø nhöõng nghieân cöùu veà chuùng ngaøy caøng ñöôïc môû roäng vaø thu huùt söï chuù yù nhieàu hôn. Caùc nhaø nghieân cöùu ñaõ thöïc hieän vieäc coá ñònh teá baøo baèng nhieàu phöông phaùp khaùc nhau, söû duïng chaát mang nhö nhöõng vaät lieäu voâ cô, nhöõng polisaccarit höõu cô vôùi mong muoán tìm kieám phöông thöùc coá ñònh phuø hôïp cho quaù trình leân men coàn trong saûn xuaát röôïu vang. Cô sôû ñeå ñaùnh giaù lieäu kyõ thuaät naøy coù theå öùng duïng thaønh coâng trong saûn xuaát coâng nghieäp hay khoâng thì phuï thuoäc vaøo khaû naêng caûi thieän naêng suaát leân men coàn, caûi thieän chaát löôïng, muøi vò cho saûn phaåm. Ñoàng thôøi kyõ thuaät ñoù phaûi ñaûm baûo söû duïng chaát mang phuø hôïp vôùi thöïc phaåm, phong phuù trong töï nhieân vaø hieäu quaû veà kinh teá. TOÅNG QUAN Nấm men. Ñaëc ñieåm hình thaùi vaø caáu taïo. Ñaëc ñieåm hình thaùi: [2] Teá baøo naám men coù nhieàu hình daïng khaùc nhau nhö laø hình caàu, hình ovan hoaëc elip, hình quaû chanh, hình truï, hình chuøy hoaëc ñoâi khi keùo daøi ra thaønh hình sôïi. Naám men coù theå thay ñoåi hình daùng kích thöôùc trong caùc giai ñoaïn phaùt trieån vaø ñieàu kieän moâi tröôøng xung quanh. Hình thaùi cuûa chuùng khoâng thay ñoåi chæ ôû caùc gioáng nuoâi caáy khi coøn treû trong caùc moâi tröôøng dinh döôõng tieâu chuaån. So vôùi caùc vi sinh vaät khaùc (ñoái vôùi vi khuaån chaúng haïn) teá baøo naám men coù kích thöôùc töông ñoái lôùn, ñöôøng kính khoaûng 1 µ, chieàu daøi 8 µm. Vôùi kích thöôùc naøy ta coù theå öôùc tính beà maët teá baøo naám men trong moät lít dòch leân men vaøo khoaûng 10 m2 vaø do vaäy cöôøng ñoä trao ñoåi chaát cuûa teá baøo naám men vôùi moâi tröôøng xung quanh laø voâ cuøng to lôùn. Caáu taïo teá baøo naám men : [1, 2] Naám men laø sinh vaät ñôn baøo hieån vi, teá baøo cô baûn gioáng vôùi ñoäng thöïc vaät. So saùnh teá baøo naám men vôùi vi khuaån ta thaáy coù söï tieán hoaù nhaûy voït töø nhaân sô ñeá nhaân chuaån. Cuøng vôùi söï tieán hoaù veà nhaân vaø cô cheá phaân chia nhaân (nhaân coù maøng, coù caùc theå nhieãm saéc, phaân baøo coù tô … ) ôû cô theå nhaân chuaån xuaát hieän nhieàu theå khoâng thaáy ôû theå nhaân sô nhö ti theå, luïc laïp v.v… Teá baøo naám men coù thaønh phaàn vaø caáu taïo phöùc taïp. Trong teá baøo coù caùc caáu töû – tieåu theå vaø coù theå chia thaønh: caùc cô quan noäi baøo hay cô quan töû cuûa teá baøo vaø caùc chaát chöùa trong teá baøo hay caùc theå vuøi cuûa teá baøo. Thaønh teá baøo naám men daøy khoaûng 25nm ( chieám 25% khoái löôïng khoâ cuûa teá baøo). Ña soá naám men coù thaønh teá baøo caáu taïo töø glucan vaø mannan. Moät soá naám men coù thaønh teá baøo chöùa mannan vaø kitin. Trong thaønh teá baøo coøn chöùa khoaûng 10% protein ( tính theo khoái löôïng khoâ), trong soá protein naøy coù moät phaàn laø caùc enzim. Treân thaønh teá baøo coøn thaáy coù moät löôïng nhoû lipit. Döôùi lôùp thaønh teá baøo laø lôùp maøng teá baøo chaát coù 3 taàng keát caáu khaùc nhau. Caáu taïo chuû yeáu laø protein (chieám 50% khoái löôïng chaát khoâ), phaàn coøn laïi laø lipit (40%) vaø moät ít polisaccarit. Nhaân cuûa teá baøo naám men ñöôïc bao boïc bôûi moät maøng nhaân nhö ôû caùc sinh vaät coù nhaân thaät khaùc. Maøng nhaân cuûa naám men coù caáu truùc 2 lôùp vaø coù raát nhieàu loå thuûng. Nhaân cuûa teá baøo men röôïu Saccharomyces cerevisiae coù chöùa 17 ñoâi nhieãm saéc theå. ADN trong teá baøo naám men ñôn boäi coù khoái löôïng phaân töû laø 1x1010Da, so vôùi khoái löôïng phaân töû cuûa ADN vi khuaån Escherichia coli thì lôùn hôn 10 laàn nhöng so vôùi ADN cuûa ngöôøi thì nhoû hôn 100 laàn. ÖÙng duïng trong coâng nghieäp.[1, 2] Raát nhieàu loaøi naám men ñaõ ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong saûn xuaát: coâng nghieäp saûn xuaát bia, röôïu, nöôùc giaûi khaùt, sinh khoái phuïc vuï chaên nuoâi, vaø cao naám men, lipit naám men, caùc enzim nhö laø amylaza, invertyaza, lactaza, uricaza, poligalacturonaza, saûn xuaát esgosterol, axit ribonucleic, riboflavin (vitamin B2), caùc axit amin nhö lizin, xixtein, metionin. Phaàn lôùn naám men ñöôïc söû duïng trong coâng nghieäp thuoäc gioáng Saccharomyces trong lôùp naám tuùi vaø vaøi gioáng thuoäc lôùp naám baát toaøn. Gioáng Endomyces vernalis laø moät loaøi naám men duøng trong theá chieán thöù nhaát ñeå toång hôïp chaát beùo. Gioáng Saccharomyces, quan troïng nhaát laø loaøi Saccharomyces cerevisiae, ñöôïc duøng nhieàu trong coâng nghieäp thöïc phaåm. Moät soá chuûng cuûa naám men naøy duøng laøm men nôû baùnh mì, moät soá khaùc duøng trong coâng nghieäp röôïu, bia, röôïu vang, saûn xuaát glycerin hoaëc enzim invertaza. Saccharomyces fragilis leân men ñöôøng lactoza ñoùng vai troø quan troïng trong saûn xuaát söõa vaø caùc saûn phaåm cuûa söõa. Coù leõ trong töông lai loaøi ngöôøi troâng caäy vaøo gioáng naám men naøy ñeå thu nhaän coàn tuyeät ñoái töø nhöõng nguyeân lieäu taùi taïo ñöôïc ñeå thay theá xaêng khi daàu moû ôû traùi ñaát bò caïn kieät. Gioáng Zygosaccharomyces, moät vaøi taùc giaû coi gioáng naøy laø gioáng phuï cuûa gioáng Saccharomyces. Zygosaccharomyces nusbarumeri ñöôïc tìm thaáy trong maät. Caùc loaøi naøy tham gia vaøo leân men röôïu vang vaø ñaëc bieät leân men ñaäu töông laøm thaønh moät thöù ñoà uoáng ñaëc bieät. Caùc gioáng Pichia, Hasenula, Debaryomyces … cuõng nhö caùc gioáng Mycoderma, Candida … laø nhöõng naám men khoâng hình thaønh maøng treân dòch nuoâi caáy, phaùt trieån treân beà maët caùc dòch öôùp chua döa chuoät vaø caùc loaïi rau quaû. Chuùng oxy hoùa caùc chaát höõu cô laøm giaûm ñoä chua vaø laøm taêng pH cuûa dòch öôùp. Hasenula vaø Pechia coù theå chòu ñöïng ñoä coàn cao vaø oxy hoùa röôïu etylic. Debaryomyces coù theå chòu ñöôïc muoái cao, ñaëc bieät ôû phomat coù muoái tôùi 24% vaãn thaáy men naøy phaùt trieån. Naám men taïo maøng khoâng hoaëc saûn sinh ra ít röôïu etylic töø ñöôøng. Taùc haïi cuûa naám men.[1, 2] Beân caïnh caùc naám men coù ích nhö ñaõ trình baøy ôû treân cuõng coù khoâng ít caùc naám men coù haïi, chuùng gaây ra hieän töôïng laøm hö hoûng thöïc phaåm töôi soáng hoaëc caùc thöïc phaåm cheá bieán. Coù khoaûng 13-15 loaøi naám men coù khaû naêng gaây beänh cho ngöôøi vaø cho ñoäng vaät chaên nuoâi . Ñaùng chuù yù nhaát laø caùc loaøi Candida albicans, Cryptococus neoformans, Trichosporon cutaneum, Trichosporon Capitatum … Moät soá loaøi thuoäc gioáng Zygosaccharomyces coù theå phaùt trieån ôû dòch ñöôøng noàng ñoä cao vaø laøm hoûng maät siro. Gioáng Saccharomycodes vaø Hasenula spora coù hình quaû chanh cuõng nhö caùc naám men giaû Kloekera khoâng sinh baøo töû coù teá baøo hình chuøy. Nhöõng gioáng men naøy laøm hoûng röôïu, ñaëc bieät laø maát muøi röôïu vang. Naám men röôïu vang. Söï chuyeån hoùa trong saûn xuaát röôïu vang laø moät quaù trình hoùa sinh phöùc taïp. Noù lieân quan ñeán töông taùc giöõa naám men vi khuaån vaø nhöõng loaøi vi sinh vaät khaùc. Trong nhöõng loaøi vi sinh vaät naøy thì naám men ñoùng vai troø quan troïng, kieåm soaùt quaù trình leân men coàn trong saûn xuaát röôïu vang. [7] Trong thôøi kì ñaàu saûn suaát röôïu vang, quaù trình leân men töï phaùt laø chính vôùi naám men töø 2 nguoàn goác khaùc nhau: beà maët traùi nho (töø vöôøn nho) , beà maët thieát bò (töø moâi tröôøng beân trong nhaø maùy). Vaø veà sau coù theâm moät höôùng phaùt trieån trong saûn xuaát röôïu vang laø duøng naám men töø quaù trình nuoâi caáy. Thaønh phaàn vaø chaát löôïng cuûa röôïu vang coù lieân quan chaët cheõ ñeán quaàn theå naám men. Trong quaù trình leân men, beân caïnh caùc saûn phaåm chính laø ethanol vaø CO2, naám men taïo thaønh nhieàu saûn phaåm phuï, ví duï nhö glycerin, axit acetic, axit succinic vaø ñaëc bieät laø caùc hôïp chaát höông, goùp phaàn ñaùng keå vaøo chaát löôïng cuûa röôïu vang. [16,18] Phaân loaïi. Naám men coù theå ñöôïc phaân thaønh 2 nhoùm: Thöù nhaát goïi laø non-Saccharomyces (NS – laø nhöõng loaøi naám men khoâng thuoäc gioáng Saccharomyces), thöôøng xuaát hieän treân beà maët cuûa traùi nho cuøng vôùi nhieàu loaïi vi sinh vaät khaùc. Haàu heát caùc loaøi NS khoâng coù khaû naêng toàn taïi khi noàng ñoä coàn cao hôn 6% v/v (chính vì vaäy maø caùc loaøi NS thöôøng phaùt trieån ôû giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình leân men coàn). Ngoaïi tröø Brettanomyces bruxellensis coù theå phaùt trieån trong moâi tröôøng coù noàng ñoä coàn leân ñeán 12%, loaøi naøy thích nghi toát hôn nhöõng loaøi NS khaùc, vaø noù vöôït troäi hôn nhöõng loaøi khaùc nhaát laø vaøo cuoái quaù trình leân men, chuùng goùp phaàn chính vaøo muøi vò cuûa röôïu, nhöng saûn phaåm phuï cuûa noù, phenol deã bay hôi, thì laø nguyeân nhaân gaây ra hö hoûng röôïu. Tröôùc ñaây, naám men NS ñöôïc xem laø caùc vi sinh vaät gaây hö hoûng. Tuy nhieân, nhöõng nghieân cöùu gaàn ñaây cho thaáy raèng, moät soá loaøi naám men NS coù lôïi cho chaát löôïng röôïu vang vaø goùp phaàn roõ raøng vaøo ñaëc ñieåm cuûa saûn phaåm cuoái, giuùp taêng cöôøng höông vò cuûa röôïu vang bôûi vì khaû naêng cuûa chuùng trong vieäc saûn xuaát ra nhöõng saûn phaåm phuï nhö laø glycerin, ester, aceton…. [31] Nhoùm khaùc goùp phaàn vaøo höông vò röôïu vang, cuõng laø nhaân toá chính cuûa quaù trình leân men coàn laø caùc loaøi thuoäc gioáng Saccharomyces. Saccharomyces coù khaû naêng chòu ñöïng söï thay ñoåi cuûa ñieàu kieän moâi tröôøng vôùi noàng ñoä ethanol vaø axit höõu cô taêng vaø söï caïn kieät chaát dinh döôõng (Pretorius, 2000). Nhö vaäy, maëc duø coù nhieàu gioáng vaø loaøi naám men trong dòch nho, nhöng gioáng Saccharomyces, maø chuû yeáu laø loaøi Saccharomyces cerevisiae môùi laø loaøi ñaûm nhieäm vieäc thöïc hieän caùc quaù trình chuyeån hoùa sinh hoïc quan troïng trong leân men vang. Chính vì theá, Saccharomyces cerevisiae coøn ñöôïc goïi laø “naám men vang”. [31] Ñaëc ñieåm cuûa caùc loaøi naám men röôïu vang:[2] Saccharomyces: coù baøo töû trong nan thöôøng laø 1-4 baøo töû, coù khi tôùi 8. Teá baøo cuûa chuùng coù hình daïng khaùc nhau: hình troøn, ovan, hoaëc elip. Sinh saûn baèng loái naûy choài, söû duïng ñöôøng trong quaù trình hoâ haáp vaø leân men, coù tröôøng hôïp leân men ôû dòch ñöôøng 30% vaø taïo ñöôïc 18ocoàn. Khoâng ñoàng hoùa ñöôïc muoái nitrat. Gioáng Sacharomyces coù tôùi 18 loaøi nhöng chæ coù 7 loaøi thöôøng gaëp trong nöôùc quaû. Caùc loaøi naám men khoâng sinh baøo töû thöôøng gaëp trong nöôùc quaû vaø khaû naêng leân men hoaëc tieâu hao ñöôøng trong ñoù, phoå bieán laø Kloeckera, Torulopsis. Ngöôøi ta thöôøng goïi chuùng laø men daïi. Sau ñaây laø moät soá loaøi naám men thöôøng gaëp trong quaû vaø coù vai troø quan troïng trong ngheà laøm röôïu vang. Saccharomyces vini. Ñaây laø teân hieän nay duøng phoå bieán, tröôùc ñaây ngöôøi ta goïi laø Saccharomyces vini Meyer hay laø Saccharomyces ellipsoideus theo Lodder laø Saccharomyces cerevisea Hansen. Naám men naøy phoå bieán trong quaù trình leân men nöôùc quaû chieám ñeán 80% trong toång soá Saccharomyces coù trong nöôùc quaû khi leân men. Khaû naêng keát laéng cuûa noù phuï thuoäc vaøo töøng noøi: caùc teá baøo daïng buïi hoaëc daïng boâng. Nguoàn dinh döôõng cacbon cuûa loaøi naøy laø ñöôøng, soàn, vaø axit höõu cô, nhöõng taùc nhaân sinh tröôûng laø axit pantotenic, biotin, mezoinit, tiamin, vaø piridoxin. Ña soá teá baøo cuûa loaøi naøy hình ovan coù kích thöôùc (3 - 8) x (5 -12) µm, sinh saûn theo loái naûy choài vaø taïo thaønh baøo töû Saccharomyces vini sinh ra enzim invertaza coù khaû naêng khöû ñöôøng saccaroza thaønh fructoza vaø glucoza, vì vaäy trong leân men ta coù theå boå sung loaïi ñöôøng naøy vaøo dung dòch quaû vaø haøm löôïng röôïu taïo thaønh bình thöôøng ñoái vôùi nhieàu noøi cuûa men vaø chæ ñaït ñöôïc 8-10 % so vôùi theå tích. ÔÛ giai ñoaïn cuoái quaù trình leân men Saccharomyces vini keát laéng nhanh vaø laøm trong dòch röôïu. Caùc noøi cuûa gioáng naøy coù ñaëc tính rieâng veà khaû naêng taïo coàn, chòu sunfit, toång hôïp caùc caáu töû bay hôi vaø caùc saûn phaåm thöù caáp taïo ra cho vang muøi vò ñaëc tröng rieâng bieät. Giai ñoaïn cuoái cuøng cuûa quaù trình leân men caùc teá baøo Saccharomyces vini thöôøng bò giaø, khoâng tieáp tuïc chuyeån ñöôøng thaønh coàn vaø bò cheát raát nhanh. Saccharomyces uvarum. Men naøy ñöôïc taùch töø nöôùc nho, röôïu vaø nöôùc quaû phuùc boàn töû leân men töï nhieân. Veà hình thaùi noù khoâng khaùc vôùi caùc loaøi khaùc. Khaû naêng sinh baøo töû khaù maïnh treân moâi tröôøng thaïch – malt. Caùc noøi cuûa loaøi naøy coù theå leân men 12-13 o coàn trong dung dòch nöôùc nho. Moät vaøi noøi ñöôïc duøng trong saûn xuaát röôïu vang. Saccharomyces chevalieri. Theo Lodder laø Saccharomyces chevalieri Guiliermond. Naám men naøy ñöôïc taùch töø nöôùc nho leân men töï nhieân, töø vang non ñöôïc gaây men nöôùc döøa hoaëc nöôùc coï. Saccharomyces chevalieri thuaàn chuûng leân men nöôùc nho coù theå taïo 16ocoàn. Noù thöôøng laãn vôùi Saccharomyces vini. Saccharomyces ovifomis. Theo Lodder laø Saccharomyces Beuanes saccado. Ñöôïc taùch ra töø nöôùc nho töï leân men, nhöng loaïi naám men naøy ít hôn Saccharomyces vini. Gioáng thuaàn chuûng phaùt trieån toát trong nöôùc nho vaø caùc nöôùc quaû khaùc , coù khaû naêng chòu ñöôïc ñöôøng cao, leân men kieät ñöôøng vaø taïo thaønh 18o coàn. Caùc yeáu toá sinh tröôûng cuûa loaïi naøy gioáng nhö Saccharomyces vini vaø coù khaû naêng chòu ñöôïc löôïng coàn cao. Duøng caùc noøi thuaàn chuûng cuûa gioáng naøy ñeå leân men dòch quaû coù haøm löôïng ñöôøng cao ñeå cheá vang khoâ cho keát quaû toát. Coù hình daøng gioáng nhö Saccharomyces vini vaø coù theå taïo thaønh 18% röôïu trong quaø trình leân men, gioáng naøy taïo thaønh maøng treân dòch quaû. Saccharomyces ovifomis leân men ñöôïc glucoza, fructoza, manoza, sacaroza, maltoza, vaø 1/3 rafinoza, khoâng leân men ñöôïc lactoza, pentoza. Ñieàu kaùhc nhau cô baûn cuûa Saccharomyces ovifomis vôùi Saccharomyces vini laø Saccharomyces ovifomis khoâng leân men ñöôïc galactoza vaø men noåi leân maët dòch leân men taïo thaønh maøng. Hai gioáng men röôïu vang naøy (Saccharomyces vini vaø Saccharomyces ovifomis) coù nhieàu noøi ñöôïc duøng trong saûn xuaát. Noùi chung, nhieàu noøi men röôïu quaû coù khoaûng nhieät ñoä thích hôïp laø 18-25oC , ôû 35oC sinh saûn cuûa chuùng bò öùc cheá, ôû 40oC sinh saûn bò nhöøng hoaøn toaøn, ôû nhieät ñoä thaáp hôn 16oC sinh saûn vaø leân men bò keùo daøi. Caùc ñieàu kieän hoùa – lyù , thaønh phaàn vaø chaát löôïng dòch quaû, cuõng nhö pH moâi tröôøng coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán quaù trình soáng cuûa naám men. Hanseniaspora apiculate- Kloeskera apiculata. Kích thöôùc töông ñoái nhoû coù hình ovan, elip, hoaëc hình quaû chanh, teá baøo coù moät ñaàu nhoû ngöôùi ta thöôøng goïi laø men hình chuøy. Sinh saûn baèng naûy choài, raát phoå bieán ôû voû quaû vaø nhieãm vaøo nöôùc quaû chieám tôùi 90% toång soá men khi baét ñaàu leân men. Noù coù theå leân men taïo thaønh 6-7o coàn, nhöng taïo thaønh moät loaït caùc axit bay hôi cuõng gioáng nhö caùc ester cuûa chuùng laøm cho dòch coù muøi taïp vaø noù coøn kieàm haõm caùc loaøi naám men chính trong leân men, Kloeskera apiculata nhaïy caûm vôùi SO2. Trong ngheà laøm röôïu vang ngöôøi ta khoâng mong muoán loaïi men naøy phaùt trieån, neáu coù thì chæ caàn trong trong giai ñoaïn ñaàu taïo ñöôïc 3-4o coàn. Qua phaân tích heä vi sinh vaät trong quaù trình leân men töï nhieân cuõng gôïi môû cho chuùng ta yù thuùc ñöôïc khi duøng naám men thuaàn chuûng ñeå leân men nöôùc quaû khoâng neân duøng moät chuûng ñôn ñoäc maø caàn phoái hôïp vôùi nhöõng chuûng chòu ñöôïc coàn cao ñeå leân men tieáp theo. [2] Trình töï leân men cuûa caùc gioáng naám men trong quaù trình leân men vang. Quaù trình leân men röôïu vang coù theå ñöôïc tieán haønh moät caùch töï nhieân maø khoâng caàn caáy gioáng hoaëc baèng caùch caáy vaøo dòch nho caùc naám men vang choïn loïc. Trong nöôùc nho töôi coù nhöõng nhoùm vi sinh vaät khaùc nhau rôi töø moâi tröôøng xung quanh , chuû yeáu ôø voû quaû, thaân, cuoáng vaø thieát bò. Trong ñoù naám men chieám 9-22%.[2] Vieäc leân men dòch nho ñöôïc thöïc hieän bôûi moät heä vi sinh vaät phöùc taïp, trong ñoù caùc chuûng naám men phaùt trieån vaø cheát tuøy theo söï thích nghi cuûa chuùng ñoái vôùi moâi tröôøng. Töông taùc naám men-naám men xaûy ra trong suoát quaù trình saûn xuaát röôïu vang ngay töø khi baét ñaàu quaù trình leân men coàn. Trong quaù trình leân men töï nhieân, söï leân men nöôùc quaû ñöôïc thöïc hieän bôûi söï noái tieáp cuûa nhöõng quaàn theå naám men khaùc nhau. Nhöõng giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình leân men noùi chung troäi hôn haún laø loaøi naám men ñaàu nhoïn thuoäc veà gioáng (genus) Hanseniaspora vaø cuõng bôûi nhöõng loaøi naám men khaùc nhö laø Candida stellata vaø Metschinikowia pulcherrima.. Theo doõi quaù trình leân men ôû nhieàu nôi moät caùch töï nhieân thaáy raèng moät vaøi ngaøy ñaàu caùc men daïi hình thoi ñaàu nhoû hoaëc hình chuøy (Kloeskera) chieám öu theá (70-80% trong toång soá naám men). Ít phoå bieán hôn laø nhöõng loaøi thuoäc gioáng Pichia vaø Kluyveromyces cuõng ñöôïc tìm thaáy. Caùc naám men naøy cheát daàn khi haøm löôïng coàn taêng, chæ coøn laïi Saccharomyces cerevisiae coù khaû naêng chòu ñöôïc haøm löôïng coàn cao tieáp tuïc quaù trình leân men cho ñeán khi keát thuùc. Theo nghieân cöùu cuûa Xufre vaø coäng söï Saccharomyces phaùt trieån hôn non-Saccharomyces chæ sau khi noàng ñoä ethanol tieán ñeán khoaûng 4-5%(v/v). Söï chuyeån bieán naøy raát quan troïng vì caùc chuûng non-Saccharomyces thöôøng taïo ra caùc hôïp chaát khoâng mong muoán nhö röôïu baäc cao, acid acetic vaø acetaldehyde. Beân caïnh ñoù, chuùng cuõng ñöôïc trích daãn laø aûnh höôûng quan troïng ñeán muøi vò vaø chaát löôïng cuûa cuûa röôïu vang vaø nhöõng taùc ñoäng cuûa loaøi naøy leân saûn phaåm cuoái vaãn coøn laø vaán ñeà gaây tranh caõi. Theo nhieàu taùc giaû thì khi coù caùc loaøi naám men non-Saccharomyces phaùt trieån trong röôïu vang vôùi moät möùc ñoä vöøa phaûi, höông vò cuûa röôïu vang seõ phong phuù hôn vaø ñöôïc öa thích nhieàu hôn so vôùi röôïu vang chæ ñöôïc leân men töø gioáng Saccharomyces. Söï bieán maát hoaëc giaûm maät ñoä cuûa gioáng non-Saccharomyces coù theå laø do khaû naêng chòu ñöïng coàn thaáp, hoaëc bò öùc cheá bôûi caùc chaát dieät men (acid beùo maïch ngaén vaø trung bình, glycoprotein,…) hoaëc do haøm löôïng oxy vaø nitrogen coøn laïi thaáp. Caùc quaù trình leân men coù kieåm soaùt thöôøng ñöôïc thöïc hieän baèng caùch caáy canh tröôøng Saccharomyces cerevisiae thuaàn khieát, nhôø ñoù quaù trình leân men dieãn ra nhanh hôn vaø coù theå taïo ra röôïu vang vôùi höông vò ñaëc tröng. [16,17,18] Chæ tieâu choïn löïa naám men vang Naám men ñöôïc löïa choïn ñöông nhieân laø phaûi coù ñaëc tính kyõ thuaät phuø hôïp vôùi saûn xuaát röôïu vang. Söï ña daïng cuûa ñaëc tính khoâng chæ phuï thuoäc vaøo loaïi röôïu maø coøn phuï thuoäc vaøo quan ñieåm khaùc nhau cuûa nhöõng nhaø chuyeân moân. Ngoaøi vai troø quan troïng cuûa naám men vang laø xuùc taùc vieäc chuyeån hoùa hoaøn toaøn vaø coù hieäu quaû ñöôøng thaønh coàn maø khoâng taïo ra caùc höông vò khoâng mong muoán thì ngaøy nay, do yeâu caàu ngaøy caøng cao, canh tröôøng Saccharomyces cerevisiae caàn phaûi coù nhieàu ñaëc tính khaùc, nhö lieät keâ trong baûng 1.1 [15]. Tuy nhieân, ñeå coù theå kieåm tra heát taát caû caùc chæ tieâu naøy thì toán raát nhieàu thôøi gian. Regodon vaø coäng söï (1997) ñaõ ñöa ra moät phöông phaùp ñôn giaûn vaø hieäu quaû ñeå choïn löïa naám men vang duøng trong saûn xuaát coâng nghieäp döïa treân caùc tính chaát coâng ngheä cuûa naám men vang. Phöông phaùp naøy chæ bao goàm 2 böôùc [30]: Böôùc thöù nhaát laø böôùc choïn loïc sô boä döïa treân khaû naêng chòu ñöïng ñoái vôùi SO2, caùc loaøi coù haïi, khaû naêng phaùt trieån taïi nhieät ñoä cao vaø söï taïo boït thaáp. Böôùc thöù hai laø böôùc choïn loïc chính thöùc döïa treân haøm löôïng acid deã bay hôi vaø ethanol taïo thaønh cuõng nhö haøm löôïng ñöôøng soùt coøn laïi trong röôïu vang. Baûng I.1 : Caùc ñaëc tính mong muoán cuûa naám men vang [15] Ñaëc tính leân men Thích nghi vôùi quaù trình leân men nhanh Toác ñoä söû duïng cô chaát vaø toác ñoä hình thaønh saûn phaåm cao Khaû naêng chòu coàn cao Khaû naêng chòu aùp suaát thaåm thaáu cao Sinh khoái taïo thaønh vöøa phaûi Caùc tính chaát veà höông vò Taïo thaønh ít sulphite/DMS/thiol Taïo thaønh ít acid deã bay hôi Taïo thaønh ít röôïu baäc cao Giaûi phoùng ra caùc tieàn chaát höông glycosylate Hoaït tính esterase thaáp Ñaëc tính coâng ngheä Tính oån ñònh cao veà maët di truyeàn Khaû naêng chòu sulphite cao Ít lieân keát vôùi sulphite Ít taïo boït Coù khaû naêng keát boâng Keát laéng caën nhanh Nhu caàu nitô thaáp Caùc ñaëc tính trao ñoåi chaát coù lieân quan ñeán söùc khoûe con ngöôøi Taïo thaønh ít sulphite Taïo thaønh ít biogenic amine Taïo thaønh ít ethyl carbamate (urea) Keát hôïp caùc gioáng naám men vaø söû duïng kyõ thuaät di truyeàn trong saûn xuaát röôïu vang Theo nghieân cöùu cuûa Renouf vaø coäng söï (2006), vieäc quan saùt söï töông taùc giöõa Saccharomyces cerevisiae vaø Brettanomyces bruxellensis vaø nhöõng loaøi naám men khaùc ñaê xaùc ñònh maëc duø Saccharomyces cerevisiae laø taùc nhaân chính trong quaù trình leân men coàn trong saûn xuaát röôïu vang nhöng Brettanomyces bruxellensis coù khaû naêng chuyeån hoùa glucoza vaø fructoza thaønh ethanol vaø chòu ñöôïc haøm löôïng coàn cao. Trong moâi tröôøng söû duïng keát hôïp Saccharomyces cerevisiae vaø Brettanomyces bruxellensis, thôøi gian caàn thieát ñeå tieâu thuï toaøn boä löôïng ñöôøng ngaén hôn laø trong moâi tröôøng chæ coù Saccharomyces cerevisiae. Söï trao ñoåi chaát cuûa Saccharomyces cerevisiae vaø Brettanomyces bruxellensis boå sung cho nhau vaø giaûm thôøi gian toång coäng leân men ñöôøng. Söï keát hôïp giöõa Saccharomyces cerevisiae vaø Metschnikowia pulcherrima laøm taêng toác ñoä leân men vaø caûi thieän veà muøi vò. Coøn keát hôïp giöõa Saccharomyces cerevisiae vaø Candida stellata seõ laøm taêng haøm löôïng glycerin, taêng toác ñoä leân men vaø chaát löôïng röôïu vang.[11,12,13,31] Trong nhöõng naêm gaàn ñaây, kyõ thuaät di truyeàn ñaõ ñöôïc öùng duïng ñeå caûi thieän caùc ñaëc tính cuûa naám men vang: Shinohara vaø coäng söï (1994) ñaõ nghieân cöùu vieäc choïn loïc vaø lai gioáng caùc chuûng naám men vang ñeå caûi thieän toác ñoä leân men, taêng khaû naêng chòu ñöïng ñoái vôùi SO2 vaø laøm taêng chaát löôïng röôïu vang [33]. Serra vaø coäng söï (2005) ñaõ nghieân cöùu vieäc lai taïo giöõa Saccharomyces cerevisiae vaø Saccharomyces bayanus var. uvarum ñeå keát hôïp öu ñieåm cuûa 2 loaøi naøy, laøm taêng chaát löôïng saûn phaåm trong saûn xuaát röôïu vang coù haøm löôïng acid thaáp (pH cao) [32]. CAÙC PHÖÔNG PHAÙP COÁ ÑÒNH TEÁ BAØO Caùc phöông phaùp coá ñònh teá baøo. Khaùi nieäm: Kyõ thuaät coá ñònh teá baøo ñöôïc ñònh nghóa laø: “Kyõ thuaät bao boïc hoaëc ñònh vò caùc teá baøo coøn nguyeân veïn leân moät “vuøng khoâng gian nhaát ñònh” nhaèm baûo veä caùc hoaït tính xuùc taùc mong muoán” (Karel vaø coäng söï, 1985) [20]. Coá ñònh thöôøng laø söï baét chöôùc caùc hieän töôïng xaûy ra trong töï nhieân do caùc teá baøo coù theå phaùt trieån treân beà maët hoaëc beân trong caùc caáu truùc cuûa nguyeân lieäu coù trong töï nhieân. Nhieàu vi sinh vaät töï noù coù khaû naêng gaén leân treân nhöõng beà maët khaùc nhau trong töï nhieân. Nhieàu quaù trình trong coâng ngheä sinh hoïc thuaän lôïi hôn nhôø kyõ thuaät coá ñònh, do ñoù maø nhieàu kyõ thuaät vaø chaát mang ñöôïc ñöa ra. Nhöõng kyõ thuaät naøy coù theå chia thaønh 4 nhoùm chính nhö laø coá ñònh treân beà maët chaát mang raén, nhoát trong khung maïng xoáp, keo tuï teá baøo (taïo haït), nhoát baèng phöông phaùp cô hoïc beân trong moät maøng chaén. [20]. Hình II.1 : Caùc kyõ thuaät cô baûn ñeå coá ñònh teá baøo [20] Coá ñònh treân beà maët chaát mang raén. Nguyeân taéc Ñaây laø phöông phaùp coá ñònh döïa vaøo töông taùc beà maët giöõa teá baøo vaø chaát mang. Caùc löïc lieân keát nhö laø löïc haáp phuï vaät lyù, lieân keát tónh ñieän (nhö löïc Van der Waal, lieân keát ion, töông taùc öa nöôùc), hoaëc lieân keát coäng hoùa trò. Nhöõng löïc lieân keát naøy yeáu nhöng ñuû lôùn veà soá löôïng ñeå coù theå lieân keát hôïp lyù. [8, 20, 34]. Öu ñieåm Ít hoaëc khoâng nguy hieåm ñeán teá baøo. [8] Ñôn giaûn, deã thöïc hieän, nhanh thu ñöôïc söï coá ñònh. [8, 26, 34]. Khoâng aûnh höôûng ñeán quaù trình truyeàn khoái [26,34]. Dieän tích tieáp xuùc giöõa teá baøo coá ñònh vaø chaát mang lôùn hôn so vôùi caùc kyõ thuaät khaùc [26]. Coù theå phuïc hoài trôû laïi teá baøo töï do. [8] Nhöôïc ñieåm Do khoâng coù maøng chaén giöõa caùc teá baøo vaø dung dòch cho neân caùc teá baøo deã bò taùch ra, laøm taêng haøm löôïng teá baøo töï do trong dung dòch [8,20] Neáu ñieàu chænh khoâng caån thaän, söï quaù taûi treân beà maët chaát mang coù theå daãn ñeán laøm giaûm hoaït tính xuùc taùc. [8] Söï thieáu khoâng gian phuø hôïp giöõa teá baøo vaø chaát mang coù theå saûn sinh ra vaán ñeà lieân quan ñeán söï caûn trôû khoâng gian.[8] Chaát mang Caùc vaät lieäu cellulose: DEAE-cellulose, goã, muøn cöa, muøn cöa ñaõ taùch lignine, … [20, 26] Caùc vaät lieäu voâ cô: polygorskite, montmorilonite, hydromica, söù xoáp, thuûy tinh xoáp, voøng Raschig, silicate, hôïp chaát titanium, … [20, 26] Nhoát trong khung maïng xoáp (taïo gel). Nguyeân taéc Ñöa teá baøo vaøo beân trong moät maïng ñuû chaët ñeå ngaên caûn teá baøo khueách taùn vaøo moâi tröôøng xung quanh, trong khi vaãn cho pheùp söï vaän chuyeån töï do cuûa caùc chaát dinh döôõng vaø söï trao ñoåi chaát dieãn ra [8, 20]. Öu ñieåm Coù theå ñaït ñöôïc maät ñoä teá baøo trong moät ñôn vò theå tích chaát mang cao hôn so vôùi canh tröôøng vi sinh vaät töï do [26]. Chaát mang coù taùc duïng baûo veä teá baøo choáng laïi thöïc khuaån hoaëc teá baøo ngoaïi laïi cuõng nhö nhöõng ñieàu kieän gaây stress [26]. Nhöôïc ñieåm Khi teá baøo taêng quaù nhieàu sinh khoái seõ laøm giaûm ñoä beàn cuûa maïng gel.[20] Teá baøo treân beà maët taêng leân nhieàu laàn vaø deã thoaùt ra khoûi maïng gel vaø phaùt trieån trong moâi tröôøng nhö laø caùc teá baøo töï do [20]. Chaát mang Polymer töï nhieân [20]: Polysaccharide: alginates, k-carrageenan, agar, chitosan vaø polygalacturonic acid. Polymer khaùc: gelatin, collagen vaø polyvinyl alcohol. Polymer toång hôïp: polyacrylamide, polyurethane vaø polyvinyl chloride [26]. Keo tuï teá baøo (taïo haït). Nguyeân taéc Söï taäp hôïp teá baøo gia taêng kích thöôùc cuûa khoái teá baøo hoaëc taïo huyeàn phuø teá baøo gaén thaønh cuïm vaø laéng xuoáng ñeå deã daøng söû duïng trong caùc bình phaûn öùng. Coù theå laø keo tuï töï nhieân hoaëc laø keo tuï nhaân taïo baèng caùch taïo thaønh caùc lieân keát ngang [20]. Öu ñieåm Ñôn giaûn, deã thöïc hieän. Khoâng aûnh höôûng ñeán quaù trình truyeàn khoái. Nhöôïc ñieåm Do khoâng coù maøng chaén giöõa caùc teá baøo vaø dung dòch cho neân caùc teá baøo deã bò taùch ra, laøm taêng haøm löôïng teá baøo töï do trong dung dòch. Nhoát baèng phöông phaùp cô hoïc beân trong moät maøng chaén. Nguyeân taéc Phöông phaùp naøy coù theå ñöôïc thöïc hieän theo 2 caùch söû duïng maøng membrane vi xoáp, söû duïng maøng vi bao. Phương phaùp naøy gioáng vôùi phöông phaùp nhoát trong khung maïng xoáp ôû choå teá baøo töï do trong dung dòch, nhöng khoâng gian beân trong laø troáng.[20, 21] Öu ñieåm Canh tröôøng leân men khoâng bò laãn teá baøo, do ñoù saûn phaåm taïo thaønh coù theå khoâng caàn loïc [20, 26]. Nhöôïc ñieåm Khaû naêng truyeàn khoái keùm [20]. Maøng membrane coù theå bò baùm baån do söï haáp phuï cô chaát leân beà maët maøng [20]. Chaát mang Membrane laøm baèng vaät lieäu cellulose acetate, cellulose nitrat, polyamide [20, 26]. Yeâu caàu veà chaát mang. [20] Chaát mang phaûi coù beà maët lôùn vôùi nhoùm chöùc naêng ñeå teá baøo coù theå gaén vaøo. Chaát mang phaûi deã ñieàu khieån vaø taùi sinh. Vôùi chaát mang ñoù thì khaû naêng soáng cuûa teá baøo vaø khaû naêng hoaït ñoäng oån ñònh cuûa chaát xuùc taùc sinh hoïc phaûi cao vaø giöõ ñöôïc trong thôøi gian daøi. Hoaït ñoäng cuûa vi sinh vaät ñöôïc coá ñònh phaûi khoâng bò aûnh höôûng baát lôïi bôûi quaù trình coá ñònh. Ñoä xoáp cuûa chaát mang phaûi ñoàng ñeàu vaø coù theå kieåm soaùt, cho pheùp söï trao ñoåi töï do cuûa cô chaát, saûn phaåm, cofactor, chaát khí. Chaát mang phaûi coù tính oån ñònh cô hoïc, hoùa hoïc, nhieät, sinh hoïc vaø khoâng deã daøng bò giaûm giaù trò bôûi enzim, dung moâi, söï thay ñoåi aùp suaát hoaëc löïc uoán caét. Chaát mang vaø kyõ thuaät coá ñònh phaûi deã thöïc hieän, vaø hieäu quaû veà kinh teá. Chaát mang phaûi thuoäc loaïi thuaàn khieát tieâu chuaån thöïc phaåm, khoâng aûnh höôûng ñeán chaát löôïng saûn phaåm bôûi vieäc coøn laïi nhöõng phaàn caën vaø deã daøng ñöôïc chaáp nhaän bôûi ngöôøi tieâu duøng. Öu, nhöôïc ñieåm cuûa teá baøo coá ñònh. Öu ñieåm cuûa teá baøo coá ñònh hôn teá baøo töï do: [20] Hoaït ñoäng keùo daøi vaø söï oån ñònh cuûa chaát xuùc taùc sinh hoïc, chaát mang coù theå ñoùng vai troø nhö moät chaát baûo veä choáng laïi aûnh höôûng hoùa lyù cuûa nhieät ñoä, pH, dung moâi, hoaëc thaäm chí laø kim loaïi naëng. Maät ñoä teá baøo treân moät ñôn vò theå tích cuûa thieát bò phaûn öùng sinh hoïc cao hôn, thôøi gian phaûn öùng ngaén hôn vaø söï loaïi boû söï taêng tröôûng cuûa nhöõng teá baøo vi sinh vaät khoâng coù lôïi. Söï haáp thu cô chaát taêng vaø naêng suaát ñöôïc caûi thieän. Coù theå thöïc hieän ñöôïc vôùi quaù trình lieân tuïc. Khaû naêng chòu ñöïng ñöôïc noàng ñoä cô chaát cao taêng, vaø giaûm söï öùc cheá cuûa saûn phaåm cuoái. Vôùi quaù trình leân men, coù theå thöïc hieän ôû nhieät ñoä thaáp daãn ñeán caûi thieän chaát löôïng cho moät soá saûn phaåm. Hoaøn thieän saûn phaåm deã daøng hôn do giaûm ñöôïc thuû tuïc taùch chieát vaø loïc, do ñoù giaûm giaù thaønh cho thieát bò vaø yeâu caàu veà naêng löôïng. Söï taùi sinh vaø taùi söû duïng chaát xuùc taùc sinh hoïc cho nhieàu thôøi cuûa söï vaän haønh giaùn ñoaïn maø khoâng phaûi thaùo boû noù ra khoûi thieát bò phaûn öùng sinh hoïc. Giaûm ruûi ro nhieãm vi sinh vaät coù haïi bôûi vì maät ñoä teá baøo cao. Coù theå söû duïng thieát bò phaûn öùng sinh hoïc nhoû hôn, vôùi söï thieát keá quaù trình soâng ngheä ñôn giaûn hoùa vaø do ñoù giaûm chi phí voán. Giaûm thôøi gian saûn xuaát ra saûn phaåm. Nhöôïc ñieåm cuûa teá baøo coá ñònh: Khi söû duïng teá baøo vi sinh vaät coá ñònh, trong moâi tröôøng saûn xuaát, hieän töôïng roø ræ hay röûa troâi teá baøo ra khoûi chaát mang ít hay nhieàu laø ñieàu khoâng theå traùnh khoûi. Do ñoù, vieäc thu nhaän vaø tinh saïch saûn phaåm ñoâi khi cuõng khaù phöùc taïp. Teá baøo coá ñònh ñoøi hoûi nhieàu nguoàn dinh döôõng vaø naêng löôïng ña daïng ñaûm baûo khaû naêng phaùt trieån vaø hoaït ñoäng bình thöôøng. Khi ñoù, trong heä thoáng söû duïng teá baøo coá ñònh coù theå xaûy ra hieän töôïng phaân huyû saûn phaåm ñeå cung caáp ñaày ñuû chaát dinh döôõng vaø naêng löôïng caàn thieát cho teá baøo. Vì theá maø hieäu suaát söû duïng teá baøo coá ñònh coù theå thaáp hôn hieäu suaát söû duïng teá baøo töï do. Do ñöôïc bao boïc bôûi chaát mang, thaønh teá baøo, maøng teá baøo chaát, … coù theå gaây caûn trôû vieäc thaåm thaáu cô chaát, saûn phaåm vaø caùc caáu töû töø moâi tröôøng ra vaøo teá baøo. Moät nhöôïc ñieåm thöôøng thaáy ôû nhöõng teá baøo vi sinh vaät ñöôïc “goùi” trong khuoân coù caáu truùc gel, nhöõng cô chaát coù kích thöôùc phaân töû lôùn seõ khoâng coù ñieàu kieän tieáp xuùc vôùi teá baøo vi sinh vaät coá ñònh. Vì theá maø hoaït löïc cuûa nhöõng teá baøo coá ñònh coù theå seõ thaáp hôn so vôùi nhöõng teá baøo töï do. Trong tröôøng hôïp cuï theå khi saûn xuaát ethanol, ngöôøi ta khoâng quan taâm ñeán söï öùc cheá cuûa ethanol leân hoaït ñoäng soáng cuûa naám men khi tieán haønh leân men giaùn ñoaïn, khi ñoù naám men chæ ñöôïc söû duïng moät laàn roài ñöôïc hoaït hoaù laïi cho laàn saûn xuaát tieáp theo. Tuy nhieân, möùc ñoä aûnh höôûng cuûa ethanol ñeán hoaït ñoäng cuûa naám men laø raát lôùn trong quaù trình leân men lieân tuïc. Sau khi leân men, hoaït tính cuûa teá baøo naám men coù theå bò öùc cheá bôûi ethanol. Töông töï nhö vaäy, khi söû duïng phöông phaùp coá ñònh naám men ñeå saûn xuaát ethanol lieân tuïc, hoaït tính cuûa naám men coá ñònh caàn ñöôïc duy trì vaø noàng ñoä ethanol phaûi thaáp ñeå khoâng gaây öùc cheá ñeán teá baøo naám men. Nhö theá thì hieäu suaát thu nhaän saûn phaåm khoâng cao. Nhieàu phöông phaùp thaùo saûn phaåm lieân tuïc khoûi thieát bò leân men ñöôïc nghieân cöùu nhaèm traùnh nhöõng taùc ñoäng khoâng toát cuûa saûn phaåm leân men ñoái vôùi naám men. CAÙC PHÖÔNG PHAÙP COÁ ÑÒNH TEÁ BAØO NAÁM MEN RÖÔÏU VANG Coá ñònh treân beà maët chaát mang raén. Nguyeân taéc thöïc hieän: Phöông phaùp coá ñònh treân beà maët chaát mang raén bao goàm vieäc troän teá baøo caàn coá ñònh vaø caùc chaát mang coù tính chaát haáp phuï laïi vôùi nhau döôùi ñieàu kieän phuø hôïp cuûa pH, löïc ion v.v… , ñeå hoãn hôïp leân men moät khoaûng thôøi gian , tieáp theo laø taäp hôïp chuùng laïi vaø ñem ñi röûa ñeå loaïi boû nhöõng thaønh phaàn khoâng lieân keát. [8] Coù theå thöïc hieän vieäc coá ñònh teá baøo vi sinh vaät treân beà maët chaát mang raén nhö sau [38]: Phöông phaùp coå ñieån: phöông phaùp ngaâm chaát mang trong dung dòch huyeàn phuø vi sinh vaät. Vi sinh vaät seõ töï ñoäng keát laéng vaø lieân keát vôùi chaát mang baèng caùch haáp phuï treân chaát mang ñoù. Phöông phaùp coå ñieån coù caûi tieán baèng caùch söû duïng caùnh khuaáy: teá baøo vi sinh vaät vaø chaát mang phaân boá ñeàu khaép trong dung dòch. Dieän tích tieáp xuùc giöõa chaát mang vaø vi sinh vaät laø cöïc ñaïi, do ñoù hieäu suaát gaén teá baøo leân chaát mang ñöôïc caûi thieän ñaùng keå. Phöông phaùp bôm canh tröôøng vi sinh vaät qua coät chöùa chaát mang: caàn coù hoài löu doøng canh tröôøng ñeå naâng cao hieäu suaát gaén teá baøo vaøo chaát mang. Caùc chaát mang: Ngöôøi ta ñaëc bieät quan taâm ñeán vieäc söû duïng teá baøo coá ñònh trong quaù trình leân men coàn. Vieäc löïa choïn chaát mang phuø hôïp ñeå haáp phuï teá baøo laø moät vieäc khoù, bôûi vì töông taùc cuûa teá baøo vaø chaát mang bò aûnh höôûng bôûi moät löôïng nhöõng nhaân toá (nhö baûn chaát cuûa chaát mang vaø teá baøo vi sinh vaät, ñieàu kieän moâi tröôøng) [26] Voû nho: [25] Voû nho ñöôïc duøng laøm chaát mang ñeå coá ñònh teá baøo naám men Saccharomyces cerevisiae trong saûn xuaát röôïu vang. Teá baøo coá ñònh naøy ñöôïc duøng leân men ôû caùc meû noái tieáp nhau vaø hieäu suaát ñöôïc caûi thieän hôn khi so saùnh vôùi teá baøo töï do. a. Giôùi thieäu veà chaát mang: Voû nho ñöôïc söû duïng bôûi vì chuùng laø phuï phaåm cuûa coâng ngheä saûn xuaát röôïu vang nho, vaø noù coù theå caáu thaønh moät chaát mang töï nhieân , ñoä saïch theo tieâu chuaån thöïc phaåm, reû vaø phong phuù duøng ñeå coá ñònh teá baøo. b. Phöông phaùp coá ñònh naám men treân voû nho: Moâi tröôøng baùn toång hôïp Tieät truøng Nuoâi caáy Naám men Ly taâm Phoái troän Voû nho Tieät truøng Moâi tröôøng Naám men coá ñònh treân voû nho Röûa Leân men Chuûng naám men Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1 chòu coàn, chòu laïnh cho taêng tröôûng trong moâi tröôøng baùn toång hôïp chöùa 20 g glucose/L, 4g chaát chieát naám men/l, 1g (NH4)2SO4/L, 1g KH2PO4/L and 5 g MgSO4.7H2O/L, vaø moâi tröôøng ñöôïc tieät truøng tröôùc ñoù ôû 121oC trong 20 phuùt. Nhöõng chuûng naøy ñöôïc nuoâi trong bình tónh döôùi ñieàu kieän hieáu khí tuyø tieän ôû 24oC trong 24 giôø, vaø ñöôïc taùch ra baèng ly taâm ôû 3000 voøng/phuùt trong 10 phuùt. Voû nho ñöôïc thu nhaän baèng caùch eùp trieät ñeå baõ. 20g teá baøo Saccharomyces cerevisiae, ñöôïc chuaån bò nhö moâ taû ôû treân, taïo huyeàn phuø beân trong 1 lít moâi tröôøng baùn toång hôïp (chöùa 120g glucose/L, pH 4,8). 400g voû nho aåm (khoái löôïng khoâ khoaûng 88g), ñaõ tieät truøng ôû 121oC trong 20 phuùt, ñöôïc cho vaøo huyeàn phuø teá baøo vaø toaøn boä ñöôïc ñeå leân men khoâng laéc ôû 25oC trong 6-8 giôø, döôùi ñieàu kieän hieáu khí tuyø tieän. Chaát loûng beân treân ñöôïc gaïn chaét vaø chaát mang ñöôïc röûa 2 laàn, moãi laàn vôùi 400 ml dòch nho. Teá baøo ñaõ coá ñònh ñöôïc duøng ñeå leân men tröïc tieáp dòch nho. c. Hieäu quaû saûn xuaát cuûa teá baøo naám men röôïu vang coá ñònh treân voû nho: Hình III.1 Hiệu suất saûn xuaát coàn ôû nhöõng nhieät ñoä leân men khaùc nhau. Hình III.2 Naêng suaát rieâng cuûa vieäc saûn xuaát coàn ôû nhöõng nhieät ñoä khaùc nhau. So saùnh vôùi teá baøo töï do, Saccharomyces cerevisiae khi lieân keát treân voû nho coù toác ñoä haáp thu glucoza, fructoza, vaø khaû naêng saûn xuaát coàn nhanh hôn ôû taát caû nhieät ñoä nghieân cöùu (0-25oC). Naêng suaát ethanol taêng khoâng ñaùng keå khi nhieät ñoä leân men giaûm. Teá baøo coá ñònh coù toác ñoä rieâng cuûa vieäc saûn xuaát ethanol cao hôn teá baøo töï do ôû moïi nhieät ñoä. Toác ñoä rieâng cuûa vieäc saûn xuaát ethanol taêng theo haøm muõ khi nhieät ñoä taêng. Quaù trình leân men vôùi teá baøo coá ñònh thuaän lôïi hôn teá baøo töï do ôû moïi nhieät ñoä nghieân cöùu. Chuyeån ñöôøng thaønh ethanol nhanh vaø hieäu quaû hôn, thaäm chí ôû nhieät ñoä cao hôn löôïng ñöôøng duøng cho hoaït ñoäng taêng tröôûng hoaëc hoaït ñoäng duy trì cuûa naám men cuõng gaàn nhö khoâng ñoåi. Khi taùi söû duïng naám men coá ñònh treân voû nho, söï toån thaát teá baøo vaøo khoaûng 10% löôïng teá baøo ban ñaàu. Ñoù laø do quaù trình röûa vôùi dòch nho (2 laàn, moãi laàn 400mL) , tröôùc khi baét ñaàu moãi meû leân men. Tuy nhieân söï toån thaát naøy ñöôïc buø ôû giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình leân men. Phöông phaùp thöïc hieän ñôn giaûn , nhanh, reû vaø khoâng coù hoaù chaát. Mieáng taùo: Quaû vaø nöôùc quaû thöôøng ñöôïc söû duïng nhö laø moät phuï gia troän vaøo nhau trong quaù trình saûn xuaát cuûa nhieàu loaïi thöïc phaåm, ñaëc bieät laø trong saûn xuaát thöùc uoáng. Theâm vaøo ñoù, röôïu taùo, laø moät thöùc uoáng coù coàn vôùi muøi vò thôm ngon, ñöôïc saûn xuaát töø dòch quaû taùo. Do ñoù maø vieäc söû duïng mieáng taùo laøm chaát mang coá ñònh teá baøo naám men trong saûn xuaát röôïu vang, beân caïnh hieäu quaû caûi thieän khaû naêng soáng soùt cuûa teá baøo, noù coøn coù theå taïo ra saûn phaåm ñöôïc caûi thieän veà muøi vò. [21] a. Giôùi thieäu veà chaát mang: Taùo laø moät loaïi quaû nhieàu vaø phong phuù vaø noù töông hôïp vôùi muøi vaø vò cuûa röôïu. Do ñoù ngöôøi ta duøng mieáng taùo nhö laø chaát mang ñeå coá ñònh teá baøo naám men vaø öùng duïng trong saûn xuaát röôïu vang.[21] Mieáng taùo ñöôïc duøng coá ñònh naám men Saccharomyces cerevisiae cho saûn xuaát röôïu vang ôû nhieät ñoä phoøng vaø nhieät ñoä thaáp. Sôû dó nghieân cöùu ôû nhieät ñoä naøy vì nhieät ñoä leân men thaáp cho chaát löôïng saûn phaåm cao hôn.[21] Söï coá ñònh naám men leân chaát mang coù theå thöïc hieän nhö laø keát quaû cuûa lieân keát hydro, söï nhoát teá baøo beân trong caáu truùc taùo, löïc Van der Waals löïc haáp phuï gaây ra bôûi vieäc nhoài teá baøo vi sinh vaät vaøo khoái teá baøo taùo.[19] b.Chaát mang vaø phöông phaùp coá ñònh teá baøo: [22] Chuûng naám men Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1 chòu coàn chòu laïnh cho taêng tröôûng trong moâi tröôøng chöùa (%w/v) 4% glucoza; 0,4% chaát chieát naám men; 0,1% (NH4)2SO4; 0,1% KH2PO4/l vaø 0,5% MgSO4. Ñeå coá ñònh teá baøo, mieáng taùo ñöôïc söû duïng nhö moät chaát mang. 425g taùo ñaõ ñöôïc caét mieáng cho vaøo beân trong moät xylanh thuûy tinh 1 lít, sau ñoù cho 500 ml moâi tröôøng vaøo xylanh. Moâi tröôøng goàm coù 12% glucoza; 0,4% chaát chieát naám men; 0,1% (NH4)2SO4; 0,1%KH2PO4; vaø 0,5% MgSO4 trong nöôùc caát vaø coù pH laø 5,6; khoâng ñieàu chænh pH. 10g chuûng naám men Saccharomyces cerevisiae ôû treân ñöôïc cho vaøo xylanh vaø ñeå leân men ñeán moät noàng ñoä khoaûng 0,5oBe. Sau ñoù, dòch leân men ñöôïc gaïn ra, vaø chaát mang ñöôïc röûa 2 laàn vôùi 400ml dòch nho (söû duïng dòch nho ñöôïc duøng cho laàn leân men keá tieáp). Sau ñoù naám men ñöôïc duøng ñeå leân men coàn trong saûn xuaát röôïu vang. Mieáng taùo Moâi tröôøng chöùa naám men Phoái troän Leân men Gaïn dòch leân men Röûa Naám men coá ñònh Moâi tröôøng Hình III.3 Naám men coá ñònh treân mieáng taùo trong quaù trình leân men röôïu. c. Hieäu quaû saûn xuaát röôïu vang: SÖÏ COÁ ÑÒNH VAØ LEÂN MEN: [22] Ñeå coá ñònh teá baøo nhöõng mieáng taùo ñöôïc phoái troän vôùi moâi tröôøng loûng cuûa chuûng naám men chòu coàn vaø chòu laïnh vaø ñeå trong 8 giôø. Chaát xuùc taùc sinh hoïc ñaõ ñöôïc chuaån bò ñöôïc duøng cho leân men giaùn ñoaïn ôû nhieät ñoä phoøng vaø nhieät ñoä thaáp vôùi noàng ñoä ban ñaàu laø 12oBe. Sau moãi 12 meû leân men phaàn traêm theå tích taùo coøn laïi trong xy lanh ñöôïc ño ñeå xaùc ñònh theå tích mieáng taùo coøn laïi sau moät thôøi gian daøi leân men. Theå tích taùo coøn laïi laø 94,4% theå tích ban ñaàu. Theå tích giaûm chuû yeáu ôû nhöõng meû leân men ñaàu. Ñieàu naøy bôûi vì söï chuyeån ñoåi ñöôøng trong taùo thaønh ethanol vaø/hoaëc thay theá baèng teá baøo. Sau khoaûng thôøi gian ñoù thì theå tích mieáng taùo oån ñònh cho ñeán khoaûng 7 thaùng bôûi vì mieáng taùo chæ coøn laïi cellulose vaø nhöõng thaønh phaàn khoâng theå leân men khaùc. KHI LEÂN MEN GIAÙN ÑOAÏN ÔÛ NHIEÄT ÑOÄ PHOØNG VAØ NHIEÄT ÑOÄ THAÁP: [21] Trong khoaûng thôøi gian leân men 7 thaùng thì hoaït tính xuùc taùc khoâng bò maát. Naêng suaát saûn xuaát röôïu giaûm khi nhieät ñoä giaûm , nhöng thaäm chí ôû nhieät ñoä thaáp naêng suaát vaãn cao hôn nhieàu laàn khi so saùnh vôùi leân men truyeàn thoáng. ÔÛ 6oC, chaát xuùc taùc sinh hoïc saûn xuaát röôïu trong 8 ngaøy, ngaén hôn khoaûng thôøi gian caàn thieát leân men dòch nho töï nhieân vaø trong coâng nghieäp söû duïng chuûng naám men thöông maïi coù saün. ÔÛ 1oC saûn xuaát röôïu vang hieäu quaû trong 1 thaùng. Noàng ñoä ethanol vaø ñöôøng coøn soùt laïi naèm ôû khoaûng giöõa röôïu vang khoâ vaø vang baùn ngoït. Noàng ñoä cao cuûa ñöôøng soùt ñöôïc quan saùt ôû moät vaøi meû leân men ñöôïc thöïc hieän cho ñeán khi noàng ñoä khoaûng 0,5-1oBe (ñöôïc döøng laïi moät caùch coá yù), ñeå giöõ laïi hoaït tính cho teá baøo. Söï giaûm nheï cuûa axit toång ñöôïc quan saùt khi nhieät ñoä leân men giaûm coù theå laø bôûi vì söï keát tinh cuûa muoái tartaric khi nhieät ñoä giaûm. Tuy nhieân söï giaûm naøy khoâng ñaùng keå trong taát caû tröôøng hôïp. Löôïng axit bay hôi raát thaáp neân chaát löôïng saûn phaåm cao. Leân men lieân tuïc: [21] Saccharomyces cerevisiae coá ñònh treân mieáng taùo ñöôïc duøng trong quaù trình leân men lieân tuïc. Thieát bò phaûn öùng vaän haønh lieân tuïc trong 95 ngaøy maø khoâng coù söï giaûm bôùt hoaït tính chaát xuùc taùc sinh hoïc. Söï oån ñònh veà vaän haønh cuûa heä thoáng ñöôïc quan saùt ít nhaát laø 71 ngaøy. Söï oån ñònh veà vaän haønh coù theå do khaû naêng chòu löôïng coàn cao cuûa chaát xuùc taùc sinh hoïc mang treân mieáng taùo, cuõng nhö tính chòu laïnh töï nhieân cuûa chuûng naám men söû duïng. Chaát xuùc taùc sinh hoïc ñöôïc mang treân mieáng taùo toû ra laø beàn veà ñoäng hoïc vaø hoaù hoïc trong suoát quaù trình lieân tuïc. Theâm vaøo ñoù naám men ñöôïc coá ñònh nhìn chung laø oån ñònh trong 95 ngaøy vaø khoâng coù söï khaùc bieät veà hoaït ñoäng trao ñoåi chaát. Noùi chung, naêng suaát saûn xuaát röôïu cao hôn trong tröôøng hôïp leân men giaùn ñoaïn, ñaëc bieät laø ôû nhieät ñoä thaáp. Trong tröôøng hôïp naøy thì naêng suaát saûn xuaát röôïu moãi ngaøy cuõng giaûm khi nhieät ñoä leân men giaûm. Löôïng ethanol vaø ñöôøng soùt trong khoaûng giöõa röôïu vang khoâ vaø baùn ngoït. ÔÛ nhieät ñoä thaáp noàng ñoä ñöôøng soùt cao bôûi vì toác ñoä doøng chaûy cao ñeå ñaït naêng suaát toái ña. Löôïng axit toång ôû möùc giöõa vang khoâ vaø vang baùn ngoït, vaø löôïng axit bay hôi thaáp. Maëc duø quaù trình leân men röôïu ñöôïc thöïc hieän treân dòch quaû ñaõ khöû truøng, kyõ thuaät leân men cuõng coù theå öùng duïng treân dòch quaû töôi, khi maø naám men coá ñònh troäi hôn trong dòch leân men nhôø vaøo noàng ñoä cao cuûa teá baøo naám men. Do ñoù söï phaùt trieån cuûa naám men daïi coù theå toàn taïi trong dòch quaû töôi seõ bò öùc cheá. Theâm vaøo ñoù thôøi gian leân men thaáp, neân khoâng coù khaû naêng coù söï chuyeån hoùa cô chaát cuûa heä vi sinh vaät töï phaùt aûnh höôûng leân quaù trình leân men vaø chaát löôïng saûn phaåm. Baûng III.1: Keát quaû kieåm tra muøi vaø vò cuûa röôïu saûn xuaát töø teá baøo Saccharomyces cerevisiae coá ñònh treân mieáng taùo trong suoát quaù trình leân men lieân tuïc so saùnh vôùi röôïu thöông maïi:[19] Kieåm tra S.cerevisiae coá ñònh treân mieáng taùo Röôïu thöông maïi Muøi 7,4±1,07 6,8±1,4 Vò 6,6±1,35 4,3±1,57 Giaù trò coù nghóa : 0 laø khoâng chaáp nhaän, 10 laø tuyeät vôøi. Vaät lieäu cellulose ñaõ loaïi lignin (DCM): [5] a.Nguyeân taéc: Loaïi lignin ra khoûi cellulose ñeå taïo loå troáng treân muøn cöa, do ñoù noù thích hôïp ñeå nhoát teá baøo vaøo loå xoáp. Coá ñònh teá baøo baèng löïc Van der Waal, lieân keát hoùa hoïc nhö lieân keát hydro giöõa nhoùm hydroxyl cuûa cellulose vaø nhoùm cacboxyl, hydroxyl vaø cacboxyl cuûa thaønh teá baøo. b. Söï chuaån bò DCM vaø coá ñònh teá baøo : Caùch 1: Teá baøo taêng tröôûng trong moâi tröôøng vôùi noàng ñoä Be vaøo khoaûng 7,1-11,4; 0,4% chaát chieát naám men; 0,1% (NH4)2SO4; 0,1% KH2PO4/l vaø 0,5% MgSO4. Tröôùc ñoù moâi tröôøng ñöôïc tieät truøng ôû 130 oC trong 15 phuùt. Moät cheùn lôùn 5 lít ñöôïc cho vaøo 300g muøn cöa vaø 3 lít dung dòch natri hydroxit 1%. Hoãn hôïp naøy ñöôïc ñun noùng 3 giôø ôû nhieät ñoä soâi, vaø theå tích nöôùc trong suoát quaù trình ñun noùng ñöôïc giöõ khoâng thay ñoåi baèng caùch ñoå theâm nöôùc vaøo. Sau ñoù noù ñöôïc loïc qua pheãu, vaø DCM ñöôïc röûa moät vaøi laàn vôùi nöôùc noùng 80oC. Saûn phaåm ñöôïc aán qua moät caùi pheãu bôûi moät caùi cheùn lôùn ñeå loaïi nöôùc. Söï chuaån bò naøy ñeå taïo ra moät DCM aåm ñöôïc duøng tieáp theo cho coá ñònh teá baøo. Trong moâi tröôøng 800ml chöùa khoaûng 12% glucoza vôùi pH 4,8 (ñöôïc ñieàu chænh bôûi cho theâm axit sunfuric ) cho vaøo 16g teá baøo aåm Saccharomyces cerevisiae. Noù ñöôïc troän vôùi 170g DCM öôùt vaø ñeå leân men trong 6 giôø. Sau thôøi gian naøy chaát loûng ñöôïc roùt ra vaø chaát raén ñöôïc röûa 2 laàn, moãi laàn 400ml moâi tröôøng chöùa glucoza. Sau khi loïc vaø aán treân pheãu, chaát xuùc taùc sinh hoïc ñöôïc mang treân DCM ñöôïc thu, vaø ñöôïc duøng tröïc tieáp cho quaù trình leân men theo meû. Muøn cöa Loaïi lignin Ñun noùng Loïc qua pheãu NaOH Moâi tröôøng taêng tröôûng Phoái troän Röûa vôùi nöôùc noùng Moâi tröôøng Tieät truøng Nuoâi caáy Naám men Leân men Roùt dòch Röûa Teá baøo coá ñònh treân DCM Caùch 2: Cung caáp muøn cöa vaøo moãi ngaên cuûa thieát bò phaûn öùng sinh hoïc. Vaø thieát bò phaûn öùng ñöôïc laøm ñaày baèng nöôùc, cung caáp töø treân cho ñeán khi cao hôn lôùp muøn cöa. Sau ñoù NaOH ñöôïc theâm vaøo cho ñeán noàng ñoä 1% . Hôi nöôùc ñöôïc duøng ñeå taêng nhieät doä leân 100oC vaø gia nhieät trong 3 giôø. Sau ñoù nöôùc töø voøi ñöôïc cung caáp trong trong 3 giôø ñeå röûa DCM nhöng nöôùc khoâng ñöôïc loaïi DCM, tieáp theo laø quaù trình khuaáy baèng khoâng khí. Quaù trình röûa, khuaáy ñöôïc thöïc hieän ñeán pH cuûa nöôùc baèng 7. Chaát mang saün saøng ñeå coá ñònh teá baøo. Dòch nho ôû 25oC chöùa 20 g/l teá baøo Saccharomyces cerevisiae ñöôïc roùt vaøo trong thieát bò phaûn öùng sinh hoïc ñeán khi noù vöôït qua löôùi. Dòch nho ñöôïc ñeå leân men vaø moät thôøi gian ngaén tröôùc khi hoaøn thaønh quaù trình leân men dòch nöôùc nho khaùc khoâng khöû truøng ñöôïc cung caáp vaøo vôùi toác ñoä 400l/h . Nhieät ñoä thì giaûm moãi ngaøy 2oC cho ñeán 16oC. Söï cung caáp dòch nho phaûi ñöôïc ñieàu chænh ñöa vaøo moät löôïng ñeå ñaït ñöôïc noàng ñoä oBe luùc ra gaàn baèng 0. Löôïng DCM vaøo cylon ñöôïc taùi söû duïng trong thieát bò phaûn öùng sinh hoïc. Neáu nhö chaát mang bò nhieãm, quaù trình seõ döøng laïi, röôïu ñöôïc gaïn vaø toaøn boä quaù trình ñöôïc laëp laïi.[36] c. Hieäu quaû saûn xuaát cuûa teá baøo naám men röôïu vang coá ñònh treân DCM: [5] Quaù trình leân men theo meû ôû nhöõng nhieät ñoä khaùc nhau ñöôïc thöïc hieän bôûi chaát xuùc taùc ñöôïc mang treân DCM thì nhanh hôn teá baøo töï do vôùi noàng ñoä teá baøo nhö nhau. Toác ñoä leân men taêng ít nhaát 3 laàn khi so saùnh vôùi teá baøo töï do. Taêng toác ñoä saûn xuaát ethanol. Vaän haønh oån ñònh cao. Chaát xuùc taùc sinh hoïc mang treân DCM laøm giaûm naêng löôïng hoaït hoùa. Cellulose laøm taêng cöôøng hoaït ñoäng leân men. Caûi thieän veà chaát löôïng caûm quan. DCM laø chaát mang tinh khieát tieâu chuaån thöïc phaåm, reû , phong phuù, deã daøng chuaån bò veà maët coâng nghieäp, deã ñöôïc chaáp nhaän bôûi ngöôøi tieâu thuï, khoâng duøng theâm hoùa chaát. d. So saùnh vôùi chaát mang khaùc [36] Duøng chaát mang laø DCM cho vò toát hôn khi so saùnh vôùi gluten pellet vaø chaát mang voâ cô kissiris, giaûm löôïng ñoäc toá khi so saùnh vôùi gluten pellet vaø chaát mang voâ cô kissiris. Duøng DCM caûi thieän veà muøi vò khi tieán haønh leân men ôû nhieät ñoä thaáp. Giaûm moät löôïng lôùn chaát bay hôi nhö röôïu baäc cao vaø röôïu amyl. DCM khoâng ñaét vaø deã daøng ñieàu khieån trong lónh vöïc coâng nghieäp, coù theå ñöôïc taûi vaøo hoaëc truùt ra deã daøng hôn khi so saùnh vôùi gluten vaø kissiris. Noù cuõng laø moät vaät lieäu phoå bieán trong töï nhieân vaø tinh khieát theo tieâu chuaån thöïc phaåm. Ñaù kissiris: a. Giôùi thieäu veà chaát mang: [39a] Ñaù kissiris ñöôïc hình thaønh töø lôùp boït daøy cuûa dung nham nuùi löûa. Khoaùng raén chöùa SiO2 vaøo khoaûng 70% veà khoái löôïng. Kissiris coù ñoä goà gheà vaø tính xoáp cao. Noù cung caáp moät dieän tích beà maët lôùn vaø deã daøng lieân keát teá baøo. Tính chaát oån ñònh vaø tính trô baåm sinh cuûa chaát mang töï nhieân naøy laø moät öu theá hôn nhöõng chaát mang toång hôïp. Kissiris coù tính beàn, oån ñònh, nguoàn goác töï nhieân. Maëc duø caû kissiris vaø teá baøo naám men ñeàu tích ñieän aâm treân beà maët, kissiris ít ñieän tích aâm hôn vaø trong khoaûng pH töø 3 ñeán 7 thì söï lieân keát vôùi teá baøo naám men coù theå xaûy ra. Nhöôïc: Nguyeân lieäu coù theå bò raõ ra trong quaù trình nuoâi caáy vi sinh vaät, vaø coù theå thaûi ra moät soá ñoäc toá khoâng mong muoán trong moâi tröôøng. b. Phöông phaùp chuaån bò Kissiris:[39] Moät mieáng kissiris khoaûng 100g ñöôïc ñaäp vôõ thaønh nhöõng mieáng troøn ñöôøng kính khoaûng 1cm söû duïng moät caùi buùa nhoû. Nhöõng mieáng kissiris ñöôïc ngaâm vaøo trong dung dòch NaOH 0,1M trong moät vaøi phuùt, sau ñoù ñöôïc ngaâm trong dung dòch H2SO4 0,05M. Nhöõng mieáng naøy ñöôïc röûa vôùi nöôùc caát moät vaøi laàn cho ñeán khi pH cuûa dung dòch laø pH 6,5 vaø khoâng coøn tính chaát axit. Chuùng ñöôïc ñaët trong moät caùi coác ñaët trong beå nöôùc soâi trong 10 phuùt vaø sau ñoù laøm khoâ chuùng trong loø ôû 105oC suoát ñeâm. Cuoái cuøng kissiris ñöôïc khöû truøng ôû nhieät ñoä 180oC trong moät giôø. Kissiris Ngaâm Laøm khoâ Röûa Kissiris ñaõ ñöôïc chuaån bò Hình III.4 Ñaù kissiris. c. Hieäu quaû cuûa phöông phaùp coá ñònh: [3] Chaát xuùc taùc sinh hoïc ñöôïc mang treân kissiris, ñöôïc chuaån bò baèng caùch coá ñònh chuûng naám men chòu coàn, chòu laïnh treân mineral kissiris, phuø hôïp vôùi quaù trình saûn xuaát röôïu vang lieân tuïc ôû nhieät ñoä thaáp (5-16oC). Naêng suaát saûn xuaát ethanol ôû 5oC bôûi quaù trình leân men lieân tuïc thì baèng vôùi naêng suaát quan saùt ôû nhieät ñoä 22-25oC bôûi quaù trình leân men töï nhieân. Hieäu quaû quan troïng ñaït ñöôïc ôû nhieät ñoä thaáp laø do söï giaûm naêng löôïng hoaït hoùa, gaây ra bôûi chaát mang mineral kissiris. Thieát bò leân men lieân tuïc hoaït ñoäng trong 75 ngaøy maø khoâng coù söï giaûm bôùt naêng suaát saûn xuaát ethanol. Vaø ñieàu cuoái cuøng laø röôïu ñöôïc saûn xuaát vôùi löôïng axit toång coäng vaø axit bay hôi thaáp khi so saùnh vôùi röôïu ñaït ñöôïc bôûi quaù trình leân men töï nhieân ôû 22-25oC. Vaán ñeà baûo quaûn chaát mang lieân tuïc ôû nhieät ñoä thaáp: Taêng tính oån ñònh cuûa chaát xuùc taùc sinh hoïc vaø taêng naêng suaát saûn xuaát ethanol vaø röôïu. Ñaëc bieät teá baøo coù theå soáng trong 2,5 naêm, saûn xuaát röôïu theo meû vaø quaù trình lieân tuïc. Theâm vaøo ñoù naêng suaát saûn xuaát röôïu vaø ethanol cao hôn ít nhaát laø naêm laàn khi so vôùi teá baøo coá ñònh treân chaát mang töông töï maø khoâng baûo quaûn ôû nhieät ñoä thaáp. Söï chuyeån hoùa vaø noàng ñoä ethanol cao hôn khi leân men vôùi chaát xuùc taùc mang treân kissiris maø khoâng baûo quaûn lieân tieáp ôû 0oC. DEAE-cellulose [24] a. Chaát mang vaø nguyeân taéc coá ñònh teá baøo: Haït DEAE-cellulose (trao ñoåi ion yeáu) laø chaát mang coù theå tieät truøng ñöôïc vaø coù tính chaát khoâng neùn, keát tuï vôùi polystyrene. Noù beàn trong moâi tröôøng axit vaø kieàm, coù theå chòu ñöôïc nhieät ñoä leân ñeán 100 oC neân deã daøng tieät truøng trong coät. Heä thoáng chaát mang ñöôïc chuaån bò nhö sau, hydrat hoùa chaát mang khoâ trong nöôùc sau ñoù bôm vaøo coät phaûn öùng. Quaù trình coá ñònh teá baøo naám men ñöôïc thöïc hieän sau khi tieät truøng chaát mang baèng caùch bôm hoãn hôïp huyeàn phuø naám men vaøo trong thieát bò phaûn öùng. Chaát mang DEAE-cellulose coù khaû naêng lieân keát naám men leân beà maët cuûa noù. Ñoù laø nhôø vaøo ñaëc ñieåm beà maët chaát mang, goà gheà, coù maét löôùi, vaø toàn taïi moät maïng xoáp daïng haït hoaëc lieân tuïc. Khaû naêng lieân keát naøy laø do löïc ñieän töø giöõa nhoùm trao ñoåi anion (tích ñieän döông) cuûa chaát mang vaø thaønh teá baøo tích ñieän aâm. Maät ñoä teá baøo naám men toát nhaát laø vaøo khoaûng 109-1012 teá baøo treân 1 lít cuûa chaát mang, toái öu laø khoaûng 109 teá baøo. Maät ñoä phaûi coù khaû naêng cung caáp ñuû hoaït tính xuùc taùc ñeå chuyeån ñöôøng thaønh ethanol. b. Phöông phaùp chuaån bò coät vaø coá ñònh teá baøo. Tröôùc tieân cho nöôùc vaøo nöûa bình hydrat hoaù, khôûi ñoäng heä thoáng vaø cho chaát mang khoâ vaøo bình. Khi quaù trình hydrat hoùa hoaøn thaønh (khoaûng 5 giôø), cho nöôùc vaøo reactor ñeán phaân nöûa vaø hoãn hôïp chaát mang töø bình hydrat ñöôïc chuyeån vaøo reactor. Ñeå giöõ möùc nöôùc trong reactor oån ñònh, van döôùi cuøng trong reactor ñöôïc ñieàu chænh ñeå doøng chaûy vaøo vaø ra nhö nhau. Chaát mang trong thieát bò ñöôïc khöû truøng vôùi dung dòch kieàm pha loaõng baèng caùch bôm noù qua reactor. Ñeäm chaát mang sau ñoù ñöôïc röûa vôùi nöôùc vaø trung hoaø baèng moät löôïng axit loaõng phuø hôïp bôm qua reactor vaø cuoái cuøng ñeäm chaát mang ñöôïc röûa baèng nöôùc ñaõ khöû truøng. Hoãn hôïp naám men ñöôïc bôm qua ñeäm chaát mang trong khoaûng 1 - 4 giôø vaø naám men töï baûn thaân noù lieân keát vôùi chaát mang. Naám men coá ñònh leân treân chaát mang trong reactor. Chaát mang Hydrat hoaù Chuyeån vaøo reactor Khöû truøng Röûa vaø trung hoaø Coá ñònh teá baøo Naám men Teá baøo coá ñònh c. Hieäu quaû cuûa phöông phaùp coá ñònh: Chaát mang laø moät ñieàu kieän quan troïng ñeå cung caáp moâi tröôøng cho naám men taêng tröôûng vaø tieáp xuùc vôùi cô chaát. Chaát mang trao ñoåi anion, khoâng neùn DEAE-cellulose coù moät vaøi ñaëc tröng coù lôïi hôn khi so saùnh vôùi chaát mang meàm daïng gel nhö haït gel alginat. Ñoù laø gaëp ít vaán ñeà veà chuyeån khoái hôn, coá ñònh deã daøng hôn, söï khôûi ñoäng nhanh hôn, môû roäng phaïm vi deã daøng hôn, caûi thieän veà khaû naêng taùi sinh vaø thôøi gian söû duïng chaát mang. Chaát mang ñöôïc laøm töø DEAE-cellulose thì deã söû duïng ñeå leân men coàn do coù söï tieáp xuùc toát giöõa naám men vaø cô chaát. Kieåu töông taùc giöõa teá baøo naám men coá ñònh vaø chaát mang naøy coù theå giaûi thích cho söï taêng veà naêng suaát. Ñoái vôùi haït alginat naám men taêng tröôûng trong töøng vuøng, moät vaøi taêng tröôûng ñi qua lôùp gel alginat ñeán beà maët haït. Nhöõng vuøng naám men nhö laø nhöõng khu vöïc hoaït hoùa trong haït alginat. Coøn nhöõng haït DEAE-cellulose thì xoáp vaø maïng hình maét löôùi cuûa nhöõng vi sôïi. Caáu truùc naøy cho pheùp cô chaát coù theå ñeán gaàn teá baøo naám men taêng tröôûng beân trong haït. Do ñoù maø teá baøo taêng tröôûng khaù loûng leûo vaø taùch bieät nhau beân trong vaø beân ngoaøi cuûa bao vi sôïi vaø nhöõng teá baøo rieâng leû naøy hoaït ñoäng nhö laø vò trí hoaït hoùa leân men trong coät. Nhieàu teá baøo treân moät ñôn vò dieän tích beà maët coù theå leân men. Cô cheá cuûa vieäc coá ñònh teá baøo naám men treân beà maët haït DEAE-cellulose, cung caáp nhieàu lôïi ích: 1.Teá baøo naám men veà cô baûn thì taát caû ôû treân beà maët chaát mang. Do ñoù teá baøo naám men hoaït ñoäng nhö laø chuùng lô löûng töï do trong dung dòch. 2. Giôùi haïn veà khuyeách taùn khoâng ñaùng keå, vaø cô chaát di ñoäng hình thaønh söï tieáp xuùc töï do vôùi naám men. Cuõng nhö chaát dinh döôõng maø naám men caàn ñeå soáng saün coù ñeå duøng maø khoâng bò ngaên caûn bôûi nhu caàu thaám vaøo beân trong cuûa phaàn töû chaát mang. 3. Tính chaát chaát mang cho pheùp khôûi ñoäng vaø taùi sinh deã daøng bôûi vì söï coá ñònh teá baøo naám men coù theå thöïc hieän ngay trong coät. Phöông phaùp naøy laøm giaûm söï ruûi ro nhieãm vaø caûi thieän ñieàu kieän cuûa heä thoáng veà toaøn boä. Theâm vaøo ñoù coät coù theå taùi sinh deã daøng theå hieän moät tính kinh teá quan troïng. Vieäc taùi söû duïng ñoâi khi caàn thieát bôûi vì taïp chaát hoùa hoïc vaø söï nhieãm töø dung dòch, nhieãm vi sinh vaät vaø töø söï bieán ñoåi vieäc coá ñònh teá baøo naám men. Ñeå taùi sinh coät phaûn öùng laøm töø chaát mang nhö DEAE-cellulose, coät ñaõ söû duïng coù theå ñöôïc röûa vaø tieät truøng vôùi dung dòch kieàm noùng hoaëc vôùi moät moâi tröôøng tieät truøng khaùc nhö laø moät taùc nhaân höõu cô trong nöôùc. Sau khi röûa vaø trung hoøa thì chaát mang saün saøng ñeå taùi coá ñònh teá baøo. ÔÛ quy moâ nhoû, coät coù theå söû duïng 13 tuaàn maø khoâng caàn taùi sinh. Trong phoøng thí nghieäm, coät töông töï coù theå duøng trong 30 tuaàn. Noùi chung toaøn boä heä thoáng thieát bò phaûn öùng, bao goàm caû chaát mang, coù theå tieät truøng nhö treân. Khi naám men trong moâi tröôøng voâ truøng sau ñoù ñöôïc bôm vaøo hoaëc taùch röûa qua ñeäm chaát mang, ruûi ro nhieãm naám men hoaëc chaát mang vôùi chuûng daïi, vi khuaån daïi laø nhoû nhaát. Khi naám men lieân keát vôùi coät (109-1012 teá baøo naám men/ 1lít chaát mang), coät coù theå coù ñieàu kieän toát hôn bôûi söï bôm chaäm chaát dinh döôõng nhö laø moâi tröôøng amoni phophat vaø ñöôøng qua coät phaûn öùng trong khoaûng moät ngaøy. Quaù trình naøy giuùp naám men phaùt trieån ñeán maät ñoä lôùn nhaát. Heä thoáng saûn xuaát ethanol nhanh vaø thuaän tieän hôn quaù trình leân men truyeàn thoáng, saûn xuaát ra saûn phaåm vôùi muøi vò töông ñöông. Thôøi gian caàn thieát ñeå leân men giaûm, töø vaøi tuaàn thaønh vaøi giôø tieát kieäm veà thôøi gian vaø tieàn baïc. d.Caùc yeáu toá aûnh höôûng: Döôùi aùp suaát thöôøng, thieát bò leân men lieân tuïc hay bình phaûn öùng coù theå vaän haønh nhö sau. Cô chaát ñöôïc cho vaøo ôû döôùi thieát bò phaûn öùng vaø CO2, hình thaønh trong suoát quaù trình leân men, ñöôïc pheùp töï do thoaùt ra khoûi ñeäm chaát mang. Tuy nhieân vôùi kyõ thuaät naøy khoâng theå ñaït ñeán traïng thaùi chaûy lyù töôûng (khí CO2 luoân laøm xaùo troän ñeäm) vaø söï hoøa tan trôû laïi cuûa noù gaây öùc cheá ethanol neân naêng suaát thaáp. Heä thoáng chaát mang naøy coù theå vaän haønh döôùi ñieàu kieän aùp suaát ñeå giöõ cacbon dioxide ôû traïng thaùi hoøa tan. Coät vaän haønh trong ñieàu kieän doøng chaûy xuoáng, vaø tieán ñeán söï chaûy lyù töôûng. Aùp suaát vaän haønh neân ñuû cao ñeå traùnh cacbon dioxide trong coät vaø traùnh söï taïo raõnh coù theå xaûy ra khi khí CO2 qua coät coá ñònh naám men. Giaù trò ñieån hình laø 14 bar. Toác ñoä doøng chaûy cô chaát laø moät thoâng soá quan troïng bôûi vì khaû naêng saûn xuaát coàn phuï thuoäc vaøo toác ñoä doøng chaûy. Noù aûnh höôûng ñeán löôïng teá baøo naám men coøn lieân keát vôùi chaát mang. Toác ñoä doøng chaûy cao, löôïng teá baøo naám men thoaùt ra taêng; do ñoù naêng suaát saûn xuaát ethanol coù theå phuï thuoäc vaøo löôïng teá baøo lieân keát vôùi heä thoáng coá ñònh, khoâng chæ phuï thuoäc vaøo löôïng cô chaát vaøo. Toác ñoä doøng chaûy quaù cao, naêng suaát saûn xuaát ethnol khoâng ñaày ñuû, khoâng töông xöùng. Baèng caùch ñieàu chænh toác ñoä chaûy, noàng ñoä ethanol coù theå ñöôïc ñieàu chænh. ÔÛ toác ñoä doøng chaûy thaáp, löôïng teá baøo coøn lieân keát vôùi vaät lieäu chaát mang töông ñoái oån ñònh, laø do löôïng teá baøo taêng tröôûng vaø löôïng thoaùt ra khoûi chaát mang caân baèng vôùi nhau. Vôùi toác ñoä doøng chaûy cao hôn thì söï thoaùt teá baøo taêng nhöng soá löôïng teá baøo laïi trôû veà möùc bình thöôøng khi toác ñoä doøng chaûy giaûm trôû laïi. Nhöng toác ñoä doøng chaûy phaûi ñuû cao ñeå coù theå loaïi khoûi chaát mang nhöõng teá baøo cheát traùnh hieän töôïng töï phaân. Nhoát trong khung maïng xoáp. Polyvinyl alcohol Polyvinyl alcohol laø chaát mang coá ñònh teá baøo baèng phöông phaùp taïo cryogel, ñaây laø moät caáu truùc gel polymer môùi. Vieäc nghieân cöùu vaø taïo ra nhöõng caáu truùc môùi nhö cryogel goùp phaàn laøm kyõ thuaät coá ñònh teá baøo vi sinh vaät ña daïng hôn. Cryogel ñöôïc hình thaønh baèng caùch söû duïng caùc phöông phaùp laøm ñoâng laïnh (nhö caáp ñoâng, baûo quaûn ôû traïng thaùi baêng trong moät thôøi gian xaùc ñònh vaø laøm tan giaù) nhöõng tieàn polymer coù phaân töû löôïng thaáp hoaëc cao. Döôùi ñieàu kieän nhieät ñoä raát thaáp, maãu nguyeân lieäu seõ bieán ñoåi vaø hình thaønh nhöõng caáu truùc môùi. Kyõ thuaät laïnh ñoâng laø moät trong nhöõng phöông phaùp höõu duïng nhaát ñöôïc nghieân cöùu nhaèm khaéc phuïc tính chaát keùm beàn nhieät vaø khoâng beàn trong dung dòch nöôùc cuûa nhieàu loaïi vaät lieäu polymer. Trong kyõ thuaät laïnh ñoâng, maãu thí nghieäm ñöôïc xöû lyù ôû nhieät ñoä raát thaáp döôùi aùp suaát nhaèm traùnh söï chuyeån pha cuûa nöôùc vaø söï oxy hoaù. Keát quaû laø maãu thí nghieäm seõ cöùng laïi döôùi taùc duïng cuûa nhieät ñoä thaáp vaø töø ñoù hình thaønh moät caáu truùc nhö mong muoán. Nhöõng nhaø nghieân cöùu ñaõ chöùng toû raèng nhieàu loaïi caáu truùc gel polymer khaùc nhau seõ ñöôïc taïo ra töông öùng vôùi nhöõng quaù trình thöïc hieän trong nhöõng cheá ñoä khaùc nhau cuûa quaù trình laïnh ñoâng – raõ ñoâng. a.Chaát mang: Polyvinyl alcohol laø moät loaïi polymer thu huùt ñöôïc raát nhieàu söï quan taâm nghieân cöùu bôûi nhieàu tính chaát ñaëc tröng cuûa noù, thoaû maõn nhöõng yeâu caàu khi ñöa vaøo öùng duïng trong nhieàu lónh vöïc khaùc nhau nhö döôïc phaåm, sinh hoaù, … Phaân töû polyvinyl alcohol coù caáu truùc hoaù hoïc töông ñoái ñôn giaûn vôùi caùc nhoùm hydroxyl (-OH) naèm ñoái xöùng nhau trong phaân töû. Nhöõng monomer – vinyl alcohol – khoâng toàn taïi ôû daïng oån ñònh maø chuùng töï saép xeáp laïi thaønh nhöõng tautomer cuûa phaân töû (acetaldehyde). Coâng thöùc phaân töû polyvinyl alcohol: Hình III.5 Coâng thöùc caáu taïo cuûa phaân töû polyvinyl alcohol. Polyvinyl alcohol ñöôïc saûn xuaát baèng caùch tieán haønh polymer hoaù caùc monomer vinyl acetate thaønh caùc polymer polyvinyl acetate. Polyvinyl acetate ngay sau ñoù seõ tham gia phaûn öùng thuyû phaân taïo thaønh saûn phaåm chính laø caùc polyvinyl alcohol. [13] Hình III.6 Coâng thöùc caáu taïo cuûa phaân töû polyvinyl acetate. Caùc böôùc toång hôïp polyvinyl alcohol töø caùc monomer vinyl acetate: [14] Polymer hoaù caùc monomer vinyl acetate thaønh caùc polymer polyvinyl acetate: Thuyû phaân chuoãi polyvinyl acetate taïo polyvinyl alcohol: Thoâng thöôøng, polyvinyl alcohol ôû daïng raén, khoâ. Döôùi daïng cheá phaåm thöông maïi, polyvinyl alcohol coù daïng haït nhoû hay boät mòn maøu traéng. Polyvinyl alcohol beàn trong caùc loaïi dung moâi, daàu thöïc vaät vaø caû môõ ñoäng vaät. Chuùng coù khaû naêng hình thaønh moät maøng moûng vôùi löïc caêng beà maët lôùn. Polyvinyl alcohol laø loaïi polymer coù khaû naêng tan trong nöôùc vaø an toaøn. Ñaây laø nhöõng tính chaát cô baûn khieán noù trôû thaønh moät loaïi chaát mang toát trong kyõ thuaät coá ñònh teá baøo vi sinh vaät. Polyvinyl alcohol ñöôïc phaân loaïi chuû yeáu döïa treân möùc ñoä thuyû phaân vaø möùc ñoä truøng hôïp hoaù. Möùc ñoä truøng hôïp hoaù seõ bieåu thò cho soá löôïng monomer tham gia phaûn öùng toång hôïp. Möùc ñoä thuyû phaân hay möùc ñoä xaø phoøng hoaù seõ bieåu thò cho khaû naêng chuyeån hoaù polyvinyl acetate thaønh polyvinyl alcohol. Hình III.7 Möùc ñoä thuyû phaân cuûa phaân töû polyvinyl alcohol: (a) thuyû phaân hoaøn toaøn, (b) thuyû phaân moät phaàn. Baûng III.2. Moät soá cheá phaåm polyvinyl alcohol thöông maïi Kyù hieäu Coâng ty saûn xuaát Khoái löôïng trung bình Tính chaát P – 8136 P – 1763 38,834 – 3 56,390 – 0 Sigma – Myõ Sigma – Myõ Merck Merck 30.000 – 70.000 70.000 – 100.000 50.000 – 85.000 124.000 – 186.000 Ñoä nhôùt cuûa dung dòch 4% ôû 200C laø 4 cPs. Ñoä nhôùt cuûa dung dòch 4% ôû 200C laø 11 - 13 cPs. Ñoä thuyû phaân 97%, ñoä nhôùt dung dòch 4% laø 6 – 22 cPs. Ñoä thuyû phaân 99%, ñoä nhôùt dung dòch 60 cPs. Tính chaát: Tính chaát cuûa caùc loaïi polyvinyl alcohol thay ñoåi phuï thuoäc vaøo khoái löôïng trung bình cuûa phaân töû polyvinyl acetate ban ñaàu vaø phuï thuoäc vaøo möùc ñoä thuyû phaân cuõng nhö möùc ñoä truøng hôïp hoaù cuûa phaân töû ñoù. Nhöõng yeáu toá naøy ñeàu coù theå kieåm soaùt trong quaù trình toång hôïp. Ngoaøi ra, nhöõng yeáu toá moâi tröôøng cuõng gaây nhöõng taùc ñoäng laøm thay ñoåi tính chaát cuûa polyvinyl alcohol. Tính tan: Polyvinyl alcohol tan deã daøng trong nöôùc nhöng khaû naêng hoaø tan cuûa chuùng phuï thuoäc vaøo baûn chaát cuûa phaân töû polymer, khoái löôïng phaân töû trung bình, möùc ñoä thuyû phaân, möùc ñoä truøng hôïp hoaù vaø nhieät ñoä khi hoaø tan: Khaû naêng hoaø tan cuûa phaân töû polyvinyl alcohol trong nöôùc taêng ñaùng keå khi khoái löôïng phaân töû trung bình giaûm, coù nghóa laø möùc ñoä polymer hoaù caøng thaáp. Nhìn chung, caùc phaân töû polyvinyl alcohol ñöôïc thuyû phaân moät phaàn deã tan hôn caùc phaân töû ñöôïc thuyû phaân toaøn phaàn. Nghóa laø, polyvinyl alcohol coù möùc ñoä thuyû phaân caøng cao thì khaû naêng hoaø tan trong nöôùc cuûa noù caøng giaûm. Caùc nhoùm acetate kò nöôùc chöa ñöôïc thuyû phaân seõ laøm yeáu lieân keát hydro noäi phaân töû vaø giöõa phaân töû vôùi caùc nhoùm hydroxyl gaàn keà. Tæ leä hoaø tan cuûa polyvinyl alcohol cuõng phuï thuoäc vaøo nhieät ñoä hoaø tan. Nhieät ñoä caøng cao, tæ leä hoaø tan caøng lôùn. Hình III.8 Khaû naêng hoaø tan phuï thuoäc vaøo möùc ñoä thuyû phaân vaø nhieät ñoä. Ñoä nhôùt: Ñoä nhôùt cuûa moät hôïp chaát polymer trong nöôùc xuaát phaùt töø hai nguoàn goác cô baûn, ñoù laø tính baát caân ñoái veà kích thöôùc vaø hieän töôïng quay noäi taïi. Ñoä nhôùt cuûa dung dòch polyvinyl alcohol taêng tæ leä vôùi möùc ñoä thuyû phaân vaø möùc ñoä truøng hôïp cuûa phaân töû. Tính chaát naøy phuï thuoäc nhieàu vaøo möùc ñoä truøng hôïp hôn laø phuï thuoäc vaøo möùc ñoä thuyû phaân. Nhö moïi chaát loûng khaùc, ñoä nhôùt cuûa dung dòch polyvinyl alcohol coøn phuï thuoäc vaøo nhieät ñoä vaø noàng ñoä dung dòch. Khi nhieät ñoä taêng hoaëc noàng ñoä dung dòch giaûm thì ñoä nhôùt giaûm vaø ngöôïc laïi. Ngoaøi ra, caùc töông taùc noäi phaân töû hay töông taùc lieân phaân töû coù taùc duïng laøm giaûm ñoä nhôùt cuûa dung dòch polyvinyl alcohol. Caùc löïc gaây neân töông taùc coù theå keå ñeán laø löïc Val der Waals, löïc Debye, löïc London, löïc lieân keát hydro vaø löïc töông taùc ion. Baûng III.3 AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán ñoä nhôùt cuûa dung dòch 10% polyvinyl alcohol coù phaân töû löôïng laø 115.000: Nhieät ñoä (0C) Ñoä nhôùt (mPa.s) 5 20 40 60 1.900 1.200 450 270 Baûng III.4 AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä dung dòch ñeán ñoä nhôùt cuûa dung dòch polyvinyl alcohol coù phaân töû löôïng laø 115.000: Noàng ñoä dung dòch (%) Ñoä nhôùt (mPa.s) 7 10 15 200 1.900 15.000 Söùc caêng beà maët: Dung dòch polyvinyl alcohol coù chöùc naêng gioáng nhö moät maøng keo baûo veä. Söùc caêng beà maët cuûa dung dòch polyvinyl alcohol taêng khi möùc ñoä thuyû phaân taêng. Noù phuï thuoäc raát ít vaøo möùc ñoä truøng hôïp hoaù. Tính keo: Polyvinyl alcohol coù khaû naêng baùm dính cao hôn so vôùi caùc polymer töï nhieân tan trong nöôùc khaùc. Khi möùc ñoä truøng hôïp vaø möùc ñoä thuyû phaân taêng, tính baùm dính cuûa phaân töû polyvinyl alcohol trong nöôùc cuõng taêng. Dung dòch polyvinyl alcohol coù tính baùm dính maïnh ñoái vôùi caùc chaát öa nöôùc. Khaû naêng chòu nhieät: Polyvinyl alcohol seõ chuyeån sang maøu vaøng döôùi taùc duïng cuûa nhieät ñoä. Nhieät ñoä chaûy meàm laø 150 – 1900C ñoái vôùi phaân töû thuyû phaân moät phaàn vaø 210 – 2300C ñoái vôùi phaân töû thuyû phaân toaøn phaàn. Polyvinyl alcohol bò phaân huyû moät phaàn ôû 200 – 2500C vaø phaân huyû nhanh choùng khi treân 2500C. Phaûn öùng phaân huyû laø phaûn öùng laøm ñöùt caùc lieân keát hoaù hoïc trong maïch chính cuûa phaân töû polymer, laøm thay ñoåi giaù trò khoái löôïng phaân töû trung bình cuûa polymer ñöa ñeán vieäc thay ñoåi tính chaát vaät lyù nhöng khoâng laøm thay ñoåi thaønh phaàn hoaù hoïc cuûa noù. ÖÙng duïng cuûa polyvinyl alcohol: Töø nhöõng tính chaát ñaùng chuù yù treân, ngöôøi ta keát luaän raèng polyvinyl alcohol laø loaïi vaät lieäu ña naêng. Noù trôû thaønh vaät lieäu polymer ñang raát ñöôïc quan taâm nghieân cöùu vaø ñöa vaøo öùng duïng roäng raõi trong coâng nghieäp, ñaëc bieät laø trong ngaønh döôïc, hoaù sinh hoïc, … Trong kyõ thuaät coá ñònh teá baøo vi sinh vaät, phaân töû polyvinyl alcohol trôû thaønh moät löïa choïn haøng ñaàu vôùi nhöõng öu ñieåm noåi baät nhö khoâng ñoäc, khoâng gaây ung thö, coù khaû naêng gaén keát sinh hoïc vaø quy trình saûn xuaát deã daøng. Theâm vaøo ñoù, phaân töû polyvinyl alcohol coøn coù caáu truùc khoâng quaù phöùc taïp, coù theå thay ñoåi caáu truùc gel taïo thaønh baèng caùch choïn loaïi polyvinyl alcohol coù phaân töû löôïng trung bình thích hôïp. Ñaây chính laø nhöõng tính chaát giuùp polyvinyl alcohol trôû thaønh chaát mang khi thöïc hieän coá ñònh teá baøo vi sinh vaät. b. Phöông phaùp thöïc hieän: Cryogel coù theå thu nhaän nhôø söï hình thaønh caû lieân keát vaät lyù laãn lieân keát ñoàng hoaù trò cuûa heä thoáng polymer khoâng ñoàng nhaát. Coù nhieàu phöông phaùp ñeå hình thaønh phaân töû polyvinyl alcohol – cryogel ñi töø dung dòch polyvinyl alcohol vôùi noàng ñoä ban ñaàu xaùc ñònh. Sau ñaây laø moät trong nhöõng phöông phaùp ñoù. Sau thôøi gian nuoâi caáy vi sinh vaät trong moâi tröôøng thích hôïp, ta tieán haønh ly taâm canh tröôøng ñeå thu nhaän huyeàn phuø sinh khoái teá baøo vi sinh vaät. Teá baøo thu ñöôïc taïo huyeàn phuø trong dung dòch PVA 10% (khoái löôïng phaân töû 70000-100000 Da). Huyeàn phuø teá baøo vaø PVA ñöôïc nhoû gioït vaøo moät coät (30x90 cm) chöùa hexan ñöôïc laøm laïnh ôû nhieät ñoä -20oC vaø haït ñoâng laïnh ñöôïc taäp hôïp laïi bôûi moät löôùi daây ñaët ôû döôùi coät. Haït sau ñoù ñöôïc chuyeån ñeán maùy laïnh -20oC vaø baûo quaûn qua ñeâm. Raõ ñoâng ñöôïc thöïc hieän chaäm baèng caùch ñaët haït ôû nhieät ñoä 4oC trong khoaûng thôøi gian khoâng ít hôn 6 giôø. Khi quaù trình raõ ñoâng hoaøn taát, phaàn dung dòch keo (tinh theå ñaù chaûy vaø PVA maø khoâng tham gia hình thaønh maïng gel) vaø hexane bò loaïi ra bôûi söï nhuùng haït vaøo nöôùc voâ truøng hoaëc laø ñeäm acetate 0,1M, pH 5 trong 1 giôø ôû 4oC. Haït PVA cryogel sau ñoù ñöôïc ñaët vaøo moâi tröôøng taêng tröôûng naám men ñeå hoaït hoùa naám men. Naám men Taïo huyeàn phuø Dung dòch PVA 10% Taïo haït Ñoâng laïnh Raõ ñoâng Röûa Teá baøo coá ñònh Dung dòch monomer hay tieàn polymer cuûa gel döôùi cheá ñoä caáp ñoâng oân hoaø seõ taïo thaønh maãu ñaëc cöùng. Tuy nhieân, khi nhìn ôû goùc ñoä vi moâ, caáu truùc maãu thí nghieäm khoâng hoaøn toaøn ñaëc cöùng. Trong caáu truùc maãu ñaëc cöùng môùi hình thaønh coøn coù nhöõng khu vöïc chöa ñoâng hay coøn goïi laø tieåu pha loûng chöa ñoâng. Sau quaù trình raõ ñoâng, gel vôùi nhöõng loã xoáp lôùn ñaëc tröng hay coøn goïi laø cryogel ñöôïc hình thaønh. Caùc loã xoáp naøy chöùa ñaày chaát loûng ñaõ tan ra. Vì theá, tính chaát ña tinh theå cuûa dung moâi ñoùng baêng ñoùng vai troø laø taùc nhaân hình thaønh loã xoáp. Trong suoát quaù trình keát tinh, nhöõng tinh theå cöù lôùn daàn cho ñeán khi tieáp xuùc vôùi moät maët cuûa tinh theå khaùc, heä thoáng caùc loã xoáp lôùn trong cryogel ñöôïc noái lieàn vôùi nhau. Ñoù chæ laø vaøi ñaëc ñieåm veà hình thaùi cuûa vaøi loaïi cryogel khaùc nhau khieán chuùng trôû thaønh nhöõng coâng cuï ñaéc löïc ñeå öùng duïng trong nhieàu lónh vöïc, ñaëc bieät laø trong lónh vöïc coâng ngheä sinh hoïc. Nhöõng chaát xuùc taùc sinh hoïc nhö enzyme hoaëc teá baøo vi sinh vaät coù theå ñöôïc coá ñònh trong gel vôùi nhieàu hình daïng khaùc nhau. Tính linh hoaït naøy khoâng thöôøng thaáy ôû nhieàu loaïi vaät lieäu polymer ñoâng khoâ khaùc. Daïng hình khoái vaø daïng vieân maëc duø deã saûn xuaát nhöng cuõng deã bò maøi moøn. Daïng baûn moûng cuõng deã saûn xuaát nhöng chæ ñöôïc duøng trong nhöõng loaïi thieát bò ñaëc bieät. Nhieàu thieát bò coù theå söû duïng daïng sôïi ñaëc hoaëc sôïi roãng. Tuy nhieân, hình thöùc thöôøng gaëp nhaát ôû caùc chaát xuùc taùc sinh hoïc coá ñònh laø daïng haït caàu. Daïng haït caàu coù theå ñöôïc söû duïng trong haàu heát caùc loaïi thieát bò phaûn öùng maø khoâng bò maøi moøn, laïi deã tính toaùn löôïng trao ñoåi sinh khoái, vaán ñeà hay gaây tranh caõi khi ñöa vaøo saûn xuaát treân quy moâ coâng nghieäp. Ñeå thu ñöôïc teá baøo coá ñònh ôû daïng haït, ngöôøi ta phaûi tieán haønh taïo haït ôû nhieät ñoä thaáp moät caùch tæ mæ. Phöông phaùp naøy cho pheùp vieäc taïo ra nhöõng haït cryogel coù kích thöôùc khaùc nhau. c. Caùc yeáu toá aûnh höôûng: Nhöõng nghieân cöùu veà tính chaát hoaù lyù vaø caáu truùc cuûa polyvinyl alcohol – cryogel chöùng toû raèng, tính chaát xoáp cuûa phaân töû chuû yeáu phuï thuoäc vaøo noàng ñoä cuûa dung dòch polymer ban ñaàu. Ngoaøi ra, tính chaát cuûa cryogel coøn coù theå bò aûnh höôûng bôûi nhieät ñoä laïnh ñoâng, thôøi gian giöõ trong traïng thaùi laïnh ñoâng, tæ leä laïnh ñoâng – raõ ñoâng, caùc dung moâi töï nhieân vaø caùc chaát phuï gia hoaø tan hoaëc khoâng hoaø tan. Gaàn ñaây, ngöôøi ta coøn chöùng minh ñöôïc raèng vieäc boå sung caùc chaát hoaït ñoäng beà maët coù theå aûnh höôûng ñeán tính chaát xoáp cuûa phaân töû polyvinyl alcohol – cryogel. Ví duï, theâm khoaûng 6 mM sodium dodecyl sulfate seõ laøm taêng tieát dieän ngang cuûa loã xoáp khoaûng 1 – 5micromet hoaëc nhieàu hôn. Do ñoù, ta caàn chuù yù khi söû duïng caùc chaát phuï gia khaùc nhau trong quaù trình hình thaønh phaân töû polyvinyl alcohol – cryogel, vì nhöõng chaát phuï gia naøy coù theå laøm thay ñoåi hình thaùi cuûa caùc loã xoáp trong caáu truùc chaát mang coù loã xoáp lôùn nhö polyvinyl alcohol – cryogel. Tính deûo töï nhieân cuûa polyvinyl alcohol khoâng bò aûnh höôûng thaäm chí trong ñieàu kieän khuaáy troän vôùi cöôøng ñoä cao. Polyvinyl alcohol – cryogel trôû neân cöùng hôn khi taêng chu kyø laïnh ñoâng – tan giaù. Dung dòch polyvinyl alcohol chuaån bò ñeå hình thaønh cryogel coù daïng chaát loûng nhôùt chöùa 10% polyvinyl alcohol tan trong nöôùc. Khi dung dòch polyvinyl alcohol naøy ñöôïc troän vôùi 1% (tính theo khoái löôïng) boät mòn silica, hoãn hôïp naøy seõ trôû neân cöùng hôn khi thöïc hieän quaù trình laïnh ñoâng – raõ ñoâng. Tính chaát cöùng cuûa noù taêng tyû leä vôùi soá laàn xöû lyù laïnh ñoâng. d. Caùc vaán ñeà khaùc: Öu ñieåm: Coá ñònh vi sinh vaät trong chaát mang polymer töï nhieân coù theå xem laø phöông phaùp oân hoaø. Tuy nhieân, nhöõng baát lôïi thöôøng gaëp ôû nhöõng chaát mang naøy laø tính beàn cô keùm, ñoä tröông thaáp vaø ñaëc bieät laø khaû naêng phaân huyû sinh hoïc cao, do ñoù yeâu caàu moâi tröôøng thöïc hieän quaù trình phaûi coù ñoä voâ truøng cao. Ñaây laïi chính laø nhöõng thuaän lôïi khi söû duïng nhöõng polymer toång hôïp laøm chaát mang. Nhöõng polymer toång hôïp nhö polyvinyl alcohol, polyurethane, polyacrylate vaø ñoàng polymer cuûa chuùng thöôøng coù tính ñaøn hoài vaø beàn cô cao. Hôn nöõa, nhöõng vaät lieäu polymer naøy khoâng bò phaân huyû sinh hoïc, do ñoù, khoâng caàn quan taâm nhieàu ñeán ñieàu kieän voâ truøng cuûa moâi tröôøng. Cuõng nhö moïi chaát polymer toång hôïp khaùc, polyvinyl alcohol coù ñoä tröông cao, khaû naêng coá ñònh teá baøo toát. Chaát mang polyvinyl alcohol coù caáu truùc loã xoáp ñaëc tröng. Nhôø caáu truùc ñaëc bieät naøy, polyvinyl alcohol trôû thaønh moät loaïi chaát mang höõu hieäu ñeå coá ñònh teá baøo vi sinh vaät maø khoâng laøm caûn trôû ñeán quaù trình sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa teá baøo vi sinh vaät ñöôïc coá ñònh beân trong. Nhöõng haït Calcium – alginate chöùa teá baøo vi sinh vaät coá ñònh trôû neân loûng leûo sau moät hoaëc hai chu kyø leân men, löôïng teá baøo bò röûa troâi khoûi chaát mang khaù nhieàu. Trong khi ñoù, haït chaát mang polyvinyl alcohol chöùa teá baøo vi sinh vaät coá ñònh coù caáu truùc beàn chaéc hôn, khoâng thay ñoåi nhieàu sau caùc chu kyø leân men. Ñaây laø moät phöông phaùp coá ñònh teá baøo coù thao taùc thöïc hieän töông ñoái ñôn giaûn. Quaù trình polymer hoaù taïo gel khoâng söû duïng caùc tia böùc xaï UV, moät thaønh phaàn ñöôïc xem laø raát nguy hieåm ñoái vôùi caùc teá baøo soáng. Haàu heát caùc teá baøo coù theå baûo toàn khaû naêng soáng soùt raát cao treân chaát mang cryogel vaø duy trì hoaït tính trong moät thôøi gian raát daøi. Hôn nöõa, teá baøo vi sinh vaät khoâng bò öùc cheá bôûi khoâng coù söï can thieäp cuûa hoaù chaát trong quaù trình hình thaønh caáu truùc gel. Cryogel coù tính beàn cô vaø coù theå ñöôïc söû duïng trong nhöõng thieát bò phaûn öùng thoâng thöôøng duøng cho vieäc coá ñònh teá baøo. Polyvinyl alcohol cryogel beàn trong dung moâi höõu cô. Tuy nhieân, nhöõng teá baøo coá ñònh thöôøng ñöôïc bao boïc bôûi nöôùc vaø vì theá maø chuùng khoâng tieáp xuùc tröïc tieáp vôùi dung moâi höõu cô. Coá ñònh laïnh ñoâng hình thaønh gel vôùi heä thoáng caùc loã xoáp laøm cho cô chaát vaø saûn phaåm phaûn öùng coù theå thaám qua chaát mang deã daøng. Töø nhöõng öu ñieåm treân, coù theå khaúng ñònh raèng, hieäu suaát nhöõng quaù trình coù söû duïng teá baøo coá ñònh trong cryogel ñöôïc caûi thieän ñaùng keå. Nhöôïc ñieåm: Nhöõng chaát polymer sinh hoïc laø saûn phaåm cuûa töï nhieân, phong phuù vaø reû tieàn. Trong khi ñoù, polyvinyl alcohol laø loaïi vaät lieäu polymer toång hôïp. So vôùi nhöõng polymer töï nhieân ñaõ bieát, polyvinyl alcohol phaûi traûi qua quaù trình toång hôïp phöùc taïp nhö ñaõ giôùi thieäu ôû treân. Do ñoù, giaù thaønh cuûa loaïi polymer naøy cuõng taêng leân. Moät baát lôïi lôùn cuûa phöông phaùp laø ban ñaàu vieäc choïn löïa chaát mang vôùi khoái löôïng phaân töû trung bình thích hôïp vôùi vieäc xöû lyù laïnh ñoâng ñeå hình thaønh caáu truùc cryogel seõ gaëp khoù khaên.Ñeå coù theå trôû thaønh moät loaïi chaát mang thích hôïp khi coá ñònh teá baøo vi sinh vaät baèng phöông phaùp laïnh ñoâng, polyvinyl alcohol phaûi coù nhöõng yeâu caàu nhaát ñònh veà khoái löôïng phaân töû trung bình vaø caùc tính chaát töông öùng. Moät nhöôïc ñieåm khaùc cuûa polyvinyl alcohol so vôùi nhöõng chaát mang khaùc, ñaëc bieät laø nhöõng chaát mang ñi töø caùc chaát polymer sinh hoïc, ñoù laø khaû naêng phaân huyû trong moâi tröôøng. Nhöõng chaát polymer sinh hoïc nhö tinh boät, chitosan, chitin, alginate, … coù khaû naêng phaân huyû deã daøng hôn so vôùi polyvinyl alcohol. Trong töï nhieân, polyvinyl alcohol khoâng töông hôïp sinh hoïc, do ñoù noù coù nguy cô huyû hoaïi moâi tröôøng. Beân caïnh ñoù, coá ñònh teá baøo vi sinh vaät trong ñieàu kieän nhieät ñoä thaáp cuõng gaây aûnh höôûng ít nhieàu ñeán hoaït tính teá baøo vi sinh vaät. Do ñaõ ñöôïc laïnh ñoâng ôû nhieät ñoä raát thaáp, caùc haït cryogel sau khi ñaõ coá ñònh teá baøo vi sinh vaät chæ thích hôïp khi ñöa vaøo saûn xuaát lieân tuïc trong ñieàu kieän nhieät ñoä thaáp. k-carrageenan a. Chaát mang:[10] Carrageenan laø teân moät loaïi polysaccharide thu nhaän töø taûo ñoû. Carrageenan coù tính chaát taïo gel, taïo ñaëc, vaø oån ñònh. Chuùng coù khaû naêng ñaëc bieät laø coù theå hình thaønh nhieàu loaïi gel khaùc nhau ôû nhieät ñoä thöôøng. Hoï carrageenan ñöôïc chia thaønh ba nhaùnh chính coù teân goïi laàn löôït laø kappa, iota vaø lambda. Ba nhaùnh naøy deã phaân bieät veà maët tính chaát gel. Kappa (k-) carrageenans taïo ra maïng löôùi gel cöùng chaéc trong khi gel do iota (i-) carrageenan taïo ra meàm hôn. Maëc duø lamda (l-) carrageenan khoâng taïo gel trong nöôùc, chuùng töông taùc maïnh meõ vôùi protein ñeå oån ñònh caùc loaïi saûn phaåm söõa. k-carrageenan ñöôïc taïo neân töø nhöõng ñôn vò caáu truùc cuûa b-D-galactose sulfate vaø 3, 6-anhydro-α-galactose laø moät polisacarit coù saün ñöôïc taùch ra töø taûo bieån vaø thaønh phaàn khoâng ñoäc ñöôïc söû duïng nhö moät phuï gia thöïc phaåm. k-carrageenan taïo gel döôùi ñieàu kieän sau. Noù taïo thaønh gel bôûi söï laøm nguoäi cuõng nhö tröôøng hôïp agar. Söï ñoâng ñaëc xuaát hieän khi töông taùc vôùi dung dòch loûng coù chöùa cation nhö K+, NH4+, Ca2+, Cu2+, Mg2+, Fe3+, amin, vaø dung moâi höõu cô coù theå hoøa tan trong nöôùc. Theo thöïc nghieäm, söï laøm laïnh vaø töông taùc vôùi dung dòch coù chöùa K+ hoaëc NH4+ thì deã thöïc hieän cho söï ñoâng ñaëc vaø khi nhöõng ñieàu kieän naøy oân hoaø cho teá baøo. Vôùi nhöõng tính chaát naøy, k-carrageenan ñöôïc nghieân cöùu ñeå söû duïng laøm chaát mang trong kyõ thuaät coá ñònh enzyme vaø teá baøo vi sinh vaät. Nhieàu loaïi enzyme vaø teá baøo vi sinh vaät ñöôïc coá ñònh deã daøng vôùi hoaït tính xuùc taùc cao. Nhöõng böôùc chuaån bò coá ñònh hoaøn toaøn thích hôïp vôùi nhieàu hình daïng khaùc nhau nhö hình khoái laäp phöông, hình haït caàu vaø daïng maøng moûng membrane. Tính chaát oån ñònh cuûa chuùng coù theå ñöôïc caûi thieän baèng caùch laøm cöùng vôùi glutaraldehyde vaø hexamethylenediamine. b. Phöông phaùp thöïc hieän Ñieàu quan troïng trong phöông phaùp naøy laø teá baøo ñöôïc troän vôùi dung dòch gel sô boä vaø sau khi taïo gel teá baøo seõ ñöôïc bao phuû beân trong vaät lieäu taïo gel.[8] Huyeàn phuø teá baøo ñöôïc laøm aám ôû nhieät ñoä vaøo khoaûng 37-50oC, vaø k-carrageenan hoaø tan trong dung dòch muoái ñöôïc laøm aám ôû 37-60oC. Chuùng ñöôïc troän laïi vôùi nhau vaø hoãn hôïp ñöôïc laøm laïnh vaø töông taùc vôùi dung dòch chöùa taùc nhaân hình thaønh gel nhö laø KCl. Sau söû lyù naøy, gel döôïc keát thaønh nhöõng phaàn coù hích thöôùc phuø hôïp vaø teá baøo coá ñònh ñöôïc taïo ra. Neáu tính oån ñònh vaän haønh cuûa teá baøo coá ñònh khoâng ñaït ñöôïc thì teá baøo coá ñònh seõ ñöôïc söû lyù vôùi taùc nhaân lieân keát ngang nhö laø hexamethylenediamine vaø glutaraldehyde. Keát quaû laø hình thaønh teá baøo coá ñònh beàn. [10] Söï pha troän coù theå thöïc hieän baèng caùch ñuøn töøng gioït qua caùi loã (phöông phaùp eùp ñuøn) hoaëc qua kim roãng (phöông phaùp nhoû gioït) hoaëc ñöôïc phaân taùn trong loûng hoaëc khí (phöông phaùp phaân taùn) [8] c. Hieäu quaû cuûa phöông phaùp coá ñònh [8] Ñaây laø phöông phaùp ñöôïc söû duïng roäng raõi ñeå coá ñònh teá baøo bôûi vì noù reû, ñôn giaûn vaø saûn xuaát trong ñieàu kieän oân hoaø trong suoát quaù trình coá ñònh. Öu ñieåm chính cuûa phöông phaùp nhoát laø maät ñoä teá baøo cao, nguy cô toån hao teá baøo thaáp. Hoaït tính vaø naêng suaát cuûa teá baøo coá ñònh töông ñoái cao. Tuy nhieân söï hình thaønh gel bò chuyeån ñoåi bôûi nhieät ñoä vaø gel coù theå meàm ra vaø raõ ra khi nhieät ñoä taêng leân, do ñoù noù khoâng phuø hôïp vôùi nhöõng öùng duïng lieân quan ñeán phaûn öùng ôû nhieät ñoä cao hôn nhö laø nhöõng vi sinh vaät chòu nhieät. Nhöôïc ñieåm khaùc cuûa carrageenan laø khi maø taùc nhaân taïo gel khoâng toàn taïi trong hoãn hôïp phaûn öùng thì söï hoøa tan cuûa gel seõ xuaát hieän vaø teá baøo seõ thoaùt ra ngoaøi. Taùc nhaân taïo gel coù theå kìm haõm hoaït ñoäng mong muoán cuûa teá baøo. Coá ñònh naám men trong gel alginate Alginate Alginate coù khaù nhieàu trong töï nhieân vaø coù theå xuaát phaùt töø 2 nguoàn goác khaùc nhau: thaønh phaàn caáu truùc cuûa taûo naâu bieån (Phaeophyceae), chieám ñeán 40% khoái löôïng chaát khoâ, polysaccharide maøng bao trong caùc loaïi vi khuaån ñaát. Tuy nhieân taát caû caùc alginate thöông maïi hieän nay ñeàu coù nguoàn goác töø taûo. Alginate laø moät copolymer khoâng phaân nhaùnh, bao goàm caùc monomer b-D-mannuronic acid (goïi taét laø M) vaø a-L-guluronic acid (G) lieân keát vôùi nhau thoâng qua lieân keát 1,4 – glucoside. Caùc monomer naøy phaân boá trong maïch alginate theo caùc block. Block M: goàm caùc goác mannuronic acid noái tieáp nhau. Block G: goàm caùc goác guluronic acid noái tieáp nhau. Block MG: goàm caùc goác mannuronic acid vaø guluronic acid luaân phieân noái vôùi nhau. Hình III.9 Caáu truùc cuûa alginate: (a) caùc monomer cuûa alginate, (b) chuoãi alginate, (c) söï phaân boá caùc block Cô cheá taïo gel Alginate coù khaû naêng taïo gel khi keát hôïp vôùi caùc cation kim loaïi hoùa trò cao hoaëc khi phaân töû alginate bò acid hoùa. Tuy nhieân, phöông phaùp taïo gel baèng caùch acid hoùa phaân töû alginate ít ñöôïc duøng vì quy trình thöïc hieän raát phöùc taïp. Alginate coù khaû naêng keát hôïp nhanh vôùi caùc cation kim loaïi hoùa trò cao ñeå taïo thaønh gel ñoàng theå. Aùi löïc cuûa alginate ñoái vôùi caùc ion hoùa trò 2 khaùc nhau giaûm theo trình töï: Pb2+ > Cu2+ > Cd2+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Co2+, Ni2+ > Zn2+ > Mn2+. Tuøy thuoäc vaøo loaïi ion lieân keát vaø loaïi alginate maø gel taïo thaønh coù tính chaát khaùc nhau. Thoâng thöôøng, ngöôøi ta thöôøng söû duïng calcium ñeå laøm ion taïo gel. Quaù trình taïo gel cuûa alginate theo phöông phaùp keát hôïp vôùi cation kim loaïi hoùa trò cao coù theå tieán haønh theo 2 phöông phaùp laø phöông phaùp taïo gel töø beân ngoaøi vaø phöông phaùp taïo gel töø beân trong. Cô cheá taïo gel theo phöông phaùp taïo gel töø beân ngoaøi Ñaây laø phöông phaùp taïo gel phoå bieán nhaát cuûa alginate. Phöông phaùp naøy coù öu ñieåm laø taïo gel nhanh vaø thao taùc raát ñôn giaûn . Khi nhoû dung dòch alginate vaøo dung dòch coù chöùa cation coù khaû naêng taïo gel (thöôøng gaëp nhaát laø Ca2+), beà maët ngoaøi cuûa haït alginate seõ laäp töùc bò gel hoùa. Tieáp theo ñoù, caùc cation taïo gel ôû beân ngoaøi haït alginate tieáp tuïc khueách taùn vaøo beân trong haït laøm cho caùc phaân töû alginate beân trong tieáp tuïc bò gel hoùa. Quaù trình naøy xaûy ra treân beà maët haït vaø phaùt trieån vaøo beân trong. Phöông phaùp naøy taïo gel nhanh, tuy nhieân tính ñoàng theå cuûa haït gel laïi khoâng cao. Hình III.10 Cô cheá taïo gel cuûa alginate theo phöông phaùp taïo gel töø beân ngoaøi Cô cheá taïo gel theo phöông phaùp taïo gel töø beân trong Cho caùc muoái coù chöùa caùc cation taïo gel ôû daïng voâ hoaït (Ví duï: CaCO3, CaSO4, EDTA-Ca, calcium citrate…) vaøo dung dòch alginate. Thay ñoåi pH cuûa dung dòch veà pH acid baèng caùc taùc nhaân acid hoùa (Ví duï: D-glucono-d-lactone (GDL)). Khi ñoù, do pH giaûm, maø ñoä hoøa tan cuûa caùc muoái chöùa caùc cation taïo gel nhö ôû treân laïi phuï thuoäc vaøo pH neân caùc ion Ca2+ seõ ñöôïc giaûi phoùng daàn vaø tham gia vaøo quaù trình taïo gel vôùi alginate (Error! Reference source not found.). Phöông phaùp naøy cho haït gel coù tính ñoàng theå cao hôn haún phöông phaùp khueách taùn do caùc ion Ca2+ phaân boá ñoàng ñeàu hôn. Hôn theá nöõa, phöông phaùp naøy coøn coù theå taïo gel vôùi caùc hình daïng khaùc nhau nhö mong muoán baèng caùch cho dung dòch alginate vaøo khuoân thích hôïp tröôùc khi quaù trình taïo gel dieãn ra. Trong khi ñoù, phöông phaùp taïo gel töø beân ngoaøi thöôøng chæ taïo thaønh caùc haït coù hình caàu. Hình III.11 Cô cheá taïo gel cuûa alginate theo phöông phaùp taïo gel töø beân trong Theo Anders Johansen vaø James M. Flink (1986), khi naám men ñöôïc coá ñònh theo phöông phaùp gel töø beân trong, toác ñoä leân men cao hôn vaø ñoä beàn gel khoâng giaûm trong suoát quaù trình leân men khi so saùnh vôùi naám men ñöôïc coá ñònh theo phöông phaùp taïo gel töø beân ngoaøi. Öu nhöôïc ñieåm cuûa vieäc coá ñònh naám men trong gel alginate Öu ñieåm Quaù trình coá ñònh deã thöïc hieän. Ñieàu kieän coá ñònh oân hoøa, khoâng phaûi xöû lyù nhieät hay xöû lyù hoùa chaát. Do ñoù, caùc teá baøo coá ñònh khoâng bò maát hoaït tính. Alginate laø chaát mang trô veà maët hoùa hoïc. Alginate khoâng coù ñoäc tính, thích hôïp cho caùc saûn phaåm thöïc phaåm. Ñoä xoáp cuûa maïng gel thuaän lôïi cho vieäc khueách taùn cô chaát vaø saûn phaåm. Gel alginate vaãn giöõ ñöôïc ñoä beàn khi nhieät ñoä leân men cao. Nhöôïc ñieåm vaø caùch khaéc phuïc Ñoä beàn gel giaûm theo thôøi gian leân men do: Caùc teá baøo naám men treân vaø gaàn beà maët coù khaû naêng sinh soâi naûy nôû chieám öu theá so vôùi caùc teá baøo naèm sau beân trong haït, do ñoù coù theå laøm phaù vôõ beà maët haït gel vaø deã daøng thoaùt ra khoûi haït gel, phaùt trieån nhanh choùng trong moâi tröôøng döôùi daïng caùc naám men töï do. Ñieàu naøy laøm caûn trôû vieäc ñaùnh giaù ñoäng hoïc phaûn öùng cuûa naám men coá ñònh, ñoàng thôøi gaây khoù khaên cho vieäc taùch naám men ra khoûi moâi tröôøng leân men. Ñeå khaéc phuïc vaán ñeà naøy coù nhieàu caùch khaùc nhau. Caùch thöù nhaát laø söû duïng kyõ thuaät taïo maøng bao. Trong phöông phaùp naøy, caùc teá baøo seõ ñöôïc nhoát beân trong moät nhaân loûng ñöôïc bao boïc bôûi moät lôùp moûng gel alginate. Do ñoù, caùc teá baøo seõ coù khoaûng khoâng nhieàu hôn ñeå phaùt trieån beân trong nhaân loûng. Vì theá, maät ñoä teá baøo ñaït ñöôïc cao hôn maø khoâng bò thoaùt baøo ra ngoaøi. Hôn theá nöõa, baèng caùch naøy coù theå söû duïng löôïng alginate ít hôn. Caùch thöù hai laø aùo naám men coá ñònh vôùi maïng polymer, coù theå thöïc hieän moät böôùc (baèng caùch söû duïng voøi ñoâi), hoaëc hai böôùc (baèng caùch taïo lôùp aùo polymer sau khi ñaõ taïo haït naám men coá ñònh). Ñaây laø phöông aùn raát khaû thi vì noù khoâng laøm aûnh höôûng ñeán toác ñoä sinh toång hôïp coàn cuõng nhö toác ñoä söû duïng cô chaát. Söï giaûi phoùng CO2 beân trong gel laøm phaù vôõ caáu truùc cuûa gel. Ñeå khaéc phuïc, coù theå laøm taêng ñoä xoáp cuûa gel alginate baèng caùch giaûm noàng ñoä alginate söû duïng, tuy nhieân ñieàu naøy laïi ñoàng nghóa vôùi vieäc laøm yeáu maïng gel. Vì theá, phaûi taêng ñoä beàn gel baèng caùch aùo caùc haït alginate xoáp naøy vôùi maøng polymer (ví duï, chitosan), khi ñoù ñoä beàn cuûa gel naøy seõ töông töï vôùi gel söû duïng noàng ñoä alginate cao. Gel Ca-alginate raát nhaïy vôùi caùc chaát taïo chelate (hôïp chaát höõu cô trong ñoù nguyeân töû taïo thaønh nhieàu hôn moät lieân keát phoái trí vôùi caùc kim loaïi trong dung dòch) nhö phosphate, citrate vaø lactate vaø caùc chaát khoâng taïo gel (non-gelling) nhö laø caùc ion sodium vaø magnesium. Söï coù maët cuûa caùc ion naøy trong dung dòch seõ laøm cho caùc haït bò phoàng ra, daãn ñeán taêng kích thöôùc caùc loã xoáp, laøm giaûm tính oån ñònh vaø phaù vôõ caáu truùc haït gel. Thoâng thöôøng ngöôøi ta thöôøng theâm vaøo moâi tröôøng leân men caùc chaát oån ñònh gel nhö laø CaCl2, celite vaø pectine vôùi moät haøm löôïng thích hôïp ñeå oån ñònh ñoä beàn gel. Hoaëc cuõng coù theå laøm cöùng gel baèng caùch söû duïng propylene glycol ester, polyethelenine (PEI) vaø caùc loaïi vaät lieäu composite (colloidal silica). Khoâng beàn hoùa hoïc trong dung dòch ñieän phaân vaø dung dòch coù pH cao. Ñeå khaéc phuïc ñieàu naøy, nhieàu nghieân cöùu ñaõ ñöôïc thöïc hieän vaø coù nhieàu phöông phaùp ñöôïc ñöa ra: taïo lieân keát cuûa haït gel vôùi glutaraldehyde (Takata vaø coäng söï, 1977), vôùi polycations (Birnbaum vaø coäng söï, 1981) vaø saáy khoâ haït gel (Klein vaø Wagner, 1978; Burns vaø coäng söï, 1985). Nhöõng phöông phaùp naøy ñeàu coù theå caûi thieän ñoä beàn trong dung dòch ñieän phaân, nhöng roõ raøng laø chuùng raát phöùc taïp vaø toán nhieàu thôøi gian. Moät soá taùc giaû ñaõ ñöa ra phöông phaùp khaùc laø duøng caùc ion Ba2+ vaø Sr2+ thay cho ion Ca2+ truyeàn thoáng. Caùc ion naøy coù aùi löïc maïnh hôn ñoái vôùi alginate, vì theá haït gel barium vaø strontium alginate beàn hôn trong dung dòch ñieän phaân so vôùi haït gel calcium alginate. Tuy nhieân, caùc ion naøy vaãn khoâng ñöôïc öùng duïng roäng raõi vì ñoäc tính cuûa noù ñoái vôùi naám men vaø vôùi moâi tröôøng. AÛnh höôûng cuûa thaønh phaàn alginate vaø caùc ñieàu kieän taïo gel ñeán ñoä beàn gel vaø quaù trình leân men + Aûnh höôûng cuûa khoái löôïng phaân töû Anders Johansen vaø James M. Flink (1986) ñaõ nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa khoái löôïng phaân töû alginate thoâng qua caùc thí nghieäm vôùi caùc loaïi alginate coù ñoä nhôùt khaùc nhau. Keát quaû cho thaáy raèng khoái löôïng phaân töû ít coù aûnh höôûng ñeán toác ñoä leân men vaø söï taïo thaønh ethanol, maëc duø toác ñoä leân men nhìn chung giaûm khi taêng khoái löôïng phaân töû. Trong khi ñoù, ñoä beàn gel (ñöôïc ño baèng khaû naêng choáng chòu ñoái vôùi löïc neùn eùp) taêng ñaùng keå khi taêng ñoä nhôùt töø 5 ñeán 70cP (ñoä nhôùt laø ñaïi löôïng ñaëc tröng cho khoái löôïng phaân töû cuûa alginate), nhöng khi ñoä nhôùt taêng cao hôn nöõa (250 ñeán 600cP) thì ñoä beàn gel taêng raát ít. Kazuaki vaø coäng söï (1995) cuõng ñaõ nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa ñoä nhôùt ñeán khaû naêng khueách taùn cuûa glucose vaø keát quaû cho thaáy raèng khaû naêng khueách taùn cuûa glucose khoâng phuï thuoäc vaøo ñoä nhôùt. Trong quaù trình xöû lyù nhieät, ñoä nhôùt cuûa alginate giaûm do giaûm möùc ñoä polymer hoùa cuûa caùc phaân töû alginate. Nhö vaäy, vieäc tieät truøng alginate khoâng aûnh höôûng baát lôïi ñeán khaû naêng khueách taùn cuûa glucose. + Aûnh höôûng cuûa tyû leä G/M Tyû leä G/M laø phaàn mol cuûa L-guluronic acid treân D-mannuronic acid, bieåu thò thaønh phaàn cuûa alginate. Khi tyû leä G/M giaûm thì: Toác ñoä leân men coù xu höôùng taêng, nhöng khoâng ñaùng keå. Ñoä beàn gel giaûm, vì caùc ion hoùa trò 2 nhö laø calcium, barium, strontium ñöôïc öu tieân lieân keát vaøo block G hôn laø block M vaø block MG. Do ñoù alginate coù haøm löôïng G lôùn seõ taïo thaønh gel xoáp, chaéc hôn vaø vaãn giöõ ñöôïc ñoä cöùng vöõng trong moät thôøi gian daøi. Trong suoát quaù trình taïo lieân keát vôùi Ca2+, caùc loaïi alginate naøy seõ khoâng bò phoàng nôû hay co ruùt, vì theá vaãn giöõ ñöôïc hình daïng toát hôn. Theâm vaøo ñoù, alginate coù haøm löôïng G cao seõ caûn trôû söï sinh tröôûng cuûa teá baøo naám men sau khi coá ñònh. Traùi laïi, alginate coù haøm löôïng M cao taïo thaønh gel meàm vaø ít xoáp hôn vaø deã bò raõ ra hôn so vôùi caùc gel giaøu G. Kazuaki vaø coäng söï (1995) cuõng ñaõ nghieân cöùu vaø keát luaän raèng gel alginate giaøu G thích hôïp ñeå coá ñònh naám men hôn vì gel naøy ít gaây caûn trôû ñeán khaû naêng khueách taùn cuûa glucose vaø coù ñoä beàn cô hoïc cao hôn. + Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä alginate Taêng noàng ñoä alginate trong khoaûng 1 – 10% laøm giaûm ñaùng keå toác ñoä leân men vaø toác ñoä sinh toång hôïp coàn do laøm giaûm söï khueách taùn nhöng laïi laøm taêng ñoä beàn gel. Theo nhieàu nhaø nghieân cöùu, noàng ñoä alginate thích hôïp ñeå coá ñònh naám men laø 2%. + Aûnh höôûng cuûa pH taïo gel Theo Kazuaki vaø coäng söï (1995), pH cuûa dung dòch alginate thích hôïp cho quaù trình taïo gel laø töø 6,0 ñeán 8,0. Naèm ngoaøi khoaûng naøy, khaû naêng khueách taùn cuûa glucose vaø ñoä beàn gel ñeàu giaûm. Ñoù laø do pH