Đề tài Tổng quan Kefir và các ứng dụng của Kefir trong thực phẩm

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay trên thế giới, các sản phẩm từ hạt Kefir (Kefir Grains) đang rất được ưa chuộng bởi giá trị dinh dưỡng mà nó còn đem lại cho con người. Ngoài việc cung cấp các vi sinh vật có lợi, kefir còn có tác dụng chống lão hóa và tăng cường khả năng tiêu hóa. Với những ứng dụng có tính phục vụ cho sức khỏe con người, kefir được một số công ty nghiên cứu và phát triển nên một số sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao như sữa chua kefir. Khác với sữa chua thông thường, kefir là sản phẩm vừa lên men lactic nhờ nhóm vi khuẩn lactic ưa ấm, vừa lên men rượu nhờ nấm men. Đây là, sản phẩm được biết đến như một loại thực phẩm chức năng giúp tăng cường khả năng miễn dịch, giảm căng thẳng thần kinh, điều hoà huyết áp và những lợi ích sức khoẻ khác mà cho đến nay vẫn còn được xem là những điều bí mật. Song, sản phẩm này tuy đã có mặt từ rất lâu đời trên thế giới, nhưng vẫn còn rất mới trên thị trường tiêu thụ Việt Nam. Do đó, để góp phần giúp cho sản phẩm Kefir ngày càng phổ biến và quen thuộc với người tiêu dùng, việc nghiên cứu nâng cao chất lượng và làm đa dạng phong phú cho sản phẩm Kefir là điều cần thiết. Với ý nghĩa khoa học và thực tiễn nêu trên đồng thời được sự chấp nhận của Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học, chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu đề tài “Tổng quan về kefir và các ứng dụng của kefir trong thực phẩm”. 1.2. Mục đích Tìm hiểu về kefir và những ứng dụng của kefir trong lĩnh vực thực phẩm và các lĩnh vực khác của cuộc sống. 1.3. Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu thành phần, tính chất, hệ vi sinh vật, công dụng của hạt Kefir (Kefir Grains), quy trình chế biến và bảo quản giống Kefir. Quy trình chế biến sữa chua Kefir (Kefir). Quy trình chế biến nước nho lên men Kefir. Nghiên cứu khả năng trung hòa tính gây độc tế bào của các yếu tố ngoại bào B. cereus của kefiran. CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu về hạt kefir 2.1.1. Nguồn gốc hạt Kefir Cách đây hàng nghìn năm, Kefir được biết đến như một thứ nấm dùng chữa bệnh, nó xuất xứ từ cách nuôi riêng của các tu sĩ Ấn Tạng. Đây là loại nấm vi khuẩn có thể làm biến đổi sữa nhờ một hệ vi sinh vật phức tạp gồm nhiều loài vi khuẩn và nấm men được chứng minh là rất có lợi cho sức khoẻ. Dân miền núi Caucasus thuộc nước Xô Viết cũ - nguyên quán của Kefir - đã bào chế nó từ sữa của các sinh vật khác nhau và Kefir được lên men tự nhiên trong những túi da thú, theo các bộ tộc người ở đây họ xem kefir như là quà tặng của đấng Allah, như nguồn tài sản của gia đình và của bộ tộc, họ tiêu thụ Kefir từ thuở ấu thơ và cứ như vậy duy trì từ thế hệ này đến thế hệ khác. Họ không hề biết đến bệnh ung thư, bệnh lao, bệnh dạ dày… và họ thọ đến trung bình là 110 tuổi. Núi Caucasus là vùng duy nhất trên địa cầu mà người ta đạt sức khoẻ hoàn toàn ở lứa tuổi này. Từ rất sớm các bác sĩ Nga đã rất tin tưởng rằng Kefir có lợi cho sức khoẻ và có khả năng chữa bệnh. Mãi đến những năm đầu của thế kỷ 20 hạt Kefir mới được sản xuất với số lượng nhỏ ở Moscow . Nguyên liệu để sản xuất Kefir có thể là sữa dê, sữa cừu hay sữa bò. Theo Oberman H và Libudiziz Z (1998) đầu tiên người ta lên men sữa thành Kefir trong các túi bằng da thú hoặc bồn bằng gỗ sồi. Đến cuối thế kỉ 19, Kefir trở thành sản phẩm quen thuộc của dân các nước vùng đông âu (Nga, Ucraina, Balan, Czech, Hungari...) và các nước vùng Scandinavia. Tuy nhiên để sản xuất sản phẩm Kefir cho mục đích thương mại mà vẫn giữ được chất lượng như sản phẩm truyền thống là một điều không dễ dàng vì theo truyền thống thì người ta không sử dụng những vật dụng bằng kim loại cho quá trình chế biến mà chỉ từ các dụng cụ bằng gỗ, đất sét hoặc da thú. Đến 1950, một phương pháp sản xuất Kefir mới đã được công nhận về chất lượng đó là phương pháp lên men có khuấy trộn. Hiện nay có hai loại Kefir, một loại có vị ngọt được lên men với nước trái cây và đường, một loại được lên men từ sữa. Hệ vi sinh vật sử dụng trong sản phẩm Kefir bao gồm vi khuẩn lactic và nấm men. Chúng cùng phát triển cộng sinh trên môi trường sữa. Do đó sản phẩm Kefir có vị chua đặc trưng và thoảng nhẹ mùi nấm men. 2.1.2. Hạt Kefir Trong sản xuất Kefir, người ta sử dụng tổ hợp giống vi sinh vật dưới dạng hạt Kefir ( Kefir Grains). Các hạt Kefir có màu từ trắng đến vàng nhạt, hình dạng không ổn định và thường kết thành chùm với nhau tạo dạng tương tự hoa Chou-fleur với đường kính trung bình 0,3÷2 cm. Hạt Kefir là phức hệ vi sinh vật gắn với nhau bởi chất polisaccharide. Các hạt này bao gồm chủ yếu là vi khuẩn lactic (Lactobacilli, Lactococci, Leuconostoc...) và nấm men. Đôi khi ta còn tìm thấy vi khuẩn A.aceti và A.racens cùng với các vi sinh vật khác tổ chức thành khối cầu vi sinh vật. Tuy vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn nhưng từ hàng nghìn năm qua sự tiêu thụ đã chứng minh được rằng hệ vi sinh vật trong Kefir là không gây bệnh mà còn có khả năng ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh như Salmonella hay Shigella. Hình 2.1: Hình dạng, kích thước hạt Kefir nguyên vẹn và sau khi đã cắt đôi ( Thành phần, cấu trúc chính tạo nên cấu trúc hạt kefir là polisaccharide. Polisacharide chủ yếu là nước, vật chất hoà tan được biết là Kefiranofaciens và L. kefir sản sinh ra polisacharide này. Chúng là một phần của hạt, nếu không có sự hiện diện của chúng thì hạt Kefir không thể hình thành. Ngoài tế bào vi sinh vật, hạt Kefir còn chứa protein (chiếm khoảng 30% tổng chất khô) và Carbohydrate (25÷50%). Như vậy từ một số thông tin đã đưa ra thành phần hợp thành của hạt giống Kefir là phức protein Polisacharide béo. Thành phần hạt giống sấy khô đông lạnh với hàm ẩm 3,5% được tìm thấy bao gồm: béo 4,4%, tro: 12,1%, Muco-polisacharide (Kefiran): 45,7%, protein tổng số 34,3% gồm có: protein không hoà tan 27%, protein hoà tan 1,6% và acid amin tự do là 5,6%. 2.1.3. Chu kỳ phát triển của giống Kefir Kefir là những giống gốc tự nhiên, chúng được hình thành từ những màng bao bọc mỏng không theo một quy tắc nào cả bao gồm hỗn hợp protein, lipid, polisacharide. Những màng bao bọc phát triển với hình dạng không nhất định, hình thành các thuỳ phức tạp và không đồng đều, các thuỳ này lại có xu hướng trở về nguyên bản tạo thành cấu trúc sinh học bao gồm nhiều thuỳ con bao quanh mình. Với dấu hiệu phát triển đặc biệt như thế chúng hình thành những hạt con, mỗi tiểu thuỳ được kết nối với nhau ở phần giữa, xòe ra trong khi nó được gắn với các điểm trung tâm của hạt giống mẹ. Hình 2.2: Sự hình thành hạt kefir Nhờ sự xuất hiện đó mà các hạt con tách ra có mẫu hình phát triển giống như hạt mẹ ban đầu. Sau một thời gian có thể do chấn thương hoặc những tác động bên ngoài, một phần thùy con gắn với hạt mẹ bị tách ra thành hạt tự do. Những hạt con này lại tiếp tục nhân giống thành hạt mẹ. Chu kỳ phát triển được lặp lại với chu trình gần giống nhau (tự nhân giống). Trong vài trường hợp đặc biệt, có những hạt không thể cho ra bất cứ hạt con nào trong một thời gian dài mà thay vào đó, chúng hình thành nên một khối lớn (khối hạt Kefir) Hình 2.3: Hạt Kefir sau khi được vớt ra khỏi sữa và nước đường (www.Kleibers.de/.../guido/4a_kefir_tibet.jpg) Bề mặt ngoài của hạt biến đổi từ dạng phẳng đến không đồng đều gồm nhiều thứ phức tạp, có những chỗ lồi lõm rải rác khắp bề mặt. Một vài hạt có thể có những vùng rộng phẳng, trong khi từ mẻ tương tự có thể có những hạt có bề mặt không đồng đều. Nếu điều kiện thuận lợi, sau một thời gian, những hạt nhẵn này thường trở lại dạng nguyên thể, sau đó hình thành các hạt bao quanh mình, nơi mà có thể nhân giống lên. Thường ở những vùng không phẳng, xù xì thường có sự hoạt động mạnh của nấm men, trong khi ở vùng phẳng vi khuẩn lại chiếm ưu thế. Nấm men hình thành những khóm nhỏ nhô ra trên bề mặt, Streptococci thì bện vào nhau với các vi khuẩn khác chứ không hình thành dạng cụm. Ở sâu bên trong hạt, Lactobacilli chiếm ưu thế và có rất ít tế bào nấm men, chúng được gói gọn trong dịch polisacharide, các vi khuẩn hình que và nấm men hình thành các cụm riêng biệt bên ngoài và bên trong hạt. Ở đó Lb.Kefiranoficients được xem là nguyên nhân hình thành polisacharide hòa tan Kefiran. Trong khi đó L. bacitophilus là nguyên nhân hình thành vỏ bọc bên ngoài polisacharide mà có thể giúp hạt co giãn. Một số nghiên cứu cho rằng vi khuẩn có thể gây ra sự nhân giống hạt Kefir vì việc nhân giống của hạt không xảy ra khi vắng mặt Lb. kefiranoficients - là vi khuẩn sinh ra Kefiran ở trung tâm hạt. 2.1.4. Kefiran Hình 2.4: Cấu tạo hóa học Kefir (www.kefir.co.kr/eng/image/sub_img_11.gif) Cơ chế phức tạp về cấu trúc gian bào vi sinh vật trong hạt Kefir hiện nay chưa được giải thích rõ ràng. Người ta khám phá được gel hòa tan polysaccharide trong hạt kefir là điều duy nhất đủ cho tên gọi kefiran (KGF-C). Hạt kefir sấy khô bao gồm chất gian bào khoảng 45% là kefiran. Polisaccharide này gồm hai đường đơn glucose và galactose với tỉ lệ cân đối. Kefiran hình thành ở trung tâm hạt, với điều kiện kỵ khí thuận lợi cho việc tổng hợp kefiran trong sự hiện diện của ethanol. Một vài loài Lactobaccilli khác cũng sinh ra polisaccharide như Lb. brevis, Lb. sp. Các loài Lactobaccilli khác nhau có thể sản sinh ra dạng gel polisaccharide gần giống nhau ở tốc độ khác nhau. Đây là một phần trong cơ chế phức tạp của hạt kefir. Có thể do những khuynh hướng khác nhau này mà Lactobaccilli sản sinh các phần ở trung tâm hạt. Một thử nghiệm trên chuột đã phát hiện tính kháng ung bứu của Kefiran. Trong thử nghiệm này kefiran được cung cấp từ đường miệng của chuột và kết quả cho thấy kích thước khối u đã giảm đi rõ. 2.1.5. Hệ vi sinh vật trong hạt Kefir Nhóm vi khuẩn lactic lactobacillus chiếm khoảng 65-80% tổng số vi sinh vật trong hạt Kefir. Chúng gồm những loài ưa ẩm và ưa nhiệt thực hiện quá trình lên men lactic theo cơ chế lên men đống hình lẫn dị hình. Nhóm vi khuẩn lactic Lactococci chiếm 20% tổng số tế bào, Bacilli 69%, Streptococci 11-12%, nấm men chiếm 16-20%. Hình 2.5: Ảnh chụp hạt Kefir dưới kính hiển vi điện tử gồm vi khuẩn, nấm men, và các chất gian bào (Kefir.vilabo.oul.com) Riêng nấm men chiếm 5÷10% tổng số vi sinh vật trong hạt gồm những loài lên men được lẫn không lên men được đường lactose. Các loài nấm men lên men được đường lactose thường được tìm thấy tại các vị trí gần bề mặt hạt Kefir. Ngược lại, các loài nấm men không lên men được đường lactose lại tìm thấy tại các vị trí sâu bên trong tâm hạt. Các tế bào nấm men tạo ra rượu và cacbon dioxyt. Protein bị phân giải một phần do quá trình trao đổi chất của nấm men mà kết quả làm cho kefir có mùi rất đặc trưng của nấm men. Hàm lượng acid lactic, alcol và cacbon dioxyt được điều chỉnh bằng nhiệt độ lên men. Bảng 2.1: Các vi sinh vật có trong hạt Kefir (Oberman H và cộng sự, 1998) Giống vi sinh vật Loài Vi khuẩn Lactobacilli Lb. brivis Lb. cellobiosus Lb. acidepphilus Lb. Kefir Lb. casei ssp. alactosus Lb. casei ssp. rhamnosus Lb. helveticus. ssplactis Lb. delbruevii.ssp.lactic Lb. paracasei.ssp.paracasei Lb. casei Lb. lactis Lb. plantarum Lb. delbrueckii. ssp. hulgaricus Lb. fructivorans Lb. hilgardii Lb. kefiranofaciens Lb. kefirgarnum sp.nov Lb. parakefir sp.nov Streptococci S. thermophilus S. lactis S. filant S. durans Lactococci Lc. lactis.ssp.lactis Lc. lactis.ssp.lactis var diacetylactis Lc. lactis.ssp.cremoris Leuconostoc Leuc. mesesteroides.ssp.dextranicum Leuc. mesenteroides.ssp.cremoris Acetobacter Acetobcaters casei Acetobacters rasenes Nấm men Kluyveromyces K. lactis K. marxinnus. ssp. bulgaricus K.morxianus. ssp. Marxianus Saccharomyces S. lactis S. cerevisiae S. florentinus S. globosus S. unisporus S.carlsbergensis S. ssp. torulopsis holmii Candida C. kefir C. pseudotropicalis C. tenuis C. rancens Torulaspora T. delbrueckii (Lê Văn Việt Mẫn, 2004 và các nguồn trên internet) 2.1.5.1. Vi khuẩn lactic a. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium, là vi khuẩn Gram (+). Đây là những trực khuẩn hoặc cầu khuẩn, đa số không sinh bào tử, thường không chuyển động và kị khí tùy tiện, vi hiếu khí, chúng không chứa cytochrom và enzyme catalase, chúng có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh, phân giải H2O2 để phát triển. Đa số chúng lên men được mono và disaccharide, một số không lên men được saccharose, số khác không lên men được đường maltose. Các vi khuẩn lactic không có khả năng lên men tinh bột và các polysaccharide khác (chỉ có loài L. delbruckii là đồng hóa được tinh bột). Vi khuẩn lactic thường có dạng hình cầu, hình oval và hình que, đường kính của dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5-1,5 μm, các tế bào hình cầu xếp thành từng cặp hoặc chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1-8 μm, trực khuẩn thường đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi. Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau tạo thành acid trong môi trường và sức chịu đựng acid cũng khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid cao hơn (khoảng 2-3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển được ở pH = 4-3,8 còn cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này. Hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn lactic ở vùng pH = 5,5-6. Đa số vi khuẩn lactic (đặc biệt là trực khuẩn đồng hình) rất kén chọn thành phần dinh dưỡng, chúng chỉ phát triển khi trên môi trường có tương đối đầy đủ các yếu tố dinh dưỡng cần thiết như acid amin, peptide, protein, vitamin (B1, B2, B6, PP, các acid pantotenic và acid folic)… Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease, chúng phân hủy được protein của sữa tới peptide và acid amin. Hoạt tính này ở các loài có khác nhau, thường trực khuẩn là cao hơn. Chúng chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn ethylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường có 10-15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl tới 7-10%. Các vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 25-350C, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối ưu là 40-450C, loài ưa lạnh có thể phát triển được ở nhiệt độ tương đối thấp (khoảng 50C hoặc thấp hơn). Khi gia nhiệt tới 60-800C hầu hết chúng bị chết sau 10-30 phút. Một số loại có khả năng tạo màng nhầy. Một số khác có khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh và làm thối rữa thực phẩm. Vi khuẩn lactic ngoài khả năng lên men lactic, chúng còn có khả năng sản sinh ra các chất kháng khuẩn gọi là bacteriocin và được ứng dụng nhiều trong y học cũng như trong bảo quản thực phẩm. Vi khuẩn lactic phân bố rộng trong thiên nhiên, trong đất, trong nước, trong không khí, chủ yếu có mặt trên thực vật (đặc biệt có là ở trên cỏ), trong thực phẩm (rau, quả, sữa, thịt,…), một số chủng có mặt trong hệ thống đường ruột của cơ thể người và động vật. Trong cơ thể người và động vật, ngoài đường ruột chúng còn tồn tại trong khoang miệng. Các dạng cầu khuẩn đường ruột được gọi là Enterococus hay Streptococus fecalis. Phân loại vi khuẩn lactic hiện nay chưa hoàn thiện và còn nhiều tranh cãi, chủ yếu phân loại dựa theo hình dáng tế bào. Thí dụ: cầu khuẩn xếp các giống Streptococcus và Leuconostoc, còn trực khuẩn xếp thành một giống Lactobacillus. b. Hoạt động sinh hóa, trao đổi chất của vi khuẩn lactic. Hoạt động sinh hóa, trao đổi chất tiêu biểu nhất của vi khuẩn lactic chính là cơ chế của quá trình lên men lactic. Qúa trình lên men lactic diễn ra trong tế bào vi khuẩn. Đầu tiên, đường sẽ được vi khuẩn lactic đưa vào bên trong tế bào nhờ cơ chế vận chuyển đặc trưng của màng tế bào. Nếu phân tử đường là đường đơn như glucose thì sẽ vào thẳng chu trình chuyển hóa, còn nếu phân tử đường là đường đôi hay các dạng đường khác thì sẽ bị thủy phân thành các monosaccharide sau đó mới vào chu trình chuyển hóa. Sau đó, phân tử đường này sẽ đi vào chu trình chuyển hóa khác nhau và cuối cùng cho sản phẩm là acid lactic, acid acetic, CO2,… Dựa vào sản phẩm tạo thành của quá trình lên men, mà người ta chia chúng ra hai nhóm là vi khuẩn lactic lên men đồng hình hay vi khuẩn lactic lên men dị hình. - Trường hợp lên men lactic đồng hình: Quá trình lên men tạo acid lactic theo chu trình Embden-Meyerhorf (con đường EMP). Trong tế bào vi khuẩn lên men lactic đồng hình có đủ enzyme carboxylase, do vậy pyruvate không bị phân giải sâu hơn, mà thay vào đó nó nhận hydro được tách ra và chuyển tới pyruvate để tạo thành acid lactic. Lượng acid lactic tạo thành chiếm hơn 90% sản phẩm, chỉ một phần nhỏ pyruvate còn lại bị khử cacbon chuyển thành acid acetic, ethanol, CO2 và acetone… C6H12O6 → CH3-CO-COOH → CH3-CHOH-COOH + Năng lượng (glucose) (acid lactic) - Trường hợp lên men lactic dị hình: Xảy ra khi vi khuẩn lactic không có đủ các enzyme cơ bản của chu trình EMP là andolase và trizaphosphattizomerase. Do không theo con đường EMP nên chúng chuyển hóa theo con đường Pentose-Phosphate ở giai đoạn đầu, từ glucose-6-phosphate, 6-phosphoglucose và ribuloae-5-phosphate dưới tác dụng của enzyme epimerase chuyển thành xilulose-5-phosphate. Xilulose-5-phosphate sẽ đi theo hai con đường chuyển hóa khác nhau: + Xilulose-5-phosphate sẽ được chuyển hóa tiếp thành glyceraldehydes-3-phosphate. Sau đó bị thủy phân tiếp theo con đường EMP để tạo thành acid lactic. + Xilulose-5-phosphate bị thủy phân tiếp theo một con đường khác để tạo acetyl phosphate. Sau đó, dưới tác dụng của acetatkinase sẽ tạo thành acetate hoặc bị khử tiếp thành acetaldehyde rồi thành ethanol, acid acetic, CO2,… C6H12O6 → CH3-CHOH-COOH + HOOC-CH2-CH2-COOH + CH3-COOH (glucose) (acid lactic) (acid sucxinic) (acid acetic) + CH3-CH2OH + CO2 +H2 (ethanol) + Lượng sản phẩm phụ của quá trình lên men dị lactic như sau: acid lactic chiếm 40% (thấp hơn nhiều so với lên men lactic đồng hình), acid sucxinic chiếm 20%, ethanol chiếm 10%, acid acetic chiếm 10% và khoảng 20% còn lại là các loại khí. 2.1.5.2. Một số chủng vi khuẩn lactic a. Streptococcus sp Streptococcus lactic: vi khuẩn này phát triển tốt trong sữa và một số môi trường pha chế từ sữa, trong khi lại phát triển kém trong môi trường nước thịt pepton. Đây là loại vi khuẩn hiếu khí tuỳ tiện nên có thể phát triển sâu trong thạch và cho khuẩn lạc hình cây có nhánh. Đặc điểm sinh hoá quan trọng là lên men glucose, lactose, galactose, maltose, dextrin, không lên men saccharose. Vì vậy, streptococcus lactic đóng vai trò quan trọng trong việc chế biến sữa chua. Phát triển tốt ở nhiệt độ 30÷350C, ở nhiệt độ này vi khuẩn gây đông tụ sữa sau 10÷12 giờ, độ acid giới hạn do Streptococcus lactic tạo nên thường dao động trong khoảng 110-1200T, mặc dù có những chủng yếu chỉ tạo khoảng 90-1000T. Sữa được lên men chua bởi vi khuẩn streptococcus lactic luôn luôn có hương vị đặc trưng của sản phẩm sữa chua. Ở nhiệt độ tối ưu Streptococcus lactic phát triển trong sữa có thể đạt đến số lượng tối đa là 1,2÷2 tỷ tế bào/ml sau 10÷12 giờ. Thời gian này tương ứng với thời gian lên men chua sữa đến 600T. Độ acid sữa tăng lên rất nhanh trong vài giờ đầu, sau đó giảm dần và ngừng hẳn khi đạt đến gần 1200T. Đường biểu thị acid trong sữa lên men không có hướng đi xuống vì sau khi đạt cực đại độ chua được giữ nguyên theo thời gian mà không giảm đi Streptococcus cremoris: loại liên cầu khuẩn này thường thấy trong sữa dưới dạng chuỗi dài hoặc hiện diện dưới dạng song cầu khuẩn, phát triển tốt ở 20÷250C. Các điều kiện nuôi cấy khác với giống S.lactic. Tuy nhiên, ảnh hưởng của chúng đối với sữa hơi khác, chúng thường làm đông sữa nhưng chúng cũng có thể làm cho sữa bị nhớt. Một số chủng loại này phát triển trong sữa cho mùi đặc biệt dễ chịu được ứng dụng trong chế biến bơ. Cũng như S. lactic, S. cremoris lên men lactose thành acid lactic nhưng không lên men saccharose, maltose, dextrin. Streptococcus cremoris làm cho sữa có độ chua thấp hơn (110÷1150T) tạo nên sản phẩm có vị ngon thường được dùng trong sản xuất bơ chua. Streptococcus diacetylatic: thuộc nhóm vi khuẩn không điển hình, tạo nên diacety, tạo hương cho sản phẩm. Streptococcus thermophillus và Streptococcus bovis: đây là hai vi khuẩn thuộc nhóm Viridams Streptococci chúng không phát triển ở 100C, phát triển tốt ở 40÷450C khi lên men sữa tạo được khối đông, không phát triển khi có sự hiện diện của 0,1% xanh methylen, 6,5%NaCl, pH=9,6, arginin, pepton, không tạo thành amoniac. Streptococcus thermophillus là vi sinh vật ưa nhiệt giống như tên chủng, nhiệt độ thích hợp khoảng 40÷450C và bị tiêu diệt ở nhiệt độ 530C. Khi làm môi trường nuôi cấy từ sữa thanh trùng và ủ ở 320C số lượng lớn khuẩn lạc của Streptococcus thermophillus xuất hiện. Streptococcus thermophillus là một vi sinh vật quan trọng trong sản xuất yaourt, phomat, nó bị ngăn cản sự hoạt động bởi 0,01 mg penicillin hay 5 mg streptomycin/ml. Streptococcus bovis được tìm thấy trong sữa bò và có thể xâm nhập vào sữa từ nguồn này hay nguồn khác, nó sống sót trong sữa thanh trùng, có thể tách chúng từ sữa thanh trùng hay một số loại phomat. Hình 2.6: Vi khuẩn Streptococcus thermophillus b. Các trực khuẩn lactic Trực khuẩn lactic phát triển rộng rãi trong thiên nhiên, chúng luôn luôn có mặt trong sữa và các sản phẩm sữa chịu được độ acid cao, phát triển ở phạm vi nhiệt độ rộng trong môi trường có hoặc không có không khí. Trực khuẩn lactic đóng vai trò rất quan trọng trong chế biến sữa chua, quá trình làm fomat. Trực khuẩn lactic cũng chia thành nhóm điển hình và nhóm không điển hình tuỳ thuộc vào khả năng tạo thành sản phẩm phụ. Nhóm trực khuẩn lactic gồm các trực khuẩn ưa nhiệt, trực khuẩn xếp chuỗi cần nhiệt độ trung bình (ưa ẩm), Bacterium thuộc nhóm trực khuẩn không điển hình. Nhờ nhiều loại enzim thích hợp nên các vi khuẩn lactic điển hình có khả năng phân giải các đường đơn (glucose, galactose, levulose...) thành acid lactic. Các loại khác nhau có thể tích tụ lượng acid khác nhau: Lactobacterium bulgaricum tích tụ đến 3,5%, Thermobacter, Ribirium cerea là 2,2%, Lactobacterium plantarum là 1%. Các trực khuẩn lactic ưa nhiệt phát triển tốt ở môi trường acid yếu (pH=6,5), tuy nhiên có loài phát triển ở pH=5,4 như Lactobacillus bulgaricus, cũng có loại phát triển tốt ở pH=3,8 trong khi các trực khuẩn xếp chuỗi không thể phát triển được, nhiệt độ tối ưu là 40÷450C, đây là vi khuẩn tạo được độ acid rất cao 300÷3500T. Lactobacterium helveticum (trực khuẩn phomat) phát triển ở 22- 510C, làm cho sữa chua tới 200÷3000T, Lactobacterium bulgarium phát triển ở 22÷530C tạo độ acid trong sữa 200÷3000T, độ giới hạn là 200÷2500T. Lactobacterium lactic phát triển ở 22÷500C độ acid giới hạn là 110÷1800T. c. Lactobaccillus Lactobaccillus brevis: Là trực khuẩn Gram dương, kích thước rộng 0.7-1.0 mm, dài 2.0-4.0mm, thể hình que, không sinh bào tử, không di động. Chúng không sinh sản nitrate (Kandler và Weiss, 1986). Lb. Brevis là vi khuẩn lên men lactic dị hình, sử dụng đường hexoses qua con đường 2-keto-3-deoxy-6phosphogluconate (KDPG) hay Entenr Doudoroff (ED) sản sinh ra acid lactic, CO2, ethanol, acid acetic (Kandler, 1983). Chúng có thể lên men các loại đường như arbinose, xylose, glucose, fructose, maltose, nhiệt độ phát triển tối đa là 30oC. Lactobaccillus casein: Là trực khuẩn Gram dương, kỵ khí tùy tiện, không sinh nha bào, không di động. Nó thường gặp ở dạng chuỗi dài hoặc ngắn, tích tụ tới 1,5% acid. Lb. Casein thuộc nhóm lên lên lactic dị hình. Nhiệt độ tối ưu cho phát triển là 30-350C. Trực khuẩn này dùng nhiều trong chế biến pho mát, nhờ nó có hoạt tính protease nên có thể phân hủy casein của sữa thành acid amin. Hình 2.7: Vi khuẩn Lactobaccillus casein Lactobaccillus acidophilus: Là trực khuẩn, kích thước trung bình 0.6-0.9 x 1.5-6mm, thuộc nhóm vi hiếu khí, lên men đồng hình; phát triển tốt ở 37-40oC, không phát triển ở 4% muối. Lb. acidophilus là một một chuỗi, dài chỉ kết hạt khi nhuộm với xanh methylene. pHtối ưu=5,8-6,6. Nhiệt độ tối thích là 450C. Khi nuôi trong sữa gầy ở 370C, trong vòng 36 giờ, chúng sinh sản được 13,33g acid lactic/l. Trong sữa nó tích tụ tới 2,2% acid. Trực khuẩn này được phân lập từ ruột trẻ em và bê non mới đẻ, dùng trong sản xuất sữa, acidophin có khả năng sinh bacteriocin có hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh đường ruột. Một số chủng có khả năng tạo thành màng nhầy. Lactobaccillus delbrukii: Là trực khuẩn lactic chịu nhiệt, thường gặp trên hạt đại mạch. Đây là trực khuẩn lớn (2,7 x 0,4-0,8 μm). Trong quá trình lên men chúng có khả năng tạo thành hình sợi dài 100 – 1000 μm không lên men lactic, không tạo acid từ maltose. Trong môi trường dịch thể chúng có khả năng tạo 70% acid latic so với đường. Có lẽ đây là giống vi khuẩn lactic duy nhất có thể đồng hóa được tinh bột. Nó không lên men và đồng hóa được lactose, vì vậy không dùng trong công nghiệp sữa. Nhiệt độ tối ưu là 45-500C, tối thiểu là 200C, tích tụ 2,5% acid. Được dùng nhiều trong sản xuất acid lactic từ tinh bột và sản xuất bánh mì. Lactobaccillus paracasei subsp. Paracasei: Tăng trưởng tốt khi nuôi cùng Lb. Acidophilus và delbrukii subsp. Bulgaricus. Chúng thuộc nhóm lên men lactic đồng hình, có khả năng sử dụng đường glucose, fructose, saccharose để thực hiện quá trình lên men, không tăng trưởng trên raffinose, stachyrose. Lactobacillus bulgaricus: Là trực khuẩn tròn (đôi khi ở dạng hạt), thường kết thành chuỗi dài, không lên men được saccharose. Đây là giống ưa nhiệt, nhiệt độ tối ưu là 40-450C, tối thiểu là 15-200C. Nó tạo thành acid mạnh, tích tụ ở trong sữa tới 2,5-3,5% acid lactic. Dùng trong chế biến sữa chua phương nam, sữa ngựa. Lactobacillus helveticus : Là trực khuẩn, có kích thước 0.7-0.9 mm; 2.0-6.0 mm, nhiệt độ phát triển của vi khuẩn này là 40-420C; tạo độ chua đến 200-3000T. Nó có khả năng lên men được glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose. d. Leuconostoc Là nhóm gồm những vi khuẩn lên men lactic không điển hình. Chúng có dạng hình cầu nhưng trong môi trường acid chúng nhọn ra ở hai đầu và dài ra sinh ra lượng acid có hạn vì thế không làm đông sữa. Khi cho vào môi trường nấm men và cao thực vật chúng phát triển rất mạnh. Những vi khuẩn thuộc loài Leuconostoc trong hạt Kefir gồm có: Leuconostoc lactic, Leuconostoc cremoris, Leuconostoc mensenteroides. Leuconostoc mensenteroides: Là vi khuẩn Gram dương, kỵ khí tùy tiện, thường được tìm thấy trong sản phẩm rau và trái cây lên men. Leuc. mensenteroides thường sản sinh ra lớp màng nhầy làm cho thực phẩm kém chất lượng. Hình 2.8: Vi khuẩn Leuconostoc mensenteroides Leuconostoc dextranicum: Là vi khuẩn gram dương, đường kính từ 0.6-1 μm. Nó phát triển tốt ở nhiệt độ 25-300C và phát triển chậm ở 80C, ở 450C ngừng phát triển, không tồn tại khi thanh trùng, rất nhạy cảm với chất kháng sinh penicillin. e. Betabacterium Trên môi trường thạch tạo những khuẩn lạc giống như khuẩn lạc của trực khuẩn lactic ưu nhiệt. Khi phát triển trong sữa vi khuẩn này cho ít acid, nếu cho dịch tự phân của nấm men vào môi trường, vi khuẩn này phát triển mạnh hẳn lên, đường sữa bị lên men bởi vi khuẩn này không chỉ tạo thành acid lactic mà còn tạo nhiều acid dễ bay hơi. Trong sữa thường có hai loại chính là Betabacterium causasium và Betabacterium breve. Bảng 2.2: Giá trị nhiệt độ và pH tối ưu cho sự sinh trưởng của loài vi khuẩn lactic Loài vi sinh vật Topt, (0C) pHopt Lactococcus lactis Lactococcus cremoris Lactococcus diacetylactis Streptococcus thermophilus Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus helveticus Lactobacillus casei Lactobacillus kefir Lactobacillus acidophilus Lauconotoc lactis Lauconotoc cremoris Bifidobacterium bifidum 29 ÷ 34 28÷32 30÷34 40÷42 43÷46 43÷46 30÷37 30 37 20÷27 25÷30 37÷41 6,0÷6,5 6,0÷6,5 6,0÷6,5 6,0÷6,5 5,5÷6,0 5,5÷6,0 - - 5,5÷6,0 5,5÷6,0 - - 2.1.5.3. Acetobacter acetic Acetobacter aceti: là những trực khuẩn ngắn, không chuyển động, có thể liên kết với nhau thành chuỗi dài. Tốc độ sinh trưởng của chúng rất nhanh, từ một tế bào sau 12 giờ có thể sinh sản thành 17 triệu tế bào. Chúng bắt màu vàng với iod, sống ở nồng cồn khá cao (11%) và có khả năng ôxy hóa cồn để tạo thành 6% acid acetic. T0 op= 23-300C, pH op= 5,5-6,2 (có loài chịu pH 400C sẽ gây ra hiện tượng co tế bào và tạo thành hình quả lê. A. aceti có khả năng chịu acid cao, có khả năng đồng hóa đạm hữu cơ và có khả năng đồng hóa các nguồn cacbon như ethanol, glucose, fructose, saccharose, maltose, glycerin, lactose… A. aceti phải có acid pantothenic và các chất khoáng (K, Mg, Ca, Fe, S, P…) mới đồng hóa được khoáng, vitamin và không có khả năng sử dụng tinh bột. Nấm men Nấm men thuộc đơn bào, tế bào có hình elip hoặc hình trứng, đường kính 10-15mm, không di chuyển được. Một vài loài nấm men tạo bào tử túi (thường 4 tế bào), chúng sinh sản chủ yếu bằng cách nẩy chồi. Nấm men phát triển tốt ở 24-40oC và có thể chịu được acid cao, pH=3.5. Chúng oxi hóa và lên men mạnh mẽ nguồn nguyên liệu carbonhydate và acid hữu cơ. Nhìn chung, chúng không phân giải protein, một vài loài có thể phân giải lipid. a. Saccharomyces Saccharomyces cerevisiae: Là loài nấm men lên men nổi, kỵ khí không bắt buộc. Sinh sản theo kiểu nảy chồi, phân đôi bào tử. Saccharomyces cerevisiae được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất rượu, bia, nước giải khát lên men… Chúng có dạng cầu, ovan, elip… kích thước khoảng 2,5-10 x 4,5-21 μm, đơn bào, sinh sản chủ yếu bằng hình thức sinh sản vô tính theo lối nảy chồi. Saccharomyces cerevisiae có thể lên men nhiều loại đường khác nhau như glucose, saccharose, maltose, fructose, galactose, raffinose. Nhưng không lên men đường lactose, cellobiose, Inulin… Loài này chịu được độ acid cao, T0op= 25-300C, T0min = 2-30C, ở 400C ngừng sinh trưởng và men bị chết. Hình 2.9: Nấm men Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces fragitis: Nó có hình trứng hay hình thuôn dài, đường kính 1.8-5.6mm, được đặc trưng bởi khả năng tạo cồn và CO2. Nhiệt độ tối thích là 37oC, không phát triển ở 5oC hay 43oC và không bị tiêu diệt khi thanh trùng. Candida pseudotropicalis var lactose: Nó là tế bào hình trứng, dài từ 7-15mm, lên men tạo ra cồn và CO2. Nhiệt độ tối thích 37oC, không phát triển ở 5oC hay 43oC. Nó không sinh bào tử, về mặt sinh hóa Candida oxy hóa tốt hơn lên men và được xem là nấm mốc hơn nấm men. Tế bào có hình hình trụ tròn và sinh sản bằng cách nhân đôi. Tế bào con được tách ra từ sự phân chia tế bào mẹ. Loài vi sinh vật này oxy hóa acid lactic thành CO2 và H2O. b. Kluyveroyces Kluyveroyces: hình thái tế bào rất giống với Saccharomyces cerevisiae, sinh sản bằng bào tử túi có thể có 1-60 bào tử túi, trong khi Saccharomyces chỉ có 1-4 bào tử túi. Sự tiêu thụ kefir Kefir đã được tiêu thụ hàng ngàn năm và có nguồn gốc từ miền núi Caucasus. Mặc dù, kefir vừa mới được khám phá ở một vài khu vực trên thế giới, nhưng nó đã phổ biến ở Liên Xô, Hungary và Phần Lan được nhiều năm (Komai và Nanno, 1992). Sau đó, nó được biết đến ở Thụy Điển, Na Uy, Phần Lan và Đức (Kroger, 1993) và Hy Lạp, Áo, Brazil, Israel (Hllé, 1994). Sau đó thì phổ biến ở cả Mỹ và Nhật. Ở nhiều nước, những sản phẩm liên quan đến kefir được sản xuất rất nhiều như kefir đông lạnh và khô được cô đặc từ sữa (360 g/kg tổng thể tích) và được lên men bởi những giống truyền thống, bơ sữa kefir là một sản phẩm truyền thống được chế biến từ sữa được lắng hết kem, sữa kefir nuôi cấy được sản xuất đặc biệt từ việc pha trong nấm men bánh mì với kem hoặc yaourt ban đầu, những sản phẩm giống kefir được sản xuất bằng hỗn hợp vi sinh vật và nó cho kết quả cảm quan khác nhau, nhưng nó thiếu những đặc điểm điển hình của kefir truyền thống, ví dụ như Omaere (ở Tây Nam Châu Phi), Rob hay Roba (ở một vài nước Ả Rập), KjaKlder MjoKlk (ở Na Uy), Kellermilch (ở Đức), Tarag (ở Mông Cổ), kefir (ở Thổ Nhĩ Kỳ), Osobyi (ở Nga). Mặc dù, sữa bò, sữa dê, sữa cừu được sử dụng một cách rộng rãi cho nhiều loại sản phẩm sữa lên men khác nhau, nhưng những thông tin về chất lượng cảm quan của kefir trong việc sử dụng nhiều loại sữa từ động vật có vú khác nhau thì rất ít. (Semih Ot.es, Oz.em Cagindi, 2003) 2.1.7. Dinh dưỡng và những lợi ích về sức khoẻ của Kefir Bên cạnh những vi khuẩn có lợi và nấm men, Kefir còn chứa nhiều khoáng chất và những acid amin cần thiết giúp chữa bệnh và duy trì các chức năng cho cơ thể. Các protein hoàn chỉnh trong Kefir được tiêu hoá hoàn toàn, vì thế cơ thể hấp thu một cách dễ dàng. Tryptophan là một trong những acid amin cần thiết rất phong phú trong Kefir, có tác dụng xoa dịu hệ thống thần kinh. Kefir rất giàu Ca và Mg, là những chất quan trọng cho một hệ thần kinh khoẻ mạnh, nếu dùng Kefir thường xuyên sẽ có tác dụng tốt cho hệ thần kinh. Kefir cung cấp một lượng lớn phospho, đây là khoáng chất cần thiết thứ hai trong cơ thể con người, nó giúp sử dụng carbohydrat, chất béo, protein giúp tế bào phát triển tốt, duy trì và cân bằng năng lượng. Kefir rất giàu vitamin B12, B1 và vitamin K. Đây là một nguồn Biotin tuyệt vời giúp cơ thể hấp thu những loại vitamin khác như acid folic, acid pantothenic và B12. Kefir chứa nhiều chất cần thiết như: đường sữa, khoáng chất, vitamin, béo. Vị chua và men của Kefir giúp dễ dàng tiêu hóa những thức ăn khác. Hơn nữa, Kefir chứa một lượng khổng lồ nhũ khuẩn đối kháng với những vi trùng gây bệnh đã rõ ràng cấu tạo. Kefir còn có những tác dụng tốt cho sức khỏe như: + Ức chế vi trùng gây bệnh đường ruột (vi khuẩn gây bệnh ở ruột già), giúp ổn định vi khuẩn đường ruột, điều hòa tiêu hóa, vừa chống tiêu chảy, vừa chống táo bón. + Đường lactose của sữa được thủy phân thành acid lactic nên tránh được tình trạng bất dung nạp đường lactose của sữa cho những người không có men lactose trong đường ruột. + Kích thích hệ thống miễn dịch giúp tạo khánh thể chống lại các khối u và ung thư. + Giảm cholesterol trong máu, giảm tress, bớt căng thẳng. Bảng 2.3: Các thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của kefir Thành phần 100g Thành phần 100g Năng lượng 65 kcal Chất béo (%) 3.5 Protein (%) 3.3 Lactose (%) 4.0 Nước (%) 87.5 Acid sữa (g) 0.8 Ethyl alcohol (g) 0.9 Acid lactic (g) 1 Cholesterol (mg) 13 Phosphate (mg) 40 Các acid amin thiết yếu (g) Tryptophan 0.05 Phenylalanin + tyrosine 0.35 Leucine 0.34 Isoleucine 0.21 Threonine 0.17 Methionine + cystine 0.12 Lysine 0.27 Valine 0.22 Các hợp chất thơm Acetaldehyde Diacetyl Aceton Chất khoáng (g) Can-xi 0.12 Phospho 0.10 Ma-giê 12 Kali 0.15 Natri 0.05 Clo 0.10 Nguyên tố vi lượng Sắt (mg) 0.05 Đồng (mg) 12 Molybden (mg) 5.5 Mangan (mg) 5 Kẽm (mg) 0.36 Vitamin (mg) A 0.06 Carotene 0.02 B1 0.04 B2 0.17 B6 0.05 B12 0.5 Niacin 0.09 C 1 D 0.08 E 0.11 (Semih Ot.es, Oz.em Cagindi, 2003) 2.1.8. Phương pháp chế biến và bảo quản giống Kefir Giống vi sinh vật rất dễ bị thoái hóa và bất hoạt, do đó công tác bảo quản giống vi sinh vật thì cần thiết và bắt buộc. Bảo quản hạt kefir trên môi trường dinh dưỡng phải đảm bảo được các điều kiện để hạt kefir có thể sống sót và giữ được các đặc tính ban đầu của hạt kefir. Có nhiều phương pháp bảo quản giống vi sinh vật, nhưng sẽ có phương pháp kinh tế và chưa kinh tế. Việc lựa chọn phương pháp bảo quản phụ thuộc vào nhiều điều kiện khách quan của phòng thí nghiệm, khả năng sống sót của từng giống và sự ổn định di truyền của giống. a. Phương pháp lạnh đông Là một phương pháp có thể trữ hạt kefir trong thời gian khoảng 2 tháng. Để đông lạnh hạt kefir một cách có hiệu quả chúng ta phải rửa sạch hạt kefir với nước được đun sôi để nguội, sau đó vỗ nhẹ chúng cho khô nước. Chúng ta có thể bảo quản hạt kefir trong một dụng cụ thủy tinh hoặc bao nylon, và cho thêm vào hạt kefir một ít bột sữa khô để bao bọc lấy hạt kefir, sau đó đông lạnh chúng. Bột sữa khô thêm vào đóng vai trò như một tác nhân bảo vệ. Nếu không thêm bột sữa khô vào hạt kefir khi bảo quản lạnh thì sau khoảng thời gian không quá một tháng thì hạt kefir sẽ bị thoái hóa và thành phần nấm men của hạt kefir trở nên hư hại. (Greeting & Welcome to Dom’s kefir FAQ in-site) Hình 2.10: Hạt kefir được bảo quản bằng phương pháp lạnh đông Ưu điểm: Đơn giản dễ làm, hạt Kefir phát triển nhanh, mạnh hơn so với bảo quản bằng phương pháp đông khô. Nhược điểm: Tốn kém (do phải thay sữa liên tục), bảo quản được ít thời gian hơn (khoảng vài tháng) sau đó, các vi sinh vật trong hạt Kefir sẽ tự chết ( không còn hoạt động nếu đem vào quy trình chế biến). b. Phương pháp đông khô Hạt kefir bị khử nước có thể trữ được trong khoảng thời gian dài từ 12 – 18 tháng. Để khử nước hạt kefir tươi, chúng ta phải rửa sạch hạt với nước đã được đun sôi và làm lạnh. Sau đó, có thể vỗ nhẹ hoặc lau khô bằng khăn lau làm bằng vải tua trắng. Giúp cho hơi nước thoát ra ngoài cho đến khi hạt kefir trở nên rắn chắc hơn và hạt có màu vàng. Tùy thuộc vào nhiệt độ, độ ẩm, kích cỡ của hạt mà chúng ta có thể khử nước hoàn toàn cho hạt kefir từ 2 – 5 ngày. Ta có thể trữ hạt kefir khô trong một dụng cụ thủy tinh kín gió và trữ trong nơi mát như trong tủ ướp lạnh (không trữ trong tủ lạnh). (Greeting & Welcome to Dom’s kefir FAQ in-site) Hình 2.11: Hạt kefir được bảo quản bằng phương pháp đông khô Ưu điểm: Hạt Kefir sẽ sống lâu hơn (khoảng vài năm) so với bảo quản bằng phương pháp lạnh đông, đỡ tốn kém hơn. Nhược điểm: Trong quá trình nuôi Kefir trong sữa bột thì gần như các vi sinh vật trong hạt Kefir sẽ vô hoạt hoàn toàn ( nghĩa là trong trạng thái chết giả), nếu muốn hạt Kefir có thể hoạt động trở lại bình thường thì phải mất vài tuần nuôi trong môi trường sữa. Tốn nhiều thời gian hơn so với phương pháp lạnh đông. Phục hồi hoạt động của hạt kefir a. Phục hồi hoạt động của hạt kefir được đông lạnh Để phục hồi hoạt động của hạt kefir được đông lạnh, chúng ta cho vào hạt kefir đông lạnh một ít nước lạnh trong vài phút và bột sữa sẽ được rửa sạch trong giai đoạn này. Sau đó cho thêm sữa tươi vào giống với tỷ lệ 1: 3 (1/2 cốc sữa với 2 muỗng giống). Sau 24h, lọc sữa và tiến hành qui trình này lại nhiều lần, sữa lúc này có thể đông hoặc không đông. Trong những lần tiếp theo, có thể cho thêm sữa với thể tích nhiều hơn. Khi trong sữa xuất hiện nhiều cục đông sau 24h thì hạt kefir của bạn đã được phục hồi. Ở thời điểm này sữa có mùi chua tinh khiết và mùi thơm của nấm men tươi. Điều này có thể làm được trong 1 tuần và trong một số trường hợp có thể kéo dài hơn. (Greeting & Welcome to Dom’s kefir FAQ in-site) b. Phục hồi hoạt động của hạt kefir được đông khô Để phục hồi hoạt động của hạt kefir đã được đông khô thì ta thêm một ít sữa tươi vào ly trữ hạt kefir. Hạt kefir sẽ được phục hồi sau mỗi mẻ, trong những mẻ đầu ta có thể thu được hay không được những cục đông, ta không nên uống sữa được lên men trong giai đoạn này, lúc này có xuất hiện màu vàng bẩn và có sự hình thành bọt trên bề mặt sữa và ta có thể uống sữa lên men khi nó có mùi thơm, chua tinh khiết. Hạt kefir được đông khô có thể được phục hồi lại sau 4 ngày và trong một số trường hợp có thể kéo dài từ nửa tuần đến một tuần. Khi sữa bắt đầu tạo những cục đông sau 24h, tạo được mùi thơm chua tinh khiết, với một mùi thơm của nấm men tươi. Lúc đó, hạt kefir được phục hồi hoạt động và có thể lên men liên tục. Tỷ lệ phát triển của hạt kefir thì khác nhau, trong một vài trường hợp có thể kéo dài đến 3 tuần. Thời gian có thể kéo dài như vậy là do điều kiện trữ hạt kefir đông khô. (Greeting & Welcome to Dom’s kefir FAQ in-site) 2.2. Cơ sở khoa học của quá trình lên men 2.2.1. Lên men lactic Trong công nghệ vi sinh vật, nhìn chung vi khuẩn lactic đồng hình luôn chiếm ưu thế. Tuy nhiên, trong công nghệ sản xuất các thực phẩm lên men truyền thống như phomai, Kefir, vi khuẩn lactic dị hình đôi khi vẫn được sử dụng nhằm mục đích đa dạng hoá chỉ tiêu về mùi vị và cấu trúc cho sản phẩm. Quá trình lên men diễn ra trong tế bào chất của vi khuẩn. Đầu tiên đường lactose trong sữa được vi khuẩn lactic đưa vào tế bào nhờ cơ chế vận chuyển đặc trưng của màng tế bào chất (Cytoplasmic membrane). Tiếp theo, lactose sẽ được phân thành 2 monosacharide rồi đi vào các chu trình chuyển hoá khác nhau. Đối với nhóm vi khuẩn lactic đồng hình như giống Lactococcus, các loài Streptococcus helveticus, Lactobacilus bulgaricus, Lactobacilus lactic, Lactobacilus thermophylus lactic.... chu trình đường phân là con đường chính chuyển hoá glucose thành acid lactic. Phương trình tổng quát của lên men đồng hình: C6H12O6+ 2ADP + 2Pi Æ 2CH3-CH-COOH + 2ATP OH Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng. Các phân tử ATP được hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất (lactose) sẽ được vi khuẩn giữ lại trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinh vật. Ngược lại, các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thải vào môi trường lên men. Kết quả là hàm lượng acid lactic tích luỹ trong môi trường lên men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo những biến đổi hóa lý khác. Trong quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic (lên men đồng hình), acid acetic, ethanol, CO2 (lên men dị hình) trong dịch lên men còn xuất hiện cả trăm hợp chất hóa học mới khác. Chúng là sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men. Hàm lượng của chúng trong dịch lên men thường rất thấp (vài ppm hoặc ít hơn). Một số hợp chất trong nhóm trên rất dễ bay hơi. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc góp phần hình thành nên mùi vị đặc trưng cho những sản phẩm lên men lactic. Đáng chú ý nhất là diacetyl và acetaldehyde, đây là những hợp chất quan trọng quyết định đến mùi vị đặc trưng cho sản phẩm lên men từ sữa. Lactose Glucose Galactose Sản phẩm trung gian Acetaldehyde C2H5OH CH3CHO +CO2,CH3CHO Axit Pyruvic CH3COCOOH Acetoin +1/2O2 CH3COCHOHCH3 + 2H +2H2O +1/2O2 - 2H +2H2 Axit lactic axit lactic CO2 + CH3COOH CH3COOH Diaxetyl CH3COCOCH3 Lên men Lên men dị thể đồng thể Hình 2.12: Sơ đồ tóm lược chuyển hoá các chất trong quá trình lên men sữa Tỷ lệ hàm lượng diacetyl và acetaldehyde ảnh hưởng đến giá trị cảm quan của yaourt và bơ. Tỷ lệ này phụ thuộc vào thành phần các vi sinh vật sử dụng trong tổ hợp giống và các thông số kĩ thuật của quá trình lên men như nhiệt độ, pH đầu, lượng giống cấy... 2.2.2. Lên men ethanol Trong công nghệ sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa, quá trình lên men ethanol được thực thực hiện chủ yếu bởi các nấm men thuộc giống Sacharomyces và Kluyveromyces. Sau khi được vận chuyển vào trong tế bào chất, đường hexose được chuyển hóa theo chu trình đường phân để tạo thành acid pyruvic. Tiếp theo acid pyruvic sẽ được chuyển hoá thành acetaldehyde rồi thành ethanol Dihydroxyacetone phosphat là một sản phẩm trung gian trong chu trình đường phân, hợp chất này có thể chuyển hoá thành glyxerol. Trong môi trường pH acid, glycerol chỉ được tạo ra với hàm lượng nhỏ. Ngược lại, trong môi trường pH kiềm lượng glyxerol sinh ra sẽ tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ trở thành một trong những sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men. Phương trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trường pH acid C6H12O6 + 2ADP +2Pi Æ 2 C2H5OH + 2CO2 + 2ATP Sự chuyển hóa đường hexose thành ethanol và khí CO2 diễn ra trong tế bào chất của nấm men. Đây là quá trình trao đổi năng lượng của nấm men trong điều kiện kỵ khí. Ethanol và CO2 trong tế bào chất sẽ được nấm men thải vào môi trường lên men. Ngoài ra tế bào nấm men còn tổng hợp và thải vào dịch lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác, những hợp chất này được tìm thấy với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4 nhóm: glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và ester. Trong quá trình lên men ethanol, nhiều acid hữu cơ được tạo thành (The Moll, 1990). Một số acid hữu cơ được sinh tổng hợp từ chu trình Crebs nếu như quá trình lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic, lactic... 2.2.3. Quá trình đông tụ casein Hình 2.13: Cấu trúc Casein Casein là một phosphoprotein. Trong thành phần của nó có chứa phosphoric Casein có nhiều nhóm chức tự do khác nhau như -CO2, -NH2, -NH, -NH-CO-, -SH,…chính nhờ các nhóm này mà casein có khả năng tham gia các phản ứng hóa học. Trong số các nhóm trên nhóm -COOH, -NH có ý nghĩa nhất vì một phần các nhóm này ở trạng thái tự do và quyết định tính chất của casein. Casein được xem như một chất điện li lưỡng tính đa hóa trị, dễ dàng tham gia các phản ứng với các kim loại kiềm, kiền thổ, casein hòa tan trong nước. Trong sữa, casein ở dạng canxi caseinat và nó lại kết hợp với canxi phosphate tạo thành phức hợp canxi phosphate caseinat (các micelle casein). Các micelle casein mang điện tích âm. Vì tất cả các micelle đều mang điện tích âm nên chúng đẩy nhau, điều đó khiến các micelle casein tồn tại dưới dạng keo. Quá trình đông tụ casein của sữa dưới tác dụng của enzyme (thường dùng là renin là một protease được chiết xuất từ dạ dày bê) thực chất là quá trình thủy phân hạn chế casein κ, vỏ háo nước bị phá hủy do đó các ion Ca2+ dễ dàng tiếp cận với các casein α, β và paracasein κ và làm cho chúng tạo gel. Casein κ có đầu amino (đầu ưa béo) được liên kết với các phân tử αs và β-casein trong micelle luôn hướng về phía tâm micelle, còn đầu carboxy ( đầu ưa nước) luôn hướng ra ngoài vùng biên micelle . Quá trình đông tụ casein bởi renin được chia thành 3 giai đoạn như sau: - Giai đoạn 1: Renin thủy phân liên kết peptide Phe-Met (2 acid amin nằm vị trí 105-106 trong phân tử casein κ) tạo thành caseinoglucopeptide (106-169) hòa tan và paracasein κ (1-105) không hòa tan. Phản ứng không phụ thuộc Ca2+. - Giai đoạn 2: Đông tụ casein. Ở giai đoan này các micelle sau khi bị mất phân đoạn caseinoglucopeptide trong phân tử casein κ bắt đầu liên kết lại với nhau. Đó là do hiện tượng giảm sự tích điện bề mặt của micelle, từ đó lực đẩy tĩnh điện giữa các micelle cũng bị giảm. Bề mặt micelle trở nên ưa béo hơn do chỉ chứa phân đoạn paracasein κ và chúng có thể liên hợp lại với nhau một cách dễ dàng hơn. Ngoài ra, phần điện tích dương của phân đoạn paracasein κ có thể tương tác với phần điện tích âm của phân tử casein α, β. Cầu calci phosphate sẽ xuất hiện giữa các micelle và góp phần làm tăng kích thước đông tụ. - Giai đoạn 3: kết thúc quá trình đông tụ và tách huyết thanh sữa Bảng 2.4: Thành phần casein trong sữa bò Casein Hàm lượng (%) Dạng Phân tử lượng Số acid amin trong phân tử Đặc điểm αs 45 - 57 αs1 23.600 199 Phân tử có một đầu mạch có tính ưu nước, một đầu mạch có tính kỵ nước. αs2 25.150-25.390 207 Có tính ưu nước cao nhất. αs3 25.150-25.390 207 αs4 25.150-25.390 207 αs5 25.150-25.390 207 Được tạo thành do phân tử αs3, αs4- casein liên kết với nhau qua cầu disulfune. αs6 25.150-25.390 207 β 25 - 35 24.000 209 Có tính ưu béo cao. κ 8 - 15 κ1, κ2, κ3, κ4, κ5, κ6, κ7. 19.000 169 Không chứa glucid, có tính lưỡng cực. γ 3 - 7 γ1 20.000 181 Là những sản phẩm của quá trình thủy phân β-casein bởi plasmine từ trong máu động vật. γ2 12.000 104 γ3 12.000 102 2.3. Các yếu tố ảnh hưởng lên men lactic a. Nguồn glucid Nước Lactose Để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào vi khuẩn cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn cacbon. Nguồn cung cấp glucid quan trọng cung cấp cho vi khuẩn là đường lactoza. Hầu hết các vi khuẩn lactic đều có enzyme lactose, nên thủy phân được lactose thành glucose và galactose. C12H22O11 C6H12O6 + C6H12O6 Lactose Glucose Galactose Glucose và galactose VK Các hợp chất khác + Sinh năng lượng Một số loại đường khác vi khuẩn lactic sử dụng rất chọn lọc: + Đisaccharide: saccharose, maltose… + Polysaccharide: dextrin, tinh bột… Đối với lên men lactic đồng hình vi khuẩn lactic chuyển hóa được khoảng 98% glucid thành acid lactic. b. Nguồn Azot Các nguồn Azot có ý nghĩa quan trọng đối với sự phát triển của vi sinh vật, nếu không có các nguồn này thì sẽ không tổng hợp được các chất phức tạp cấu tạo nên nguyên chất trong tế bào vi sinh vật. Vi sinh vật đòi hỏi nguồn Azot rất cao đặc biệt là: Protit: Sự tương tác giữa Casein trong sữa với vi khuẩn lactic khi có sự hiện diện của ion H+ trong môi trường làm tăng khả năng lên men lactic. Ngoài ra, Casein còn là chất đệm có tính trung hòa một lượng acid sinh ra trong quá trình lên men. Pepton: Trong môi trường sữa đã có sẵn nguồn pepton nhưng do nhu cầu peptone đối với vi khuẩn rất cao do đó cần bổ sung peptone từ bên ngoài vào môi trường sữa để đảm bảo lượng peptone đủ để làm tăng tốc độ lên men. Acid amin: Vi khuẩn lactic hấp thụ dễ dàng. Theo các nghiên cứu, vi khuẩn lactic phát triển tốt nhất trong môi trường có đầy đủ 16 loại acid amin. Đối với các vi khuẩn sinh hương, acid amin ngoài sự cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn mà nó còn kích thích sự tạo hương thơm. Trong acid amin, senin có tác dụng ức chế sự phát triển của nhiều loài Streptococcus. c. Vitamin Vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin và do môi trường sữa có đầy đủ các loại vitamin cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn lactic nên không cần bổ sung thêm từ bên ngoài. Bảng 2.5: Các vitamin được các loài vi khuẩn sử dụng Loài vi khuẩn Vitamin Riboflavin Piridoxin Acid fomic B12 Tiamin Lc. Jugurti + + − − − Lc. Lulveticum + + − − − Lc. Bulgaricum + − +/− − − Lc. Lactic + − − +/− − Lc. acidepphilus + − + +/− − d. Muối khoáng và các nguyên tố vi lượng Nhu cầu này không lớn do đó không cần bổ sung thêm từ ngoài vào mà chỉ cần sử dụng những chất có sẵn trong môi trường sữa. Trong các loai muối khoáng P chiếm tỉ lệ cao nhất. ­Chú ý: Nồng độ NaCl trong môi trường không được quá 6,5% nó sẽ tiêu diệt hết tất cả các loại vi khuẩn lactic. e. Nhu cầu oxy Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy và vừa sống được trong môi trường không có oxy. Theo nghiên cứu cho rằng vi khuẩn lactic phát triển tốt nhất trong môi trường có oxy thấp. f. Nhiệt độ Tùy từng loại vi khẩn khác nhau mà nhiệt độ thích hợp cho nó sẽ khác nhau: VSV ưa lạnh: VSV ưu ấm: VSV ưu nóng: tmin = 00C tmax = 20 – 300C top = 5 – 100C tmin = 30C tmax = 45 – 500C top = 20 – 350C tmin = 300C tmax = 800C top = 50 – 600C Nhiệt độ không những ảnh hưởng đến cường độ phát triển mà còn ảnh hưởng đến khả năng phát triển của chúng nữa. Điều chỉnh nhiệt độ thích hợp sẽ: + Rút ngắn thời gian lên men. + Hạn chế sự nhiễm các vi sinh vật lạ khác. + Sản phẩm thu được đạt kết quả như mong muốn. g. pH môi trường pH của môi trường ảnh hưởng đến hoạt động phát triển của vi sinh vật, sự có mặt của ion H+ sẽ tác động lên tế bào của vi sinh vật theo nhiều cách: + Ảnh hưởng trực tiếp lên bề mặt của tế bào làm thay đổi sự tích điện trên bề mặt của màng từ đó dẫn đến hoạt độ của các loại enzyme bị giảm. + Nồng độ ion H+ ảnh hưởng đến độ phân ly của các chất dinh dưỡng trong môi trường. + pH môi trường khác còn làm độ phân tán chất keo và độ xốp của thành tế bào không đồng đều cho nên việc chống lại các tác động bên ngoài sẽ khác nhau dẫn đến làm thay đổi hình dạng của tế bào. Với vi khuẩn lactic thì các loại cầu khuẩn chịu pH kém hơn so với các trực khuẩn. Bảng 2.6: Các giá trị pH mà vi sinh vật phát triển được Loài vi khuẩn pHmin pHop pHmax Trực khuẩn ưu nhiệt 3,5 – 4,25 5,5 – 6,5 7 – 8 S. Lactic 4,75 6 – 6,5 8,5 S. thermophilus 4,75 6 – 7 8,5 S. Faecalis 4,5 6 – 7 10 Đối với các vi khuẩn lên men lactic đồng hình, pH môi trường thường không ảnh hưởng đến các sản phẩm đặc trưng của quá trình lên men còn đối với các vi khuẩn lên men lactic dị hình thì ngược lại. + Khi pH môi trường cao thì sản phẩm tạo thành chủ yếu là acid lactic. + Khi pH môi trường thấp thì sản phẩm tạo thành ngoài acid lactic còn có thêm acid acetic và nhiều sản phẩm khác. Qua nhiều nghiên cứu người ta nhận thấy rằng lượng di-acetyl tạo ra nhiều nhất tại pH = 4.6-5,2. Đây chính là yếu tố làm tăng mùi hương cho sản phẩm. Tác dụng của chất kháng sinh do các vi khuẩn lactic sinh ra cũng bị ảnh hưởng bởi pH môi trường. h. Các chất kháng sinh Các chất kháng sinh ảnh hưởng rất lớn đến vi khuẩn lactic + Penicilin: chỉ một lượng rất nhỏ cũng đủ làm ức chế nhiều loài vi khuẩn lactic. + Streptomycin: có tính kháng sinh rất mạnh, có khả năng tiêu diệt cả vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm. Trong quá trình lên men, hàm lượng chất kháng sinh tạo ra trong môi trường đủ lớn sẽ làm giảm hiệu xuất lên men. Bảng 2.7: Biến đổi các thành phần từ sữa tạo thành Kefir Thành phần Chú thích Chất béo Phụ thuộc nguồn sữa ban đầu (bò, dê...) và lượng béo của sữa được dùng (nguyên béo, tách béo một phần hay không béo) Lactose Tiêu thụ một phần lactose, bởi vi khuẩn lactic và nấm men. Lactose trên 100 g sản phẩm sữa Kefir: 2÷2,5 g. Acid lactic Hình thành bởi vi khuẩn lactic. Trên 100 g sản phẩm sữa Kefir có 0,6÷1 g Potein Chiếm 3÷3,4 g/100g sản phẩm sữa Kefir Ethanol Sản sinh bởi nấm men nếu dùng men: lượng cồn là 0,01÷0,1g/100g sữa, nếu dùng hạt Kefir lượng cồn là 0,02÷1,8 g/100g sữa. Các acid hữu cơ khác Axetic, fomic, propionic, Succinic, pyruvic, iso butyric, caproic, acid lauric…góp phần tạo hương cho Kefir hay được tiêu thụ bởi chính loài vi khuẩn trong suốt quá trình lên men. CO2 Sinh ra nhờ nấm men và vi khuẩn lactic lên men dị thể sinh CO2 tạo tính đặc trưng cho Kefir. Hợp chất thơm Acetaldehyde, diacetyl, acetone góp phần vào hương của sản phẩm Vitamin Tăng vitamin B (đối với sữa cừu), pyridoxine (từ sữa cừu, dê, ngựa), acid folic (trừ sữa ngựa), orotic, nicotinic, acid pantothenic: không đổi hay giảm khi cô đặc (Nguyễn Tú Thanh, 2003) CHƯƠNG III: CÁC ỨNG DỤNG CỦA KEFIR 3.1. Qui trình chế biến Kefir 3.1.1. Qui trình sản xuất men giống Kefir a. Quy trình Sữa tươi tiệt trùng Cấy giống Lên men Lọc thô Xử lý Dịch men giống cho sản xuất Hạt Kefir Hạt Kefir (5%) Hạt Kefir Hình 3.1: Sơ đồ quy trình tạo men giống trong sản xuất sữa chua Kefir b. Giải thích qui trình sản xuất men giống § Môi trường chuẩn bị giống Môi trường sử dụng có thể là sữa tươi, sữa gầy hoặc sữa hoàn nguyên. Hàm lượng chất khô trong môi trường khoảng 11÷12%. Sữa được thanh trùng ở 90÷950C trong thời gian 30÷45 phút (thời gian thanh trùng kéo dài nhằm vô hoạt enzyme và ức chế đến mức tối thiểu sự có mặt của vi sinh vật lạ trong môi trường để giúp cho giống phát triển tốt và không bị tạp nhiễm), sau đó đưa về 22÷240C để chuẩn bị cấy giống. Ở đây ta sử dụng sữa tươi tiệt trùng của Vinamilk . § Cấy giống sử dụng hạt Kefir với lượng ban đầu 5% theo khối lượng, quá trình nhân giống cũng được thực hiện ở nhiệt độ phòng (23÷250C) . Do hạt Kefir có kích thước lớn nên chúng thường bị chìm xuống dưới đáy nên cần phải khuấy trộn môi trường trong thời gian 10÷15 phút sau mỗi 2÷5 giờ. Quá trình nhân giống kết thúc khi pH môi trường giảm xuống còn 4,5. § Lọc thô Khi đạt pH yêu cầu, canh trường được lọc. Hạt kefir được xử lý bằng cách rửa trong nước vô khuẩn ở nhiệt độ thấp (6÷100C) để loại bỏ tạp chất bám trên bề mặt hạt (có thể sử dụng sữa gầy vô trùng để rửa hạt, Hạt Kefir đã qua rửa sạch và bảo quản trong nước vô khuẩn hoặc dung dịch muối NaCl 0,9%. Khi cần nhân giống cho mẻ tiếp theo, sử dụng tiếp hạt Kefir trên để nhân giống . Dịch thu được sau quá trình lọc thô chứa các vi khuẩn lactic và nấm men có thể sử dụng để cấy giống vào môi trường sữa nguyên liệu để sản xuất Kefir. Quá trình sản xuất giống cũng được thực hiện ở 25÷300C thời gian nuôi trung bình là 20 giờ (cần kiểm tra giá trị pH của canh trường là 4,5 để xác định thời điểm kết thúc quá trình nuôi 3.1.2. Qui trình chế biến sữa chua Kefir a. Quy trình Sữa tiệt trùng không đường Phối chế Cấy giống Lên men (18 giờ,25 0C) Phối chế, điều vị Vô bao bì Ủ chín (12 giờ, 14-16 0C) Sản phẩm Kefir (bảo quản lạnh) 6% dịch men giống Kefir 10% sirô đường saccharose nồng độ 40%, 10% gelatine 10% sirô đường saccharose nồng độ 60% Hình 3.2: Sơ đồ quy trình sản xuất sữa Kefir b. Giải thích qui trình sản xuất Kefir § Nguyên liệu Sữa có chất lượng cao, không chứa kháng sinh và đạt các mức chỉ tiêu về vi sinh. Hàm lượng chất béo có thể thay đổi tuỳ thị hiếu người tiêu dùng, sản phẩm Kefir thường có hàm lượng chất béo từ 2,5÷3,5%. Trong các thí nghiệm này, sử dụng nguyên liệu là sữa tươi tiệt trùng của Vinamilk. § Phối chế Bổ sung thêm sirô đường saccharose vào sữa nguyên liệu nhằm tạo điều kiện tối ưu cho vi khuẩn lactic phát triển và tạo hương vị đa dạng cho sản phẩm. Dung dịch gelatin được cho vào tỷ lệ 10%(v/v) so với thể tích dịch lên men. § Cấy giống Sữa sau khi đã được điều phối tạo điều kiện tối ưu cho nấm Kefir hoạt động, tiến hành cấy dịch men giống (đã được chuẩn bị ở phần sản xuất dịch men giống (mục 1.6.1) vào để lên men § Lên men Trong quá trình lên men Kefir, vi khuẩn lactic sẽ chuyển đường lactose thành acid lactic, một số loại nấm men sử dụng đường lactose sẽ chuyển hoá lactose thành ethanol và khí CO2. Ngoài ra, trong dịch lên men chứa hàng trăm sản phẩm phụ từ hai quá trình lên men lactic và ethanol nói trên. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành nên hương vị của sản phẩm, đáng chú ý nhất là các acid hữu cơ như acid propiomic, acid formic, acid succinic, các hợp chất bay hơi thuộc nhóm aldehyde (aldehyde acetic, diacetyl) và rượu cao phân tử, nhiệt độ lên men 25÷300C. § Phối chế Sản phẩm sau lên men sẽ có độ nhớt tương đối cao nên cần bổ sung thêm nước và sirô đường saccharose nồng độ 60% để sản phẩm đạt cấu trúc và hương vị mong muốn § Vô bao bì Bao bì sử dụng là hũ thủy tinh hay hũ nhựa 50ml, được rửa sạch, vô trùng và rót sản phẩm trong điều kiện vô trùng để hạn chế các vi sinh vật từ môi trường xung quanh nhiễm vào sản phẩm. § Ủ chín Sau khi phối chế và vô bao bì tiến hành ủ chín sản phẩm bằng cách đưa sản phẩm về nhiệt độ 14-16 0C. Ở nhiệt độ này tốc độ trao đổi chất của vi khuẩn lactic và nấm men bị chậm lại. Công đoạn ủ chín giúp ổn định cấu trúc của sản phẩm sau quá trình phối chế và vô bao bì, vi khuẩn lactic và nấm men tiếp tục quá trình tạo sản phẩm phụ. Mùi vị sản phẩm Kefir được cải thiện rõ nét. Thời gian ủ chín là 12-14 giờ. § Bảo quản Sản phẩm hoàn thành được bảo quản ở 4÷60C. Trong quá trình bảo quản hệ vi sinh vật Kefir vẫn tiếp tục trao đổi chất với môi trường và làm biến đổi dần các chỉ tiêu hoá lý (độ chua, hàm lượng ethanol) và chỉ tiêu cảm quan (mùi vị...) của sản phẩm. Hình 3.3: Các sản phẩm sữa Kefir 3.2. Hạt Kefir trong môi trường nước đường a. Quy trình chuẩn bị giống Kefir Hạt Kefir Rửa sạch Môi trường nước đường (saccharose, glucose, fructose) Rửa sạch Rửa sạch Rửa sạch Men giống Kefir Hình 3.4: Quy trình chuẩn bị men giống Kefir b. Thuyết minh quy trình trên (Hình 2.12) Hạt Kefir sau khi vớt ra từ sữa, rửa thật sạch bằng nước vô trùng, sau đó thả vào môi trường nước đường đã được chuẩn bị sẵn. Ban đầu lấy khoảng 100ml nước đun sôi để nguội, pha khoảng 10% tương ứng với 10g đường ( loại đường nào cũng được glucose, fructose, saccharose,…) tuy nhiên ở đây chọn loại đường saccharose (đường trắng hoặc vàng tinh luyện của nhà máy đường Biên Hòa) để nuôi hạt Kefir. Sau 2–3 lần nuôi trong môi trường nước đường, hạt Kefir đã có vẻ thích nghi, ta tăng khối lượng đường lên (20g, 30g, 40g va 50g). Sau vài lần nuôi Kefir trong môi trường nước đường, hạt có khả năng phát triển và sinh sản mới cho kefir vao môi trường thí nghiệm. 3.3. Cơ sở khoa học của quá trình lên men Kefir trong môi trường nước đường Nhiều vi khuẩn và nấm men có trong hạt Kefir khi sống trong môi trường dinh dưỡng (như nước đường) sẽ sản sinh ra enzyme invertase thủy phân đường saccharose giải phóng giải phóng glucose và fructose. Đây là nguồn chất dinh dưỡng cơ bản cho các loài vi sinh vật khác có trong hạt Kefir. Cũng có những loài sử dụng nguồn năng lượng chính từ nguồn đường saccharose làm nguồn năng lượng và trao đổi cấu trúc. 3.3.1. Lên men lactic. Tác nhân gây lên men hay là tác nhân cung cấp hệ enzyme là các vi khuẩn họ Lactobacteriaccae (vi khuẩn này là vi khuẩn yếm khí hoặc vi khuẩn hiếu khí). Phụ thuộc vào hệ enzyme của từng nòi vi khuẩn mà trong môi trường lên men hoặc chỉ có acid lactic (lên men đồng hình) hoặc ngoài acid lactic còn có sản phẩm khác và CO2 (lên men dị hình). Tuy hệ vi khuẩn trong hạt Kefir rất phong phú nên trong sản phẩm lên men thường có chứa rất nhiều chất khác ngoài acid lactic. Có hai cơ chế tạo acid lactic: Acid lactic được tạo thành theo sơ đồ Embden-meyerhoff. Hydro đã được tách ra khi dehydro hóa triosephosphat, được chuyển đến pyruvat. Acid lactic tạo thành chiếm hơn 90% tổng sản phẩm lên men. Chỉ một phần nhỏ pyruvat bị khử cacbonxyl để chuyển thành acid acetic, ethanol, CO2 và acetoin. Lượng phẩm vật phụ tạo phụ thuộc vào sự có mặt của O2. Cơ chế thứ hai, xảy ra khi các vi khuẩn lactic không có enzyme cơ bản của sơ đồ Embden-meyerhoff là aldose và triosephosphatizomerase. Nói khác ra, acid lactic tạo thành ở đây theo chu trình pentosephosphat: nghĩa là qua glucose, 6-phosphogluconat và ribulose-5-phosphat. Xilulose-5-phosphat dưới tác dụng của enzyme pentosephosphocetolase (trong phản ứng phụ thuộc tiaminpirophosphat), bị phân ly để tạo thành aldehyd phosphoglycerinic va acetylphosphat. Acetylphosphat hoặc bị phân ly dưới tác dụng của acetatkinase (có phosphoryl hóa ADP) sẽ tạo thành acetate (L.brevis), hoặc bị khử để tạo thành acetaldehyde rồi thành rượu ethanol (L.mesenteroides). Còn aldehyd phosphoglycerinc thì bị ôxy hóa thành lactat theo con đường thông thường của sơ đồ Embden-meyerhoff. 3.3.2. Lên men ethanol. Nấm men chính cung cấp hệ enzyme đặc thù đề tạo thành ethanol trong giai đoạn lên men Saccharosemyces Cerevisiae. Nấm men có đặc điểm là trong điều kiện sinh hoạt yếm khí, chúng có khả năng chuyển đường thành ethanol và CO2 một cách hợp thức. Diễn biến của quá trình lên men như sau: Đường cùng các chất dinh dưỡng khác của môi trường lên men, trước tiên được hấp phụ vào trên bề mặt của tế bào nấm men, sau đó khuyếch tán qua màng bề mặt bán thấm đó mà vào bên trong tế bào. Trong khi nước được vào ra tế bào một cách tự do thì đường và các chất dinh dưỡng khác chỉ được màng tế bào cho đi vào mà không cho đi ra. Vì vậy, đường được chuyển hóa qua một chuỗi phản ứng để tạo thành sản phẩm cuối cùng của sự lên men là rượu ethylic và CO2. Phương trình phản ứng tổng quát của quá trình lên men: C6H12O6 + 2ADP + 2H3PO4 = 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 2H2O Trong điều kiện sản xuất, sự lên men rượu sẽ tiến hành một cách thuận lợi khi nhiệt độ từ 29÷320C. Người ta thấy, nấm men có thể làm lên men được mặc dù chậm chạp những dung dịch đường có nồng độ 25÷30%. Tuy nhiên môi trường thuận lợi cho lên men là 10÷18% đường. Dung dịch đường có nồng độ rất cao sẽ tạo ra áp suất thẩm thấu lớn gây phá hủy trạng thái sinh lý bình thường của nấm men. Thời gian lên men sẽ kéo dài, sử dụng không triệt dể hết đường, đồng thời lượng rượu tạo thành lớn sẽ ức chế hoạt động của nấm men. Giới thiệu sản phẩm nước quả lên men truyền thống. 3.4.1. Khái quát Nước giải khát lên men đó là sản phẩm của quá trình lên men rượu chưa kết thúc. Tùy theo nguồn nguyên liệu dùng để pha chế dịch lên men, người ta chia nước giải khát lên men thành nhiều nhóm khác nhau. Ở nước ta chưa sản xuất nước giải khát này nhưng có thể chia làm hai nhóm chính: nước giải khát lên men từ nguyên liệu chứa tinh bột và nước giải khát lên men từ nước quả. Dựa vào nguồn nguyên liệu mà ta có các sản phẩm như: nước giải khát lên men dứa, cam, chanh…Và tùy yêu cầu mà ta có hoặc không bổ sung CO2 vào trong nước giải khát. Thông thường thì người ta có bổ sung CO2 vào để tạo nước giải khát có ga. So với các loại siro quả mà hiện nay thường bán trên thị trường thì nước giải khát lên men (nước quả lên men) ngon và có tác dụng giải nhiệt hơn nhiều. Ngon hơn vì CO2 thoát ra do phản ứng lên men sẽ hòa tan với nước giải khát, sau đó tác dụng với các chất hoặc nguyên tố có trong thành phần của nước giải khát, tạo ra các este đơn giản và phức tạp nên có mùi thơm và vị dịu hơn. Mặt khác, do trong dịch còn chứa các chất giữ bọt như peptit, acid amin, melanoidin, các sản phẩm thủy phân…nên CO2 khi tới mặt nước sẽ không tan ngay mà được giữ lại và bám vào nhau tạo thành lớp bọt dày. Sản phẩm này giải nhiệt tốt hơn vì khi uống nước giải khát có ga thì CO2 sẽ bay hơi và thu nhiệt do đó gây cho ta cảm giac mát và khoan khoái. Sản xuất nước giải khát lên men từ nước quả có ưu điểm là đơn giản, và đòi hỏi ít trang bị, có thể tổ chức ở quy mô xí nghiệp, hợp tác xã và gia đình. Nhưng nhược điểm là giá thành cao và nếu điều kiện kỹ thuật không đảm bảo thì nước quả lên men dễ bị hỏng. Đặc điểm: -Nồng độ chất hòa tan trong sản phẩm: 5÷8% khối lượng -Độ chua: 2÷4 độ -Nồng độ rượu: 0,5÷1,5% thể tích -Thời gian tàng trữ để ổn định chất lượng: 5÷6 giờ -Thời gian bảo quan: 2 ngày Đặc điểm của nước giải khát lên men là trong thành phần các quá trình sinh học còn tiếp diễn, do đó không thể bảo quản lâu quá 2 ngày dù ở nhiệt độ thấp. Khi đã rót ra cốc mà để lâu thì chất lượng nước giải khát cũng bị giảm rõ rệt sau 2÷3 giờ. Vì vậy, nước giải khát lên men nói chung thường chỉ sản xuất đủ tiêu dùng trong ngày và lên uống khi còn tươi. Tuy nhiên đối với một số nước giải khát lên men cao cấp, người ta loại bớt tế bào nấm men rót vào chai đậy nút rồi đem thanh trùng ở nhiệt độ thích hợp và vì thế thời gian bảo quản cho phép tăng 2÷3 tháng, tương tự như bia. 3.4.2. Quy trình sản xuất chung a. Quy trình Nước vô trùng Bã Đường Nước Acid thực phẩm Làm lạnh Nguyên liệu Diệt khuẩn CO2 bão hòa Bã Men giống 5%V 65 0C, 35 – 45 phút T0 = 5 – 6 0C T0 lm = 28 - 30 0C pH = 5,4 - 5,8 Chai Sản phẩm Xử lý nguyên liệu Ép lấy nước cốt Bổ sung Pha loãng Lên men Làm lạnh Phối chế Lọc Chiết rót Thanh trùng Kiểm tra Dán nhãn Lọc Đun nóng Hình 3.5: Quy trình sản xuất nước quả lên men b. Thuyết minh quy trình §Nguyên liệu Dứa, cam, chanh, quýt, vải, nhãn, xoài, chôm chôm, mơ… §Xử lý nguyên liệu Đầu tiên là chọn lựa các trái có thể dùng để sản xuất (còn nguyên hay có chút hư hỏng), độ chín kỹ thuật, đạt màu sắc, tươi ngon. Sau đó tiến hành rửa, vừa để làm sạch vừa để phân loại quả dùng được hay bỏ đi… Bóc vỏ quả, có thể dùng nhiệt hoặc hóa chất. §Ép lấy nước cốt Dùng máy ép lọc lấy nước cốt qua sang, đường kính lỗ sang 0,3÷0,8 mm. §Diệt khuẩn Đem nước ép trái cây vào nước nóng 70÷750C để diệt khuẩn bằng độ ấm cao trong 5 phút để tránh ảnh hưởng khi lên men sau này. §Bổ sung Giai đoạn này ta bổ sung sirô đường và CO2 bão hòa vào. Đây là yêu cầu đối với nước giải khát lên men. § Pha loãng Trước khi lên men cần pha loãng dịch để giảm hàm lượng chất khô đến 5÷8% và yêu cầu là sử dụng nước vô khuẩn. §Lên men Men giống ta sử dụng là Saccharomyces minor. Có thể sử dụng kết hợp nấm men này với vi khuẩn lactic để có độ chua ổn định và tăng hương vị của sản phẩm. Tuyệt đối không sử dụng các giống trong sản xuất rượu etylic vì cá giống này có khả năng lên men mạnh, không phù hợp cho yêu cầu nước giải khát. Quá trình lên men tiến hành trong thùng lên men, nhiệt độ khống chế ở 28÷300C, pH = 5,4÷5,8. §Làm lạnh Sau 10h lên men, ta lấy mẫu kiểm tra, nếu nồng độ dịch lên men giảm 1,0÷ 1,2% thì ta làm dịch lên men xuống 100C. Khi đó áp suất trong thùng giảm từ 1,0÷ 1,2at đến 0,4÷0,5at và do lạnh lên CO2 hòa tan vào nước giải khát. Tế bào nấm men lắng xuống, nhờ đó giảm bớt cường độ lên men. Sau 2 giờ khi nhiệt độ giảm xuống 100C, quan sát tháo bớt dịch lên men và tháo sản phẩm ra. Chú ý: rằng tốc độ và nhiệt độ làm lạnh ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng nước giải khát Làm lạnh nhanh và ở nhiệt độ thấp thì nấm men sẽ lắng nhanh, hạn chế cường độ lên men, do đó thành phần nước giải khát ổn định hơn trong thời gian bảo quản, nhất là ở mạng lưới thương nghiệp. Vì vậy, nếu xí nghiệp có điều kiện thì lên làm lạnh ở 5÷60C và có thể sử dụng nước muối để làm lạnh tốt. Nồng độ tế bào nấm men trong nước giải khát phụ thuộc vào tốc độ và nhiệt độ làm lạnh, có thể 15÷25 triệu tế bào/ml. Ngoài ra nhiệt độ bảo quản cũng ảnh hưởng nhiều đến chất lượng nước giải khát. §Điều phối Tùy theo chất lượng của nước giải khát quy định mà ta có thể bổ sung thêm dịch đường, màu, mùi, acid thực phẩm…rồi dùng CO2 sục đều. Hương màu và hương mùi ở đây có thể tự nhiên hay tổng hợp. §Lọc Sau khi điều phối ta lọc lại để cho dịch trong suốt. §Chiết rót Chiết rót vào chai. Chai đựng nước giải khát yêu cầu phải có kích thước xác định, thường dung tích là 650, 500, 330ml. Đậy chai bằng nút sắt tây lót cao su hoặc giấy caton yêu cầu phải kín. Chai phải trong suốt và có màu xanh tối hoặc sẫm vàng. Điều này sẽ hạn chế tác dụng trực tiếp của ánh sáng mặt trời, tránh cho nước giải khát bị đục. Ngoài ra chai phải chịu được áp suất và sự thay đổi nhiệt độ đột ngột. Yêu cầu chung đối với tất cả nước có ga là trước khi chiết rót phải làm lạnh tới nhiệt độ 8÷100C. §Thanh trùng Do trong nước giải khát lên men vẫn còn chứa tế bào nấm men, đó là nguyên nhân làm mất ổn định chất lượng sản phẩm khi bảo quản. Bảo quản lạnh chỉ hạn chế được hoạt động của nấm men nhưng không làm ngừng hoàn toàn được quá trình sinh học xảy ra trong thành phẩm. Vì vậy thanh trùng là biện pháp chung nhất nhằm giữ cho sản phẩm lâu hư hỏng. Tuy nhiên, để vừa tiêu diệt được tế bào nấm men vừa không ảnh hưởng đến mùi vị và chất lượng sản phẩm. Quá trình thực hiện: đầu tiên đun đến 450C, duy trì nhiệt độ này trong 15 phút, sau đó tiếp tục tăng nhiệt độ lên 650C trong 35÷40 phút, sau đó làm lạnh xuống 450C trong 10 phút và làm lạnh dần đến 100C. Đối với nước giải khát đóng chai và thanh trùng như vậy sẽ bảo quản được từ 2÷3 tháng. §Kiểm tra, dán nhãn Đây là khâu loại bỏ các chai không đạt yêu cầu và hoàn chỉnh sản phẩm để có thể tiêu thụ buôn bán trên thị trường. §Chuẩn bị sirô đường Nước, đường và acid thực phẩm ta đem đun nóng. Sử dụng phương pháp đun nóng để tiêu diệt các vi sinh vật có trong đường và trong nước, mặt khác tạo điều kiện tốt để biến saccharose thành glucose. Đường chuyển hóa này sẽ có vị ngọt và dịu hơn làm nước giải khát có chất lượng tốt hơn. §Lọc Nhằn mục đích loại hết các tạp chất cơ học, như rác, đất, cát lẫn vào đường trong quy trình vận chuyển và bảo quản. §Làm lạnh Đến nhiệt độ thấp 4÷100C để hạn chế tổn thất và giữ được hương thơm. Hình 3.6: Nước gừng và nước chanh lên men kefir ( 3.5. Giới thiệu về sản phẩm Kefir d’Uva hay Grape Juice Kefir (nước nho lên men Kefir) 3.5.1. Giới thiệu về nguyên liệu chính: trái nho a. Nguồn gốc và phân bố của cây nho Nho là một trong những cây có nguồn gốc sớm nhất trên trái đất, qua những mẫu hóa thạch của cây và lá nho trong các trầm tích đá phẩn, các nhà khoa học đã đi đến kết luận rằng cây nho có cùng tuổi phát sinh với loài người. Cây nho dại có nguồn gốc ở vùng bắc bán cầu, đặc biệt là vùng có khí hậu ôn đới thuộc Châu Âu, Bắc Mỹ, Trung Mỹ và Tây bắc của Nam Mỹ. Nho được trồng trọt chủ yếu như một cây trồng vào thế kỷ thứ 11-12 sau Công nguyên. Cho đến nay, cây nho đã được trồng trên cả 5 châu lục, ở những vùng có khí hậu phù hợp, đối với vùng có khí hậu ôn đới, cây nho chỉ cho thu hoạch mỗi năm một vụ, trong khi ở các nước có khí hậu nhiệt đới và bán nhiệt đới cây nho có khả năng sinh trưởng liên tục và cho thu hoạch 2,5-3 vụ mỗi năm. Hình 3.7: Một số loại nho. Ở Việt Nam, Hà Nội trồng nho làm cảnh, che bóng mát, quả khá sai có giá trị trang trí nhưng giá trị thực phẩm thấp vì ăn được nhưng vỏ dày, dư vị chát, ít đường, hương vị kém, không sản xuất kinh doanh được. Chỉ có miền Nam mới trồng được nho với quy mô sản xuất kinh doanh, chất lượng tuy chưa phải lý tưởng so với nho ngon ở Bồ Đào Nha, Carlifornia nhưng không thua các trái cây khác. Nho trồng chủ yếu ở Ninh Thuận và Bắc Bình Thuận với diện tích 2.500 - 7.000 ha. Đặc biệt ở vùng Ninh Thuận, cây nho rất có tiền năng, năng suất khá cao, trên một hecta có thể thu được 30 – 40 tấn mỗi năm. b. Đặc điểm và tính chất của trái nho Trái nho mọc thành chùm từ 6 đến 300 quả. Trái nho cấu tạo hình ô van. Trái có màu sắc khác nhau. Khi còn non có màu xanh. Khi lớn và chín, trái có màu xanh, đỏ đậm, tím, tùy thuộc vào đặc điểm của giống. Hình 3.8: Cấu tạo trái nho. Vỏ: thành phần hóa học vỏ nho: nước, cellulose, polyphenol, acid hữu cơ… Pectin: protopectin và pectin Polyphenol: Chất màu: flavoniodes gồm có anthocyanes (đỏ, xanh,…), flavones (vàng)… Chất không màu: phenol monomer (acid phenolic), polyphenol ngưng tụ, tannin. Hạt: chứa vài chất, một vài chất có hại nếu có mặt trong rượu: dầu, acid bay hơi, chất nhựa…,do đó cần thiết là khi nghiền nho không làm vỡ hạt. Thịt trái: nước 75-85%, đường 12-20%, các chất khác (acid, chất chứa N, pectin, vitamin): 5-6%. + Đường: đường lên men (glucose, fructose, sucrose…), không lên men (xylose, arabinose, methylpentose…) + Acid hữu cơ: 90% là acid tartaric và malic, 10% còn lại là acid khác như acid citric, fumaric, oxalic, a.cetonic (puryvic, glutaric, oxaloacetic…), acid phenolic… Các acid này có trong nho dưới dạng tự do hoặc dạng muối: bitartrat kali, tartrat kali, malat kali. Tỷ lệ giữa acid tự do và dạng muối phụ thuộc vào pH. Do đó pH quan trọng trong việc làm rượu vang. + Enzyme: hydrolase, oxydase. + Hợp chất chứa N: 0,3-1 g/l dịch nho, một phần là nitơ ammoniac (10-20%) được đồng hóa bởi nấm men. Phần khác dưới dạng nitơ hữu cơ (acid amin, amid, protein) sẽ tủa một phần khi lên men dưới tác dụng của polyphenol và rượu. + Chất chứa pectin: tồn tại dưới dạng keo và khá bền trong dung dịch nho. + Vitamin: Chứa vitamin C, B1, B2, PP và các chất thơm khác. + Chất khoáng:K là quan trọng nhất, dao động khoảng 0,7-2 g/l dich nho. Trong rượu, hàm lượng K bao giờ cũng nhỏ hơn trong dịch nho, do bị tủa bởi bitartrat kali khi len men kết thúc và khi bảo quản lạnh. Trong nho còn có nhiều chất khoáng khác được thể hiện ở bảng 2.8. Bảng 3.1: Thành phần chất khoáng trong nho. Các chất khoáng g/l Ca 0,075-0,250 Mg 0,05-0,15 Na 0,03-0,3 Fe 0,005-0,012 Bảng 3.2: Thành phần polyphenol trong nho. Thành phần polyphenol mg/kg Anthocyanin 100-400 Flavonol (chủ yếu là rutin). 5-285 Flavanol 0-25 Hydroxycinnamate 2-25 Thành phần hóa học trong nho Bảng 3.3: Thành phần hóa học trong 100g nho. % không ăn được so với cả vỏ 0 Nhiệt lượng (calo) 50 Nước (g) 86 Protein (g) 0,5 Lipit (g) 0,3 Glucid cộng cả cellulose (g) 12,8 Cellulose (g) 0,9 Ca (mg) 9 P (mg) 20 Fe (mg) 0,6 Na (mg) 6 K (mg) 111 Tương đương với carotene Vitamin A (mg) 50 Thiamin B1 (mg) 0,10 Riboflavin B2 (mg) 0,06 Niacin (mg) P 0,2 Acid acosbic (mg) 4 c. Những lợi ích của trái nho: tác dụng chữa bệnh của polyphenol Trước đây, một số nhà khoa học cho rằng sở dĩ rượu vang đỏ có lợi ích cho sức khỏe là do tính chống ôxy hóa của flavonoid. Cũng có ý kiến cho rằng rượu vang có những chất polyphenol nên có lợi ích với tim mạch… Nhưng hiện nay, người ta đã biết chính xác rằng chính hợp chất resveratrol trong lớp vỏ của nho đỏ ( nho xanh không có chất này) đã đem lại những lợi ích nói trên. Resveratrol có tác dụng ngăn hồng cầu kết dính vào nhau, làm giảm nguy cơ hình thành các cục máu đông, tăng cholesterol tốt (HDL) và giảm cholesterol xấu (LDL). Gần đây, các nhà khoa học còn phát hiện thấy ăn nhiều nho đỏ có thể chống được ung thư vì trong quả nho đỏ có chất quercetin bình thường vẫn tiền ẩn không hoạt động, nhưng khi tiếp xúc và bị tác động bởi vi khuẩn trong bộ máy tiêu hóa sẽ biến thành một chất có khả năng chống ung thư. Nhà y học người Mỹ Stoner cũng cho rằng một số hợp chất chiết xuất từ một số loại quả trong đó có nho, có khả năng ngăn chặn tác hại của nhiều loại hóa chất gây ung thư và aflatoxin (loại độc tố do nấm mốc aspergillus flavus tiết ra thường có trong lạc mốc bị coi là có thể gây ung thư gan). Theo dược điền Mỹ, nho có công dụng chữa chứng ăn khó tiêu, sốt, trĩ, táo bón, các bệnh gan, thận. Nước ép nho đỏ vừa ảnh hưởng trực tiếp lên phản ứng đông máu, vừa làm tăng nồng độ các chất chống ôxy hóa và làm giảm các gốc tự do. Resveratrol có khả năng chống ôxy hóa mạnh gấp 7 lần vitamin E. Một nghiên cứu khác cho thấy, nước ép nho đỏ có hoạt tính chống ôxy hóa mạnh gấp 3 lần so với nước ép cà chua, cam, bưởi. Ngoài ra, trong quả nho còn có boron, một chất làm chậm lại hoặc ngăn chặn chứng loãng xương ở phụ nữ mãn kinh, người cao tuổi. d. Một số sản phẩm từ nho Nho là nguồn nguyên liệu sản xuất các thực phẩm có giá trị như rượu nho, nước nho, nho khô, mứt nho,… Đặc biệt nho chế biến rượu vang có giá trị dinh dưỡng cao, có hương thơm và mùi vi đặc trưng. Một só sản phẩm đặc trưng từ nho là: rượu vang nho, rượu cognac, mứt nho, nho compot (hay đồ hộp nho nước đường), nước nho đóng hộp. 3.5.2. Sản phẩm nước nho lên men Kefir a. Nguồn gốc Sản phẩm được bắt nguồn từ nước Pháp. Ở Pháp có truyền thống sản xuất rượu vang rất nổi tiếng, vì ở Pháp nho được trồng ở rất nhiều nơi. Người ta cho lên men nước nho trong thời gian ngắn ( từ 1÷2 tuần) nên sản phẩm có độ cồn rất nhẹ và vị hơi chua (thích hợp cho phụ nữ và người già). Một thương nhân người Nga cũng đem sản phẩm này về nước và pha chế thành một kiểu thức uống khác nhưng hương vị cũng gần giống với sản phẩm ban đầu. Ở Nga, người ta không cấy men vào thức uống thay vào đó, lại cấy hạt Kefir vào. Và thế là cho ra đời một sản phẩm mới, độc đáo hơn vì nó có hương vị khác biệt (đặc biệt là nó có ga nhiều hơn, tạo cảm giác sản khoái khi uống và đã khát hơn). b. Thành phần nguyên liệu gồm: 500ml nước ép nho nguyên chất (có thể chọn các giống tùy thích nhưng với mỗi sản phẩm nên chọn nho cho một màu như: nho tím, nho xanh, nho đỏ…). Đường: có thể chọn đường saccharose, glucose hay fructose… Ở đồ án này chọn đường saccharose tinh luyện màu trắng do nhà máy đường Biên Hòa sản xuất. Hạt giống Kefir: đã được nuôi trong môi trường nước đường để có thể lên men tốt. Acid citric hoặc nước cốt chanh: có tác dụng điều vị, tăng thên vị chua cho sản phẩm. c. Quy trình chế biến (Hình 2.21) Trái nho Bóc vỏ Rửa Bỏ hạt Xay nhuyễn Trộn với nước Lọc Rót vào chai có nắp đậy kín Lên men (ở nhiệt độ phòng, thời gian là 48 giờ) Lọc Kefir Phối chế (điều vị) Men giống Kefir Sản phẩm Hình 3.9: Quy trình chế biến nước nho lên men d. Thuyết minh quy trình Quy trình chế biến sản phẩm gồm 3 quá trình sau: v Quá trình chuẩn bị (sơ chế): Nguyên liệu chính là trái nho: có thể sử dung một hay nhiều loại nho phối hợp với nhau (nho đỏ, nho xanh, nho đen tùy theo mùa). Tuy nhiên để cho sản phẩm có màu đặc trưng thì nên sử dụng một loại nho có màu đặc trưng. Trái nho phải được lựa chọn kỹ: trái chín không bị sâu, không bị dập, cuống nho không héo, trên trái nho không bị nứt vỏ. Sau đó đem nho rửa sạch những cặn bã, bụi bẩn bám trên vỏ, để ráo nước, rồi tiến hành lột vỏ, bỏ hột. Ở công đoạn này cần tuân thủ những quy định vệ sinh nghiêm ngặt vì sản phẩm này sẽ không qua xử lý nhiệt nên có thể nhiễm vi sinh vật có hại. Có hai cách để lấy nước nho: một là có thể ép trực tiếp từ trái nho, hai là xay nhuyễn trái nho. Sau đó lọc ta được nước nho trong (không lẫn thịt nho), cho vào bình có nắp. Thể tích nước nho lấy khoảng 500ml. Phối chế khoảng 100g đường (tương đương 20%). Cho hạt giống Kefir vào bình và đậy nắp kím. v Quá trình lên men Kefir trong môi trường nước nho: Trong quả nho ngoài thành phần đường còn có chứa các acid hữu cơ (như acid tartaric, malic, citric, fumaric, oxalic, a.cetonic…), các polyphenol, các chất màu và các chất thơm. Tất cả những chất đó là nguồn dinh dưỡng rất thích hợp để hệ vi sinh vật có tự nhiên trong hạt Kefir sử dụng để lên men. Dựa vào cơ chế tác dụng, có thể chia quá trình lên men nước nho thành hai giai đoạn: - Giai đoạn lên men rượu được tiến hành bởi nấm men: Nấm men chính thực hiện quá trình lên men rượu này là Saccharomyces và Kloeckera (là hai loài nấm men có mặt tự nhiên trong quả nho), chúng có tính kỵ khí không bắt buộc, có khả năng lên men và hô hấp khác nhau, tạo ra các sản phẩm khác nhau (có ý nghĩa đối với sản phẩm này). Lên men glycerin do saccharose là sự biến dạng của quá trình lên men rượu, và được tạo thành như một sản phẩm phụ với số lượng rất ít. Glycerin sẽ gây ra vị đặc biệt của sản phẩm này. Lên men 2,3-butadiol: là một biến thể của lên men formic điển hình đối với các vi khuẩn đường ruột kỵ khí không bắt buộc.Đó là sự lên men cho nhiều sản phẩm, trong đó có acid formic là sản phẩm phụ điển hình, là một trong những chất thơm trong rượu vang. Lên men lactic. Có hai kiểu lên men lactic: điển hình và dị hình. Trong kiểu lên men lactic điển hình chỉ sinh ra acid lactic (tạo vị chua cho sản phẩm), còn kiểu lên men dị hình hoặc không điển hình thì các sản phẩm cuối cùng là acid lactic, ethanol, acid axetic và CO2 (tạo ra hương vị đặc trưng cho sản phẩm này). Aceton và diacetyl: đều có ảnh hưởng đến chất lượng của rượu vang, mặc dù số lượng của chúng được tạo ra trong rượu vang không lớn lắm: acetoin từ 2,0÷84 mg/l và diacetyl từ 0,1÷1,8 mg/l. Sự có mặt của chúng ảnh hưởng rất lớn đến hương vị của rượu vang nếu ở nồng độ thấp, còn ngược lại ở nồng độ cao sẽ làm biến đổi hóa sinh trong rượu, gây ra mùi vị không tốt cho rượu. Aldehyd và ester: là những hợp chất quan trọng hình thành nên hương vị của loại vang này. Aldehyd gồm: aldehyd acetic, propionic, butyric, valeric… Ester gồm: etylbytyrat, ester của các rượu bậc cao… - Giai đoạn lên men malolactic được thực hiện bởi vi sinh vật lactic. Ở giai đoạn lên men malolactic hay còn gọi là giai đoạn lên men phụ được thực hiện bởi một số vi khuẩn như: Lactobacillus, Pediococcus và Leuconostoc, nhằn tạo ra cho rượu vang những tính chất cảm vị đặc thù. Điểm đặc trưng nhất cùa giai đoạn này là các acid hữu cơ, dưới tác dụng của phức hệ enzyme của vi khuẩn lactic, đã bị biến đổi rất sâu góp phần tạo lên rượu vang. Ví dụ như: acid malic có trong quả nho là thành tố quan trọng nhất, sẽ được chuyển hóa bởi phức hệ enzyme của vi khuẩn thành acid lactic và khí cacbonic theo những đường hướng khác nhau. Trong đó, đường hướng tiêu biểu nhất là đường hướng acid L-malic dưới xúc tác của enzyme malolactic đã được chuyển hóa theo phương trình phản ứng sau: HOOCCH2CHOHCOOH Enzyme malolactic CH3CHOHCOOH + CO2 Cuối giai đoạn này, rượu vang được hình thành, CO2 được bão hòa, các hạt lơ lửng trong rượu vang, các tanat và muối tartrat được lắng xuống làm rượu vang trở lên trong. v Quá trình phối chế thành phẩm sau khi lên men: Có thể thêm đường hoặc không (tùy thuộc độ ngọt của sản phẩm), cho thêm vài giọt acid citric hoặc nước cốt chanh (có tác dụng điều hòa vị chua cho sản phẩm). e. Thành phần dinh dưỡng và lợi ích của sản phẩm: Bảng 3.4: Thành phần dinh dưỡng của sản phẩm nước nho lên men Kefir (khối lượng là 253g) cho năng lượng khoảng 155kcal. Thành phần các chất Khối lượng Nước 84% Protein 0,55% Béo 0,08% Tổng cacbonhydrat 15 Ca 8,69mg% Mg 9,48mg% Na 2,76mg% Fe 0,237mg% P 10,67mg% Vitamin A 20(IU) Vitamin C 0,079mg% Riboflavin 0,039mg% Thiamin 0,027mg% Niacin 0,276mg% 3.6. Nghiên cứu khả năng trung hòa tính gây độc tế bào của các yếu tố ngoại bào B. cereus của kefiran Dòng vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy B. cereus được phân lập từ các vụ ngộ độc thực phẩm được cung cấp bởi Laboratorio Central de Salud Pública, Buenos Aires, Argentina. Dịch gốc được bảo quản ở - 800C trong glycerol như một chất chống đông lạnh. Vi khuẩn được tái hoạt hóa trong 16 h ở 320C trong môi trường BHI broth được bổ sung 0,1% glucose. Sau đó, cấy chuyển dịch vi khuẩn này vào 5 ml môi trường BHI broth có bổ sung 0,1% glucose và ủ ở nhiệt độ 320C trong 16h trong điều kiện lắc. Các tế bào tự do được sử dụng trong nuôi cấy đã thu được sau khi tiến hành ly tâm (900 v/p) và lọc (màng lọc 0,45 μm). pH của dịch được điều chỉnh lên 7,0 bằng NaOH 5N để tránh sự hư hại của tế bào trong môi trường acid. Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy trong PBS. Môi trường BHI broth được sử dụng làm đối chứng. Độ chuẩn của hoạt tính sinh học được xác định ở mỗi thử nghiệm. Phân lập và định lượng kefiran Hạt kefir được xử lý trong nước sôi (tỷ lệ hạt kefir : nước = 1 : 10) trong 3 h bằng cách khuấy gián đoạn. Hỗn hợp này được ly tâm ở 10000 v/p trong 20 phút ở 200C. Polysaccharide trong dịch huyền phù được kết tủa bằng cách thêm 2 thể tích cồn lạnh và được bảo quản ở nhiệt độ - 200C qua đêm. Sau đó, hỗn hợp này được ly tâm ở 10000 v/p trong 20 phút ở nhiệt độ 40C. Các chất kết tủa bị phân hủy trong nước nóng và quy trình kết tủa này được lặp lại hai lần. Chất kết tủa cuối cùng được hòa tan trong nước nóng vô trùng (dung dịch kefiran). Nồng độ polysaccharide được xác định bằng phương pháp anthrone, đo độ hấp thụ ở bước sóng 620 nm và sử dụng dung dịch glucose làm chất chuẩn. Kefiran được pha loãng để sử dụng cho các thử nghiệm tiếp theo Nuôi cấy các tế bào biểu bì ruột ở người Tế bào Caco – 2 được nuôi cấy trong môi trường Dulbecco's modified Eagle's minimum essential (DMEM) chứa glucose với nồng độ 25 mM, bổ sung thêm 15% huyết thanh bào thai bê bị bất hoạt bởi nhiệt, 1% các acid amin không thiết yếu, penicillin (12 UI/ml), streptomycin (12 μg/ml), gentamycin (50 μg/ml) và fungizone (1,25 μg/ml). Để duy trì, các tế bào được cấy chuyển hằng tuần, sử dụng 0,02% trypsin trong Ca2+ và PBS không có Mg2+. Các tế bào một lớp được chuẩn bị trong các đĩa nuôi cấy mô 24 giếng bằng cách cấy 7.104 tế bào/giếng. Thí nghiệm và giữ tế bào được ủ ở nhiệt độ 370C trong điều kiện 5% CO2 – 95% không khí. Môi trường nuôi cấy được thay đổi mỗi 2 ngày. Sự tách rời tế bào Sự tách rời tế bào Caco-2 được đo lường theo nghiên cứu của Minnaard và ctv (2001). Tóm lại, các tế bào được biệt hóa được ủ với các dịch lọc có nồng độ pha loãng khác nhau ở 370C trong 2 h có sự hiện diện của nồng độ kefiran từ 0 – 1000 mg/l. Sau khi ủ, tế bào được rửa với PBS, cố định trong 1 phút với formaldehyde 2% trong PBS và rửa lại. Tiến hành nhuộm bằng cách ủ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng với 500 μl crystal violet. Sau khi rửa bằng PBS để loại bỏ thuốc nhuộm, mẫu được xử lý khoảng 1 h với cồn 50% trong PBS ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 650 nm. Phần trăm tế bào gắn kết được tính toán theo công thức: 100 x (A/Ac), trong đó A là độ hấp thụ của tế bào được xử lý; Ac là độ hấp thụ của tế bào đối chứng không xử lý. Hoạt tính dehydrogenase ở ty thể Tế bào đơn Caco – 2 được ủ với độ pha loãng dịch huyền phù không có sự hiện diện của tế bào B. cereus và không có sự hiện diện kefiran (800 mg/l). Sau khi ủ ở 370C trong 1h, các tế bào được tách rời bằng cách cạo cơ học và ủ với 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium (MTT) trong 4h ở 370C. Thử nghiệm MTT dựa vào khả năng chuyển hóa của MTT thành formazan màu tím, không tan nhờ sự hoạt động của dehydrogenase ty thể. Mẫu được ly tâm ở 14000 v/p và vết màu được chiết với HCl 0,1N trong isopropanol. Sau khi ly tâm, độ hấp thu được đo ở bước sóng 550 nm trong đĩa đọc. Phần trăm hoạt tính duy trì được tính theo công thức: 100 x (A/Ac), trong đó A là độ hấp thụ của tế bào được xử lý; Ac là độ hấp thụ của tế bào đối chứng không xử lý. Đánh dấu với FITC annexin V và propidium iodine Phương pháp này đã được sử dụng bởi van Engeland (1999). Theo đó, sau 1h ủ với dịch nuôi cấy B. cereus và nồng độ kefiran khác nhau, tế bào được rửa 2 lần với buffer gắn. Sau đó, thêm 5 μl FITC – annexin V, 1 μg propidium iodine và 100 μg Rnase trong 100 μl buffer gắn. Tế bào được ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, rửa 3 lần với buffer gắn và được làm tiêu bản trong glycerol 50% trong buffer gắn. Chụp ảnh bằng kính hiển vi huỳnh quang Quét dưới kính hiển vi điện tử Tế bào Caco – 2 được nuôi cấy trên mặt kính phẳng. Sau khi cùng ủ trong 2h với dịch huyền phù không có tế bào B. cereus, có (800 mg/l) hoặc không có kefiran, mẫu được rửa 3 lần bằng PBS và cố định với glutaraldehyde 2,5%. Vết bẩn được khử nước trong các dung dịch ethanol được pha loãng. Cuối cùng, mẫu được làm khô tới hạn bằng cách sử dụng CO2, phủ lớp vàng và được xác định bằng kính hiển vi electron. Thử nghiệm phân giải hemoglobin Khả năng phân giải hồng cầu được quyết định theo Promdonkoy và Ellar (2003). Theo đó, tiến hành pha loãng dịch huyền phù không có tế bào B. cereus và bổ sung tế bào hồng cầu người trong PBS. Dịch này được ủ ở 370C và tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 600 nm ở các thời điểm khác nhau. Ảnh hưởng của kefiran được thử nghiệm ở các nồng độ 0, 500, 800 và 1000 mg/l. Phần trăm hồng cầu không bị ly giải được tính theo công thức % = (A600 mẫu/A600 đối chứng)x100. Độ hấp thu được đo ở bước sóng 600 nm Kết quả Sử dụng dịch huyền phù được thử nghiệm trên tế bào Caco-2 dẫn đến đáp ứng theo liều được chỉ định. Hình 3.10A, hoạt tính sinh học bao gồm tổng sự tách rời tế bào khi nồng độ các yếu tố ngoại bào cao. Không có sự tách rời khi ủ với môi trường BHI hoặc BHI và kefiran. Từ đó nhận thấy rằng kefiran (800 mg/l) có khả năng bảo vệ tế bào hồng cầu khỏi hoạt tính tách rời của dịch huyền phù B. cereus. Hình 3.10B chứng tỏ rằng ảnh hưởng của các nồng độ kefiran khác nhau đến hoạt tính sinh học của các yếu tố ngoại bào B. cereus được pha loãng 1/32. Sự bảo vệ chống lại các hoạt tính sinh học của dịch chiết tương đương với nồng độ kefiran từ 300-1000 mg/l. Thật ra chỉ có 55% tế bào duy trì sự gắn kết khi không có kefiran trong khi giá trị này khoảng 80% khi thử nghiệm tất cả các nồng độ của kefiran. Hình 3.10: Ảnh hưởng của dịch huyền phù B. cereus đối với tế bào biểu bì ruột ở người (Caco – 2) Ảnh hưởng sinh học của các yếu tố ngoại bào B. cereus bao gồm sự suy yếu của hoạt tính dehydrogenase ty thể (hình 3.11). Kefiran cũng bảo vệ chống lại hoạt tính phá hủy tế bào. Thật ra, độ pha loãng dịch huyền phù nuôi cấy sử dụng B. cereus ở nồng độ 1/16 duy trì 50% hoạt tính dehydrogenase ty thể trong khi đến 70% hoạt tính được duy trì khi có sự hiện diện của kefiran. Hình 3.11: Ảnh hưởng của việc sử dụng dịch huyền phù B. cereus B10502 đến hoạt tính dehydrogenase ty thể trên tế bào Caco-2 khi có và không có sự hiên diện của kefiran Tế bào đơn bào Caco – 2 được ủ 1 h với dịch huyền phù B. cereus có tỷ lệ hoại tử cao (hình 3.12A). Trái lại, khi có sự hiện diện của kefiran trong khi ủ, ảnh hưởng hoại tử giảm đi đáng kể và chỉ có một vài tế bào tự hủy (hình 3.12B,C). Nghiên cứu sử dụng kính hiển vi điện tử để quan sát. Bề mặt tế bào hấp thu ở ruột bị thay đổi đáng kể khi ủ với dịch huyền phù B. cereus gồm có sự mất đi và ngắn bớt các lông nhỏ (hình 3.13A). Trái lại, với sự hiện diện của kefiran được duy trì giống như thực nghiệm đối chứng (hình 3.13B,C). Hình 3.12: Đánh giá số lượng tế bào hoại tử và tự chết bằng cách đánh dấu với Annexin V – FITC và propiduin Iodine Kết quả hoạt tính thủy phân hồng cầu của dịch huyền phù có liên quan đến tính độc tế bào. Quá trình thủy phân này thể hiện khi có sự hiện diện hay không có sự hiện diện của kefiran được thể hiện ở hình 3.14. Độ pha loãng dịch huyền phù nuôi cấy có B. cereus cao (1/192) có sự ly giải hồng cầu ở người. Hoạt tính ly giải hầu như biến mất khi bổ sung kefiran ở nồng độ 800 mg/l. Hình 3.13: Kết quả quét dưới kính vi điện tử của tế bào Caco – 2 khi ủ với dịch huyền phù B. cereus khi có (A), không có (B) kefiran, (C) đối chứng Hình 3.14: Kết quả ly giải tế bào hồng cầu ở người theo thời gian của dịch nuôi cấy B. cereus khi có và không có sự hiện diện cửa kefiranChương IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Sữa kefir có giá trị dinh dưỡng cao và tốt cho sức khỏe. Ngoài việc cung cấp các vi sinh vật có lợi, kefir còn có tác dụng chống lão hóa và tăng cường khả năng tiêu hóa, giảm căng thẳng thần kinh, điều hoà huyết áp… Khác với sữa chua thông thường, kefir là sản phẩm vừa lên men lactic nhờ nhóm vi khuẩn lactic ưa ấm, vừa lên men rượu nhờ nấm men. Hệ vi sinh trong hạt kefir gồm : - Nhóm vi khuẩn lactic: Streptococcus lactic gây đông tụ sữa, Streptococcus diacetylatic tạo mùi hương cho sản phẩm, Lactobaccillus casein phân hủy casein của sữa thành acid amin, Lactobacillus helveticus tạo độ chua cho sữa… - Nhóm nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Candida pseudotropicalis, Kluyveroyces…giúp thúc đẩy quá trình lên men. - Nhóm vi khuẩn Acetobacter: đặc trưng nhất là Acetobacter aceti có khả năng đồng hóa đạm hữu cơ và nguồn cacbon như ethanol, glucose, fructose, saccharose, maltose, glycerin, lactose… Trong thành phần của kefir có kefiran, là một thành phần có nhiều ứng dụng và một trong những ứng dụng của kefiran là khả năng trung hòa khả năng gây độc tế bào của B. cereus. 4.2. Kiến nghị Kefir là món quà cuộc sống đươc ban tặng cho con người. Từ xa xưa nó đã được sử dụng và lưu truyền đên bây giờ. Sản phẩm sẽ bổ sung một số lượng lớn vi sinh vật cho cơ thể, giúp cơ thể khỏe mạnh và sống lâu hơn. Vì vậy kefir nên được sử dụng rộng rãi và tìm hiểu kỹ hơn. Vì vậy để nâng cao giá trị dinh dưỡng, đa dạng hóa sản phẩm, cúng như được người tiêu dùng chấp nhận, sản phẩm cần được nghiên cứu thêm: - Nghiên cứu sự phát triển của kefir trên các môi trường khác: dịch quả nguyên chất, sữa đậu nành, sữa dừa,... - Khảo sát thời gian thời gian khuấy trộn, nồng độ oxy cung cấp cho quá trình lên men. - Khảo sát thời gian và nhiệt độ ủ lạnh sản phẩm sau lên men để sản phẩm có hương vị đặc trưng và hấp dẫn. - Nghiên cứu bổ sung chất bảo quản thích hợp cho sản phẩm để sử dụng được lâu mà vẫn đảm bảo chất lượng và không độc hại với con người PHỤ LỤC Bảng 4.1: Bảng điểm đánh giá cảm quan sản phẩm sữa Kefir Điểm Mô tả Mùi 5 Sản phẩm có mùi thơm đặc trưng của sữa chua, mùi thơm dịu của dâu Tây hòa hợp với mùi của rượu etylic, dễ chịu. 4 Sản phẩm có mùi thơm nhẹ của sữa chua, mùi thơm dịu của dâu Tây và thoảng mùi rượu etylic, nhưng ít đặc trưng hơn. 3 Mùi thơm của sữa chua và dâu Tây không thể hiện rõ, mùi rượu quá nhẹ hoặc quá nồng, kém hài hòa. 2 Sản phẩm có mùi kém, không có mùi tự nhiên của sữa chua, không có mùi dâu hoặc mùi dâu đã bị biến đổi, mùi acid acetic quá mạnh. 1 Sản phẩm có mùi lạ, không thể nhận biết được mùi của sữa và dâu. 0 Sản phẩm có mùi của quả thối, mùi của sữa hư hỏng, khó ngửi Vị 5 Sản phẩm hài hòa giữa vị ngọt và vị chua dịu của acid lactic, vị nồng nhẹ của cồn và CO2 khá hấp dẫn. 4 Sản phẩm có vị chua ngọt hài hòa nhưng độ cồn hơi cao hoặc hơi thấp, tương đối hấp dẫn. 3 Vị chua ngọt của sản phẩm kém hài hòa, hơi chua hoặc hơi ngọt, cồn quá nhiều hoặc quá ít, không hấp dẫn lắm. 2 Sản phẩm quá chua hoặc không chua, vị ngọt kém, không hòahợp, không phát hiện cồn hoặc cồn quá mạnh, hơi đắng. 1 Sản phẩm có vị lạ, nhạt nhẽo. 0 Vị rất khó chấp nhận, đắng chát, biểu hiện của hư hỏng. Hình thái 5 Sản phẩm đồng nhất, không phân lớp, độ nhớt vừa phải 4 Sản phẩm tương đối đồng nhất, ít lợn cợn 3 Sản phẩm có dấu hiệu tách nước, hoặc độ nhớt hơi cao. 2 Sản phẩm bị phân lớp (lớp nước bên trên, dịch sữa bên dưới đồng nhất) hoặc độ nhớt quá cao. 1 Sản phẩm bị phân 2 lớp rõ rệt, dịch sữa bên dưới không đồng nhất, (có lợn cợn lớn) 0 Sản phẩm bị phân làm nhiều lớp Bảng 4.2: Bảng điểm đánh giá cảm quan sản phẩm nước nho lên men Kefir Điểm Mô tả Độ trong và màu sắc 5 Chất lỏng trong suốt, không vẫn đục và không có vật thể lạ nhỏ. Có màu sắc đặc trưng của nho ( như màu: xanh, đỏ, tím, đen…). 4 Chất lỏng trong suốt, ít có vật thể lạ nhỏ (xác nho còn sót lại). Vẫn còn màu đặc trưng của sản phẩm. 3 Chất lỏng tương đối trong, có xác cặn nhiều hơn, màu hơi khác một ít so với màu đặc trưng của sản phẩm. 2 Chất lỏng hơi đục, có khá nhiều xác cặn nhìn thấy rõ. Mùi khác nhiều so với mùi đặc trưng. 1 Chất lỏng đục, nhiều lắng cặn, có nhiều xác quả to hơn, màu không đặc trưng (chuyển từ màu tươi sang màu ngả thâm đen). 0 Vẫn đục, màu tối xác cặn nổi nhiều trên mặt chất lỏng, sản phẩm bị hư hỏng Mùi 5 Sản phẩm có mùi thơn nồng của rượu vang nhẹ, dễ chịu hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm. 4 Chưa hoàn toàn hòa hợp (mùi rượu etylic cay nồng hơn hoặc ít hơn nên khó nhận rõ). 3 Mùi cay hơi gắt, thoảng mùi phụ khác, ít đặc trưng cho sản phẩm. 2 Mùi rượu quá nồng gắt, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm. 1 Nồng hăng hoặc nồng cay quá gắt, khó ngửi không đặc trưng cho sản phẩm. 0 Có mùi lạ của sản phẩm bị hư hỏng, không ngửi được. Vị 5 Hòa hợp, êm dịu của vị chua của nho lẫn vị cay nồng của rượu etylic, để lại dư vị tốt. Ngoài ra, CO2 tạo cảm giác rất mát, đã khát và khoan khoái sau khi uống. 4 Chưa hòa hợp giữa các vị, dư vị vừa phải, ít đặc trưng. Cảm giác đã khát chưa có do lượng CO2 còn ít. 3 Chưa hòa hợp, hơi gắt và sốc, dư vị yếu, ít đặc trưng. 2 Vị cay quá gắt, xen lẫn vị đắng, thoảng vị lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm. 1 Sốc, có vị lạ khó chịu của sản phẩm bị hư hỏng Bảng 4.3: Một số vi khuẩn lên men lactic (môi trường nước đường) Streptococcus lactic Trực khuẩn rất ngắn, gây lên men chua sữa tự nhiên, yếm khí tùy tiện. Lên men tốt glucose, maltose, lactose, tạo trong môi trường đường 0,8÷1% acid lactic. Nguồn nitơ cho vi khuẩn nay là peptone. Nhiệt độ tối thiểu cho chúng phát triển là 100C, tối ưu là 350C và cao nhất là 450C. Streptococcus cremoris Thường tạo thành một chuỗi dài. Tế bào có kích thước là 0,6÷0,7µ. Lên men glucose và galactose. Phát triển nhiệt độ thấp hơn Streptococcus lactic: tối ưu là 25÷300C, tối đa là 35÷380C. Lactobacterium Vulgaricum Đây là trực khuẩn rất dài, có khả năng lên men glucose và lactose. Nhiệt độ phát triển tối đa là 40÷450C, tối ưu là 200C, có khả năng tạo acid cao (có khả năng tạo 3,7% acid lactic). Bảng 4.4: Một số nấm men (môi trường nước đường) Saccharomyces cerevisae Tế bào hình cầu, hình ôvan hay elip. Khi già chúng thường kết thành vòng và có thể tạo thành màng nổi lên trên dịch men. Lên men đường tốt, tạo thành 18% cồn etylic. Hansenula Giống này tạo thành màng trên các dịch chứa đường. Trên bề mặt nước nho chúng phát triển khá nhanh tạo màng sau 2÷3 ngày và lắng cặn, đồng thời lên men rượu, tích tụ được 2÷3% cồn. Trong dịch Hansenula phát triển và lên men nhẹ, nhưng đồng thời acid hóa đường và rượu (khi môi trường có nồng độ rượu dưới 13%) và đủ oxy. Nó còn oxy hóa đường rượu, acid hữu cơ làm cho pH môi trường chuyển từ acid thành kiềm. Trong quá trình phát triển, Hansenula có thể chuyển hóa đường thành rượu etylic, butyric, amylic, thành các acid acetic, succinic, butyric, các ester bay hơi (đặc biệt là etyl acetate) làm cho dịch lên men có mùi thơm riêng biệt. Kloeckera apiculata Giống men này khi trưởng thành có các hình dáng ovan, elip và dài.Kích thước tế bào không lớn: 3÷4,5*5÷11µm. Loài nấm men này thường có trên quả có đường (trong đó có nho). Nó có đặc điểm sinh sản rất nhanh so với các loài khác (so với men rượu vang nhanh gấp 2 lần) và ở 350C ngừng sinh sản, ở 450C chúng bị chết. Điều này giải thích được ở giai đoạn đầu lên men, nó đóng vai trò chủ yếu.