Đề tài Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Báo cáo môn Công nghệ lên men thực phẩm Đề tài TINH SẠCH ENZYME LACTASE TỪ CANH TRƯỜNG NẤM SỢI GVHD: PGS.TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN Nhóm thực hiện: 1.Trần Thị Nguyệt Minh MSSV: 60701493 2.Nguyễn Hoàng Phong MSSV: 60701792 3.Đoàn Thị Như Quỳnh MSSV: 60702001 4.Bùi Thị Kim Thy MSSV: 60702437 Lớp : HC07TP2 Nhóm: 01-B Tháng 05 năm 2010 Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 2 MỤC LỤC Trang 1. SƠ LƯỢC VỀ ENZYME LACTASE VÀ THU NHẬN ENZYME LACTASE TỪ CANH TRƯỜNG NẤM SỢI ............................................................................................................ 6 2. NGUYÊN LIỆU ............................................................................................................................ 8 2.1 Nguyên liệu chính.................................................................................................................. 8 2.2 Nguyên liệu phụ..................................................................................................................... 8 3. QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ ........................................................................................................ 9 3.1 Sơ đồ khối .............................................................................................................................. 9 3.2 Sơ đồ thiết bi ........................................................................................................................ 10 4. GIẢI THÍCH QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ .......................................................................... 12 4.1 Nghiền .................................................................................................................................. 12 4.2 Trích ly ................................................................................................................................. 14 4.3 Ly tâm .................................................................................................................................. 17 4.4 Siêu loc ................................................................................................................................. 21 4.5 Làm lạnh .............................................................................................................................. 25 4.6 Tủa enzyme .......................................................................................................................... 27 4.7 Ly tâm lạnh .......................................................................................................................... 30 4.8 Hịa tan tủa ........................................................................................................................... 31 4.9 Sắc ký trao đổi ion ............................................................................................................... 32 4.10 Lọc nano ............................................................................................................................... 37 4.11 Sấy thăng hoa ....................................................................................................................... 39 4.12 Phối trộn ............................................................................................................................... 44 4.13 Đĩng gĩi ............................................................................................................................... 45 5. SẢN PHẨM ENZYME LACTASE TỪ CANH TRƯỜNG NẤM SỢI ............................ 46 5.1 Đặc điểm sản phẩm ............................................................................................................. 46 5.2 Yêu cầu về chất lượng sản phẩm ........................................................................................ 47 6. THÀNH TỰU CƠNG NGHỆ .................................................................................................. 48 6.1 Cải tiến giống ....................................................................................................................... 48 6.2 Hồn thiện phương pháp thu nhận, tinh sạch trong quy mơ cơng nghiệp ....................... 48 Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 3 7. TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................................... 49 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1 Các loại màng membrane thường dùng trong siêu lọc …………………….….. 21 Bảng 2 Các thơng số hoạt động của màng …………………….……………………….. 21 Bảng 3 Lượng muối hạt (NH4)2SO4 thêm vào để đạt nồng độ bão hịa cần thiết cho 1lít dung dịch ở 0o C …………………….……… ……………………………. 28 Bảng 4 Tiêu chuẩn vật lý và hĩa học của chế phẩm enzyme ………………………….. 46 Bảng 5 Chỉ tiêu vi sinh của chế phẩm enzyme …………………….…………………… 46 Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 4 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1 Cân bằng vật chất trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật ……………… 7 Hình 2 Sơ đồ khối quy trình tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi Aspergillus niger ……………………………… ………………………………... 8 Hình 3 Sơ đồ thiết bị quy trình tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi Aspergillus niger …………………………… ………………………........... 9 Hình 4 Nguyên lý hoạt động máy nghiền trục ………………………………………... 12 Hình 5 Thiết bị nghiền trục …………………………………………………………… 13 Hình 6 Thiết bị trích ly kiểu vít tải ……………………………………………………... 15 Hình 7 Thiết bị ly tâm liên tục dạng đĩa ……………………………………………….. 19 Hình 8 Thiết bị phân riêng bằng membrane: mơ hình ống …………………………… 23 Hình 9 Thiết bị siêu lọc ………………………………………………………………... 24 Hình 10 Nguyên lý hoạt động thiết bị trao đổi nhiệt ống lồng ống ……………………. 26 Hình 11 Thiết bị trao đổi nhiệt ống lồng ống ……………………………………… 26 Hình 12 Sự phụ thuộc của điện tích protein vào pH của dung dịch ……………………. 33 Hình 13 Thiết bị trao đổi ion ……………………………………………………………. 35 Hình 14 Sơ đồ nguyên lý của thiết bị trao đổi ion ……………………………………... 36 Hình 15 Thiết bị lọc nano ……………………………………………………………….. 37 Hình 16 Các phương pháp gia nhiệt nguyên liệu trong buồng sấy thăng hoa …………. 40 Hình 17 Sơ đồ nguyên lý thiết thiết bị sấy thăng hoa hoạt động tuần hồn …………. 41 Hình 18 Thiết bị sấy thăng hoa ………………………………………………………... 42 Hình 19 Thiết bị trộn ……………………………………………………………………. 44 Hình 20 Sản phẩm chế phẩm enzyme lactase …………………………………………… 45 Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 5 MỞ ĐẦU Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên qui mơ cơng nghiệp. Thực tế đa cĩ hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đa được khai thác và tinh chế cĩ mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn cơng nghiệp và ứng dụng. Chế phẩm enzyme khơng chỉ được ứng dụng trong y học mà cịn được ứng dụng trong nhiều lãnh vực cơng nghiệp khác nhau, trong nơng nghiệp, trong hĩa học… "ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lãnh vực thực tế khơng kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lượng nguyên tử". Theo thời gian, enzym cơng nghiệp ngày càng được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đĩ những enzym ứng dụng nhiều nhất là protease, cellulase, ligase, amylase,… và một số enzym đặc biêt khác đã thu được rất nhiều lợi nhuận từ ngành này.Cơng nghệ enzyme được bắt đầu từ giai đoạn sản xuất chế phẩm thơ kết thúc ở giai đoạn tạo thành chế phẩm tinh khiết.Bắt đầu từ chế phẩm enzyme thơ, người ta tiến hành tinh sạch enzyme bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Khối lượng chế phẩm enzyme sẽ được giảm dần qua từng bước tinh sạch. Chế phẩm enzyme thơ thường chứa những thành phần cơ bản sau: +Nước chiếm khối lượng lớn nhất +Protein khơng cĩ hoạt tính sinh học +Các tạp chất từ mơi trường nuơi cấy +Enzyme Như vậy quá trình tinh sạch enzyme là quá trình loại bỏ ba phần đầu,chỉ thu nhận sản phẩm cuối cùng là enzyme. Việc loại ba thành phần đầu khơng thể thực hiện trong một giai đoạn mà phải thực hiện qua nhiều giai đoạn khác nhau, ở mỗi giai đoạn, ta sẽ loại bỏ được một phần khơng phải là enzyme ra khỏi hỗn hợp. Khi các thành phần khác khơng phải là enzyme được loại dần ra, khối lượng chế phẩm sẽ giảm theo. Nếu enzyme được tinh sạch theo những bước kỹ thuật khác nhau sẽ thu nhận những giá trị quan trọng sau: -Giảm được khối lượng. Trị số này cĩ ý nghĩa cho việc đĩng gĩi bao bì, vận chuyển, sử dụng, bảo quản. -Tăng được hoạt tính enzyme cĩ ý nghĩa rất lớn trong quá trình sử dụng sau này. -Tăng giá trị kinh tế thơng qua giá thành sản phẩm. Trong đề tài này, ta đi vào tìm hiểu quy trình tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi Asperillus niger (canh trường rắn). Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 6 1. SƠ LƯỢC VỀ ENZYME LACTASE VÀ THU NHẬN ENZYME LACTASE TỪ CANH TRƯỜNG NẤM SỢI 1.1 Sơ lược về enzyme lactase Lactase (LCT), là một enzyme thuộc nhĩm β-galactosidase, là một hydrolase glycoside tham gia vào các thủy phân của disaccharide lactose thành galactose và glucose. Lactase là một enzyme cần thiết cho tiêu hĩa ( thủy phân ) đường lactose trong sữa. Thiếu enzyme lactase sẽ dẫn đến hiện tượng cơ thể khơng dung nạp được lactose. Lactase thương mại được sản xuất cĩ thể được chiết xuất từ nấm men như Kluyveromyces fragilis và Kluyveromyces lactis và từ nấm sợi, chẳng hạn như Aspergillus niger và Aspergillus oryzae. Nĩ được sử dụng chủ yếu để phá vỡ lactose trong sữa làm cho sữa thích hợp cho những người khơng dung nạp được lactose. Tuy nhiên, Thực phẩm và Dược Hoa Kỳ (FDA) đã khơng chính thức đánh giá hiệu quả của các sản phẩm này. Lactase cũng được sử dụng trong sản xuất kem. Bởi vì glucose và galactose cĩ độ ngọt cao hơn so với lactose, lactose tạo ra một hương vị dễ chịu hơn. Lactose cũng kết tinh ở nhiệt độ thấp của kem, tuy nhiên, sản phẩm thành phần của nĩ, glucose và galactose, vẫn cịn bị giải thể và đĩng gĩp cho một cấu trúc mịn hơn. Lactase được sử dụng trong việc chuyển đổi whey thành sirup. Các nhà sản xuất kem, sữa chua và mĩn tráng miệng đơng lạnh sử dụng lactase để cải thiện độ mịn, vị ngọt, và khả năng tiêu hĩa, và giảm kích thước tinh thể lactose trong nguyên liệu. Thưc tế cho thấy, phơ mai sản xuất từ sữa đã thủy phân cĩ hiệu suất cao hơn so với phơ mai sản xuất từ sữa bình thường. Đặc tính của enzyme lactase: Các đặc tính của enzyme này phụ thuộc vào nguồn của nĩ. Nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme khác nhau với các loại chế phẩm cụ thể. Cố định của các enzym, phương pháp cố định, và loại chất mang sử dụng cũng cĩ thể ảnh hưởng đến các giá trị này. Nhìn chung, lactase đi từ nấm sợi cĩ pH tối ưu trong khoảng 2,5-4,5, lactase đi từ vi khuẩn và nấm men cĩ pH trung tính tương ứng là 6-7 ; 6,5-7,5. Sự khác nhau về pH tối ưu của lactases làm cho chúng phù hợp với nhiều ứng dụng, ví dụ lactases từ nấm mốc được sử dụng để thủy phân whey acid, trong khi lactase đi từ vi khuẩn và nấm men phù hợp với sữa (pH 6,6) và whey ngọt (pH 6,1) thủy phân. Tuy nhiên,ứng với những cơ chất khác nhau thì pH của enzyme cũng thay đổi như đối với cơ chất o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) là 4,5 và với cơ chất lactose là 4,8. Đối với enzyme lactase thu nhận từ nấm sợi thì pH sẽ dao động trong khoảng từ 3,0-5,0 và khoảng nhiệt độ tối ưu của nĩ cũng dao động từ 50-550C. Về vấn đề ức chế sản phẩm, ví dụ như ức chế bởi galactose, đây là một đặc tính phụ thuộc vào nguồn gốc của lactase. Các enzyme từ Aspergillus niger bị ức chế mạnh mẽ bởi galactose hơn từ Aspergillus oryzae. Sự ức chế này cĩ thể được khắc phục bằng cách thủy phân lactose ở nồng độ thấp bằng cách sử dụng các hệ thống cố định enzyme hoặc bằng cách phục hồi các enzyme thủy phân -sử dụng siêu lọc hàng loạt. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 7 1.2 Quá trình nuơi cấy nấm sợi trên mơi trường rắn Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuơi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme, người ta thường sử dụng mơi trường đặc. Trong trường hợp này, vi sinh vật phát triển trên bề mặt mơi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt mơi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào. Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt mơi trường, cịn các enzyme nội bào nằm trong sinh khối vi sinh vật. Vi sinh vật khơng chỉ phá triển trên bề mặt mơi trường, nơi ngăn cách pha rắn ( mơi trường ) và pha khí ( khơng khí ) mà cịn phát triển trên bề mặt của các hạt mơi trường nằm hẳn trong lịng mơi trường. Mơi trường nuơi cấy vừa cĩ độ xốp cao và vừa phải cĩ độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết mơi trường lại , khơng khí khơng thể xâm nhập vào trong lịng mơi trường, nếu cĩ độ ẩm thấp quá sẽ khơng thuận lợi cho vi sinh vật phát triển. Thơng thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% khối lượng là hợp lý. Quá trình phát triển của nấm mốc trong mơi trường bán rắn khi nuơi bằng phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau: Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuơi cấy. Ở giai đoạn này cĩ những thay đổi sau: -Nhiệt độ tăng rất chậm. -Sợi nấm bắt đầu hình thành và cĩ màu trắng hoặc màu sữa. -Thành phần dinh dưỡng bắt đầu cĩ sự thay đổi. -Khối mơi trường cịn rời rạc. -Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành. Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối khơng được đưa nhiệt độ cao quá 30oC vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ. Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ. Trong giai đoạn này cĩ những thay đổi cơ bản sau: Tồn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt mơi trường trong lịng mơi trường. -Trong giai đoạn này ta cĩ thể hồn tồn nhìn rõ các sợi nấm cĩ màu trắng xám bằng mắt thường. -Mơi trường được kết lại khá chặt -Độ ẩm mơi trường giảm dần -Nhiệt độ mơi trường sẽ tăng nhanh cĩ thể lên tới 40-45oC. -Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hố mạnh của nấm sợi. -Lượng O2 trong khơng khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, nên trong giai đoạn này cần phải được thơng khí mạnh và nhiệt độ cần duy trì trong khoảng 29-30oC là tốt nhất. Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. Ở giai đoạn này cĩ một số thay đổi cơ bản như sau: -Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đĩ mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. -Nhiệt độ của khối mơi trường giảm.Trong giai đoạn này cần xác định thời điểm kết thúc quá trình nuơi cấy. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 8 1.3 Thu nhận canh trường sau lên men Kết thúc quá trình nuơi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzym, chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzym thơ (vì ngồi thành phần enzym ra, chúng cịn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần mơi trường và nước trong mơi trường). + + + Hình 1– Cân bằng vật chất trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật Canh trường sau lên men (canh trường rắn) của nấm sợi Aspergillus niger chứa:  Sản phẩm trao đổi chất ngoại bào gồm cĩ: +Sản phẩm trao đổi chất bậc I chủ yếu là glucose, ߚ-D-galactose, … +Enzym lactase +Protein phi enzyme  Cơ chất sĩt: chất độn của mơi trường nuơi cấy, lactose, pepton, K2HPO4, MgSO4.7H2O, (NH4)H2PO4, CaCl2,…  Sinh khối nấm sợi Aspergillus niger. Trong những phần tiếp theo bên dưới ta đi vào quy trình tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi Aspergillus niger (canh trường rắn sau lên men) 2. NGUYÊN LIỆU 2.1 Nguyên liệu chính Canh trường sau lên men của nấm sợi Aspergillus niger, canh trường rắn (nuơi cấy bề mặt). 2.2 Nguyên liệu phụ Nước Muối (NH4)2SO4 Chất độn maltodextrin hoặc tinh bột biến tính Các phụ gia khác Cơ chất Giống VSV Sinh khối vi sinh vật Sản phẩm trao đổi chất Cơ chất sĩt Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 9 3. QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ 3.1 Sơ đồ khối Hình 2- Sơ đồ khối quy trình tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi Aspergillus niger Canh trường rắn sau lên men Nghiền thơ Trích ly Ly tâm Siêu loc Làm lạnh Tủa Ly tâm lạnh Hịa tan tủa Sắc ký trao đổi ion Lọc nano Sấy thăng hoa Phối trộn Đĩng gĩi Chế phẩm enzyme lactase Bã Nước Muối (NH4)2SO4 Dung dịch đệm Chất độn, phụ gia Bao bì Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 10 3.2 Sơ đồ thiết bi Hình 3- Sơ đồ thiết bị quy trình tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi Aspergillus niger Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 11 Chú thích: Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 12 4. GIẢI THÍCH QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ 4.1 Nghiền Nghiền là quá trình biến các chất rắn thành những chất nhỏ hơn dưới tác dụng của va đập, nén vỡ, chà xát, chia cắt và các yếu tố khác. Ở đây, ta tiến hành nghiền sơ bộ canh trường nấm mốc sau lên men để trích ly enzyme lactase là enzyme ngoại bào nên chỉ nghiền sơ bộ, hạn chế sự phá vỡ tế bào nấm sợi và sự hịa tan của các thành phần tạp khác vào trong canh trường sau khi nghiền như protein phi enzyme, oligosaccharide, … (vì nếu cĩ nhiều thành phần tạp lẫn vào canh trường thì việc tinh sạch sẽ càng khĩ khăn và tốn kém chi phí). 4.1.1 Mục đích cơng nghệ: Chuẩn bị: trong quá trình nghiền, kích thước nguyên liệu sẽ giảm, diện tích bề mặt riêng tăng lên; từ đĩ làm tăng hiệu quả truyền khối (tăng tốc độ và hiệu quả trích ly). Do đĩ, quá trình nghiền ở đây cĩ mục đích là chuẩn bị cho quá trình trích ly diễn ra tốt hơn, hiệu quả hơn. 4.1.2 Các biến đổi của nguyên liệu: Vật lý : biến đổi vật lý là biến đổi chủ yếu trong quá trình nghiền, kích thước nguyên liệu sẽ giảm, diện tích bề mặt riêng tăng lên. Các biến đổi hĩa học, hĩa lý và hĩa sinh : khơng đáng kể (Do nghiền ở nhiệt độ phịng và nhiệt độ của nguyên liệu khơng tăng nhiều trong quá trình nghiền). Sinh học: khi nghiền vật liệu, dưới tác dụng của lực cơ học, vi sinh vật cĩ thể bị tiêu diệt một phần, nhưng mức độ khơng đáng kể. Sau khi nghiền, diện tích bề mặt tăng lên, mật độ vi sinh vật tăng lên. Các thành phần dinh dưỡng giải phĩng một phần, cĩ thể làm vi sinh vật phát triển mạnh hơn. 4.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng: + Cấu trúc nguyên liệu: yếu tố này quyết định đến lực cơ học tác động lên nguyên liệu. Ở đây với nguyên liệu là canh trường rắn ta chọn lực tác dụng là lực nén. + Độ cứng nguyên liệu: ảnh hưởng đến thơng số của máy nghiền về cơng suất và tốc độ quay của máy nghiền. + Kích thước nguyên liệu: là yếu tố đầu tiên để tính tốn, lựa chọn thiết bị nghiền. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 13 4.1.4 Thơng số quá trình: +Lực tác dụng lên nguyên liệu: hiệu chỉnh tùy thuộc vào cấu tạo và loại thiết bị. +Kích thước hạt đầu ra: 5-7 mm +Nhiệt độ: 25oC 4.1.5 Thiết bị Việc chọn máy nghiền phụ thuộc vào đặc tính của vật liệu nghiền, vào yêu cầu sản phẩm nhận được và vào năng suất sản xuất. Như khi nghiền các chủng nuơi cấy trên bề mặt trên dây chuyền sản xuất enzim khơng cho phép ứng suất cơ học phá huỷ cấu trúc của enzim, khơng cho phép tăng nhiệt độ vật liệu. Độ đồng nhất và mức độ nghiền cĩ ảnh hưởng lớn đến sự thu nhận enzim từ canh trường nấm mốc được nuơi cấy bằng phương pháp bề mặt. Khi trị số của các hạt đạt được từ 5 ÷ 7 mm thì quá trình khuếch tán enzim sẽ là tối ưu. Giảm kích thước của các tiểu phần sẽ làm tăng sức cản thuỷ lực trong các thiết bị khuếch tán. Tăng kích thước các tiểu phần canh trường sẽ làm chậm tốc độ khuếch tán của enzim. Để nghiền canh trường nấm mốc ta cĩ thể chọn một trong các loại máy nghiền sau: máy nghiền búa, nghiền vít, máy tán, nghiền trục, nghiền rung ,… Ở đây, ta chọn máy nghiền trục. Thiết bị cĩ bộ phận chính là hai trục răng. Khi thiết bị hoạt động, hai trục răng sẽ quay ngược chiều nhau,nguyên liệu được nạp từ trên xuống. Dưới tác dụng ép và chà xát làm giảm kích thước nguyên liệu. Sau đĩ, nguyên liệu chui qua trục sẽ được đưa ra ngồi. Tốc độ quay của trục : 180 vịng/phút Hình 4 – Nguyên lý hoạt động máy nghiền trục Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 14 Hình 5 – Thiết bị nghiền trục 4.2 Trích ly Trích ly là quá trình hịa tan chọn lọc một hay nhiều cấu tử cĩ trong mẫu nguyên liệu bằng cách cho nguyên liệu tiếp xúc trực tiếp với dung mơi. Động lực của quá trình trích ly là sự chênh lệch nồng độ của cấu tử ở trong nguyên liệu và ở trong dung mơi. Đây là một quá trình truyền khối. Dung mơi sử dụng: nước. 4.2.1 Mục đích cơng nghệ : Mục đích cơng nghệ ở đây là khai thác (do chiết rút các cấu tử cần thu nhận cĩ trong nguyên liệu ban đầu, làm gia tăng nồng độ của cấu tử cần trích ly). 4.2.2 Các biển đổi của nguyên liệu: +Hĩa lý: đây là quá trình biến đổi quan trọng nhất. Đĩ là sự hịa tan của các cấu tử vào dung mơi. +Vật lý: sự khuếch tán là biến đổi vật lý quan trọng nhất. Sự khuếch tán sẽ làm cho quá trình chiết rút các cấu tử vào dung mơi nhanh và triệt để hơn. Động lực của quá trình khuếch tán là sự chênh lệch nồng độ. +Hĩa học: hầu như khơng đáng kể. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 15 +Hĩa sinh và sinh học: Khi sử dụng dung mơi là nước thì các enzyme sẽ xúc tác cho những phản ứng chuyển hĩa cơ chất. Các yếu tố ảnh hưởng: +Kích thước của nguyên liệu: kích thước nguyên liệu càng nhỏ thì diện tích bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung mơi càng lớn, việc trích ly diễn ra dễ dàng hơn. +Tỉ lệ khối lượng của nguyên liệu và dung mơi: với cùng một lượng nguyên liệu nếu ta tăng lượng dung mơi thì hiệu suất trích ly sẽ tăng theo. +Nhiệt độ trích ly: khi tăng nhiệt độ, các cấu tử sẽ chuyển động nhanh hơn, do đĩ sự hịa tan và khuếch tán của cấu tử vào dung mơi sẽ được tăng cường. +Thời gian trích ly: khi tăng thời gian trích ly thì hiệu suất thu hồi chất chiết sẽ gia tăng. +Tốc độ của dịng dung mơi chảy qua lớp nguyên liệu trong thiết bị trích ly: nếu dịng dung mơi được bơm với tốc độ cao vào thiết bị chứa nguyên liệu thì sẽ làm giảm đi kích thước lớp biên bao bọc xung quanh nguyên liệu, đây là nơi tập trung các cấu tử hịa tan nên tốc độ trích ly sẽ gia tăng. 4.2.3 Thơng số cơng nghệ :  Kích thước của nguyên liệu: 5 ÷ 7 mm thì quá trình khuếch tán enzim sẽ là tối ưu (Giảm kích thước của các tiểu phần sẽ làm tăng sức cản thuỷ lực trong các thiết bị khuếch tán. Tăng kích thước các tiểu phần canh trường sẽ làm chậm tốc độ khuếch tán của enzim, hiệu suất trích ly thấp).  Tỉ lệ khối lượng của nguyên liệu và dung mơi: 1/10.  Nhiệt độ trích ly: 25oC  Thời gian trích ly: 40-60 phút.  Tốc độ của dịng dung mơi chảy qua lớp nguyên liệu trong thiết bị trích ly: phụ thuộc vào hình dạng thiết bị trích ly, kích thước lớp nguyên liệu trong trong thiết bị trích ly.  Canh trường sau trích ly: +Hoạt độ riêng enzym: 3đơn vị hoạt độ/mg protein +Hiệu suất thu hồi:100% 4.2.4 Thiết bị: sử dụng thiết bị trích ly liên tục dạng vít tải Để trích ly enzim, axit amin và các chất khác từ vật liệu rắn trong điều kiện sản xuất lớn, người ta ứng dụng máy trích ly tác động liên tục. Máy trích ly gồm 3 cột- nạp liệu, dỡ liệu kiểu nâng và cột nằm ngang. Bên trong mỗi cột cĩ vít đột lỗ, bộ truyền động điều chỉnh số vịng quay trong giới hạn 0,25 đến 2 vịng/phút nhằm để chọn chế độ trích ly tối ưu. Các cột nạp và tháo liệu gồm những đoạn ống nối nhau cĩ đường kính trong 600 mm. Chiều dài của khoan trích ly 10 000 mm khi tổng chiều dài của cột 12 000 mm. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 16 1. Dẫn động 10. Khung đỡ 2. Khớp nối 11. Nắp 3. Cấu trúc kim loại 12. Vít trung gian 4. Cơ cấu nạp liệu 13. Vít nâng 5. Vít nạp liệu 14. Cơ cấu tháo liệu 6. Vỏ 15. Nắp 7. Điểm nút tựa ổ 16. Gối tựa vít đứng 8. Khớp nối 17. Ngõng trục 9. Dẫn động vít tải Hình 6- Thiết bị trích ly kiểu vít tải Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 17 Bộ nạp liệu kiểu vít tải chuyển pha rắn của canh trường nấm mốc vào phần trên của cột nạp liệu. Vít đột lỗ chuyển tiếp xuống phía dưới và qua phần nằm ngang của cột để vào cột nâng. Canh trường nấm mốc từ cột nạp liệu qua cột chuyển nằm ngang vào cột nâng và sau khi vắt thì thải ra ngồi. Nước dâng lên trong cột nạp liệu được bảo hồ liên tục và sau khi qua bộ lọc ở phần trên của cột nâng thì đưa ra ngồi. Hệ số chứa đầy pha rắn của cột cĩ tính đến sự trương nở của sản phẩm bằng 0,8. Thời gian trích ly 40÷60 phút ở nhiệt độ 25oC. Sử dụng bộ dẫn động điện điều chỉnh cĩ cơng suất 3,2 kW, số vịng quay 1500 ÷150 vịng/ph để quay vít tải. Truyền động quay được thực hiện qua đai truyền và bộ truyền động. Đặc tính kỹ thuật của máy trích ly dạng vít: Năng suất tính theo pha rắn, kg/h 330 Năng suất trích ly, m3/h 0,8 Tỷ lệ giữa phần trích ly và pha rắn tính theo khối lượng chất khơ 5:1 Thể tích hoạt động của phần trích ly, m3 3,4 Thời gian trích ly, phút 40 đến 60 Nhiệt độ của phần trích ly, oC 25 Hệ số chiết, % 95 Cơng suất thiết kế của bộ dẫn động, kW 9,66 Kích thước cơ bản, mm 3940 × 3055 × 12020 Khối lượng, kg 13200 4.3 Ly tâm Ly tâm là quá trình sử dụng lực ly tâm để phân riêng các cấu tử cĩ khối lượng riêng khác nhau. Động lực của quá trình là lực ly tâm và yếu tố khác biệt để phân riêng là khối lượng riêng. Sự khác biệt khối lượng riêng càng lớn thì quá trình phân riêng được thực hiện càng dễ dàng. Dựa vào đối tượng phân riêng, quá trình ly tâm cĩ thể được phân loại như sau : - Ly tâm để phân riêng hai chất lỏng khơng tan vào nhau: hệ nhũ tương nước trong dầu (w/o) hoặc hệ nhũ tương dầu trong nước (o/w) - Ly tâm để phân riêng hệ huyền phù: quá trình thường được sử dụng để làm “ trong ” các huyền phù - cịn gọi là ly tâm lắng - Ly tâm lọc - Ly tâm để tách các cấu tử lơ lửng trong pha khí: quá trình thường được sử dụng để tách bụi từ khơng khí. Ứng dụng trong cơng nghệ enzyme: thu nhận dung dịch enzyme, dung dịch này chứa các enzyme ngoại bào. Phần lớn các enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme hịa tan. Như vậy, khi tiến hành ly tâm, dung dịch được tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzyme thơ. Dung dịch Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 18 enzyme thơ này cịn chứa: enzyme, protein khơng cĩ hoạt tính sinh học, các chất hịa tan khác và nước Ly tâm chỉ tách được phần rắn cĩ tỷ trọng lớn hơn dung dịch. Dịch thu được chỉ là chế phẩm enzyme thơ, nĩ cịn chứa những protein khơng hoạt động và các chất hịa tan khác. 4.3.1 Mục đích cơng nghệ: Khai thác: ly tâm được sử dụng để tách bỏ những tạp chất rắn ra khỏi dung dịch để ta thu được chế phẩm enzyme thơ. 4.3.2 Các biến đổi của nguyên liệu: Chủ yếu là sự tách pha trong quá trình ly tâm ( hệ nguyên liệu tách thành hai pha: pha rắn khơng tan (sẽ được loại bỏ) và pha lỏng chứa các các cấu tử hịa tan như enzyme, protein phi enzyme, đường sĩt, khống …( sẽ được xử lý tiếp theo)). Các biến đổi khác khơng đáng kể. 4.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng: - Độ nhớt pha lỏng: độ nhớt cĩ ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ chuyển động của các cấu tử. khi tác dụng cùng một lực, độ nhớt càng lớn thì tốc độ chuyển động càng chậm. Do đĩ, trong quá trình phân riêng cần chú ý đến độ nhớt của pha liên tục. - Độ chênh lệch khối lượng riêng : Độ chênh lệch khối lượng riêng giữa các cấu tử cần phân riêng càng lớn thì tác dụng của lực ly tâm càng nhiều, quá trình phân riên diễn ra càng dễ. - Nhiệt độ: trong quá trình ly tâm, nếu nhiệt độ của nguyên liệu càng cao, độ nhớt của chất lỏng trong pha liên tục càng giảm, hiệu suất của quá trình phân riêng càng tăng. Tuy nhiên, enzyme rất dễ biến tính ở nhiệt độ cao nên khi nâng cao nhiệt độ cần chọn nhiệt độ thích hợp. - Vận tốc ly tâm: khi vận tốc gĩc càng lớn thì lực ly tâm càng lớn, do đĩ hiệu suất của quá trình phân riêng càng tăng. Tuy nhiên, trong quá trình ly tâm, vận tốc gĩc càng lớn thì yêu cầu về độ bền cơ học của thiết bị càng cao, chi phí đầu tư thiết bị càng lớn, làm giảm hiệu quả kinh tế của quá trình. - Bán kính ly tâm: bán kính ly tâm càng lớn, lực ly tâm càng lớn, hiệu quả phân riêng trong quá trình ly tâm càng cao. - Thời gian lưu: thời gian lưu của các cấu tử trong quá trình ly tâm càng lâu thì hiệu quả của quá trình phân riêng càng cao. Tuy nhiên, thời gian lưu càng dài sẽ giảm năng suất thiết bị. 4.3.4 Thơng số cơng nghệ - Nhiệt độ: 25oC. - Vận tốc ly tâm: thường khoảng 10 000 vịng/phút. - Thời gian ly tâm: phụ thuộc vào kích thước, dung tích của máy. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 19 4.3.5 Thiết bị: tiến hành ly tâm lạnh ( nếu cĩ điều kiện) hoặc tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp để tránh hiện tượng biến tính enzyme. Sử dụng các máy ly tâm liên tục dạng đĩa. Hoạt đơng: Ở đây ta sử dụng máy phân ly tốc độ cao dạng AX-213 thuộc máy phân lý mới nhất và hiện đại. Yếu tố phân chia của nĩ bằng 142000, nhờ đĩ cĩ thể tách các hạt cĩ đường kính đến 0,0005 mm. Năng suất của máy đạt 36 m3/h. Các hạt rắn được phân ly tập trung ở ngoại vi của trống quay - ngồi vùng phân ly - và trong khoảng thời gian 4 ÷ 5 phút thì tháo ra ngồi nhằm tránh sự ngăn cản dịng tiếp theo. Máy phân ly vi khuẩn làm việc liên tục, khơng cần phải ngừng để làm sạch, cĩ hệ thống điều khiển quá trình tháo dỡ các hạt rắn, quá trình rửa khơng cần phải tháo trống quay và hồn tồn được tự động hố. Máy phân ly (hình 7) được lắp đặt trên bệ 13 cĩ bốn chân giảm xĩc 10, đảm bảo tính ổn định và loại trừ dao động của máy khi hoạt động. Bên trong vỏ cĩ trục đứng, trống quay 2 được lắp chặt trên trục hình thành dạng lõi - ống. Các ổ trục trên và dưới được lắp trong các bộ giảm xĩc bằng cao su để loại trừ rung động. Hệ bơi trơn bằng phun dầu tạo sương mù được tiến hành khi trục quay. Trống của máy phân ly vi khuẩn được trang bị các túi 3 để gom pha rắn. Các mặt bên của túi được xếp thành gĩc để hướng các hạt rắn vào các ống xả. Sự bố trí các ống xả theo dọc trục cho phép đảm giữ sự hồn chỉnh tường ngồi của trống, và làm cho nĩ cĩ độ bền cơ học lớn. Sự tồn tại vịng hãm làm cho đường kính nhỏ lại nhằm giảm khối lượng và tăng độ bền thiết bị nhưng cho phép đạt tốc độ cao. Động cơ 12 được lắp trên bệ. Truyền động quay tới trục trống nhờ đai đơn dẹt. Khớp nối từ tính 11 bảo đảm việc mở và dừng trục một cách êm thuận. Máy phân ly vi khuẩn được trang bị bộ hãm bằng thủ cơng để tác động tới tang của thùng chứa dầu đặt ở trong đáy vỏ trục. Nạp huyền phù dịch trích ly vào trống từ trên theo ống tâm cố định 1, rồi qua bộ phân phối để vào bộ đĩa 7, tại đây các hạt rắn được tách ra. Các hạt rắn được bắn xuyên tâm theo hướng tác động của các lực ly tâm và được tháo xuống đĩa, rơi xuống mép đĩa và được đẩy ra khỏi khoảng giữa các đĩa vào ngoại vi đã được phân bố của túi, tại đây các hạt được gom lại. Chất lỏng trong chảy lên miệng trống và được tháo ra nhờ đĩa áp lực 4. Trên đĩa áp lực cĩ vật đệm kín 5. Tiến hành phun gián đoạn các hạt rắn, cứ 4 ÷ 5 phút phun một lần trong khi chất lỏng được nạp liên tục và khơng được ngừng hoạt động. Các ống xả dọc trục 6 được nối với các van. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 20 Trong điều kiện bình thường, các van được đĩng lại nhờ tấm chắn lị xo. Để đẩy các hạt rắn, tấm chắn hạ xuống nhờ thổi đột ngột khơng khí vào trục rỗng của trống. Khi đĩ các van được mở ra và các hạt rắn được tháo vào vịng gom. Các hạt rắn được tháo ra từ vịng gom vào xiclon, sau đĩ được tháo ra ngồi dưới áp suất của lực ly tâm. Ưu điểm: thời gian thu nhận sản phẩm nhanh, liên tục; khơng gây ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme. 1- Ống nạp chất lỏng để làm trong 8- Vỏ trục 2- Trống 9- Bộ tra dầu 3- Các túi để chứa các hạt rắn 10- Bộ giảm xĩc 4- Đĩa áp lực 11- Khớp nối từ tính 5- Vật đệm kín 12- Động cơ 6- Vịi để xả các hạt rắn 13- Bệ máy 7- Các đĩa Hình 7 -Thiết bị ly tâm liên tục dạng đĩa Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 21 4.4 Siêu loc Phân riêng bằng membrane là quá trình tách các cấu tử cĩ phân tử lượng khác nhau nhưng cùng hịa tan trong một pha lỏng hoặc tách các cấu tử rắn cĩ kích thước rất nhỏ ra khỏi pha lỏng hoặc pha khí. Đối với nguyên liệu cần phân riêng dạng lỏng, khi bơm dung dịch nguyên liệu vào thiết bị membrane, một số cấu tử cĩ phân tử lượng nhỏ sẽ đi qua membrane, cịn các cấu tử cĩ phân tử lượng lớn bị giữ lại trên bề mặt membrane. Quá trình phân riêng này cho ta hai dịng sản phẩm: +Dịng sản phẩm đi qua membrane: permeate +Dịng sản phẩm khơng qua membrane: retentate Quá trình phân riêng bằng membrane tương tự quá trình lọc, trong đĩ, membrane đĩng vai trị là vách ngăn để phân riêng các cấu tử. Động lực quá trình phân riêng là sự chênh lệch áp suất ở hai bên bề mặt của membrane và sự chênh lệch áp suất này được tạo ra là nhờ hoạt động của bơm để đưa nguyên liệu vào thiết bị phân riêng. Các mao dẫn trên membrane cĩ kích thước rất nhỏ so với vách ngăn trong quá trình lọc và thiết bị phân riêng bằng membrane luơn hoạt động trong điều kiện kính dưới một áp lực nhất định. Phân loại: Membrane vi lọc với đường kính mao dẫn 0,01-2µm sẽ giữ lại các cấu tử lơ lửng cĩ kích thước rất nhỏ như tế bào vi sinh vật, cịn các cấu tử hịa tan trong dung dịch sẽ đi qua được. Membrane siêu lọc đường kính mao dẫn 0,1-0,01 µm sẽ giữ lại các đại phân tử hịa tan với phân tử lượng thường giao động trong khoảng 2000-300000 Da ( một số protein, dextrin…) Membrane trong lọc nano sẽ tách được các phân tử với phân tử lượng nằm trong khoảng 300-1000Da. Membrane thẩm thấu ngược giữ lại các hợp chất hịa tan trong dung dịch, các phân tử nước cĩ thể đi qua. Vật liệu Những membrane được ứng dụng trong cơng nghiệp hiện nay cĩ nguồn gốc từ nhiều loại vật liệu khác nhau: cellulose acetate, polyamide, polysulfone, ceramic… Giới thiệu màng siêu lọc: Membrane siêu lọc cĩ kích thước lỗ màng 0,01-0,1µm, sẽ giữ lại các đại phân tử hịa tan với phân tử lượng thường giao động trong khoảng 2 000-300 000Da ( một số protein, dextrin…) Màng siêu lọc được cấu tạo bởi các sợi rỗng. Trong mỗi sợi rỗng lại cĩ nhiều sợi rỗng xếp song song và gắn chặt với lớp ngồi tạo thành những lỗ để các chất thấm qua. Các sợi này Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 22 được chế tạo từ các sợi polymer bền như fluoro polimer( FS), cellulose acetate (CA) , polysulphone(GR),… Tùy theo mục đích cụ thể mà người ta sử dụng loại màng thích hợp. Cơ đặc protein: dùng màng FS, GR Cơ đặc enzyme: dùng màng GR Bảng 1-Các loại màng membrane thường dùng trong siêu lọc Loại màng Chất liệu màng Khối lượng phân tử của cấu tử bị giữ lại (Da) CA600PP Cellulose acetate 20 000 GR40PP Polysulphone 100 000 GR51PP Polysulphone 50 000 GR60PP Polysulphone 25 000 GR61PP Polysulphone 20 000 GR70PP Polysulphone 20 000 GR81PP Polyethersulphone 10 000 GR95 Polyethersulphone 2 000 FS40PP Fluoro polymer 100 000 FS61PP Fluoro polymer 20 000 RC70PP Cellulose acetate (thế hệ mới) 10 000 ETNA01PP Composit fluoro polymer 1 000 ETNA10PP Composit fluoro polymer 10 000 Bảng 2- Các thơng số hoạt động của màng Thơng số Màng GR pH Áp suất vào (bar) Nhiệt độ vào ( oc) Áp suất ra (bar) Nhiệt độ ra ( oc) 1-13 1-10 0-75 1-5 0-75 Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 23 Các hiện tượng cần chú ý: Hiện tượng tập trung nồng độ: hiện tượng một số cấu tử trong nguyên liệu sẽ phân bố tập trung lên vùng bề mặt hoạt động của membrane. Nồng độ cấu tử tại vùng bề mặt membrane sẽ cao hơn so với trong mẫu nguyên liệu ban đầu. Hiện tượng này cĩ thể làm giảm lưu lượng dịng permeate. Để hạn chế, cần thực hiện khuấy trộn mẫu trong khoảng khơng gian phía trên bề mặt hoạt động của membrane hoặc gia tăng giá trị áp lực qua membrane. Hiện tượng fouling: hiện tượng tắc nghẽn mao dẫn membrane do một số cấu tử trong nguyên liệu hấp phụ lên bề mặt membrane hoặc tương tác với các thành phần hĩa học của membrane. Hiện tượng này làm giảm lưu lượng dịng permeate. Để khắc phục hiện tượng, dùng một số phương pháp vệ sinh membrane để giải hấp phụ các cấu tử từ vùng bề mặt của membrane hoặc làm yếu đi tương tác giữa membrane và các cấu tử cĩ trong nguyên liệu cần phân riêng. 4.4.1 Mục đích cơng nghệ: Khai thác: loại các chất cĩ phân tử lượng nhỏ hơn các protein enzyme, làm tăng hàm lượng enzyme cần tinh sạch trong dịch enzyme thơ. Chuẩn bị: quá trình lọc gĩp phần cơ đặc được dung dịch enzyme làm cho quá trình tủa bằng dung dịch muối trung tính tiếp diễn ra thuận lợi dễ dàng hơn nên quá trình lọc cĩ mục đích cuẩn bị cho quá trình tủa theo sau. 4.4.2 Các biến đổi của nguyên liệu: +Vật lý: sau quá trình phân riêng dịng permeat và dịng retentate sẽ cĩ một số thay đổi về độ nhớt,tỉ trọng,… +Hĩa học: khơng làm xảy ra các phản ứng hĩa học. +Hĩa lý: hầu như khơng gây ra những biến đổi về pha. +Hĩa sinh và sinh học: quá trình phân riêng bằng membrane khơng làm biến đổi sinh học hay hĩa sinh 4.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc: Nhiệt độ: nhiệt độ phải thích hợp với sản phẩm và loại màng sử dụng. Khi chọn nhiệt độ cần lưu ý đến khả năng kết tủa của protein và sự tăng nhiệt độ trong quá trình siêu lọc vì các yếu tố này cĩ thể làm bít màng. Áp suất: thường tốc độ dịng chảy (số lít chất lỏng chảy qua 1m2 màng trong 1 giờ) sẽ tăng cùng với sự gia tăng áp suất cho đến khi đạt giá trị cực đại. Nếu áp suất tăng cao hơn nữa thì tốc độ dịng chảy sẽ giảm. Những thuận lợi (ưu điểm) của phương pháp siêu lọc: Cĩ thể chọn loại màng thích hợp tùy mục đích cụ thể. Đối với enzyme cĩ thể cơ đặc tới 25 lần mà khơng mất hoạt tính. Quá trình này vừa cơ đặc ,vừa tinh sạch được enzyme (nếu thêm nước vào trong quá trình thực hiện thì độ tinh sạch càng cao) Quá trình siêu lọc cĩ thể thực hiện tốt ngay ở nhiệt độ thấp (5oC) Nhược điểm: Nhiệt độ cao cĩ thể làm mất hoạt tính của enzyme. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 24 4.4.4 Thơng số của quá trình: Tốc độ dịng chảy nên chỉnh từ 4-5 lít/phút, tương ứng với hiệu số PI1 (áp suất dịng vào)- PI2 (áp suất dịng ra) ở trong khoảng 0,5-3 bar. Áp suất dịng vào lớn nhất PI1 lớn nhất 7 bar Áp suất dịng ra nhỏ nhất là 0,5 bar. Nhiệt độ thích hợp để tiến hành là 10-20oC để khơng làm mất hoạt tính enzyme. Ở đây, ta sử dụng màng GR40PP cĩ khả năng giữ lại những phân tử cĩ khối lượng trên 100.000 Da. 4.4.5 Thiết bị: Thiết bị là hai ống hình trụ đồng trục bằng thép khơng rỉ, đường kính khác nhau và được lồng vào nhau. ống hình trụ bên trong cĩ thân được đục lỗ. Một membrane dạng tấm được cuộn trịn lại để tạo thành hình ống và được lồng ép sát vào thành bên trong của ống hình trụ cĩ đường kính nhỏ. Hình 8-Tthiết bị phân riêng bằng membrane: mơ hình ống Hoạt động: Dung dịch nguyên liệu sẽ được bơm vào một đầu bên trong ống hình trụ cĩ đường kính nhỏ. Dịng retentate sẽ thốt ra tại đầu bên kia của ống hình trụ này. Cịn dịng permeate sẽ chui qua các mao dẫn của membrane và thốt ra thành bên ngồi của ống hình trụ nhỏ và theo đường dẫn để ra bên ngồi thiết bị. Để tăng diện tích phân riêng trong thiết bị, người ta cĩ thể lắp đặt một chùm ống hình trụ đường kính nhỏ được quấn membrane bên trong thân rồi được đặt song song nhau và ở bên trong thân của một ống hình trụ đường kính lớn. Chiều cao các ống hình trụ cĩ thể lên tới 10m. Cĩ thể Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 25 chia ống hình trụ lớn thành nhiều khoang, nguyên liệu sẽ được bơm vào trong các khoang này theo nguyên tăc nối tiếp hoặc song song Ưu điểm thiết bị: +Dễ tạo dịng chảy rối nên hạn chế được việc tập trung nồng độ +Vệ sinh, thay thế thiết bị dễ dàng. Nhược điểm: +Thiết bị cồng kềnh, chiếm nhiều diện tích nhà xưởng. +Tốc độ dịng nhập liệu đi vào thiết bị sẽ giảm dần do chiều cao thiết bị quá lớn. Kết quả: ta sẽ thu dịng retentate cĩ chứa các đại phân tử protein khơng đi qua membrane. Hình 9 - Thiết bị siêu lọc 4.5 Làm lạnh Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 26 4.5.1 Mục đích - Chuẩn bị : chuẩn bị cho quá trình tủa enzyme bằng dung dịch muối trung tính diễn ra thuận lợi hơn, tránh hiện tượng protein bị biến tính bất thuận nghịch làm vơ hoạt enzyme cần tinh sạch. 4.5.2 Các biến đổi của nguyên liệu - Vật lý: nhiệt độ của dung dịch enzyme thơ hạ xuống, độ nhớt dung dịch tăng. - Sinh học: ức chế hoạt động của vi sinh vật cĩ trong dung dịch enzyme thơ - Các biến đổi khác: khơng đáng kể. 4.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng - Đặc điểm nguyên liệu: cấu trúc và tính chất, thành phần hĩa học của nguyên liệu sẽ ảnh hưởng đến thời gian làm lạnh, năng lượng tiêu tốn cho quá trình làm lạnh. - Nhiệt độ ban đầu của nguyên liệu: nhiệt độ ban đầu của nguyên liệu càng cao thì năng lượng tiêu tốn cho quá trình làm lạnh càng nhiều. 4.5.4 Thơng số quá trình - Nhiệt độ ban đầu của nguyên liệu : 25oC - Nhiệt độ sau khi làm lạnh :0oC-4oC - Tác nhân làm lạnh : dung dịch ethylenglycol 4.5.5 Thiết bị Sử dụng thiết bị trao đổi nhiệt dạng ống lồng ống, dạng chùm ống hình trụ cùng đường kính đặt song song với nhau trong một ống hình trụ cĩ đường kính lớn. Dung dịch enzyme thơ đi bên trong các ống đường kính nhỏ, tác nhân lạnh đi trong khoảng khơng gian tạo nên bởi mặt ngồi của các ống cĩ đường kính nhỏ và mặt trong của ống cĩ đường kính lớn. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 27 Hình 10 – Nguyên lý hoạt động thiết bị trao đổi nhiệt ống lồng ống Hình 11 –Thiết bị trao đổi nhiệt ống lồng ống 4.6 Tủa enzyme Enzyme là một phức hợp protein cĩ khả năng tạo tủa với một số dung mơi. Dùng dung mơi thích hợp để kết tủa enzyme, thu lấy kết tủa. Kết tủa âm: là sự kết tủa của protein tạp. Kết tủa dương: sự kết tủa của các protein cần thiết. Chính sự phức tạp này mà phương pháp kết tủa bằng dung mơi khĩ thu nhận được protein hồn tồn tinh khiết. Muốn thu nhận được các protein tinh khiết hơn phải sử dụng những phương pháp đặc biệt khác. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 28 Các phương pháp kết tủa: Kết tủa bằng muối Kết tủa bằng dung mơi hữu cơ Kết tủa ở điểm đẳng điện của protein enzyme Ở đây ta sử dụng Phương pháp kết tủa enzyme bằng dung dich muối trung tính: Nguyên lý phương pháp tủa bằng muối (NH4)2SO4: Điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn pH 7, do đĩ, trong điều kiện sinh lý, các phân tử protein cĩ tích điện âm thừa và chính những điện tích âm thừa này đã kết hợp với các đầu mang điện tích dương của phân tử nước hữu cực (ở trong dung dịch protein liên kết với một lượng nước khá lớn) cũng như các ion dương. Sự kết hợp với nước tạo ra một lớp nước bao xung quanh phân tử protein và cản trở sự kết tủa của chúng. Để cĩ thể kết tủa được các protein, điều cần thiết là phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử bằng cách bổ sung vào dung dịch protein các dung mơi hoặc các hĩa chất ưa nước cĩ ái lực với nước mạnh hơn protein để lơi kéo nước ra khỏi phân tử protein đĩ, giúp cho protein tủa xuống. Các dung mơi thường được sử dụng để kết tủa protein là acetone và ethanol, cịn các hĩa chất khác như các muối trung tính ở nồng độ cao cũng cĩ thể kết tủa được enzyme. Ammonium sulfate ((NH4)2SO4 ) là loại muối trung tính cĩ độ hịa tan rất tốt, do đĩ ở dung dịch bão hịa của muối này thì tất cả protein đều kết tủa. Sự kết tủa với tác nhân ammonium sulfate (đặc biệt ở nhiệt độ thấp) là một quá trình thuận nghịch, tủa dễ dàng hịa tan bằng nước và muối cĩ thể được loại bỏ ra khỏi protein bằng cách thẩm tích. 4.6.1 Mục đích cơng nghệ: Khai thác: sử dụng dung dịch muối trung tính ở nồng độ thích hợp để kết tủa protein, tách protein ra khỏi dung dịch enzyme thơ. 4.6.2 Các biến đổi của nguyên liệu: Biến đổi lớn nhất là biến đổi hĩa lý: trong quá trình sẽ cĩ sự chuyển pha, các protein từ trạng thái hịa tan trong dung dịch chuyển sang pha rắn. Biến đổi vật lý: trong quá trình kết tủa, kích thước của các khối tủa sẽ tăng dần. 4.6.3 Các yếu tố ảnh hưởng: Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 29 Nồng độ muối bão hịa sử dụng: theo lý thuyết, nồng độ muối bão hịa càng cao thì sự kết tủa càng nhanh, nhưng trên thực tế, mỗi protein cĩ một nồng độ muối xác định mà tại đĩ hiệu suất của quá trình kết tủa là cao nhất. Thời gian tiếp xúc giữa dung dịch enzyme và tác nhân gây tủa: 4.6.4 Thơng số tiến hành quá trình: Bổ sung muối (dạng hạt) vào dịch chiết enzyme đã được làm lạnh ( 2oC) đến khi đạt nồng độ muối theo yêu cầu và khuấy đều. Nồng độ tối ưu của muối dùng để kết tủa enzyme được xác định trong những thí nghiệm cụ thể. Khoảng tối ưu của nồng độ muối dùng trong kết tủa enzyme khoảng 20- 80%. Người ta thường sử dụng ammonium sulfate tại nồng độ muối bão hịa là 70% . Lượng muối được bổ sung vào để đạt nồng độ bão hịa theo bảng trên. Thời gian : phụ thuộc vào lượng protein trong dung dịch thơ ban đầu. Bảng 3- Lượng muối hạt (NH4)2SO4 thêm vào để đạt nồng độ bão hịa cần thiết cho 1lít dung dịch ở 0o C Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 30 Sau quá trình tủa enzym: +Hoạt độ riêng enzym: 25,3 đơn vị hoạt độ/mg protein +Hiệu suất thu hồi: 84,7% +Độ tinh sạch: 8,43 4.6.5 Thiết bị : thùng hình trụ cĩ cánh khuấy chế tạo bằng thép khơng gỉ. 4.7 Ly tâm lạnh 4.7.1 Mục đích cơng nghệ: Khai thác: ly tâm được sử dụng để tách bỏ những tạp chất ra khỏi hệ để ta thu được enzyme dạng tủa. 4.7.2 Các biến đổi của nguyên liệu: Chủ yếu là sự tách pha trong quá trình ly tâm ( hệ nguyên liệu tách thành hai pha: pha rắn là enzyme dạng tủa (sẽ được xử lý tiếp theo sau) và pha lỏng chứa các các cấu tử hịa tan ( sẽ loại bỏ)). Các biến đổi khác khơng đáng kể. 4.7.3 Các yếu tố ảnh hưởng: - Độ nhớt pha lỏng: độ nhớt cĩ ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ chuyển động của các cấu tử. khi tác dụng cùng một lực, độ nhớt càng lớn thì tốc độ chuyển động càng chậm. Do đĩ, trong quá trình phân riêng cần chú ý đến độ nhớt của pha liên tục. - Độ chênh lệch khối lượng riêng: Độ chênh lệch khối lượng riêng giữa các cấu tử cần phân riêng càng lớn thì tác dụng của lực ly tâm càng nhiều, quá trình phân riên diễn ra càng dễ. - Nhiệt độ: trong quá trình ly tâm, nếu nhiệt độ của nguyên liệu càng cao, độ nhớt của chất lỏng trong pha lien tục càng giảm, hiệu suất của quá trình phân riêng càng tăng. Tuy nhiên, enzyme rất dễ biến tính ở nhiệt độ cao nên khi nâng cao nhiệt độ cần chọn nhiệt độ thích hợp. - Vận tốc ly tâm: khi vận tốc gĩc càng lớn thì lực ly tâm càng lớn, do đĩ hiệu suất của quá trình phân riêng càng tăng. Tuy nhiên, trong quá trình ly tâm, vận tốc gĩc càng lớn thì yêu cầu về độ bền cơ học của thiết bị càng cao, chi phí đầu tư thiết bị càng lớn, làm giảm hiệu quả kinh tế của quá trình. - Bán kính ly tâm: bán kính ly tâm càng lớn, lực ly tâm càng lớn, hiệu quả phân riêng trong quá trình ly tâm càng cao. - Thời gian lưu: thời gian lưu của các cấu tử trong quá trình ly tâm càng lâu thì hiệu quả của quá trình phân riêng càng cao. Tuy nhiên, thời gian lưu càng dài sẽ giảm năng suất thiết bị. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 31 4.7.4 Thơng số cơng nghệ - Nhiệt độ: 40C - Tốc độ: 15000 vịng/phút - Thời gian ly tâm: phụ thuộc vào kích thước thiết bị và lượng nguyên liệu đầu vào. 4.7.5 Thiết bị: tiến hành ly tâm lạnh hoặc tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp để tránh hiện tượng biến tính enzyme.Sử dụng các máy ly tâm liên tục dạng đĩa (như phần 3.3) 4.8 Hịa tan tủa 4.8.1 Mục đích - Chuẩn bị: quá trình hịa tan tủa protein sẽ làm cho protein hịa tan trở lại vào dung dịch, trở lại trạng thái bình thường, dễ dàng thực hiện các phản ứng trao đổi ion hơn, làm cho quá trình trao đổi ion tiếp theo diễn ra thuận lợi hơn, hiệu quả hơn. 4.8.2 Các biến đổi nguyên liệu - Vật lý: sự thay đổi về khối lượng dung dịch, tỉ trọng dung dịch (do bổ sung dung dịch đệm để hịa tan tủa protein) - Hĩa lý: sự biến đổi pha của protein (protein từ dạng tủa chuyển sang dạng hịa tan trong dung dịch) - Các biến đổi khác: khơng đáng kể. 4.8.3 Các yếu tố ảnh hưởng - Dung mơi hịa tan tủa: dung mơi cần chọn phải cùng tính chất với chất kêt tủa ( tức là cùng ưa nước, tan tốt trong nước), pH của dung mơi phải xa điểm đẳng điện của protein cần hịa tan. - Tỉ lệ thể tích giữa dung mơi hịa tan và dung dịch chứa tủa: dung mơi càng nhiều thì càng dễ hịa tan tủa, thời gian ngắn. - Nhiệt độ: nhiệt độ tăng thì khả năng hịa tan tủa càng tăng, tuy nhiên nhiệt độ khơng được quá cao làm biến tính protein cần hịa tan. - Thời gian: tùy thuộc lượng dung mơi sử dụng và lượng tủa trong dung dịch. - Tác động cơ học trong quá trình hịa tan: trong quá trình hịa tan tủa, nếu cĩ tác động khuấy trộn thích hợp sẽ làm tăng khả năng hịa tan tủa, thời gian hịa tan tủa ngắn hơn. 4.8.4 Thơng số quá trình - Sử dụng dung mơi hịa tan tủa là dung dịch đệm sử dụng cho quá trình trao đổi ion (dung dịch đệm ban đầu làm cân bằng cột trao đổi ion) Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 32 - Hịa tan bằng dung dịch đệm sẽ dùng để tiến hành sắc kí với một thể tích bằng thể tích dung dịch enzyme trước khi đem tủa. - Tiến hành ở nhiệt độ phịng (25oC) - Tùy theo lượng tủa mà thời gian ngắn hay dài. 4.8.5 Thiết bị Thiết bị là một thùng hình trụ cĩ cánh khuấy làm bằng thép khơng rỉ. 4.9 Sắc ký trao đổi ion Nguyên lý : Sắc ký trao đổi ion dựa vào sự tương tác giữa điện tích của các protein trong mẫu và các nhĩm tích điện được cố định trên bề mặt trao đổi. Protein được gắn vào các bề mặt nhờ các liên kết tĩnh điện. Sự bền vững của liên kết được xác định bởi trị số điện tích của protein, mà trị số này lại phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ muối (của dung dịch đệm). Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều cĩ mang một điện tích tương ứng với điểm pH đĩ. Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm pH nhất định, ta cĩ thể phân tách hỗn hợp protein. Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương. Cấu tạo của anionit DEAE - cellulose (diethylamino - ethyl - cellulose)  Đây là chất trao đổi anion Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 33 Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE- cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm.  Đây là chất trao đổi cation. Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phĩng thích những protein này, cĩ thể dùng một dung dịch đệm để phản hấp phụ cĩ pH khác hoặc thêm một loại ion khác cĩ lực ion lớn hơn. Khi đĩ, phân tử protein enzyme sẽ bị đẩy ra khỏi chất trao đổi ion. Khi tiến hành phản hấp phụ, thường người ta thêm vào các ion Na+ và Cl- trong NaCl cĩ nồng độ tăng dần theo bậc thang hay theo gradient. Các phân tử protein enzyme nào cĩ điện tích tổng số nhỏ thì sẽ bị đẩy ra trước do lực liên kết với chất trao đổi ion yếu. Cịn những protein enzyme nào cĩ liên kết với ionit lớn hơn thì sẽ bị đẩy ra bằng một lực ion của muối lớn hơn. Như vậy, bằng cách này, chúng ta cĩ thể tách được từng phần các loại protein enzyme. Việc tách từng phần cĩ lựa chọn tốt nhất là khi tăng dần nồng độ các ion thay thế. Nhờ nồng độ ion của muối tăng dần (gradient) người ta cĩ thể rút ra từ cột các loại protein enzyme khác nhau. Cĩ thể thu nhận dịch chiết enzyme protein sau khi qua cột bằng máy thu phân đoạn tự động. Theo thứ tự từng phần dịch thu được, người ta tiến hành định lượng protein theo các phương pháp Lowry hay phương pháp đo quang phổ và xác định hoạt độ của enzyme. Ngồi việc dùng muối NaCl cho các ion Na+ và Cl-, người ta cĩ thể dùng các loại muối khác như KCl, Na3PO4., ta tăng nồng độ ion của pha động (dung dịch rửa giải) (sử dụng gradient , những ion này sẽ thay thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion âm, ta thêm muối natri clorua trong dung dịch tách giải bởi vì ion Cl- sẽ tranh bám vào cột với các protein cĩ điện tích âm, do đĩ, những protein mang điện tích âm được phĩng thích ra ngồi cột lần lượt theo độ lớn về điện tích. Điện tích của protein phụ thuộc vào pH của mơi trường: - Nếu pH lớn hơn pI thì protein tích điện âm - Nếu pH nhỏ hơn pI thì protein tích điện dương - Nếu pH bằng pI thì protein khơng tích điện. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 34 Hình 12 – Sự phụ thuộc của điện tích protein vào pH của dung dịch. Trong trường hợp enzyme lactase cĩ pI = 4,6 nên nếu pH của dung dịch đệm lớn hơn 4,6 thì enzyme sẽ tích điện âm, ngược lại , enzyme sẽ tích điện dương. Độ mạnh của tương tác tĩnh điện giữa enzyme và chất trao đổi phụ thuộc vào sự khác biêt giữa pI của enzyme và pH của dung dịch đệm. Vì thế, enzyme lactase cĩ pI bằng 4.6 sẽ được gắn chặt hơn trên cột trao đổi anion nếu enzyme ở trong dung dịch đệm cĩ pH bằng 8 hơn tại pH bằng 7. Để enzyme cĩ thể gắn được lên nhựa, ít nhất pH phải cách 0,5 hoặc tốt hơn là 1 đơn vị so với pI của nĩ (cao hơn đối với anionit, thấp hơn với cationit). pH cách quá xa sẽ tạo ra sự liên kết quá mạnh với nguy cơ gây biến tính và hiệu suất thấp. 4.9.1 Mục đích cơng nghệ: Khai thác: bằng phương pháp trao đổi ion, ta tách bớt thành phần tạp chất lẫn vào enzyme lactase cần tinh sạch, từ đĩ ta thu được enzyme lactase tinh khiết hơn , nên mục đích của quá trình trao đổi ion là khai thác. 4.9.2 Các biến đổi của nguyên liệu: +Vật lý: Khi ta cho các hạt nhựa trao đổi ion vào trong một dung dịch, chúng sẽ trương nở và gia tăng thể tích. Kèm theo đĩ là sự solvate hĩa xảy ra. Các cấu tử tích điện trong mẫu lỏng sẽ thế chỗ cho các ion trên pha rắn, ngược lại các ion trên pha rắn sẽ dịch chuyển vào mẫu lỏng. Đồng Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 35 thời các phân tử dung mơi và chất tan sẽ dịch chuyển vào bên trong cấu trúc xốp của các hạt nhựa theo nguyên tắc thẩm thấu. +Hĩa học: làm thay đổi thành phần hĩa học của mẫu trước và sau xử lý. +Hĩa lý: một số cấu tử khơng tích điện sẽ bị hấp phụ trong mao dẫn của các hạt nhựa. +Hĩa sinh và sinh học: trao đổi ion khơng làm biến đổi các quá trình hĩa sinh và sinh học. 4.9.3 Các yếu tố ảnh hưởng: +Nhiệt độ: khi tăng nhiệt độ thì sự khuếch tán của các cấu tử trong dung dịch tăng lên. Tuy nhiên, khi nhiệt độ cao cĩ thể gây ra những phản ứng phụ khơng mong muốn đồng thời làm tăng chi phí năng lượng cho quá trình xử lý. Nhiệt độ quá cao cũng cĩ thể làm vơ hoạt enzyme. +Thời gian: đây là một thơng số quan trọng. Nếu thời gian xử lý của mẫu với ionit quá ngắn thì phản ứng trao đổi ion xảy ra khơng hồn tồn. Ở đây ta cần chú ý đến tính chất cân bằng của ionit. 4.9.4 Các thơng số vận hành : - Trong quy trình tinh sạch enzyme lactase ở đây, ta vận hành trao đổi ion với các thơng số như sau: - Enzyme lactase thu nhận từ canh trường nấm sợi Aspergillus niger cĩ pI=4,6. Chọn pH vận hành là pH=7 thì enzyme lactase sẽ tích điện âm. Khi đĩ ta thực hiện trao đổi anion. - Dung dịch đệm sử dụng là đệm phosphate 0,05M cĩ pH=7 - Dung dịch rửa giải là hỗn hợp gồm đệm phosphate 0,05M cĩ pH=7 và dung dịch NaCl 0,5-1M (tỉ lệ thể tích 1:1) - Nhiệt độ : 250C - Thời gian: tùy thuộc vào lượng enzym cĩ trong dung dịch. - Tốc độ pha động: tùy thuộc vào kích thước thiết bị. - Sau quá trình trao đổi ion: +Hoạt độ riêng enzym: 40,7 đơn vị hoạt độ/mg protein +Hiệu suất thu hồi: 54,9% +Độ tinh sạch: 13,57 4.9.5 Thiết bị: Thiết bị cĩ dạng hình trụ đứng, đáy cầu và được chế tạo bằng thép khơng rỉ. Phía trên đáy là tấm lưới đỡ. Người ta sẽ cho các hạt nhựa trao đổi ion lên tấm lưới này. Khi cho ionit tiếp xúc với dung dịch, các hạt nhựa sẽ trương nở. Chiều cao của lớp hạt nhựa trong quá trình hoạt động thường dao động từ 1-2m. ở phía dưới tấm lưới người ta thường cho các chất mang dạng hình Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 36 cầu. Vai trị của các chất mang này là để hạn chế sự xáo trộn của các cấu tử trong dịng ra và để bào tồn gradient nồng độ trong quá trình hoạt động của thiết bị. Dưới cùng tại cửa thốt là một tấm lưới lọc để ngăn cản sự cuốn trơi các hạt nhựa trao đổi ion ra khỏi thiết bị. Ở phía bên trên các hạt nhựa là ống để phân phối mẫu nguyên liệu. Nguyên liệu sẽ được bơm vào thiết bị qua ống phân phối. Tại đây, nguyên liệu sẽ được phân bố đều trên hình trịn của mặt cắt thân trụ rồi chảy xuống bên dưới. Sản phẩm được lấy ra tại cửa đáy . Người ta thường sử dụng quá trình trao đổi ion để gắn cấu tử cần thu nhận lên cột ionit. Như vậy, khi cho mẫu nguyên liệu qua thiết bị trao đổi ion thì sản phậm cần thu nhận sẽ bị giữ lại trên cột. Sau đĩ, người ta dùng một dung dịch đệm cĩ pH hoặc lực ion thích hợp đế tách sản phẩm ra khỏi cột.dung dịch rửa giải cũng sẻ cho vào cột qua bộ phận phân phối rồi di chuyển theo chiều tử trên xuống dưới. Tùy theo bản chất của các ion gắn trên hạt nhựa mà người ta sẽ chọn “dung dịch tái sinh” phù hợp. 1. Tấm lưới đỡ các ionit 6. Cảm biến định mức dịch lỏng trong thiết bị 2. Hạt nhựa trao đổi ion 7. Cửa nạp nguyên liệu cần xử lý 3. Chất mang làm giá đỡ 8. Cửa tháo sản phẩm 4. Lưới lọc 9. Cửa tháo nước vệ sinh (sử dụngchế độ chảy ngược) 5. Ống phân phối nguyên liệu Hình 13 – Sơ đồ nguyên lý của thiết bị trao đổi ion Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 37 Hình 14 – Thiết bị trao đổi ion 4.10 Lọc nano 4.10.1 Mục đích - Khai thác: loại các chất cĩ phân tử lượng nhỏ, kim loại hĩa trị I, loại bớt nước làm tăng hàm lượng enzyme cần tinh sạch trong dung dịch. - Chuẩn bị: quá trình lọc gĩp phần cơ đặc được dung dịch enzyme chuẩn bị cho quá trình sấy. 4.10.2 Các biến đổi của nguyên liệu - Vật lý: sau quá trình phân riêng dịng permeat và dịng retentate sẽ cĩ một số thay đổi về độ nhớt,tỉ trọng,… - Hĩa học: khơng làm xảy ra các phản ứng hĩa học. - Hĩa lý: hầu như khơng gây ra những biến đổi về pha. - Hĩa sinh và sinh học: quá trình phân riêng bằng membrane khơng làm biến đổi sinh học hay hĩa sinh 4.10.3 Các yếu tố ảnh hưởng - Nhiệt độ: nhiệt độ phải thích hợp với sản phẩm và loại màng sử dụng. Khi chọn nhiệt độ cần lưu ý đến khả năng kết tủa của protein và sự tăng nhiệt độ trong quá trình lọc nano vì các yếu tố này cĩ thể làm bít màng. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 38 - Áp suất: thường tốc độ dịng chảy( số lít chất lỏng chảy qua 1m2 màng trong 1 giờ) sẽ tăng cùng với sự gia tăng áp suất cho đến khi đạt giá trị cực đại. Nếu áp suất tăng cao hơn nữa thì tốc độ dịng chảy sẽ giảm. 4.10.4 Thơng số quá trình - Tốc độ dịng chảy: 650-1400 l/h - Áp suất dịng vào lớn nhất PI1 lớn nhất 25 bar - Nhiệt độ thích hợp để tiến hành là 10-20oC để khơng làm mất hoạt tính enzyme. - Ở đây, ta sử dụng màng lọc nano cĩ khả năng giữ lại những phân tử cĩ khối lượng trên 30-1000 Da, kích thước lỗ màng 0,0001-0,001 µm. 4.10.5 Thiết bị Thiết bị là hai ống hình trụ đồng trục bằng thép khơng rỉ, đường kính khác nhau và được lồng vào nhau. ống hình trụ bên trong cĩ thân được đục lỗ. Một membrane dạng tấm được cuộn trịn lại để tạo thành hình ống và được lồng ép sát vào thành bên trong của ống hình trụ cĩ đường kính nhỏ. Dạng thiết bị sử dụng là dạng ống lọc (giống như phần 4.4.5). Hình 15 – Thiết bị lọc nano Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 39 4.11 Sấy thăng hoa Sấy thăng hoa là quá trình tách ẩm từ các sản phẩm bằng phương pháp lạnh đơng và tiếp theo là chuyển đá làm lạnh đơng được tạo thành trong sản phẩm thành hơi khi đun nĩng sản phẩm trong chân khơng. Khi sấy thăng hoa, ẩm chuyển dời trong sản phẩm ở dạng hơi khơng kéo theo nĩ những chất trích ly và những vi sinh vật. Trong sản xuất vi sinh, sấy thăng hoa được ứng dụng cho các vi sinh vật, nấm men, vitamin, kháng sinh, các enzim khơng bền ở nhiệt độ cao. Thường quá trình sấy thăng hoa được bắt đầu từ lúc làm lạnh đơng bề mặt sản phẩm đến nhiệt độ − 20oC đến – 30oC. Tốc độ làm lạnh đơng các vật liệu khơng bền nhiệt ảnh hưởng tới việc bảo quản hoạt động sống của vi sinh vật và độ hoạt hố của các chế phẩm sinh học, vì khi làm lạnh nhanh các sản phẩm tạo nên đá ở bên trong tế bào, xảy ra biến đổi nhanh chĩng thành phần các dung dịch sinh lý bên trong và bên ngồi tế bào và dẫn tới sự phá huỷ và làm chết tế bào. Tất cả các vật liệu sinh học đem sấy thăng hoa cĩ độ ẩm khác nhau, cho nên chúng cĩ những điểm Ơtecti khác nhau, khi đĩ cĩ thể cĩ sự cân bằng đá, pha lỏng và pha hơi. Cho nên đối với các vật liệu vi sinh , tốc độ lạnh đơng của chúng được xác định bằng thực nghiệm. Quá trình thăng hoa xảy ra ở những giá trị áp suất hơi trên bề mặt vật liệu và giá trị nhiệt độ trong các điểm nằm ở dưới điểm ba cân bằng pha của dung mơi (nước). Thường khi sấy thăng hoa các vật liệu vi sinh, áp suất sử dụng 133,3 ÷ 13,3 Pa, và nhiệt độ của vật liệu bắt đầu sấy từ − 20oC đến – 30oC. Khi độ ẩm của sản phẩm bị giảm xuống tối thiểu, nhiệt độ của vật liệu tăng đến + 30oC đến + 40oC. Điều kiện sấy như thế bảo đảm quá trình oxy hố tối thiểu của sản phẩm do hàm lượng oxy khơng đáng kể trong mơi trường khí của phịng sấy. Trong các máy sấy thăng hoa dạng cơng nghiệp, việc nạp nhiệt tới sản phẩm hoặc bằng độ dẫn nhiệt hoặc nhờ các tia hồng ngoại. Quá trình sấy thăng hoa thường gồm 3 giai đoạn: - Giai đoạn 1: lạnh đơng nguyên liệu để chuyển một phần nước trong nguyên liệu sang dạng rắn. - Giai đoạn 2: tạo áp suất chân khơng rồi gia nhiệt nguyên liệu đã lạnh đơng trong buồng sấy để nước thăng hoa. - Giai đoạn 3: do trong giai đoạn lạnh đơng, chúng ta khơng thể chuyển tồn bộ lượng nước trong nguyên liệu sang dạng rắn nên sau giai đoạn sấy thăng hoa là giai đoạn sấy chân khơng để tách thêm một phần ẩm ở dạng lỏng trong nguyên liệu, đảm bảo độ ẩm trong nguyên liệu sau quá trình sấy đạt yêu cầu. 4.11.1 Mục đích cơng nghệ Khai thác: quá trình sấy tách bớt nước ra khỏi nguyên liệu, hàm lượng protein enzyme trong một đơn vị sản phẩm tăng lên . Bảo quản: quá trình sấy làm giảm hoạt độ của nước nên ức chế hoạt động của enzyme cũng như hệ vi sinh vật trong sản phẩm, giúp kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm. 4.11.2 Các biến đổi của nguyên liệu Vật lý : Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 40 - Xuất hiện gradient nhiệt độ trong nguyên liệu. (Trong giai đoạn đầu (giai đoạn làm lạnh đơng) nhiệt độ nguyên liệu cao hơn so với tác nhân làm lạnh. Trong giai đoạn sau (giai đoạn sấy thăng hoa) nhiệt độ của nguyên liệu thấp hơn tác nhân nhiệt) - Các tính chất vật lý của nguyên liệu thay đổi như: khối lượng, tỉ trọng, … Hĩa học: khơng đáng kể Hĩa lý: chủ yếu và quan trọng nhất là sự chuyển pha của nước ( từ pha lỏng sang rắn ( trong giai đoạn lạnh đơng ban đầu) và từ pha rắn sang hơi ( trong giai đoạn bốc hơi thăng hoa lúc sau)) Hĩa sinh và sinh học: khơng đáng kể 4.11.3 Các yếu tố ảnh hưởng Tốc độ lạnh đơng Nhiệt độ gia nhiệt Phương pháp gia nhiệt Diện tích bề mặt nguyên liệu Thành phần hĩa học của nguyên liệu Áp suất trong buồng sấy Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 41 (a) Gia nhiệt bằng phương pháp dẫn nhiêt từ một phía bề mặt nguyên liệu (b) Gia nhiệt bằng phương pháp dẫn nhiêt từ hai phía bề mặt nguyên liệu (c) Gia nhiệt bằng phương pháp bức xạ Hình 16 – Các phương pháp gia nhiệt nguyên liệu trong buồng sấy thăng hoa Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 42 4.11.4 Thơng số cơng nghệ  Nhiệt độ - Giai đoạn lạnh đơng: nhiệt độ bắt đầu <20-25oC, nhiệt độ kết thúc từ -30oC đến -20oC - Giai đoạn sấy thăng hoa: nhiệt bắt đầu từ -30oC đến -20oC, nhiệt độ kết thúc từ -20oC đến 30oC  Phương pháp gia nhiệt: chọn phương pháp gia nhiệt bằng bức xạ ( vì nguyên liệu được gia nhiệt đồng đều hơn và việc thốt hơi nước ra mơi trường xung quanh diễn ra dễ dàng hơn).  Áp suất trong buồng sấy: 27-133 Pa.  Độ ẩm nguyên liệu sau khi sấy: <5% 4.11.5 Thiết bị Các máy sấy thăng hoa hoạt động tuần hồn hay liên tục. Hình 17 chỉ sơ đồ nguyên tắc sấy thăng hoa tác động tuần hồn.Thiết bị này gồm phịng sấy hình trụ kín (nồi thăng hoa) 1, ở trong cĩ giàn ống rỗng 2, vật liệu sấy cho vào đây. Nồi thăng hoa làm việc một cách tuần hồn như một phịng lạnh. Ở chế độ làm lạnh, bơm 5 đẩy tác nhân lạnh ở bên trong ống rỗng 2. 1. Phịng sấy 7. Bộ trao đổi nhiệt 2. Giàn ống rỗng 8. Bơm chân khơng 3. Bộ trao đổi nhiệt 9. Thiết bị làm lạnh 4. Thiết bị làm lạnh 10. Nồi ngưng tụ 5. Bơm 11. Các ống 6. Bơm Hình 17 – Sơ đồ nguyên lý thiết thiết bị sấy thăng hoa hoạt động tuần hồn Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 43 Sự làm lạnh của chất tải nhiệt được tiến hành trong bộ trao đổi nhiệt 3 cĩ đính ruột xoắn, chất làm nguội đi qua đĩ và vào thiết bị làm lạnh 4. Khi nồi thăng hoa làm việc ở chế độ của máy sấy, chất tải nhiệt được đun nĩng trong bộ trao đổi nhiệt 7 và đẩy vào các ống rỗng nhờ bơm 6. Sự ngưng tụ hơi được tạo ra khi sấy trong nồi thăng hoa được tiến hành trong nồi ngưng tụ chống thăng hoa 10. Nĩ là một bộ trao đổi nhiệt, hỗn hợp hơi - khơng khí từ nồi thăng hoa vào khơng gian giữa các ống của bộ trao đổi nhiệt. Chất làm nguội (amoniac, freon) qua các ống 11 của nồi chống thăng hoa vào thiết bị làm lạnh 9. Thường để làm lạnh bề mặt thăng hoa và ngưng tụ, người ta sử dụng máy nén 2 hoặc 3 cấp cĩ khả năng đảm bảo lạnh bề mặt đến nhiệt độ − 60oC đến − 40oC. Các khí chưa ngưng tụ được tách ra khỏi nồi chống thăng hoa bằng bơm chân khơng 8. Hơi ngưng tụ được làm lạnh ở dạng lớp đá trên bề mặt các ống lạnh của nồi chống thăng hoa. Vì trong quá trình làm việc của nồi chống thăng hoa, các ống 11 bị phủ bởi một lớp đá đáng kể, nên cần làm tan băng một cách chu kỳ. Để thực hiện điều đĩ, đẩy nước nĩng từ bộ đun 7 vào các ống 11. Hiện nay người ta bắt đầu sử dụng phổ biến các thiết bị thăng hoa tác động liên tục. Sấy thăng hoa liên tục gồm hai nồi thăng hoa và hai bộ chống thăng hoa, chúng làm việc luân phiên nhau. Năng suất của thiết bị thăng hoa tác động liên tục tính theo độ ẩm bốc hơi lớn hơn 200 kg/h. Thời gian cĩ mặt của sản phẩm trong máy sấy từ 40 đến 110 phút, nhiệt độ cao nhất của sản phẩm cuối quá trình sấy thường nhỏ hơn 27oC. Hình 18 – Thiết bị sấy thăng hoa Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 44 4.12 Phối trộn 4.12.1 Mục đích - Hồn thiện: giúp điều chỉnh hoạt tính enzyme theo yêu cầu, giúp ổn định hoạt tính enzyme, từ đĩ nâng cao chất lượng chế phẩm enzyme. 4.12.2 Các biến đổi của nguyên liệu - Vật lý: làm tăng khối lượng của nguyên liệu đầu vào, thay đổi về tỷ trọng. - Các biến đổi khác khơng đáng kể 4.12.3 Các yếu tố ảnh hưởng - Tính chất nguyên liệu: sự khác biệt về kích thước, tỷ trọng của chất độn và phụ gia trộn vào so với nguyên liệu. Sự khác biệt này càng lớn thì quá trình phối trộn càng khĩ thực hiện. - Nhiệt độ: quá cao sẽ gây biến tính protein làm mất hoạt tính enzyme. 4.12.4 Thơng số quá trình - Ở đây, người ta thường sử dụng chất độn là tinh bột biến tính hoặc maltodextrin cùng với một số phụ gia khác. - Tỉ lệ phối trộn phụ thuộc vào hoạt tính enzyme cần hiệu chỉnh theo yêu cầu sản phẩm. - Nhiệt độ: <30oC 4.12.5 Thiết bị Máy trộn trục vít: cấu tạo gồm một buồng trộn dạng nĩn , bên trong cĩ hai vít tải, vít trung tâm 2 được lắp theo trục của buồng trộn, vít nghiêng 3 được lắp theo cạnh của hình nĩn. Đầu dưới vít trung tâm được nối với ổ trục, đầu trên nối với thanh gạt qua khớp nối. Thanh gạt và các vít tải quay được nhờ các bộ dẫn động lắp trên nắp buồng trộn. Các vít tải quay quanh trục nhờ bộ dẫn động và hộp giảm tốc, cịn thanh gạt quay được nhờ bộ dẫn động qua khớp nối và truyền động trục vít. Nạp nguyên liệu qua khớp nối trên nắp. Tháo sản phẩm qua van tháo liệu ở đáy thiết bị. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 45 1. Thành thiết bị 2. Trục vít trung tâm 3. Trục vít nghiêng 4. Cửa nạp liệu 5. Cửa tháo liệu Hình 19 – Thiết bị trộn 4.13 Đĩng gĩi 4.13.1 Mục đích - Hồn thiện : quá trình bao gĩi giúp sản phẩm dễ vận chuyển, phân phối đến tay người tiêu dùng. Ngồi ra, việc bao gĩi cịn làm tăng giá trị hình thức của sản phẩm. - Bảo quản : ngăn cách sự tiếp xúc của sản phẩm với mơi trường bên ngồi, nên giảm giảm sự hút ẩm, sự nhiễm vi sinh vật , từ đĩ kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm. 4.13.2 Các biến đổi của nguyên liệu - Khơng cĩ biến đổi nào. 4.13.3 Phương pháp thực hiện - Vật liệu bao gĩi: thường sử dụng bao bì nhựa và thủy tinh. - Quá trình bao gĩi được tiến hành liên tục trên và tự động hĩa trên dây chuyền đĩng gĩi. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 46 5. SẢN PHẨM ENZYME LACTASE TỪ CANH TRƯỜNG NẤM SỢI 5.1 Đặc điểm sản phẩm  Lactase thường là dạng bột màu trắng nhạt đến trắng sáng, khơng cĩ mùi vị khác thường và khơng bị nhiễm bẩn.  Cĩ thể hịa tan được trong nước, khơng hịa tan được trong etanol, aceton, isopropyl alcohol.  pH tối ưu nằm trong khoảng từ 3,0 đến 4,0 .  Điểm đẳng điện pI khoảng 4,6.  Nhiệt độ tối ưu từ 350C đến 550C.  Phân loại sản phẩm: chế phẩm enzyme lactase cĩ thể ở dạng bột mịn hoặc dạng viên hay dạng bột được bao bọc bởi vỏ capsule.  Sản phẩm nên được bảo quản trong điêù kiện lạnh khơ từ 4-6oC. Hình 20 – Sản phẩm chế phẩm enzyme lactase Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 47 5.2 Yêu cầu về chất lượng sản phẩm 5.2.1 Chỉ tiêu hĩa lý  Yêu cầu về thành phần: Nguyên liệu thơ dùng để sản xuất chế phẩm enzyme tuân theo GMP (Good Manufacturing Practices) Bảng 4-Tiêu chuẩn vật lý và hĩa học của chế phẩm enzyme Chỉ tiêu Ngưỡng cho phép Chì (mg/kg) ≤ 5 Asen (mg/kg) ≤ 3  Hoạt lực của enzyme lactase được tiêu chuẩn hĩa đến 100 000 ALU/g. 5.2.2 Chỉ tiêu vi sinh Bảng 5-Chỉ tiêu vi sinh của chế phẩm enzyme Chỉ tiêu Hàm lượng cho phép Tổng số vi khuẩn yếm khí cfu/g (ml) ≤ 50.000 Coliform MPN/g (ml) ≤30 E.Coli 25g (ml) Khơng phát hiện Salmonella 25g (ml) Khơng phát hiện 5.2.3 Các yêu cầu khác  An tồn và phù hợp cho người sử dụng, khơng cĩ mùi vị khác thường, khơng bị nhiễm bẩn.  Quy trình sản xuất: quy trình sản xuất phải tuân theo GMP  Bao bì: bao bì sản phẩm phải khơ sạch và kín; đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn vệ sinh.  Dán nhãn: nhãn thương mại phải đầy đủ thơng tin về sản phẩm, tuân theo các quy tắc của nhà nước.  Bảo quản và vận chuyển: - Tránh mưa, nắng và sự nhiễm vi sinh vật. - Khơng nên bảo quản chung với các phụ gia khơng dùng cho thực phẩm. - Tránh các điều kiện bất lợi trong quá trình vận chuyển. Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 48 6. THÀNH TỰU CƠNG NGHỆ 6.1 Cải tiến giống Để tìm thấy một nguồn thay thế nấm sợi người ta tiến hành khảo sát 13 loại nấm sợi khác nhau (Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Rhizopus và Fusarium sp.) được nuơi cấy trong mơi trường sản xuất lactase tại 30 ° C và 150 vịng / phút cho 6 ngày. Kết quả thử nghiệm cho thấy, lactase được tổng hợp từ Trichoderma viride ATCC 32.098 cĩ khả năng hoạt hĩa cao nhất, tiếp theo là Trichoderma harzianum 1.073 D3. Ngồi ra, các nghiên cứu về sự ổn định đã được tiến hành trong khoảng pH 3,0-7,5 ở nhiệt độ từ 20 đến 70 ° C. Kết quả cho thấy rằng, hoạt động của lactase được sản xuất từ T. viride ATCC 32.098 lần trên 90% trong khoảng pH 3,0-7,5 ở nhiệt độ giữa 20 và 60 ° C, và thậm chí 66% ở 70 ° C. Đĩ là kết luận rằng Trichoderma sp.. Đặc biệt là T. viride ATCC 32.098, cĩ thể được sử dụng như là một chất thay thế để sản xuất lactase trong quy mơ cơng nghiệp. Lactase đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu vì nĩ cĩ một ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành cơng nghiệp. Vì enzyme này cĩ thể được sản xuất từ khác nhau các nguồn như vi khuẩn, nấm men và nấm mốc. Lactase thương mại được sản xuất từ cả nấm men, chẳng hạn như Kluyveromyces lactis và Kluyveromyces fragilis, nấm mốc như Aspergillus niger, Aspergillus oryzae... 6.2 Hồn thiện phương pháp thu nhận, tinh sạch trong quy mơ cơng nghiệp Thế kỷ 21, theo các nhà khoa học sẽ phát triển rất mạnh các phương pháp cố định enzyme để tạo ra sản phẩm sạch nhờ các quá trình enzyme. Các loại enzyme cố định hiện đang được sử dụng và thể hiện tính ưu việt của nĩ. Phương pháp cố định enzyme và cố định tế bào sẽ được áp dụng cĩ hiệu quả trong phương pháp tinh sạch enzyme sẽ được hồn thiện hơn với thời gian ngắn hơn và hiệu kinh tế sẽ cao hơn. Đối với lactase các chất mang đã được sử dụng để cố định enzyme là chitin, chitosan, agar… Tinh sạch enzyme lactase từ canh trường nấm sợi 49 7. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Văn Cách- Bùi Thị Hải Hịa- Đặng Thị Thu, Tách,tinh chế và xác định đặc tính của ߚ-galactosidase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 3 , Tuyển tập Hội nghị Hĩa sinh và Sinh học Phân tử phục vụ nơng sinh y học và thực phẩm tồn quốc, trang 298-300. 2. Lê Văn Hồng, Các quá trình và thiết bị cơng nghệ sinh học trong cơng nghiệp, Đại học bách khoa, Đại học Đà Nẵng. 3. Nguyễn Đức Lượng (CB) và cộng sự, Cơng nghệ Enzym, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh, năm 2004, 534 trang. 4. Lê Văn Việt Mẫn (CB)- Lại Quốc Đạt- Nguyễn Thị Hiền- Tơn Nữ Minh Nguyệt- Trần Thị Thu Trà, Cơng nghệ chế biến thực phẩm,Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp.Hồ Chí Minh, năm 2009, 1020 trang. 5. Hafiz Ahmed, Reactions of protein extraction, purification, and characterization, CRC Press LLC, 2005, 390p. 6. Martin Chaplin and Christopher Bucke, Enzyme technology, Cambridge University Press, 1990 ( 7. Y.Tanaka, A.Kagamiishi, A. Kiuchi, J.Biochem, T.Horiuchi, Purification and properties of beta-galactosidae from arpergillus, J.Biochem, Vol 77, No.1, 1975 8. Một số trang web:   niger/116848.html     tin-%20and%20chitosan-based%20materials.pdf   hydrolysis_of_lactose_in_whey_by_immobilized_lactase_of_Aspergillus_oryzae  enzyme-biotechnology/purification-of-enzymes.html  ETRY=0   