Đề tài Tìm hiểu về protein đậu phộng

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐẬU PHỘNG GIỚI THIỆU [1] Lạc, còn được gọi là đậu phộng (danh pháp khoa học: Arachis hypogaea), là một loài cây thực phẩm thuộc họ Đậu có nguồn gốc tại Trung và Nam Mỹ ở các nước Bolivia, Brazil và Peru. Nó là loài cây thân thảo, thân cao từ 3-50 cm. Lá mọc đối, kép hình lông chim với bốn lá chét, kích thước lá chét dài 1-7 cm và rộng 1-3 cm. Hoa dạng hoa đậu điển hình màu vàng có điểm gân đỏ, cuống hoa dài 2-4 cm. Sau khi thụ phấn, quả phát triển thành một dạng quả đậu dài 3-7 cm, chứa 1-4 hạt, và quả thường giấu xuống đất để phát triển. Đậu phộng thường được trồng phổ biến ở Trung Quốc, Ấn Độ, Senegal, Nigeria, Myanmar, Sudan, Mỹ, Argentina và Indonesia. Hình 1.1. Cây đậu phộng CẤU TẠO HẠT [1] Cấu tạo vỏ hạt Vỏ quả dày từ 0.3 – 2mm và gồm có 3 lớp là: vỏ ngoài, vỏ giữa có mô cứng và vỏ trong có mô mềm. Khi quả chín, trên vỏ quả có các đường gân ngang, dọc hình mạng lưới. Quá trình hình thành quả đậu phộng chia làm hai giai đoạn: giai đoạn hình thành vỏ quả và giai đoạn hình thành hạt. Như vậy quả đậu phộng hình thành từ ngoài vào trong, vỏ trước, hạt sau. Hoa nở được 30 ngày thì vỏ quả hình thành xong. Hoa nở được 60 ngày thì hạt hình thành xong. Vỏ quả chiếm 25-28%, vỏ hạt chiếm 3-4% khối lượng quả. 42% lipid 20% cacbohydrate 4% Nitơ 3% Tro 2% chất xơ <1% Các chất khoáng (Ca,Mg,Fe,K) 46% lipid 26% protein 17% cacbohydrate 2% Tro 2% chất xơ <1% Các chất vitamin E, B1, B2, B3, B9, Ca, P, Mg, Zn, Fe, K 60% chất xơ 25% xenlulose 8% nước 6% protein thô 2% tro 1% lipid 35% Nitơ tự do 12% lipid 9% nước 11% tro phôi Lá mầm vỏ quả trong vỏ quả giữa vỏ quả ngoài Vỏ vỏ lụa giữa Hình 1.2.Cấu tạo vỏ hạt đậu phộng Cấu tạo hạt Hạt đậu phộng có nhiều hình dạng khác nhau: tròn, bầu dục… Về màu sắc cũng khác nhau như đỏ tím, đỏ nâu, nâu nhạt… Hạt đậu phộng có 3 bộ phận là vỏ lụa, tử diệp và phôi. Hạt đậu phộng là nguồn thực phẩm vừa cung cấp đạm vừa cung cấp dầu. Khối lượng 1.000 hạt nặng khoảng 400 ÷ 750gram Hình 1.3. Cấu tạo hạt đậu phộng Trong đậu phộng, thành phần hóa học được phân ra làm 4 nhóm hợp chất chính: protein, lipid, các chất tan khác ngoài protein và các chất không tan từ trích ly protein. Protein Protein chiếm khoảng 21-36%, trong đậu phộng có đến 90-95% là hai loại Globulin: Arachin (chiếm 3/4) và Conarachin (chiếm 1/4) hợp thành. Bảng1.1: Thành phần các acid amin trong đậu phộng (tính trên 100g) Thành phần Khối lượng (g) Tryptophan 0,2445 Threonine 0,859 Isoleucine 0,882 Leucine 1,627 Lysine 0,901 Methionine 0,308 Cystine 0,322 Phenylalanine 1,3 Tyrosine 1,02 Valine 1,052 Arginine 3,001 Histidine 0,634 Alanine 0,997 Glycine 1,512 Proline 1,107 Serine 1,236 (Nguồn ạc) Lipid [2] Đậu phộng chứa hàm lượng lipid khá cao (khoảng 35-55%). Acide béo chủ yếu trong đậu phộng là acide oleic. Hàm lượng acide oleic trong đậu phộng cao hơn bắp và đậu nành nhưng ít hơn dầu olive. Đặc biệt dầu phộng có khoảng 7% các acide béo mạch dài C-20 archidic, C-22 behenic, C-24 lignoceric là những acide béo đặc trưng chỉ có chủ yếu trong dầu phộng Bảng 1.2: Thành phần các acide béo có trong đậu phộng Thành phần acide béo Khoảng dao động (%) Trung bình (%) Myristic (C-14:0) <0.1 0.1 Palmitic (C-16:0) 8.3 - 14.0 11.1 Palmitoleic (C-16:1) <0.2 0.2 Magaric (C-17:0) - 0.1 Magaroleic (C-17:1) - 0.1 Stearic (C-18:0) 1.9 - 4.4 2.4 Oleic (C-18:1) 36.4 - 67.1 46.7 Linoleic (C-18:2) 14.0 - 43.0 32.0 Linolenic (C-18:3) <0.1 – Arachidic (C-20:0) 1.1 – 1.7 1.3 Gadoleic (C-20:1) 0.7-1.7 1.6 Behenic (C-22:0) 2.1- 4.4 2.9 Erucic (C-22:1) <0.3 – Lignoceric (C-24:0) 1.1 - 2.2 1.5 Nervonic (C-24:1) <0.3 – (Nguồn: Fats and Oils, Richard D.O Brien) Hàm lượng glyceride trong dầu phộng chiếm khoảng 96% tổng hàm lượng dầu. Các glyceride được cấu tạo nên chủ yếu từ các acide béo như palmitic, oleic và linoleic, 80% glyceride trong dầu phộng được tạo nên từ các acide béo không no. Cacbohydrate Hàm lượng monosaccharide trong đậu phộng khoảng 5%, trong đó D – glucose chiếm 2.9% và D – fructose chiếm 2.1%. Trong khi đó, hàm lượng oligosaccharide chỉ khoảng 3.3%, bao gồm 0.9% sucrose, 1% raffinose, 0.8% stachyose và 0.3% verbascose (E.W. Lusas, 1979). Trong khi đó, polysaccharide trong đậu phộng chủ yếu gồm: tinh bột, glucan, galactoaraban, hemicellulose và cellulose. Bảng 1.3: Thành phần các polysaccharide có trong đậu phộng Polysaccharide Hàm lượng (%)a Cấu trúc Kiểu liên kết Arabinan 0.15 Chưa xác định Chưa xác định Galactoaraban - Mạch thẳng b-1,4- Glucan - Mạch thẳng b-1,4- Glucomannan 0.15 Mạch thẳng b-1,4- Xylan 0.25 Phân nhánh b-1,4- (mạch chính) b-1,2- & 1,3-(mạch nhánh) Phức hợp acideic polysaccharide 1.80 Chưa xác định Chưa xác định a dựa trên khối lượng bột đậu phộng đã tách béo (Nguồn: Journal of the Science of Food and Agriculture1979, 30) ØHemicellulose: gồm hemicellulose A và hemicellulose B (gồm nhiều polysaccharide kết hợp với nhau). Hemicellulose A không tan trong nước và khi phân tích bằng sắc kí sau khi thủy phân thì thu được glucose, arabinose và xylose với tỷ lệ 4 : 0.5 : 0.1 cùng với galacturonic acide ở dạng vết. Trái lại, hemicellulose B tan trong nước và khi thủy phân thu được galacturonic acide, glucose, galactose, arabinose và xylose với tỷ lệ 1 : 4 : 1 : 12 : 6 (N.Tharanathan, 1979). Các polysaccharide chủ yếu hợp thành hemicellulose B. ØGlucomannan: được cấu tạo từ D – glucose và D – mannose với tỷ lệ mol 4 : 1 theo liên kết b - 1,4. Ngoài ra trong glucomannan còn có một lượng nhỏ xylose. Trong đậu phộng, glucomannan thường liên kết với glucan hoặc các phân tử cellulose bị thoái hóa. ØXylan: có cấu tạo mạch nhánh. Mạch chính của xylan là các phân tử D – xylopyranose liên kết với nhau theo liên kết b - 1,4. Tùy thuộc vào giống đậu phộng mà các mạch nhánh của xylan sẽ khác nhau, thường là các phân tử đường khác nhau sẽ liên kết với mạch chính theo liên kết b - 1,2 hoặc b - 1,3. ØArabinan: là những hemicellulose cấu tạo nên từ các phân đoạn pectic acide – araban. Theo phương pháp phân tích methyl hóa, các nhà khoa học cho rằng arabinan có cấu tạo mạch nhánh. Sau khi trích ly béo, hàm lượng carbohydrate trong bột đậu phộng tách béo chiếm khoảng 38%. Trong đó hàm lượng mono và oligosaccharide là 18%, tinh bột là 12.5%, hemicellulose A và B lần lượt là 0.5% và 3.5%, hàm lượng cellulose khoảng 4.5%. Thành phần chủ yếu của oligosaccharide là sucrose 14.55%, raffinose 0.92%, stachyose 1.6% và verbascose 0.42%. Hàm lượng cellulose trong đậu phộng khoảng 3%. Hàm lượng cellulose cao trong bột đậu sau khi tách béo sẽ làm giảm giá trị dinh dưỡng của bột đậu và gây ra những ảnh hưởng xấu trong các quá trình chế biến. Cellulose chủ yếu liên kết với vỏ đậu phộng, do đó việc tách vỏ lụa là bước cần thiết phải thực hiện. Việc tách vỏ lụa sẽ góp phần làm giảm bớt những vấn đề trong quá trình sản xuất PPC/PPI do hàm lượng cellulose quá cao. Từ cấu tạo thành phần polysaccharide trong đậu phộng và bột đậu phộng tách béo ta thấy nếu dùng các loại enzyme carbohydrase như: hemicellulase, celluloase, pectinase, xylanase, glucanase…. hỗ trợ quá trình trích ly protein thì sẽ đạt hiệu quả cao hơn. Vì protein trong đậu phộng tồn tại dưới dạng liên kết với các thành phần khác như cellulose, hemicellulose… do đó enzyme thủy phân, phân cắt các liên kết của phân tử protein với các liên kết khác làm xuất hiện nhiều nhóm ưa nước, tăng khả năng hòa tan của protein. Điều này cũng phù hợp với nghiên cứu của Rudrapatnam N. Tharanathan, Dharmaraj B. Wankhede và Madhava R. Raghavendra Rao. Trích ly protein từ bột đậu phộng tách béo độ thu hồi chỉ 60-70%. Protein chưa được trích ly triệt để còn nằm lại trong phần bã do protein có mối liên kết với carbohydrate (hemicellulose, cellulose…). Khi xử lý bột đậu phộng tách béo với hemicellulase thì hầu như phá vỡ hoàn toàn thành phần pentosan và kết quả là trích ly protein được nhiều hơn 90%. 2.4. Các thành phần khác [19] Acide phytic và muối phytate thường hiện diện trong lá mầm, đóng vai trò là nguồn dự trữ phosphate. Bột đậu phộng sau khi tách béo chứa 1.5 – 1.7% phytate. Nếu những chất này hiện diện trong thực phẩm thì sẽ kết hợp với các cation hóa trị 2 như Ca, Fe, Zn, Mg… và làm giảm giá trị dinh dưỡng của thực phẩm. Mặc dù có những ý kiến lo ngại về sự hấp thụ phytate, nhưng một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng acide phytic đóng vai trò quan trọng trong việc làm giảm hàm lượng glucose trong máu, làm giảm hàm lượng cholesterol cũng như làm giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư (Shahidi, 1997). Tuy nhiên sự hiện diện của acide phytic sẽ gây ra một số vấn đề trong quá trình sản xuất protein từ đậu phộng bởi vì phytate có khả năng tương tác với protein và làm giảm khả năng hòa tan của protein. Phức hợp phytate – protein không hòa tan trong môi trường acide. Ngoài ra, trong đậu phộng còn có một hàm lượng đáng kể các hợp chất phenolic. Các hợp chất phenolic có khả năng tác dụng với protein. Những hợp chất phenolic thường gặp trong đậu phộng là: acide phenolic (caffeic, vanillic, syringic, coumaric) hoặc tannins thường tồn tại dưới dạng tự do, ester hoặc các dạng liên kết khác. Trong 1g bột đậu phộng tách béo, hàm lượng acide phenolic và các hợp chất phenolic khác lần lượt là 1756 – 2033μg và 50 – 120μg. Những chất này sẽ gây ra mùi vị không mong muốn, làm sậm màu, cũng như làm giảm giá trị của các khoáng chất. Phương pháp làm giảm hàm lượng phenolic chủ yếu tập trung vào việc tối thiểu hóa sự tương tác giữa phenolic và protein, sau đó loại phenolic ra khỏi protein do sự khác nhau về khả năng hòa tan cũng như kích thước. Việc trích ly với dung môi có tính acide như acetone làm giảm hàm lượng phenolic hiệu quả nhất. Tuy nhiên phương pháp này sẽ làm biến tính protein cũng như làm giảm khả năng hòa tan của protein. PPI trong phòng thí nghiệm chứa một lượng phenolic trung tính khó nhận thấy 810mg .g-1 và khoảng 1% phytate. Phương pháp trao đổi ion loại ≥ 85% phytate, 92% tổng acide phenolic còn xử lý PPI với than hoạt tính thì loại 82% tổng acide phenolic. Acide p-Coumaric là acide chính của phenolic, chiếm khoảng 40-68% tổng acide phenolic trong tất cả sản phẩm protein đậu phộng. Bảng 1.4: Hàm lượng flavonoid và polyphenol có trong đậu phộng Phân loại Tổng flavonoid (mg CE/g)* Tổng polyphenol (mg CE/g)* Đậu phộng sống 0.01 25.71 ± 0.41 Đậu phộng sống (còn vỏ) 0.05 28.71 ± 1.91 Đậu phộng rang khô (DR) 0.01 27.33 ± 0.83 Đậu phộng rang dầu (OR) 0.01 28.61 ± 1.44 Đậu phộng luộc (còn vỏ) 0.06 36.42 ± 1.39 (*) CE: catechin equivalent – tính theo hàm lượng catechin (Nguồn: Journal of Agriculture and Food Chemistry 2007, 55) Các nguyên tố khoáng chủ yếu có trong đậu phộng là K, P, Mg và Ca. Bảng 1.5: Thành phần các nguyên tố khoáng trong đậu phộng Thành phần Hàm lượng (mg/100g đậu phộng) Ca 51.59 ± 0.32 K 867.52 ± 21.10 Mg 227.97 ± 2.69 P 568.16 ± 7.97 Al 0.11 ± 0.04 B 2.50 ± 0.01 Cu 0.05 ± 0.01 Fe 1.17 ± 0.01 Mn 1.86 ± 0.04 Na 10.26 ± 2.40 Zn 2.99 ± 0.03 (Nguồn: Journal of Agriculture and Food Chemistry 1997) Bảng 1.6: Thành phần các vitamin trong đậu phộng (tính trên 100g) Vitamin Hàm lượng (mg) B1 0,6 B2 0,3 B3 12,9 B5 1,8 B6 0,3 B9 0,246 (Nguồn ạc) THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN [43] Thu hoạch Thời điểm thu hoạch rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng hạt giống. Nên chọn ngày nắng ráo, mặt ruộng khô để thu hoạch. Khi thấy lá trở màu nên nhổ 1 vài bụi để quan sát, nếu thấy 2/3 số trái đã già thì nên thu hoạch ngay. Hiện nay, Việt Nam đã sản xuất thành công máy tuốt lạc. Máy tuốt rất tiện và có thể tuốt củ lạc một cách nhanh chóng. Máy nhẹ nên chỉ cần một người vận hành. Máy dễ lưu động nên có thể trải tung các cây lạc đã tuốt ra khắp mặt ruộng để làm phân xanh. Người nông dân cũng có thể tự chế được, do các vật liệu và bộ phận vốn rất sẵn trong vùng. Chi phí để chế tạo và bảo quản rất thấp. Nhưng cũng có 2 hạn chế chính, đó là máy tuốt sẽ làm bị thương nếu như vô ý khi sử dụng nó và máy cũng không thể làm sạch những củ lạc đã tuốt. Máy tuốt lạc gồm một trống xoay với 4 dây cao su căng ở trong kéo từ bên nọ sang bên kia của trống. Cấu trúc trống có một trục trung tâm được cố định lên một khung bằng gỗ. Khung đó được nối với càng trước của máy kéo hai bánh. Động cơ máy kéo sẽ làm quay trống bằng dây coroa- V. Bảo quản Đậu phộng là loại hạt có chứa nhiều dầu và protein. Trong điều kiện á nhiệt đới sau 18 tháng bảo quản, lượng protein trong hạt bị hao hụt. Nitơ tổng hao hụt 7,5%. Riêng nitơ protein giảm tới 11,5%, nitơ hòa tan giảm 10,5%. Lượng lipit bị hao thất nhiều nhất do quá trình oxy hóa dưới tác dụng của lipase. Ngoài ra trong quá trình bảo quản, hạt đậu phộng còn bị sâu mọt và vi sinh vật phá hoại nghiêm trọng cũng gây ra những tổn thất đáng kể. Ở lớp vỏ quả và hạt đậu phộng để bị nấm mốc phát triển, điển hình là Aspergillus Flavus tiết ra độc tố aflatoxin có hại với người và gia súc. Vì thế cho nên khi bảo quản đậu phộng cần phải hạn chế đến mức thấp nhất sự hô hấp của hạt và những yếu tố thúc đẩy quá trình này, động thời ngăn chặn sự phát triển của sâu mọt và nấm mốc... Muốn vậy phải giữ cho độ ẩm của hạt và trong kho ở mức độ thấp và hạt tránh tiếp xúc với không khí. Ngoài ra kho phải được theo dõi, kiểm tra thường xuyên và xử lý kịp thời khi phát hiện sâu bệnh gây hại. Kho bảo quản cần phải cao ráo, có lớp chống ẩm. Nhiệt độ trong kho bảo quản nên giữ ở 10 - 15°C là tốt. Đậu phộng được đóng trong bao từ 30 - 50 kg bao bì có một lớp Polyetylen, trước lúc đóng bao, nhập kho cần được phơi sấy nhẹ đảm bảo độ ẩm an toàn trong phạm vi 8 – 9%. CHƯƠNG 2: TÍNH CHẤT CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN GIỚI THIỆU VỀ TÍNH CHẤT CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN[5] Tính chất chức năng của protein cũng như tính chất vật lý hay hóa học của protein, nó ảnh hưởng suốt các quá trình chuẩn bị, chế biến, bảo quản và tiêu thụ. Tính chất chức năng của protein được phân loại làm ba phần: thuộc tính hydrate hóa như hòa tan hay giữ nước, thuộc tính bề mặt như nhũ tương hay tạo bọt, và sự tương tác protein-protein là tạo gel. Nó thường là kết quả của nhiều tương tác vật lý, hóa học xuất hiện đồng thời hoặc liên tục trong thực phẩm trong suốt quá trình chế biến và không dễ dàng đo lường được bằng các phương pháp kiểm tra vật lý, hóa học đơn giản. Tính chất chức năng của protein có thể tạo thành từ một protein hoặc một nhóm protein. Thường thì mỗi thực phẩm đòi hỏi protein có nhiều hơn một tính chất chức năng. Do đó, một protein hoặc một nhóm protein cần phải đa chức năng như protein trứng yêu cầu phải tạo bọt và tạo gel, cũng như khả năng nhũ hóa chất béo và giữ nước để tạo thể custard với những thuộc tính chất lượng mong muốn. Thông thường, yêu cầu về một chức năng riêng biệt sẽ thay đổi trong suốt quá trình chuẩn bị và chế biến.Ví dụ như protein cơ giữ nước, tăng độ nhớt và có thể nhũ hóa lipid trong ngô sống một thời gian ngắn ở sản phẩm thịt nhưng cần có khả năng tạo gel giữ nước cao trong lúc gia nhiệt để đạt được những tính chất cảm quan mong muốn đồng thời đạt hiệu suất theo yêu cầu của quá trình. Thuộc tính chức năng của protein chịu ảnh hưởng của quá trình xử lý, nhân tố môi trường cũng như tương tác với các chất khác. Điều kiện môi trường như pH, lực ion, loại muối, hàm ẩm, các chất oxy hóa- khử có khả năng làm thay đổi tính chất chức năng của protein. Bên cạnh đó, tính chất chức năng của protein còn bị ảnh hưởng bởi từng giai đoạn trong suốt quá trình chế biến như gia nhiệt, sấy, cắt gọt, xử lý áp lực và lạnh đông. Tính chất chức năng của protein thường thay đổi trong suốt quá trình bảo quản do sự tương tác vật lý hóa học như sự đông tụ protein, biến tính, hoạt tính enzyme, oxy hóa chất béo, tổn thương tinh thể đá… TÍNH CHẤT CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM[4] Tính chất chức năng của protein Tính kỵ nước Do các gốc kỵ nước của các acide amin trong chuỗi polipeptit của protein hướng ra ngoài các gốc này liên kết với nhau tạo liên kết kỵ nước. Độ kỵ nước có thể giải thích như sau: do các gốc acide amin có chứa các gốc -R không phân cực nên nó không có khả năng tác dụng với nước. Ví dụ chúng ta có các acide amin trong nhóm 7 acide amin không phân cực:. glycine, alanine, valine, proline, methionine, lysine, isoleucine chúng không tác dụng với nước. Tính kỵ nước sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến tính tan của protein. Ví dụ có 7 acide amin liên kết peptit với nhau, trong đó có 3 acide amin không phân cực (kỵ nước) nếu như các acide amin này cùng nằm ở một đầu thì tính tan sẽ giảm so với khi các acide amin này đứng xen kẽ nhau trong liên kết. Hình 2.1. Tính kỵ nước của protein Nguồn: Tính chất dung dịch keo protein Khi hoà tan protein thành dung dịch keo. Các phân tử keo có kích thước lớn, không đi qua màng bán thấm. Hai yếu tố đảm bảo độ bền của dung dịch keo: Sự tích điện cùng dấu của các protein. Lớp vỏ hydrat bao quanh phân tử protein. Loại bỏ hai yếu tố này protein sẽ bị kết tủa. Có 2 dạng kết tủa: kết tủa thuận nghịch và không thuận nghịch: Kết tủa thuận nghịch: sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì protein vẫn có thể trở lại trạng thái dung dịch keo bền như ban đầu. Kết tủa không thuận nghịch: là sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì protein không trở về trạng thái dung dịch keo bền vững như trước nữa. Sự biến tính của protein Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như tia cực tím, sóng siêu âm, khuấy cơ học... hay tác nhân hóa học như acide, kiềm mạnh, muối kim loại nặng, tanin ... các cấu trúc bậc hai, ba và bậc bốn của protein bị biến đổi nhưng không phá vỡ cấu trúc bậc một của nó, kèm theo đó là sự thay đổi các tính chất của protein so với ban đầu. Đó là hiện tượng biến tính protein. Sau khi bị biến tính, protein thường thu được các tính chất sau: Độ hòa tan giảm do làm lộ các nhóm kỵ nước vốn đã chui vào bên trong phân tử protein. Khả năng giữ nước giảm. Mất hoạt tính sinh học ban đầu. Tăng độ nhạy đối với sự tấn công của enzim protease do làm xuất hiện các liên kết peptit ứng với trung tâm hoạt động của protease. Tăng độ nhớt nội tại. Mất khả năng kết tinh. Tính lưỡng cực của protein Acide amin có tính chất lưỡng tính vì trong acide amin có chứa cả gốc acide (-COOH) và gốc base (-NH2). Trong dung dịch, ở pH trung tính, acide amin tồn tại chủ yếu ở dạng ion lưỡng cực (chỉ 1% ở dạng trung hòa). Ở dạng ion lưỡng cực, nhóm cacboxyl bị phân ly, nhóm amin bị proton hóa. Trạng thái ion hóa của nhóm này phụ thuộc vào pH môi trường. Tương tự như acide amin, protein cũng là chất điện ly lưỡng tính, vì trong phân tử protein có nhiều nhóm phân cực của mạch bên (gốc R) của acide amin. Các biến đổi của protein có ứng dụng vào công nghệ thực phẩm Khả năng tạo gel của protein Khi các phân tử protein bị biến tính tập hợp lại thành một mạng lưới không gian có trật tự gọi là sự tạo gel. Khi protein bị biến tính, các mạch polipeptit đã bị duỗi ra (trong điều kiện gia công nhất định) trở nên gần nhau, tiếp xúc với nhau và liên kết lại với nhau mà mỗi vị trí tiếp xúc là một nút, phần còn lại hình thành mạng lưới không gian ba chiều vô định hình, rắn, trong đó có chứa đầy pha phân tán (H2O). ØĐiều kiện tạo gel: ü Nhiệt độ: là yếu tố cần thiết đầu tiên để tạo gel. Sau khi gia nhiệt người ta thường làm lạnh để tạo nhiều liên kết hidro cho cấu trúc gel được bền. üAcide hóa nhẹ hoặc kiềm nhẹ: đưa pH của protein về điểm đẳng điện, làm cho gel tạo nên chắc hơn. üThêm chất đồng tạo gel: như polysaccharide nhằm làm cầu nối giữa các hạt, do đó gel protein tạo ra có độ cứng và độ đàn hồi cao hơn. Hình 2.2. Sự hình thành gel do nhiệt Khả năng tạo bột nhão Các protein (gliadin và glutenin) của gluten bột mì còn có khả năng tạo hình, tạo ra “bột nhão” có tính cố kết, dẻo và giữ khí. Khả năng tạo màng Protein như gelatin còn có khả năng tạo màng. Màng này chủ yếu được hình thành từ liên kết hidro nên có tính thuận nghịch. Khả năng nhũ hóa Khi protein được hấp phụ vào bề mặt liên pha giữa các giọt béo phân tán và pha nước liên tục sẽ tạo ra những tính chất cơ lý như độ dày, độ nhớt, độ đàn hồi, độ cứng có tác dụng bảo vệ làm ổn định sự phân tán của các giọt dầu béo hay làm cho chúng khó kết hợp lại với nhau. Ngoài ra, phụ thuộc vào pH, sự ion hóa các gốc R của protein cũng sẽ tạo ra lực đẩy tĩnh điện làm cho hệ nhũ tương bền. Khả năng tạo bọt Bọt thực phẩm là hệ phân tán của các bong bọt trong một pha liên tục là chất lỏng hoặc bán lỏng, có chứa các chất hoạt động bề mặt hòa tan. Muốn cho bọt bền nghĩa là các bong bọt không bị vỡ thì màng mỏng bao quanh bong bọt phải đàn hồi và không thấm khí. Khi protein được hấp phụ vào bề mặt liên pha thì sẽ tạo được một màng như thế nên bảo vệ được bong bọt. Khả năng cố định mùi Protein có thể cố định được các chất có mùi khác nhau. Các protein có thể hấp phụ lý học hoặc hấp phụ hóa học các chất có mùi qua tương tác Van der Waals hoặc qua liên kết đồng hóa trị và liên kết tĩnh điện. CÁCH XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN[5] Thực phẩm là một hỗn hợp phức tạp chứa nhiều thành phần khác nhau. Nên việc phân lập và xác định một tính chất riêng rẽ của thực phẩm là việc vô cùng khó khăn và phức tạp vì có vô số những tương tác xuất hiện giữa các chất trong thực phẩm trong suốt quá trình chuẩn bị và chế biến. Vì lý do này, các nhà khoa học thống nhất xác định tính chất chức năng của protein bằng hệ thống đơn giản được định nghĩa đầy đủ và kiểm soát các điều kiện. Theo hướng này có thể loại bỏ những thay đổi phức tạp đồng thời làm đơn giản hóa những dữ kiện giải thích. Tuy nhiên, kết quả của những mô hình kiểm tra này phải được giải thích cẩn thận, những kết quả từ một hệ thống kiểm tra đơn giản không thể được đánh giá cao trong hệ thống thực phẩm thực tế. Những mô hình kiểm tra khác nhau được áp dụng, nhưng một vài mô hình không được đánh giá cao trong việc dự đoán tính chất chức năng của protein trong hệ thống thực phẩm thực tế. Những điều kiện như năng lượng đầu vào, lực ion, pH, tốc độ gia nhiệt được sử dụng trong những mô hình trạng thái thường khác nhau từ cách sử dụng và trong suốt quá trình chế biến. Nên kết quả đạt được của một thí nghiệm không có ý nghĩa đại diện cho kết quả khác. Việc lựa chọn kiểm tra thuộc tính để đánh giá những chức năng riêng biệt của protein là một điều khó khăn. Kiểm tra tính chất chức năng của protein phụ thuộc vào nhu cầu của người kiểm tra và việc trả lời những câu hỏi được đặt ra. Bất kì một phương pháp nào cần phải được kiểm tra trước khi sử dụng để chắc chắn rằng kết quả sẽ tương quan với hệ thống thực phẩm thực tế được nghiên cứu. Mangino (1989) tuyên bố rằng phương pháp đánh giá tính chất chức năng có nhiều ảnh hưởng to lớn đến kết quả hơn là những thay đổi thực tế khi được nghiên cứu. Một số phương pháp được tiêu chuẩn hóa cao ở quá trình tiến hành trong khi một số khác chỉ đặc biệt sử dụng riêng biệt cho phòng thí nghiệm. Một số phương pháp dựa vào kinh nghiệm là chủ yếu, một số khác lại tuân theo những nguyên tắc cơ bản. Không có một phương pháp riêng biệt nào được áp dụng chung. Những phương pháp tiêu chuẩn hóa có giá trị từ các tổ chức như là hiệp hội các nhà hóa học lương thực tại Mỹ (the American Association of Cereal Chemists), hội các nhà hóa học về dầu tại Mỹ( American Oil Chemists Society), hội liên hiệp sữa quốc tế (International Dairy Federation)… Một cách tổng quát, cách phương pháp này đã được kiểm tra trong những nghiên cứu hợp tác giữa một vài phòng thí nghiệm. Do đó, viêc sử dụng những phương pháp tiêu chuẩn hóa có thể làm đơn giản việc so sánh kết quả của các phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, một phương pháp được tiêu chuẩn hóa cũng không bảo đảm rằng kết quả kiểm tra sẽ liên quan đến chức năng của protein trong sản phẩm riêng biệt hoăc trong những ứng dụng của sản phẩm. Một vấn đề khác là hầu hết những phương pháp được tiêu chuẩn hóa là do kinh nghiệm. Nếu bất kì bước nào trong tiến trình bị thay đổi hoặc thay thế thiết bị thì việc so sánh giữa các phòng thí nghiệm không thể thực hiện được. Sự có mặt của cacbonhydrate và lipid có thể ảnh hưởng đến tính chất chức năng của protein. Nó đóng vai trò quan trọng trong việc bao bọc lấy những đại phân tử này. Tóm lại, hệ thống càng phức tạp thì kết quả càng có tương quan gần với thực phẩm thực tế. Những yếu tố gây xáo trộn do sự tương tác giữa các thành phần có thể dẫn đến những kết luận không chính xác. Bảng 2.1. Phương pháp xác định tính hidrate hóa của protein Tên phương pháp Mô tả Thông số đo Ưu nhược điểm Tài liệu tham khảo Nitơ hòa tan Sản phẩm khô là bã, được hydrate hóa bằng cách khuấy, sau đó ly tâm ở 270 vòng trong 10phút Tỷ số nitơ hòa tan(NSI) = (%nitơ tan trong nước)/(% nitơ tổng)*100 Ưu điểm : có thể tái sử dụng Nhược điểm : chỉ áp dụng cho các sản phẩm họ đậu nành hòa tan trong nước; không có quy định sử dụng dung dịch đệm thay thế. AOCS Method Ba 11 – 65 (AOCS, 1999);AACC Method 46 – 23 (AACC, 2000) Chỉ số phân tán Protein Sản phẩm khô được phân tán trong nước bằng cách trộn, sau đó ly tâm ở 880 vòng trong 10phút Chỉ số protein phân tán (%) = (% protein phân tán trong nước)/(%tổng số protein)*100 Ưu điểm: Đã được kiểm tra trong một nghiên cứu hợp tác và có thể sử dụng phương pháp này giữa các phòng thí nghiệm. Nhược điểm : Giới hạn sản phẩm đậu nành, protein được xác định bởi phân tích Kjeldahl có thể mất nhiều thời gian AOCS Method Ba 10 – 65 (AOCS, 1999);AACC method 46 – 24 (AACC, 2000) Protein hòa tan Protein trong những dung dịch đệm đặc biệt được ly tâm ở 20000 vòng trong 30 phút. Lượng protein của mẫu và các chất nổi trên mặt được xác định. Protein hòa tan = (%protein nổi trên mặt)/(%protein có trong mẫu)*100 Ưu điểm : Áp dụng cho các protein khác nhau; khảo nghiệm được tìm thấy sẽ được lặp lại trong nghiên cứu hợp tác. Nhược điểm : Yêu cầu kiểm soát chặt chẽ của dung dịch đệm, pH, và các điều kiện ly tâm cho các kết quả lặp lại. Kocher and Foegeding (1993); Jaurequi et al. (1981); Lee and Patel (1984) Độ ẩm liên kết Khả năng giữ nước của protein khi tác động của một lực bên ngoài, ví dụ như, ly tâm hoặc áp lực, trong các điều kiện rõ ràng Độ ẩm liên kết (%) = (khối lượng nước liên kết)/(khối lượng nước có trong mẫu)*100 Ưu điểm : dễ thực hiện Nhược điểm : cấu trúc mẫu có thể bị phá hủy hoặc biến dạng bởi lực tác dụng dẫn đến kết quả không tương quan với một hệ thống thực phẩm thực tế. Honikel(1987) Nhỏ giọt ít, nhỏ giọt tự do, hay tan rỉ dịch. Phần lớn chất lỏng được thoát ra từ một mẫu mà không có tác động của một lực bên ngoài trong một khoảng thời gian quy định Giảm nhỏ giọt (%) =(khối lượng nhỏ giọt / trọng lượng mẫu ban đầu)*100 Ưu điểm : các thiết bị thử nghiệm đơn giản, thường được sử dụng cho sản phảm thịt. Nhược điểm : Kiểm tra có thể mất 24 giờ để hoàn thành; nếu không được kiểm soát, kết quả có thể bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường, chẳng hạn như độ ẩm tương đối hay nhiệt độ. Khả năng hấp thụ nước, thế năng liên kết nước, khả năng hydrate hóa. Đo lượng bán rắn hay thực phẩm khô có thể hấp thụ nước trong các điều kiện quy định Khả năng hấp thụ nước được đo trong mẫu ml / g; thực tế phụ thuộc phương pháp tính toán Ưu điểm : được sử dụng cho thực phẩm rắn hoặc khô. Nhược điểm : kết quả phụ thuộc nhiều vào phương pháp; cần đưa phần protein bị thất thoát vào phần nổi trên mặt, đồng thời kết quả phụ thuộc vào kích thước protein. Regenstein et al. ( 1979); Quinn and Paton (1979) Bảng 2.2. Các phương pháp xác định tính chất bề mặt của protein Tên phương pháp Mô tả Thông số đo Ưu và nhược điểm Tài liệu tham khảo Tốc độ nhũ tương hóa Lượng dầu tối đa có thể được nhũ tương hóa bởi dung dịch protein trước khi hệ nhũ tương bị phá vỡ. Tốc độ nhũ tương hóa = khối lượng dầu nhũ hoá / trọng lượng của protein Ưu điểm : Đơn giản và nhanh chóng; các thiết bị sử dụng tương đối đơn giản và không tốn kém. Nhược điểm : đo khả năng nhũ tương bằng tỷ lệ protein/lipid không thường gặp trong các hệ thống thực phẩm; kết quả được đánh giá phụ thuộc nhiều vào phương pháp và thiết bị. Wang and Kitisella (1976); Swift et al. (1961) Sự ổn định hệ nhũ tương được đo bằng cách sử dụng kiểm tra độ ổn định tồn trữ Đo sự phân phối kích thước giọt và nồng độ tại đỉnh và đáy của một bình kín trong thời gian tồn trữ Kết quả thường được trình bày dưới dạng biểu đồ đánh giá kích thước giọt, và nồng độ(theo thể tích) là một hàm theo thời gian tồn trữ Ưu điểm : Các mẫu có thể được tồn trữtrong điều kiện thực tế. Nhược điểm : Kiểm tra có thể mất hơn 1 năm để hoàn thành; yêu cầu lấy mẫu lặp đi lặp lại và thiết bị để đo kích thước giọt. UNIT 03.4, Basic Protocol 1 Sự ổn định hệ nhũ tương được đo bằng cách kiểm tra váng nổi (creaming) Nhũ tương được đặt ở chỗ phân chia của xylanh và được giữ trong khoang. Chiều cao giữa các lớp đã được phân ranh giới rõ ràng trong huyết thanh và kem trong giai đoạn tách được đo Chiều cao giữa các lớp đã được phân ranh giới rõ ràng trong huyết thanh và kem tăng khi hệ nhũ tương bị phân hủy quá thời gian; kết quả thường được trình bày dạng sơ đồ. Ưu điểm: Kiểm tra có thể được thiết lập nhanh chóng; được sử dụng cho nhũ tương mà trở nên mất ổn định trong vòng 1-4 tuần; có giá trị khi xác định ảnh hưởng của pH, lực ion, nồng độ protein lên sự ổn định. Nhược điểm : cần phải phân tích nhiều lần; điều kiện lưu trữ phải được kiểm soát UNIT 03.4, Basic Protocol 2 Kiểm tra sự ổn định nhanh chóng bằng cách sử dụng chỉ số khối lượng nhũ tương (EVI) tăng tốc tiến trình lão hóa của hệ nhũ tương trong ống microhematocrit chịu lực ly tâm EVI = (chiều dài của giai đoạn nhũ tương / tổng chiều dài của cột) (% chất béo / 0,9)*100. EVI càng cao cho thấy hệ nhũ tương càng ổn định trong điều kiện kiểm tra. Ưu điểm: Thời gian phân tích ngắn hơn; các nghiên cứu đã tìm thấy mối tương quan giữa EVI và kiểm tra tính ổn định dài hạn trong một số sản phẩm. Nhược điểm : Tỷ lệ váng nổi trong một pham vi ly tâm có thể không bền khi lưu trữ lâu dài; phản ứng hóa học có thể làm mất ổn định hệ nhũ tương trong quá trình lưu trữ lâu dài Fligner el al. (1991) Chỉ số độ hoạt động nhũ hóa (EAI) Độ đục của dịch nhũ tương có liên quan đến bề mặt phân chia pha bằng một phương trình Chỉ số độ hoạt động nhũ hóa =diện tích bề mặt phân chia pha ổn định/đơn vị khối lượng protein Giá trị EAI càng cao hệ nhũ tương càng ổn định Ưu điểm: kiểm tra tương đối nhanh; không phụ thuộc vào tác động bên ngoài đến sự phá vỡ của hệ nhũ tương; sử dụng một lượng nhỏ protein; chỉ cần tiến hành với các thiết bị thông thường trong phòng thí nghiệm Nhược điểm: Hệ nhũ tương cần được chuẩn bị trong những điều kiện tiêu chuẩn hóa; một số nghiên cứu cho thấy có sự tương quan yếu giữa EAI và sự ổn định của hệ nhũ tương trong hệ thống thực phẩm. Pearce and Kinsella (1978); Cameron et. al.(1991) Khả năng tạo bọt Thể tích bọt xuất hiện trong điều kiện đông đặc từ lượng lipid đông đặc. Điểm kết thúc dựa vào thời gian tạo bọt hoặc thể tích bọt có thể xác định được. Theo dõi thể tích bọt và biểu diễn sự biến thiên khả năng tạo bọt. Thế tích bọt có thể xác định bằng những dụng cụ đo hình trụ có chia vạch. Hoặc là tính toán độ giãn nở của bọt= khối lượng bọt/khối lượng dung dịch trong điều kiện thể tích không đổi Ưu điểm: Việc kiểm tra đơn giản, thiết bị tương đối rẻ tiền. Nhược điểm: kết quả phụ thuộc vào quá trình tao bọt; cần sử dụng các kiểm tra được tiêu chuẩn hóa. Wilde and Clark (1996); Phillips et al. (1990) Thể tích bọt ổn định Sự thay đổi thể tích bọt theo thời gian Sự ổn định thường được biểu diễn bằng nửa chu kì phân hủy bọt( thời gian để chất lỏng rút xuống hoặc bọt xẹp xuống một nữa) Ưu điểm: Việc kiểm tra đơn giản, thiết bị tương đối rẻ tiền. Nhược điểm: kết quả chỉ được so sánh khi có quá trình tạo bọt giống nhau, mất thời gian vài giờ. Wilde and Clark (1996); Phillips et al. (1990) Phân bố kích thước bọt Sự biến đổi phân bố kích thước bọt quá thời gian cũng là một chỉ tiêu để đánh giá sự ổn định của bọt. Sự vỡ và mất cân bằng của bọt có liên quan đến sự ổn định của bọt Ưu điểm: phương pháp cơ bản hơn đo thể tích bọt hay sự ổn đinh của bọt. Nhược điểm: khó xác định sự phân bố và kích thước bọt. Wilde and Clark (1996) Tính kỵ nước bề mặt Bề mặt kỵ nước của protein được đo bằng đầu dò huỳnh quang như acid cis-parinaric Độ dốc ban đầu của cường độ phát huỳnh quang chống lại nồng độ protein được xem như một chỉ số chức năng Ưu điểm: Tính kỵ nước bề mặt có mối tương quan rõ ràng với khả năng nhũ hóa và tạo bọt của protein. Nhược điểm: ảnh hưởng đến thuộc tính của hệ nhũ tương Kato and Nakai (1980); Nakai et al.(1996) Thuộc tính bề mặt phân chia Sự thay đổi áp suất bề mặt và nồng độ protein quá thời gian Sự thay đổi áp suất bề mặt theo thời gian hay nồng độ protein có thể được đo bằng những tính chất cơ bản khác nhau. Sự thay đổi áp suất bề mặt chống lại đường cong nồng độ protein được dùng để xác định nồng độ vượt mức bề mặt (nồng độ micelle tới hạn), được xác định bằng lượng protein bề mặt/diện tích bề mặt. Nó cho biết lượng protein tối thiểu cần để tạo hệ nhũ tương. Ưu điểm: cơ bản hơn, có thể so sánh kết quả giữa các phòng thí nghiệm Nhược điểm: hầu hết được áp dụng với protein tinh sạch; yêu cầu thiết bị chuyên dụng; kết quả có hoặc không ảnh hưởng đến hệ thống thực phẩm thực tế. McClements(1999) Bảng 2.3. Các phương pháp xác định tính chất gel của protein Tên phương pháp Mô tả Thông số đo Ưu và nhược điểm Tài liệu tham khảo Kiểm tra sự phá hỏng cấu trúc bằng nén ép một trục Gel được phá hỏng bằng cách nén ép giữa hai đĩa song song Sức căng bề mặt tại điểm phá hỏng hay hiệu suất (ΔL/L) Ứng suất bề mặt (Lực/diện tích bề mặt) Ưu điểm: có thể kiểm tra trong 5 phút đối với sản phẩm thương mại. Nhược điểm: mẫu có cấu trúc yếu không bị rạn nứt nhưng bị chảy. UNITH2.1, Basic Protocol 1; Lee et al. (1997) Kiểm tra sự phá hỏng cấu trúc bằng kiểm tra độ xoắn Gel được gắn vào vật cố định và bị làm biến dạng bằng lực xoắn. Sức căng tại điểm phá hỏng hay hiệu suất (ΔL/L) Ứng suất (Lực/diện tích bề mặt) Ưu điểm:sử dụng cho những sản phẩm bị biến dạng cao khi sức căng lớn và dễ rạn nứt. Nhược điểm: thiết bị phức tạp, gel dính chặt vào nơi được gán cố định vào. Diehl et al. (1979) Kiểm tra thực nghiệm thuộc tính gel Sử dụng những dụng cụ đặc biệt: đầu đâm, cắt hoặc ấn. Những thuộc tính khác nhau sẽ được đo Ưu điểm: tốt khi đo lặp lại với một loại mẫu. Nhược điểm: thay đổi kiểm tra thực nghiệm với thiết bị, điều kiện tiến hành, kích thước và hình dạng mẫu. Giữ cấu trúc gel Kiểm tra sự biến dạng nhỏ với việc kiểm soát điều kiện sức căng hoặc ứng suất bằng kiểm tra tĩnh học hoặc động học Độ đàn hồi, độ nhớt, điểm tạo gel và một số thuộc tính cụ thể khác. Ưu điểm: đo được những thuộc tính cơ bản; nguyên liệu kiểm tra không bị phá hỏng; có thể xác định sự thay đổi thuộc tính gel theo pH và nhiệt bằng phương pháp kiểm tra động học. Nhược điểm: thuộc tính kiểm tra có thể không tương quan với đánh giá cảm quan của người tiêu dùng; gel phải được đo trong vùng nhớt và dẻo và được đo bằng ứng suất hoặc sức căng. UNIT H3.2; Steffe (1996); Vittayanont et al. (2003) CHƯƠNG 3: TÍNH CHẤT CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN ĐẬU PHỘNG I. PROTEIN ĐẬU PHỘNG[4] Đậu phộng chứa 26 – 29% protein có giá trị dinh dưỡng cao mặc dù các amino acide như lysine, methionine và threonine có hàm lượng thấp (theo mức độ tiêu thụ protein cần thiết hàng ngày). 90% protein là các anionic globulin gồm 2 phân đoạn chính là arachin (nằm trong lớp aleurone), conarachin (nằm trong tế bào chất) và 10% là các albumin (Daussant et al, 1969). Arachin được phân làm 2 loại: monomer (arachin I) và dimer (arachin II). Cả 2 loại arachin đều có khối lượng phần đơn phân tử là 180kDa và được cấu tạo nên từ những “subunit” có cấu trúc tương tự nhau. Arachin I có 6 “subunit” khác nhau với khối lượng phân tử 19.5 – 40.5kDa. Conarachin cũng được phân làm 2 loại: conarachin I và conarachin II với các subunit khác nhau. Conarachin II có khối lượng phân tử là 180kDa cấu tạo nên từ 3 “subunit” có khối lượng phân tử là 65kDa (Yamada et al, 1980). Tỷ trọng khối lượng của protein tổng, arachin, conarachin I và conarachin II lần lượt là 0.253, 0.312, 0.080 và 0.084g/ml. Acide aspartic, acide glutamic, và arginine chiếm 45% tổng lượng amino acide trong đậu phộng. Trong khi đó methionine, tryptophan và cystein là những amino acide có hàm lượng thấp trong đậu phộng. Tuy nhiên các nhà khoa học đã nghiên cứu và thu được protein giàu methionine với hàm lượng methionine là 2.9% và cystine là 10.8%. Những phân tử protein này có trọng lượng phân tử khoảng 118kDa, và điểm đẳng điện giữa pH 5.6 – 6.2. Các phương pháp nghiên cứu gần đây (DEAE chromatography và electrophoresis) khi tinh sạch và xác định tính chất của arachin và conarachin đều cho thấy hầu hết protein trong hạt đậu phộng ở dạng acide protein trong tự nhiên. Trong khi đó, base protein trong đậu phộng là các thành phần hỗn tạp, không đồng nhất và chỉ chiếm khoảng 1% lượng protein tổng có trong hạt đậu phộng. Thành phần các acide amin cao có trong base protein là lysine (8.5%), glycine (27.9%), và methionine (1%) và thấp là aspartic acide (5.3%) và glutamic acide (5.6%) khi so sánh với protein tổng có trong hạt đậu phộng. Các base protein được tìm thấy dưới dạng glycoprotein, nó gồm cả dạng tự nhiên (glucose, mannose) lẫn dạng amino sugar (glucosamine). Bảng 3.1. Khối lượng phân tử 5 lớp chính của “subunit” protein đậu phộng, xác định bằng SDS-PAGE Lớp protein đậu phộng Khối lượng phân tử (kDa) Conarachin >50 Arachin acid 38-49.9 Trung bình 23-37.9 Arachin cơ bản 18-22.9 Protein phân tử lượng thấp 14-17.9 II. TÍNH CHẤT CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN ĐẬU PHỘNG[10], [14], [25], [27] Sự tách protein chỉ là bước đầu tiên nhằm hướng đến việc kết hợp protein đậu phộng ứng dụng vào trong thực phẩm. Bên cạnh những ích lợi về giá trị dinh dưỡng, điều quan trọng là protein đậu phộng khi được ứng dụng vào trong thực phẩm thì thực phẩm vẫn giữ được sự hấp dẫn đối với khách hàng. Việc hiểu rõ tính chất chức năng của protein sẽ giúp ta áp dụng một cách hiệu quả nhất. Tính chất chức năng của protein là tất cả những tính chất hóa lý của protein góp phần tạo nên những đặc trưng cấu trúc, những đặc tính mong muốn của sản phẩm thực phẩm chứa protein. Trong mỗi thực phẩm, để tạo cấu trúc đặc trưng của nó có thể có sự tham gia tương hỗ của nhiều tính chất chức năng của những thành phần khác nhau: protein, lipid, glucide… trong nguyên liệu tạo ra. Tính chất chức năng của protein thực phẩm có thể phân thành 3 nhóm chính sau: Các tính chất do tương tác giữa protein với nước (hydrat hóa): khả năng hấp thụ nước và giữ nước, trương nở, dẻo dính (adhesion), phân tán, hòa tan và tạo nhớt. Các tính chất do tương tác protein - protein: các hiện tượng như đông tụ, kết tủa, tạo gel, tạo màng, tạo sợi, tạo bột nhão. Các tính chất bề mặt: liên quan đến sức căng bề mặt như khả năng tạo nhũ, khả năng tạo bọt, khả năng cố định mùi. Tuy nhiên những tính chất này không hoàn toàn độc lập, không có ranh giới phân chia dứt khoát. Chẳng hạn như sự tạo gel không những do tương tác protein - protein mà còn do tương tác protein - nước. Độ nhớt và độ hòa tan phụ thuộc vào các tương tác protein - nước và protein - protein. Những tính chất chức năng được quan tâm nhất là: khả năng giữ nước, khả năng liên kết với dầu, khả năng nhũ hóa, khả năng tạo bọt và tạo gel. 1. Tính hòa tan của protein đậu phộng Tính hòa tan của protein đậu phộng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: thành phần các amino acide có trong protein đậu phộng, pH của protein… Ảnh hưởng của thành phần amino acide: khả năng hòa tan và hấp thụ nước của protein từ đậu phộng phụ thuộc vào thành phần các amino acide có trong phân tử (thường là trên bề mặt các phân tử protein). Khả năng hòa tan sẽ tăng khi số gốc kỵ nước giảm và ngược lại. Ảnh hưởng của pH: tại pH trên và pH dưới điểm đẳng điện của protein, số nhóm tích điện sẽ tăng lên, sự tương tác tĩnh điện và hydrate hóa sẽ xảy ra, khả năng hòa tan sẽ tăng lên. Theo nghiên cứu của P.Vincent Monteiro (1994) về khả năng hòa tan của protein đậu phộng trong nước và dung dịch NaCl 0.2M tại các pH khác nhau, protein từ đậu phộng, cũng như hầu hết các cây có dầu khác sẽ giảm khả năng hòa tan xung quanh điểm đẳng điện, tuy nhiên nếu NaCl được thêm vào thì khả năng hòa tan của protein sẽ tăng lên do làm tăng độ mạnh của lực ion trong dung dịch, tăng cường khả năng liên kết của protein với nước. Ngược lại, tại pH acide hay pH kiềm, sự hiện diện của NaCl sẽ làm giảm khả năng hòa tan của protein, đặc biệt là pH acide. Tác giả cho rằng hầu hết các protein trong đậu phộng là acide protein, nên trong điều kiện pH acide, các nhóm chức -COOH sẽ không phân ly, làm giảm khả năng hòa tan của protein. Ngoài ra NaCl sẽ cạnh tranh nước với protein. Kết quả là những tương tác kỵ nước của protein đậu phộng sẽ tăng lên, protein sẽ bị đông tụ và làm giảm khả năng hoàn tan. Ngoài ra tính chất này bị ảnh hưởng rất lớn bởi phương pháp sản xuất. Sự biến tính sẽ ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của protein vì sẽ làm thay đổi tương tác ưa nước – kỵ nước trên bề mặt phân tử protein. Protein đậu phộng hòa tan từ pH 2-10, hòa tan kém nhất tại điểm đẳng điện pH 4.5. Hơn 95% protein hòa tan tại pH dưới 2.5 hoặc trên 7. Protein tổng hòa tan cao nhất (87.5%) trong nước tại pH 3.5, arachin là 91% tại pH 2.5, 98% cho conarachin II và conarachin I tại pH 10. Hình 3.1: Khả năng hòa tan protein tại các pH khác nhau. A – Protein hòa tan trong nước, B- Protein hòa tan trong NaCl 0.2M, (a) protein tổng, (b) arachin, (c) conarachin II, (d) conarachin I Albumin và phân đoạn conarachin bị thay đổi tính chất hòa tan nhiều nhất trong quá trình sản xuất. Điểm đẳng điện của các phân đoạn protein này bị thay đổi gần đến pH trung tính khi trích ly béo bằng dung môi hữu cơ. Trong khi đó arachin mang bản chất lipoprotein, sự ổn định của arachin phụ thuộc vào vị trí của protein trong tế bào. Arachin nằm trong lớp aleurone, được bao quanh những giọt dầu nằm trong tế bào chất. Do được bao bọc bởi dầu và lớp màng nên arachin được bảo vệ khỏi sự tác động của nhiệt độ cũng như các yếu tố khác. Giá trị khả năng hấp thụ nước của protein tổng, arachin, conarachin I và conarachin II lần lượt là 1.45, 1.30, 1.53 và 1.49g H2O/g protein 2. Khả năng giữ dầu của protein đậu phộng Giá trị khả năng giữ dầu của protein tổng, arachin, conarachin I và conarachin II lần lượt là 1.22, 1.28, 1.26 và 1.29 g dầu/g protein 3. Khả năng nhũ hóa Kỹ thuật tách protein ảnh hưởng rất nhiều đến khả năng nhũ hóa cũng như khả năng tạo bọt của protein đậu phộng. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng nhũ hóa cũng như độ bền của các protein đậu phộng như: thời gian, nồng độ protein, nồng độ muối, pH. Theo nghiên cứu của P.Vincent Monteiro (1994) về khả năng nhũ hóa và độ bền của hệ nhũ từ protein đậu phộng thông qua phương pháp đo độ hấp thu tại bước sóng 500nm tại thời điểm ban đầu và tại thời điểm hệ nhũ giảm một nửa độ bền vì thay đổi các yếu tố như: thời gian, nồng độ protein, nồng độ muối và pH, P.Vincent Monteiro đã thu được kết quả như sau: Ảnh hưởng của thời gian Qua nghiên cứu P.Vincent Monteiro đã thu được kết quả được biểu diễn như hình dưới đây: EAI Hình 3.2: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng nhũ hóa của protein đậu phộng (a) protein tổng, (b) arachin, (c) conarachin II, (d) conarachin I Nhìn trên hình 3.2 ta thấy trong 6 phút đầu khả năng nhũ hóa của các protein đậu phộng giảm nhanh nhất từ phút thứ 7 đến phút thứ 18 thì khả năng nhũ hóa có giảm nhưng giảm rất ít, và từ phút thứ 18 trở đi thì khả năng nhũ hóa là không đổi. Trong cùng một khoảng thời gian như nhau, khả năng nhũ hóa của các protein trong đậu phộng được sắp xếp theo thứ tự: protein tổng < arachin < conarachin II < conarachin I . EAI Ảnh hưởng của nồng độ protein Hình 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ protein đến khả năng nhũ hóa của protein đậu phộng protein tổng, (b) arachin, (c) conarachin II, (d) conarachin I Nhìn trên hình 3.3 ta thấy khả năng nhũ hóa của protein đậu phộng tăng dần theo nồng độ protein, khả năng nhũ hóa đạt cực đại khi có nồng độ protein là 3mg/ml. Sau đó khi nồng độ protein tiếp tục tăng thì khả năng nhũ hóa giảm xuống, trong khoảng 3-4mg/ml thì khả năng nhũ hóa của protein đậu phộng giảm nhẹ, nếu tiếp tục tăng nồng độ của protein lên thì khả năng nhũ hóa của protein đậu phộng giảm mạnh. Trên hình 3.3 ta thấy, ở cùng một nồng độ protein thì khả năng nhũ hóa của các protein đậu phộng giảm theo thứ tự: arachin > conarachin I > conarachin II > protein tổng. Ảnh hưởng của pH EAI Hình 3.4: Ảnh hưởng của pH đến khả năng nhũ hóa của protein đậu phộng protein tổng, (b) arachin, (c) conarachin II, (d) conarachin I Nhìn chung khi trong pH tăng trong khoảng từ pH 2 đến pH 6 thì khả năng nhũ hóa của các protein đậu phộng đều giảm mạnh, đặc biệt tại pH 5 thì khả năng nhũ hóa của conarachin II và ở pH 6 khả năng nhũ hóa của arachin gần như bằng 0. Ta thấy mỗi protein đậu phộng có một điểm pH khác nhau mà tại đó khả năng nhũ hóa là thấp nhất, nếu ta tiếp tục tăng pH lên thì khả năng nhũ hóa tăng dần. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl EAI Hình 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng nhũ hóa của protein đậu phộng (a) protein tổng, (b) arachin, (c) conarachin II, (d) conarachin I Nhìn trên hình 3.5 ta thấy khả năng nhũ hóa của conarachin I, arachin và protein tổng đều bị giảm khi nồng độ NaCl tăng. Khả năng nhũ hóa của conarachin I giảm cực tiểu khi NaCl có nồng độ 0,2M và tăng dần nếu ta tiếp tục tăng nồng độ NaCl. Khả năng nhũ hóa của protein tổng giảm cực tiểu khi NaCl có nồng độ 0,3M và tăng dần nếu ta tiếp tục tăng nồng độ NaCl. Khả năng nhũ hóa của arachin I giảm cực tiểu khi NaCl có nồng độ 0,4M và tăng dần nếu ta tiếp tục tăng nồng độ NaCl. Khác biệt nhất là conarachin II có khả năng nhũ hóa tăng nhẹ khi tăng nồng độ NaCl và tăng cực đại khi NaCl có nồng độ 0,4M, sau đó nếu tiếp tục tăng nồng độ NaCl thì khả năng nhũ hóa lại giảm nhẹ. 4. Khả năng tạo gel và tạo nhớt Các nhà khoa học cho rằng độ nhớt của protein isolate phụ thuộc vào sự tương tác giữa những protein hòa tan, protein không hòa tan với nước và các phân tử đã hydrate hóa. Độ nhớt sẽ gia tăng theo hàm mũ khi hàm lượng protein tăng lên. Ngoài ra pH kiềm cũng sẽ làm gia tăng độ nhớt. Việc biến tính protein một phần cũng sẽ làm gia tăng độ nhớt, khả năng tạo gel vì sẽ làm gia tăng bề mặt của phân tử protein do protein bị duỗi mạch. Protein có khả năng tạo gel tốt vì kích thước phân tử lớn và có khả năng hình thành những mối liên kết theo không gian 3 chiều. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo gel như pH, nhiệt độ, các thành phần không phải protein và các quá trình cơ học trong quy trình sản xuất. Gel không thể được hình thành tại vùng pH gần với điểm đẳng điện của protein đậu phộng. Ta có thể làm tăng độ cứng của gel khi bổ sung thêm muối nhưng tính đàn hồi của mạng lưới gel vẫn rất kém khi hàm lượng các hợp chất phytate và phenolic cao. Tóm lại, các tài liệu nghiên cứu đều nhấn mạnh đến tầm quan trọng của việc loại bỏ các hợp chất phytate, phenolic trong suốt quá trình sản xuất protein đậu phộng. III. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN TÍNH CHẤT CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN ĐẬU PHỘNG 1. Một số tính chất chức năng của protein đậu phông bị thủy phân một phần bằng papain trong bột đậu phộng[36] Bài báo miêu tả ảnh hưởng của việc thủy phân một phần protein của bột đậu phộng bằng papain, so sánh sự thay đổi một số tính chất chức năng của nó với protein chưa bị thủy phân và đề nghị những sản phẩm ứng dụng hợp lý của sản phẩm này dựa trên những tính chất chức năng đó. Bột đậu phộng phân tán trong nước đã khử ion (1/10, w/v) được xử lý với papain (0,5% tổng thể tích) tại 450C trong 15 phút. Hỗn hợp phản ứng sau đó được làm lạnh, làm lạnh khô và kết quả được so sánh với bột chưa bị thủy phân. Trong nghiên cứu này, tác giả quan tâm đến khả năng nhũ hóa, độ nhớt hệ nhũ tương và thuộc tính tạo bọt. Để loại bỏ những ảnh hưởng của việc xử lý enzyme đến tính chất chức năng của protein, enzyme phải được vô hoạt tại điểm kết thúc để ngăn chặn sự thủy phân diễn ra tiếp tục tạo thành các peptide nhỏ hơn hoặc các amino acid tự do gây đắng cho bột. Trong nghiên cứu này, papain là enzyme thủy phân làm thay đổi protein đậu phộng và việc vô hoạt enzyme hầu như không cần thiết vì khả năng phân giải protein đạt đến cân bằng trong 10-15 phút. Sự hòa tan protein Sự hòa tan protein đậu phộng (dựa trên sự hòa tan nitơ) trên dãy pH 1-9 được trình bày ở hình 3.6 và sự hòa tan protein đậu phộng dựa vào khối lượng thực tế của bột được trình bày ở hình 3.7. Nhìn chung, việc xử lý enzyme đã cải thiện được khả năng hòa tan tại tất cả các giá trị pH ngoại trừ pH 2 và pH 8. Protein của bột không xử lý enzyme có khả năng hòa tan thấp hơn ở pH=4-5. Hình 3.6. Khả năng hòa tan nitơ (Kjeldahl) của các protein đậu phộng P.H.P= thủy phân một phần bằng papain 5%, CON= không xử lý papain Hình 3.7. Khả năng hòa tan protein đậu phộng( đo khối lượng) P.H.P= thủy phân một phần bằng papain 5%, CON= không xử lý papain Dưới những điều kiện đó, trypsin phá hủy hoàn toàn năng lực nhũ hóa của protein bị biến đổi. Sự thủy phân bởi papain làm giảm độ nhớt của hệ phân tán bột đến 73% nhưng nó không hoàn toàn phá hủy năng lực nhũ hóa. Do đó, bột đậu phộng với độ nhớt giảm có thể được dùng để đánh giá khả năng tạo đặc của protein đậu phộng, đây là một thuộc tính có thể ứng dụng hấp dẫn trong thực phẩm bán đặc, đồ tráng miệng như pudding, bánh kẹo đông cứng. Tuy nhiên, protein thủy phân một phần ít có khả năng ứng dụng trong trường hợp này bằng protein chưa bị thủy phân. Khả năng tạo bọt và ổn định bọt Protein đậu phộng bị thủy phân một phần làm gia tăng khả năng tạo bọt và thể tích bọt một cách đáng kể tại tất cả các cấp độ khảo sát, đặc biệt khi pH được điều chỉnh hai lần với HCl 1N và NaOH 1N ưu tiên cho việc hình thành bọt. Tiến hành hai bước này làm gia tăng năng lực tạo bọt gấp ba lần. Mặc dù sự ổn định bọt tại pH 6,3-6,7 thì thấp ( ít hơn 30 phút), sự ổn định ở pH cao 8,2 lâu hơn, nhưng việc đó cho thấy một hướng ứng dụng tiềm năng hơn của protein thủy phân một phần trong thực phẩm không chứa pH acid. Những nghiên cứu này cho thấy rằng papain-làm thay đổi protein đậu phộng có thể ứng dụng trong đồ tráng miệng đông lạnh, kem hỗn hợp mềm, topping… Bảng 3.2. Khả năng tạo bọt và ổn đinh bọt của protein đậu phộnga protein Thể tích Khả năng tạo bọt 1 phút, ml Khả năng ổn định bọt 60 phút, ml Thay đổi,% Thể tích gia tăng, % acid base pHb Không qua xử lý 6.7 99.5 87 12.6 76.3 Đã thủy phân 6.3 139.0 c c 125.5 Không qua xử lý 1.2 8.2 97.0 87 10.3 73.3 Đã thủy phân 2.2 8.2 182.0 98 46.2 148.0 Không qua xử lý 4.9 6.1 4-8.2 127.3 108 15.1 83.2 Đã thủy phân 5.8 8.2 4-8.2 367.5 305 17.0 238.4 a: mỗi mẫu chứa 8% bột đậu phộng (w/v) b: pH được điều chỉnh với HCl 1N hoặc NaOH 1N c: bọt phá vỡ trước khoảng đọc 30 phút, là số ml hay % không thể xác định được ở thời điểm cuối cùng của 60 phút 2. Ảnh hưởng của enzyme thủy phân lên cấu tạo và tính chất chức năng của protein đậu phộng isolate[31] So với bột đậu phộng tách béo, PPI có những tính chất chức năng tốt hơn, nhưng tính chất chức năng của protein isolate họ đậu nghèo nàn hơn. Để cải thiện tính chất chức năng của protein họ đậu enzyme thủy phân đã được sử dụng. Ảnh hưởng của enzyme thủy phân có giới hạn-alcalase lên cấu tạo và tính chất chức năng của protein được nghiên cứu. Enzyme thủy phân có giới hạn cải thiện tính chất chức năng của protein PPI như sự hòa tan protein, khả năng tạo gel nhưng làm giảm đi chỉ số độ hoạt động tạo nhũ (EAI). Sự hòa tan protein Sự hòa tan của HPPI cao hơn PPI đáng kể trừ ở pH 5. Enzyme thủy phân được đánh giá có thể cải thiện khả năng hòa tan của protein trong dãy pH đã định. Tại pH >7.0, sự hòa tan protein của những chất thủy phân khác nhau trên 80%. Sự hòa tan protein đạt nhỏ nhất quanh pH 5. Sự hòa tan protein tại pH <6( đặc biệt trong khoảng 4.0-6.0) tăng lên với sự tăng DH từ 2.1% đến 5.4%. Chỉ số độ hoạt động tạo nhũ (EAI) Bảng 3.4 trình bày giá trị EAI của HPPI, PPI và chất thủy phân từ nó tại pH 7.0 và 5.0. Xử lý nhiệt làm gia tăng tính kỵ nước bề mặt và sự hòa tan protein của PPI, trong khi giá trị EAI của HPPI đã giảm mạnh ngoài mong muốn và EAI của HPPI là thấp nhất trong số tất cả các mẫu thử nghiệm, mặc dù tính kỵ nước bề mặt của nólà cao nhất trong số tất cả các mẫu thử nghiệm. Đối với PPI và chất thủy phân từ nó giá trị EAI giảm với sự gia tăng của DH. Những kết quả này gợi ý rằng các giá trị EAI của HPPI độc lập với tính kỵ nước bề mặt. Tuy nhiên, đối với PPI và chất thủy phân từ nó có một sự tương quan giữa tính kỵ nước bề mặt và giá trị EAI. Ngoài ra, ở pH 5.0, xu hướng thay đổi giá trị của EAI tương tự như ở pH 7.0, nhưng giá trị EAI ở pH5.0 thấp hơn so với ở pH 7.0. Kết quả này có thể là do protein hòa tan ít hơn ở pH 5.0 dẫn đến sự di chuyển cũng như là sự hấp thụ tại bề mặt phân chia hệ dầu-nước chậm hơn. (Guan và cộng sự, 2007.). Bảng 3.3. DSC của thành phần sulphydryl tự do (tổng và nhìn thấy được) và thành phần liên kết disunfite của PPI, HPPI và các chất thủy phân từ nó Mẫu Conrachin Arachin Thành phần liên kết disunfite và sulphydryl tự do Td1(0C) H1(J/g) Td2(0C) H2(J/g) Sulphydryl tổng Sulphydryl nhìn thấy được Liên kết disunfite PPI 89.60.12a 2.350.07a 101.50.09d 6.260.23a 5.130.07a 2.870.23b 0.690.03d HPPI 89.80.09a 1.530.03b 103.30.03c 1.80.07d 5.100.06a 3.540.22a 0.650.03d DH 2.1% 88.10.13b 2.210.07a 102.90.07c 3.790.04b 4.250.47b 2.410.26b 13.510.54a DH 3.6% 88.00.07b 1.750.09c 104.40.04c 2.450.06c 3.900.22b 1.860.22c 12.440.47b DH 5.4% 88.20.16b 1.620.06c 106.10.06a 1.970.11d 3.650.02c 1.300.29d 11.260.43c Bảng 3.4. Tính chất chức năng (EAI và G’) và tính kỵ nước bề mặt của HPPI, PPI và chất thủy phân từ nó Mẫu EAI(m2/g) G’(Pa) Tính kỵ nước bề mặt pH 5.0 pH 7.0 PPI 30.72.2a 56.21.1a 3.50.22d 541.914.6b HPPI 16.41.3b 22.22.7d 5.50.57c 1481.117.8a DH 2.1% 11.01.6c 39.23.5b 374.428.6a 173.615.8c DH 3.6% 16.31.2b 29.32.0c 19.71.89b 131.09.6d DH 5.4% 15.31.2b 29.23.2c 3.70.13d 101.911.4e Sự tạo gel do nhiệt Như đã trình bày ở bảng 3.4, sự gel hóa do nhiệt của HPPI, PPI và chất thủy phân từ nó ở pH trung tính được đánh giá bởi phép đo động lực dao động. PPI và HPPI không thể tạo dạng gel cứng, trong khi các chất thủy phân từ PPI với DH 2.1% cho thấy tính chất tạo gel tốt (Bảng 3.4). Điều này cho thấy rằng các biến tính của protein được chứng minh là một điều kiện tiên quyết cho sự hình thành gel (Renkema, Gruppen, và Vliet, 2002). Td của 7S và 11S trong protein isolate đậu nành lần lượt là 79.90C và 95.50C (Molina Ortiz & Anón, 2001) với Td là thước đo sự ổn định nhiệt, giá trị Td càng lớn thì sự ổn định nhiệt của protein dạng cầu càng cao (Tang, Sun, & Yin, 2009).Theo phân tích DSC (bảng 3.3), tỉ lệ Td của conarachin (7S) và arachin (11S) trong protein đậu phộng cao hơn protein đậu nành, có thể một phần hạn chế sự hình thành gel. Hơn nữa, không có liên kết đisunfua tham gia vào liên kết của những “subunit” trong arachin, bởi vì sự phân ly trong dung dịch urê xảy ra khi không có mặt -mercaptoethanol (Yamada, Aibara, và Morita, 1979). Điều này có nghĩa là có nhiều liên kết đisunfua hơn nữa được giấu vào bên trong. Enzym thủy phân hạn chế tạo DH 2.1% bộc lộ cấu trúc của PPI và lộ ra những liên kết sulphydryl và đisunfua bên trong các phân tử, điều đó góp phần cho sự hình thành gel rất nhiều Với sự gia tăng của DH, khối gel sẽ bị thủy phân làm phá vỡ mạng gel và giảm tương tác protein-protein. 3. Thay đổi tính chất của màng protein đậu phộng bằng phương pháp vật lý và hóa học [34] Các tính chất của màng protein đậu phộng đã được thay đổi bằng các phương pháp vật lý và hóa học, và những ảnh hưởng của nó lên màu sắc, lực cơ học, sự hòa tan vào nước và sự ngăn cản hơi nước và ôxy qua màng được nghiên cứu. Những phương pháp vật lý bao gồm phương pháp biến tính nhiệt lên dung dịch hình thành màng trong 30 phút ở 600C, 700C, 800C và 900C, tia cực tím chiếu xạ lên màng lên đến 24 h, và ba bước xử lý siêu âm dung dịch hình thành màng. Phương pháp hóa học bao gồm thêm các aldehyt và anhydric. Xử lý nhiệt ở 700C, tia cực tím chiếu xạ trong 24 h, xử lý siêu âm 10 phút trong bồn nước, và thêm formaldehyde và glutaraldehyde vào là nguyên nhân của sự gia tăng đáng kể độ bền kéo của màng. Tính thấm hơi nước(WVP) và tính thấm oxy(OP) qua màng giảm sau khi biến tính nhiệt và xử lý aldehyde. OP cũng giảm với xử lý tia cực tím. Xử lý nhiệt là phương pháp xử lý hiệu quả nhất, làm cho màng bền hơn, khả năng chống thấm nước tốt hơn và thấm hơi nước và oxy yếu hơn. Những thuộc tính của protein đậu phộng có thể thay đổi bằng những phương pháp trong nghiên cứu này. Điều đó giúp cho màng có những ứng dụng đặc biệt. làm tăng lực cơ học, giảm hòa tan trong nước và làm gia tăng những thuộc tính tiềm ẩn được cải thiện như mong muốn. Nhìn chung, những thuộc tính vật lý và hóa học của màng đã thay đổi được thay đổi đáng kể bởi sự liên kết chéo của mạng protein. Xử lý nhiệt là phương pháp hiệu quả nhất, tiếp theo là xử lý bằng tia UV và xử lý với aldehyte. Do đó, protein đậu phộng có thể sử dụng như một vật liệu sinh học trong bao gói và một số ứng dụng khác. 4. Protein đậu phộng concentrate: sản xuất và ảnh hưởng tính chất chức năng trong quá trình chế biến[33] Protein đậu phộng concentrate (PPC) được phân lập từ bột đậu phộng đã tách béo lên men và chưa lên men bằng kết tủa đẳng điện và quá trình phân ly vật lý. PPC được sấy khô bằng sấy phun hoặc sấy chân không. Bột PPC từ mỗi kỹ thuật sấy được đánh giá gần đúng thành phần và tính năng (sự hòa tan protein, năng lực liên kết hệ nước / dầu, năng lực nhũ hóa, khả năng tạo bọt và độ nhớt) cùng với bột đậu phộng tách béo và protein đậu nành isolate. PPC chứa hơn 85% protein so với 50% protein trong bột đậu phộng tách béo được sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất PPC. Khả năng hòa tan của PPC tương tự như bột đậu phộng, với độ hòa tan tối thiểu quan sát được ở pH 3.5-4.5 và độ hòa tan tối đa ở pH 10 và cao hơn. Đậu phộng rang làm giảm tất cả các tính chất chức năng của bột đậu phộng tách béo trong khi lên men có tác dụng ngược lại. Các kĩ thuật sấy ảnh hưởng đáng kể đến các tính chất chức năng của PPC. PPC sấy phun thể hiện tính chất chức năng tốt hơn so với PPC sấy chân không, đặc biệt là về khả năng nhũ hóa và khả năng tạo bọt. PPC sấy phun cũng cho thấy có thể so sánh như với protein đậu nành isolate (SPC) đã được thương mại hóa về liên kết với dầu và khả năng tạo bọt. Ở nồng độ tương đương và nhiệt độ phòng, hệ phân tán PPC biểu hiện độ nhớt thấp hơn so với hệ phân tán protein đậu nành isolate (SPI). Tuy nhiên, khi đun nóng tới 900C trong 30 phút, độ nhớt của PPC tăng mạnh. Kết quả thu được từ nghiên cứu này cho thấy PPC có thể được sử dụng trong công thức thức ăn đòi hỏi cao năng lực tạo nhũ tương, nhưng không thích hợp cho ứng dụng đòi hỏi khả năng giữ nước cao và khả năng tạo bọt. PPC có thể là một nguồn cung cấp protein cho nhiều sản phẩm thực phẩm dành cho người tiêu dùng thiếu protein ở các nước đang phát triển cũng như là một thành phần chức năng cho ngành công nghiệp đậu phộng. Sản xuất PPC làm tăng thêm giá trị cho bột đậu phộng tách béo, và là một sản phẩm phụ trong sản xuất dầu đậu phộng. Tính chất chức năng của các loại bột protein đậu phộng và đậu phộng tập trung chủ yếu ở sự hòa tan protein. Protein với những liên kết dầu- nước cao được mong muốn để sử dụng trong các loại thịt, xúc xích, bánh mì, và bánh ngọt trong khi protein có khả năng nhũ hóa cao lại tốt cho xúc xích, xúc xích xông khói, súp và salad dressing. Lên men bột protein đậu phộng và thu nhận protein concentrate cho thấy những tính chất chức năng tốt hơn protein chưa lên men và thu nhận protein concentrate, đặc biệt là khả năng giữ nước và khả năng nhũ hóa. PPC sấy phun được phát triển từ bột đậu phộng rang có khả năng giữ dầu tốt hơn và khả năng nhũ hóa tốt hơn và phù hợp để sử dụng trong các sản phẩm như thịt và xúc xích. Khả năng nhũ hóa cực kỳ tốt của loại PPC này làm cho nó trở thành ứng cử viên cho các công thức thức ăn đòi hỏi khả năng nhũ hóa cao như salad dressing và kem súp. Độ nhớt thấp của hệ phân tán PPC ở nhiệt độ phòng và độ nhớt cao hơn trong lúc gia nhiệt làm cho PPC trở thành một chất làm đặc cho súp giàu protein. Ngoài ra, một thực tế là PPC được phát triển từ bột đậu phộng rang tách béo là một lợi thế quan trọng đối với ngành công nghiệp sản xuất dầu đậu phộng vì bột đậu phộng rang tách béo là một sản phẩm phụ rẻ tiền trong sản xuất dầu đậu phộng. Vì vậy, protein đậu phộng isolate và concentrate có khả năng tăng thêm giá trị cho ngành công nghiệp đậu phộng và cung cấp nguồn xử lý thực phẩm với giá cả phải chăng từ nguồn protein thực vật với hương vị đồng nhất và đặc tính chức năng đặc trưng. CHƯƠNG 4: BỆNH DỊ ỨNG VÀ PROTEIN GÂY DỊ ỨNG TRONG ĐẬU PHỘNG BỆNH DỊ ỨNG Bệnh dị ứng [13], [3] Dị ứng là từ chung để chỉ các phản ứng khác nhau của cơ thể đối với các chất như phấn hoa, lông mèo hoặc các chất khác, mà cơ thể cho là lạ từ bên ngoài vào. Thống kê cho thấy khoảng 15% dân số hiện nay mắc bệnh dị ứng và nhiều trường hợp bị dị ứng nặng. Dị ứng là do hệ miễn dịch của cơ thể quá mẫn cảm. Hệ miễn dịch dị ứng nhận nhầm một chất vốn không có hại thành có hại, sau đó tấn công chất này với cường độ mạnh hơn mức cần thiết. Người có cơ địa dị ứng là người mà cơ thể quá mẫn cảm với một số yếu tố mà phần lớn mọi người thấy chúng lành hoặc không gây hại. Những tác nhân gây dị ứng thông thường là phấn hoa, khói thuốc lá, bụi nhà máy, lông súc vật hoặc biểu bì súc vật (gầu), một số loại thực phẩm, bụi nhà và trong một số ít trường hợp tiếp xúc với không khí hoặc nước quá lạnh cũng gây phản ứng dị ứng. Tình hình dị ứng đậu phộng trên thế giới [22], [18], [9], [8], [15], [17] Tỷ lệ dị ứng đậu phộng ở các nước phương Tây đã được tính là cứ 1000 người thì có 1 người bị dị ứng với đậu phộng, thậm chí có những nước cứ 200 người thì có 1 người bị dị ứng với đậu phộng. Người ta nhận thấy rằng tỷ lệ bị dị ứng đậu phộng đang gia tăng trong những năm vừa qua. Tỷ lệ mắc bệnh dị ứng với đậu phộng ở trẻ dưới 5 tuổi ở Mỹ được báo cáo là đã tăng gấp đôi trong 5 năm từ 1998 đến 2003 (Sampson.2003). Một nghiên cứu khác báo cáo rằng dị ứng đậu phộng chiếm 28% số ca bị dị ứng thực phẩm ở trẻ em (Moneret-Vautrin, et al., 1998). Có một điều khá thú vị là tỷ lệ mắc các bệnh dị ứng đậu phộng ở các nước khác nhau là khác nhau, thông thường những người nhập cư vào Mỹ có mức độ dị ứng thực phẩm thấp hơn so với người Mỹ, nhưng khi theo cùng chế độ ăn uống và lối sống của người Mỹ thì nhanh chóng có cùng mức độ dị ứng như dân bản địa. Nguyên nhân của hiện tượng này hiện nay vẫn đang là một câu hỏi cho các nhà nghiên cứu . Trong báo cáo năm 2001 về 32 trường hợp tử vong do phản ứng phản vệ của cơ thể với các loại thực phẩm (báo cáo thực hiện tại Mỹ), đậu phộng được xác định là nguyên nhân gây ra 14/32 số ca tử vong. Khi nghiên cứu các trường hợp tử vong này, người ta thấy hầu hết các nạn nhân đều bị dị ứng thực phẩm và bị suyễn trước khi bị tử vong (Bock, et al., 2001). Tuy nhiên ở Trung quốc thì số người bị dị ứng với đậu phộng lại thấp hơn rất nhiều so với Mỹ, mặc dù Trung Quốc là nơi tiêu thụ đậu phộng rất lớn. Trong 29 trẻ em tuổi từ 2-12 ở Trung Quốc được nghiên cứu, thì thấy chúng không có dấu hiệu dị ứng lâm sàng đối với đậu phộng. Thật thú vị, dân số người Mỹ gốc Hoa sống tại Mỹ đã có một tỷ lệ dị ứng đậu phộng tương tự với dân số Mỹ nói chung (Beyer, et al., 2001). Tại Úc tỷ lệ bị tử vong do dị ứng đậu phộng ở trẻ em dưới 5 tuổi được ghi nhận là trong vòng 30 năm thì chỉ có một ca bị tử vong, tỷ lệ trẻ em Úc có nguy cơ dị ứng với đậu phộng ở mức độ nghiêm trọng là chỉ có 0.25%, thử nghiệm trên da cho dị ứng đậu phộng trong 456 trẻ em ở Tasmanian tuổi từ 7-8 tất cả đều là âm tính (Kemp, 2005). Một báo cáo gần đây từ Đức cho thấy 103 trường hợp sốc phản vệ được báo cáo bởi bản câu hỏi của bác sĩ trong năm 2004, các loại thực phẩm là trường hợp thường xuyên nhất gây phản ứng phản vệ (chiếm 57%), tiếp theo là do côn trùng chích (chiếm 13%) và liệu pháp thuốc tiêm miễn dịch (chiếm 12%). Đậu phộng và các hạt cây là loại thực phẩm thường xuyên nhất gây ra các phản ứng phản vệ (Mehl, et al., 2005). Tại Canada, tỷ lệ dị ứng đậu phộng được xác định ở trẻ em từ lớp mẫu giáo đến lớp 3 tại trường được lựa chọn ngẫu nhiên ở Montreal là ở khoảng 1.5%-1.76%. Nghiên cứu này bao gồm một bản câu hỏi, tiếp theo là xét nghiệm trên da, đo lường kháng thể IgE đặc hiệu đậu phộng, và các bài kiểm tra thử thách đậu phộng bằng miệng (Kagan, et al., 2003). Những ví dụ này chỉ ra sự chênh lệch lớn về phản ứng phản vệ với đậu phộng ở các nước trên khắp thế giới. Chắc chắn, tỷ lệ mắc dị ứng đậu phộng ở Mỹ cao hơn ở bất kỳ nước nào khác. Nhiều ý kiến đã được đưa ra để giải thích cho hiện tượng này, có ý kiến cho rằng đó là do sự khác biệt trong giống đậu phộng tiêu thụ tại mỗi nơi hoặc sự khác biệt trong phương pháp chế biến đậu phộng cung cấp tại thị trường bán lẻ, sự khác biệt trong khuynh hướng di truyền dân số. Cơ chế gây dị ứng Dị ứng được định nghĩa là những tác động xấu đến sức khỏe mà có thể là kết quả của sự kích thích của một phản ứng miễn dịch cụ thể. Bệnh dị ứng có thể có nhiều hình thức và phát triển bình thường trong hai giai đoạn. Giai đoạn đầu thường gọi là giai đoạn mẫn cảm xảy ra khi một cá nhân mẫn cảm được tiếp xúc lần đầu tiên với một chất gây dị ứng gây đủ số lượng để kích thích một phản ứng miễn dịch cơ bản. Nếu các cá nhân này tiếp xúc với các chất gây dị ứng vào một lần tiếp theo thì sau đó một phản ứng miễn dịch xảy ra, dẫn đến phản ứng quá mẫn cảm gây liên quan tới các cơ quan của người bệnh (giai đoạn II). Để có thể hiểu rõ hơn về cơ chế gây dị ứng ta hãy xem sơ đồ sau : Lần 1: tiếp xúc với chất dị ứng lần đầu Tác nhân gây dị ứng (A) Đi vào trong cơ thể người Tiếp xúc trong môi trường APC (A) bị bao bọc trong môi trường APC (A) tiếp xúc với tế bào lympho-T Giải phóng ra Cytokine Cytokine tiếp xúc với tế bào (B) hình thành tế bào Plasma Sản xuất ra kháng thể IgE Kháng thể IgE tiếp xúc với tế bào Mast Hình thành lên một tế bào mới, tạm gọi là tế bào (H) Lần 2 : tiếp xúc tác nhân gây dị ứng ở các lần tiếp theo Tác nhân gây dị ứng (A) (A) tiếp xúc với tế bào (H) Hình thành nên Histamin Histamin đi vào máu gây giãn mạch máu Xuất hiện các biểu hiện của dị ứng Ở lần đầu tiên tiếp xúc (do ăn phải, hít phải, tiếp xúc ngoài da) với các chất gây dị ứng các chất gây dị ứng sẽ đi vào bên trong cơ thể, nó đi vào trong môi trường APC, bị bao bọc trong môi trường APC sau đó chất gây dị ứng này tiếp tục đi sâu vào bên trong cơ thể và gặp tế bào lympho T, khi gặp chất gây dị ứng này thì ngay lập tức tế bào lympho T giải phóng ra một chất mà người ta gọi là cytokine, cytokine mới được sinh ra tiếp xúc với tế bào B trong cơ thể, hình thành lên tế bào Plasma, chính tế bào plasma sản xuất ra một loại kháng thể gọi là kháng thể IgE . Kháng thể IgE này khi gặp phải tế bào Mast sẽ hình thành lên một tế bào mới mà trong bài này em xin tạm gọi là tế bào (H). Ở lần tiếp xúc với chất gây dị ứng (cùng một chất gây dị ứng) tiếp theo, khi chất gây dị ứng đi vào bên trong cơ thể bệnh nhân và tiếp xúc với tế bào (H) (sinh ra do sự kết hợp của IgE và tế bào Mast) thì sẽ sinh ra histamine, khi histamine đi vào mạch máu sẽ gây giãn mạch máu khi đó bệnh nhân sẽ có dấu hiệu bị dị ứng: da bị mẩn đỏ, sưng tấy, nôn, nghẹt thở, tức ngực … Các triệu chứng của bệnh dị ứng đậu phộng Người ta đã nghiên cứu và tìm ra 4 hệ thống bộc lộ dấu hiệu dễ nhận biết nhất đó là: Da thường hay bị nổi mề đay, màu da có màu đỏ đặc biệt là vùng da ở mặt, thậm chí còn bị sưng tấy . Đường hô hấp có hiện tượng: thở khò khè, ho, khó thở, nghẹt mũi, cổ họng như bị siết chặt. Đường tiêu hóa: người bệnh bị nôn mửa, tiêu chảy và đau bụng . Hệ thống tim mạch: người bệnh bị tụt huyết áp, nhịp tim không đều thậm chí nặng hơn là tim ngừng đập. Báo cáo năm 2003 (Al-Muhsen, et al., 2003) chỉ ra rằng phản ứng dị ứng đậu phộng đầu tiên thường xuất hiện giữa 14 và 24 tháng tuổi, và thường xảy ra ở nhà. Theo một nghiên cứu tại Mỹ (Sicherer, et al 2001) nơi mà có số ca dị ứng đậu phộng lớn nhất trên thế giới thì 50% trẻ em bị dị ứng đậu phộng có triệu chứng trong một hệ thống cơ quan (một trong bốn hệ thống cơ quan đã nói ở trên), 30% có các triệu chứng trong hai hệ thống, 10-15% trong ba hệ thống, và 1% trong bốn hệ thống. Các phương pháp chẩn đoán dị ứng đậu phộng [12] Theo (Roberts, et al., 2005) thì việc chẩn đoán dị ứng đậu phộng bao gồm bốn bước chính sau : Bước 1: người ta sẽ tìm hiểu về bệnh sử của người bệnh Bước 2: người ta sẽ tiến hành các xét nghiệm với da của người bệnh Bước 3: tiến hành xét nghiệm máu để biết xem có sự xuất hiện kháng thể IgE trong máu người bệnh hay không. Kháng thể IgE đặc hiệu đậu phộng trong máu được đo bằng một bài kiểm tra gọi là radioallergosorbent (RAST) Bước 4: người ta sẽ cho bệnh nhân tiêu thụ một lượng đậu phộng (tất nhiên lượng đậu phộng này phải được cân nhắc kĩ lưỡng tránh trường hợp có thể đe dọa tính mạng cho bệnh nhân) để xem các triệu chứng của bệnh nhân Xét nghiệm RAST dùng để đo nồng độ của kháng thể IgE trong máu người bệnh, cách làm như sau: Bước 1: bệnh nhân được trích máu và mẫu máu này được tách bỏ hết hồng cầu bạch cầu, phần còn lại chính là huyết thanh (serum). Mẫu huyết thanh này sau đó được gửi đến phòng thí nghiệm để làm xét nghiệm. Bước 2: lấy một lượng kháng nguyên KN (đã biết khối lượng là m), mà các phân tử KN liên kết với 1 chất không hòa tan cho vào ống nghiệm N. Kháng nguyên liên kết với chất không hòa tan ký hiệu là kt (kết tủa) trở thành KNkt. Sở dĩ dùng chất không hòa tan là vì cho phép ta tách riêng hỗn hợp kết tủa ra cùng với những gì liên kết với nó (sau khi xả hết dung dịch cùng với những gì hòa tan cùng trong dung dịch). Bước 3: cho huyết thanh của bệnh nhân vào N, lượng huyết thanh đã biết là m2. Trong huyết thanh của bệnh nhân có các kháng thể KT (với nồng độ chưa biết). Các kháng thể này sẽ bám vào KNkt. Nếu nồng độ kháng thể càng cao thì sẽ có càng nhiều kháng thể bám vào các các KNkt, KNkt trở thành KT-KNkt. Tách kết tủa KT-KNkt ra. Bước 4: một lượng kháng thể khác đã được đánh dấu bằng phóng xạ (px) (chất phóng xạ để đánh dấu thường là 1 đồng vị px 131 của Iốt) với khối lượng là m3 cho vào N. Các KT phóng xạ (KTpx) này sẽ bám vào các KT-KNkt. Càng nhiều KT-KNkt thì sẽ càng nhiều KTpx bám vào, và thu được KTpx - KT-KNkt. Tách kết tủa KTpx - KT-KNkt ra. Bước 5: đo độ phóng xạ của KTpx-KT- KNkt. Nếu như lượng KT trong huyết tương ban đầu càng nhiều thì rõ ràng độ phóng xạ này sẽ càng lớn. Bước 6: bác sĩ hoặc chuyên gia sẽ kết luận. PROTEIN GÂY DỊ ỨNG TRONG ĐẬU PHỘNG Các loại protein gây dị ứng trong đậu phộng [7], [11], [16], [24] Đậu phộng chứa nhiều protein khác nhau, mỗi loại có cấu trúc riêng biệt của nó. Một số protein trong số này gây dị ứng, và có thể kích hoạt các kháng thể IgE - mỗi phân tử kháng thể được đặc hiệu với một chất gây dị ứng nhất định. Các protein gây dị ứng đậu phộng đặc trưng và được đặt tên. Chúng bao gồm: • Ara h1 • Ara h7 • Ara h2 • Ara h8 • Ara h3 •Arah Agglutinin • Ara h4 • Ara h LTP • Ara h5 • Ara h Oleosin • Ara h6 • Ara h TI Hình 4.1. Cấu trúc Ara h1 Hình 4.2. Cấu trúc Ara h2 và Ara h6 Lượng tương đối của từng chất gây dị ứng đặc hiệu sẽ ảnh hưởng đến từng cá nhân một cách khác nhau, có thể một người mẫn cảm nhiều với một loại protein (A nào đó trong đậu phộng chẳng hạn) và người đó thì lại ít mẫn cảm với loại protein (B nào đó trong đậu phộng chẳng hạn) nhưng một người khác thì lại mẫn cảm nhiều với loại protein B trong đậu phộng và lại ít mẫn cảm với protein A trong đậu phộng.Vì vậy giả định cho rằng tất cả các protein gây dị ứng được trong đậu phộng đều có tầm ảnh hưởng như nhau trên tất cả các cá nhân là hoàn toàn sai lầm. Trong số các protein trong đậu phộng gây dị ứng kể trên thì có những protein được phát hiện thường xuyên trong việc đóng vai trò là nguyên nhân gây dị ứng cho người. Ví dụ, trong một nghiên cứu gần đây, Ara h2 đã được công nhận là chất gây dị ứng mạnh nhất trong tất cả các xét nghiệm về việc kích hoạt triệu chứng gây dị ứng, và thực sự nó gây ra một phản ứng dị ứng ở nồng độ rất thấp, trong khi Ara h1 và Ara h3 thì gây phản ứng dị ứng ở mức độ yếu hơn và phản ứng chỉ xảy ra ở nồng độ cao hơn gấp trăm lần Ara h2. Vì vậy nhà nghiên cứu kết luận dựa trên nhóm bệnh nhân mà họ nghiên cứu rằng Ara h2 là chất gây dị ứng đậu phộng quan trọng nhất, một vài loại của các protein khác cũng gây ra những phản ứng dị ứng nhưng yếu hơn và ở nồng độ cao hơn rất nhiều (Koppelman, Wensing, et al., 2004). Burks và các cộng sự ( Burks AW, et al, 1992) đã tiến hành phân lập 2 chất gây dị ứng chủ yếu trong đậu phộng đó là Ara h1 và Ara h2. Đây là các glycoprotein với điểm isoelectric và trọng lượng phân tử tương ứng là 4.55 và 63,500 Dalton và 5.2 và 17,000 Daltons tương ứng. Phân tích cấu trúc của Ara h2 thu nhận từ đậu phộng sống bằng quang phổ tử ngoại người ta xác định Ara h2 có 31% là các sợi hình xoắn ốc, 10% bằng sợi đơn và 59% là những vòng cuộn lại ngẫu nhiên, khi xử lý Ara h2 thu nhận từ đậu phộng sống với DTT ( Dithioreitol) nồng độ 50 mmol/l để qua đêm (15h) sau đó khử muối rồi đem đi phân tích cấu trúc thì thấy các sợi hình xoắn ốc đã giảm từ 5-10%. Còn ở Ara h2 thu nhận từ đậu phộng rang có 29% là sợi hình xoắn ốc, 12% là các sợi đơn và 59% các vòng cuộn lại ngẫu nhiên. Trong một nghiên cứu khác (Becker, et al, 2001.) các tác giả tính toán tỷ lệ mẫn cảm với mỗi chất gây dị ứng trong số lượng 40 bệnh nhân mẫn cảm với đậu phộng. Kết quả của họ chỉ ra rằng ngoài Ara h1 (tỷ lệ 65%) và Ara h2 (tỷ lệ 85%), Ara h4 (53%) cũng là những chất gây dị ứng chính, còn Ara h5 (13%), Ara h6 (38%) và Ara h7 (43%) là những tác nhân gây dị ứng phụ. Có một điều đáng nói ở đây là, mặc dù Ara h6 được coi là một chất gây dị ứng phụ, các tác giả thấy rằng sự mẫn cảm với Ara h6 có các triệu chứng lâm sàng nặng hơn so với hầu hết các chất gây dị ứng khác. Nghiên cứu trong tương lai chắc chắn sẽ chứng minh được rằng: có thể các protein gây dị ứng trong đậu phộng thì có những kích thích phản ứng dị ứng rất mạnh đối với một dân tộc cụ thể này nhưng lại có những kích thích phản ứng dị ứng yếu hơn đối với dân tộc khác. Một điều đáng nói nữa là những ảnh hưởng bởi các phương pháp chế biến khác nhau trong sản xuất thực phẩm của đậu phộng. Điều này có thể giải thích tại sao một số vùng dân cư người dân có nguy cơ bị dị ứng với đậu phộng cao hơn nhiều so với các vùng dân cư khác. Trong tương lai sự hiểu biết về cấu trúc phân tử của các chất chủ yếu gây dị ứng trong đậu phộng và các phản ứng miễn dịch đặc hiệu đậu phộng sẽ dẫn đến các phương pháp hiệu quả để chẩn đoán, trị liệu, và các chiến lược phòng, chống dị ứng với đậu phộng (Scurlock và Burks, 2004). Chúng ta cũng có thể dùng kỹ thuật di truyền để loại bỏ các protein gây dị ứng độc nhất. Tính chất của các protein gây dị ứng trong đậu phộng 2.1. Ảnh hưởng của quá trình chế biến (nhiệt) đến đặc tính gây dị ứng của protein[38] a) Tính gây dị ứng của protein đậu phộng tăng lên trong quá trình rang Protein đậu phộng giống như nhiều protein gây dị ứng cao trong thực phẩm, chúng không bị xuống cấp ở nhiệt độ cao và chúng vẫn duy trì khả năng kích hoạt một phản ứng dị ứng. Trong một thí nghiệm về ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng phản ứng gây dị ứng người ta trích ly protein tinh khiết từ đậu phộng và chia ra làm 4 mẫu như nhau, sau đó gia nhiệt lần lượt từng mẫu lên 500C, 800C, 900C, 1000C. Các cuộc nghiên cứu đã chứng minh việc rang đậu phộng góp phần làm tăng khả năng gây dị ứng của các protein gây dị ứng so với khi chế biến bằng phương pháp khác như là luộc, nấu ăn (Maleki, et al., 2000). Điều này được chứng minh là ở Mỹ tỷ lệ người dân mắc bệnh dị ứng rất cao vì người Mỹ rất thích những sản phẩm của đậu phộng được chế biến qua quá trình rang, điển hình là bơ đậu phộng, ngược lại ở Trung Quốc nơi mà tỷ lệ người dân mắc bệnh dị ứng đậu phộng thấp nhất thế giới vì người Trung Quốc thích ăn đậu phộng luộc. Như vậy yếu tố chính ảnh hưởng đến sự gia tăng dị ứng của protein đậu phộng rang là do nhiệt độ cao đạt tới trong quá trình rang so với quá trình luộc hoặc nấu. b) Tính tan của protein đậu phộng giảm trong quá trình gia nhiệt Tuy nhiên nhiệt độ quá cao đạt được trong quá trình rang lại có những ảnh hưởng trong việc thay đổi dạng protein thành dạng không hòa tan nhiều hơn so với protein trong nguyên liệu ban đầu. Tính tan của protein đậu phộng giảm trong quá trình gia nhiệt cũng là một nguyên nhân giải thích tại sao protein đậu phộng khi được gia nhiệt lại có khả năng gây dị ứng cao hơn là khi không được gia nhiệt hoặc chỉ được gia nhiệt ở nhiệt độ thấp. Vì khi mà protein đậu phộng có độ hòa tan thấp nghĩa là chỉ có một phần protein hòa tan đi vào trong đường tiêu hóa của con người, khi đó phần còn lại không hòa tan được sẽ tránh khỏi việc bị các enzyme trong hệ tiêu hóa phân hủy. Những protein không hòa tan này đóng vai trò như là một nguồn dự trữ liên tục các chất gây dị ứng để bổ sung vào hệ tiêu hóa sau khi các protein ở dạng hòa tan trước đó đã bị phân hủy và loại khỏi cơ thể. 2.2. Phản ứng maillard làm tăng khả năng gây dị ứng của protein đậu phộng [23] Một trong những phản ứng điển hình của protein là phản ứng maillard, phản ứng này là sự kết hợp các acide amin với đường để tạo thành các hợp chất như cacboxymethyl lysine, malaneidin. Việc này có thể làm giảm giá trị dinh dưỡng gây những tác động sinh lý và thậm chí là việc gây ra chất độc ảnh hưởng đến hệ thống miễn dịch của con người, làm hao hụt và thay đổi các acide amin, nhóm sulfdryl tự do. Tuy nhiên đây cũng là một phản ứng quan trọng góp phần làm thay đổi hương vị và màu sắc của thực phẩm, trong một số trường hợp phản ứng maillard làm tăng tính cảm quan của thực phẩm. Người ta đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của phản ứng maillard đến khả năng gây dị ứng của protein đậu phộng. Hình 4.3: Sơ đồ chung của phản ứng maillard và sự hình thành các sản phẩm cuối Trên đây là sơ đồ hình thành phản ứng maillard, đầu tiên là sự kết hợp của protein đậu phộng để hình thành các nhóm schiffbase, schiffbase tiếp tục bị oxy hoá để tạo thành amodori. Sản phẩm amodori trải qua một phản ứng dehydrate để tạo thành glucosone (diketone), là trung gian để tạo thành AGE (advanced glycation end product). Các protein đậu phộng sau khi tham gia phản ứng maillard trở nên kháng (tồn tại lâu) trong enzyme tiêu hóa Để chứng minh điều này người ta thực hiện thí nghiệm sau: chuẩn bị 11 mẫu (từ 1 đến 11) Ara h1 tinh khiết, từ mẫu 6 đến mẫu 11 được cho thêm đường fructose, sau đó được gia nhiệt để xảy ra phản ứng maillard. Sau đó cho Gastric Secretions (GS) được lấy từ dạ dày của một người được giữ đói vào cả 11 mẫu, tiếp theo ủ ấm cả 11 mẫu ở 370C trong tủ ấm theo thứ tự thời gian như sau: Bảng 4.1: Bảng chuẩn bị mẫu thí nghiệm protein đậu phộng với enzym tiêu hóa Mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Thời gian 5 phút 10 phút 30 phút 180 phút 15 giờ 0 phút 5 phút 10 phút 30 phút 180 phút 15 giờ Rồi đem ra phân tích điện di SDS-PAGE ta thu được kết quả sau: Hình 4.4: Phân tích ảnh hưởng của phản ứng maillard đến khả năng kháng enzyme tiêu hóa Nhìn trên hình phân tích ta thấy ở các mẫu từ 1 đến 3 khi mà không có phản ứng maillard và có sự có mặt của GS trong thời gian ngắn thì các Ara h1 bị phân hủy thành những protein có khối lượng phân tử trung bình (< 64kDa), còn ở các mẫu 4 và 5 khi mà khoảng thời gian là khá lâu (3h và 15h) thì hầu như các Ara h1 đã bị phân hủy thành các protein có khối lượng phân tử nhỏ hơn 20kDa. Trong khi đó chúng ta quan sát thấy ở các mẫu từ mẫu 6 đến 11 (có phản ứng maillard và sự hiện diện của GS) thì Ara h1 bị phân hủy rất ít, đa số chúng có khối lượng phân tử lớn hơn 98kDa. Phản ứng maillard làm cho các protein dị ứng trong đậu phộng bền hơn khi bị tác động bởi nhiệt Người ta đã nghiên cứu và đi đến kết luận là khi protein gây dị ứng trong đậu phộng tham gia phản ứng thì chúng có khả năng tồn tại bền vững dưới tác động của nhiệt, người ta đã làm thí nghiệm như sau: Đầu tiên chuẩn bị mẫu theo bảng kê bên dưới (WPE: Whole peanut extract-dịch chiết từ đậu phộng, Allergen- các chất gây dị ứng chiết xuất từ đậu phộng). Bảng 4.2: Bảng chuẩn bị mẫu thí nghiệm protein đậu phộng với nhiệt độ Mẫu 1 2 3 5 6 7 Nguyên liệu WPE WPE WPE Allergen Allergen Allergen Đường Không có Có Không có Có Không có Có Tác động Không gia nhiệt Gia nhiệt Không gia nhiệt Gia nhiệt Gia nhiệt Không gia nhiệt Sau khi đã chuẩn bị các mẫu như bảng trên ta tiến hành mang các mẫu đi phân tích điện di và thu được kết quả như hình ảnh bên dưới: Hình 4.5: Phân tích điện di SDS-PAGE của các protein đậu phộng có và không tham gia phản ứng Maillard Quan sát trên hình 4.5 ta thấy ở mẫu 2 (gồm có WPE + đường và gia nhiệt đến khi xảy ra phản ứng Maillard), hình ảnh protein Ara h1 được thấy rõ nhất. Ở mẫu 3 (chỉ có WPE, không có đường và được gia nhiệt) thì thấy các vết protein hiện ra rất mờ, chứng tỏ protein đã bị phân hủy bởi nhiệt độ. Bây giờ ta so sánh hình ảnh ở mẫu 5 và mẫu 6. Ở mẫu 5 (gồm có Allergen + Glucose và được gia nhiệt đến khi xảy ra phản ứng Maillard) thấy hình ảnh Ara h1 hiện lên rất rõ, còn ở mẫu 6 (chỉ có Allergen và được gia nhiệt) thấy hình ảnh Ara h1 rất mờ, chứng tỏ nó đã bị phân hủy bởi nhiệt độ. Rõ ràng là phản ứng Maillard góp phần làm tăng tính bền vững của protein gây dị ứng trong đậu phộng đối với nhiệt độ. 2.3. Protein gây dị ứng trong đậu phộng có khả năng ức chế enzyme tiêu hóa Cũng giống như các protein khác, protein gây dị ứng Ara h1 và Ara h2 cũng bị các enzyme trong hệ thống tiêu hóa con người phân hủy, tuy nhiên sự phân hủy này là nhỏ hơn so với các loại protein thông thường khác vì chúng có khả năng ức chế các enzyme. Thí nghiệm thực tế cho thấy rằng các Ara được thu nhận từ đậu phộng rang thì có khả năng ức chế enzyme tiêu hóa mạnh gấp 3 lần so với các Ara thu nhận từ đậu phộng sống. Một điều thú vị mà người ta nhận thấy là Ara h2 có khả năng bảo vệ Ara h1 khỏi sự phân hủy của các enzyme tiêu hóa. Để minh chứng cho điều này người ta tiến hành thí nghiệm sau: Chuẩn bị 3 mẫu chứa Ara h1 tinh khiết, sau đó cho enzyme trypsin vào 3 mẫu này với cùng một lượng như nhau (kí hiệu 3 mẫu lần lượt là 1, 2, 3). Thêm Ara h2 vào mẫu 2 Thêm Ara h2 vào mẫu 3 nhưng với hàm lượng nhỏ hơn vào mẫu 2 Mẫu 1 là mẫu đối chứng nên ta không cho thêm Ara h2 vào mẫu 1 Sau đó cất 3 mẫu này vào tủ ấm giữ ở 370C và để qua đêm (15h). Tiếp theo mang 3 mẫu này đi phân tích điện di SDS-PAGE để xác định hàm lượng Ara h1 còn lại trong mẫu, người ta thu được kết quả như sau: - Hàm lượng Ara h1 còn lại trong mẫu 2 là lớn nhất, sau đó tới mẫu 3 và thấp nhất là mẫu 1. Như vậy, điều này đã chứng minh Ara h2 có vai trò bảo vệ Ara h1 khỏi sự phân hủy của enzyme trypsin. Sở dĩ ở mẫu 1 hàm lượng Ara h1 còn lại là thấp nhất vì nó không có Ara h2 để bảo vệ. Còn ở mẫu 3 Ara h1 còn lại ít hơn mẫu 2 là do hàm lượng Ara h2 ở mẫu 3 ít hơn so với mẫu 2, vì vậy khả năng ức chế enzyme trypsin cũng bị giảm đi. 3. Cải thiện tính chất gây dị ứng của protein đậu phộng 3.1. Rút ngắn khả năng gây dị ứng của chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng[35] Các hợp chất phenolic hình thành nên các phức hòa tan và không hòa tan với protein. Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định xem các phenolic như axit caffeic, ferulic, chlorogenic có hình thành phức không hòa tan và không thuận nghịch với chất gây dị ứng chủ yếu trong đậu phộng hay không và nếu có thì phức này có làm giảm immunoglobulin (IgE) hay không. Sau khi thêm mỗi phenolic vào chiết xuất từ ​​đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng, nguyên liệu hòa tan được phân tích bởi SDS-PAGE và ức chế cạnh tranh ELISA. Kết quả cho thấy việc bổ sung các phenolic kết tủa hầu hết các chất gây dị ứng chủ yếu trong đậu phộng, Ara h 1 và Arah 2, và phức tạo thành là không thuận nghịch. Tổ hợp IgE đã giảm khoảng 10 -16 lần. Điều đó kết luận rằng việc giảm tổ hợp IgE bởi các phenolic là khả thi. Theo nghiên cứu, đã được chứng minh bởi các nghiên cứu lâm sàng, nó có thể dẫn đến sự phát triển của sản phẩm từ đậu phộng dạng lỏng nghèo chất gây dị ứng. Ảnh hưởng của phenolic lên chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng Sau khi xử lý với phenolic (acid caffeic, acid chlorogenic và acid ferulic), một số protein trong chiết xuất từ ​​đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng đã được giảm. Trong số các protein đã được giảm là các chất gây dị ứng chủ yếu trong đậu phộng, Ara h 1(63 kDa) và Ara h 2 (18-20 kDa). Ngược lại, protein giữa 27 kDa và 35 kDa và dưới 12 kDa không giảm nhưng hòa tan trở lại. Theo kết quả xử lý phenolic, ta thu được kết tủa hay phức chất. Phân tích các kết tủa bởi SDS-PAGE đã xác nhận sự hiện diện của hai chất gây dị ứng quan trọng trong đậu phộng. Theo Spencer et al.(1988) và Baxter et al. (1997), kết tủa hoặc phức của các protein có thể là không thuận nghịch thông qua tương tác đa chiều (ví dụ như nhiều phenolic có thể liên kết với một phân tử protein) hoặc một phenolic có thể liên kết với protein ở nhiều vị trí hoặc một protein. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy rằng phức các chất gây dị ứng trong đậu phộng với phenolic không hòa tan trong NaCl 1M hoặc urê 2M là không thuận nghịch. Mặc dù xử lý với phenolic, nhưng vẫn còn xuất hiện một số chất gây dị ứng hòa tan còn lại trong các dung dịch mẫu. Do đó, chúng ta thực hiện lặp đi lặp lại việc tạo phức (xử lý 2 lần) để xác định xem nó có giúp cho kết tủa các chất gây dị ứng còn lại (Lưu ý: xử lý hơn 2 lần là không cần thiết dựa trên các dữ liệu được thảo luận dưới đây). Các mẫu đậu phộng như vậy được xử lý liên tục, sau đó được phân tích bằng SDS-PAGE so với các mẫu đã được xử lý một lần với hợp chất phenolic. Việc xử lý một protein điển hình trong mẫu bơ đậu phộng dạng lỏng ở những thời điểm khác nhau với acid cafeic được minh họa trong hình 4.7. Tổng tổn thất của protein (bao gồm cả các protein hòa tan khác ngoài các chất gây dị ứng chủ yếu trong đậu phộng) với mẫu được xử lý liên tục được so sánh với các mẫu đã được xử lý một lần. Điều này cho thấy việc lặp lại tạo phức không chỉ loại bỏ chất gây dị ứng chủ yếu trong đậu phộng mà còn loại bỏ một số protein hòa tan còn lại. Trong trường hợp này, tạo phức nhiều lần có thể dùng để sản xuất một sản phẩm đậu phộng không còn là đậu phộng- một trích dẫn từ Burks (2008) đã chỉ ra, trong tham chiếu đến việcphát triển đậu phộng biến đổi gen không chứa các chất gây dị ứng, việc mà thay đổi đủ để làm biến đổi các chất gây dị ứng trong đậu phộng theo hướng giảm phản ứng dị ứng có thể dẫn đến việc sản xuất sản phẩm không còn là đậu phộng. Do thiếu protein, đậu phộng biến đổi có thể không có giá trị dinh dưỡng và mất hương vị do sự mất mát của liên kết protein trong phản ứng Maillard (Chung & Champagne, năm 2001; Cämmerer & Kroh, 2009). Với sự thiếu giá trị dinh dưỡng và hương vị đậu phộng, các sản phẩm đậu phộng biến đổi đó không được chào đón bởi người tiêu dùng. Trên cơ sở đó, nghiên cứu này không sử dụng việc tạo phức nhiều lần để loại bỏ những các chất gây dị ứng trong đậu phộng. Do phức của chất gây dị ứng và phenolic là không tan nên chúng không thể được tiêu hóa bằng enzyme tiêu hóa. Nên nếu ăn phải, chúng không được tiêu hóa và hấp thụ qua cơ thể con người, và cuối cùng sẽ bài ​​tiết ra khỏi cơ thể. Điều này kết hợp với việc giảm lượng chất gây dị ứng hòa tan trong đậu phộng. Kết quả này làm chúng ta tin rằng xử lý các chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng với phenolic có thể giảm gây dị ứng hoặc làm yếu tổ hợp IgE. Nhìn chung, các dữ liệu chứng minh rằng, với ba phenolic kiểm tra đã làm kết tủa các chất gây dị ứng trong đậu phộng không thuận nghịch. Trong số ba phenolic, acid caffeic có hiệu quả nhiều hơn trong việc kết tủa protein hơn so với chất khác trong bơ đậu phộng dạng lỏng(Hình 4.6). Bơ đậu phộng dạng lỏng Các chiết xuất từ đậu phộng Hình 4.6. SDS-PAGE của các chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng qua xử lý phenolic và không qua xử lý. M= điểm đánh dấu, 1=xử lý ferulic, 2= xử lý chlorogenic, 3= xử lý caffeic Bơ đậu phộng dạng lỏng Hình 4.7. SDS-PAGE của bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý 1 lần và 2 lần với caffeic. 1= không qua xử lý, 2= xử lý hai lần, 3= xử lý một lần Tổ hợp IgE khi xử lý chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng bằng phenolic Kết quả ở trên cho thấy rằng tổ hợp IgE có thể giảm trên cả chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng do kết tủa của các chất gây dị ứng hòa tan chủ yếu trong đậu phộng (Hình 4.6). Để kiểm tra giả thuyết này, chúng ta thực hiện phương pháp ELISA ức chế cạnh tranh (cisELISA), một trong các xét nghiệm bắt buộc là kiểm tra tổ hợp IgE trong ống nghiệm được đo như là một chỉ số đặc trưng cho khả năng gây dị ứng của các mẫu đậu phộng. Trong khảo nghiệm, xử lý phenol và không xử lý phenol trên chiết xuất từ ​​đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng được thử nghiệm sự ức chế của nó trên tổ hợp IgE. Trong trường hợp này, các chất gây dị ứng trong mẫu càng nhiều thì sự ức chế và gây dị ứng trong mẫu càng nhiều. Kết quả (Hình 4.8) cho thấy tác dụng ức chế đã rõ nét hơn với mẫu không được xử lý (trên đường) hơn so với các chất chiết xuất từ đậu phộng hoặc bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý bằng ​​phenol. Điều này có nghĩa là tổ hợp IgE của mẫu không qua xử lý cao hơn mẫu được xử lý với phenolic. Nói cách khác, tổ hợp IgE của các chất chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng được xử lý với ​​phenol giảm xuống. Và không có sự khác biệt đáng kể trong tổ hợp IgE (P <0,05) giữa ba phương pháp xử lý (acid caffeic, acid chlorogenic và axit ferulic). Để xác định mức độ giảm tổ hợp IgE, các giá trị IC50 của mẫu xử lý phenolic và không được xử lý phenolic được tính toán. IC50 là nồng độ protein cần thiết để ức chế 50% tổ hợp IgE. Trong trường hợp này, IC50 của các chất chiết xuất từ ​​đậu phộng đã xử lý phenolic và không xử lý phenolic xấp xỉ 7 g / ml và 0,7 g / ml (Bảng 4.3). Đối với bơ đậu phộng dạng lỏng đã xử lý phenolic IC50 là 5 g / ml, so với mẫu không qua xử lý là 0,3 g / ml. Trong trường hợp này, mẫu được xử lý với phenolic giảm tổ hợp IgE khoảng 10 - 16 lần so với mẫu không qua xử lý. Điều này cho thấy tổ hợp IgE hay khả năng gây dị ứng của chất chiết xuất từ ​​đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng đã giảm thành công bởi phenolic. Các chiết xuất từ đậu phộng Bơ đậu phộng dạng lỏng Khả năng ức chế (%) Khả năng ức chế (%) Nồng độ chất ức chế( protein, g/ml Nồng độ chất ức chế( protein, g/ml Hình 4.8. Liên kết IgE của các chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng qua xử lý phenolic và không qua xử lý Bảng 4.3. IC50a của mẫu đậu phộng xử lý và không xử lý phenolic Mẫu Không xử lý Xử lý phenolicb Giảm liên kết IgEc Chiết xuất từ đậu phộng 0.7 7 10 lần Bơ đậu phộng dạng lỏng 0.3 5 16 lần a= Nồng độ protein ức chế 50% liên kết IgE b= xử lý caffeic, chlogenic, và ferulic c= chỉ đối với xử lý phenolic Ảnh hưởng của xung ánh sáng tia UV lên chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng [30] Xung ánh sáng tia cực tím (PUV), một công nghệ phi nhiệt, đã được sử dụng để xử lý các chất chiết xuất từ ​​đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng. Mục tiêu là để xác định xem việc xử lý này có làm giảm thuộc tính gây dị ứng của chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng hay không. Mẫu đậu phộng được xử lý PUV bằng cách sử dụng RS Xenon-3000C theo các điều kiện sau: 3 xung / s, 14,6 cm từ trục trung tâm của bóng đèn, 4 phút (đối với chiết xuất đậu phộng) hay 3 phút (đối với bơ đậu phộng dạng lỏng). Sau khi xử lý, các mẫu đậu phộng được ly tâm và các chất lỏng nổi trên mặt được phân tích bằng SDS-PAGE và cạnh tranh ức chế miễn dịch liên kết enzyme khảo nghiệm (cisELISA). Để so sánh, phương pháp đun sôi cũng được thực hiện. SDS-PAGE cho thấy trong khi đun sôi ít tác động đến các chất gây dị ứng trong đậu phộng, thì mẫu xử lý với PUV thể hiện giảm khả năng hòa tan hay cấp độ chất gây dị ứng đậu phộng (63 kDa). Độ hòa tan của các chất gây dị ứng khác (18-20 kDa) là không bị ảnh hưởng. Kết tủa không tan hình thành làm giảm cấp độ của chất gây dị ứng trong mẫu xử lý bằng PUV. cisELISA cho thấy mẫu chưa xử lý có liên kết IgE cao hơn 7 lần so với mẫu xử lý với PUV. Do đó kết luận rằng ánh sáng PUV có hiệu quả trong việc giảm tổ hợp IgE của chất chiết xuất từ ​​đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng. Các nghiên cứu hiện nay cung cấp một hướng tiếp cận với sự phát triển của sản phẩm đậu phộng ít gây dị ứng. Tuy nhiên, việc giảm dị ứng thực tế cần phải được xác nhận bởi các nghiên cứu lâm sàng. SDS-PAGE của chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý PUV Sau khi xử lý ánh sáng PUV, cả hai chất chiết xuất từ ​​đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng cho thấy có sự thay đổi trong khối lượng. Khối lượng giảm khoảng 40% là do bốc hơi nước. Các mẫu được xử lý PUV được ly tâm hoặc để lắng và các chất nổi trên mặt sau đó được đem phân tích điện di SDS-PAGE.Một tài liệu về SDS-PAGE điển hình của chiết xuất từ đậu phộng xử lý PUV thể hiện trong hình 4.9A. Dãy protein tương ứng của chất gây dị ứng 63 kDa và protein 50kDa hầu như không nhận thấy trong các chiết xuất xử lý PUV,so với mẫu chưa qua xử lý, dãy tương ứng từ chất gây dị ứng18 -20kDa còn lại xuất hiện rõ ràng. Điều này cho thấy chỉ có các chất gây dị ứng 63 kDa bị ảnh hưởng bởi PUV ánh sáng. Sự biến mất của nó trong SDS-PAGE cho thấy phần lớn các chất gây dị ứng 63 kDa không nằm trong chiết xuất xử lý PUV là protein hòa tan, nhưng chúng tồn tại như một kết tủa không tan. Hiện tượng keo tụ này đã được chứng minh bởi một số nghiên cứu có sử dụng công nghệ năng lực đỉnh cao như xung điện trường và ma trận, hỗ trợ xung laser để bốc hơi enzym bị vô hoạt(Castro và những người khác năm 2001; Jelinek và những người khác, 2007; Wei và những người khác 2007). Trong những nghiên cứu, các nhà nghiên cứu chứng minh rằng keo tụ là kết quả của sự biến tính protein. Dù PUV ánh sáng trong nghiên cứu này có gây ra sự biến tính protein hay không vẫn chưa được biết. Những điều nêu trên cho thấy việc tìm kiếm chất gây dị ứng 18-20 kDa không phải là một vấn đề cốt lõi bởi vì, như thể hiện trong hình 4.9A, đa số chất gây dị ứng 18 -20kDa vẫn còn hòa tan khi xử lý bằng PUV ánh sáng. Trong những nghiên cứu, các chất gây dị ứng không bị biến tính mà là liên kết chéo với nhau hoặc tạo thành phức không hòa tan với các hợp chất hóa học tự nhiên, kết quả cuối cùng dẫn đến việc giảm mức độ của các chất gây dị ứng và các tổ hợp IgE của các chất chiết xuất từ ​​đậu phộng. Tóm lại, nghiên cứu này cho thấy mức giảm của chất gây dị ứng hòa tan trong chiết xuất từ ​​đậu phộng xử lý bằng PUV. Các tổ hợp IgE của các chất chiết xuất có lẽ sẽ được giảm. Bởi vì các protein cũng có thể keo tụ khi đun sôi(Mills và những người khác 2001), việc xác định ảnh hưởng của quá trình đun sôi đến chất gây dị ứng trong đậu phộng có như PUV ánh sáng hay không được tiến hành (thời gian xử lý là như nhau trong cả hai trường hợp). Beyer và những người khác (2001) cũng giữ thời gian xử lý như nhau cho các phương pháp nấu ăn (đun sôi, rang, và chiên) được sử dụng để xử lý đậu phộng. Thời gian xử lý lâu hơn không được thực hiện trong nghiên cứu này bởi vì nó gây nên vấn đề về tổn thất hương, đặc biệt là với bơ đậu phộng dạng lỏng . Hình 4.9A cho thấy SDS-PAGE điển hình của chiết xuất từ đậu phộng đun sôi so với xử lý PUV. Mặc dù có sự hình thành các keo tụ, nhưng xử lý bằng phương pháp đun sôi với chiết xuất từ đậu phộng cho thấy không thiếu các dãy, có nghĩa là protein 63 kDa và protein 50 kDa đã xuất hiện trước các chiết xuất xử lý với PUV, và nó tương tự như mẫu chưa xử lý. Điều này cho thấy rằng trong phương pháp đun sôi, phần lớn các chất gây dị ứng vẫn hòa tan và không tồn tại tủa. Trong trường hợp này, dường như PUV ánh sáng có hiệu quả hơn phương pháp đun sôi trong việc keo tụ chất gây dị ứng 63 kDa. Sự hình thành keo tụ rất quan trọng vì cuối cùng chúng sẽ được loại bỏ để sản xuất đậu phộng với mức độ chất gây dị ứng thấp. Do đó, khả năng gây dị ứng sẽ yếu đi. Hình 4.9B trình bày một SDS-PAGE điển hình của các phần hòa tan của bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý PUV. Kết quả cũng cho thấy sự biến mất của các chất gây dị ứng 63-kDa và protein 50-kDa . Các protein khác, ngoại trừ chất dị ứng 18 – 20 kDa cũng biến mất. Các số liệu cho thấy khả năng hòa tan hoặc cấp độ các chất gây dị ứng 63-kDa trong bơ đậu phộng dạng lỏng đã giảm sau khi xử lý PUV ánh sáng. Việc giảm chất gây dị ứng trong đậu phộng là kết quả keo tụ của chất gây dị ứng trong đậu phộng. Những keo tụ dễ dàng nhìn thấy khi gạn từ bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý PUV giữ ở 40C. Nhưng không nên nhầm lẫn với các cryoproteins, vì chất này keo tụ trong điều kiện lạnh (ở 40C) và hòa tan thuận nghịch khi ủ ở nhiệt độ phòng. Các keo tụ từ xử lý PUV ánh sáng khác với keo tụ từ cryoproteins vì nó hình thành chất không tan không thuận nghịch ở nhiệt độ phòng. Các kết quả thử nghiệm cho thấy rằng các tủa không tan trong bộ đệm NaCl 1M, hoặc ure 2M. Việc tiêu hóa bởi các enzyme như pepsin hoặc trypsin cũng không thành công do nó không tan được. SDS-PAGE của keo tụ cho thấy các tủa chứa chủ yếu là chất gây dị ứng 63 -kDa và protein 50 kDa và rất ít chất gây dị ứng 18 -20 kDa (Hình 4.8). Tóm lại, kết quả chỉ ra rằng bơ đậu phộng dạng lỏng giảm độ hòa tan hay mức độ của chất gây dị ứng đậu phộngsau khi xử lý PUV. Tổ hợp IgE của các chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng có xử lý PUV Việc chiết xuất từ đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý với PUV làm giảm các chất gây dị ứng trong đậu phộng đã dẫn chúng ta đến định đề rằng tổ hợp IgE của mẫu xử lý PUV có thể bị giảm. Để kiểm tra định đề này, người ta thực hiện phương pháp ức chế cạnh tranh ELISA (cisELISA) bằng cách sử dụng nhóm tế bào plasma từ ba bệnh nhân bị dị ứng lâm sàng với đậu phộng chứa kháng thể IgE chống lại chất gây dị ứng trong đậu phộng. Trong các khảo nghiệm, các chất chiết xuất từ ​​đậu phộng và bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý và không qua xử lý cho các hiệu quả ức chế trên các kháng thể IgE. Trong trường hợp này, hiệu quả ức chế càng cao thì năng lực tổ hợp IgE của các mẫu đậu phộng càng cao. Các kết quả (Hình 4.11A) cho thấy hiệu quả ức chế ít rõ ràng hơn với đậu phộng xử lý PUV hơn là với đậu phộng không qua xử lý. Khi các chiết xuất xử lý theo phương pháp đun sôi được kiểm tra, hiệu quả ức chế trên tổ hợp IgE không khác nhau nhiều so với khi chưa qua xử lý, nhưng cao hơn so với khi xử lý PUV (Hình 4.11A). Trong trường hợp của bơ đậu phộng dạng lỏng, hiệu quả ức chế cũng ít rõ ràng khi xử lý PUV (Hình 4.11B). Tất cả điều này cho thấy rằng khả năng tổ hợp IgE của chiết xuất hoặc bơ đậu phộng dạng lỏng có xử lý PUV đã giảm. Các giá trị của IC50 của các chiết xuất có xử lý PUV và không qua xử lý (hoặc đun sôi-T) lần lượt là 4 μg /ml và 0,7 μg /ml (bảng 4.3). Tương tự thu được các giá trị tương ứng 4 μg / ml và 0,6 μg / ml) với bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý PUV và không qua xử lý. Sự khác biệt đáng kể giữa IC50 giữa xử lý PUV và không qua xử lý cho thấy rằng tổ hợp IgE trong mẫu chưa xử lý cao gấp 6-7 lần trong mẫu xử lý PUV. Vậy xử lý PUV thực sự có hiệu quả trong việc giảm tổ hợp IgE sau phản ứng lâm sàng. Các chiết xuất từ đậu phộng Bơ đậu phộng dạng lỏng (B) (A) Hình 4.9. (A)SDS-PAGE của chiết xuất từ đậu phộng thô (pH=7) xử lý với ánh sáng PUV và phương pháp đun sôi, mỗi 4 phút. (B)SDS-PAGE của bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý PUV Hình 4.10. SDS-PAGE của keo tụ và chất nổi bề mặt của bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý PUV được so sánh với mẫu chưa qua xử lý Bơ đậu phộng dạng lỏng (A) Các chiết xuất từ đậu phộng (B) Khả năng ức chế (%) Khả năng ức chế (%) Hình 4.11. (A)Liên kết IgE của chiết xuất từ đậu phộng xử lý PUV và xử lý bằng phương pháp đun sôi. (B) liên kết IgE của bơ đậu phộng dạng lỏng xử lý và không xử lý PUV bằng ELISA CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua quá trình tìm hiểu về protein đậu phộng và tính chất chức năng của nó, em xin đưa ra một số kết luận về protein đậu phộng. Mong rằng đây sẽ là một tài liệu có ích cho những nghiên cứu liên quan đến vấn đề này. Protein trong đậu phộng chủ yếu là globulin (90%, tan trong dung dịch muối) và một phần nhỏ albumin (10%, tan trong nước). Globulin thì chia làm hai phân đoạn chính arachin (nằm trong lớp aleurone) chiếm 3/4 và conarachin nằm trong tế bào chất chiếm 1/4 . Các tính chất chức năng của protein đậu phộng như: Ø Tính hòa tan bị ảnh hưởng bởi: èThành phần amino acide: Khả năng hòa tan sẽ tăng kh