Đề tài Tìm hiểu một số phương pháp phân tích vi sinh vật gây bệnh có trong thực phẩm

MỤC LỤC Danh mục hình ảnh 5 Lời mở đầu 6 CHƯƠNG 1: CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT THƯỜNG ĐƯỢC KIỂM SOÁT TRONG THỰC PHẨM 1.1. Samonella 7 1.2. Campylobacter 7 1.3. Clostridium perfringens 8 1.4. Clostridium botulinum 9 1.5. Staphylococcus aureus 10 1.6. Vibrio spp 11 1.7. Escherichia coli 12 1.8. Shigella spp 13 1.9. Coliforms 14 1.10. Listeria monocytogenes 15 1.11. Bacillus cereus 16 1.12. Aspergillus 17 1.13. Virus 18 CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT TRUYỀN THỐNG 2.1. Samonella 20 2.1.1. Tổng quan 20 2.1.2. Nguyên tắc 20 2.1.3. Môi trường và hóa chất 21 2.1.4. Quy trình phân tích đánh định tính Salmonella trong thực phẩm 22 2.2. Vibrio 27 2.2.1. Tổng quan 27 2.2.2. Nguyên tắc 28 2.2.3. Môi trường và hóa chất 28 2.2.4. Quy trình phân tích 29 2.3. Listeria monocytogenes 31 2.3.1. Tổng quan 31 2.3.2. Nguyên tắc 32 2.3.3. Môi trường và hóa chất 32 2.3.4. Quy trình phân tích 33 2.4. Staphylococcus aureus 35 2.4.1. Tổng quan 35 2.4.2. Nguyên tắc 35 2.4.3. Môi trường và hóa chất 36 2.4.4. Phân tích định tính Staphylococus aureus 36 2.4.5. Định lượng S.aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 37 2.4.6. Định lượng S.aureus bằng phương pháp MPN 39 2.5. Bacillus Cereus 39 2.5.1. Tổng quan 39 2.5.2. Nguyên tắc 40 2.5.3. Môi trường và hóa chất 40 2.5.4. Quy trình phân tích 41 2.6. Clostridium 46 2.6.1. Tổng quan 46 2.6.2. Nguyên tắc 47 2.6.3. Môi trường và hóa chất 48 2.6.4. Quy trình phân tích 48 2.6.5. Báo cáo kết quả 49 2.7. Coliform và E.Coli 49 2.7.1. Tổng quan 49 2.7.2. Định lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân và E.coli bằng phương pháp MPN 49 2.7.3. Định lượng Coliforms, Coliform phân bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 52 2.7.4. Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 55 2.8. Tổng nấm men nấm mốc 57 2.8.1. Tổng quan 57 2.8.2. Nguyên tắc 58 2.8.3. Môi trường và hóa chất 58 2.8.4. Quy trình phân tích định tính 59 2.8.5. Quy trình phân tích định lượng 59 CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT KHÔNG TRUYỀN THỐNG 3.1. Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh 61 3.2. Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 63 3.3. Phương pháp lai phân tử (Hybridization) 65 3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 66 3.5. Một số phương pháp thử nhanh khác 70 3.5.1. Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ 70 3.5.2. Kỹ thuật màng lọc phát huỳnh quang trực tiếp (Direct Epifluorscent Technique – DEFT) và màng lọc lưới kỵ nước (Hydrophobic Grid Membrane) 71 3.5.3. Kỹ thuật màng petri (Petrifilm) 71 3.5.4. Kỹ thuật Redigel 72 3.5.5. Kỹ thuật độ dẫn điện, trở kháng (conductance/impedance) 72 3.5.6. Kỹ thuật đo vi lượng calorie (Microcalorimetry) 73 3.5.7. Kỹ thuật đo mức phóng xạ (Radiometry) 73 KẾT LUẬN 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Samonella. Hình 1.2 Campylobacter. Hình 1.3 Clostridium perfringens. Hình 1.4 Clostridium botulinum. Hình 1.5 Staphylococcus aureus. Hình 1.6 Vibrio cholerae. Hình 1.7 V.vulnificus. Hình 1.8 V.parahaemolyticus. Hình 1.9 Escherichia coli. Hình 1.10 Shigella. Hình 1.11 Coliforms. Hình 1.12 Listeria monocytogenes. Hình 1.13 Bacillus cereus. Hình 1.14 Aspergillus flavus. Hình 1.15 A.parasiticus. Hình 1.16 Virus. LỜI MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Ngày nay người tiêu dùng lựa chọn thực phẩm thì ngoài những yêu cầu về sự bỗ dưỡng, hợp khẩu vị, giá cả phải chăng còn có an toàn thực phẩm cũng là một trong những yêu cầu hàng đầu. Số vụ ngộ độc thực phẩm cùng tỷ lệ bệnh ung thư được cho là do ăn phải các chất gây ô nhiễm ngày càng gia tăng. Trong số đó, nhiễm khuẩn chiếm tỉ lệ khá cao đang là mối lo của nhiều nước trên thế giới. Việt Nam là nước đang phát triển thuộc vùng nhiệt đới. Trình độ sản xuất còn thấp cộng với điều kiện khí hậu nóng, ẩm, tạo điều kiện cho nhiều loài vi sinh vật gây hại thực phẩm phát triển. Tình hình ngộ độc thực phẩm liên tục xảy ra. Vì vậy, việc tìm hiểu quy trình, phương pháp phân tích vi sinh vật gây bệnh có trong thực phẩm là rất cần thiết nhằm phát hiện thực phẩm nhiễm khuẩn, kém chất lượng, bảo vệ sức khỏe của người tiêu dùng và cho cộng đồng. Xuất phát từ yêu cầu trên sinh viên tiến hành đề tài: TÌM HIỂU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT GÂY BỆNH CÓ TRONG THỰC PHẨM. Mục đích nghiên cứu Nội dung báo cáo là giới thiệu về đặc trưng và phương pháp xác định một số vi sinh vật gây ngộ độc thường xuất hiện trong thực phẩm. Qua đó giúp cho mọi người biết được có những mối nguy nào trong việc sử dụng thực phẩm và phương pháp để kiểm nghiệm những thực phẩm nghi ngờ có nhiễm vi sinh vật. Kết cấu của khóa luận tốt nghiệp Khóa luận gồm 3 chương: Chương 1: Các chỉ tiêu vi sinh vật thường được kiểm soát trong thực phẩm. Chương 2: Các phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật truyền thống. Chương 3: Các phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật không truyền thống. CHƯƠNG 1: CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT THƯỜNG ĐƯỢC KIỂM SOÁT TRONG THỰC PHẨM 1.1. Salmonella Salmonella có thể gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện đến mức cả triệu tế bào trong một gram thực phẩm. Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn. Thời gian ủ bệnh kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm cho đến khi các triệu chứng được biểu hiện là 12 – 36 giờ. Triệu chứng ngộ độc thường kéo dài từ 2 – 7 ngày. Không phải tất cả mọi người khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm Samonella đều bị ngộ độc. Các loại thực phẩm có nguy cơ bị nhiễm Samonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và các sản phẩm từ trứng, thủy sản. Nguồn gây nhiễm các loại thực phẩm này thường là phân người và động vật, được nhiễm gián tiếp hay trực tiếp. Đặc biệt nguy hiểm cho người là các loài Samonella typhi, S.paratyphi A, B, C gây sốt thương hàn. Hình 1.1 Samonella 1.2. Campylobacter Campylobacter gây bệnh viêm nhiễm đường ruột, hiện diện khắp nơi, đặc biệt trong hệ vi sinh vật của nhiều loại động vật và chim. Tuy nhiên các dòng Campylobacter gây ngộ độc thực phẩm thuộc loại ưa nhiệt bắt buộc, không thể phát triển ở nhiệt độ thấp hơn 30oC. Các triệu chứng ngộ độc do vi sinh vật này gây ra là đau nhức, tiêu chảy, sốt, đau đầu, khó chịu, chuột rút, lạnh cóng, mê sảng, thỉnh thoảng có những biểu hiện bệnh giống như cảm cúm. Thời gian ủ bệnh từ 2 – 11 ngày. Các sản phẩm sữa, thịt gia cầm, nước là nguồn có thể gây nên ngộ độc do Campylobacter. Campylobacter có thể hiện diện trong các loại thực phẩm hút chân không. Các loài này rất nhạy cảm với nhiệt độ và acid nên có thể bi tiệt trùng hoàn toàn bằng phương pháp thanh trùng Pastuer và không tăng trưởng được trong thực phẩm có tính acid. Hình 1.2 Campylobacter 1.3. Clostridium perfringens C.perfringens được tìm thấy trong đất, trong phân người. Trước đây người ta cho rằng chỉ các dòng C.perfringens kháng nhiệt, tạo bào tử và không làm tan máu mới có thể gây ngộ độc thực phẩm. Ngày nay đã có những ghi nhận các vụ ngộ độc thực phẩm gây ra bởi các dòng C.perfringens nhạy cảm với nhiệt, không làm tan máu. Các triệu chứng ngộ độc do độc tố của vi sinh vật này gây ra là đau thắt vùng bụng, tiêu chảy. Thời gian ủ bệnh từ 12 – 24 giờ. Nguồn thực phẩm có thể chứa các vi sinh vật này thường là thịt gia cầm, nhất là gia cầm đông lạnh sâu, thịt trong các hầm chứa và các loại thực phẩm khác. Bào tử của C.perfringens có tính bền đối với nhiệt nên chúng có thể sống sót qua quá trình nấu chín, đặc biệt là khi đun nấu thực ăn ở nhiệt độ thấp và thời gian ngắn. Các bào tử sống sót này khi gặp điều kiện thích hợp sẽ nảy mầm, tăng trưởng. Hình 1.3 Clostridium perfringens 1.4. Clostridium botulinum Loài vi sinh vật này phân bố khắp nơi trong đất, nước, trong đường ruột các gia súc và các loài thủy sản. Vi sinh vật này sinh độc tố botulin gây ngộ độc thịt làm thực phẩm cho người. Triệu chứng lâm sàng khi ngộ độc là ói mửa, buồn nôn, sau đó có những biểu hiện rối loạn thần kinh như choáng váng, rối loạn thị giác, rối loạn các cơ ở cổ và miệng, đau ở vùng ngực, khó thở và tê liệt, có thể dẫn đến tử vong. Các triệu chứng trên biểu hiện 12 – 36 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm độc tố và kéo dài 2 – 6 ngày tùy theo mức độ nhiễm độc và tình trạng sức khỏe của từng bệnh nhân. Các loại thực phẩm như thịt, rau quả không được bảo quản đúng quy định, thực phẩm nhiễm đất, phân động vật được chế biến không đủ nhiệt độ trước khi dùng, các sản phẩm đóng hộp không đúng quy cách có nguy cơ gây ngộ độc bởi vi sinh vật này rất cao. Điều kiện thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo độc tố của vi sinh vật này là điều kiện kỵ khí, pH trung tính, không có các vi sinh khác cạnh tranh. Độc tố botulin do C.botulinum dòng E thường có nguồn gốc từ cá và các sản phẩm thủy sản. Dòng vi sinh vật này thường phân lập được từ các mẫu bùn đáy tại các cửa sông. Hình 1.4 Clostridium botulinum 1.5. Staphylococcus aureus Trong tự nhiên Staphylococcus aureus thường được tìm thấy trên da, mũi, tóc hay long của các loài động vật máu nóng. Staphylococcus aureus sản sinh một số loại độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt, không bị phân hủy ở 100oC trong 30 phút. Khi ăn phải thực phẩm có chứa các độc tố này, sau 4 – 6 giờ người bị ngộ độc có các triệu chứng tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8 giờ. Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như jambon, kem tổng hợp, nước súp (ít khi được xử lý ở nhiệt độ cao hơn 40oC) và các loại thủy sản, thực phẩm đóng hộp thường hay nhiễm các loài vi sinh vật này. Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trình chế biến. Hình 1.5 Staphylococcus aureus 1.6. Vibrio spp Các loài Vibrio thường hiện diện trong nước biển do chúng cần ion Na+ để phát triển, một số loài có khả năng gây bệnh cho người là Vibrio cholera, V.parahaemolyticus, V.vulnificus, V.hollisae, V.furnsii, V.mimicus, V.fluvialis, V.alginolyticus, V.cholerae là tác nhân gây nên các vụ dịch tả trên toàn thế giới. Loài vi sinh vật này được chia thành hai kiểu huyết thanh chính là O1 và không O1 (non-O1). Kiểu huyết thanh O1 lại gồm ba kiểu huyết thanh phụ là Ogawa, Inaba và Eltor (còn được gọi là kiểu O139). Hai kiểu huyết thanh Inaba và Ogawa ngày nay chỉ còn được tìm thấy tại các nước thuộc khu vực châu Á. Trong khi đó, các vụ dịch tả trên thế giới lại gây ra bởi kiểu Eltor. Dịch tả gây ra bởi V.cholerae thường được lan truyền rất nhanh qua đường nước, gây nhiễm thực phẩm và truyền nhiễm qua con người khi điều kiện vệ sinh kém. V.cholerae tạo ra độc tố tả cholera-toxin, có độc tính mạnh: chỉ cần 5μg gây nhiễm qua đường miệng có thể gây ra tiêu chảy cho người trưởng thành. Ngoài độc tố tả, loài này cũng tiết ra một số độc tố tương tự shiga-toxin. Nguồn thực phẩm có nguy cơ nhiễm và lan truyền dịch tả là nước uống, nước trái cây, rau quả, sữa và các sản phẩm sữa, các loại thủy sản tươi sống (không qua gia nhiệt hay gia nhiệt nhẹ). Một loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng khác là V.parahaemolyticus tạo độc tố hemolysin bền nhiệt có phản ứng kháng nguyên Kanagawa. Tuy nhiên, những năm gần đây người ta phát hiện ra rằng nhiều dòng V.parahaemolyticus có phản ứng Kanagawa âm tính cũng có thể gây bệnh. Triệu chứng ngộ độc là đau thắt vùng bụng, viêm nhiễm đường ruột và tiêu chảy nhẹ xuất hiện 2 – 96 giờ sau khi ăn phải thực phẩm bị nhiễm. Thời gian ủ bệnh phụ thuộc vào mật độ tế bào vi khuẩn đã xâm nhiễm và thể trạng của từng bệnh nhân. Loài vi khuẩn này hiện diện và tăng trưởng trong môi trường có hàm lượng muối cao, thường phân lập được từ các sản phẩm thủy sản, trong các vùng nước ấm ven biển. Các loài Vibrio khác khi xâm nhiễm vào trong thực phẩm cũng có thể gây nên các bệnh đường ruột và có biểu hiện bệnh lý tương tự như hai loài trên. Riêng loài V.vulnificus không gây các triệu chứng bệnh đường ruột mà gây nhiễm trùng máu cho người. Hình 1.6 Vibrio cholerae Hình 1.7 V.vulnificus Hình 1.8 V.parahaemolyticus 1.7. Escherichia coli E.coli là vi sinh vật hiếu khí tùy ý hiện diện trong đường ruột của người và các loài động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E.coli không gây hại và đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý đường ruột. Tuy nhiên có 4 dòng có thể gây bệnh cho người và một số loài động vật là Enteropathogenic E.coli (EPEC), Enterotoxigenic E.coli (ETEC), Enteroinvasive E.coli (EIEC) và Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC)/Verocytoxin E.coli (VTEC) hay E.coli O157: H7. Các loài E.coli hiện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường. Gần đây người ta còn chứng minh được rằng E.coli cũng hiện diện ở những vùng nước ấm, không bị ô nhiễm chất hữu cơ. Do sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên nên E.coli dễ dàng nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn các triệu chứng rối loạn đường tiêu hóa. Biểu hiện lâm sàng thay đổi từ nhẹ đến rất nặng, có thể gây chết người phụ thuộc và mức độ nhiễm, dòng gây nhiễm và khả năng đáp ứng của từng người. Hình 1.9 Escherichia coli 1.8. Shigella spp Giống Shigella thuộc họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) gồm 4 loài khác nhau là S.dysenteriae, S.sonnei, S.plexneri và S.boydii. Các loài Shigella có tính chuyên biệt ký chủ cao, chỉ xâm nhiễm và tăng trưởng trong người và các loài linh trưởng. Trong môi trường nước các loài này có thể tồn tại hơn 6 tháng. Các vụ ngộ độc thực phẩm do Shigella gây ra chủ yếu tập trung ở các nước kém phát triển, nơi việc sản xuất chế biến thực phẩm được thực hiện trong điều kiện vệ sinh không đảm bảo. Shigella cũng có thể lây nhiễm trực tiếp từ người qua người. Shigella chủ yếu gây nên các triệu chứng lỵ (bệnh lỵ trực trùng) trong khoảng 1 – 7 ngày sau khi sử dụng thực phẩm bị nhiễm. Biểu hiện bệnh lý có thể thay đổi từ dạng nhẹ như tiêu chảy nhẹ đến mức nghiêm trọng (đặc biệt là ở trẻ em và người già) như đi tiêu ra máu, có những mảnh niêm mạc ruột, mất nước, sốt cao và bị co rút thành bụng. Các triệu chứng trên có thể kéo dài từ 12 – 14 ngày thậm chí lâu hơn. Hàng năm có khoảng nửa triệu người tử vong do vi sinh vật gây bệnh này. Vi khuẩn Shigella lây nhiễm chủ yếu qua nước và thực phẩm. Thực phẩm bị nhiễm Shigella từ nguyên liệu hay thông qua tiếp xúc bề mặt trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm. Hình 1.10 Shigella 1.9. Coliforms Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhóm các vi sinh vật dùng để chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Nhóm Coliform gồm những vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý, Gram âm , không sinh bào tử, hình que, lên men đường lactose và sinh hơi trong môi trường nuôi cấy lỏng. Dựa vào nhiệt độ tăng trưởng, nhóm này lại được chia thành hai nhóm nhỏ là Coliform và Coliform phân có nguồn gốc từ phân của các loài động vật. Trên thực tế kiểm nghiệm Coliform phân được quan tâm nhiều hơn Coliform. Coliform phân có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu nóng bao gồm các giống Escherichia, Klebsiella và Enterobacter. Khi Coliform phân hiện diện ở số lượng lớn trong mẫu thì mẫu có khả năng bị nhiễm nước nhiễm phân và có khả năng chứa các vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong phân. Trong các thành viên của nhóm Coliform phân thì E.coli là loài được sự quan tâm nhiều nhất về vệ sinh an toàn thực phẩm. Hình 1.11 Coliforms 1.10. Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes trở thành tác nhân gây bệnh nguy hiểm ở trẻ em, phụ nữ mang thai hay người già trong những năm gần đây. Mặc dù L.monocytogenes chỉ hiện diện với số lượng nhỏ trong thực phẩm, nhưng khi được đưa vào cơ thể, chúng tồn tại, khi có điều kiện thuận lợi sẽ tăng trưởng nhanh xâm nhiễm vào các mô sâu hơn và gây bệnh. Triệu chứng bệnh thường bắt đầu là tiêu chảy, sốt nhẹ, sau đó là nhiễm trùng máu, tổn thương hệ thần kinh trung ương, tim, mắt, gây nên sẩy thai, đẻ non hay nhiễm trùng thai nhi ở phụ nữ mang thai. L.monocytogenes ưa lạnh, tăng trưởng ở nhiệt độ từ 2 – 44oC, thường được phân lập từ phô mai, sữa, thịt cá, rau quả và trong nước. Loài này có thể nhiễm vào thực phẩm ở mọi công đoạn trong quy trình chế biến thực phẩm, sữa hay rau quả. Đặc biệt, trong thời gian bảo quản thực phẩm ở nhiệt độ thấp, loài này có cơ hội tăng trưởng thành số lượng lớn. Các sản phẩm được thanh trùng bằng phương pháp Pastuer và được bảo quản trong các tủ lạnh có nguy cơ nhiễm vi sinh vật này rất cao. Hình 1.12 Listeria monocytogenes 1.11. Bacillus cereus B.cereus là trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử, kỵ khí tùy ý, tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 5 – 50oC, tối ưu ở 35 – 40oC, pH dao động từ 4,5 - 9,3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô…). Vi khuẩn có thể tiết ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B.cereus khi thực phẩm được chuẩn bị mà không được giữ trong điều kiện lạnh trong vài giờ trước khi sử dụng. Thực phẩm chứa vi khuẩn ở mật độ trên 106 tế bào/g đủ gây ngộ độc. Triệu chứng ngộ độc phổ biến gây ra bởi B.cereus là đau bụng, tiêu chảy, không sốt, bắt đầu 4 – 16 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm và kéo dài trong 12 – 24 giờ. Một dạng triệu chứng ngộ độc khác là buồn nôn và nôn sau 1 – 2 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn, không bị tiêu chảy, kéo dài khoảng 24 giờ. Hình 1.13 Bacillus cereus 1.12. Aspergillus Aspergillus flavus và A.parasiticus là hai loài nấm mốc quan trọng trong các loài nấm mốc có khả năng tạo độc tố mycotoxin gây ngộ độc thực phẩm. Độc tố mycotoxin có thể được tạo ra bởi nhiều chủng của hai loài này được gọi chung là aflatoxin có khả năng gây ung thư. Các nấm mốc này có thể phát triển ở nhiệt độ từ 7 – 40oC và tối ưu ở 24 - 28oC, do vậy có khả năng tăng trưởng tốt trên các loại ngũ cốc, nông sản (gạo, lúa, miến, đậu phộng, bắp, lúa mì…) không được phơi sấy tốt, đặc biệt là ở các nước nhiệt đới với điều kiện độ ẩm và nhiệt độ không khí cao. Từ các nguyên liệu này, nấm mốc và độc tố có thể nhiễm vào thực phẩm gây độc cho người. Ở các chủng có khả năng sinh độc tố, sau khi tăng trưởng 1 – 3 ngày độc tố được tạo ra và tiết vào cơ chất. Bốn loại aflatoxin được tạo ra bởi A.flavus và A.parasiticus là aflatoxin B1, B2 phát huỳnh quang màu xanh (blue) và G1, G2 phát huỳnh quang màu lục (green). Khi ăn cỏ hoặc thức ăn chứa aflatoxin B1 hoặc B2, bò sữa có thể chuyển hóa chúng thành các độc tố aflatoxin M1, M2 hiện diện trong sữa bò. Do aflatoxin là chất gây ung thư mạnh nên được kiểm tra nghiêm ngặt. Hầu hết các nước đều có tiêu chuẩn quốc gia về hàm lượng tối đa cho phép sự hiện diện của độc tố này trong nông sản, thực phẩm, thường là 10ppb (một phần tỷ). Hình 1.14 Aspergillus flavus Hình 1.15 A.parasiticus 1.13. Virus Các vụ dịch bệnh gây ra do tác nhân virus từ thực phẩm cho đến nay vẫn là vấn đề bí ẩn. Các nghiên cứu về virus thực phẩm. Đặc điểm sinh lý của virus đường ruột, phương pháp nuôi cấy, phát hiện virus trong thực phẩm cho đến nay vẫn còn nhiều hạn chế. Tuy nhiên, bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như lai phân tử, kỹ thuật PCR… người ta có thể phát hiện virus có hại cho con người trong thực phẩm. Sự lan truyền virus qua người thông qua đường miệng đã được biết đến từ năm 1950. Các virus gây bệnh đường ruột cho người chủ yếu có nguồn gốc từ các sản phẩm thủy sản. Trong khoảng hơn 100 loại virus đường ruột được biết hiện nay chỉ một vài loại có khả năng gây bệnh cho người (Hepatitis type A virus, HAV, Norwalk virus, Calicivirus, Astrovirus, Virus Non A, Virus Non B). Virus tồn tại ở thể không hoạt động khi ở bên ngoài tế bào, không thể tự nhân lên trong nước hay trong thực phẩm. Chúng xâm nhiễm vào thực phẩm hoàn toàn do quá trình chế biến, từ nước bị ô nhiễm. Các loài nhuyễn thể ăn lọc như nghêu, sò… có khả năng tích lũy nhiều virus trong nước làm mật độ virus trong nhuyễn thể cao hơn rất nhiều so với môi trường nước xung quanh. Liều lượng gây nhiễm của virus từ thực phẩm có thể thấp hơn rất nhiều so với vi khuẩn. Virus hiện diện trong cơ thể người và các loài động vật và được tìm thấy với số lượng lớn trong phân của những người bị nhiễm, tồn tại từ nhiều ngày đến nhiều tuần. Nước bị nhiễm phân là con đường lây nhiễm gián tiếp hay trực tiếp của virus vào thực phẩm. Khả năng sống sót của virus trong môi trường hay trong thực phẩm phụ thuộc vào các yếu tố: nhiệt độ, nồng độ muối, cường độ bức xạ mặt trời hay sự hiện diện của các thành phần hữu cơ khác. Tất cả virus đường ruột đều có tính kháng với acid, các enzyme thủy phân, muối mật có trong đường tiêu hóa. Một số virus có thể kháng nhiệt như virus viêm gan siêu vi A (HAV), hoặc kháng phenol, ethanol… Ô zôn và chlorine là những tác nhân có thể làm bất hoạt một vài loại virus đường ruột. Để ngăn ngừa các bệnh do virus từ thực phẩm, các loại thức ăn phải được nấu chín để khử virus trước khi dùng, các loại nhuyễn thể ăn lọc phải được khai thác từ, những vùng nước không nhiễm virus hay được nuôi trong các vùng nước sạch trước khi tiêu thụ. Hình 1.16 Virus CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT TRUYỀN THỐNG 2.1. Samonella 2.1.1. Tổng quan Là trực khuẩn Gram âm,hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, có tiên mao, lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indole, không phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S.Cho đến nay đã xác định được 2339 serotype (kiểu huyết thanh) thuộc giống Salmonella. Các serotype này được chia theo hệ thống của Kaffmann – White dựa trên công thức kháng nguyên O (kháng nguyên somatic) và kháng nguyên tiên mao H (flagella). 2.1.2. Nguyên tắc Salmonella có thể được phát hiện (phân tích định tính) bằng một quy trình gồm 4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện chung với một số lượng lớn các loại vi khuẩn khác thuộc họ Enterobateriaceae có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella. - Bước tăng sinh: tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu cần chọn quy trình tăng sinh phù hợp. Thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi trường tăng sinh là 1:9, tuy nhiên tùy trường hợp cụ thể tỉ lệ này có thể thay đổi. - Bước tăng sinh chọn lọc: các môi trường tăng sinh chọn lọc thường dùng để phát hiện Salmonella trong các mẫu thực phẩm là Rappaport Vassiliadis (RV), Selenite Cystein Broth, Tetrathionate Mueler Kauffmann Broth (TT). Các nghiên cứu gần đây của AOAC cho thấy môi trường RV có thể thay thế cho các môi trường khác để phân tích nhiều loại mẫu khác nhau. Tuy vậy, môi trường TT thường được dùng để phân tích các loại mẫu chứa thịt tươi sống, các mẫu có mật độ nhiễm cao, các loại thức ăn gia súc… Hiện nay người ta khuyến khích việc sử dụng ít nhất 2 loại môi trường tăng sinh chọn lọc để tăng cường khả năng phát hiện được tất cả các serotype Salmonella nếu có hiện diện trong mẫu. - Bước phân lập: nhằm tách và nhận dạng Salmonella khỏi các quần thể vi sinh vật khác trong mẫu. Nhiều loại môi trường rắn khác nhau được sử dụng để phân lập Salmonella, mỗi môi trường giúp nhận dạng các loài thuộc giống này dựa trên một vài đặc tính. Hiện nay, các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm khuyến khích việc sử dụng ít nhất hai loại môi trường phân lập khác nhau để tăng cường khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella, đặc biệt môi trường XLD được khuyến khích sử dụng. - Bước khẳng định: nhằm xác nhận lại các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella xuất hiện trên môi trường phân lập. Bước này dựa trên việc sử dụng các thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm huyết thanh đặc trưng cho Salmonella. Các thử nghiệm được khuyến khích sử dụng là thử nghiệm KIA/TSI, indol, LDC (lysine decarboxylase), ODC (ornithine decarboxylase), urea, lên men mannitol, sorbitol, các thử nghiệm huyết thanh O và H đa giá. Thông thường các phòng phân tích vi sinh thực phẩm không có khả năng xác định đến loại phụ hay serotype mà chỉ xác nhận đến Salmonella spp. Việc phân tích chính xác serotype nhiễm vào thực phẩm thường được thực hiện tại các trung tâm vệ sinh phòng dịch hay các phòng thí nghiệm chuyên định danh vi sinh vật. 2.1.3. Môi trường và hóa chất - Nước pepton đệm (Buffered Peptone Water, BPW). - Canh Rappaport – Vasiliadis Soya Pepton (RV). - Canh Malachite Green Magnesium Chloride (canh RV cải tiến). - Tetrethionate Muller – Kauffmann (TT). - Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD). - Thạch Hektoen Entric Agar (HE). - Thạch Bismuth Sulphite Agar (BS). - Thạch Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS). - Thạch Triple Sugar Iron (TSI). - Canh Ure. - Canh Lysine Decarboxylase. - Canh Ornithine Decarboxylase. - Canh Mannitol (Phenol Red Broth Base). - Canh Sucrose (Phenol Red Broth Base). - Canh Sorbitol (Phenol Red Broth Base). - Canh Tryptone. - Thuốc thử Kovac’s. - Kháng huyết thanh Salmonella đa giá. 2.1.4. Quy trình phân tích đánh định tính Salmonella trong thực phẩm 2.1.4.1. Tăng sinh Đối với các loại mẫu thông thường tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 15 hoặc 30 giây. Ủ ở 37 1oC trong 18 – 24 giờ. Đối với một số loại thực phẩm có chứa các chất có thể gây độc hoặc ức chế sự tăng trưởng của Salmonella cần thực hiện quy trình tăng sinh đặc biệt như sau: - Đối với mẫu gia cầm tươi sống: đặt gia cầm vào một bao nhựa lớn, thêm 1 lít môi trường tăng sinh BPW. Lắc bằng máy lắc khoảng 30 giây để môi trường thấm được vào trong toàn bộ mẫu. - Đối với sữa khô: cho 25g mẫu vào trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml môi trường BPW, để yên 60 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó lắc cho đến khi sữa tan hoàn toàn. - Đối với các gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị: đồng nhất mẫu ở độ pha loãng 1/100 trong BPW (thay vì 1/10 như bình thường) trước khi nuôi tăng sinh. Biện pháp này nhằm làm giảm nồng độ các hợp chất ức chế sự tăng trưởng của Salmonella trong bước tăng sinh. - Đối với các loại mẫu như casein, pho mát, bơ và các sản phẩm tương tự khác: thực hiện đồng nhất mẫu trong môi trường tăng sinh đã được làm ấm đến 40oC. - Đối với sản phẩm chứa cocoa: đồng nhất mẫu trong môi trường Skim Milk Broth được làm ấm ở 40oC. - Đối với dừa, các sản phẩm của dừa và các mẫu có hàm lượng chất béo cao đồng nhất mẫu với BPW, sau đó thêm vào 2 – 3 giọt Triton X-100 trước khi ủ tăng sinh. 2.1.4.2. Tăng sinh chọn lọc Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, và chuyển 0,1ml sang 10ml môi trường tăng sinh Rappapport-Vassliadis Soya Pepton đã được ủ ấm đến 42oC. Ủ ở 42 0,2oC trong 18 – 24 giờ. Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ. Một số môi trường tăng sinh chọn lọc khác như Selenite Cysteine Broth, Tetrathionate Muller-Kauffman cũng được dùng. Mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng chọn lọc trên một đặc điểm phát triển của Salmonella, một số dòng Salmonella tăng trưởng được trong môi trường này nhưng lại không tăng trưởng được trong môi trường khác. Ví dụ Salmonella typhi không tăng trưởng được trong môi trường Rappaport Vassiliadis và Tetrathionate Muller-Kaufmann, Salmonella Dublin không tăng trưởng được trong môi trường Rappaport Vassiliadis. Do vậy, để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella hiện diện trong mẫu thực phẩm cần phải dung ít nhất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc khác nhau cho cùng một mẫu. Ngoài ra, mỗi môi trường chọn lọc được ủ ở một nhiệt độ nuôi cấy khác nhau như môi trường RV được ủ ở 42oC, môi trường TT và SC được ủ ở 37oC trong 22 – 24 giờ. 2.1.4.3. Phân lập và nhận diện Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho Salmonella như XLD, HE, BS… Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái khuẩn lạc của Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau. Để chọn lọc và nhận dạng được tất cả các dòng Salmonella phải dung tối thiểu 2 môi trường chọn lọc phân biệt khác nhau cho cùng một mẫu. Các biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường khác nhau như sau: - Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bong rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc. - Môi trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ xanh dương đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc. - Môi trường BS: khuẩn lạc Salmonella có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kim tím. Môi trường chung quanh khuẩn lạc chuyển thành màu nâu và sau đố chuyển thành đen nếu kéo dài thời gian ủ. - Môi trường BPLS: có khuẩn lạc Salmonella màu hồng nhạt, trong suốt, xung quanh khuẩn lạc môi trường chuyển màu đỏ. Tất cả các đĩa môi trường sau khi cấy được ủ ở 37oC trong 22 – 26 giờ. auk hi ủ, chọn các khuẩn lạc có đặc điểm của Salmonella như trên để thực hiện bước khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm kháng nguyên. 2.1.4.4. Khẳng định Từ mỗi môi trường chọn lọc phân biệt chọn và cấy chuyền ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trưởng không chọn lọc ví dụ như TSA. Ủ ở 37oC trong 18 – 24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh. Các thử nghiệm sinh hóa chính cần thực hiện cho Salmonella là lên men glucose, lactose, saccharose, H2S, urea, indol, VP, ODC, LDC, sử dụng mannitol, sorbitol. Các chủng Salmonella cho các kết quả thử nghiệm sinh hóa như sau: - Thử nghiệm sinh H2S (TSI hay KIA): Salmonella chỉ lên men được đường glucose trong các môi trường trong các môi trường trên vì thế phần nghiêng của môi trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Đa số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường này. Có thể thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng là vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên trên tạo ra một khoảng không bên dưới đáy ống nghiệm. - Thử nghiệm LDC (+): sau khi nuôi cấy môi trường chuyển thành kiềm, màu môi trường được chuyển thành màu như ban đầu (màu tím hay xanh). - Thử nghiệm urea (-): Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường, sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu cam. - Lên men mannitol, sorbitol (+): môi trường sau nuôi cấy bị acid hóa và chuyển thành màu vàng. - Thử nghiệm Indol và VP (-). Các thử nghiệm kháng nguyên cần được thực hiện song song với mẫu chứng không bằng dung dịch nước muối sinh lý để loại trừ khả năng ngưng kết giả. Hai loại kháng huyết thanh đa giá cần dùng là Salmonella Polyvalent O và Salmonella Polyvalent H. Phản ứng (+) khi chủng thử nghiệm tạo ngưng kết với kháng huyết thanh nhưng không có hiện tượng ngưng kết với nước muối sinh lý. 2.1.4.5. Báo cáo kết quả Quy trình kiểm nghiệm này chỉ cho phép phân tích định tính Salmonella, giúp kết luận có hay không có Salmonella hiện diện trong 25g mẫu, không cho phép phân biệt được các dòng Salmonella hiện diện trong mẫu. Để khẳng định được tên chủng Salmonella phân lập được cần phải tiến hành thử nghiệm ngưng kết với các loại kháng huyết thanh đơn giá khác nhau hay cần gởi chủng Salmonella phân lập được đến các phòng thí nghiệm chuyên định danh vi sinh vật. Cần lưu ý Salmonella là nhóm chứa các dòng gây bệnh nguy hiểm. Do vậy cần tuân thủ triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng Salmonella dùng làm đối chứng (+) cũng như khi thao tác trên các chủng phân lập được. Các môi trường hay mẫu vật sau nuôi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn thận trước khi rửa. 2.2. Vibrio 2.2.1. Tổng quan Vibrio là vi sinh vật gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo thành hình dấu phẩy, di động, sống kỵ khí tùy ý, có phản ứng catalase và oxidase (+), lên men glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H2S, nhạy cảm với Vibriostaticum O/129. Trừ V.cholerae hiện diện ở vùng nước ngọt, tất cả các loài Vibrio khác đều cần muối để tăng trưởng và thường xuyên được phân lập được từ các vùng nước ven biển. Giống này có 4 loài là tác nhân gây bệnh cho người gồm: V.cholerae, V.parahaemolyticus, V.vulnificus và V.alginolyticus được phân biệt dựa trên các đặc điểm sau đây: V.cholerae có phản ứng oxidase (+) tăng trưởng được trong môi trường canh trypton ở 42oC, arginiae dehydrolase (-), lysine decarboxylase (+), lên men được sucrose (saccharose), khử nitrate thành nitrite, có thể tăng trưởng được trong môi trường chứa 0 – 3% NaCl, không phát triển được trong các môi trường chứa 6, 8, 10% muối. V.parahaemolyticus có phản ứng oxidase (+), phát triển được trong canh trypton ở 24oC, phản ứng ADH (-), LDC (+), có khả năng khử nitrate thành nitrite nhưng không lên men sucrose, sử dụng được một số carbohydrate khác để lên men nhưng không sinh hơi, không tăng trưởng được trong môi trường không có muối, tăng trưởng tốt trong môi trường có đến 8% muối nhưng bị ức chế trong môi trường chứa 10% muối. V.vulnificus khác với hai loài nêu trên là không lên men sucrose, không tăng trưởng được trong môi trường không có muối, bị ức chế trong môi trường có 8 – 10% muối. V.alginolyticus có khả năng lên men đường sucrose, không tăng trưởng được khi trong môi trường không có muối nhưng có thể phát triển trong môi trường chứa đến 10% muối. 2.2.2. Nguyên tắc Một lượng mẫu xác định được tăng sinh trong môi trường chọn lọc đặc trưng. Cấy phân lập từ môi trường tăng sinh sang môi trường phân biệt chọn lọc đặc trưng. Các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập được khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh học. Môi trường tăng sinh chọn lọc cho Vibrio cholera, V.alginolyticus và V.vulnificus là nước pepton kiềm. Trong khi đó môi trường Colistine Polymicine Broth thường được dùng để tăng sinh V.parahaemolticus. Môi trường thường dùng để phân lập Vibrio là TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar). Các vi sinh vật lên men được sucrose trong môi trường này sẽ cho khuẩn lạc màu vàng và làm acid hóa môi trường bên dưới khuẩn lạc. Nếu vi sinh vật không lên men được đường sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu xanh. 2.2.3. Môi trường và hóa chất - Canh Pepton kiềm Alkaline Peptone Water (APW). - Canh Colistine Polymicine Broth (Colistine). - Thạch Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose (TCBS Agar). - Canh Tryptone. - Thạch Kligler Iron (KI). - Canh Hugh Leifon Glucose (HLG). - Canh Carbohydrate tím. - Môi trường thử nghiệm Decarboxylase (Moeller). - Dung dịch oxidase. - Dung dịch thử nghiệm String (sodium desoxycholate 5%). - Kháng huyết thanh polyvalent’O dùng cho V.cholerae. - Kháng huyết thanh O. - Dung dịch NaOH 1N. - Dung dịch HCl 1N - Dung dịch dầu phủ vô trùng. - Dung dịch Bromocresol tím. 2.2.4. Quy trình phân tích 2.2.4.1. Tăng sinh chọn lọc Cân 25g mẫu vào trong bao PE vô trùng, thêm 225 ml canh thang tăng sinh chọn lọc (dùng nước pepton kiềm chứa 1% muối NaCl cho trường hợp V.cholerae, V.vulnificus, V.alginolyticus, canh Colistine cho trường hợp V.parahaemolyticus). Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Ủ ở 37oC trong 6 – 8 giờ. 2.2.4.2. Phân lập Dùng que cấy vòng ria váng trên bề mặt môi trường tăng sinh chọn lọc lên bề mặt đĩa thạch TCBS để phân lập khuẩn lạc đơn, ủ 37oC trong 18 – 22 giờ. Hình dạng khuẩn lạc đặc trưng của các loài Vibrio trên môi trường này là như sau: khuẩn lạc V.cholerae và V.alginolyticus lớn, đường kính khoảng 2 – 3mm, láng, có màu vàng, hơi phẳng, tâm đục và chung quanh khuẩn lạc có quầng trắng đục. Khuẩn lạc V.parahaemolyticus và V.vulnificus lớn, đường kính khoảng 3 – 4mm, có màu xanh đến xanh dương. Tiếp theo, cấy chuyển sinh khối từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập sang môi trường không chọn lọc hay thạch máu, ủ qua đêm ở nhiệt độ 37oC để thu sinh khối sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa. 2.2.4.3. Thử nghiệm sinh hóa Các thử nghiệm sinh hóa quan trọng để phát hiện hay phân biệt các loài Vibrio là quan sát tính di động trên kính hiển vi, quan sát sự di động trên thạch mềm và các thử nghiệm khác. Các đặc điểm sinh hóa của V.cholerae là: ONPG (+), lactose (-), ADH (-), LDC (+), TDA (-), Indol (+), manose (+), sucrose (+), oxidase (+), tính ưa mặn NaCl 0% (+), 3% (+), 6% (-), 8% (-), 10% (-). Các đặc điểm sinh hóa của V.parahaemolyticus là: ONPG (-), lactose (-), ADH (-), LDC (+), TDA (-), Indol (+), manose (+), sucrose (-), oxidase (+), tính ưa mặn NaCl 0% (-), 3%(+), 6% (+), 8% (+/-). 10% (-). 2.2.4.4. Thử nghiệm kháng huyết thanh: Thử nghiệm ngưng kết huyết thanh được dùng để xác định các dòng Vibrio có các biểu hiện kháng nguyên chuyên biệt. Trường hợp V.cholerae có thể phân biệt được các dòng V.cholera O1 và V.cholerae non-O1 (khác O1) như sau: - Thử nghiệm với kháng huyết thanh đa giá polyvalent O nhóm 1: nhỏ một giọt kháng huyết thanh O đa giá lên phiến kính sạch và một giọt nước muối sinh lý lên một vị trí khác của phiến kính. Dùng que cấy vô trùng chuyển vi khuẩn lên 2 giọt dung dịch trên, phân tán đều vi khuẩn vào trong giọt dung dịch. Kết luận (+) khi có hiện tượng ngưng kết. - Xác định kiểu kháng nguyên O1: dùng kháng huyết thanh đơn giá Inaba và Ogawa. Kháng huyết thanh Inaba (+) khi kháng nguyên chỉ ngưng kết với kháng huyết thanh Inaba không ngưng kết với các nhóm khác hay dung dịch muối sinh lý. Kháng huyết thanh Ogawa (+) khi kháng nguyên chỉ ngưng kết với kháng huyết thanh Ogawa và không ngưng kết với các nhóm khác hay dung dịch muối sinh lý. Kháng huyết thanh Hikojima (+) khi kháng nguyên ngưng kết với kháng huyết thanh Ogawa và Inaba nhưng không ngưng kết với dung dịch muối sinh lý. Phản ứng kháng nguyên là (-) khi chúng không ngưng kết với các nhóm kháng huyết thanh nêu trên và không ngưng kết với dung dịch muối sinh lý. Trường hợp này có thể gặp do sai lầm trong thao tác thử nghiệm hoặc là do chủng Vibrio nêu trên thuộc nhóm non-O1. Phản ứng ngưng kết là không đặc hiệu khi tất cả thử nghiệm kháng huyết thanh đều cho kết quả (+). Trường hợp V.parahaemollyticus thực hiện ngưng kết với hai loại huyết thanh là huyết thanh O và huyết thanh K. Tuy nhiên trong một số trường hợp kháng nguyên O bị kháng nguyên K che lấp, vì thế cần phải xử lý chủng trước khi thực hiện ngưng kết với kháng nguyên O bằng cách dùng que cấy chuyển sinh khối của chúng trên môi trường thạch chọn lọc vào dung dịch nước muối 3%, hấp ở 121oC trong 1 giờ để biểu lộ kháng nguyên O ra bên ngoài. 2.2.4.5. Báo cáo kết quả Kết quả được báo cáo dưới dạng phát hiện hay không phát hiện V.cholera hay V.parahaemolyticus trong 25g mẫu. Cần lưu ý Vibrio là nhóm chứa các dòng gây bệnh nên cần tuân thủ triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng Vibrio dùng làm đối chứng (+) cũng như khi thao tác trên các chủng phân lập được. Các môi trường hay mẫu vật sau nuôi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn thận trước khi rửa. 2.3. Listeria monocytogenes 2.3.1. Tổng quan L.monocytogenes là vi khuẩn có hình gậy ngắn, mảnh, gram dương sau khi nuôi cấy 20 giờ, cho thử nghiệm catalase (+), oxidase (-), chuyển động xoay tròn thành đợt trong tiêu bản giọt treo (khi nuôi cấy ở 20 – 25oC), có khả năng thủy giải esculin và làm tan huyết trên môi trường thạch máu, sinh acid rhamnose nhưng không xylose, có phản ứng CAMP (+) với Staphylococcus aureus và (-) với Rhodococcus equi. L.monocytogenes là một số tác nhân gây bệnh listeriosis rất nguy hiểm (nhiễm trùng máu, sẩy thai ở phụ nữ, viêm màng não, gây tử vong thai nhi) có tỉ lệ tử vong rất cao (30 – 35% ở người lớn và 70% ở trẻ em). Loài này thường được phát hiện trong thức ăn gia súc, nước, nước thải, là loài đặc biệt nguy hiểm trong các loại thực phẩm đã qua gia nhiệt. Các quy định về an toàn vệ sinh thực phẩm thường không cho phép sự hiện diện của L.monocytogenes trong 25g thực phẩm đã qua gia nhiệt nhưng cho phép 100 CFU/g đối với thực phẩm phải gia nhiệt trước khi sử dụng. 2.3.2. Nguyên tắc Quy trình phát hiện L.monocytogenes được thực hiện bằng quá trình tăng sinh 2 giai đoạn. Mẫu được cân vào trong túi PE vô trùng, đồng nhất với môi trường tăng sinh sơ cấp. Sau khi ủ 24 giờ, dịch nuôi cấy được chuyển vào môi trường tăng sinh thứ cấp và được ủ tiếp 24 giờ. Hiện nay quy trình cải tiến cho phép tăng sinh một giai đoạn nhưng thời gian tăng sinh là 48 giờ. Quy trình tăng sinh một giai đoạn được sử dụng khi các mẫu có mật độ vi sinh vật nhiễm thấp; quy trình tăng sinh hai giai đoạn được sử dụng cho các mẫu có mật độ vi sinh vật nhiễm cao. Sau bước tăng sinh, canh khuẩn được chuyển sang bước phân lập trên môi trường chọn lọc đặc trưng. Các khuẩn lạc nghi ngờ được khẳng định bằng các đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hóa và miễn dịch bằng các thử nghiệm đặc trưng. Trong phát hiện L.monocytogenes cần sử dụng các chủng vi sinh vật làm đối chứng như: L.monocytogenes, L.innocua, S.aureus dung huyết yếu, R.equi. 2.3.3. Môi trường và hóa chất - Canh tăng sinh sơ cấp Listeria Enrichment Broth I (LBI). - Canh tăng sinh thứ cấp Listeria Enrichment Broth II (LBII) được chuẩn bị thành các ống nghiệm 10ml. - Môi trường Enrichment Broth (EB) cải biên từ môi trường LB, được sử dụng trong quy trình tăng sinh một giai đoạn. - Môi trường thạch Oxford Agar. - Thạch máu. - Môi trường thạch mềm BHI: BHI chứa 5g agar/l, phân phối 5ml vào trong các ống nghiệm. - Rhamnose Phenol Red Broth (RPR), Xylose Phenol Red Broth (XPR). - Thuốc thử catalase, oxidase. 2.3.4. Quy trình phân tích 2.3.4.1. Tăng sinh Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh LBI bằng Stomacher trong 30 giây. Ủ 30oC trong 24 giờ. Chuyển 0,1ml LBI sang ống 10ml LBII tiếp tục ủ ở 30oC trong 24 giờ. Quy trình tăng sinh một giai đoạn được thực hiện như sau: Cân 25g mẫu, thêm vào 225ml canh EB (đã được làm ấm ở 45oC nếu mẫu thử là các sản phẩm của sữa và ở 30oC đối với các sản phẩm khác) và tiến hành đồng nhất mẫu trong 30 giây. Ủ ở 30oC trong 48 giờ. 2.3.4.2. Phân lập Dùng tăm bông vô trùng thấm dịch mẫu từ ống tăng sinh, trải sang 1/2 đĩa môi trường Oxford Agar. Từ những vệt cấy này dùng que cấy vòng ria sang 1/2 đĩa còn lại. Ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ. Trên môi trường này khuẩn lạc Listeria có màu xám hay nâu được bao quanh bởi vòng đen, khuẩn lạc lõm, nhỏ, đường kính khoảng 1mm. 2.3.4.3. Khẳng định - Thử khả năng tan huyết: chọn khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch Oxford, dùng que cấy vòng cấy chuyền sang môi trường thạch máu, ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ. Trên môi trường thạch máu khuẩn lạc L.monocytogenes được bao quanh bởi vòng tan huyết hẹp do hiện tượng dung huyết dạng . Trước khi tiến hành thử khẳng định, cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ L.monocytogenes sang một môi trường lỏng không chọn lọc, ủ ở 25oC trong 20 giờ. - Thử nghiệm catalase và oxidase: L.monocytogenes có catalase (+) và oxidase (-). - Nhuộm gram: Listeria nhuộm gram dương. - Khả năng di động phương pháp giọt treo: Listeria spp chuyển động xoay tròn trong canh trùng ủ ở 25oC. Thử tính di động trong ống nghiệm: cấy vi trùng bằng cách đâm sâu vào thạch mềm trong ống nghiệm, ủ 25oC trong 40 giờ hoặc lâu hơn, kiểm tra sự tăng trưởng của vi khuẩn xung quanh đường cấy, Listeria spp di động tạo hình chiếc dù cách bề mặt thạch vài mm. - Khả năng biến dưỡng đường: ủ các ống canh trùng thử khả năng lên men đường ở 37oC trong 7 ngày. Kết quả (+) (màu vàng) thường quan sát được trong vòng 24 – 48 giờ L.monocytogenes lên men đường rhamnose nhưng không có khả năng lên men đường xylose. - Thử thử nghiệm CAMP: trên đĩa thạch dùng để thử CAMP, cấy S.aureus thành một đường cấy mỏng, tương tự cấy R.equi để tạo thành hai đường cấy song song cách nhau 4cm. Cấy chủng nghi ngờ Listeria ở giữa, gần nhưng không chạm vào hai đường cấy song song của S.aureus và R.equi. Có thể cấy một hoặc nhiều dòng vi khuẩn nghi ngờ L.monocytogenes (chủng thử nghiệm) để kiểm tra trên cùng một đĩa. Cấy chủng đối chứng (+) L.monocytogenes và chủng L.innocua. Ủ đĩa ở 37oC trong 20 – 36 giờ. Phản ứng (+) khi xuất hiện vùng cộng hưởng tan huyết rộng (5 – 10mm) và có hình dạng đầu mũi tên. Phản ứng (+) với S.aureus thường tạo vùng tan huyết hẹp (khoảng 2mm) có dạng hình tròn. L.monocytogenes cho phản ứng CAMP (+) với S.aureus và (-) với R.equi. Ngược lại, L.innocua có phản ứng CAMP (-) với cả hai loài S.aureus và R.equi. 2.3.4.4. Báo cáo kết quả Báo cáo phát hiện hoặc không phát hiện L.monocytogenes trong 25g mẫu. 2.4. Staphylococcus aureus 2.4.1. Tổng quan Thuộc nhóm tụ cầu khuẩn, Gram dương, hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S.aureus đều mẫn cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl. Một số dòng có khả năng làm tan máu trên môi trường thạch máu. Đường kính vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng đều nhỏ hơn đường kính của khuẩn lạc. Sản sinh ra nội độc tố enterotoxin bền nhiệt dẫn đến ngộ độc thực phẩm,các tế bào thường liên kết thành hình các chùm nho, không tạo bào tử, không di động, có khả năng sinh coagulase làm đông huyết tương, không phân bố trong tự nhiên, tồn tại chủ yếu trên da và tóc của người và động vật. Khi phát triển trong môi trường, tạo sắc tố có màu từ trắng tới vàng đậm. Sự hiện diện với mật độ cao của S.aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến. 2.4.2. Nguyên tắc S.aureus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng đông huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập. 2.4.3. Môi trường và hóa chất - Môi trường canh Mannitol Salt Broth (MSB): môi trường này được dùng để phân tích định tính S.aureus hay trong định lượng bằng phương pháp MPN. - Môi trường thạch máu: Máu được sử dụng là máu cừu hay bê non dưới 5 tháng tuổi đã được loại bỏ các sợi máu hay máu đã được bổ sung chất chông đông citrate. Môi trường cần được pha chế ít nhất 2 ngày trước khi sử dụng để kiểm tra khả năng bị nhiễm. - Môi trường thạch Baird Parker Agar (BPA): thành phần lòng đỏ trứng tươi và potassium tellurite chỉ được bổ sung vào môi trường sau khi khử trùng và làm nguội đến khoảng 60oC. - Môi trường thạch Tellurite Glycine Agar (TGA). - Môi trường Brain Heart Infusion (BHI). - Huyết tương thỏ: huyết tương thỏ được cố định bằng 0,1% EDTA hay sodium oxalate và được phân phối 0,3ml vào các ống nghiệm nhỏ. 2.4.4. Phân tích định tính Staphylococus aureus: Lấy 2ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 8ml môi trường MSB, trộn đều và ủ ở 37oC trong 24 giờ. Dùng que cấy vòng cấy ria dịch mẫu từ ống (+) (môi trường chuyển từ đỏ sang màu vàng) lên môi trường phân lập là thạch TGA hay thạch Baird Parker, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Tìm khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên môi trường phân lập có màu đen nhánh, sáng, tròn, lồi, đường kính 1 – 1,5mm có vòng sáng chung quanh khuẩn lạc. Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy vào ống môi trường BHI, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0,3ml huyết tương và ủ ở 37oC trong 24 giờ để thử phản ứng đông kết. Thực hiện song song một ống đối chứng không được cấy dịch vi sinh vật. Mẫu được kết luận là có S.aureus khi thử nghiệm coagulase này (+) (có sự xuất hiện của khối đông trong khi ống đối chứng không có). 2.4.5. Định lượng S.aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 2.4.5.1. Đồng nhất mẫu và pha loãng Cân chính xác 10 0,1g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dịch pha loãng, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây. Chuẩn bị dãy pha loãng thập phân thích hợp tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa thạch Baird Parker sẽ xuất hiện khoảng 10 – 100 khuẩn lạc/đĩa. 2.4.5.2. Phân lập trên môi trường chọn lọc Cấy 0,1ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường thạch Baird Parker. Dùng que cấy tam giác thủy tinh (thanh gạt thủy tinh) trải đều mẫu lên bề mặt môi trường cho đến khi khô. Thực hiện lập lại 3 đĩa môi trường thạch Baird Parker cho mỗi độ pha loãng. Thực hiện tương tự với môi trường thạch máu. Lật ngược đĩa, ủ ở 37 1oC trong 24 – 48 giờ đối với môi trường Baird Parker và 24 giờ đối với môi trường thạch máu. Sau 24 giờ, khuẩn lạc S.aureus trên môi trường thạch Baird Parker có đường kính khoảng 0,5 – 1mm, lồi, đen bóng có vòng sáng rộng khoảng 1 – 2 mm bao quanh. Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm như trên và tiếp tục ủ đến 48 giờ. Sau 48 giờ khuẩn lạc S.aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5mm, màu đen bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn lạc một số dòng S.aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn lạc như trên. Cần đếm và đánh dấu cả hai dạng khuẩn lạc. Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ S.aureus cho khuẩn lạc bóng loáng, đục, lồi có màu xám hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1 – 2mm. Hầu hết S.aureus có vùng tan máu, tuy nhiên một số dòng không tạo vùng tan máu này. 2.4.5.3. Khẳng định Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng từ môi trường Baird Parker lên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 1oC trong 24 giờ. Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống nghiệm chứa huyết tương đã rã đông, ủ ở 37 1oC. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 24 giờ. Tính tỉ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng. Thực hiện tương tự với các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu. Kết quả thử nghiệm là (+) khi có khối đông huyết tương hình thành (mọi mức độ đông kết đều được xem là (+)). Kết quả là (-) khi không có hình thành khối đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy. 2.4.5.4. Kết quả Dựa vào số khuẩn lạc nghi ngờ là S.aureus đã đếm trên các đĩa petri và dựa vào tỷ lệ số ống phản ứng coagulase dương tính trên tổng số ống thử phản ứng, áp dụng công thức dưới đây để tính số lượng S.aureus trung bình có trong 1ml hay 1g mẫu. Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) = Trong đó: F: độ pha loãng. Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng. Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng. Ht: tỉ số giữa khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc đặc trưng. Ha: tỉ số giữa số khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc không đặc trưng. 2.4.6. Định lượng S.aureus bằng phương pháp MPN Phương pháp này được dùng để định lượng S.aureus trong mẫu có mật độ S.aureus thấp nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao, khó có thể xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Dung dịch mẫu được pha loãng thập phân với ba độ pha loãng thập phân liên tiếp (ví dụ 10-1,10-2,10-3). Tùy theo yêu cầu về độ chính xác của kết quả phân tích, có thể sử dụng phương pháp MPN với hệ thống 9 ống nghiệm (3 độ pha loãng với 3 lần lặp lại ở mỗi độ pha loãng) hay hệ thống 15 ống nghiệm (3 độ pha loãng với 5 lần lặp lại ở mỗi độ pha loãng). Môi trường được sử dụng là canh MSB hay Tryptose Soy Broth chứa 10% muối NaCl. Cấy 1ml dịch mẫu có độ pha loãng khác nhau vào ống 10ml môi trường, ủ ở 37oC trong 48 giờ. Chọn các ống (+), có vi sinh vật phát triển làm đục môi trường để tiến hành phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường thạch Baird Parker, ủ ở 37oC trong 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường Baird Parker để thực hiện thử nghiệm khẳng định S.aureus tương tự trường hợp phương pháp đếm khuẩn lạc. Các đĩa cho kết quả khẳng định S.aureus (+) được đối chiếu với các ống nghiệm trong hệ thống các dãy ống nghiệm ban đầu và ghi lại số ống nghiệm (+) ứng với mỗi độ pha loãng. Tra bảng MPN để suy ra mật độ S.aureus trong mẫu (số MPN/g hay MPN/ml). 2.5. Bacillus Cereus 2.5.1. Tổng quan B.cereus là những trực khuẩn, gram dương, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, di động, tạo nội bào tử, lên men glucose sinh hơi, phản ứng VP (+), có khả năng sử dụng nitrate. Loài này tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 5 – 50oC, tối ưu ở 35 – 40oC; pH dao động từ 4,5 – 9,3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Trên môi trường chọn lọc loài này tạo khuẩn lạc rất to, mọc lan, rìa nhăn. Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô…). Vi khuẩn có thể tiết ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa. Loài này phân biệt với các loài khác trong Bacillus nhóm 1 như B.anthracis gây bệnh than ở người, B.thuringiensis tạo độc tố kết tinh gây bệnh cho côn trùng. 2.5.2. Nguyên tắc B.cereus được phát hiện và định lượng bằng môi trường thạch chọn lọc: Mannitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP) hoặc Cereus Selective Agar (MOSSEL), Polymycin Elgelb Mannitol Bromothymol Blue Agar (PEMBA). Khuẩn lạc B.cereus có hình thái đặc trưng trên các môi trường này. Các khuẩn lạc này có thể tiếp tục khẳng định dựa trên các thử nghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men glucose sinh acid trong điều kiện kỵ khí, khử nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP (+), thủy phân L-tyrosine, tăng trưởng được trong 0,001% lysozyme. Ngoài ra B.cereus cũng đươc định lượng bằng phương pháp MPN. 2.5.3. Môi trường và hóa chất - Nước pepton đệm Buffered Peptone Water (BPW). - Thạch Mannitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP). - Thạch Polymycin Elgelb Mannitol Bromothymol Blue Agar (PEMBA). - Môi trường thạch Cereus Selective Agar (MOSSEL). - Nhũ lòng đỏ trứng (Egg Yolk Emulsion), 50%. - Canh Trypticase Soy Polymycin (TSP). - Canh Phenol Red Glucose. - Thạch Tyrosine. - Canh Lysozyme. - Môi trường thử nghiệm Voges-Proskauer. - Canh Nitrate Broth. - Thạch dinh dưỡng Nutrient Agar cho B.cereus. - Thạch máu Trypticase Soy Sheep. - Môi trường kiểm tra sự di động. - Thuốc thử nitrate (dung dịch A, dung dịch B). - Hóa chất nhuộm Gram. 2.5.4. Quy trình phân tích Cho 25g mẫu vào túi PE, bổ sung 225ml môi trường pepton đệm (BPW) đồng nhất để có độ pha loãng 10-1, đồng nhất bằng Stomacher trong 1 phút. Mẫu tiếp tục được pha loãng thành dãy thập phân để có các độ pha loãng thích hợp. 2.5.4.1. Định lượng B.cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc: a. Phát hiện bằng môi trường chọn lọc Trải 0,1ml mỗi độ pha loãng lên môi trường thạch MYP, ủ 24 giờ ở 30oC. Do B.cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng polymycin nên trên môi trường này khuẩn lạc B.cereus có màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa chứng tỏ lecithinase được tạo thành. Trường hợp sử dùng môi trường MOSSEL, khuẩn lạc B.cereus to, màu hồng, xung quanh có vòng sáng. Chọn từ 5 khuẩn lạc (+) cấy sang thạch nghiêng để chuẩn bị cho các phản ứng khẳng định B.cereus. b. Các thử nghiệm khẳng định Nhuộm Gram: cấy ria các khuẩn lạc chọn từ môi trường MYP hay MOSSEL sang ống thạch dinh dưỡng. Ủ ở 30oC trong 24 giờ. Sau đó tiến hành nhuộm Gram, quan sát dưới kính hiển vi. Việc nhuộm Gram có thể được thực hiện bằng phương pháp Jensen hay phương pháp Hucker. Trước tiên, tạo vệt bôi vi sinh vật trên phiến kính. Chọn một phiến kính sạch, dùng bút ghi trên kính vẽ 1 vòng tròn đường kính khoảng 2cm ở mặt dưới của phiến kính. Đặt ở vị trí tương ứng với vòng đánh dấu ở mặt trên của phiến kính vài giọt nước cất thành một giọt lớn. Dùng que cấy vòng chuyển một ít sinh khối khuẩn lạc vào giọt nước trên phiến kính, khuấy nhẹ bằng đầu que cấy để được huyền phù đồng nhất và bôi đều trong khu vực của vòng tròn. Trường hợp chủng nằm trong dịch nuôi cấy thì dùng que cấy vòng chuyển vài vòng dịch tế bào lên vùng vòng tròn ở trung tâm bề mặt phiến kính, bôi đều trong khu vực của vòng tròn. Để yên cho vệt bôi khô. Dùng tay giữ hai cạnh của một đầu phiến kính, đưa phiến kính (ở vị trí cạnh vệt bôi) qua lại vài lần trên ngọn lửa đèn cồn hoặc đèn Bunsen để cố định vệt bôi trên kính. Tránh để vệt bôi tiếp xúc trực tiếp với ngọn lửa. Thực hiện tương tự để tạo một vệt bôi chung hai chủng vi sinh vật đối chứng trong cùng một phiến kính khác. Sử dụng E.coli làm chủng đối chứng cho Gram (-) và Staphylococcus aureus làm chủng đối chứng cho Gram (+). Theo phương pháp Jensen, nhỏ vài giọt dung dịch methyl violet lên vệt bôi, giữ yên trong 20 giây. Dùng bình xịt nước, bơm nước lên vệt bôi để rửa sạch phẩm nhuộm. Nhỏ vài giọt dung dịch KI/I2 lên vệt bôi, để yên 1 phút. Dùng bình xịt chứa cồn 95%, bơm cồn lên vệt bôi, rửa phẩm nhuộm đến vừa mất màu. Để yên vài giây sau đó rửa lại bằng nước. Nhuộm bằng dung dịch safranin 30 giây. Rửa sạch bằng nước. Thấm nước dừ bằng giấy lọc. Theo phương pháp của Hucker, bằng thao tác tương tự như ở phương pháp Jensen, nhuộm vệt bôi 1 phút bằng dung dịch crystal violet. Rửa bằng nước. Nhuộm bằng dung dịch KI/I2 trong 1 phút. Khử màu bằng cách xịt cồn 95% cho đến khi sạch màu. Rửa lại bằng nước và nhuộm bằng dung dịch safranin trong 2 phút. Sau khi thực hiện xong quy trình nhuộm, quan sát màu nhuộm của tế bào bằng vật kính 100X nhúng trong dầu. Tế bào nhuộm Gram (+) có màu tía (S.aureus), tế bào nhuộm Gram (-) có màu đỏ hồng (E.coli). B.cereus là trực khuẩn lớn, Gram dương, thường kết hợp với nhau thành dạng chuỗi. Bào tử hình bầu dục, không có dạng nang bào tử. Dùng que cấy vòng cấy chuyền một lượng sinh khối chủng thử nghiệm trong ống thạch dinh dưỡng vào 0,5ml BPW vô trùng. Huyền phù hóa dịch này để sử dụng cho các phản ứng sinh hóa. - Thử nghiệm lên men glucose: cấy vi khuẩn vào 3ml canh Phenol Red Glucose Broth, ủ ở 35oC, 24 giờ trong điều kiện kỵ khí. Lắc ống nghiệm thật mạnh và quan sát sự phát triển thông qua độ đục và sự chuyển màu môi trường từ đỏ sang vàng, chứng tỏ sự sinh acid từ glucose trong điều kiện kỵ khí. - Thử nghiệm khả năng khử nitrate: cấy vi khuẩn vào 5ml môi trường canh Nitrate Broth, ủ ở 35oC trong 24 giờ. Kiểm tra sự hiện diện của nitrite bằng cách bổ sung vài giọt dung dịch A và dung dịch B của thuốc thử nitrate. Nếu có màu cam xuất hiện trong vòng 10 phút thì chứng tỏ nitrate bị khử thành nitrite. - Thử nghiệm VP: Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đã ủ 18 – 24 giờ trên môi trường KIA hoặc TSI. Ủ yên các ống môi trường này ở 37oC trong 24 – 48 giờ hoặc đến 10 ngày khi cần thiết. Thử nghiệm VP là (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường, là (-) khi bề mặt môi trường không đổi màu. - Thử nghiệm khả năng thủy phân tyrosine: cấy vi khuẩn vào thạch nghiêng Tyrosine, ủ ở 35oC trong 48 giờ. Sự xuất hiện của sinh khối, khuẩn lạc là chỉ thị tyrosine bị phân hủy. - Thử nghiệm với canh Lysozyme Broth: cấy vi khuẩn vào 2,5ml môi trường Nutrient Broth chứa 0,001% lysozyme. Thực hiện tương tự với môi trường Nutrient Broth không chứa lysozyme. Ủ ống nghiệm ở 35oC trong 24 giờ. Kiểm tra sự tăng trưởng trong môi trường chứa lysozyme và môi trường đối chứng. Ủ những ống âm tính thêm 24 giờ trước khi kết luận kết quả thử nghiệm. c. Các thử nghiệm phân biệt các loài trong Bacillus nhóm 1 Để phân biệt các loài khác nhau trong Bacillus nhóm 1 cần tiến hành bổ sung các thử nghiệm sau: - Thử nghiệm tính di động: dùng que cấy vòng cấy dịch 24 giờ nuôi cấy thẳng vào giữa môi trường kiểm tra di động cho B.cereus. Ủ ở 30oC, từ 18 – 24 giờ và kiểm tra dưới ánh đèn kiểu mọc dọc theo đường cấy. Loài di động mọc khuếch tán vào môi trường theo hướng xa đường cấy. Loài không di động chỉ mọc trong và dọc theo đường cấy. Bổ sung 0,2ml nước cất vô trùng vào bề mặt môi trường thạch nghiêng Nutrient Agar. Cấy huyền phù vi khuẩn vào. Ủ thạch nghiêng từ 6 – 8 giở ở 30oC. Nhỏ nước vô trùng lên phiến kính và đặt sinh khối vào. Quan sát ngay dưới kính hiển vi để kiểm tra sự di động. Hầu hết các chủng B.cereus và B.thuringiensis là di động, B.anthracis và hầu hết các chủng B.mycoides không di động. - Sự hình thành rễ giả: chạm nhẹ que cấy vòng mang huyền phù 24 giờ nuôi cấy lên giữa đĩa Nutrient Agar. Ủ ở 30oC trong 48 – 72 giờ. Kiểm tra sự phát triển của rễ giả, đặc trưng bởi việc tạo những khuẩn lạc có cấu trúc giống như rễ hoặc tóc mở rộng vài centimet từ vị trí cấy. B.cereus không tạo cấu trúc rễ giả, thường tạo những nhóm khuẩn lạc xù xì khác với cấu trúc rễ giả đặc trưng của B.mycoides. - Thử nghiệm làm tan máu: cấy chủng lên môi trường thạch máu Trypticase Soy. Ủ ở 35oC trong 24 giờ. B.cereus làm tan máu mạnh và tạo vùng tan máu hoàn toàn () 2 – 4mm xung quanh vùng phát triển. B.thuringiensis và B.mycoides cũng tan máu . B.anthracis thường không làm tan máu sau 24 giờ. - Sự tạo độc tố protein dạng tinh thể: cấy huyền phù tế bào 24 giờ lên ống thạch nghiêng Nutrient Agar, ủ 24 giờ ở 30oC, sau đó để ở nhiệt độ phòng 2 – 3 ngày. Thực hiện nhuộm bằng phẩm màu fuchsin. Quan sát dưới kính hiển vi những tinh thể độc tố hình tứ giác (dạng kim cương) được nhuộm màu tối nhỏ hơn bào tử. Tinh thể độc tố của B.Thuringiensis xuất hiện nhiều sau 3 – 4 ngày nuôi cấy nhưng không thể phát hiện được bằng kỹ thuật nhuộm cho đến khi bào tử nang vỡ ra. Do đó, nếu không quan sát được bào tử tự do, cần để thêm vài ngày ở nhiệt độ phòng rồi tiến hành kiểm tra lại. B.cereus và các Bacillus khác cùng nhóm không có tinh thể độc. d. Cách tính kết quả Tính số tế bào B.cereus trên 1g mẫu dựa vào số khuẩn lạc mọc ở mỗi độ pha loãng và hiệu chỉnh bằng tỷ lệ khẳng định (% khuẩn lạc được xác nhận là B.cereus). Ví dụ, số khuẩn lạc đếm được ở độ pha loãng 10-4 là 65, và có 4 trong số 5 khuẩn lạc được chọn xác nhận là B.cereus sau khi kiểm tra bằng các phản ứng sinh hóa. Như vậy, số tế bào B.cereus trong 1g thực phẩm là 65 4/5 10.000 10 = 5.200.000 (phải nhân với 10 vì chỉ có 0,1ml mẫu được sử dụng để trải đĩa). 2.5.4.2. Định lượng B.cereus bằng phương pháp MPN Phương pháp MPN được sử dụng để định lượng B.cereus trong những mẫu thực phẩm không được có B.cereus nhiều hơn 10 tế bào/g. Phương pháp này cũng được sử dụng để kiểm tra những mẫu thực phẩm có tinh bột khô mà phương pháp đếm khuẩn lạc không thích hợp. Cấy 1ml mẫu có độ pha loãng 10-1, 10-2 và 10-3 vào ống nghiệm chứa 10ml canh Trypticase Soy-Polymycin. Thực hiện 3 ống nghiệm lặp lại cho mỗi độ pha loãng (hệ 9 ống nghiệm). Ủ ở 30oC trong 48 2 giờ. Kết quả là (+) khi có sự tăng trưởng của B.cereus. Cấy ria từ các ống (+) lên môi trường thạch MYP. Ủ đĩa ở 30oC trong 24 – 48 giờ. Chọn những khuẩn lạc màu hồng eosin, lecithinase (+), cấy chuyển sang thạch nghiêng Nutrient Agar để tiến hành các phản ứng sinh hóa khẳng định B.cereus. Dựa vào bảng MPN tính trị số MPN/g mẫu dựa vào số ống (+) B.cereus được khẳng định: TSP (+), MYP (+), các thử nghiệm sinh hóa khác. 2.6. Clostridium 2.6.1. Tổng quan Giống Clostridium là các vi khuẩn gram dương, hình que, kỵ khí, sinh bào tử, phần lớn di động, có thể thủy giải saccharide và protein trong các hoạt động thu nhận năng lượng. Những loài thủy giải saccharide có thể lên men các loại đường polysaccharide tạo thành acetic acid, butyric và rượu. Nhiều loài có thể thủy giải protein và chuyển hóa không hoàn toàn các acid amin tạo thành mùi rất khó chịu trong sản phẩm. Hầu hết giống Clostridium thuộc nhóm ưa nhiệt vừa, tuy nhiên có một số loài thuộc nhóm ưa nhiệt và một số loài khác thuộc nhóm ưa lạnh. Các loài Clostridium hiện diện trong đất, một số loài trong nhóm này gây bệnh cho người và động vật, một số loài khác gây hư hỏng thực phẩm, khử sulphite thành sulphur tạo ra màu đen và gây mùi khó chịu. Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng là C.botulinum và C.perfringens. Ngoài ra, loài C.tetani là tác nhân gây bệnh uốn ván, một số loài khác như C.novyi, C.perfringens, C.septicum, C.sordellii… gây hoại tử cho mô bị nhiễm, gây biến chứng tại các vết thương nhưng cho đến nay chưa xác định được các đặc điểm bệnh lý. Đặc điểm quan trọng của một số loài thuộc giống Clostridium thường gặp là như sau: - C. botulinum là loài sống kỵ khí bắt buộc, chỉ tăng trưởng được trong môi trường trung tính, không có sự cạnh tranh với các vi sinh vật khác. Các dòng khác nhau trong loài này có các đặc điểm nuôi cấy khác nhau và 6 kiểu kháng nguyên được ký hiệu từ A – F. Kiểu kháng nguyên A, B và F có hoạt tính thủy giải protein tạo nên một vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc trên môi trường Willis và Hobbs, trong khi đó kiểu kháng nguyên C, D, E không có các đặc tính này. Kiểu kháng nguyên A thường được tìm thấy trong các mẫu thịt trong khi đó kiểu E chỉ được phân lập từ các mẫu cá. - C.terani là loài kỵ khí bắt buộc, bị chết ngay khi tiếp xúc với không khí. Loài này có đặc điểm tạo khối kết tụ khi được nuôi cấy trong môi trường lỏng. Loài này được tìm thấy trong đất, trong phân các loài động vật và người, là loài gây bệnh uốn ván rất nguy hiểm. - C.perfringens là loại kỵ khí không bắt buộc, rất ít khí tạo bào tử trong các môi trường nuôi cấy nhân tạo, nhưng có thể quan sát được bào tử khi nuôi cấy trong môi trường Ellner, môi trường co bổ sung muối mật và bicarbonate hay quinoline. Loài này có sáu kiểu kháng nguyên được ký hiệu từ A – F. Kiểu kháng nguyên A thường gây hoại tử cho các vết thương và gây ngộ độc thực phẩm. 2.6.2. Nguyên tắc Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định bằng cách sử dụng môi trường có chứa ferri ammonium citrate và disodium sulphite, ủ ở 37oC trong 1 – 2 ngày. Nếu nghi ngờ có Clostridium ưa nhiệt có thể ủ thêm ở 50oC. Trên môi trường này các khuẩn lạc Clostridium có màu đen do phản ứng giữa ion sulphide (S2-) và ion sắt (Fe2+) có trong môi trường. 2.6.3. Môi trường và hóa chất - Pepton đệm Buffered Peptone Water (BPW). - Iron Sulphite Agar (ISA). - Perfringens Selective Agar (hay Shahidi Ferguson Perfringens, SFP). 2.6.4. Quy trình phân tích Mẫu được giải đông ở nhiệt độ không quá 45oC và được phân tích ngay sau khi giải đông. Cân 10g (hoặc 25g) mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 90ml (hoặc 225ml) nước pepton đệm và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Mẫu được tiếp tục pha loãng thập phân tùy mật độ hiện diện của Clostridium trong mẫu. Trước khi cấy, mẫu được xử lý nhiệt ở 70 – 80oC trong 20 phút để diệt bớt tế bào sinh dưỡng của các vi sinh vật khác. Cấy vào đĩa vô trùng 1ml dịch mẫu đã được pha loãng thích hợp vào một đĩa petri vô trùng. Đổ 15ml môi trường ISA hoặc SFP Agar đã được ủ ấm ở 45oC vào đĩa, lắc đều. Sau khi môi trường đã đông, đổ thêm lên trên bề mặt khoảng 10ml ISA hoặc SFP Agar. Một phương pháp khác là cho vào một ống nghiệm vô trùng 1ml dịch mẫu ở nồng độ thích hợp, thêm 12ml ISA hoặc SFP Agar đã được ủ ấm ở 45oC vào ống, trộn đều mẫu. Sau khi môi trường đã đông, đổ thêm lên trên bề mặt 2 – 3ml ISA hoặc SFP Agar. Đĩa hoặc ống nghiệm đã cấy mẫu được ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ trong các bình kỵ khí. Nếu nghi ngờ Clostridium chịu nhiệt, thực hiện ủ song song ở 37oC và 50oC. Thông thường, việc đọc kết quả trên đĩa là dễ hơn trong ống nghiệm. ISA là môi trường không chọn lọc nên các loài vi khuẩn sinh H2S khác không phải là Clostridium cũng tăng trưởng được và tạo khuẩn lạc màu đen trên môi trường này. Để khẳng định khuẩn lạc là Clostridium cần thực hiện thêm những quy trình tiêu chuẩn để giúp khẳng định kết quả. 2.6.5. Báo cáo kết quả Đếm tất cả các khuẩn lạc đen, hoặc có thể bao quanh bởi vòng đen. Mật độ Clostridium trong mẫu được tính từ số khuẩn lạc đếm được nhân với hệ số pha loãng mẫu và được trình bày ở dạng CFU/g hay CFU/ml sản phẩm. 2.7. Coliform và E.Coli 2.7.1. Tổng quan Bao gồm một số vi khuẩn Gram âm, không tạo bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng lên men đường lactoza, sinh hơi trong vòng 48 giờ ở nhiệt độ nuôi cấy thích hợp. Coliform ưa nhiệt (coliform phân): lên men lactoza ở nhiệt độ 44oC. E.Coli thuộc nhóm Coliform ưa nhiệt và là loại coliform rất bền với phenol 0,085 và sinh indol ở nhiệt độ 42 – 44oC. Xác định lượng Coliform và E.coli cho biết mức độ ô nhiễm và tình trạng vệ sinh trong phân xưởng sản xuất. 2.7.2. Định lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân và E.coli bằng phương pháp MPN 2.7.2.1. Nguyên tắc Số lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân và E.coli trong mẫu thực phẩm chứa mật độ thấp của nhóm vi khuẩn này có thể được xác định bằng phương pháp MPN (Most Probable Number). Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng tính MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu. 2.7.2.2. Môi trường và hóa chất - Môi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth LSB (canh Lauryl Sulphate). - Môi trường lỏng Brilliant Green Lactose Bile Salt (canh BGBL). - Môi trường lỏng E.coli (E.coli medium, canh EC). Các môi trường lỏng trên được chuẩn bị trong các ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược. Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống Durham. - Canh Tryptone. - Môi trường rắn Simmon Citrate Agar (thạch Simmon Citrate). - Dung dịch nước muối pepton SPW (Saline Pepton Water). - Thuốc thử Kovac’s. - Thuốc thử Methyl Red. - Thuốc thử -napthol. 2.7.2.3. Quy trình phân tích Chuẩn bị đồng nhất mẫu hoặc pha loãng mẫu để có dịch mẫu có độ pha loãng 10-1. a. Định lượng Coliforms Tuần tự cấy 1ml dịch mẫu đã pha loãng 10-1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10ml canh LSB. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10-2 và 10-3. Đây là trường hợp xác định MPN bằng hệ 3 dãy nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại (hệ 3 3 hay 9 ống nghiệm). Nếu nghi ngờ số lượng Coliforms trong mẫu quá cao, phải sử dụng các mẫu có bậc pha loãng cao hơn. Ủ các ống nghiệm ở 37oC trong 48 giờ. Ghi nhận số ống có sinh hơi. Dùng que cấy vòng (khuyên cấy) cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa canh BGBL và ủ ở 37oC 1oC trong 48 giờ. Ghi nhận số ống cho kết quả (+) (có sinh hơi) ứng với mỗi độ pha loãng. b. Định lượng Coliforms chịu nhiệt Dùng que cấy vòng chuyển một vòng dịch mẫu từ các ống canh LSB (+) sang môi trường canh EC ủ ở 44,5 0,2oC trong 24 giờ. Đếm số lượng các ống cho kết quả (+) (sinh hơi) ở mỗi độ pha loãng. c. Định lượng Coliforms phân Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường dịch EC sang môi trường thạch đĩa EMB. Ủ các đĩa này ở 37oC trong 24 giờ. Các khuẩn lạc tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím là khuẩn lạc của Coliforms phân hay E.coli giả định. Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1mm và cấy chuyển vào canh Trypton, ủ ở 44,5 0,2oC trong 24 giờ. Nhỏ thuốc thử Kovac’s vào các ống nghiệm. Ống nghiệm có sự xuất hiện của màu đỏ trong môi trường trong vài phút là ống (+). Thực hiện tương tự cho tât cả các ống (+) trên môi trường EC. Ghi nhận số lượng các ống cho kết quả (+) trên môi trường Trypton tương ứng với mỗi độ pha loãng. d. Định lượng E.coli Trước tiên thực hiện tương tự như trường hợp định lượng Coliforms phân như trên. Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB. Ủ các đĩa này ở 37oC trong 24 giờ để tìm các khuẩn lạc E.coli giả định (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím). Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1mm và cấy vào các môi trường MRVP, Simmon Citrate Agar để thực hiện các thử nghiệm IMViC. Khuẩn lạc E.coli giả định cho kết quả thử nghiệm IMViC tuần tự là + + - - chính là E.coli. Ống nghiệm cho kết quả (+) trong môi trường EC và khuẩn lạc E.coli giả định trên môi trường EMB cho kết thử nghiệm IMViC như trên là ống nghiệm có E.coli (+). Thực hiện tương tự cho tất cả các ống nghiệm cho kết quả (+) trong môi trường EC và tạo được khuẩn lạc E.coli giả định trên môi trường EMB. Ghi nhận số lượng các ống nghiệm có E.coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu. 2.7.2.4. Cách đọc kết quả Ở tất cả các trường hợp nêu trên, từ số lượng các ống nghiệm có E.coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng MPN thích hợp (bảng 3 3 tức 9 ống nghiệm) để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng. 2.7.3. Định lượng Coliforms, Coliform phân bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 2.7.3.1. Nguyên tắc Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ ở 37 1oC trong 24 – 48 giờ. Ngoài lactose, môi trường chọn lọc cho Coliforms còn chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dương và chất chỉ thị pH như aeutral red, crystal violet. Trên môi trường này khuẩn lạc Colifoms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính > 0,5 mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật. Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL. Để định lượng Coliforms phân, thực hiện tương tự nhưng thay đổi nhiệt độ ủ là 44oC. Mật độ Coliforms hay Coliforms phân được tính dựa trên số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, tỉ lệ khẳng định và độ pha loãng mẫu trước khi cấy vào đĩa. Để phát hiện được bộ phận tế bào Coliforms bị tổn thương hay bị giảm sức sống do quá trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, bộ phận này có thể không tăng trưởng được trong môi trường chọn lọc, trước tiên mẫu được cấy vào một môi trường không chọn lọc như TSA, trước khi bổ sung môi trường chọn lọc. 2.7.3.2. Môi trường và hóa chất - Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA) được chuẩn bị trong các bình hay chai thủy tinh, hấp khử trùng và bảo quản ở 4 – 8oC. Trước khi sử dụng, môi trường được đun chảy và làm nguội ở 45oC trong bể điều nhiệt. - Violet Red Bile Agar (VRB) được chuẩn bị vô trùng trong các chai thủy tinh, đun chảy và làm nguội ở nhiệt độ 45oC trong bể điều nhiệt trước khi sử dụng. Có thể sử dụng môi trường Desoxycholate Agar thay cho VRB. - Môi trường canh Brilliant Green Lactose Broth (BGBL) được phân phối 10ml vào mỗi ống nghiệm vô trùng chứa một ống Durham úp ngược. Hấp khử trùng. Sau khi hấp kiểm tra các ống để đảm bảo không có bọt khí trong ống Durham. - Môi trường canh EC Broth được chuẩn bị tương tự như trường hợp môi trường BGBL. - Môi trường canh Trypton Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp khử trùng. - Thuốc thử Kovac’s hay Indol. 2.7.3.3. Quy trình phân tích Mẫu được đồng nhất hóa và pha loãng tương tự như phần định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí sao cho chứa <100 tế bào Coliforms trong 1ml dung dịch pha loãng. Chuyển 1 ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri. Bổ sung vào mỗi đĩa đã cấy mẫu khoảng 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt ở 45oC. Lắc tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 – 5 lần để trộn đều dịch mẫu với môi trường. Để ở nhiệt độ phòng trong 1 – 2 giờ để hồi phục các tế bào bị tổn thương. Bổ sung vào mỗi đĩa 10 – 15ml môi trường thạch VRB ở nhiệt độ 45oC lên trên môi trường TSA. Chờ cho môi trường trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37 1oC trong 24 – 48 giờ. Thực hiện tương tự trên mẫu ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp sao cho mỗi đĩa sẽ xuất hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc và lặp lại ít nhất 2 đĩa ứng với mỗi nồng độ pha loãng. - Thử nghiệm khẳng định Coliforms: Trong trường hợp mẫu có chứa các nguồn carbon khác không phải lactose, để tránh các trường hợp vi sinh vật sử dụng các nguồn carbon trong mẫu để lên men và tạo khuẩn lạc có hình dạng tương tự Coliforms cần thực hiện thêm bước khẳng định như sau: Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cấy chuyển sang các ống nghiệm chứa môi trường BGBL (trường hợp khẳng định Coliforms tổng số) hoặc môi trường EC (trường hợp khẳng định Coliforms phân). Ủ các ống BGBL ở 37 1oC và các ống EC ở 44oC trong 24 – 48 giờ. Kết quả khẳng định là (+) khi vi khuẩn tăng trưởng làm đục môi trường và sinh hơi trong ống Durham. Tính tỉ lệ khẳng định là tỉ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả (+) với số khuẩn lạc được dùng trong thử nghiệm khẳng định. Ngoài ra, trường hợp thử nghiệm khẳng định Coliforms phân, các khuẩn lạc cho kết quả (+) trên EC cần được thực hiện thử nghiệm indol ở 44oC. Thử nghiệm khẳng định Coliforms phân chỉ được xem là (+) khi vừa là (+) trên môi trường EC vừa là (+) trên thử nghiệm Indol. 2.7.3.4. Cách tính kết quả Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỉ lệ khẳng định, tính mật độ của Coliforms và Coliforms phân theo công thức sau: A (CFU/g hay CFU/ml) = R N: tổng số khuẩn lạc đếm được. ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng. v: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa. fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm. R: tỉ lệ khẳng định. 2.7.4. Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 2.7.4.1. Nguyên tắc Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose, ủ ở 44oC trong 24 giờ, đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng của Coliforms. Khẳng định các khuẩn lạc đã đếm là E.coli bằng các thử nghiệm IMViC. 2.7.4.2. Môi trường và hóa chất - Môi trường canh Tryptone Soya Agar (TSA) và môi trường thạch Violet Red Bile Agar (VRB) được chuẩn bị tương tự phần định lượng Coliforms. - Môi trường canh Escherichia coli Broth (EC Broth) được phân phối 10ml trong mỗi ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược, hấp khử trùng để nguội và kiểm tra không có sự hiện diện của bọt khí trong ống Durham. Các ống EC này được bảo quản ở 2 – 8oC cho đến khi sử dụng. - Môi trường canh Lactose Tryptone Lauryl Sulphate Broth (LST Broth) được chuẩn bị tương tự như môi trường canh EC. - Môi trường canh Tryptone Broth được chuẩn bị tương tự phần định lượng Coliforms. - Môi trường canh MR-VP Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp khử trùng để nguội và bảo quản ở 2 – 8oC cho đến khi sử dụng. - Môi trường thạch Simmon Citrate được chuẩn bị dưới dạng các ống thạch nghiêng có màu xanh lục. - Thuốc thử Kovac’s. 2.7.4.3. Quy trình phân tích Mẫu được đồng nhất, pha loãng và định lượng tương tự như phần Coliforms phân với bước khẳng định được tiến hành như sau: Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cấy chuyển sang môi trường canh EC, ủ ở 44 0,5oC trong 24 giờ. Chọn các ống cho kết quả (+) (sinh hơi) và dùng que cấy vòng cấy chuyền sang các môi trường sau: canh Tryptone, canh MR-VP, thạch Simmon Citrate. Ủ các môi trường trên ở 44 0,5 oC trong 24 giờ. Thực hiện thử nghiệm Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate. Ghi nhận số khuẩn lạc cho thử nghiệm khẳng định E.coli (+) (IMViC là + + - -). 2.7.4.4. Cách tính kết quả Tính tỉ lệ khẳng định và tính mật độ E.coli (CFU/ml hay CFU/mg) theo công thức tương tự ở trên. 2.8. Tổng nấm men nấm mốc 2.8.1. Tổng quan Nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật rất đa dạng, cho đến nay có hơn 400.000 loài nấm men và nấm mốc đã được mô tả. Đây là nhóm vi sinh vật nhân thật, có vách tế bào là lớp vỏ chitin, có nhân và các bào quan khác. Tất cả các loài men và mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn carbon hữu cơ để cung cấp năng lượng từ môi trường bên ngoài. Vì thế vi sinh vật này thường xuyên được phân lập từ thực phẩm hay các nguồn giàu dinh dưỡng khác. Có thể phân biệt nấm men và nấm mốc theo khái niệm đơn giản như sau: nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty, nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiều nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuỗi. Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là nấm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường. Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn khuẩn ty. Quá trình tăng trưởng của nấm men và nấm mốc phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố từ môi trường. Hầu hết nấm mốc, nấm men đều thuộc nhóm vi sinh vật ưa mát, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chúng trong khoảng 20 – 28oC, một số ít trong nhóm này ưa lạnh hay ưa nóng. Nước hoạt tính cũng là một nhân tố ảnh hưởng rất quan trọng đến tăng trưởng. Hầu hết các loài nấm mốc và nấm men phát triển tốt trong cơ chất có nước hoạt tính khoảng 85% hay lớn hơn, một số ít loài có thể tăng trưởng trong cơ chất có nước hoạt tính thấp hơn khoảng 60 – 70%. Nấm mốc và nấm men tăng trưởng được trong vùng pH từ 2 – 9, trong đó pH thích hợp nhất nằm trong khoảng 4 – 6,5. Hầu hết nấm mốc, nấm men đều thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, một số có thể phát triển trong điều kiện vi hiếu khí. Một số loài có thể tiếp nhận oxy nguyên tử từ cơ chất của chúng, nhưng dù ở dạng nào, oxy vẫn là nguyên tố cần thiết cho quá trình phát triển của nấm mốc và nấm men. Trong thực phẩm, nấm mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm, một số có thể tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm. 2.8.2. Nguyên tắc Mật độ nấm mốc, nấm men trong mẫu được xác định chung dưới dạng tổng nấm mốc nấm men bằng kỹ thuật pha loãng, trải và đếm khuẩn lạc trên môi trường Dichloran Glycerol Agar (DG18) hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC). Môi trường DG18 được sử dụng cho các loại mẫu thực phẩm có hàm lượng nước thấp như các loại thực phẩm khô: gạo, ngũ cốc, tiêu, các loại thực phẩm có dầu, có hàm lượng đường hay muối cao. Môi trường DRBC được sử dụng cho các mẫu có hàm lượng nước cao như sữa và các sản phẩm của sữa, các loại rau quả và trái cây tươi, các loại đồ hộp… Đối với mẫu có mật độ nấm mốc thấp, ví dụ như mỹ phẩm, môi trường được sử dụng là môi trường Malt Extract Agar (MEA) hay Potato Dextrose Agar (PDA) chứa 40ppm chloramphenicol hay chlotetracyline. 2.8.3. Môi trường và hóa chất - Dung dịch pha loãng (nước pepton 1%). - Môi trường thạch Dichloran Glycerol Agar (DG18). - Môi trường thạch Dichloran Rose Bengal Chloramplenicol Agar (DBRC). - Môi trường thạch Malt Extract Agar (MEA). - Môi trường thạch Potato Dextrose Agar (PDA). - Môi trường thạch Sabouraud Dextrose Agar (SDA). - Môi trường thạch Sabouraud Dextrose Broth (SDB). Các loại môi trường thạch được chuẩn bị trong các đĩa petri, làm khô bề mặt trong điều kiện vô trùng, tránh ánh sáng trước khi sử dụng. Môi trường thạch Sabouraud Dextrose Agar còn được chuẩn bị dưới dạng các ống thạch nghiêng. 2.8.4. Quy trình phân tích định tính Đối với mẫu có nguy cơ nhiễm và mật độ nhiễm nấm mốc quá thấp việc phân tích thường được thực hiện một cách định tính theo quy trình như sau: Mẫu được pha loãng 10-1 và đồng nhất trong môi trường SDB. Dịch đồng nhất được ủ ở 30oC, theo dõi từng ngày đến 7 ngày. Các khuẩn lạc nấm mốc xuất hiện trên các đĩa môi trường này được cấy chuyền lên bề mặt ống thạch nghiêng SDA để định danh khi cần thiết. 2.8.5. Quy trình phân tích định lượng Cân 10g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 90ml dung dịch pha loãng. Trường hợp mẫu dạng khô, ngâm mẫu trong dung dịch khoảng 30 phút trước khi đồng nhất mẫu. Mẫu được đồng nhất bằng máy dập mẫu trong 2 phút và được pha loãng thành các dãy nồng độ thập phân liên tiếp thích hợp. Hút vô trùng 0,1ml dịch mẫu lên các đĩa môi trường DBRC hoặc DG18. Nếu mật độ nấm men và nấm mốc trong mẫu thấp, có thể cấy 1ml mẫu. Dùng que gạt thủy tinh trải dịch mẫu đều trên bề mặt đĩa môi trường cho đến khô. Đặt ngửa đĩa trong bao nylon, để hở miệng bao, ủ ở nhiệt độ 25oC trong 5 – 7 ngày. Đĩa được đặt ngửa để tạo độ ẩm thích hợp cho sự phát triển nấm men mốc và hạn chế làm khô thạch. Thực hiện ba đĩa cho mỗi nồng độ pha loãng. Đếm và tính số khuẩn lạc nấm mốc và nấm men trên tất cả các đĩa cấy. Khi cần thiết phải quan sát bằng kính hiển vi soi nổi hay kính lúp để phân biệt khuẩn lạc nấm men hay nấm mốc. Kết quả được ghi nhận bằng đơn vị CFU/g. Nếu có yêu cầu phân loại hay định danh các loài nghi ngờ sinh độc tố, các khuẩn lạc nấm mốc được cấy chuyền vào trong các ống thạch nghiêng SDA để gởi đến các phòng thí nghiệm chuyên định danh và phân loại nấm. Cần lưu ý rằng trong thời gian ủ nấm mốc có thể tạo bào tử và phát tán vào trong môi trường nuôi cấy tạo nên các khuẩn lạc mới. Để hạn chế hiện tượng này, trong suốt thời gian ủ, không được chạm tay hoặc di chuyển các đĩa cho đến khi đếm kết quả. Mặt khác, khi tiến hành đếm khuẩn lạc cần hạn chế việc mở đĩa để hạn chế sự phát tán của bào tử vào trong không khí, gây nhiễm vào trong mẫu hay môi trường nuôi cấy khác. CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT KHÔNG TRUYỀN THỐNG 3.1. Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh Phân tử adenosine triphosphate (ATP) được tìm thấy trong tất cả các tế bào sống (tế bào Eukaryote và Prokaryote) nên sự phát hiện ATP là dấu hiệu để nhận biết vật chất sống đang tồn tại. ATP có thể được phát hiện một cách nhanh chóng bởi lượng ánh sáng phát ra thông qua sự kết hợp với enzyme luciferase nhờ một máy đo ánh sáng. Kỹ thuật này có thể phát hiện được 1pg ATP (10-12g), tương ứng với khoảng 1000 tế bào vi khuẩn (10-15g ATP/tế bào). Độ nhạy này có được khi sử dụng với những hóa chất thương mại (thường đắt tiền). Sự phân tích sẽ diễn ra chỉ trong vài phút và vì thế phương pháp này được xem là nhanh hơn và thuận lợi hơn so với phương pháp đếm khuẩn lạc. Việc dùng phương pháp đo hàm lượng ATP để xác định rõ số vi sinh vật đang hiện diện đã được biết đến vào năm 1960. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi nhiều sự cải tiến trong việc thiết kế máy đo lượng ánh sáng phát ra (giảm giá thành và có thể mang đi được) và những hóa chất ổn định sự phát sáng. Phương pháp này được ứng dụng trong 3 lĩnh vực: giám sát vệ sinh, kiểm tra những loại chất lỏng như nước rửa làm sạch hệ thống, đánh giá chất lượng vi sinh của thực phẩm. Để đánh giá chất lượng vi sinh của thực phẩm bằng ATP thì ATP của vi sinh vật cần phải được tách chiết ra khỏi tế bào vi sinh vật và được định lượng dựa vào cường độ ánh sáng phát ra. Phản ứng phát sáng của đom đóm (Photinus pyralis) là có hiệu quả nhất, được biết đến như phản ứng phát sáng sinh học để xác định hàm lượng ATP. Phản ứng này đòi hỏi D-luciferin và ion Mg2+ để hoạt động, đây là thành phần đắt tiền trong bộ kit thương mại. Chất dioxetanone thì được hình thành bởi sự tạo phức hợp của luciferase với oxy và phức hợp Mg-ATP. Sau đó, ánh sáng vàng-xanh (bước sóng cao nhất là 562nm) được phát ra. Để kiểm tra tình trạng vệ sinh bề mặt thiết bị trong sản xuất, chế biến thực phẩm, tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thành phẩm, người ta xác định tổng lượng ATP của mẫu. Tổng hàm lượng ATP này bao gồm hàm lượng ATP của tế bào eukaryote và ATP của tế bào vi sinh vật. Thông thường ATP không có nguồn gốc là tế bào vi sinh vật thì được tách chiết bởi những chất tẩy không ion ví dụ như Triton X-100. ATP này sau khi được tách chiết khỏi tế bào sẽ được thủy phân bằng cách xử lý với enzyme ATPase trong vòng 5 phút. Tiếp theo, ATP của tế bào vi sinh vật sẽ được ly trích bằng chất trichloacetic acid (5%). Ánh sáng phát ra bởi phản ứng phát sáng được đo bằng các loại máy đo ánh sáng đo được cường độ ánh sáng thấp. Ngày nay sự phát quang sinh học đã được sử dụng khá rộng rãi để đánh giá chất lượng vệ sinh bề mặt thiết bị sử dụng trong quá trình sản xuất, chế biến, đánh giá chất lượng thực phẩm, mỹ phẩm. Quy trình thực hiện rất đơn giản, cho kết quả rất nhanh chóng trong vài phút và có thể dễ dàng tự động hóa. Nguyên tắc chung của quy trình này là như sau: Mẫu được thu bằng cách dùng que bông vô trùng quẹt một diện tích nhất định trên bề mặt dụng cụ, thiết bị. Sau đó que bông được cho vào dung dịch ly trích ATP, xử lý với ATPase và cho phản ứng phát sáng. Gần đây nhiều hệ thống phát hiện được thiết kế, chế tạo chứa sẵn những hóa chất nằm trong dụng cụ quẹt mẫu bằng tay và sự phát sáng xảy ra ở phía đầu của dụng cụ quẹt mẫu, sau đó dụng cụ này được đặt trong máy đo lượng ánh sáng phát ra. Để biết mật độ của vi sinh vật, so sánh trị số ánh sáng đo được với một đường chuẩn tương quan giữa lượng ánh sáng phát ra và mật độ tế bào vi sinh vật đã được biết trước. 3.2. Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Những tiến bộ kỹ thuật trong vài thập niên vừa qua thúc đẩy sự phát triển của nhiều kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh nhanh nhạy, chính xác các bệnh truyền nhiễm. Mặt khác, sự phát triển của những kỹ thuật tự động cho phép đơn giản hóa các thao tác thực hiện. Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch là phản ứng kết hợp giữa một tế bào (kháng nguyên) với một kháng thể đặc hiệu. Tín hiệu của phản ứng miễn dịch có thể nhận biết thông qua sự ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên – kháng thể hoặc bằng cách sử dụng những kháng thể đã được đánh dấu (bằng chất nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzyme). Trong số các phương pháp phân tích miễn dịch, phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay – ELISA hay enzyme immunosorbent assay – EIA) được quan tâm nhiều do có tính đơn giản và hiệu quả cao. Phương pháp này có thể được sử dụng cho hầu hết các loại kháng nguyên với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Nguyên tắc kỹ thuật ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng (microplate). Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ được giữ lại trên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme như horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng, enzyme xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng. Bằng cách theo dõi sự đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng lượng kháng nguyên. ELISA đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng các bộ hóa chất (kit) thương mại (phát hiện Salmonella, thuốc trừ sâu…) và có thể được cải tiến để tự động hóa. ELISA có thể sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh. Kỹ thuật này có độ nhạy phát hiện khoảng 106 CFU/ml (một số báo cáo cho rằng giới hạn này có thể đạt được 104). Tuy nhiên trong phương pháp này vẫn cần thực hiện bước tăng sinh và tăng sinh chọn lọc trước khi thực hiện các phản ứng miễn dịch. Transin Salmonella (Diffchamb AB, Sweden) là một bộ kit phát hiện nhanh Salmonella spp dựa trên nguyên tắc ELISA sandwich. Khi mẫu được cho vào giếng, nếu có sự hiện diện của vi sinh vật mục tiêu, kháng nguyên tiên mao của vi sinh vật sẽ tạo phức hợp với kháng thể cố định trên giếng và kháng thể tự do có gắn enzyme peroxidase tạo thành một phức hợp kép (sandwich). Sau đó, các kháng thể gắn enzyme ở dạng tự do không tạo phức hợp sandwich sẽ bị rửa khỏi phản ứng. Phức hợp sandwich được phát hiện nhờ sự bổ sung cơ chất của phản ứng (ure peroxide và tetramethylbenzidine). Enzyme peroxidase sẽ thủy phân cơ chất tạo sản phẩm có màu xanh dương. Phản ứng được kết thúc bằng cách bất hoạt enzyme bằng dung dịch kết thúc làm acid hóa môi trường và chuyển màu xanh thành màu vàng. Sự hình thành màu vàng chứng minh sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu hay sự hiện diện của vi sinh vật mục tiêu và mật độ của vi sinh vật có thể được xác định bằng cách đo cường độ bằng máy so màu. Một ví dụ khác về sản phẩm ELISA thương mại là quy trình phát hiện độc tố đường ruột và định danh độc tố (loại A đến E) của Staphylococci trong thực phẩm. Quy trình này có thời gian ngắn (4 giờ), nhạy (1 ng/ml hay mg) và có thể phát hiện đồng thời sự hiện diện của nhiều loại độc tố của Staphylococcus (nhưng không thể phân biệt các loại độc tố). Phản ứng ELISA được thực hiện dựa trên kỹ thuật “sandwich”. Bộ kit này có tên thương mại là TECRATM (TECRA Diagnostic, Roseville, 2069, Australia), là sản phẩm đầu tiên được chứng nhận bởi AOAC. 3.3. Phương pháp lai phân tử (Hybridization) Từ những năm 1980, nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm ứng dụng các thành tựu của kỹ thuật di truyền, sinh học phân tử vào lĩnh vực thực phẩm. Hiện nay, nhiều hệ thống đã được thiết lập dựa trên DNA để định lượng vi sinh vật và độc tố. Tuy nhiên, chỉ có phương pháp lai phân tử (hay còn được gọi là phương pháp mẫu dò, probes), phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là được thương mại hóa dưới dạng các bộ kit phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Phương pháp sử dụng mẫu dò để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm được dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là quá trình lai phân tử. Quá trình này bao gồm sự tách rời hai mạch đôi của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử DNA và sự tái bắt cặp giữa các đoạn DNA có trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. Một trong hai mạch DNA bổ sung (gọi là DNA mục tiêu là DNA của tế bào vi sinh vật) được cố định trên một giá thể rắn hoặc nằm ngay trên tế bào hay mô. Sự lai phân tử xảy ra khi đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với một vùng trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ. Sự lai phân tử còn có thể xảy ra giữa DNA và RNA. Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi các yếu tố nồng độ DNA trong môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của môi trường. Một ví dụ về hệ thống phát hiện bằng mẫu dò là hệ thống Gen-trak (Framingham, USA). Hệ thống này sử dụng que thử với mẫu dò để phát hiện Listeria trong mẫu bơ sữa và mẫu môi trường. Mẫu dò là những đoạn oligomer DNA đánh dấu bằng hóa chất phát quang. Quy trình phân tích có thể được chia thành 6 bước: (1) phá vỡ tế bào thu nhận rRNA; (2) mẫu dò DNA có đuôi oligodeoxyadenylic nucleotide (dA) và mẫu dò phát hiện (reporter probe) chứa fluorescein isothiocyanate (F) ở đầu 5’ và 3’ của phân tử được đặt vào phản ứng; (3) que thử được bao bọc bởi polydeoxythymidine (dT) để gắn được với oligodA của mẫu dò; (4) que thử được đặt vào ống đo chứa mẫu dò phát hiện được đánh dấu bằng enzyme; (5) sau khi rửa loại phần enzyme thừa, que thử được đặt vào ống đo chứa cơ chất tạo màu; (6) sau khi ủ để hiện màu, màu được phát hiện ở bước sóng 450 nm. 3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ thuật này do Karl Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh vào năm 1985. Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm. Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này. Mồi la những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase. Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận được đoạn DNA này cho các mục đích tái thao tác trên gen. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngược (antisens primer) so với chiều phiên mã của gen. Phản ứng PCR là gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bước là: - Bước 1 (bước biến tính, denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 94 – 95oC trong vòng 30 – 60 giây. Mạch đôi DNA tách ra thành dạng mạch đơn. - Bước 2 (bước lai, anealation): trong bước này, nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 – 70oC, tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 – 60 giây. - Bước 3 (bước tổng hợp, elongation): nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase (vốn là polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian của bước này tùy thuộc độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Trong phản ứng PCR một chu kỳ bao gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng 106 bản sao. Sau phản ứng PCR, các DNA được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể quan sát thấy thông qua việc điện di sản phẩm PCR trong gel agarose và quan sát dưới tia UV (bước sóng 312 nm). Hiện nay có nhiều ứng dụng của phản ứng PCR trong các bộ kit thương mại dùng để phát hiện đặc hiệu các chủng vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm hoặc những loài khó nuôi cấy. Một số ưu điểm chính của phương pháp PCR dùng trong phát hiện vi sinh vật gây bệnh là: - Thời gian cho kết quả nhanh. - Có thể phát hiện được những vi sinh vật khó nuôi cấy. Việc nuôi tăng sinh là đơn giản hơn và đôi khi không cần thiết. - Hóa chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm và dễ tồn trữ hơn so với trường hợp huyết thanh học. Không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp, có thể thực hiện ở hiện trường. - Ít tốn kém về mặt nhân sự, có thể được tự động hóa để làm giảm chi phí phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Mặc dù vậy phương pháp PCR vẫn còn một số nhược điểm cần khắc phục: - Sự ức chế hoạt tính của Taq DNA polymerase bởi thành phần của mẫu vật do mẫu thực phẩm thường có những thành phần phức tạp. Tuy nhiên, việc chiết tách và tinh chế DNA từ thực phẩm hay môi trường trước khi thực hiện phương pháp PCR thường cho phép loại bỏ những hợp chất ức chế. - Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp, nên trong đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu để có được mật độ đủ để phát hiện bằng PCR. - Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết, do vậy có thể dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết. Ngược lại phương pháp này cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm sinh hay tế bào đã chết của các vi sinh vật gây bệnh hoặc gây ngộ độc. Một giải pháp chung đối với các nhược điểm trên là kết hợp một bước tăng sinh ngắn và một bước ly tâm loại bỏ thành phần môi trường nuôi cấy và rửa tế bào trước khi tiến hành phản ứng PCR. Việc phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật đơn lẻ trong thực phẩm bằng phương pháp PCR thường gây tốn kém. Do đó, các nhà nghiên cứu đang tìm cách làm giảm chi phí bằng cách sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi trong một phản ứng PCR (gọi là phản ứng multiplex PCR) để có thể phát hiện đồng thời nhiều vi sinh vật gây bệnh khác nhau. Tại Việt Nam đã có một số nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm thực hiện tại trung tâm khoa học và công nghệ sinh học và phòng thí nghiệm công nghệ sinh học phân tử, trường đại học khoa học tự nhiên, đại học quốc gia TP.HCM. Dựa trên kết quả nghiên cứu trên một số đối tượng vi khuẩn gây bệnh, một quy trình chung cho việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp PCR được đề nghị như sau: - Bước 1: tăng sinh trên môi trường không hoặc ít chọn lọc (TSB hoặc TSB có bổ sung một số thành phần dinh dưỡng đặc biệt khác) trong khoảng thời gian từ 10 – 20 giờ (tùy từng đối tượng vi sinh vật, loại mẫu thực phẩm cùng điều kiện lưu giữ mẫu). - Bước 2: thu dịch nuôi cấy, ly tâm bỏ mảnh vụn, ly tâm gộp sinh khối tế bào vi khuẩn, huyền phù tế bào trong dung dịch TE (10mM Tris-HCl pH8,0, 1mM EDTA) với thể tích bằng 1/10 thể tích dịch nuôi cấy ban đầu, xử lý bằng nhiệt ở 100oC trong 10 phút, ly tâm loại bỏ tạp chất không tan ức chế phản ứng PCR. - Bước 3: thực hiện phản ứng PCR. - Bước 4: điện di trên gel agarose 1,5%, xem kết quả trên đèn UV. Toàn bộ quy trình phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm từ khi tiếp nhận mẫu đến khi cho kết quả khoảng 14 – 24 giờ (10 – 20 giờ tăng sinh và 4 giờ thực hiện phản ứng PCR và xem kết quả). 3.5. Một số phương pháp thử nhanh khác 3.5.1. Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ Để phân lập tế bào vi sinh vật mục tiêu với tế bào các vi sinh vật khác cần thực hiện kỹ thuật phân tách. Trong quá trình đồng nhất mẫu, mẫu thường được pha loãng thập phân tạo ra một thể tích lớn nguyên liệu (250ml), nhưng chỉ dùng vài ml mẫu cho quy trình phát hiện. Có thể rút ngắn thời gian và tăng hiệu quả phát hiện bằng cách làm tăng mật độ các vi sinh vật mục tiêu trong mẫu. Một kỹ thuật phân tách được sử dụng rộng rãi là phân tách miễn dịch – từ tính (Immunomagnetic separation – IMS). Trong phương pháp này, giai đoạn phân lập có thể được rút ngắn bằng cách thay thế môi trường tăng sinh chọn lọc bằng một quy trình tương tự nhưng không cần nuôi cấy. IMS sử dụng những hạt có từ tính cao được bao bọc bên ngoài bởi những kháng thể của vi sinh vật mục tiêu. Các hạt này giúp hấp thụ chọn lọc vi sinh vật mục tiêu này có thể được phát hiện bằng các quy trình vi sinh truyền thống. Dynabeads® (Dynal A/S, Oslo, Norway) là một sản phẩm dựa trên kỹ thuật IMS. Quy trình này sử dụng những hạt polystyrene từ tính cao có đường kính 2,8m (Dynabeads® M-280) và 4,5m (Dynabeads® M-450).Cả hai loại M-280 và M-450 đều