Đề tài Tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải Coker 312 và VN36P bằng phương pháp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

1 CHƢƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Bơng vải (Gossypium hirsutum.L) là cây trồng lấy sợi quan trọng hàng đầu để thoả mãn một trong những nhu cầu bức thiết của con người là mặc, đồng thời cũng là cây lấy dầu từ hạt quan trọng thứ hai trên thế giới sau cây đậu tương (Nobre và ctv, 2001). Cây bơng vải được trồng khắp nơi trên thế giới. Trong các nước trồng bơng vải thì Ấn Độ là nước sản xuất bơng vải lớn nhất, đứng đầu về diện tích (khoảng 9,7 triệu ha) chiếm 32%, kế đến là Mỹ chiếm 24% và Trung Quốc chiếm 20% diện tích trồng bơng vải tồn cầu (Satyavathi và ctv, 2002). Ở Việt Nam nghề trồng bơng vải cĩ từ ngàn xưa và từng là loại cây trồng quan trọng ở vùng Duyên Hải Trung Bộ trong thời kỳ kháng chiến chống Pháp. Sau năm 1975, nhà nước ta nhiều lần cố gắng tổ chức trồng bơng ở đây nhưng khơng thành cơng do giá cả thị trường bấp bênh và khơng phịng trừ được sậu đục quả bơng một cách hiệu quả dẫn đến người trồng bơng thua lỗ, diện tích trồng bơng khơng thể phát triển được. Trong những năm gần đây, do áp dụng những tiến bộ khoa học và cơng nghệ đã cho ra đời các giống bơng lai kháng sâu và cĩ năng suất cao để đưa vào sản xuất. Tuy nhiên sản lượng bơng xơ chỉ đáp ứng một phần nhỏ (10 - 15%) nhu cầu nguyên liệu cho ngành dệt may. Dự kiến đến năm 2010, sản lượng bơng xơ đáp ứng 20% nhu cầu trong nước, đưa diện tích trồng bơng tăng lên 1 triệu ha, tập trung ở vùng Duyên Hải Miền Trung, Tây Nguyên, Đơng Nam Bộ và Đồng Bằng Sơng Cửu Long ( Bộ Nơng Nghiệp và PTNT, 2003). Từ lâu người ta đã quan tâm nhiều đến việc cải thiện đặc tính di truyền của các lồi cây bơng vải. Mặc dù cĩ nhiều giống bơng vải tốt được tạo ra theo các phương pháp lai tạo và chọn lọc truyền thống, nhưng dường như các giống bơng đĩ khĩ cĩ thể khai thác được các nguồn gen cĩ lợi một cách hiệu quả. Việc ứng dụng cơng nghệ di truyền thực vật cĩ thể thúc đẩy việc tạo ra các giống cây bơng cĩ nhiều đặc tính ưu việt về đặc tính nơng học như tính kháng sâu bệnh hại, thuốc diệt cỏ và tính chống chịu với các đều kiện bất lợi của mơi trường (rét, khơ hạn, phèn, mặn…) và các tính trạng số lượng cũng như chất lượng của bơng và sợi (Gasser và Fraley, 1992). 2 Trong thập kỷ qua, các nổ lực nghiên cứu chuyên sâu đã từng tập trung trên cây bơng vải và các gen quy định các đặc tính nơng học tốt đã được chuyển nạp bằng phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium (Perlak và ctv, 1990; Thomas và ctv, 1995; Satyavathi và ctv, 2000). Cây bơng vải đã được xem là cây khĩ cĩ thể chuyển nạp gen và chỉ sau khi các giống nhĩm bơng vải Coker được phát hiện là đáp ứng tốt cho sự chuyển nạp gen (Nobre và ctv, 2001) thì các gen mong muốn đều được chuyển vào nhĩm giống này và sau đĩ hồi giao với các giống bơng khác. Ngồi sự giới hạn về kiểu gen, một số cây tái sinh từ mơ sẹo cĩ hình thái dị thường do biến dị soma cho nên sự cải tiến phương pháp nuơi cấy để tạo ra hệ thống tái sinh hiệu quả là cần thiết. Các phương pháp chọn tạo giống truyền thống và các kỹ thuật cơng nghệ sinh học tiến bộ gần đây (bao gồm các quy trình nuơi cấy mơ và chuyển nạp gen) đã và đang được ứng dụng vào việc chọn tạo giống bơng vải (Nobre và ctv, 2001). Trong chuyển nạp gen ở cây trồng, hệ thống thanh lọc cây biến đổi gen thơng dụng nhất là sử dụng thuốc kháng sinh và thuốc diệt cỏ (Christou, 1997). Việc sử dụng các hệ thống chọn lọc này gây nhiều lo ngại về tính an tồn của cây trồng biến đổi gen đối với con người và mơi trường. Nhằm khắc phục vấn đề này, phương pháp chọn lọc mới thộng qua thanh lọc bằng đường mannose được áp dụng. Hệ thống thanh lọc này dựa trên enzyme phosphomannose isomerase mã hố bởi gen pmi được phân lập từ vi khuẩn E. coli. Enzyme này đĩng vai trị trong việc chuyển hĩa đường mannose làm nguồn carbon cho các hoạt động biến dưỡng trong sinh vật và các tế bào thực vật biến đổi gen (Hoa và Bong, 2003). Hiện nay ở Việt Nam, các hệ thống tái sinh cây bơng vải qua mơ sẹo chưa được thực hiện thành cơng và việc chuyển gen chỉ được thực hiện bằng vi tiêm vào ống phấn và chuyển trực tiếp trên đỉnh chồi (Lê Trần Bình, 2001). Phương pháp chuyển gen này tuy cĩ hiệu quả nhưng sự biểu hiện của các gen chuyển nạp trên cây khơng được hồn tồn, tạo ra các thể khảm gây khĩ khăn cho việc phân tích và thu nhận cây chuyển gen sau này. Sự thu nhận cây chuyển gen tái sinh qua con đường sinh phơi thể hệ từ các tế bào sinh phơi là các phương pháp được ưu chuộng hiện nay (Chen và ctv, 2000). Cho đến nay chưa cĩ một nghiên cứu nào được thực hiện để tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên các giống bơng vải đang trồng ở Việt Nam. Vì vậy việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của ba giống bơng vải Coker 312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ” là một vấn đề cần thiết 3 1.2. Mục tiêu của khĩa luận Tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bơng vải Coker 312 và VN36P bằng phương pháp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và hệ thống chọn lọc bằng mannose để thanh lọc mơ sẹo sau khi được chuyển nạp. 1.3. Hạn chế của khĩa luận Do thời gian thực hiện ngắn nên khĩa luận chỉ thực hiện xong giai đoạn thanh lọc (qua 3 vịng) mơ sẹo đã được chuyển nạp gen trên hai giống Coker312 và VN36P. Giai đoạn thử nghiệm sự biểu hiện gen chỉ thị gus (β-glucuronidase) tạm thời các mơ sẹo đã qua thanh lọc chưa cĩ điều kiện thực hiện. 4 CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc về cây bơng vải 2.1.1. Vị trí phân loại Cây bơng vải thuộc Ngành hiển hoa bí tử (Angiospermatophyta), Lớp song tử diệp (Dicotyledoneae), Họ Malvaceae, Chi Gossypium (Hộ, 1997). 2.1.2. Tính đa dạng, nguồn gốc và phân bố Chi Gossypium rất đa dạng, cĩ 39 lồi, trong đĩ cĩ 5 lồi được trồng phổ biến trên thế giới (Hộ, 1997), và cĩ 3 lồi được trồng ở Việt Nam: G. arboreum, G. hirsutum, G. barbadense. 2.1.2.1. Gossypium arboreum Lồi G. arboretum (lồi bơng Cỏ) cĩ nguồn gốc từ châu Á, cĩ mặt và gắn liền với nghề trồng bơng ở nước ta từ lâu. Các giống bơng Cỏ cĩ dạng hình thống, thân mảnh, lá nhỏ, lơng ít, rễ cộc nhỏ với bộ rễ ăn nơng, chịu được mưa, cuống quả dài rủ xuống, đầu quả quay xuống đất, vỏ quả mỏng, chín sớm, hạn chế được hiện tượng thối quả khi gặp mưa lúc bơng nở. Về phẩm chất xơ bơng Cỏ : thơ, tỉ lệ xơ thấp, độ mịn kém. Trong khoảng thế kỷ XIII – XIV, lồi bơng này được trồng phổ biến khắp mọi miền đất nước. Các giống bơng Cỏ hiện cĩ ở Việt Nam thuộc 2 lồi phụ: G. arboreum ssp neglectum và G.arboreum ssp nanking (Lê Quang Quyến, 2004). 2.1.2.2. Gossypium hirsutum Lồi Gossypium hirsutum (lồi bơng Luồi) thường là cây hàng năm, cây cao, lá to, mặt lá phẳng. Cành lá khỏe, số lượng lá nhiều, quả trịn, mặt quả nhẵn, trọng lượng hạt bơng trung bình trong một quả đạt 5 - 6g. Lồi G. hirsutum xuất xứ từ Trung Mỹ, du nhập vào Việt Nam khoảng cuối thế kỷ XIX đầu thế kỷ XX. Lồi này cĩ khả năng thích ứng rộng, phù hợp với đều kiện trồng nhờ nước trời ở nước ta, với tiềm năng cho năng suất cao và cĩ chất lương xơ tốt, các giống bơng này dần thay thế các giống bơng Cỏ trước đĩ. Bơng Luồi được trồng nhiều nhất ở Mỹ, Nga, Ấn Độ, Mêhico, Trung Quốc, Braxin… Bơng Luồi 5 cĩ nhiều lồi phụ như : G.hirsutum ssp. Mexicanum, G.hirsutum ssp. punctatum, G.hirsutum ssp. panicultum… 2.1.2.3. Gossypium barbadense Lồi Gossypium barbadense cịn gọi là bơng Hải Đảo, cây tương đối to, chín muộn, lá to, khía sâu, màu xanh đậm. Thân cành lá gần như khơng cĩ lơng, đài khơng cĩ răng cưa rõ rệt và thường chỉ gợn hình làn sĩng. Hạt thường nhẵn, khơng cĩ xơ ngắn, xơ dài màu trắng hoặc cà phê sữa. Lồi G. barbadense cĩ nguồn gốc từ Nam Mỹ, nay được trồng nhiều ở Nga, Mỹ, Ai Cập và một số nước khác. Lồi này thường gặp dưới dạng cây bơng lâu năm ở trong các vườn hoang và bờ dậu. Bơng Hải Đảo chỉ thích hợp trong vụ khơ cĩ tưới, khơng thích hợp với đều kiện mưa nhiều, độ ẩm cao. Bơng Hải Đảo cĩ nhiều lồi phụ như: G. barbadense ssp. darwinii, G. barbadense ssp. ruderale, G. barbadense ssp. ventiforlum. Hiện nay lồi này được nghiên cứu trong chương trình tạo giống bơng lai giữa bơng Luồi với bơng Hải Đảo nhằm mục đích khai thác khả năng cho năng suất cao của bơng Luồi kết hợp với chất lượng xơ tốt của bơng Hải Đảo. 2.1.2.4. Gossypium herbaceum Lồi này phân bố chủ yếu ở các sa mạc, khí hậu khơ nĩng như vùng Trung Á, Tây Bắc Trung Quốc, Châu Phi, chưa thấy trồng ở Việt Nam. 2.1.2.5. Gossypium tricuspidatum Lồi này khá giống lồi G. hirsutum, cây và lá to, chín hơi muộn, xơ dài và mịn. Lồi này địi hỏi đất tốt, nhiều nước, nhiệt độ cao, chống chịu sâu bệnh khá và được trồng nhiều ở Nam Mỹ. Lồi bơng này khơng cĩ ở Việt Nam 2.1.3. Tình hình sản xuất bơng vải ở Việt Nam Trước thời Pháp thuộc, giống bơng vải được sử dụng chủ yếu là các giống bơng Cỏ địa phương (Gossypium arboreum). Giống bơng này cho năng suất thấp. Một số ít diện tích ở Trung Bộ và Nam Bộ đã được trồng các giống bơng Luồi (Gossypium hirsutum) nhập nội với năng suất đạt 300 – 500 kg/ha. Đầu thế kỷ 20, nước ta đã xuất khẩu bơng sang Nhật, Hồng Kơng. Trong thời kỳ kháng chiến chống Pháp, diện tích trồng bơng đã được phát triển mạnh, trong đĩ liên khu V đạt khoảng 10000 ha và liên khu IV đạt khoảng 13000 ha. 6 Sau năm 1954, các giống bơng Luồi nhập nội được thay thế một phần cho giống bơng Cỏ địa phương. Sau ngày đất nước thống nhất, xuất phát từ nhu cầu cấp thiết về nguyên liệu bơng xơ cho ngành Dệt May, Đảng và nhà nước ta cĩ chủ trương đẩy mạnh việc phát triển cây bơng ở vùng Duyên hải Miền Trung và Tây Nguyên. Tuy nhiên việc phát triển bơng theo kế hoạch khơng thưc hiện được do: i. Tổ chức sản xuất trên cơ sở kế hoạch tập trung giao cho Hợp tác xã Nơng nghiệp và các Nơng trường quốc doanh, theo cơ chế bao cấp, kém năng động, nên khơng phát huy hết sức mạnh và nguồn lực tồn dân. ii. Sâu bệnh gây hại ở tất cả các vùng trồng bơng, mùa khơ khơng đủ nước tưới, dẫn đến người trồng bơng thua lỗ, các nơng trường bị giải thể, diện tích bơng khơng thể phát triển được. iii. Chưa cĩ giống bơng phù hợp với từng đều kiện sinh thái và kháng sâu bệnh. Chưa cĩ hệ thống cơ sở hạ tầng cho việc phát triển bơng, như hệ thống thuỷ lợi đồng bộ ( Lê Kim Hỷ, 2003; Lê Quang Quyến, 2004.). Sau năm 1990, Nhà nước ta chủ trương phát triển bơng dựa vào các hộ nơng dân, nền sản xuất bơng chuyển hướng từ tập trung sang phân tán trong đều kiện mùa mưa nhờ nước tưới trời nhằm giảm áp lực sâu hại, do đĩ diện tích bơng được nhanh chĩng mở rộng và năng suất được nâng lên bình quân khoảng 7- 8 tạ/ha (Lê Kim Hỷ, 2003; Lê Quang Quyến, 2004). Từ sau những năm 1990, ngành bơng Việt Nam cĩ những bước thay đổi mạnh mẽ, chúng ta đã tạo được các giống bơng, đặc biệt là các giống bơng lai cĩ năng suất cao, chất lượng xơ tốt, chống chịu được sâu bệnh. Hàng loạt các tiến bộ kỹ thuật được áp dụng như: áp dụng biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp giúp giảm chi phí thuốc bảo vệ thực vật, các biện pháp kỹ thuật canh tác khác như hệ thống luân canh xen canh hợp lý, phủ màng PE cho bơng, phun các chất đều hịa tăng trưởng… chính vì vậy mà năng suất và chất lượng bơng xơ tăng, nghề sản xuất bơng cho hiệu quả kinh tế cao. Hiện nay, diện tích đã đạt hơn 35000 ha, năng suất đạt hơn 11 tạ/ha, tăng gấp hai lần so với bình quân trước đây (Bảng 2.1). 7 Bảng 2.1. Diễn biến tình hình sản xuất bơng ở Việt Nam trong những năm qua. (Nguồn: Lê Quang Quyến, 2004). Niên Vụ Diện tích (ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (tấn) 1996/1997 1997/1998 1998/1999 1999/2000 2000/2001 2001/2002 2002/2003 10676 11716 19963 17705 13250 29573 35200 6 9 8 10 9 11 10,5 6866 10986 16245 17578 20340 32530 36960 2.1.4. Tình hình sản xuất bơng trên thế giới Vụ bơng 2001- 2002 tổng diện tích bơng trên thế giới là 33,457 triệu ha, trong đĩ các nước đang phát triển chiếm 70% diện tích và các nước phát triển chỉ chiếm cĩ 30% diện tích. Trong mười nước cĩ diện tích trồng bơng lớn nhất thế giới (Bảng 2.2), thì Ấn Độ dẫn đầu với diện tích là 8,7 triệu ha, tiếp theo là Mỹ 5,6 triệu ha, Trung Quốc 4,8 triệu ha và Pakistan 3,1 triệu ha (ISAAA, 2002). Sản lượng bơng thế giới đã tăng từ 9,8 triệu tấn niên vụ 1960/1961 lên 21,2 triệu tấn niên vụ 2001/2002. Trong mười nước cĩ sản lượng bơng lớn nhất thế giới (bảng 2.3) thì Trung Quốc dẫn đầu với 5,3 triệu tấn, tiếp theo là Mỹ 4,4 triệu tấn, Ấn Độ 2,5 triệu tấn. Điều đặc biệt là trong mười nước cĩ sản lượng bơng cao nhất thế giới thì cĩ sáu nước là các nước đang phát triển. Về năng suất Australia dẫn đầu với năng suất là 1658 kg bơng xơ/ha, tiếp theo là Syria 1303 kg bơng xơ/ha và Trung Quốc 1103 kg bơng xơ/ha (ISAAA, 2002). Trong khi đĩ, diện tích trồng bơng chuyển gen trên thế giới ngày càng gia tăng. Diện tích trồng bơng trên thế giới năm 2004 là 32 triệu ha, trong đĩ bơng chuyển gen chiếm 28% . So với năm 2003 diện tích bơng chuyển gen tăng 11% (9 triệu ha trong năm 2004 so với 7,2 triệu ha trong năm 2003). Trong số các nước trồng bơng chuyển gen, Ấn Độ là nước cĩ diện tích trồng bơng chuyển gen tăng nhanh nhất thế giới (tăng 400% so với năm 2003). Năm 2003, Ấn Độ chỉ cĩ 100 ngàn ha bơng chuyển gen nhưng năm 2004 diện tích bơng chuyển gen tăng lên 500 ngàn ha. Trung Quốc cũng là nước cĩ sự gia tăng diện tích trồng bơng chuyển gen đáng chú ý: năm 2003 cĩ 2,8 triệu ha nhưng năm 2004 đã tăng lên 3,7 triệu ha (chiếm 60% diện tích bơng). Theo dự báo của các chuyên gia thì diện tích trồng 8 bơng chuyển gen trên thế giới sẽ tiếp tục gia tăng trong những năm tới và hướng chuyển gen vào cây bơng sẽ tập trung vào việc tạo ra các giống bơng kháng sâu bệnh là chủ yếu (James, 2004) Bảng 2.2. Mười nước cĩ diện tích trồng bơng lớn nhất thế giới năm 2001- 2002. (ISAAA, 2002) STT Quốc gia Triệu ha 1 Ấn Độ 8,730 2 Mỹ 5,596 3 Trung Quốc 4,824 4 Pakistan 3,125 5 Uzbekistan 1,453 6 Brazil 0,750 7 Thổ Nhĩ Kỳ 0,654 8 Turkmenistan 0,550 9 Mali 0,516 10 Benin 0,415 TỔNG CỘNG 26,613 Diện tích trồng bơng của thế giới 33,457 Nguồn: ICAC, 2002 ( 9 Bảng 2.3. Mười nước cĩ sản lượng bơng cao nhất thế giới năm 2001 – 2002. (ISAAA, 2002) STT Quốc gia Sản lượng (triệu tấn) Năng suất bơng xơ (Kg/ha) 1 Trung Quốc 5,320 1103 2 Mỹ 4,420 790 3 Ấn Độ 2,508 287 4 Pakistan 1,853 593 5 Uzbekistan 1,055 726 6 Thổ Nhĩ Kỳ 0,880 1345 7 Brazil 0,750 999 8 Úc 0,670 1658 9 Syria 0,335 1303 10 Ai Cập 0,314 944 Tổng Cộng 18,105 980 Các quốc gia khác 3,132 Sản lượng tồn thế giới 21,237 635 Nguồn: ICAC, 2002 2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen ở bơng vải Hiện nay cĩ nhiều phương pháp chuyển nạp gen khác nhau nhưng phổ biến là chuyển nạp gen trực tiếp bằng súng bắn gen với vật liệu nuơi cấy là đỉnh chồi phân sinh hoặc từ tế bào huyền phù (McCabe và Martinell, 1993; Rajasekaran và ctv, 2000), phương pháp chuyển nạp gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens (Umbeck và ctv, 1987; Rajasekaran và ctv, 1996; Satyavathi và ctv, 2002). Chuyển nạp gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ở bơng vải thành cơng đã được cơng bố lần đầu tiên vào những năm 1980 (Firoozabady và ctv, 1987; Umbeck và ctv, 1987) với mẫu cấy là trụ hạ diệp và tử diệp. Từ đĩ nhiều gen được chuyển thành cơng vào cây bơng nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, bao gồm các gen kháng cơn trùng và gen kháng thuốc diệt cỏ (Perlak và ctv, 1990; Chen và ctv, 1994). Các loại mẫu cấy như trụ hạ diệp, tử diệp, mơ sẹo từ trụ hạ diệp và tử diệp cũng như phơi non đã được dùng trong việc chuyển 10 gen nhờ Agrobacterium tumefaciens hay nhờ súng bắn gen (Firoozabady và ctv, 1987; Perlak và ctv, 1990). Ngồi ra cịn cĩ các mơ phân sinh phân lập từ trục phơi đã được sử dụng cho việc chuyển gen bằng súng bắn gen ở bơng vải (Chlan và ctv, 1995). Tuy nhiên tỉ lệ chuyển gen thường khá thấp, khoảng 20 - 30% khi trụ hạ diệp được dùng làm mẫu cấy (Firoozabady và ctv, 1987; Rajasekaran và ctv, 1996). Một hiệu quả chuyển gen cao hơn cĩ ý nghĩa (đến 60%) đã được cơng bố khi trụ hạ diệp được dùng làm mẫu cấy và gen onc (mã hĩa cho enzyme tổng hợp octopin-octopin synthase) được dùng làm gen chỉ thị (Firoozabady và ctv, 1987). Nhưng chỉ là kết quả của sự thử nghiệm sự biểu hiện gen tạm thời của gen onc. Một báo cáo gần đây cho rằng hiệu quả chuyển nạp gen ở song tử diệp chỉ khoảng 20 -30% (Cousins và ctv,1991), hiệu quả chuyển nạp gen thậm chí cịn thấp khi sử dụng phương pháp bắn gen (Keller và ctv, 1997. Sự khác biệt giữa các loại mẫu cấy được dùng trong chuyển nạp gen cĩ thể ảnh hưởng cĩ ý nghĩa đến hiệu quả của chuyển nạp gen và sự tái sinh, một số nhà nghiên cứu cho rằng để giảm thiểu các thể chuyển nạp gen dương tính giả, tử diệp là mẫu cấy tốt hơn trụ hạ diệp (Firoozabady và ctv, 1987). Sunilkumar và Rathore (2001) đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển nạp gen trên cây bơng vải bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho thấy các yếu tố như chủng vi khuẩn, acetosyringone và nhiệt độ trong chuyển gen cĩ ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả chuyển gen. Thêm vào đĩ kích thước mẫu cấy cũng ảnh hưởng đến sự sống sĩt của các mẫu cấy trên mơi trường chọn lọc (Sunilkumar và Rathore, 2001). Sự chuyển nạp gen cũng phụ thuộc vào kiểu gen. Chỉ cĩ một số giống nhất định mới cĩ khả năng tái sinh và chuyển nạp như giống bơng Luồi Coker 312 và Jin 7, cịn hầu hết các giống khác thường khĩ cĩ thể tái sinh và chuyển nạp được. Thiếu phương pháp tái sinh cây hiệu quả cũng được xem như là một rào cản chính cho việc áp dụng phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ở bơng vải (Firoobady và ctv, 1987). Để cải tiến phương pháp chuyển nạp, một quy trình chuyển gen hiệu quả cao dùng cuống lá và trụ hạ diệp cây mầm làm mẫu cấy được phát triển, cùng với mơi trường nuơi cấy được cải tiến thích hợp. Hiện nay, Trung Quốc đã thành cơng trong việc chuyển nạp gen vào cây bơng vải bằng phương pháp tiêm DNA qua ống phấn, nhưng phương pháp này gặp khĩ khăn trong việc xác định cây chuyển gen vì rất nhiều cây được tạo thành nhưng chỉ một số ít cây được chuyển nạp gen (Chen và ctv, 2000). 11 2.3. Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Chuyển nạp gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào bộ gen của sinh vật đang nghiên cứu. Những thành tựu của kỹ thuật nuơi cấy mơ và kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã mở ra triển vọng đối với chuyển nạp gen ở thực vật bậc cao, tạo ra những tính trạng di truyền mới như kháng sâu bệnh hại, thuốc diệt cỏ… Sự chuyển nạp gen thành cơng trên cây trồng đã được ghi nhận bằng cách sử dụng plasmid Ti, thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để đưa gen mong muốn vào trong bộ gen cây trồng. Phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển nạp gen cịn được gọi là phương pháp chuyển nạp gen gián tiếp. 2.3.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Giống Agrobacterium được chia làm một số lồi dựa trên triệu chứng gây bệnh và kí chủ. Một số lồi thuộc chi Agrobacterium như: A. radiobacter ( lồi nay khơng gây bệnh cho cây), A. tumefaciens và A. rhizogens gây bệnh khối u và bệnh cổ rễ… (Jiang, 2004) Hình 2.1. Khối u do Agrobacterium tumefaciens gây ra trên thực vật. A: một khối u lớn trên thân cây hoa Hồng; B: các khối u trên cành Nho (Deacon và ctv, 2005). Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hình que, gram âm, cĩ khả năng di động, khơng sinh bào tử và cĩ quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium (Deacon và ctv, 2005). Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, cĩ 5- 11 lơng roi, vi khuẩn này phát triển tối ưu ở nhiệt 29oC trong mơi trường cĩ bổ sung mangan và succinate như là nguồn cacbon duy nhất (Domer, 1999). Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh khối u trên cây (chủ yếu là cây hai lá mầm) khi xâm nhiễm vào cây. Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dạng vịng cĩ kích thước là 2,6Mb. Ngồi ra vi khuẩn 12 cịn mang plasmid lớn cĩ kích thước 200 - 800 kb (Gelvin, 2003), chính plamid này là nguyên nhân gây ra khối u trên cây khi vi khuẩn này xâm nhập. Plasmid này cĩ tên gọi là Plasmid Ti, hầu hết các gen gây khối u đều nằm trên plasmid này (Deacon và ctv, 2005). Khi rễ cây xuất hiện vết thương thì tế bào vi khuẩn sẽ di chuyển về phía vết thương và xâm nhập vào cây qua vết thương đĩ. Vi khuẩn độc mang một hoặc nhiều plasmid, một trong số đĩ là Plasmid Ti. Plasmid Ti mang các gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây. Những vi khuẩn khơng mang Plasmid Ti thì được xem như là vi khuẩn khơng độc và khơng cĩ khả năng gây bệnh khối u cho cây. Khối u đầu tiên xuất hiện nhỏ màu trắng, ban đầu được tìm thấy ở gốc cây. Các khối u lớn dần và xuất hiện các vết lốm đốm nâu đen do các tế bào ngoại biên chết đi. Các khối u cĩ thể mền và xốp và cĩ thể bị vỡ vụn khi chạm vào, nhưng cũng cĩ thể cứng và xuất hiện các u nhỏ. Các khối u cĩ đường kính đến 30 cm nhưng phổ biến là 5 – 10 cm. Cây bị nhiễm vi khuẩn sẽ trở nên cịi cọc, lá úa vàng và rất nhạy cảm với các điều kiện mơi trường. Khi xâm nhiễm vào cây một phần gen trên Plasmid Ti sẽ gắn vào bộ gen của cây làm cho các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc biệt gọi là Opine. Vi khuẩn sẽ sử dụng chất này như một nguồn cacbon 2.3.2. Ti-plamid Plasmid Ti là một DNA vịng tách rời với nhiễm sắc thể của vi khuẩn và cĩ khả năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn. Việc xác định Plasmid Ti như một nguyên lý tạo bướu TIP (tumor inducing principle) đã đánh dấu bước khởi động của một giai đoạn mới trong nghiên cứu về Agrobacterium tumefaciens. Điều này đã mở ra khả năng nghiên cứu cấu trúc và chức năng của plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000). Plasmid Ti cĩ cấu trúc bao gồm: đoạn T- DNA mang các gen tổng hợp các hormon thực vật và vùng gen vir, ngồi ra cịn cĩ một số gen mã hố cho việc tái sinh plasmid, cho việc tiêu hố opine. Trong cấu trúc của Plasmid Ti , hai yếu tố quan trọng cần cho sự chuyển gen vào cây là đoạn T- DNA bao gồm cả trình tự 25 bp ở hai cánh của đoạn T- DNA và gen vir (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2002). 2.3.2.1 Chức năng của T-DNA T-DNA là một đoạn DNA cĩ kích thước 10-30 kb, trong đĩ cĩ chứa gen mã hố cho việc tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u (Gelvin, 2003). Trong Plasmid 13 Ti, vị trí của T-DNA được giới hạn bởi bờ phải và bờ trái. Trình tự nucleotide của bờ phải và bờ trái tương tự nhau và đều cĩ kích thước 25bp (Gelvin, 2003). Tuy nhiên, bờ trái của T-DNA cĩ thể được bỏ qua trong chuyển nạp T-DNA, trong khi đĩ bờ phải lại cần thiết và tiến trình chuyển nạp diễn ra với bờ phải trước và tiến dần về phía trái. Việc đảo ngược bờ phải sẽ làm yếu đi khả năng tạo khối u (Gelvin, 2003; Zhu và ctv, 2000). T-DNA mã hĩa một vài protein và các protein này biểu hiện trong tế bào cây được chuyển gen làm kiểu hình cây thay đổi lớn. Các gen trên T-DNA cĩ thể biểu hiện trong tế bào cây bằng cách mơ phỏng các gen của cơ thể đa bào. Theo Binns và Costantino (1998), T-DNA mã hĩa cho 13 protein và những vùng khơng sao mã của các gen được chuyển mang nhiều đặc điểm của các gen trong cây, yếu tố tăng cường sao mã, các vị trí gắn đuơi poly A của cơ thể đa bào. Một nhĩm các gen của T-DNA điều khiển tổng hợp các hormon sinh trưởng của cây, những hormon này làm các tế bào tăng sinh và làm thay đổi hình dạng bên ngồi. Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH điều khiển sự chuyển hố tryptophan thơng qua indolacetamin thành indolacetic axit (auxin). Sản phẩm của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl pyrophosphat với AMP (Binns và Costantino, 1998) và các enzyme trong cây được cho là chuyển hố isopentenyl-AMP thành cytokinin zeatin bằng cách loại bỏ nhĩm phosphoribosyl và loại bỏ phân tử hydro của một nhĩm methyl của isopentenyl. Hai gen trên T-DNA khác được cho là cĩ chức năng trong tạo khối u là 5 và tml (cũng cịn gọi là 6b). Sản phẩm của gen 5 điều khiển sinh tổng hợp indole-3-lactate, đĩ là một chất đồng đẳng với auxin (Korber và ctv,1991). Trong khi đĩ gen tml làm tăng mức độ nhạy cảm của các tế bào cây với phytohormon bằng một cơ chế chưa được giải thích (Tinland và ctv, 1992). Gen tml cĩ thể kích thích tạo các khối u ngay cả khi vắng mặt các gen gây khối u khác. Một nhĩm gen được chuyển thứ hai đều khiển sản xuất nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn, đĩ là các opine. Đây là một dạng kết hợp giữa một aminoacid với một keto acid hoặc một đường (Dessaux và ctv, 1998). Các tế bào chuyển gen tổng hợp và tiết ra một số lượng lớn các opine. Các opine này hấp dẫn vi khuẩn mang kiểu gen tiêu biểu (bên ngồi vùng T-DNA và thường trên plasmid độc) cần cho việc phân giải các opine được tổng hợp từ khối u. Dựa trên các kiểu opine đựơc tạo ra từ các khối u mà phân chia nhĩm vi khuẩn Agrobacterium thành các chủng như là: octopine, nopaline, succinamopine và leucinopine. Hiện cĩ ít nhất là 20 loại opine khác nhau, mỗi chủng tạo ra và phân giải một nhĩm opine chuyên biệt (Ziemienowicz, 2001, trích từ Petit và Tempé, 1985). Gen ocs mã hĩa cho 14 octopine synthase, enzyme này gắn pyruvate với arginine, lysine, histidine hoặc ornithine để tạo ra octopine, lysopine, histopine hoặc octopinic acid và tất cả những opine này đều được phát hiện trong các khối u (Dessaux và ctv, 1998). Sản phẩm của gen mas2’ được cho là làm kết nối glutamine hoặc glutamic acid với glucose (mặc dù đều này chưa đựơc chứng minh bằng thực nghiệm), trong khi đĩ sản phẩm của mas1’ lại làm giảm bớt các dạng trung gian mannopine và mannopinic acid. Sản phẩm của gen ags sẽ làm lacto hĩa mannopine thành agropine. Mannopine và agropine cũng cĩ thể lactate hĩa thành agropinic acid (Dessaux và ctv, 1998). Bởi vậy, các khối u được tạo ra bởi Plasmid Ti kiểu octopine cĩ thể tạo 4 loại octopine và 4 kiểu thuộc nhĩm mannityl opine. 2.3.2.2 Chức năng của các gen vir Vùng vir trên Plasmid Ti cĩ khoảng 25 gen được nhận biết trong 7 đơn vị phiên mã là: virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2002) và vùng này cĩ kích thước khoảng 30- 40 kbp (Riva và ctv, 1998). Những gen vir này mã hố cho các vai trị như: nhận ra tế bào thực vật, tấn cơng vào tế bào thực vật, gia cơng đoạn T-DNA, chuyển nạp đoạn T-DNA và cĩ lẽ cĩ cả vai trị trong sự xâm nhập của T-DNA vào tế bào kí chủ. Các gen vir cĩ vai trị trong việc nhận diện ra vết thương của cây thơng qua dấu hiệu hố học tiết từ vết thương. Các tín hiệu hố học từ vết thương ở tế bào cây chủ tạo ra được nhận biết trước tiên bởi VirA protein, rồi đến VirG protein để làm kích hoạt các gen độc khác ở vùng vir, tạo ra các protein cần thiết. Gen vir được kích hoạt tối đa ở pH acid với sự hiện diện của các hợp chất phenol như là acetosyringone (AS), chất mà được giải phĩng khi tế bào cây bị tổn thương (Ziemienowicz, 2001). Biểu hiện cơ bản của gen virA tổng hợp nên protein nằm trong màng tế bào, protein VirA đáp ứng với sự trao đổi chất của vết thương của cây. VirA cĩ thể đáp ứng nhạy cảm với sự thay đổi của mơi trường. Với một nồng độ AS thích hợp VirA cĩ thể được kích thích bởi đường, các opine khối u hoặc amino acid (Zhu và ctv, 2000; Ziemienowicz, 2001). Protein VirA sẽ tự phosphoryl hố, sự tự phosphoryl hố này sẽ làm protein nội bào VirG được phosphoryl hố bởi aspartic acid cịn lại sau khi VirA tự phosphoryl hố (Jin và ctv, 1990) và kích hoạt sao mã cho tất cả các gen vir. Các promoter của gen vir cĩ kích thước khoảng 12bp trong trình tự “vir box” (Winans và ctv, 1987). 15 Các gen vir cĩ vai trị trong việc tạo sợi đơn T-DNA trong vi khuẩn và đưa sợi đơn T- DNA vào trong tế bào cây. Các protein được mã hố bởi gen virD và virE thực hiện chức năng tạo ra phức hợp T-DNA. Protein VirD2 là một endonuclease, protein này sẽ cắt T- DNA tại vị trí nucleotide thứ 3 và thứ 4 trên trình tự bờ vai 25 bp để tạo ra phân tử sợi đơn T-DNA và liên kết đồng hố trị với đầu 5’ của sợi đơn T-DNA. Protein VirD2 được tinh sạch từ oligonucleotide sợi đơn mang các trình tự bờ vai ở vị trí tương đồng (Zupan và ctv, 1996; Deng và ctv,1998). Protein VirE2 là một protein gắn trên sợi đơn DNA , nĩ sẽ bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của các enzyme nuclease trong tế bào cây (Deng và ctv, 1998), protein VirE2 là protein chiếm số lượng nhiều nhất. Protein VirE2 và VirD2 mang trình tự định vị nhân, trình tự này giúp thúc đẩy sự hấp thu phức hợp T-DNA vào nhân. Hai sản phẩm của gen vir khác cũng được cho là cĩ chức năng trong việc tạo gia cơng T-DNA là: VirC1 và VirC2. VirC1 đã được thấy gắn kết vào vùng “overdrive”, vùng này nằm gần bờ phải, và bởi vậy giúp tăng cường sự cắt T-DNA ở vị trí bờ vai của VirD1/VirD2 endonuclease (Gelvin, 2003). Một số tác giả khác cho rằng VirC1 và VirC2 khơng cần cho tạo sợi đơn T-DNA nhưng khi vắng mặt hai protein này thì hiệu quả chuyển nạp T-DNA vào cây khá thấp. Do đĩ đề nghị rằng chúng cĩ chức năng trong việc xuất T-DNA (Zhu và ctv, 2000). Ngồi ra, Protein VirD2 được cho là cĩ chức năng trong sự hịa hợp T-DNA, bởi nĩ gắn vào đầu 5’ của T-DNA, đưa T-DNA vào nhân tế bào và lưu lại cùng với T-DNA trong các bước hịa hợp. Hai giả thuyết về chức năng của protein VirD2 trong sự hịa hợp T-DNA đã được đề nghị: VirD2 hoạt động như một integrase và VirD2 hoạt động như một ligase (Ziemienowicz, 2001). Hệ thống chuyển nạp T-DNA được mã hĩa bởi operon virB, operon này mang 11 gen. Sự chuyển phức hợp T-DNA dựa trên chiên mao (pili) do operon virB mã hố và đột biến ở bất kì gen nào trong số 11 gen của operon này đều làm mất khả năng tạo pili và tạo khối u và tạo khối u (Lai và Kado, 1998). Các protein VirB đều khiển tạo chiên mao và VirB2 là tiểu phần chính của chiên mao này. Hai protein VirB là VirB4 và VirB11 cĩ hoạt tính ATPase và được cho là cung cấp năng lượng cho việc xuất các tiểu phần protein khác, cho vận chuyển T-DNA. Hệ thống VirB đưa T-DNA tới tế bào chất của tế bào cây, nơi đây các bước cần cho chuyển T-DNA vào nhân và hịa hợp với DNA của cây được thực hiện (Zhu và ctv, 2000). 16 Hình 2.2. Mơ hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây (nguồn Zhu và ctv, 2000) 2.3.2.3 Cơ chế lây nhiễm Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sống phổ biến ở xung quanh và trên bề mặt rễ cây. Vùng mà vi khuẩn sống gọi là vùng rễ, nơi mà vi khuẩn tồn tại nhờ việc sử dụng chất dinh dưỡng do mơ rễ tạo ra. Vi khuẩn chỉ xâm nhiễm vào cây khi cây bị tổn thương do nhiều nguyên nhân khác nhau. Trong đều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn di chuyển đến vị trí vết thương nhờ các dấu hiệu hố học. Đều này cĩ được là do đáp ứng giải phĩng đường và các thành phần phổ biến khác trong rễ. Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn mang Plasmid Ti sẽ đáp ứng mạnh hơn bởi vì chúng xác định các hợp chất vết thương (hợp chất phenolic) như acetosyringone. Chất này cĩ tác dụng rất mạnh dù ở nồng độ thấp (10-7 M). Bởi vậy, một trong những chức năng của Plasmid Ti là mã hố các thụ thể (receptor) nhận biết các chất hố học. Những thụ thể này nằm trên màng tế bào vi khuẩn và cĩ thể giúp cho vi khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn thương. Acetosyringone đĩng vai trị quan trọng trong tiến trình xâm nhiễm. Ở nồng độ cao (10-5 – 10-4 M) hơn nĩ sẽ kích hoạt các gen vir trên Plasmid Ti (Valentine, 2003 ) Sau khi được kích hoạt, các gen vir sẽ đều khiển quá trình tạo sợi đơn T-DNA. Quá trình tạo sợi đơn T-DNA được thực hiện trong tế bào vi khuẩn và do các protein VirD1 và 17 VirD2 thực hiện. Sau đĩ protein VirD2 gắn vào sợi đơn T-DNA để tạo thành phức hợp T- DNA. Phức hợp T-DNA-VirD2 cùng với protein VirE2 được chuyển vào trong tế bào cây thơng qua hệ thống chuyển nạp được mã hố bởi các gen virB. Cùng với một số thành phần trong tế chất của tế bào cây, các protein của vi khuẩn sẽ tiếp tục đưa phức hợp T-DNA vào trong nhân tế bào. (Valentine, 2003 ) Hình 2.3. Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA (Valentine, 2003 ) Trong nhân tế bào cây, T-DNA được kết nạp vào bộ gen của cây khơng theo một quy luật tái tổ hợp nào cả, đầu tiên đầu 3’ của T-DNA nhận diện các đoạn tương đồng với DNA của cây và gắn vào. Sau đĩ nucleotide gắn với VirD2 tìm các đoạn vi tương đồng (microhomology) trên DNA cây và gắn vào. Sự gắn kết này mang cầu nối phosphotyrosine cĩ ái lực điện tử của đầu 5’ đến gần đầu 3’ nucleophilic của DNA cây mà bị tách ra. Cuối cùng sự gắn kết trên sợi DNA của cây được hồn thành và cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp đoạn T-DNA dẫn đến sự hịa hợp của T-DNA hồn thành. Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hồn thành các gen trên T-DNA hoạt động tổng hợp nên các sản phẩm cần thiết cho vi khuẩn (Valentine, 2003 ). Hình 2.4. Quá trình kết nạp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây (Valentine, 2003 ) 18 CHƢƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bơng vải Coker 312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, sử dụng plasmid pManCa (Hoa và Bong, 2003) mang gen pmi và gen gus để xây dựng quy trình chuyển nạp gen với hệ thống thanh lọc bằng mannose đối với cây bơng vải. 3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian: khĩa luận được thực hiện từ ngày 21/03/2005 đến ngày 31/07/2005. Địa điểm: khĩa luận được thực hiện tại bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sơng Cửu Long, huyện Cờ Đỏ, TP. Cần Thơ. 3.3. Vật liệu nghiên cứu Giống bơng vải Coker 312 và VN36P. Hạt bơng vải tự thụ được thu từ cây bơng vải trồng ở nhà lưới của bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sơng Cửu Long. Mẫu cấy: trụ hạ diệp của cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi. Dụng cụ, thiết bị, hố chất ở bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sơng Cửu Long (phụ lục 7). 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1.Chuẩn bị vật liệu nuơi cấy Hạt của các giống bơng vải được đốt lớp xơ bao quanh bằng axit sunfurit đậm đặc (H2SO4 98%), rồi rửa dưới vịi nước máy nhiều lần cho đến khi sạch hết axit và bột than, sau đĩ sấy trong tủ sấy ở 400C khoảng 48 giờ để đạt độ ẩm 14%. Sau khi sấy, hạt được khử trùng bề mặt với cồn 700 trong 2 phút rồi rửa bằng nước cất vơ trùng (3 lần), tiếp theo hột được khử trùng tiếp bằng HgCl2 0,1% (w/v) cĩ vài giọt Tween 20, lắc ở tốc độ 100 vịng/phút thực hiện 2 lần mỗi lần 10 phút (giữa 2 lần khử trùng bằng HgCl2 cĩ rửa lại 3 lần bằng nước cất vơ trùng), sau đĩ hạt được rửa nhiều lần với nước cất vơ trùng (6 lần) rồi được bảo hồ qua đêm trong nước cất. 19 Sau khi bảo hịa qua đêm, hạt tiếp tục được khử trùng bằng HgCl2 0,1% cĩ vài giọt Tween 20 (thực hiện 2 lần mỗi lần 5 phút). Sau đĩ những hạt nứt nanh được bĩc vỏ trong đều kiện vơ trùng và cấy vào mơi trường nảy mầm MSG (phụ lục 1) và nuơi ở nhiệt độ 28 - 29 0C, độ ẩm tương đối bằng 50%. Sau 5-7 ngày ta loại bỏ những keo bị tạp nhiễm, chọn những cây khơng bị tạp nhiễm làm nguồn vật liệu thí nghiệm. Từ cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi đã được nuơi cấy, các trụ hạ diệp được cắt thành những đoạn dài khoảng 0,5 cm dùng làm vật liệu cho nghiên cứu chuyển nạp gen. Hình 3.1. Hạt bơng vải sau khi tách vỏ và cấy vào mơi trường nảy mầm Hình 3.2. Cây mần in vitro 5 ngày tuổi. 20 3.4.2. Quy trình chuyển nạp gen 3.4.2.1. Nguồn plasmid Nguồn plasmid được sử dụng để nghiên cứu là vector pManCa (Hoa và Bong, 2003) mang gen pmi (phosphomannose isomerase) giúp tế bào vi khuẩn biến dưỡng đường mannose và gen chỉ thị gus trong chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (Hoekema và ctv, 1983). Hình 3.3. Sơ đồ vector pManCa mang gen pmi và gen gus 3.4.2.2. Chuẩn bị vi khuẩn Chủng vi khuẩn LBA4404 mang vector pManCa từ ống tồn trữ trong glycerol (50%, v/v) ở nhiệt độ -800C được nuơi cấy trên mơi trường đặc ABG (Chilton và ctv, 1974) cĩ 50 mg/l kanamycin và ủ ở 280C trong 72 giờ. Trên mơi trường đặc ABG (phụ lục 4) chọn một khuẩn lạc phát triển tốt đem nuơi cấy trong 3ml mơi trường lỏng YEP (An và ctv, 1988) cĩ bổ sung 50mg/l kanamycin và nuơi qua đêm (24-28 giờ) ở 280C trên máy lắc với tốc độ 200vịng/phút. Sau khi nuơi cấy 24-28 giờ, cấy chuyền sang 50 ml mơi trường YEP (phụ lục 5) cĩ kanamycin 50mg/l và nuơi cấy khoảng 16- 18 giờ ở 280C, lắc 200 vịng/phút đến khi OD600 đạt khoảng 0,5 - 1. 3.4.2.3. Lây nhiễm (đồng nuơi cấy) Chủ yếu dựa theo quy trình của Chen và ctv, 2000 (US Patent số: WO 00/77230 A1) với một vài thay đổi: OD600 pha lỗng là 0,5, thời gian ngâm mẫu trong dịch vi khuẩn là 30 phút và lây nhiễm trên mơi trường khơng cĩ giấy thấm (Chen và ctv tiến hành thí nghiệm với OD600 pha lỗng là 0,3, thời gian 5 phút và lây nhiễm trên mơi trường cĩ giấy thấm). 21 Vi khuẩn sau khi chuẩn bị được đem li tâm với tốc độ 5000 vịng/phút trong 10 phút. Sau khi li tâm, phần lắng được pha lỗng bằng mơi trường lây nhiễm khơng cĩ phytagel (cĩ bổ sung AS) và lắc với tốc độ 220 vịng/phút ở 280C trong 1giờ để chuẩn bị cho lây nhiễm. Từ cây mầm in vitro đã được chuẩn bị ta cắt lấy đoạn trụ hạ diệp, sau đĩ đoạn cắt trụ hạ diệp được cắt thành những mẫu dài khoảng 0,5 cm rồi ngâm trong dịch vi khuẩn pha lỗng (OD600 ~ 0,5) khoảng 30 phút. Sau khi lây nhiễm các mẫu cấy được chuyển vào đĩa petri cĩ giấy thấm tuyệt trùng cho khơ mẫu sau đĩ cấy sang đĩa petri cĩ mơi trường đồng nuơi cấy MSCo (phụ lục 2). Các đĩa mẫu sau đĩ được giữ trong tủ nuơi ở 210C trong đều kiện chiếu sáng liên tục khoảng 72 giờ. 3.4.2.4. Thanh lọc Sau khi đồng nuơi cấy với vi khuẩn, mẫu cấy được rửa vi khuẩn bằng nước cất vơ trùng 2 lần để loại bỏ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bám trên bề mặt mẫu cấy và kháng sinh carbernicillin 500 mg/l để ức chế vi khuẩn mọc trở lại. Sau khi rửa, mẫu cấy được đặt lên đĩa petri cĩ giấy thấm vơ trùng trong vài phút cho khơ mẫu. Sau đĩ mẫu cấy được cấy chuyền lên mơi trường thanh lọc MMS1 (phụ lục 3) cĩ tác nhân thanh lọc là đường mannose và glucose ở các nồng độ khác nhau theo sự tăng dần nồng độ mannose (2,5% w/v, 30% w/v và 35% w/v) và giảm dần nồng độ glucose (10% w/v, 5% w/v và 0% w/v) qua 3 lần thanh lọc, mỗi lần cách nhau 2 tuần. Bảng 3.1. Nồng độ đường mannose và glucose ở các lần thanh lọc Lần thanh lọc Mannose Glucose I II III 25g/l 30g/l 35g/l 10g/l 5g/l 0g/l Sau khi thanh lọc thì các mơ sẹo chuyển gen giả định (biến dưỡng đường mannose) xuất hiện. Tỉ lệ mơ sẹo chuyển gen giả định được theo dõi. Từ các mơ sẹo sống sĩt sau khi thanh lọc, ta chọn ra những mơ sẹo phát triển tốt, cĩ màu xanh hơi vàng và rời rạc để tách nhỏ và cấy chuyền lên mơi trường phát sinh phơi MMS2 (phụ lục 6). 22 3.4.3. Các chỉ tiêu theo dõi Sự biến đổi hình thái mơ sẹo trong quá trình lây nhiễm và chọn lọc: Trong nghiên cứu này chúng tơi tiến hành theo dõi sự thay đổi hình thái mơ sẹo qua các giai đoạn là sau 2 tuần trên mơi trường thanh lọc lần 1, thanh lọc lần 2 và thanh lọc lần 3. Tỉ lệ mẫu sống sĩt và hình thành mơ sẹo: Sau các lần thanh lọc tỉ lệ mẫu sống sĩt và hình thành mơ sẹo được chúng tơi theo dõi và ghi nhận. Từ tỉ lệ này chúng ta cĩ thể so sánh được sự khác nhau giữa các giống đồng thời cũng đánh giá được hiệu quả của hệ thống thanh lọc đang thực hiện. 23 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Sự hình thành và phát triển mơ sẹo Trong nghiên cứu chuyển nạp gen với mẫu cấy là trụ hạ diệp thì sự hình thành và phát triển của mơ sẹo cĩ một ý nghĩa rất quan trọng. Từ các mơ sẹo được hình thành sau khi lây nhiễm và qua quá trình thanh lọc chúng ta cĩ thể chọn ra được các mơ sẹo chuyển gen cĩ khả năng tái sinh để tiếp tục tái sinh thành cây chuyển gen. Sau 2 tuần trên mơi trường thanh lọc lần 1 thì mơ sẹo đều bắt đầu hình thành và phát triển ở cả mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm. Mơ sẹo cĩ màu xanh lá cây tuy nhiên ở mẫu đối chứng sự phát triển của mơ sẹo đồng đều hơn so với mẫu lây nhiễm cĩ thể là do mẫu lây nhiễm bị tổn thương do ngâm trong dịch vi khuẩn và rửa lại bằng nước và kháng sinh khi tiến hành lây nhiễm (Hình 4.2). Hình 4.1. Mẫu cấy giống Coker 312 sau khi lây nhiễm trên mơi trường MSCo 24 Hình 4.2. Mẫu cấy giống Coker 312 sau 2 tuần trên mơi trường thanh lọc lần 1. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm Hai tuần trên mơi trường thanh lọc lần 2, mơ sẹo phát triển thành một khối to gấp 3 – 4 lần so với mơ sẹo trên mơi trường thanh lọc lần 1 (Hình 4.3). So sánh giữa đối chứng và mẫu lây nhiễm ta thấy ở mẫu đối chứng thì khối mơ sẹo cứng, cĩ màu xanh đậm cịn ở mẫu lây nhiễm thì mơ sẹo cĩ màu xanh hơi vàng và chắc, một số mơ sẹo cĩ xu hướng rời ra khi chạm kẹp vào. Theo Mishra và ctv (2003) thì các mơ sẹo này đáp ứng tốt với khả năng tái sinh. Hình 4.3. Mẫu cấy giống Coker 312 sau 2 tuần trên mơi trường thanh lọc lần 2. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm 25 Hình 4.4. Mẫu cấy giống Coker 312 sau 2 tuần trên mơi trường thanh lọc lần 3. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm Hình 4.5. Mẫu cấy VN36P sau 2 tuần trên mơi trường thanh lọc lần 3 A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm. Trên mơi trường thanh lọc lần 3 chúng tơi thấy các mơ sẹo tiếp tục phát triển và kích thước mơ sẹo lớn hơn trên mơi trường thanh lọc lần 2. Ngồi ra, chúng tơi cịn thấy được sự khác biệt giữa đối chứng và mẫu lây nhiễm. Các mẫu đối chứng chuyển sang màu xanh đậm hơn, khối mơ sẹo cứng và dính chặt vào nhau, trong khi đĩ ở mẫu lây nhiễm thì khối mơ sẹo chắc, các mơ sẹo rời và cĩ màu xanh vàng rõ hơn khi quan sát dưới kính hiển vi. Một số mẫu ở đối chứng bắt đầu cĩ hiện tượng hố nâu và chết, tuy nhiên vẫn cịn một số 26 mẫu sống sĩt, cĩ thể là do trong các khối mơ sẹo cĩ sự tích lũy đường glucose (Hình 4.4, Hình 4.5 và Hình 4.6). Các mơ sẹo cĩ màu xanh vàng, chắc, rời rạc từ khối mơ sẹo cịn sống trong giai đoạn này được tách nhỏ và tiếp tục cấy chuyền lên mơi trường thanh lọc giống như ở lần 3 (Hình 4.7). Sau 2 tuần quan sát chúng tơi thấy các mơ sẹo được tách nhỏ từ mẫu đối chứng điều bị chết cịn ở mẫu lây nhiễm thì một số mơ sẹo tiếp tục phát triển cĩ màu xanh vàng, rời rạc, đây là các mơ sẹo đáp ứng tốt với khả năng tái sinh và cĩ khả năng sinh phơi tốt (Mishra và ctv, 2002; Sakhanokho và ctv, 2001). Tuy nhiên số mơ sẹo chuyển màu nâu đen trong nghiệm thức chuyển gen cũng rất nhiều. Ở các mơ sẹo chết và trên một số mơ sẹo hĩa nâu chúng tơi thấy cĩ xuất hiện các mơ sẹo mới. Các mơ sẹo này cĩ thể là những mơ sẹo được chuyển nạp gen (Hình 4.8). Hình 4.6. Mẫu cấy giống Coker 312 chết trên mơi trường thanh lọc lần 3. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm Hình 4.7. Khối mơ sẹo giống Coker 312 sau khi thanh lọc lần 3. A: mơ sẹo được tách nhỏ và chuyển tiếp lên mơi trường thanh lọc lần 3, B: mơ sẹo khơng được tách và chuyển lên mơi trường thanh lọc lần 3. 27 Hình 4.8. Mơ sẹo giống VN36P được tách nhỏ sau 2 tuần trên mơi trường thanh lọc lần 3 A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm. 4.2. Tỉ lệ mẫu sống sĩt và hình thành mơ sẹo sau các lần thanh lọc Tỉ lệ mẫu sống sĩt và hình thành mơ sẹo là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong nuơi cấy mơ thơng thường và chuyển gen. Trong nghiên cứu này chúng tơi tiến hành theo dõi sự hình thành mơ sẹo của các mẫu cấy sau khi kết thúc mỗi lần thanh lọc (thời gian cho mỗi lần thanh lọc là 2 tuần). Bảng 4.1. Tỉ lệ mẫu sống sĩt và hình thành mơ sẹo sau khi thanh lọc lần 1 trên giống Coker 312 Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mơ sẹo sau khi thanh lọc lần 1 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 38 150 38 146 100 97,3 2 34 146 34 143 100 97,9 3 36 147 36 144 100 97,9 4 34 143 34 139 100 97,2 Trung bình 100 97,6 28 Bảng 4.2. Tỉ lệ mẫu sống sĩt và hình thành mơ sẹo sau khi thanh lọc lần 1 trên giống VN36P Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mơ sẹo sau khi thanh lọc lần 1 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 42 148 42 146 100 98,6 2 39 146 39 143 100 97,9 3 42 147 42 143 100 97,3 4 40 143 40 142 100 99,3 Trung bình 100 98,3 Bảng 4.3. Tỉ lệ mẫu sống sĩt và hình thành mơ sẹo sau khi thanh lọc lần 2 trên giống Coker 312 Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mơ sẹo sau khi thanh lọc lần 2 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 38 150 38 143 100 95,3 2 34 146 34 141 100 96,6 3 36 147 36 143 100 97,3 4 34 143 34 138 100 96,5 Trung bình 100 96,4 29 Bảng 4.4. Tỉ lệ mẫu sống sĩt và hình thành mơ sẹo sau khi thanh lọc lần 2 trên giống VN36P Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mơ sẹo sau khi thanh lọc lần 2 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 42 148 42 140 100 94,6 2 39 146 39 135 100 92,5 3 42 147 42 138 100 93,9 4 40 143 40 137 100 95,8 Trung bình 100 94,2 Kết quả ở bảng 4.1 và bảng 4.2 cho thấy sau thanh lọc lần 1 thì hầu hết các mẫu đối chứng đều sống sĩt và hình thành mơ sẹo (100%). Ở các mẫu lây nhiễm tỉ lệ này cũng khá cao. Tỉ lệ mẫu sống sĩt và hình thành mơ sẹo của giống Coker 312 sau thanh lọc lần 1 là 97,6% cịn đối với giống VN36P thì tỉ lệ này là 98,3% sau khi thanh lọc lần 1. Sau khi thanh lọc lần 2 thì mẫu đối chứng vẫn sống sĩt và hình thanh mơ sẹo với tỉ lệ 100% cịn ở mẫu lây nhiễm tỉ lệ này cĩ giảm nhưng rất nhỏ. Tỉ lệ mẫu sống sĩt và hình thành mơ sẹo sau khi thanh lọc lần 2 của giống Coker 312 là 96,4% và của giống VN36P là 94,2% (Bảng 4.3 và Bảng 4.4). Tỉ lệ sống sĩt cao trong lần thanh lọc 1 và 2 cĩ thể do cịn cĩ một lượng đường glucose trong mơi trường (1% và 0,5%). Các mẫu cấy cĩ thể đã sử dụng lượng đường này làm nguồn dinh dưỡng. Riêng ở mẫu lây nhiễm cĩ một số mẫu bị chết cĩ thể là do bị tổn thương khi ngâm trong dịch vi khuẩn và rửa bằng nước cất, kháng sinh trong quá trình lây nhiễm và cũng cĩ thể do thao tác thí nghiệm khi chuyển mẫu. 30 Bảng 4.5. Tỉ lệ mẫu sống sĩt và hình thành mơ sẹo sau khi thanh lọc lần 3 trên giống Coker 312 Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mơ sẹo sau khi thanh lọc lần 3 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 38 150 32 34 84,2 22,7 2 34 146 30 33 88,2 22,6 3 36 147 32 35 88,9 23,8 4 34 143 28 32 82,4 22,4 Trung bình 85,9 22,9 Bảng 4.6. Tỉ lệ mẫu sống sĩt và hình thành mơ sẹo sau khi thanh lọc lần 3 trên giống VN36P Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mơ sẹo sau khi thanh lọc lần 3 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 42 148 37 36 88,1 24,3 2 39 146 33 33 84,6 22,6 3 42 147 35 32 83,3 21,8 4 40 143 36 31 90,0 21,7 Trung bình 86,5 22,6 Sau khi thanh lọc lần 3, số mẫu cịn sống khá cao ở các đối chứng (85,9% đối với Coker312 và 86,5% đối với VN36P), cịn ở mẫu lây nhiễm số mẫu cịn sống là rất ít, trên giống Coker 312 là 22,9% cịn trên giống VN36P là 22,6 (Bảng 4.5 và Bảng 4.6). Trên mơi trường lần 3 khơng cĩ đường glucose chỉ cĩ đường mannose mà tỉ lệ mẫu đối chứng cịn sống rất cao cĩ thể là do trong các khối mơ sẹo cĩ sự tích lũy đường glucose, trong khi đĩ tỉ lệ mẫu sống và hình thành mơ sẹo ở mẫu lây nhiễm lại thấp. Với việc các mẫu đối chứng cịn sống chúng ta khơng thể cho rằng các mẫu lây nhiễm cịn sống là các 31 mẫu được chuyển nạp gen cũng như đánh giá được sự khác biệt giữa hai giống Coker312 và VN36P về khả năng chuyển nạp gen. Sau 3 lần thanh lọc, số mẫu đối chứng sống sĩt cao cĩ thể là do các khối mơ sẹo cĩ sự tích lũy đường cũng cĩ thể do nồng độ đường mannose dùng cho các lần thanh lọc chưa được chuẩn hĩa đúng mức. Để khắc phục khĩ khăn này chúng tơi đã tiến hành tách nhỏ và tiếp tục thanh lọc các mơ sẹo cịn sống. Từ các khối mơ sẹo, những mơ sẹo rời rạc, màu xanh hơi vàng được tách nhỏ và chuyển lên mơi trường giống như ở lần thanh lọc 3 (Hình 4.6 và Hình 4.7). Sau hai tuần thì mẫu đối chứng chết hồn tồn và mẫu lây nhiễm cịn sống với tỉ lệ thấp là 10,4% đối với giống Coker 312 (Bảng 4.7) và 13,6% đối với giống VN36P (Bảng 4.8). Bảng 4.7. Tỉ lệ mẫu sống sĩt sau khi tách nhỏ và tiếp tục thanh lọc trên mơi trường thanh lọc lần 3 trên giống Coker 312 Số lần thí nghiệm Số mẫu tách nhỏ Số mẫu sống sau 2 tuần trên mơi trường thanh lọc lần 3 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 32 34 0 4 0 11,8 2 30 33 0 3 0 9,1 3 32 35 0 5 0 14,3 4 28 32 0 2 0 6,3 Trung bình 0 10,4 Bảng 4.8. Tỉ lệ mẫu sống sĩt sau khi tách nhỏ và tiếp tục thanh lọc trên mơi trường thanh lọc lần 3 trên giống VN36P Số lần thí nghiệm Số mẫu tách nhỏ Số mẫu sống sau 2 tuần trên mơi trường thanh lọc lần 3 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 37 36 0 5 0 13,9 2 33 33 0 5 0 15,2 3 35 32 0 4 0 12,5 4 36 31 0 4 0 12,9 Trung bình 0 13,6 32 Kết quả thu được cho thấy hiệu quả thanh lọc sẽ tốt hơn khi tách nhỏ mơ sẹo, do đĩ sau khi thanh lọc lần 2 các khối mơ sẹo nên được tách nhỏ rồi mới chuyển lên mơi trường thanh lọc lần 3 để tránh hiện tượng thốt mẫu (escape) và việc thanh lọc sẽ hiệu quả hơn. Ngồi ra kết quả thu được cho thấy giống bơng vải Coker312 và VN36P trong thử nghiệm này đáp ứng tốt với quá trình tạo mơ sẹo. Mơ sẹo ở các giống bắt đầu hình thành sau 14 ngày chuyển lên mơi trường thanh lọc với tỉ lệ cao (97 – 98%). Trong khi đĩ một kết quả với tỷ lệ hình thành mơ sẹo thấp hơn (78% sau 10-15 ngày) đã được cơng bố (Chaudhary và ctv, 2003). Sự khác nhau giữa 2 kết quả này cĩ thể là do Chaudhary và ctv đã sử dụng hệ thống thanh lọc bằng chất kháng sinh kanamycin với nồng độ thanh lọc giảm dần, lần lượt là 50mg/l; 50mg/l; 25mg/l và 0mg/l. Ngồi ra giống bơng vải được nghiên cứu trong báo cáo cũng khác nhau (Chaudhary và ctv đã nghiên cứu trên giống Coker 310). Trong khi đĩ ở mẫu đối chứng khơng chuyển gen thì tỷ lệ hình thành mơ sẹo giống nhau (100%). Chúng tơi cho rằng sự khác nhau trong tỷ lệ hình thành mơ sẹo của mẫu lây nhiễm là do hệ thống thanh lọc và giống được sử dụng khác nhau. 33 CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ kết quả bước đầu thu nhận được về khả năng đáp ứng chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens của hai giống bơng vải Coker 312 và VN36P và việc ứng dụng hệ thống thanh lọc bằng đường mannose chúng tơi cĩ những nhận xét sau: -Các giống bơng vải Coker 312 và VN36P sau khi được chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (sử dụng vắc tơ pManCa mang gen pmi và gen gus), sau 3 vịng thanh lọc trên mơi trường cĩ chứa mannose cho tỷ lệ mẫu mơ sẹo sống sĩt theo thứ tự đạt 10,4% và 13,6%, so với mẫu đối chứng (khơng chuyển nạp gen) cĩ 0% tỷ lệ mẫu mơ sẹo sống sĩt. Điều này cho thấy hệ thống chọn lọc mannose cĩ hiệu quả trong thanh lọc chuyển nạp gen. Sử dụng hệ thống chọn lọc bằng mannose cĩ lợi điểm hơn so với các hệ thống chọn lọc bằng chất kháng sinh vì làm giảm các mối lo ngại về tính an tồn sinh học của cây trồng biến đổi gen do việc sử dụng các gen đánh dấu chọn lọc là gen kháng chất kháng sinh. -Kỹ thuật tách nhỏ mơ sẹo trong giai đoạn thanh lọc đĩng vai trị rất quan trọng trong việc hạn chế sự phát triển của các mơ khơng chuyển gen, đặc biệt đối với hệ thống thanh lọc bằng đường mannose. 5.2. Đề nghị Cần tiếp tục nghiên cứu thêm về các mức liều lượng đường mannose và glucose ở mỗi vịng thanh lọc và thời gian chọn lọc để nâng cao hiệu quả chọn lọc, giảm thiểu điều kiện cho hiện tượng thốt mẫu. Cần tiến hành song song nghiên cứu chuyển nạp gen cây bơng vải sử dụng hệ thống thanh lọc bằng đường mannose bên cạnh các hệ thống thanh lọc phổ biến khác như hygromycin làm đối chứng nhằm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển nạp gen như vi khuẩn, thời gian lây nhiễm, vật liệu nuơi cấy khởi đầu, quy trình chọn lọc, v.v. Trên cơ sở đĩ tiến hành hồn thiện với hệ thống thanh lọc bằng đường mannose để ứng dụng trong việc nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của các giống bơng đang được trồng ở Việt Nam. 34 CHƢƠNG 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lê Trần Bình, 2001. Thực trạng chuyển nạp gen ở Việt Nam. Hội Nghị Nhận Thức Về Cơng Nghệ Sinh Học, Hà Nội, 6-8 tháng 7 năm 2001. 2. Bộ Nơng Nghiệp và Phát Triển Nơng Thơn, 2003. Mục tiêu và trương trình phát triển năm 2003 của Bộ Nơng Nghiệp và Phát Triển Nơng Thơn. Tạp chí Nơng Nghiệp và Phát Triển Nơng Thơn, số 1/2003: 5-8. 3. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2000. Di truyền phân tử-Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng (tập II: Chuyển nạp gen). Nhà Xuất Bản Nơng Nghiệp. 4. Phạm Hồng Hộ, 1997. Cây cỏ Việt Nam. Tái bản lần thứ ba. Nhà Xuất Bản Trẻ. Tp. Hồ Chí Minh. 5. Lê Kim Hỷ, 2003.Phát Triển Cây Bơng Vải Ở Các Tỉnh Duyên Hải Nam Trung Bộ. Hội nghị về phát triển cây bơng vải ở Duyên Hải Nam Trung Bộ. 6. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Lê Thị Thuỷ Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh, Cao Cường, 2002. Cơng nghệ gen. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh. 7. Lê Quang Quyến, 2004. Phát Triển Cây Bơng Và Nghề Trồng Bơng Ở Việt Nam. Viện Nghiên Cứu Cây bơng và Cây cĩ sợi. TIẾNG NƢỚC NGỒI 8. Binns A.N. and Costantino P, 1998. The Agrobacterium oncogens, p. 251-266. (Spaink.H.P, Kondorosi. A., Hooykaas. P. J. J. editors), In The Rhizobiaceae: molecular biology of model plant-associated bacteria. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 9. Chauhary B., Kumar S., Prasad V.S.K., Oinam G.S., Burma P.K and Pental D, 2003. Slow desication to high – frequency shoot recovery from transformed 35 somatic embryos of cotton (Gossypium hirsutumL. cv. Coker 310). Plant Cell Reports 21: 955 – 960. 10. Chaudhary B., Kumar S., Prasad V.S.K., Oinam G.S., Burma P.K and Pental D, 2003. Slow desication to high – frequency shoot recovery from transformed somatic embryos of cotton (Gossypium hirsutumL. cv. Coker 310). Plant Cell Reports 21: 955 – 960. 11. Chen Z.X., Liewellyn D.J., Fan Y.L., Li S.J. , Guo S.D., Jiao G.L. and Zhao J.X, 1994. The 2,4D Resistant transgenic cotton plants produce by Agrobacterium mediated gen transfer. Scientina Agiculture Sinica 27(2): 31 – 37. 12. Chen Z.X, Zhi X.J. and Xian S.J, 2000. High-efficiency Agrobacterium- mediated transformation of cotton using petiole explants. US Patent No.: WO 00/77230 A1. 13. Chilton M.D., Currier T.C., Farrand S.K., Bendich A.J., Gordon M.P and Nestor E.W, 1974. Agrobacterium tumefaciens DNA and PS8 bacteriophage DNA not detected in crown gall tumors. Proceeding of National Academy Science. USA 71: 3672- 3676. 14. Chlan Y.L., Lin J., Cary J.W., and Cleveland T.E, 1995. A producer for biolistic transformation and regenration of transgenic cotton from meristematic tissues. Plant Molecular Bology Reporter. 13: 31-37. 15. Christou P, 1997. Rice transfomrmation: bombardment. Plant Molecular Biology. Reporter. 35: 179-203. 16. Cousin Y.L, Lyon B.R and Llewellyn D.J, 1991. Transformation of Australia cotton cultivars: Prospects for cotton improvement through genetic engineering. Australia Journal Plant Physiology., 18, 481-494. 17. Deacon J., Robertson A and Isbister A, 2005. The Microbial World: Biology and Control of Crown Gall (Agrobacterium tumefaciens). Institute of Cell and Molecular Biology, The University of Edinburgh. 18. Deng W., Chen L., Wood D.W., Metcalfe T., Liang X., Gordon M.P., Comai L and Nester E.W, 1998. Agrobacterium VirD2 protein interacts with plant host cyclophilins. Proceeding of the National Academy of Sciences 95: 7040-7045. 36 19. Dessaux Y., Petit A., Farrand S.K and Murphy P.J, 1998. Opines and opine-like molecules involved in plant-Rhizobiaceae interactions. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 20. Firoozabady E., DeBoer D.L., Merlo D.J., Halls E.J., Anderson I.N., Raska K.A and Muray E.E, 1987. Transformation of cotton, Gossypium hirsutum L. by Agrobacterium tumefaciens and regeration of transgenic plants. Plant Molecular Bology 10: 105-116. 21. Gasser C.S. and Fraley K., 1992. Transgenic crops. Sci. Am. 266: 62-69. 22. Gelvin S.B., 2003. Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the "Gene-Jockeying" Tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews 67: 16-37 23. Hoa T.T.C and Bong B.B, 2003. Effcient Agrobacterium-mediated transformation of indica rice (Oryza sativa) using mannose selection system. Viet Nam Journal of Agriculture & Rural Development 1+2: 60-63. 24. Hoekema L. 1983. A binary vector strategy base on separation of Vir- and T- region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature 303: 179-180. 25. ISAAA, 2002. Global Review of Commercialized Transgenic Crops: 2001 26b.pdf 26. James C. 2004. Preview: Global status of commercialized biotech/GM crops: 2004. International Service for the Acquisition of Agri – Biotech Applications (ISAAA), Excutive Summary. No. 32 – 2004: 4 – 8. 27. Jiang B.G, 2004. Optimization of Agrobacterium mediated cotton transformation using shoot apex explants and quantitative trait loci analysis of yeild and yeild component traits in Upland Cotton (Gossypium hirsutm L.). PhD. Thesis, Louisiana State University, USA. 28. Jin S., Prusti R.K., Roitsch T., Ankenbauer R.G and Nester E.W, 1990. Phosphorylation of the VirG protein of Agrobacterium tumefaciens by the autophosphorylated VirA protein: Essential role in biological activity of VirG. Journal of Bacteriology 172: 4945- 4950. 29. Korber H., Strizhov N., Staiger D., Feldwish J., Olsson O., Sandberg. G., Palme K., Schell J and Koncz C, 1991. T-DNA gen 5 of Agrobacterium modulates 37 auxin response by autoregulated synthesis of a growth hormone an tagonist in plants. EMBO J. 10: 3983-3991. 30. Lai E.M. and Kado C.I., 1998. Processed VirB2 Is the Major Subunit of the Promiscuous Pilus of Agrobacterium tumefaciens. Journal of Bacteriology 180: 2711-2717. 31. McCabe D.E and Martinell B.J, 1993. Transformation of lite cotton cultivars via particle bombardment of meristems. Bio/Technology 11: 596-598. 32. Mishra R., Wang H.Y., Yadav N.R and Wilkins T.A, 2003. Development of a highly regenrable elite Acala cotton (Gossypium hirsutumcv. Maxxa) – a step towards genotype-independent regenration. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 73: 21–35. 33. Murashige T. and Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum 15: 476-493. 34. Nobre J., Keith J.D and Dunwell J.M, 2001. Morphogenesis and regeneration from stomatal guard cell complexes of cotton (Gossypium hirsutum L.). Plant Cell Reports 20: 8-15. 35. Perlak F.J., Deaton R.W., Armstrong T.A., Fruchs R.L, Sims S.R., Grennplate J.T and Fischhoff D.A, 1990. Insect resistant cotton plants. Bio/Technology 8: 934-943. 36. Rajasekaran K., Hudspeth R.I., Cary J.W., Anderson D.M and Cleveland D.M, 2000. High- frequency stable transformation of cotton (Gossypium hirsutumL.) by particle bombardment of embryogenic cell suspension cultures. Plant Cell Reports 19: 539- 545. 37. Rajasekaran K, 1996. Regenration of plants from cryopreserved embrygenic cell suspension and callus cultures of cotton (Gossypium hirsutumL.). Plant Cell Report 3: 859 – 864. 38. de la Riva G.A., González-Cabrera J., Vázquez-Padrĩn R and Ayra-Pardo C, 1998 .The agrobacterium tumefaciens gen transfer to plant cell. Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458. 39. Sakhanokho H.F. , Zipf A. , Rajasekaran K. , Saha S and Shama G.C, 2001, Induction of highly embryogenic calli and plant regenration in Upland 38 (Gossypium hirsutumL.) and Pima (Gossypium barbadense L.) cottons. Crop Science 41: p 1235-1240. 40. Satyavathi V.V., Prasad V., Laskmi BG. and Sita G.L, 2002. High efficiency tranformation protocol for three Indian cotton varieties via Agrobacterium tumefaciens. Plant Science 162: 215-223. 41. Sunilkumar G and Rathore K.S, 2001. Transgenic cotton: factors influencing Agrobaterium- mediated transformation and regenration. Molecular Breed 8: 37- 52. 42. Tinland B., Fournier P., Heckel T and Otten L, 1992. Expression of a chimeric heat-shock-in-ducible Agrobacterium 6b oncogen in Nicotiana rustica. Plant Molecular Biology 18: 921- 930. 43. Umbeck P.F., Johnson G., Barton K. and Swain S, 1987. Gentically transformed cotton (Gossypium hirsutumL.). Plant Biotechnology 5: 263 – 266. 44. Valentine L., 2003. Agrobacterium tumefaciens and the Plant: The David and Goliath of Modern Genetics. Plant Physiology 133: 948-955. 45. Ziemienowicz A., 2001. Odyssey of Agrobacterium T-DNA. Acta biochimica polonica 48: 623.635. 46. Zhu J., Oger P.M., Schrammeijer B., Hooykaas P.J.J, Farrand S.K and Winans S. C, 2000. The Bases of Crown Gall Tumorigensis. Journal of Bacteriology 182:3885- 3895. 47. Zupan J. R., Citovsky V and Zambryski P, 1996. Agrobacterium VirE2 protein mediates nuclear uptake of single-stranded DNA in plant cells. Proceeding of the National Academy of Sciences 93: 2392-2397. 48. Winans S.C., Allenza P., Stachel S.E., McBride K.E and Nester E.W, 1987. Characterization of the virE operon of the Agrobacterium tumefaciens Plasmid Ti pTiA6. Nucleic Acids Research 15: 825.837. 39 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Thành phần mơi trƣờng nãy mầm hạt MSG trong 1 lít 2, 15 g Hỗn hợp khống MS (M 0221, Duchefa, Hà Lan) 10 g Glucose 0, 9 g MgCl2.6H2O 1, 8 g Phytagel (P 8169, Sigma, Mỹ) pH 7,0 (chuẩn bằng KOH) Phụ lục 2. Thành phần mơi trƣờng lây nhiễm MSCo trong 1 lít 4, 4 g Hỗn hợp khống và vitamin B5 (M 0231, Duchefa, Hà Lan) 30 g Glucose 0, 05 mg 2,4-D 0, 10 mg Kinetin 0, 9 g MgCl2.6H2O 2, 0 g Phytagel (P 8169, Sigma, Mỹ) pH 6,5 (chuẩn bằng KOH) 0,2 mM AS Phụ lục 3. Thành phần mơi trƣờng tạo mơ sẹo và thanh lọc MMS1 trong 1 lít 4, 4 g Hỗn hợp khống và vitamin B5 (M 0231, Duchefa, Hà Lan) 0, 05 mg 2,4-D 0, 10 mg Kinetin 0, 9 g MgCl2.6H2O 2, 0 g Phytagel (CAT. No. P 8169, Sigma, Mỹ) glucose 10 g, 5 g, 0 g. mannose 25 g, 30 g, 35 g. pH 6,5 (chuẩn bằng KOH) 500 mg CB 40 Phụ lục 4. Thành phần mơi trƣờng ABG (Chilton và ctv, 1974) trong 1 lít Thành phần nồng độ cuối Dung dịch đệm AB (hấp tiệt trùng riêng) K2HPO4.3H2O 3,0 g/l NaH2PO4 1,0 g/l Khống AB (hấp tiệt trùng riêng) NH4Cl 1,000 g/l MgSO4.7H2O 0,300 g/l KCl 0,150 g/l CaCl2 0,010 g/l FeSO4.7H2O 0,0025 g/l Mơi trƣờng ABG Glucoz 5,0 g Agar 15,0 g Nước cất 900,0 ml Khống AB 20X 50,0 ml Đệm AB 20X 50,0 ml Phụ lục 5. Thành phần mơi trƣờng YEP (An và ctv, 1988) trong 1 lít 5,0 g Beef extract 1,0 g Yeast extract 5,0 g Pepton 5,0 g Sucrose 2 ml MgSO4 1M pH 7,0 (chuẩn bằng NaOH) Phụ lục 6. Thành phần mơi trƣờng phát sinh phơi MMS2 trong 1 lít 4,4 g Hỗn hợp khống và vitamin B5 (M 0231, Duchefa, Hà Lan) 1,9 g KNO3 30 g glucose 0,9 g MgCl2.6H2O 2,0 g Phytagel (CAT. No. P 8169, Sigma, Mỹ) 41 pH 6,5 (chuẩn bằng KOH) Phụ lục 7. Dụng cụ, thiết bị dùng trong thí nghiệm Keo thủy tinh Nồi hấp tiệt trùng autoclave: Microm (Model No. SA- 252M) Tủ nuơi cấy: VƯtsch VB 0714 và Sanyo chamber MLR-350H (Serial No. 21215175) Cân điện tử: Chyo (MJ- 500) và AA-200 Máy đo pH Themo orion (Model 420) Microwave: Sanyo EM-G4753 Ống đong (10, 25, 100, 250, 500, 1000 ml) Đĩa Petri Ф 60 và Ф 90 Bình tam giác (10, 100, 250, 500 ml) Máy lắc (200 vịng/phút): Orbital incubator SI50 Tủ cấy: Holten LaminAir (model 1.8) và ASTECT Microflow laminar (ABS1200). 200011310) Tủ lạnh (0, 4, -200C) Máy ly tâm: Hermle Z323 Máy đo OD600 Bio-Rad Smartspec TM 3000 Tủ sấy Kéo, kẹp, dao Pipet (6, 50, 200, 1000 µl) Máy khuấy từ: Bioblock cimarec 1