Đề tài Thu nhận inulinase

Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 2 Mục lục Trang I. Giới thiệu 5 1.1. Inulin 5 1.2. Định nghĩa 5 1.3. Công thức cấu tạo 5 1.4. Nguồn thu nhận 5 1.5. Ứng dụng 6 2. Enzyme inulinase 7 2.1. Định nghĩa 7 2.2. Phân loại 7 2.3. Các bậc cấc trúc và cơ chế xúc tác 7 2.4. Ứng dụng 9 3. Vi sinh vật 11 3.1. Nhóm vi sinh vật sử dụng sinh tổng hợp inulinase 11 3.2. Đặc điểm sinh lý 12 II. Quy trình công nghệ 14 III. Giải thích quy trình công nghệ 16 1. Chuẩn bị môi trường 16 2. Tiệt trùng môi trường 16 3. Chuẩn bị giống 18 4. Nhân giống 18 5. Cấy giống 20 6. Lên men 20 7. Tinh sạch 28 7.1. Ly tâm lần 1 28 7.2. Kết tủa 29 7.3. Ly tâm lần 2 30 7.4. Hòa tan kết tủa 31 7.5. Thẩm tách 31 7.6. Trao đổi sắc ký ion 32 7.7. Trao đổi sắc ký ái lực 35 7.8. Sấy 36 IV. Sản phẩm 38 V. Thành tựu công nghệ 38 VI. Tài liệu tham khảo 56 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 3 MỤC LỤC BẢNG Bảng Trang Bảng 1: Một số vi sinh vật được sử dụng để sinh tổng hợp inulinase 10 Bảng 2: Một vài tính chất của inulinase từ các loài vi sinh vật… 11 Bảng 3: Sự ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính của enzyme 25 Bảng 4: Sự kết hợp các thành phần tối ưu của môi trường 27 Bảng 5: Các thành phần của môi trường dựa trên mô hình… 40 Bảng 6: Mô hình thực nghiệm sử dụng phương pháp Plackett – burman 41 Bảng 7: 41 Bảng 8: Thành phần dinh dưỡng bổ sung vào môi trường cơ chất rắn 43 Bảng 9: Mô hình thực nghiệm cho tối ưu hóa các nồng độ thành phần… 43 Bảng 10: Phân tích kết quả các biến số thực nghiệm của mô hình … 44 Bảng 11: Phương pháp cố định và không cố định tế bào trong sản xuất… 53 Bảng 12: So sánh hoạt tính inulinase đạt được bởi các điều kiện khác nhau 55 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 4 MỤC LỤC HÌNH Hình Trang Hình 1: Công thức cấu tạo inulin 5 Hình 2: Quy trình sản xuất inulin 6 Hình 3 : Cấu trúc của enzyme inulinase 7 Hình 4: Cơ chế thủy phân inulin của inulinase 8 Hình 5: Vi sinh vật Kluyvermyces marxianus 12 Hình 6: Sơ đồ khối quy trình công nghệ sản xuất inulinase 15 Hình 7: Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC-20 17 Hình 8: Thiết bị nhân giống 19 Hình 9: Thiết bị lên men 21 Hình 10: Ảnh hưởng của nguồn carbon inulin(a), Ảnh hưởng của nguồn carbon 22 khác(b) với inulin là chất cảm ướng cho sản xuất inulinase Hình 11: Ảnh hưởng của nguồn nitơ 24 Hình 12: Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt tới hoạt tính bề mặt tới hoạt 26 tính của inulinase Hình 13: Thiết bị li tâm lắng 28 Hình 14: Thiết bị kết tủa 30 Hình 15: Cơ chế thẩm tách 32 Hình 16: Cơ chế sắc ký trao đổi ion 34 Hình 17: Thiết bị trao đổi ion 34 Hình 18: Sắc ký ái lực 36 Hình 19: May sấy phun chân không 2 giai đoạn 37 Hình 20: Ảnh hưởng của inulin….. 45 Hình 21: Ảnh hưởng của dịch bắp… 45 Hình 22: Ảnh hưởng của inulin … 46 Hình 23: Hoạt tính của inulinase và số tế bào sống theo thời gian 47 Hình 24: Ảnh hưởng của pH… 51 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 5 I. GIỚI THIỆU 1. Inulin 1.1. Định nghĩa Inulin là một polysaccharide có nguồn gốc từ thực vật,là nguồn cơ chất phong phú cho quá trình sản xuất HFS từ vi sinh vật, tan trong nước.đây là thành tựu quan trọng trong thực phẩm, đồ uống và y dược. 1.2. Công thức cấu tạo - Về mặt hóa học, Inulin – thuộc loại fructan là một polymer mạch thẳng với monomer chủ yếu là carbohydrate, liên kết b - (2,1) fructosyl - fructose. Fructose là một loại monomer cơ bản trong cấu trúc của Inulin . Bắt đầu là một nửa phân tử a-D-glucose có thể tồn tại nhưng không cần thiết. Gpy Fn [glucopyranosyl-(fructofuransoyl)n -fructose] và Fpy Fn [fructopyranosyl-(fructofuranosyl)n -fructose] là các hợp chất được kể đến trong cùng một danh pháp; chúng là cả một hỗn hợp của oligomer và polymer tốt nhất đặc trưng bởi mức độ polymer hóa ( DP), hoặc là giá trị trung bình (DPav ) hoặc tối đa (DPmax). - Công thức phân tử C6nH10n+2O5n+1 - Các đơn vị fructosyl của inulin được liên kết với chuỗi polymer kết thúc bởi 1 gốc glucose ở cuối mạch. Inulin Hình 1 Công thức cấu tạo của inulin 1.3. Nguồn thu nhận - Inulin được thu nhận từ Jerusalem artichoke, rau diếp xoăn, thược dược… - Inulin được thủy phân bởi enzyme inulinase. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 6 Hình 2 Quy trình sản xuất inulin 1.4. Ứng dụng - Inulin được coi là nguồn carbohydrate tốt nhất. Tại Hoa Kỳ, nó được gọi GRAS, an toàn cho con người và mức tiêu thụ trung bình hàng ngày đã được ước tính là từ 3 đến 11 g tại Châu Âu và từ 1 đến 4 g tại Hoa Kỳ. Trong y học, Inulin chống lại cả sự thủy phân acid và tương tác của các enzym tuyến tụy, nhưng không thay đổi gì ở đường ruột, nơi nó được sử dụng như một nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn probiotic. Điều này lý giải tại sao Inulin không làm tăng glycaemia, cũng không có ảnh hưởng đến hàm lượng insulin trong máu, do đó sự có mặt của nó trong cơ thể các bệnh nhân tiểu đường là tốt. - Vì lợi ích sức khỏe của nó, nó được sử dụng như là một thành phần thực phẩm trong nhiều loại thực phẩm chế biến. Nó có nhiều chức năng như: giúp cải thiện sự hấp thu và cân bằng chất khoáng, làm giảm sự tăng lượng đường trong máu. Lý do chính để inulin được sử dụng trong thực phẩm chế biến chính vì nó có thể thay thế chất béo và làm giàu chất xơ. Như một sự thay thế chất béo, nó cải thiện mùi vị, kết cấu, và khẩu vị của việc giảm bớt chất béo và các sản phẩm sữa nghèo chất béo. Các sản phẩm ngũ cốc như bánh ngọt, bánh mì, ngũ cốc dùng ăn sáng được cải tiến cấu trúc và độ giòn. Sản phẩm thủy phân của Inulin, oligofructose, không chỉ cải thiện kết cấu và khẩu vị mà còn giúp tăng cường hương vị và mùi vị trái cây khi được sử dụng trong sữa chua nghèo chất béo kết hợp với độ ngọt cao. Nó cũng được dùng trong đồ uống sữa giàu dinh dưỡng để nâng cao lượng chất xơ. - Inulin ngày càng được sử dụng phổ biến trong thực phẩm bởi vì nó có tính năng dinh dưỡng thay đổi bất kỳ. Mùi vị của nó trong khoảng từ không vị đến rất ngọt (khoảng 10% vị ngọt của đường / sucrose). Nó có thể được dùng để thay thế đường, chất béo, và bột. Điều này đặc biệt thuận lợi vì inulin chiếm 1/3 tới 1/4 năng lượng của đường hoặc Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 7 carbohydrate khác và 1/6 đến 1 / 9 của năng lượng của chất béo. Nó cũng làm tăng sự hấp thu Ca và có thể tăng sự hấp thu Mg đồng thời thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn đường ruột. Về mặt dinh dưỡng, nó được coi là một dạng chất xơ hòa tan và đôi khi được xem như một probiotic, có khả năng ngăn ngừa ung thư ruột kết.. - Ngày nay trong công nghiệp, người ta sản xuất High fructose syrup từ inulin với hiệu suất thủy phân cao, là một sản phẩm quan trọng trong ngành thức uống nói riêng và thực phẩm nói chung. 2. Enzyme inulinase 2.1. Định nghĩa - Enzyme inulinase (β-D-fructan fructanohydrolases) là enzyme thủy phân liên kết β-2,1 và liên kết β–2,6 của inulin. 2.2. Phân loại - Có 2 loại enzyme inulinase: Exoinulinase (β-D-fructan fructohydrolase, EC 3.2.1.80) Endoinulinase (β -2,1-D-fructan fructanohydrolase, EC 3.2.1.7) Bảng 1 Một vài tính chất của inulinase từ các loài vi sinh vật khác nhau 2.3. Các bậc cấu trúc và cơ chế xúc tác Hình 3 Cấu trúc của enzyme inulinase - Quá trình thủy phân inulin thành fructose: inulin là hỗn hợp của nhiều polyme với các giá trị DP khác nhau và nồng độ của nó thì khó xác định. Cho nên để đánh giá quá trình thủy phân, người ta sẽ dựa vào hàm lượng đường fructose và glucose được tạo ra. Trong quá trình thủy phân inulin xảy ra đồng thời 3 cơ chế của một hệ 3 enzyme: exoinulinase, endoinulinase, invertase. - Trong đó exoinulinase sẽ tấn công vào liên kết β-2,1-fruto cắt fructose tận cùng của inulin cho ra fructosevà endoinulinase tấn công vào liên kết β-2,6- inulooligosaccharides (IOSs) (hình ) Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 8 Hình 4 Cơ chế thủy phân inulin của inulinase 2.4. Ứng dụng a. Sản xuất Ultra-high-fructose syrup (UHFS) từ inulin - Fructose syrup có lợi ở bệnh nhân tiểu đường, làm tăng hấp thu sắt ở trẻ em, có độ ngọt cao, vì vậy nó có thể được sử dụng để bổ sung vào khẩu phần ăn của người béo Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 9 phì, kích thích sự hấp thụ canxi của phụ nữ mãn kinh, kích thích sự tăng trưởng của hệ vi khuẩn Bifidobacteria trong ruột già và ruột non, ngăn ngừa bệnh ung thư ruột kết, và nó được sử dụng thay cho chất béo đối với những người ăn kiêng. Fructose cũng được sử dụng rộng rãi trong nhiều loại thực phẩm, dược phẩm, và đồ uống nhẹ thay cho sucrose. Tuy nhiên, hiện nay các phương pháp hóa học để sản xuất fructose bị hạn chế. Fructose cũng có thể được sản xuất từ tinh bột bằng phương pháp enzym bao gồm: α-amylase, amyloglucosidase, và glucose isomerase .Và người ta thấy rằng cách tốt nhất là sử dụng vi sinh vật inulinase, bằng phương pháp thủy phân từng bậc inulin, hiệu suất thu được sau quá trình thủy phân là 95% fructose. Vì vậy, exoinulinase từ nhiều loài vi sinh vật khác nhau được sử dụng để sản xuất Ultra high - fructose syrup (UHFS) từ inulin và từ nguyên liệu có chứa inulin. - Có một điều thú vị đáng chú ý chỉ có monosaccharide (glucose và fructose) đã được thu nhận từ inulin do hoạt tính của inulinases từ hai chủng nấm men C. aureus G7a and P. guilliermondii. Vì vậy, inulinases từ hai chủng nấm men này có tiềm năng rất lớn trong việc thủy phân trực tiếp inulin trong thực phẩm và ngành công nghiệp lên men. Các monosaccharide và oligosaccharide cũng được phát hiện sau khi thủy phân inulin trong hơn 2 giờ do các exoinulinase sản xuất bởi K . marxianus var. bulgaricus. b. Sản xuất ethanol từ inulin - Ethanol được ứng dụng làm nhiên liệu sinh học hoặc là khí đốt. Nó cũng là một nguyên liệu lý tưởng cho hóa tổng hợp. - Jerusalem artichoke là một trong những nguyên vật liệu tốt nhất để sản xuất nhiên liệu ethanol. Chủng Saccharomyces cerevisiae được sử dụng cho việc sản xuất đồng thời ethanol và fructose từ hỗn hợp glucose/fructose hoặc từ dịch thủy phân Jerusalem artichoke. Điều này cho phép sản xuất 5g ethanol/lít và 48g đường/lít chứa đến 99% fructose từ sự pha loãng dịch thủy phân Jerusalem artichoke có chứa 60g đường/lít. - Ethanol cũng được sản xuất từ Jerusalem artichoke bằng cách sử dụng K. fragilis với hoạt tính của inulinase, từ nấm men thương mại S. cerevisiae, hoặc từ các vi khuẩn Zymomonas mobilis. Công nghiệp sản xuất ethanol của S. cerevisiae cũng như vi khuẩn, Z. mobilis trong quá trình lên men nếu trộn với nấm men có hoạt tính inulinase, cụ thể là K. fragilis, thì hàm lượng sản phẩm thu nhận được tăng lên 12% so với phương pháp sử dụng một loại vi sinh vật. c. Sản xuất Oligofructan từ inulin - Fructooligosaccharide là một trong những thành phần phổ biến cấu thành nên thực phẩm chức năng vì có tính chất tăng cường hệ vi sinh vật bifidogenic trong đường ruột. Inulin có thể được thủy phân một cách chọn lọc bởi inulinase tạo ra IOSs như inulotriose and inulotetraose. Các Inulooligosaccharide có cấu trúc và chức năng tương tự các fructooligosaccharide, tác động có lợi trên người và động vật. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 10 - Khi endoinulinase được sử dụng cho thủy phân Inulin, fructooligosaccharide có thể được sản xuất bởi quá trình thủy phân từng bậc, năng suất hơn 80%. - Ngoài các ứng dụng trên, inulinase còn được sử dụng để sản xuất các chất khác như: gluconic acid, sorbitol, pupulan, acetone và butanol. 3. Vi sinh vật Có nhiều loại vi sinh vật được sử dụng để sản xuất inulinase: nấm men, nấm mốc, và vi khuẩn Bảng 1 Một số vi sinh vật được sử dụng để sinh tổng hợp inulinase Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 11 Bảng 2 Một vài tính chất của inulinase từ các loài vi sinh vật khác nhau Sự ảnh hưởng của vi sinh vật lên khối lượng phân tử inulinin: - Hầu hết các inulinases từ nấm mốc có khối lượng phân tử lớn hơn 50,0 kDA (Pandey et al. 1999). Ví dụ, khối lượng phân tử của inulinase tinh sạch từ canh trường lên men của nấm men C. aureus G7a được ước tính là 60,0 kDA (Sheng et al. 2008b) trong khi khối lượng phân tử của inulinase tinh sạch từ P. guilliermondii được ước tính là 50,0 kDA (Gong et al 2008).. Tuy nhiên, inulinase ngoại bào từ nấm men K. fragilis có khối lượng phân tử là 250 kDA. - Khối lượng phân tử của exoinulinase tinh sạch từ vi khuẩn được ước tính là khoảng 54,0 KDA (Tsujimoto et al. 2003; Kwon et al. 2000). Điều này cho thấy khối lượng phân tử của exoinulinases từ vi khuẩn là gần như giống với khối lượng phân tử của exoinulinases từ nấm men. - Các endoinulinases từ nấm mốc và vi khuẩn cũng được tinh sạch và mô tả. Ví dụ, endoinulinase sản xuất bởi Penicillium sp. TN-88 có khối lượng phân tử là 68,0 kDA (Nakamura et al 1997). Trong khi khối lượng phân tử của endoinulinase ngoại bào từ Arthrobacter sp. S37 là 75 kDA (Kang et al 1998).. 3.1. Nhóm vi sinh vật sử dụng để sản xuất inulinase Chủng : Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Saccharomycetes Bộ: Saccharomycetales Họ: Saccharomycetaceae Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 12 Giống : Kluyveromyces Loài : K. marxianus Hình 5 Kluyveromyces marxianus - Sự hình thành nang bào tử: sự tiếp hợp của các tế bào đơn bội hoặc các tế bào chồi có thể hình thành nên nang nấm, hoặc nang nấm có thể mọc trực tiếp từ tế bào lưỡng bội. 1 đến 4 nang bào tử được hình thành. Các bào tử được sắp xếp thành hình dạng từ hình cầu đến hình elip đến hình thận. Các bào tử sẽ được giải phóng từ nang bào tử ngay sau khi hình thành và có khuynh hướng kết dính lại. - Sự hình thành bào tử sẽ xảy ra sau 2-5 ngày ở 17-25oC trên môi trường thạch agar 1%. Hầu hết giống này có khả năng sinh bào tử tốt. 3.2. Đặc điểm sinh lí Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 13 - Khả năng lên men các loại đường: - Sự tiêu thụ cơ chất: - Những đặc tính sinh trưởng khác: Chỉ tiêu chọn giống vi sinh vật) - Khả năng sinh độc tố: không có. - Khả sinh tổng hợp gellan: càng mạnh càng tốt. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 14 - Khả năng thích nghi của giống phải cao, tốc độ sinh trưởng mạnh. - Điều kiện nuôi cấy: đơn giản, là môi trường đặc trưng cho sự sinh trưởng của vi khuẩn và tổng hợp gellan. Môi trường dễ kiếm, giá thành không quá cao. - Sự ổn định của giống theo thời gian: càng lâu càng tốt. II. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 15 Hình 6 Sơ đồ khối quy trình công nghệ sản xuất inulinase INULIN Chuẩn bị môi trường Tiệt trùng Lên men Ly tâm lần 1 Kết tủa Ly tâm lần 2 (NH4)2SO4 Nhân giống Kluyveromyces marxianus Hòa tan kết tủa Thẩm tách Trao đổi ion Trao đổi sắc ký ái lực Sấy Sản phẩm Dung dịch đệm acetate - phophate Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 16 III. GIẢI THÍCH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ 1. Chuẩn bị môi trường lên men - Mục đích: Chuẩn bị chất dinh dưỡng, tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trong môi trường lên men. - Thành phần môi trường lên men bề sâu bao gồm: (w/v) Inulin 1.0 % Chất chiết nấm men 1.0 % KH2PO4 0.5% KCl 0.12% NH4Cl 0.15% MgSO4.7H2O 0.07% ZnSO4.7H2O 0.01% Dung dịch các nguyên tố vết: 0.1% ( v/v) pH : 6.5 Sau khi tiệt trùng, làm nguội và đưa về nhiệt độ 30ºC để cấy canh trường giống với tỉ lệ 5% . 2. Tiệt trùng môi trường - Mục đích: Tiêu diệt vi sinh vật chuẩn bị cho quá trình lên men - Các biến đổi của nguyên liệu: Vật lý: Sự thay đổi về thể tích, khối lượng, tỉ trọng (nước bốc hơi), … Hóa lý: Sự bốc hơi nước. Hóa sinh: Enzym bị vô hoạt. Sinh học: Ức chế, tiêu diệt vi sinh vật. Cảm quan:Sự tổn thất của một số cấu tử mẫn cảm với nhiệt (vitamin,…). - Thiết bị sử dụng: Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 17 Hình 7 Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC-20 Chú thích: 1- Thùng chứa 2- Bơm 3- Bộ đun nóng 4- Bộ giữ nhiệt 5- Bộ lấy mẫu 6- Thiết bị trao đổi nhiệt- thu hồi 7- Thiết bị trao đổi nhiệt- thiết bị làm mát 8- Thiết bị lên men Cấu tạo: gồm thùng chứa môi trường dinh dưỡng, bơm ly tâm, bộ đun nóng, bộ giữ nhiệt, bộ thu hồi nhiệt, bộ trao đổi nhiệt, hệ thống điều chỉnh tự động các thông số của quá trình. Nguyên tắc hoạt động: Trước khi bắt đầu hoạt động tất cả các thiết bị, đường ống dẫn và phụ tùng YHC được thanh trùng bằng hơi quá nhiệt. Hơi nước được đưa vào bộ đun nóng theo đường viền của van điều chỉnh tiêu hao hơi, sau đó vào bộ giữ nhiệt, thu hồi nhiệt và theo đường viền của van giảm áp suất vào thiết bị làm mát. Cùng lúc mở các van xả nước ngưng và khi đạt được nhiệt độ lớn hơn 1400C thì bắt đầu tiệt trùng. Khi nhiệt độ và áp suất trong nồi phản ứng đạt trị số ổn định thì khuấy đảo các cấu tử của môi trường dinh dưỡng, môi trường mới lại cho vào thùng chứa để bơm đẩy qua khe đứng nhỏ vào bộ phận đun nóng. - Thông số công nghệ: Nhiệt độ: 1210C. Thời gian tiệt trùng: 20 phút. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 18 pH = 6.5 Tốc độ bơm môi trường: 3.5 m3/s. Áp suất: 1 atm. 3. Chuẩn bị giống - Mục đích: Chuẩn bị giống cho quá trình nhân giống. - Môi trư ờng giữ giống Kluyveromyces marxianus: Dịch chiết malt 0.3% Dịch chiết nấm men 0.3% Peptone 0.5% Glucose 1% Agar 2% pH: 6.5 Toàn bộ canh trường được giữ ở 300C và được thay mới 2 lần/ tuần và được bảo quản ở 40C. - Con giống từ canh trường trên trước khi cấy giống sẽ được chuẩn bị vào 50ml môi trường chứa: Chất chiết nấm men (0.3%,w/v), peptone (0.5%, w/v), glucose (2.0%, w/v) và đưa về pH 6.0 (môi trường này đã được tiệt trùng ở 1210C, 20 phút) trong một erlen 250ml, sau đó đem cho vào thiết bị lắc với vận tốc 100 rpm ở 300C trong 12 giờ và đem bảo quản ở 40C. - Các biến đổi : Quá trình làm tăng khuẩn lạc của nấm mốc. 4. Nhân giống - Nhân giống là quá trình tăng dung tích, dịch chứa sinh khối qua nhiều cấp. Mỗi cấp nhân giống thường tăng dung khối từ 10-15 lần. Cứ làm như vậy cho đến khi toàn bộ dung tích đủ để tiến hành quá trình lên men. - Khi nhân giống giai đoạn phòng thí nghiệm, người ta sử dụng các dụng cụ thủy tinh như ống nghiệm, erlen với các dung tích 750 ml, 1l, 2l kết hợp với tủ ấm, tủ lắc điều nhiệt. Do thể tích môi trường nhỏ nên việc sử dụng máy lắc có thể đảm bảo được sự đồng nhất trong canh trường nuôi và cung cấp đầy đủ oxy cho sự sinh trưởng, phát triển của nhóm vi sinh vật hiếu khí. - Khi nhân giống ở giai đoạn phân xưởng, người ta sử dụng những thiết bị với dung tích khác nhau: 100l, 500l, 1m 3 , 3 m 3 , 5 m 3 , 10 m 3 hoặc lớn hơn tùy theo dung tích của thiết bị lên men đang sử dụng tại nhà máy. - Mục đích: Chuẩn bị giống cho quá trình lên men. Quá trình nhân giống giúp gia tăng số lượngtế bào( tăng sinh khối), tích lũy đủ số lượng tế bào cần thiết để cấy giống vào môi trường lên men. - Môi trường nhân giống: Thành phần (g/l) Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 19 Dịch chiết malt 30.0 Peptone 5.0 Agar 15.0 Môi trường được hấp tiệt trùng ờ 1150C trong 10 phút. Dịch chiết malt là nguồn cung cấp năng lượng cho vi sinh vật, peptone cung cấp nguồn Nitơ cho vi sinh vật, agar là tác nhân làm đông đặc môi trường. - Phương pháp thực hiện: 10ml chứa môi trường glucose được tiệt trùng và canh trường vi sinh vật được ủ ở 30 oC trong 24h. Sau 24h, canh trường sẽ được chuyển vào 90ml môi trường đã tiệt trùng tương tự và tiếp tục ủ ở 300C trong 24h. 100ml giống này sẽ được chuyển tiếp đến 900ml môi trường và được ủ tiếp. Các cấp nhân giống được thực hiện cho đến khi có đủ số lượng giống cần thiết cho quá trình lên men. Hình 8 Thiết bị nhân giống 1. Hệ thống điều nhiệt (nhân giống trong erlen). 2. Bình nhân giống trung gian. 3. Thiết bị nhân giống. 4. Hệ thống lọc tách bụi và vi sinh vật. 5. Valve. 6. Bộ phận lọc hơi. 7. Bộ phận đo pH. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 20 - Các yếu tố ảnh hưởng: Nhiệt độ: Nếu tiến hành nhân giống vi sinh vật ở nhiệt độ thấp hoặc cao hơn khoảng nhiệt độ tối ưu thì vi sinh vật sinh trưởng chậm hơn và hằng số tốc độ sinh trưởng của giống (μexpo ) sẽ giảm xuống. Oxy: Đối với nhóm vi sinh vật hiếu khí bắt buộc như Aspergillus niger, việc cung cấp oxy cho môi trường là rất cần thiết để giúp vi sinh vật tổng hợp năng lượng, duy trì các hoạt động trao đổi chất và tổng hợp sinh khối. Thời gian: Theo lý thuyết, vào thời điểm đầu của giai đoạn ổn định, số lượng tế bào thu được trong canh trường là cao nhất và chúng có hoạt tính sinh lý ổn định. Do đó, ta kết thúc quá trình nhân giống để thu nhận sinh khối vào thời điểm này để đạt được hiệu quả kỹ thuật và kinh tế cao nhất. 5. Cấy giống - Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình lên men . - Các biến đổi: Hầu như không đáng kể - Thiết bị: Trong quá trình thực hiện có một bình nhân giống vi sinh vật và một bình lên men. Sau khi nhân giống và tách sinh khôi, giống sẽ được cho vào bình lên men bằng bơm. - Thông số công nghệ : Tỉ lệ giống cho vào là 5% (v). Quá trình được thực hiện ở 300C. 6. Lên men - Mục đích : khai thác, tạo môi trường với các thông số công nghệ thích hợp tạo ra càng nhiều inulinase càng tốt. - Phương pháp thực hiện: Nạp môi trường vô trùng vào trong thiết bị. Cho giống cấy vào thiết bị với tỉ lệ giống 5% so với thể tích của môi trường lên men. Lên men bề sâu trong thiết bị lên men ở 300C, pH 6.5. Khuấy trộn trong 200rpm, lưu lượng khí 0.75 vvm. Thời gian lên men: 60h - Các biến đổi: Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 21 Vật lý : Nhiệt độ của quá trình tăng và được điều nhiệt cố định ở 300C trong suốt quá trình phản ứng bằng bột phận điều nhiệt được lấp ở vỏ của thiết bị lên men. Hóa học: Nồng độ cơ chất trong môi trường giảm dần, sản phẩm trao đổi chất được tạo thành ngày càng nhiều. Hóa lý: Độ nhớt tăng. Hóa sinh: Enzyme xúc tác cho các phản ứng trao đổi chất trong tế bào vi khuẩn diễn ra mạnh. Sinh học: Sinh khối tế bào tăng lên. - Thiết bị: Cấu tạo của bình lên men: cấu tạo tương tự như thiết bị nhân giống vi sinh vật. Chúng cũng cũng có dạng hình trụ đứng, được chế tạo từ vật liệu thép không rỉ. Bên trong thiết bị có hệ thống cánh khuấy và các đầu dò nhiệt độ, pH… để có thể theo dõi trực tiếp các thông số công nghệ trong quá trình lên men. Motor cho cánh khuấy thường được đặt phía trên nắp thiết bị. Còn cửa nạp và tháo môi trường được bố trí phía đáy. Ngoài ra thiết bị còn có cửa quan sát, van lấy mẫu… Hình 9 Thiết bị lên men Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 22 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men a. Ảnh hưởng của nguồn carbon Khả năng sản xuất enzym từ nhiều nguồn carbon khác nhau: Inulin> sucrose> fructose> glucose> lactose > Maltose> tinh bột Hình 10 Ảnh hưởng của nguồn carbon inulin (a), ảnh hưởng của các nguồn carbon khác với inulin như là chất cảm ứng cho sản xuất inulinase Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 23 Inulin là nguồn carbon tốt nhất để sản xuất inulinase từ K. marxianus YS-1. Những nguồn carbon khác thì cho hiệu suất sản xuất inulinase thấp khi sử dụng cô lập, và khi sử dụng tinh bột là nguồn carbon thì hoat tính inulinase hoàn toàn không có (hình 9a). Hiệu quả của từng nguồn cacbon (1%, w / v) kết hợp với Inulin ở nồng độ 0,1% và% 0,5 (w / v) đã được nghiên cứu (hình 9b). Có sự gia tăng đáng kể trong hoạt tính của enzyme khi sử dụng kết hợp. Inulin với từng nguồn carbon như trên. Vì vậy, có thể kết luận rằng inulinase là enzyme cảm ứng trên cơ chất cảm ứng là inulin. Người ta thấy rằng inulin là cơ chất cảm ứng cho quá trình sản xuất inulinase, trong khi sự nuôi cấy của vi sinh vật sử dụng các nguồn carbon khác ức chế quá trình sản xuất enzyme này. Và điều này có thể là do những nguồn carbon này kìm hãm sinh tổng hợp inulinase enzym . b. Ảnh hưởng của nguồn nitơ Khả năng sản xuất inulinase dưới ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau: chất chiết thịt> chất chiết thịt bò> peptone>chất chiết men > ammonium clorua > Ammonium sulfate> dịch bắp> ammonium nitrat> Natri nitrat> urê (hình 10). Hoạt tính tối đa của inulinase đạt được là 6,5 IU / ml khi sử dụng chất chiết thịt. Hoạt tính inulinase cũng khá cao khi sử dụng peptone và chất chiết thịt bò. Những nguồn nitơ hữu cơ tốt hơn so với các nguồn nitơ vô cơ. Chất chiết thịt được xem là nguồn nitơ tốt nhất cho việc sản xuất inulinase từ Chrysosporium pannorum (Xiao et al. 1988). Chất chiết thịt heo sau chất chiết thịt bò đã được sử dụng là nguồ nitơ tốt để tổng hợp từ inulinase từ Kluyveromyces sp. Y-85 (Wenling et al, 1998b.). Do đó, chất chiết thịt là nguồn nitơ thích hợp nhất cho sản xuất inulinase, và được chọn cho những nghiên cứu sau này. Để xác định nồng độ tối ưu của các chất chiết thịt, người tat thay đổi nồng độ của nó từ 0.5-5.0%, w/v được sử dụng trong môi trường. Khi nồng độ của chất chiết thịt đạt đến 2% (w/v) thì hoạt tính enzyme cực đại (12.1 IU/ml) và nếu nồng độ vượt qua 2% có sự giảm hoạt tính enzyme. Điều này có thể là do bản chất phức tạp của nguồn nitơ và ở nồng độ cao một vài thành phần của nó có thể gây độc cho quá trình sản xuất inulinase Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 24 Hình 11 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến hoạt tính của enzyme c. Ảnh hưởng của các nguyên tố vết Bảng 3: chỉ ra sự ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính của enzyme. Chỉ có Mn 2+ (0.1 mM) và Ca 2+ (0.5 mM) nâng cao hoạt tính của inulinase trong khi Mg2+, Cu2+, Zn2+, Co 2+ , K + , BO3 3- và MoO4 2- không có ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp inulinase. Tuy nhiên, nếu nồng độ của những nguyên tố này cao hơn sẽ tác động tiêu cực đến sinh tổng hợp inulinase. Fe 2+ và Ni 2+ làm giảm khả năng tạo inulinase. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 25 Bảng 3 Sự ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính của enzyme d. Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt Trong số những chất hoạt động bề mặt được sử dụng, chỉ có SDS nâng cao khả năng sản xuất inulinase (hình 11). Những nghiên cứu trước cho thấy chất hoạt động bề mặt ảnh hưởng đến khả năng thẩm thấu của màng tế bào ((Tukmachev et al., 1977). Để tối ưu nồng độ của SDS, người ta thay đổi nồng độ SDS từ 0.05–2.5 mM trong môi trường. Khi nồng độ của SDS tăng đến 0.1 mM thì hoạt tính inulinase cực đại là 21.5 IU/ml. Khi nồng độ SDS cao hơn 0.1 mM thì nó có khả năng hòa tan màng protein và phospholipids, từ đó giết chết tế bào nấm men. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 26 Hình 12 Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt tới hoạt tính của inulinase e. Ảnh hưởng của tuổi và tỉ lệ giống cấy Hoạt tính enzyme đạt tối đa 24,8 IU/ml khi sử dụng canh trường giống 12h tuổi. Hoạt tính enzyme thấp hơn với canh trường giống dưới 12h tuổi. Điều này có thể do canh trường giống chưa vào giai đoạn sinh trưởng. Sử dụng canh trường giống này, hoạt tính inulinase tăng cực đại (24.8 IU/ml) khi tỉ lệ giống cấy là 5%(v/v). Nếu tỉ lệ giống cấy thấp, lượng sinh khối nấm men sinh ra có thể không đủ để tận dụng hết nguồn cơ chất. Tuy nhiên, hàm lượng vi sinh vật cao, độ nhớt của môi trường thể lên men dẫn đến sự mất cân bằng dinh dưỡng trong môi trường. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 27 f. Hiệu quả việc kết hợp các thành phần tối ưu của môi trường Hiệu quả của việc dử dụng kết hợp các thành phần tối ưu của môi trường lên men được thể hiện ở bảng sau: Bảng 4 Sự kết hợp các thành phần tối ưu của môi trường Từ bảng trên, cho thấy rằng sự kết hợp các thành phần đã được tối ưu: inulin 1.5%, chất chiết thịt 2%, CaCl2 0.5mM, và SDS 0.1mM sẽ cho hoạt tính enzyme cực đại 24.7 IU.ml. g. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ Kết quả cho thấy rằng hoạt tính enzyme cực đại là 24.5 IU/ml khi tăng pH của môi trường lên 6.5. Ở pH 4.0 và 8.0 , hoạt tính enzyme rất thấp: tương ứng với pH 8 hoạt tính enzyme là 4.2 IU/ml. Khoảng pH 6.4 – 6.6 tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp inulinase từ K. marxianus (Gupta et al., 1994). Năng suất cực đại cũng đạt được bởi K. marxianus ở pH 6.5 bởi (Kalil et al., 2005; Silva-Santisteban and Filho, 2005). Hoạt tính inulinase tối đa 24.3 IU/ml ở 30oC, nếu nhiệt độ vượt quá nhiệt độ này thì hoạt tính enzyme sẽ giảm đáng kể. Nói chung nhiệt đô ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của tế bào. h. Ảnh hưởng của sự khuấy trộn Tác động khuấy trộn có ảnh hưởng mạnh đến quá trình sinh tổng hợp inulinase. Hoạt tính enzyme tăng đáng kể 28.1 IU/ml khi tốc độ khuấy trộn là 150rpm so với điều kiện không khuấy trộn 5.9 IU/ml. Nếu tốc độ khuấy trộn vượt quá 150 rpm thì hoạt tính enzyme giảm. Tốc độ khuấy trộn không chỉ ảnh hưởng đến lượng oxy, mà còn ảnh hướng đến những chất dinh dưỡng khác trong môi trường. Khi tốc độ khuấy trộn cao hơn, hoạt tính enzyme sẽ thấp do sự ảnh hưởng của ứng suất trượt lên tế bào nấm men cũng như cấu trúc tế bào enzyme. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 28 i. Ảnh hưởng của thời gian lên men Hoạt tính enzyme đạt 30.8 IU/ml khi thời gian lên men là 72h, và sau đó sẽ giảm. Điều này cho thấy rằng sự sinh tổng hợp inulinase từ K. marxianus liên quan đến sự sinh trưởng của tế bào và đạt đến giá trị tối ưu (Al-Dagal and Bazaraa, 1998). Hoạt tính enzyme sẽ giảm sau 72 lên men do sự giảm của chất dinh dưỡng trong môi trường, hoặc do phản ứng dị hóa của enzyme. 7. Tinh sạch 7.1. Ly tâm lần 1 - Mục đích: Tách sinh khối vi sinh vật - Các biến đổi: Vật lý: Sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng, nhiệt độ của dung dịch. Hóa lý: Độ nhớt giảm, huyền phù tách ra thành 2 pha rắn - lỏng Hóa học: Thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn – lỏng. Vi sinh: Hàm lượng vi sinh vật giảm. - Thiết bị: Sử dụng các cơn lốc ly tâm để tách riêng các phần tử rắn và lỏng có tỷ trọng khác nhau. Hình 13 Thiết bị ly tâm lắng - Nguyên tắc hoạt động: Cấu tạo: gồm một máy ly tâm nằm ngang có sức chứa lớn,quay khoảng 10000rpm, lực ly tâm lớn làm cho các pha tách ra khỏi nhau nhờ vào tỉ trọng khác nhau của chúng. Khi máy hoạt động, hỗn hợp huyền phù được nạp theo ống nạp liệu vào khoang trong của vít tải rồi qua cửa tháo vào bên trong rotor. Dưới tác động của lực li tâm, huyền phù được Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 29 phân chia và các tiểu phần của pha rắn được lắng trên tường của rotor. Chất lỏng trong chảy vào cửa rót, tràn qua ngưỡng rót và được tháo ra khỏi rotor. - Thông số công nghệ: Tốc độ ly tâm 10000rpm. Nhiệt độ 40C Thời gian 20 phút. Hiệu suất thu hồi 100% Độ tinh sạch 1 Hoạt tính riêng 9.4 IU/mg Tổng lượng protein 185.0 mg Tổng hoạt độ 1750 IU 7.2. Kết tủa - Mục đích: Khai thác: Tách protein ra khỏi dung dịch enzyme thô, thu protein dưới dạng kết tủa. Chuẩn bị: Chuẩn bị cho quá trình sấy thu nhận sản phẩm. - Các biến đổi: Vật lý: Nhiệt độ giảm. Hóa lý: Sự kết tủa và tách pha. Enzyme chuyển từ dạng lỏng sang dạng rắn. Hóa học: Hàm lượng enzyme hòa tan trong dung dịch giảm. Vi sinh: vi sinh vật bị tiêu diệt hoặc ức chế. Vi sinh vật nổi lên trên bề mặt . - Phương pháp thực hiện: Dịch enzyme thô thu được sau quá trình ly tâm lắng tách sinh khối và tạp chất rắn sẽ được thêm vào môi trường dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa 80% theo tỉ lệ giữa thể tích môi trường và thể tích chất làm kết tủa là 1:5. Trong quá trình thêm vào, hỗn hợp được khuấy với tốc độ 1000rpm. Quá trình trên nhằm mục đích đưa (NH4)2SO4 bão hòa vào để tăng nhanh hiệu suất quá trình kết tủa tách protein ra khỏi dung dịch enzyme thô. - Các yếu tố ảnh hưởng: Nồng độ dung dịch enzyme ban đầu càng loãng thì enzyme càng khó kết tủa và ngược lại. Lượng muối hòa tan bổ xung càng nhiều thì khả năng kết tủa enzyme càng cao nhưng nếu quá cao thì khả năng kết tủa giảm. - Thiết bị: Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 30 Hình 14 Thiết bị kết tủa Một cách tổng quát, thiết bị kết tủa gồm các bộ phận chủ yếu sau: thùng hình trụ với đáy tròn hoặc nón. Theo đường tâm của thiết bị lắp trục khuấy với cánh khuấy. Trục khuấy xuyên qua nắp và được bít kín bởi hộp đệm phía trên nắp. Truyền chuyển động cho trục khuấy từ động cơ cánh khuấy qua hộp giảm tốc độ để tạo tốc độ thích hợp cho cánh khuấy. Thực hiện nhập liệu qua các cửa phần trên của thiết bị còn tháo sản phẩm qua đường dưới đáy thiết bị. Trên nắp và thân thiết bị, người ta bố trí cửa sửa chửa và cửa quan sát. - Thông số công nghệ: Nhiệt độ 40C Muối: (NH4)2SO4 bão hòa 80% Thời gian 30 phút Tổng lượng protein 35.0 mg Tổng hoạt độ 850 IU Hoạt độ riêng 38 IU/mg Độ tinh sạch 2.5 Hiệu suất thu hồi 48.5% 7.3. Ly tâm lần 2 - Mục đích: Thu nhận kết tủa. - Các biến đổi: Vật lý: Sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng, nhiệt độ của dung dịch. Hóa học: Thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn – lỏng. Hóa lý: Huyền phù tách ra thành 2 pha rắn - lỏng - Các yếu tố ảnh hưởng : Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 31 Sự chênh lệch khối lượng riêng của 2 pha rắn – lỏng: chênh lệch nhiều thì quá trình phân riêng sẽ dễ dàng hơn. Tốc độ quay của roto: Tốc độ quay càng nhanh thì quá trình ly tâm càng thuận lợi. - Thiết bị: Giống ly tâm lần 1. - Thông số kỹ thuật: Tốc độ quay 10000rpm Thời gian 10 phút Nhiệt độ 40C 7.4. Hòa tan kết tủa - Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình thẩm tách. - Các biến đổi: Hóa lý: Enzyme chuyển từ dạng rắn sang dạng lỏng. Hóa học: Nồng độ dung dịch enzyme giảm do mất các chất hòa tan. - Các yếu tố ảnh hưởng: Lượng dung dịch đệm càng nhiều thì khả năng hòa tan càng cao nhưng gây khó khăn trong quá trình lọc gel. Chêng lệch pH của dung dịch đệm và pI của enzyme càng cao thì hòa tan càng tốt - Thiết bị: Dạng thiết dạng hình trụ có cánh khuấy. - Thông số công nghệ: Dung dịch đệm: Citrate-phosphate . pH 6.0 Trong dung dịch thu được, ngoài enzyme còn có các protein cấu trúc, các chất cao phân tử khác nhau như polysaccharid nucleic acid, các chất có phân tử nhỏ như đường monose, các chất lipid, muối khoáng...Để loại chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau. 7.5. Thẩm tách - Mục đích: Hoàn thiện: Loại bỏ phần muối sau quá trình kết tủa còn dư ra khỏi enzyme, tách các tạp chất có kích thước nhỏ. - Các biến đổi: Hóa lý: Huyền phù tách ra thành 2 pha rắn - lỏng, tách các cấu tử hòa tan và các chất có kích thước rất nhỏ cỡ vi sinh vật.. Các đại phân tử bị giữ lại. Vật lý: Nhiệt độ tăng, có sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng của dung dịch. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 32 Hóa học: Thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn – lỏng. - Các yếu tố ảnh hưởng : Kích thước các tạp chất rất nhỏ: Nếu quá nhỏ, lưu lượng qua lỗ thấp, dễ gây bít lỗ màng, giảm hiệu suất quá trình thẩm tách. Nhiệt độ: Các quá trình tinh sạch, thu nhận enzyme đều thực hiện ở nhiệt độ thấp (40C ) nên các chất hòa tan, các chất kích thước nhỏ chuyển động chậm, giảm hiệu suất thẩm tách, chúng tự chui qua lỗ màng. Vì thế tốn thời gian. - Phương pháp thực hiện: Cho dung dịch enzyme vào túi colodion hoặc cellophane (thông thường người ta dùng cellophane tốt hơn), sau đó đặt cả túi vào nước cất. Màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ cho các chất có phân tử nhỏ xuyên và đi qua vào các dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán. Còn lại trong màng là các chất protein có phân tử lớn. Để giảm thời gian thẩm tách, tăng hiệu suất quá trình, người ta thường tạo ái lực trong thiết bị thẩm tách. Hình 15 Cơ chế thẩm tách - Thông số công nghệ: Nhiệt độ 40C Dung dịch Nước cất 7.6. Trao đổi ion - Mục đích: Khai thác: Thu nhận enzyme Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 33 Hoàn thiện: Tách tạp chất khỏi sản phẩm. - Biến đổi: Vật lý: lực hút tĩnh điện giữa các hạt tích điện dương trong cột và các ion âm trong dịchlên men. Hóa học: Nồng độ các chất hòa tan tích điện dương giảm đáng kể - Phương pháp thực hiện:  Nguyên lý của phương pháp: Phương pháp sắc ký trao đổi ion có thể coi là 1 dạng đặc biệt của sắc ký hấp phụ mà trong đó các cấu tử mang điện có khả năng tương tác tĩnh điện 1 cách thuận nghịch với pha tĩnh là các hạt nhựa mang điện trái dấu, còn pha động là các dung dịch điện ly.  Quy trình thực hiện gồm 4 bước: Bước 1: Nhồi hạt nhựa trao đổi ion vào cột . Bước 2: Đưa các mẫu vào cột . Bước 3: Các thành phần của mẫu có thể tích điện dương, âm hay trung hòa về điện, khi đi qua cột chỉ có phần tử mang điện trái dấu mới kết hợp với hạt nhựa, các phần tử khác do không bị giữ lại bởi pha tĩnh sẽ rời khỏi cột, trong đó có enzyme inulinase cần thu nhận. Bước 4: Tái sinh cột. Do enzyme inulinse tích điện âm nên ta dùng thiết bị trao đổi anionit .Các ion âm sẽ bị giữ lại trên cột, ngoài ra còn có các ion âm khác như ion acetate , ion photphate,... Các ion dương và các chất không mang điện trong dung dịch sẽ đi ra khỏi cột. Các ion âm có ái lực khác nhau với pha tĩnh (hạt nhựa) v à pha động (chất rửa giải) nên các cấu tử sẽ phân bố khác nhau giữa pha tĩnh và pha động và được pha động lôi cuốn ra khỏi cột với vận tốc khác nhau. Ta sử dụng dung dịch rửa giải là NaCl để lôi cuốn ion âm ra khỏi cột. - Thiết bị: Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 34 Hình 16 Cơ chế sắc ký trao đổi ion Hình 17 Thiết bị trao đổi ion Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 35 - Thông số công nghệ: Nhựa trao đổi anion DEAE-Sephacel (2.5 x 30 cm) Dung dịch đệm 50 mM tris (pH 8.0) Tốc độ rửa giải khoảng 0.4 ml/phút Tổng lượng protein 4.2 mg Tổng hoạt độ 160 IU Hoạt độ riêng 38 IU/mg Độ tinh sạch 4 Hiệu suất thu hồi 9.1% - Các yếu tố ảnh hưởng: Pha tĩnh: Phụ thuộc vào tính chọn lọc của nhựa trao đổi ion  Tính chọn lọc cao: Các peak thu được tách rời nhau ra .  Tính chọn lọc thấp: Các peak thu được không hoàn toàn tách rời.  Đối với nhựa trao đổi anion: ion F – bị giữ lại ít nhất. Pha động: Phụ thuộc bản chất ion đối (ion thuộc pha động) và nồng độ của nó. Dung dịch đệm:  Đối với các chất lưỡng tính có khả năng tích điện ở pH khác nhau, pH lớn hơn pI thì phân tử tích điện âm và ngược lại.  Do đó cần lựa chọn pH dung dịch đệm thích hợp. 7.7. Sắc ký ái lực - Mục đích: Khai thác: Thu nhận enzyme Hoàn thiện: Tách tạp chất khỏi sản phẩm, thu enzyme với độ tinh sạch cao. - Các biến đổi: Hóa học: Xuất hiện liên kết ái lực giữa inulinase với các hạt ConA-CL Agarose. Tăng nồng độ enzyme trong dung dịch. - Phương pháp thực hiện: Dịch enzyme thu được sau quá trình trao đổi ion được bơm vào thiết bị sắc ký ái lực nhằm thu được enzyme inulinase với độ tinh sạch cao nhất. Những protein không hấp thu trên cột sẽ tách ra ngoài với dung dịch đệm tương tự. Trong khi đó, các protein bị hấp thu trên cột được tách ra bởi quá trình rửa giải từng bậc bằng methyl- -D-mannopyranoside (0–0.5 M) trong dung dịch đệm 25 mM citrate ( pH 6.0 ) - Thiết bị: Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 36 Hình 18 Cơ chế sắc ký ái lực - Thông số công nghê: Sắc ký ái lực: cột có kích thước 2.0 x 2.8 cm với ConA-CL Agarose. Dung dịch đệm: 25 mM citrate (pH 6.0) Dung dịch rửa giải: methyl- -D-mannopyranoside (0–0.5 M) Tổng lượng protein: 0.5 mg Tổng hoạt độ: 85 IU Hoạt độ riêng: 170 IU/mg Độ tinh sạch: 18.0 Hiệu suất thu hồi: 4.8% 8. Sấy - Mục đích: Bảo quản (do sau quá trình sấy phun độ ẩm sản phẩm bé hơn 5%),tạo sản phẩm dạng bột mịn. - Các biến đổi: Vật lý: Có sự giảm về khối lượng do nước bay hơi, nhiệt độ tăng. Hóa lý : Sự bay hơi nước và các chất dễ bay hơi dưới tác động của nhiệt độ cao. Có sự chuyển pha: dung dịch enzyme sau quá trình sấy phun sẽ có dạng bột. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 37 Hoá sinh: Inulinase có thể bị vô hoạt hoặc giảm hoạt tính bởi nhiệt độ nên có thể sẽ làm giảm các phản ứng do enzym xúc tác. Tuy nhiên thời gian lưu trong buồng sấy là rất ngắn nên ảnh hưởng không đáng kể đến hoạt tính enzyme. Sinh học: Tiêu diệt vi sinh vật. - Phương pháp thực hiện: Dịch dextran sau khi ly tâm được bơm vào máy sấy phun trong điều kiện chân không để sấy ở 300C và thu được dextran ở dạng bột. Lượng dextran tạo thành được tính toán theo hàm lượng chất khô. - Thiết bị: Hình 19 Máy sấy phun chân không 2 giai đoạn. Với hệ thống này, độ ẩm bột sản phẩm từ buồng sấy phun được hiệu chỉnh cao hơn 2 – 5% so với giá trị độ ẩm cuối cùng. Phần ẩm còn lại cần tách sẽ được bốc hơi tiếp trong thiết bị sấy tầng sôi. Với hệ thống này giai đoạn 1 là sấy phun bình thường, giai đoạn 2 là sấy tầng sôi. Tuy phải tiêu tốn thêm một phần năng lượng cho sấy tầng sôi nhưng nhờ sấy tầng sôi nên hạt sản phẩm sau quá trình sấy đạt kích thước cần thiết, nghĩa là quá trình sấ y tầng sôi tương đương với quá trình tạo hạt, do đó tiết kiệm chi phí thiết bị so với hệ thống sấy phun 1 giai đoạn và hệ thống sấy thăng hoa. - Thông số công nghệ: Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 38 Nhiệt độ 1500C Thời gian lưu của các hạt trong buồng sấy 5s Độ ẩm sản phẩm 3 – 4% IV. SẢN PHẨM  Sản phẩm dạng bột Hoạt tính riêng 40000 IU/mg Màu sắc Bột màu trắng Mùi Không có mùi lạ pHopt 5.5 topt 55 o C Tổn thất do sấy <5% Samonella Không phát hiện E.coli Không phát hiện Tổng số vi sinh vật hiếu khí <3000 cfu/G V. THÀNH TỰ CÔNG NGHỆ 1. Sản xuất inulinse bằng phương pháp lên men bề mặt sử dụng Response surface methodology ( RSM )  Theo truyền thống, người ta sản xuất inulinase theo phương pháp lên men bề sâu.. Gần đây, có nhiều bài nghiên cứu khoa học sản xuất inulinase theo phương pháp lên men bề mặt. Phương pháp lên men bề mặt (SSF) có những thuận lợi hơn phương pháp lên men bề sâu là: năng suất cao, kĩ thuật đơn giản, ít chi phí đầu tư, năng lượng cần ít, và cần ít nước thu hồi sản phẩm tốt hơn và phù hợp với các nước đang phát triển. SSF là tiềm năng lớn trong sản xuất enzyme và gần đây nó được ứng dụng nhiều trong sản xuất enzyme.  Mô hình tối ưu các thành phần của môi trường là một khía cạnh rất quan trọng trong việc phát triển quá trình SSF. Kĩ thuật mô hình thực nghiệm thống kê là một công cụ hữu ích cho việc lựa chọn thành phần của môi trường lên men, vì nó cung cấp mô hình thống kê giúp ta hiểu được các tương tác giữa các thông số của quá trình ỡ những mức độ khác nhau và có thể tính toán được mức tối ưu cho từng thông số cho mục đích đưa ra, ví dụ như sản xuất enzyme với hiệu suất tối đa. Ứng dụng của kĩ thuật mô hình thực nghiệm thống kê trong việc phát triển quá trình lên men có thể dẫn đến cải thiện hiệu suất thu nhận sản phẩm, giảm sự biến đổi của quá trình, giảm thời gian và giá tổng cộng của quá trình. Response surface methodology( RSM) là một mô hình bao gồm kĩ thuật toán học và thống kê, được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiều biến số và tìm ra điều kiện tối ưu cho một hệ đa Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 39 biến. Ứng dụng thành công của RSM trong nâng cao năng suất sản xuất enzyme bằng việc tối ưu hóa môi trường đã được nghiên cứu. Nói cách khác nghiên cứu xem xét tối ưu hóa môi trường lên men bề mặt để sản xuất inulinase vẫn cón khá mới. Sau đây là nghiên cứu sản xuất inulinase từ giống mới, Kluyveromyces S120. RMS được đưa ra ở đây như là công cụ để tối ưu hóa môi trường lên men bề mặt.  Vi sinh vật sử dụng : Kluyveromyces S120 được phân lập từ đất, được giữ trên, môi trường thạch nghiêng với môi trường tương ứng (g/l): Glucose 20 Chất chiết nấm men 10 Pepton 10 Agar 20.  Lên men bề mặt Môi trường lên men chứa (g/l): Chất chiết nấm men 10 Pepton 20 Inulin 10. 20g cám lúa mì 3.0 mg MgSO4.H2O 9.0 mg FeSO4.6H2O tính trên 100g cơ chất khô được chỉnh 2.5 mg ZnSO4.7H2O 3.5 mg CaCl2 pH 6.0 Hàm ẩm 65% Môi trường được chứa trong bình nón 250ml và được bịt kín bằng bông không thấm nước. Sau đó đem bình nón đi tiệt trùng ở 1210C trong vòng 20 phút. Sau khi tiệt trùng, bình nón được làm nguội, sau đó bổ sung 4% giống vào bình , trộn đều nhưng vẫn đảm bảo được môi trường vẫn vô trùng. Sau đó được ủ trong buồng vói hàm ẩm 80%, nhiệt độ 300C trong vòng 72h. Bằng việc sử dụng mô hình Plackett-Burman và mô hình của Box-Behnken để đánh giá ảnh hưởng của các thành phần môi trường lên quá trình sản xuất inulinase, thành phần của môi trường thay đổi dựa trên mô hình thực nghiệm.  Nghiên cứu các thành phần bổ sung sử dụng mô hình Plackett-Burman Mô hình Plackett-Burman một kĩ thuật hiệu quả để tối ưu hóa thành phần của môi trường, được sử dụng để lựa chọn các nhân tố ảnh hưởng quan trọng đến sản xuất inulinase và những nhân tố nào không quan trọng sẽ được loại ra nhằm thu hẹp các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình và dễ dàng điều khiển các nhân tố còn lại. Cám lúa mì được bán trên thị trường được sử dụng làm cơ chất rắn. Các thành phần bổ sung được điều chỉnh bằng mô hình Plackett-Burman cho 8 biến số ở hai mức độ. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 40  Tối ưu hóa các thành phần bổ sung sử dụng mô hình Box- Behnken Một khi các nhân tố được xác định qua màn hình, mô hình Box-Behnken cho 3 biến số độc lập, mỗi biến số ở 3 mức độ với 3 bản sao ở những điểm trung tâm, được sử dụng để phù hợp với một mô hình đa thức: Trong đó Y - hiệu suất tạo inulinase, 0 - hệ số chặn, 1 2 3, , - hệ số tuyến tính, 12 13 23, , - hệ số tương tác, 11 22 33, , - hệ số bậc hai và X1, X2, X3 - các biến số đã độc lập được mã hóa. Gói SAS được sử dụng cho thiết kế thực nghiệm và phân tích hồi quy các dữ liệu đạt được.  Hoạt tính enzyme Hoạt tính của enzyme được xác định bằng cách xác định hàm lượng đường khử được tạo ra trong quá trình thủy phân sucrose. 0.5 ml dịch chiết enzyme đã pha loãng phù hợp được trộn với dung dịch sucrose ( 2%, w/w ) trong dung dịch đệm acetate 0.1M, pH 4.8. Phản ứng được thực hiện ở 500C trong 10 phút, sau đó đun sôi 10 phút. Xác định lượng đường fructose trong hỗn hợp phản ứng bằng phương pháp DNS. Đường cong hiệu chỉnh được chuẩn bị với dịch fructose đã biết nồng độ và mẫu trắng được thực hiện đồng thời với enzyme và cơ chất. Một đơn vị hoạt tính của inulinase được định nghĩa là lượng enzyme cần để sản xuất ra 1 mol fructose dưới điều kiện đã nêu trên.  Đếm Kluyvermyces Vất chất lên men được trộn đầy dủ với 10 thể tích nước vô trùng. Hỗn hợp được pha loãng đến nồng độ thích hợp trong điều khiện vô trùng. 0.1 ml hỗn hợp đã pha loãng được trải đều trên môi trường chất chiết malt. Sau khi ủ trong 48h ở 300C, số khuẩn lạc CFU/g được đếm theo hệ số pha loãng . Kết quả  Sàng lọc các nhân tố ảnh hưởng quan trọng đến sản xuất inulinase Dựa trên những nghiên cứu gần đây, ảnh hưởng của tổng 8 thành phần khác nhau lên sản xuất inulinase được phân tích trên cơ sở sử dụng mô hình Plackett – Burman ( bảng 5). Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 41 Bảng 5 Các thành phần của môi trường dựa trên mô hình Plackett –Burman Trong mẫu thực nghiệm, từng hàng đại diện cho một thí nghiệm, và từng cột đại diện cho một biến số độc lập. Dấu (+) và (-) đại diện cho hai mức khác nhau ( cao và thấp) của biến số độc lập. Hiệu suất sản xuất inulinase, xác định cho từng thí nghiệm, được trình bày ở bảng 6. Việc phân tích các biến số (ANOVA) cho mô hình thực nghiệm được tính toán, và mức độ quan trọng của từng biến số môi trường lên men được quyết định bởi giá trị t như bảng 7. Kết quả phân tích chỉ ra rằng inulin, dịch bắp và (NH4)2SO4 có ảnh hưởng quan trọng đến sản xuất inulinase. Tất cả các biến số không quan trọng sẽ được loại bỏ và sự kết hợp của ba biến số trên sẽ được phân tích kĩ hơn bằng mô hình Box-Behnken. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 42 Bảng 6 Mô hình thực nghiệm sử dụng phương pháp Plackett – burman Bảng 7 Thực nghiệm được tiến hành lặp để đi đến một sự kết hợp tối ưu của ba nhân tố trên trên mô hình Box-Behnken. Dựa trên kết quả của mô hình thực nghiệm Plackett-Burman, inulin, dịch bắp và (NH4)2SO4 có ảnh hưởng tích cực lên quá trình sản xuất inulinase và nồng Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 43 độ của ba nhân tố trên sẽ được tăng lên trong mô hình Box-Behnken. Bảng 8 đưa ra các mức thay đổi khác nhau. Bảng 8 Thành phần dinh dưỡng bổ sung vào môi trường cơ chất rắn Bảng 9 Mô hình thực nghiệm cho tối ưu hóa các nồng độ thành phần của môi trường Bảng 9 đưa ra mô hình và kết quả thực nghiệm được thực hiện theo mô hình Box- Behnken. Kết quả đạt được được kiểm tra theo ANOVA trên gói SAS và phương trình hồi quy được đưa ra như sau: Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 44 Trong đó Y1 – hiệu suất sản xuất inulinase, X1 – nồng độ inulin, X2 – nồng độ dịch bắp, X3 – nồng độ (NH4)2SO4. ANOVA của mô hình hồi quy cấp 2 diễn tả rằng: phương trình * là một mô hình quan trọng, là bằng chứng từ hệ số Fisher với giá trị xác suất rất thấp [(pmodel > F) = 0.001261](bảng 10). Tính chất phù hợp của mô hình được kiểm tra bằng hệ số tương quan (R2). Trong trường hợp này (R2 = 0.978) chỉ ra rằng chỉ có 2.2% của sự biến đổi toàn bộ không được giải thích bằng mô hình.Giá trị của hệ số xác định điều chỉnh (AdjR2 = 0.9385) cũng cao để tán thành cho mức ý nghĩa cao của mô hình. Cùng thời điểm, giá trị thấp hơn của hệ số biến thiên (CV = 1.68%) chứng tỏ độ chính xác và độ tin cậy tốt hơn của những thí nghiệm được tiến hành. Trong các số hạng của phương trình, X2, X3, X1 2 , X2 2 và X3 2 có mức ý nghĩa với xác suất 99%, X1 có mức ý nghĩa với xác suất 95% (bảng 10). Tương tác giữa X1, X2, X3 ảnh hưởng không đáng kể đến hiệu suất sản suất inulinase. Sự phản hồi phù hợp với mô hình hồi quy được thể hiện trên hình1 và 3. Bảng 10 Phân tích kết quả các biến số thực nghiệm của mô hình Box - Behnken Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 45 Hình 20 Ảnh hưởng của Inulin ( X1) và dịch bắp ( X2) lên quá trình sản xuất inulinase ( Y1) ( khi bổ sung 1.61% (NH4)2SO4 ) Hình 21 Ảnh hưởng của dịch bắp ( X2) và (NH4)2SO4 ( X3 ) lên quá trình sản xuất inulinase ( Y1 ) ( khi bổ sung 12.72% inulin ) Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 46 Hình 22 Ảnh hưởng của inulin ( X1 ) và (NH4)2SO4 ( X3 ) lên quá trình sản xuất inulinase ( Y1 ) ( khi bổ sung 10.76% dịch bắp ) Biểu đồ không gian ba chiều sinh ra cho sự kết hợp từng đôi một của 3 yếu tố trong khi cố định một yếu tố ở mức tối ưu cho quá trình sản xuất inulinase. Biểu đồ nêu bật vai trò của các yếu tố khác nhau và cũng nhấn mạnh vai trò của những ràng buộc vật lý với các phương diện tổng hợp sinh học trong hiệu suất cuối sinh tổng hợp inulinase. Hoạt tính tối đa của inulinase 412.0 U/g cơ chất khô (gds) nhận được từ nồng độ ban đầu của các chất inulin, dịch bắp và (NH4)2SO4 lấn lượt là 12.72%, 10.76%, 1.61%. Hoạt tính inulinase (409.8U/gds) trong môi trường tối ưu từ 3 bản sao (ví dụ 410.2; 409.6; 409.6 U/gds) trùng hợp với giá trị tiên đoán và mô hình được chứng tỏ ngược với lên men bề sâu. Nó đạt được hiệu suất cao nhất trong các tài liệu từ trước đến nay. Nồng độ cuối của môi trường được tối ưu hóa với RSM là 12.72% inulin, 10.76% dịch bắp, 1.61% (NH4)2SO4. Các hợp chất carbon là nguồn carbon của skelelon và năng lượng của tế bào vi sinh vật, trong khi nguồn nitơ cung cấp nguyên tố N với tế bào chất và các cấu trúc khác của tế bào. Inulin không những là nguồn carbon quan trọng mà còn là tác nhân sản xuất inulinase bẳng vi sinh vật Kluyvermyces S120. Tuy nhiên nếu nồng độ inulin cao hơn sẽ gây ức chế quá trình dị hóa, do vậy làm giảm hiệu suất tổng hợp enzyme. Điều này được thể hiện ở hình. Inulin là cơ chất không đắt và có nhiều. Trong công nghiệp nó có thể được thay thế bằng chất Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 47 chiết từ Jerusalem artichoke, rau diếp, thược dược. Dịch bắp cung cấp nguồn nitơ, vitamin và các dưỡng chất khác cho môi trường, là một nguồn nitơ quan trọng trong sản xuất inulinase bởi vi sinh vật Kluyvermyces S120. Dịch bắp là nguồn nitơ tốt nhất trong sản xuất inulinase bẳng giống Actinomycete và Kluyvermyces SP.Y85 theo con đường lên men chìm. Tuy nhiên nồng độ dịch bắp cao sẽ làm giảm khả năng sinh inulinase như trong hình 1 và 2, điều này có thể là do bản chất phức tạp của dịch bắp và một vài thành phần của nó ở nồng độ cao có thể gây độc ức chế sản xuất inulinase. NH4 + nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp inulinase hiệu quả hơn NO3 - được thể hiện trong so sánh việc bổ sung (NH4)2SO4 và NH4 NO3 (bảng 3). Tuy nhiên nếu nồng độ ammonium sẽ kìm hãm sự tổng hợp inulinase, điều này được thể hiện trên hình 2 và 3. Vì vậy, nếu tăng nồng độ inulin, dịch bắp hay (NH4)2SO4 trong môi trường sẽ gây ức chế sinh tổng hợp inulinase dù sự sinh trưởng của tế bào vẫn tiếp tục tăng chậm. Mặt khác nếu giảm nồng độ của các thành phần môi trường thì sự sinh trưởng của tế bào và sinh tổng hợp inulinase sẽ giảm nhanh chóng. Hình 23 Hoạt tính của inulinase ( )và số tế bào sống( )theo thời gian Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 48  Thời gian lên men Thời gian lên men trong môi trường tối ưu được điều chỉnh trong 120h ( hình 4). Sau khoảng 12h, sự sinh trưởng tế bào tăng nhanh đáng kể do sự hình thành sinh khối, trong khi inulinase tạo thành tăng đột ngột sau 12h. Số tế bào sống cực đại là 4.3 109 CFU/gds sau 84h. Sau đó số tế bào giảm có thể do môi trường dinh dưỡng đã cạn kiệt hoặc sự ức chế quá trình dị hóa trong suốt quá trình nuôi cấy kéo dài. Hoạt tính tối đa của inulinase là 409.2U/gds sau 96h. Do sự giảm sự sinh trưởng tế bào sau 84h hoặc giảm inulinase bởi những enzyme tự phân, thời gian chọn để sản xuất inulinase bẳng Kluyvermyces S120 là 96h. Kết luận Sử dụng RSM có thể xác định được môi trường tối ưu để sản xuất inulinase với hiệu suất cao cho Kluyvermyces S120. Thành phần môi trường lên men bề mặt (SSF) là 12.72% inulin, 10.76% dịch bắp, 1.61% (NH4)2SO4 trên cơ chất rắn là cám lúa mì. Ứng dụng môi trường RSM, năng suất cực đại đạt được là 409.2U/gds. Đây là hiệu suất cao nhất từ trước đến nay. 2. Sinh tổng hợp inulinase bằng cách cố định khuẩn ty ( hệ sợi) Aspergillus Niger  Bào tử đính của Aspergillus Niger 20 Osm sản xuất inulinase ngoại bào được cố định trên đá bọt hoặc vật liệu xốp polyurethane và được sử dụng trong quá trình lên men từng mẻ nhiều lần. một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp inulinase bằng cố định khuẩn ty của Aspergillus Niger 20 Osm trên đá bọt được nghiên cứu Lượng inulinase tối đa xảy ra trong 50 ml môi trường chứa 0.5g chất mang ở 300C, pH 6.0, tốc đậ khuấy trộn 200rpm. Quá trình sản xuất này có thể sản xuất enzyme nhiều mẻ, có thể lên men 6 mẻ, mỗi mẻ 24h. Đây là bài báo cáo đầu tiên về sinh tổng hợp inulinase bằng cách cố định bào tử đính A. niger trên vật liệu xốp polyurethan sử dụng bão hòa oxy không thông thường trong canh trường đảm bảo rằng nồng độ oxy hòa tan vẫn liên tục.  Vật liệu và phương pháp Giống và môi trường - Biến thể Aspergillus Niger 20 Osm. - Giống có đặc tính có khả năng sản xuất và hoạt tính inulinase cao trong lên men chìm. - Giống được giữ trên trên môi trường thạch malt nghiêng ở 40C và sinh trưởng trong môi trường cơ bản với (g/l): sucrose 33.3, chất chiết nấm men 19.7, NaNO3 3.65, K2HPO4 2.6, MgSO4.7H2O 0.15. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 49 Chuẩn bị bào tử Aspergillus Niger 20 Osm cho cố định tế bào Aspergillus Niger 20 Osm được sinh trưởng trong môi trường malt. Sau 4 hoặc 5 ngày phát triển ở 300C, bào tử được thu nhận, rửa 2 lần với đệm Mellvain 0.1M đã tiệt trùng, pH 5.0, và lọc qua bông thủy tinh để lọc bỏ cặn. Bào tử sau đó sẽ ở trạng thái lơ lửng và pha loãng trong cùng dung dịch đệm như trên để đạt được 7.8 107 bào tử/ml. Vật liệu cố định Hạt đá bọt (BDH Chemical Ltd, UK),10 – 24 mesh, vật liệu xốp polyurethane đường kính 9cm, dày 0.8cm và đường kính trung bình lỗ xốp là 0.3mm. Thử nghiệm cố định Thử nghiệm Cố định bào tử A. niger được thực hiện trong những bình nón có lắc đảo 300ml, từng bình chứa 0.3 g đá bọt như trên. 5 đĩa quay được dán chặt với vật liệu xốp polyurethane tiệt trùng trong 30 phút trong nồi hấp tiệt trùng ở áp suất 0.075MPa được sử dụng để cố định bào tử. Huyền phù bào tử từ 3 ống nghiêng (20ml và 1.61 củ dung dịch đệm 0.1M Mellvaine, pH 5.0)được đổ vào thiết bị phản ứng chứa vật liệu xốp polyurethane. Huyền phù được ủ trong ở 300C trong 24h. sau thời gian đó các bào tử không được hấp phụ sẽ được tách ra khỏi chất mang, sau đó sẽ được rửa hai lần với nước cất. 1.6L môi trường căn bản được cho vào thiết bị phản ứng. Điều kiện sinh trưởng Bào tử đính của A. niger được cố định trên đá bọt được sinh trưởng trong bình lắc đảo 200 rpm trong 3 đến 6 ngày. Môi trường được thay bằng môi trường tiệt trùng mới sau 24h trong suốt thời kì này. Được cố định trên vật liệu xốp polyurethane, bào tử đính sinh trưởng trong bình lên men thủy tinh 2L ( Biostat B, B. Braun Biotech International GmbH, Germany) chứa đầy 1.6L môi trường cơ bản trong 12 ngày ở 300C (200rpm). Môi trường được thay bằng môi trường tiệt trùng mới sau 48h một lần trong suốt thời kì này. Sản lượng inulinase được xác định sau mỗi 24h. Lưu lượng oxy cung cấp (1 l /phút) và khuấy trộn 200 rpm trong thiết bị phản ứng không cố định tế bào được thực hiện trong 96h ở 300C và có thiết bị chống tạo bọt. pH được giữ ở 6.0 bằng việc thêm NaOH 0.1M. Nồng độ oxy hòa tan của dịch lên men được đo bằng điện cực Ingold (Mettler – Toledo GmbH). Giá trị đọc được là phần trăm của mức đầu tiên cua sự bão hòa. Nồng độ oxy hòa tan trong môi trường được bão hòa oxy không thông thường được điều khiển tự động bằng một dụng cụ nhân tạo mới, có khả năng đo liều lượng của H2O2 và oxy trong môi trường từ 1 – 100%. Hỗn hợp phản ứng chứa 0.1ml canh trường pha loãng thích hợp và 0.5% (w/v) inulin hòa tan trong dịch đệm acetate 0.1M (pH 5.0) và được ủ ở 500C. sau 20 phút ủ sự tăng hàm lượng đường khử được đánh giá bằng phương pháp acid 3,5 – dinitrosalicylic. Sự hấp thu Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 50 được đo ở bước sóng 550 nm. Một đơn vị hoạt tính của inulinase được xác định bằng lượng enzyme để sản xuất 1 mol đường khử/phút dưới điều kiện trên. Hoạt tính xúc tác được đo quang phổ bằng cách quan sát sự giảm hấp thu ánh sáng ở bước sóng 525 nmtrong suốt quá trình phân hủy H2O2 bởi enzyme. Hàm lượng protein trong môi trường và trong dịch lọc canh trường được xác định bằng phương pháp Schacterle và Pollack. Để xác định hàm lượng chất khô, toàn bộ lượng vật chất trong bình phản ứng được qua giấy lọc đã sấy khô đến khối lượng không đổi. Hàm lượng sinh khối khô được xác định từ sự khác nhau giữa bào tử dính cộng chất mang và chỉ có chất mang. Quá trính lên men được thực hiện trong bô ba bình canh trường và phân tích được tiến hành lặp. Dữ liệu đưa ra ở đây trung bình của các phép đo. Sai số chuẩn trung bình cho đánh giá inulinase là 0.23và khoảng giá trị là 0.003 đến 0.36 U/ml. Kết quả và thảo luận Quá trình sản xuất inulinase trong công nghiệp hay trong những bài báo cáo khoa học bao gồm lên men chìm và lên men bề mặt. Giữa những cơ chất, inulin và sucrose được sử dụng như là nguồn carbon thích hợp. Nói chung inulin là cơ chất tốt nhất để sản xuất inulinase. Nhưng nếu vi sinh vật tiết ra cả hoạt tính inulinase và hoạt tính invertase, sucrose được xem là nguồn carbon tốt nhất để sản xuất enzyme. Vì giá thành của inulin cao hơn sucrose nên sucrose được sử dụng cho nghiên cứu tối ưu. Đây là chất thay thế đáng quan tâm vì sucrose có khả năng hòa tan cao, rẻ và là thành phần chính trong mật rỉ, một nguyên liệu hấp dẫn trong lên men với năng suất lớn, trong khi inulin chỉ có sẵn trong một lượng giới hạn và giá thành cao. Thực nghiệm liên quan cố định bào tử A. niger bởi quá trình hấp phụ vậ lý lên đá bọt và vật liệu xốp polyurethane. Trong giai đoạn đầu một vài điều kiện như pH của môi trường, lượng chất mang, thể tích môi trường nhiệt độ và tốc độ khuấy trộn được thay đổi để tối ưu điều kiện để sản xuất inulinase. Trong tất cả các thí nghiệm, môi trường cơ bản được thay mới sau 24h, và len men mẻ tuần tự ba lần. Hệ sợi nấm trong lỗ xốp mọc tràn ra bề mặt chất mang sản xuất inulinase. A. niger lúc đầu được cố định bên trong chất mang, dần dần phát triển thành một lớp dày đặc trên bề mặt chất mang được quan sát rõ trên kính hiển vi điện tử. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 51 Hình 24 Ảnh hưởng của pH ( A); Khối lượng chất mang ( B); Thể tích môi trường (C);Nhiệt độ ( D ); tốc độ khuấy ( E )lên sản xuất inulinase Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 52 pH đầu của môi trường, tối ưu cho sản xuất inulinase bằng bào tử đính của A. niger cố định trên đá bọt là 6.0 ( hình 24A) và cũng tương tự như quá trình sản xuất inulinase bằng bào tử tự do. Hoạt tính inulinase cao nhất bằng việc cố định trên 2.0 g chất mang khi lượng sinh khối lớn nhất tích lũy được. Nếu thêm vào một lượng chất mang thì hoạt tính enzyme sẽ giảm (hình 24B). Hoạt tính enzyme tối đa xảy ra trong mẻ len men thứ hai khi sử dụng 50ml môi trường cơ bản (hình 23C). Hoạt tính inulinase khi cố định bào tử đính tăng khi nhiệt độ đạt 300C, nhưng giảm ở 350C (hình 24D). điều này trùng sản xuất inulinase bằng bào tử tự do, nhiệt độ tối ưu để sản xuất inulinase là cũng là300C. Tốc độ khuấy trộn tối ưu là 200 rpm (hình 24E). sau 6 mẻ lên men được thực hiện chỉ ra rằng hoạt tính của inulinase vẫn tăng cho đến mẻ thứ 5 và sau đó giảm chậm (hình 24F). Để đánh giá tiềm năng sản xuất thật sự của biến thể, bắt đầu khảo sát trong thiết bị phản ứng là cần thiết. Thật sự, trong giai đoạn này thường thì có thể nhận được dấu hiệu hữu ích về phía tính ổn định trong quá trình sản xuất thừa của biến thể và về phía tính thực thi trong việc thiết kế quy mô sản xuất lớn hơn. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 53 Bảng 11 Phương pháp cố định và không cố định tế bào trong sản xuất inulinase từ A.Niger 20 Osm Một thông số quan trọng của quá trình lên men hiếu khí cần đạt được là nồng độ tối ưu của oxy hòa tan (DO). DO giới hạn để xác định khả năng tối ưu của vi sinh vật thay đổi và phụ thuộc vào sản phảm mong muốn cuối cùng. Giới hạn oxy trong canh trường có thể tùy thuộc vào tỷ trọng của bào tử đính, nồng độ nguồn carbon và giá trị pH. Sản xuất inulinase bởi A. niger chịu ảnh hưởng rõ rệt bởi nồng độ DO trong pha lỏng. Bổ sung H2O2 được nêu thêm như là một phương pháp thay thế để tăng nồng độ oxy hòa tan và hiệu suất sản xuất inulinase. Sản xuất inulinase bởi bào tử Aspergillus Niger 20 Osm ở trong trường hợp bào tử tự do hay cố định trên vật liệu xốp polyurethane, được nghiên cứu trong bình phản ứng 2l sử dụng canh trường bão hòa oxy thông thường và không thông thường. Hoạt tính enzyme inulinase của bào tử tự do tăng trong suốt quá trình sục khí tông thường, và đạt giá trị tối đa là 22.1 (U/ml) sau 96h lên men (hình 24A). Ngược lại dưới điều kiện sục khí không thông Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 54 thường hoạt tính enzyme của bào tử tự do tăng chậm, giá trị cực đại là 3.4 (U/ml) trong khoảng 48h lên men. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng sinh khối trong canh trường bão hòa oxy với H2O2 ít hơn so với canh trường sục oxy thông thường (hình 24 B). Điều này có thể gây ra bởi ức chế oxy tác động mạnh tới kìm hãm sự phát triển của bào tử tự do và sản xuất enzyme. Trong suốt quá trình sục khí thông thường, sự giảm mạnh nồng độ oxy trong canh trường (từ 100% đến 70% và 0% sau 24h và 48h) được quan sát, trong khi canh trường sục khí không thông thường không gây ra sự thay đổi nồng độ oxy hòa tan (60 2%). Sự tang hoạt tính enzyme không phải lúc nào cũng liên quan với hàm lượng protein cao trong canh trường lên men. Ví thế chúng tôi suy đoán rằng sự tăng hoạt tính enzyme bởi sự thay đổi trong chính enzyme. Một khả năng khác là khả năng tận dụng protein trong môi trường của Aspergillus Niger 20 Osm. Sau 96h, lượng đường khử cao hơn trong canh trường bão hòa oxy với H2O2 so với canh trường sục khí thông thường. Giảm hiệu ứng kìm hãm của H2O2 lên sự sinh trưởng của bào tử tự do và sản xuất inulinase trong anh trường bão hòa oxy, bào tử của Aspergillus Niger 20 Osm được cố định trong vật liêu xốp polyurethane. Để thực hiện mục đích này, thiết bị lên men được trang bị 5 đĩa gắn chặt với vật liêu xốp polyurethan. Kết quả của 6 mẻ lên men được trình bày trong hình 24C. Kết quả tục nghiệm chỉ ra rằng năng suất tạo inulinase tăng trong cả 6 mẻ trong điều kiện sử dụng bào tử cố định bão hòa oxy với H2O2. Cố định trên vật liêu xốp polyurethan cho kết quả tốt do có sự bền cơ của chất mang . Sự tăng hoạt tính xúc tác sau mẻ thứ ba và sự tích lũy đáng kể khối lượng khô (13g/l) chứng tỏ rằng bào tử cố định có thể chịu được ức chế oxy. Khống có thay đổi đáng kể hàm lượng proteintrong môi trường. Có thể kết luận rằng bào tử cố định A. niger có thể sản xuất inulinase trong thời gian ngắn khoảng 48h và xa hơn nữa có thể thời gian rút ngắn xuống chỉ còn 24h. Hoạt tính của inulinase tăng trong mẻ thứ 5 và 6 đề xuất ra rằng quá trình lên men có thể liên tục trong hơn 6 mẻ (hình 24 C ). Trong thiết bị lên men từng mẻ sử dụng bào tử cố định trong điều kiện sục khí bình thường, hoạt tính inulinase tăng đến me thứ ba 7.5 U/ml. Tuy nhiên canh trường này sẽ thể không kéo dài vì sự tích lũy của bào tử cao 20.0 (g/l) và xảy ra sự giải phóng các bào tử tự do vào môi trường. Kết quả nghiên cứu được so sánh với các nghiên cứu trước đây. Hoạt tính của inulinase sản xuất bởi bào tử cố định và không cố định của Aspergillus Niger 20 Osm nằm trong khoảng giá trị của bào tử tự do của A.niger nhưng cao hơn so với tổng hợp enzyme từ Penicillium purpurogenum và Fusarium oxysporum. Dựa vào bảng 2 hệ thống của chúng tôi đạt được sự giảm thời gian sản xuất đáng kể và hoạt tính inulinase cao và do đó năng suất sản xuất inulinase sẽ cao. Hơn nữa, môi trường sản xuất inulinase mà chúng tôi đưa ra thành phân khá đơn giản so với các môi trường trước đây. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 55 Bảng 12 So sánh hoạt tính inulinase đạt được bởi các điều kiện khác nhau Kết luận: Trong giới hạn thực nghiệm của nghiên cứu này, chúng ta có thể sản xuất inulinase liên tục. Bào tử được cố định A. niger sử dụng canh trường bão hòa oxy không thông thường sản xuất ra lượng inulinase lớn và từ đó có thể thiết lập bước đậu trong quá trình tổng hợp enzyme liên tục . Sự cải thiện xa hơn nữa quá trình có thể đạt được bằng việc tối ưu hóa nồng độ oxy. Cấn nhấn mạnh rằng bão hòa oxy không thông thường cho canh trường được sử dụng lần đầu tiên cho sản xuất inulinase bằng việc cố định bào tử A. niger. Quá trình lên men chống được sự nhiễm vi sinh vật lạ do có sự hiện diện của H2O2. Phương pháp canh trường bão hòa oxy cho phép tiến dần đến một sự cân bằng chính xác về lượng oxy tiêu thụ và hứa hẹn sẽ có ứng dụng rộng đặc biệt là trong trường hợp vi sinh vật nhạy cảm trượt thể hiện hoạt tính xúc tác. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 56 V. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bùi Ái, Công nghệ lên men ứng dụng trong công nghệ thực phẩm. Nhà xuất bản đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh 2. Lê Ngọc Tú ( chủ biên) - Lê Văn Chứ - Đặng Thị Thư – Phạm Quốc Thăng-Nguyễn thị Kim Thịnh – Bùi Đức Hợi – Lưu Duẩn – Lê Doãn Diên. Hóa sinh côngnghiệp.Nhà xuất bản khoa học và kĩ thuật Hà Nội – 2002. 3. R.S. Singh *, Balwinder Singh Sooch, Munish Puri, Optimization of medium and process parameters for the production of inulinase from a newly isolated Kluyveromyces marxianus YS-1( From Carbohydrate and Protein Biotechnology Laboratory, Department of Biotechnology, Punjabi University, Patiala 147 002, India), Received 6 July 2006; received in revised form 31 August 2006; accepted 7 September 2006 Available online 27 October 2006 4. R.S. Singh *, Rajesh Dhaliwal, Munish Puri, Production of inulinase from Kluyveromyces marxianus YS-1using root extract of Asparagus racemosus, ( From Production of inulinase from Kluyveromyces marxianus YS-1using root extract of Asparagus racemosus, Punjabi University, Patiala 147002, Punjab, India), Received 17 December 2005; received in revised form 24 February 2006; accepted 9 March 2006. 5. Chen Xiong, Wang Jinhua, Li Dongsheng, Optimization of solid-state medium for the production of inulinase byKluyveromyces S120 using response surface methodology ( From College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology, Wuhan 430068, PR China), Received 4 February 2006; received in revised form 31 October 2006; accepted 2 December 2006. 6. Andrelina M.P. Santos1* and Francisco Maugeri, Synthesis of Fructooligosaccharides from Sucrose Using Inulinase from Kluyveromyces marxianus, ( From Laboratory Devices and Nanostructures (LDN), UFPE, C.P. 7800, CEP 50711-970, Recife, PE, Brazil; Department of Food Engineering (FEA), UNICAMP, CEP 13081-970, Campinas, SP, Brazil). Received: December 19, 2005; Accepted: September 25, 2006 7. Prabhjot Kaur Gill, Rajesh Kumari Manhas, Prabhjeet Singh, Purification and properties of a heat-stable exoinulinase isoform from Aspergillus fumigatus ( From Department of Biotechnology, Guru Nanak Dev University, Amritsar 143 005, Punjab, India; Department of Microbiology, Guru Nanak Dev University, Amritsar 143 005, Punjab, India), Received 20 January 2005; received in revised form 22 April 2005; accepted 24 April 2005; Available online 16 June 2005. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 57 8. Arun Dev Sharma, Prabhjot Kaur Gill, Purification and characterization of heat- stable exo-inulinase from Streptomyces sp (From Department of Biotechnology, Lyallpur Khalsa College, Jallandhar 144001, Punjab, India; Department of Biotechnology, Lovely Institute of Higher Studies, Phagwara (Chehru), Punjab, India), Received 13 October 2005; accepted 10 April 2006; Available online 29 April 2006. 9. Emanuele Ricca , Vincenza Calabro , Stefano Curcio, Gabriele Iorio, Fructose production by chicory inulin enzymatic hydrolysis:A kinetic study and reaction mechanism ( From Department of Engineering Modelling, University of Calabria, I-87030 Arcavacata di Rende (CS), Italy). 10. Prem P. Sehgal and Aubrey W.Naylor, Purication and properties of urease derived from hydrated seeds of jack bean, Canavalia ensiformis (L), Plant Physiology. 4, 567 – 572, Horsham, 1966. Các trang web: 1. 2. 3. 4.