Đề tài Thử nghiệm và so sánh các phương pháp đo hoạt tính kháng vi sinh vật của vi khuẩn lên men lactic để chọn chủng tiềm năng probiotic

Chöông 1: Môû Ñaàu Ñaët vaán ñeà Hieän nay coâng ngheä sinh hoïc laø moät lónh vöïc ñang phaùt trieån vaø coù nhieàu tieàm naêng lôùn. Vieät Nam cuõng ñaõ töøng böôùc taïo ñieàu kieän ñeå phaùt trieån coâng ngheä sinh hoïc, ñaëc bieät laø nhöõng öùng duïng trong noâng nghieäp vaø caû trong coâng nghieäp. Probiotic moät thaønh quaû khoa hoïc, moät thaønh quaû cuûa coâng ngheä sinh hoïc. Noù ñang ñöôïc öùng duïng roäng raõi vaøo ñôøi soáng con ngöôøi bôûi ví tính hôïp lyù vaø hieäu quaû maø noù theå hieän. Hieäu quaû taùc duïng cuûa probiotic khoâng chæ ñôn thuaàn laø laøm thöùc aên ngon hôn maø coù raát nhieàu taùc duïng, nhö: tieâu hoaù thöùc aên vaø laøm bôùt söï roái loaïn tieâu hoaù; ñaåy maïnh söï toång hôïp vitamin B vaø moät soá enzyme tieâu hoaù; caûi thieän söï dung naïp lactose; caûi thieän chöùc naêng mieãn dòch; ngaên chaën nhöõng choã loeùt trong heä thoáng tieâu hoaù; ngaên chaên chöùng vieâm; giaûm cholesterol; giaûm tyû leä cheát non; laøm giaûm soá löôïng vi khuaån gaây haïi; taêng troïng nhanh… Treân quan ñieåm veà an toaøn sinh hoïc, an toaøn thieát thöïc thì probiotic ñang chieám theá thöôïng phong so vôùi moät soá phöông caùch khaùc. Vì tính hieäu quaû cuûa probiotic (tính trò beänh) laø söï ñieàu hoaø töï nhieân khoâng laøm toàn dö khaùng sinh, toàn dö taùc haïi trong sinh vaät chuû. Maø vôùi söï khaét khe cuûa con ngöôøi thì ñieàu naøy laø soá moät. Nhö ñaõ bieát tröôùc ñaây vaø caû hieän nay nhieàu noâng daân söû duïng chaát khaùng sinh trong chaên nuoâi nhö laø bieän phaùp toái öu nhaát bôûi nhöõng lôïi ích maø noù mang laïi nhö: Taêng naêng suaát sinh tröôûng vaø sinh saûn ôû gia suùc, gia caàm Taêng hieäu quaû söû duïng thöùc aên, laøm cho vaät nuoâi thích öùng nhanh choùng vôùi söï thay ñoåi baát thöôøng veà cô caáu vaø chuûng loaïi nguyeân lieäu trong khaåu phaàn aên Naâng cao chaát löôïng saûn phaåm (giaûm tyû leä thòt môõ, taêng tyû leä thòt naïc, laøm cho thòt trôû neân meàm hôn vaø khoâng nhieãm maàm beänh). Phoøng caùc beänh maõn tính vaø ngaên chaën xaåy ra nhöõng dòch beänh do vi truøng. Taêng hieäu quaû kinh teá trong chaên nuoâi. Tuy nhieân, theá giôùi ñaõ nhanh choùng nhaän ra nhöõng taùc ñoäng xaáu do vieäc laøm naøy mang laïi. Söû duïng khaùng sinh lieàu thaáp trong chaên nuoâi (söû duïng khoâng ñuùng caùch trong ñieàu trò, phoøng beänh vaø duøng trong thöùc aên chaên nuoâi nhö chaát kích thích sinh tröôûng) ñaõ daãn ñeán moät haäu quaû raát nghieâm troïng laø laøm taêng hieän töôïng khaùng khaùng sinh cuûa caùc loaøi vi khuaån gaây beänh treân ngöôøi vaø vaät nuoâi. Coù yù kieán cho raèng, vieäc söû duïng khaùng sinh lieàu thaáp trong chaên nuoâi ñaõ bieán vaät nuoâi thaønh nôi ñeå moät soá loaøi vi khuaån “ hoïc” caùch voâ hieäu hoaù taùc duïng cuûa caùc loaïi  khaùng sinh. Haäu quaû cuûa söï khaùng khaùng sinh ôû vi khuaån veà kinh teá raát lôùn. Tuy nhieân, nhöõng thieät haïi veà kinh teá khoâng phaûi laø chính yeáu maø vaán ñeà ñaùng lo ngaïi laø khoâng chæ vaät nuoâi maø ngay caû loaøi ngöôøi ñang ñöùng tröôùc hieåm hoaï xaåy ra caùc thaûm dòch do nhöõng loaøi vi khuaån khaùng thuoác gaây ra maø khoâng theå kieåm soaùt ñöôïc. Nhö vaäy nghieân cöùu phaùt trieån vaø öùng duïng probiotic vaøo cuoäc soáng laø moät coâng vieäc caàn ñöôïc quan taâm vaø ñaàu tö nhieàu hôn nöõa. Coù nhö vaäy môùi tieáp tuïc hoaøn thieän probiotic ñem laïi hieäu quaû cao hôn, chaát luôïng cuoäc soáng ngaøy ñöôïc cao hôn, an toaøn hôn ñaùp öùng nhu caàøu ngaøy caøng cao vaø khaét khe cuûa chuùng ta. Coù theå noùi ñaây laø söï taùc ñoäng thaân höõu cuûa con ngöôøi vaøo töï nhieân neân ñaõ môû ra moät chieán löôïc phaùt trieån beàn vöõng vaø an toaøn. Khoa hoïc coâng ngheä luoân phaùt trieån nhaèm ñeå ñaùp öùng laïi nhu caàu ngaøy caøng cao cuûa con ngöôøi. Treân phöông trình taêng tieán naøy, con ngöôøi ñoøi hoûi khaét khe hôn veà chaát löôïng cuûa moïi loaïi saûn phaåm ñaëc bieät laø söï an toaøn veà söùc khoeû cuûa chính baûn thaân hoï. Maø chính nhöõng nhu caàu naøy laø kích thích toá tröïc tieáp thuùc ñaåy khoa hoïc phaùt trieån. “ Probiotic” laø moät phaàn cuûa söï phaùt trieån aáy. Ñeå coù theå coù moät cheá phaåm probiotic coù ñaày ñuû nhöõng hoaït tính caàn thieát, khaâu choïn loïc chuûng vi khuaån ñeå laøm probiotic laø cöïc kì quan troïng. Bôûi vì ngay taïi khaâu naøy seõ quyeát ñònh vai troø vaø taùc duïng cuûa cheá phaåm leân ñoái töôïng caàn quan taâm. Tuy nhieân, trong phaïm vi nhoû heïp cuûa nghieân cöùu naøy, toâi chæ thöïc hieän ñeà taøi ôû böôùc kieåm tra hoaït tính khaùng vi sinh vaät vì thôøi gian thöïc hieän ñeà taøi chæ trong 12 tuaàn khoâng cho pheùp toâi thöïc hieäân hoaøn chænh taát caû caùc tieâu chí tuyeån choïn Probiotic. Chính vì theáø toâi ñaõ choïn ñeà taøi “THÖÛ NGHIEÄM VAØ SO SAÙNH CAÙC PHÖÔNG PHAÙP ÑO HOAÏT TÍNH KHAÙNG VI SINH VAÄT CUÛA VI KHUAÅN LEÂN MEN LACTIC ÑEÅ CHOÏN CHUÛNG TIEÀM NAÊNG PROBIOTIC”. Muïc tieâu nghieân cöùu Thöû nghieäm vaø so saùnh caùc phöông phaùp ño hoaït tính khaùng vi sinh vaät cuûa vi khuaån leân men lactic. Choïn loïc vi khuaån leân men lactic coù hoaït tính probiotic. Ñoái töôïng nghieân cöùu Vì thời gian haïn heïp, ñeà taøi chæ taäp trung ôû những ñoái töôïng sau : Vi khuaån leân men lactic coù nguoàn goác töø thöïc phaåm leân men ( caø muoái, döa muoái, nem, söõa leân men) vaø coù nguoàn goác töø caùc cheá phaåm döôïc. Vi sinh vaät chæ thò Escherichia coli. Phöông phaùp nghieân cöùu Phöông phaùp luaän Tröôùc khi baét tay vaøo thöïc hieän ñeà taøi naøy, toâi ñaõ tham khaûo khaù nhieàu caùc nghieân cöùu töø tröôùc tôùi nay veà probiotic cuõng nhö caùc phöông phaùp tuyeån choïn noù. Nhaän thaáy coù khaù nhieàu phöông phaùp ñöôïc söû duïng ñeå thöïc hieän vieäc choïn loïc naøy, toâi ñaõ xem xeùt vaø choïn ra nhöõng phöông phaùp ñieån hình nhaát cho ñeà taøi cuûa mình. Toâi xin ñeà xuaát sô ñoà tieán haønh nghieân cöùu nhö sau: Toång hôïp bieân taäp taøi lieäu Phaân tích caùc nghieân cöùu lieân quan Tieán haønh thöû nghieäm caùc phöông phaùp Trao ñoåi yù kieán vôùi giaùo vieân höôùng daãn Phaân tích öu ñieåm – khuyeát ñieåm cuûa caùc phöông phaùp Choïn phöông phaùp toái öu, tieán haønh choïn loïc probiotic Ñöa ra keát quaû nghieân cöùu Hình 1.1: Sô ñoà nghieân cöùu Phöông phaùp xöû lyù soá lieäu Söû duïng phaàn meàm Excel veõ ñoà thò bieåu dieãn. Söû duïng phaàn meàm Statgraphics xöû lyù soá lieäu thoâ, tính giaù trò trung bình, ñoä leäch chuaån, veø ñoà thò töông quan. YÙ nghóa khoa hoïc vaø thöïc tieãn Tìm hieåu veà caùc phöông phaùp ñaùnh giaù khaû naêng khaùng vi sinh vaät chæ thò cuûa caùc vi khuaån leân men lactic. Taïo tieàn ñeà cho caùc nghieân cöùu lieân quan sau naøy taïi phoøng thí nghieäm. Goùp phaàn choïn loïc ñöôïc chuûng vi khuaån leân men lactic coù hoaït tính probiotic. Chöông 2: Toång Quan Taøi Lieäu Toång quan veà Probiotics Giôùi thieäu sô löôïc veà probiotic Giôùi thieäu chung Vieäc söû duïng caùc vi khuaån lactic nhö thöùc aên boå sung ñaõ xuaát hieän töø laâu khi con ngöôøi bieát ñeán söõa leân men. Vieät nghieân cöùu ñöôïc baét ñaàu töø Metchnikoff laøm vieäc ôû vieän Pasteur Paris. OÂng ta cho raèng vi sinh vaät trong ruoät coù aûnh höôûng xaáu tôùi söùc khoûe vaät nuoâi vaø nhöõng aûnh höôûng xaáu naøy coù theå ñöôïc caûi thieän bôûi vieäc söû duïn söõa chua. OÂng ñaõ trích daãn caùc quan saùt veà noâng daân Bungari söû duïng soá löôïng lôùn söõa chua vaø coù tuoåi thoï raát cao. OÂng phaân laäp ñöôïc heä sinh vaät töø söõa chua oâng goïi laø “Bulgarian bacillus” vaø söû duïng chuùng trong caùc thöû nghieäm. Nhöõng sinh vaät naøy ñöôïc xaùc ñònh vaø ñöôïc bieát ñeán laø Lactobacillus bulgaricus vaø ngaøy naøy ñöôïc goïi laø L. delbrueckii subsp bulgaricus laø moät trong soá sinh vaät ñöôïc söûduïng ñeå leân men söõa vaø saûn xuaát yoghurt. Sau khi Metchnikoff maát vaøo naêm 1916, hoaït ñoäng nghieân cöùu naøy chuyeån veà USA. Ñöôïc bieát ôû thôøi ñieåm ñoù ngöôøi ta ñaõ ñeà xuaát vieäc söû duïng caùc L. acidophilus vaø nhieàu thöû nghieäm ñaõ ñöôïc thöïc hieän vôùi sinh vaät naøy. [34] Thuaät ngöõ probiotic voán coù nhieàu ñònh nghóa khaùc nhau, noù ñöôïc söû duïng laàn ñaàu tieân naêm 1965 (Lilly & Stillwell ) ñeå moâ taû moät chaát ñöôïc taïo bôûi moät protozoan ñeå kích thích söï taêng tröôûng cuûa moät sinh vaät khaùc. Ñeán naêm 1974, Parker ñaõ söû duïng ñeå chæ caùc chaát boå sung thöùc aên ñoäng vaät: laø caùc sinh vaät vaø chaát coù taùc ñoäng tích cöïc leân ñoäng vaät baèng caùch caân baèng vi sinh vaät ruoät. Fuller (1989) ñaõ ñöa ra ñònh nghóa raát gaàn vôùi hieän nay laø “ moät boå sung vi sinh vaät soáng qua thöùc aên coù taùc ñoäng tích cöïc leân kyù chuû baèng caùch caûi thieän caân baèng vi sinh vaät ñöôøng ruoät”. [33] Baûng 2.1: Moät soá saûn phaåm söõa leân men coù chöùa ñöïng caùc vi khuaån probiotic (T. Mattila-Sandholm, M. Saarela, Probiotic functional foods) Daïng saûn phaåm Teân saûn phaåm Coâng ty Vi Khuaån probiotic boå sung (107-108 LAB/ml) Nôi saûn xuaát Yoghurt LC1 Nestle L. johnsonii LC-1 France, Belgium, Spain, Switzerland, Portugal, Italy, Germany, UK Yoghurt Gefilus Valio L. rhamnosus GG Finland Yoghurt Vifit Mona L. rhamnosus GG Netherlands, Ireland Yoghurt Vifit Sudmilch L. rhamnosus GG Germany Yoghurt drink Yo-Plus Waterford Foods L. acidophilus Ireland Yoghurt Bio-Pot Onken Biogarde cultures Europe Yoghurt LA7 Bauer L. acidophilus Germany Fermented milk drink Yakult Yakult L. casei Shirota strain Nertherlands, UK, Germany Cultures yoghurt-style product Gaio MD-Foods E. faecium Denmark Yoghurt SNO Dairygold L. acidophilus Ireland Yoghurt Actimel Cholesterol Control Danone L. acidophilus Belgium Fermented milk drink Actimel Danone L. casei Europe Yoghurt Yoplait Waterford-Foods L. acidophilus Ireland Fermented milk drink Bra-Mjolk Arla Bifidus, L. reuterii, L. acidophilus Sweden Fermented milk drink Fyos Nutricia L. casei Netherlands Yoghurt Symbalance Tonilait L. reuterii, L. casei, L. acidophilus Switzerland Yoghurt Shape St Ivel L. acidophilus Ireland, UK Hieäu quaû söû duïng probiotic Ñaõ coù raát nhieàu cheá phaåm probiotic daønh cho ngöôøi hay cho vaät nuoâi ñöôïc ñaêng kí baûo hoä saùng cheá. Haàu heát caùc saûn phaåm naøy chöùa Lactobacillus spp. hoaëc Streptococcus spp., moät soá chöùa Bifidobacteria spp., Saccharomyces boulardii, hay Bacillus subtilis. AÛnh höôûng cuûa caùc cheá phaåm probiotic coù theå laø tröïc tieáp hoaëc giaùn tieáp thoâng qua söï ñieàu chænh heä vi sinh vaät ñöôøng ruoät. Nhöõng cheá phaåm naøy coù nhöõng hieäu quaû söû duïng ñöôïc bieát tôùi nhö sau: [2], [3], [5], [25], [32], [33] Coù khaû naêng khaùng ung thö vaø choáng caùc yeáu toá ñoät bieán Kìm haõm vi sinh vaät gaây beänh ñöôøng tieâu hoùa Caûi thieän vieäc söû duïng lactose ôû nhöõng ngöôøi khoâng dung naïp lactose Laøm giaûm Cholesterol trong huyeát thanh Kích thích heä thoáng mieãn dòch Giaûm nhieãm truøng ñöôøng nieäu Taêng troïng (5%) ôû gia caàm Giaûm beänh nhieãm truøng ôû gia caàm Giaûm tieâu chaûy ôû doäng vaät non Giaûm taùc duïng phuï cuûa chaát khaùng sinh Hieäu quaû laâm saøng cuûa moät vaøi chuûng probiotic ñöôïc trình baøy trong Baûng döôùi ñaây: Baûng 2.2: Taùc duïng laâm saøng cuûa moät soá chuûng probiotic [8], [15] Chuûng Taùc duïng laâm saøng treân ngöôøi Lactibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) Giaûm hoaït tính enzyme phaân, giaûm tieâu chaûy do khaùng sinh ôû treû em, ñieàu trò vaø döï phoøng rotavirus vaø tieâu chaûy caáp ôû treû em, ñieàu trò tieâu chaûy taùi phaùt do Clostridium difficile, kích thích mieãn dòch, giaûm nheï trieäu chöùng vieâm da khoâng ñieån hình ôû treû em Lactobacillus johnsonii (acidophilus) LJ-1 (La1) Caân baèng heä vi sinh vaät ñöôøng ruoät, taêng cöôøng mieãn dòch, hoã trôï ñieàu trò Helicobacter pylori Bifidobacterium lactis Bb-12 Döï phoøng tieâu chaûy du lòch, ñieàu trò tieâu chaûy do virus, keå caû rotavirus, caân baèng heä vi sinh vaät ñöôøng ruoät, caûi thieän tình traïng taùo boùn, kích thích heä mieãn dòch, giaûm nheï trieäu chöùng vieâm da khoâng ñieån hình ôû treû em Lactobacillus reuteri (BioGaia Biologics) Ruùt ngaén thôøi gian bò tieâu chaûy do rotavirus ôû treû em, ñieàu trò tieâu chaûy caáp ôû treû em, an toaøn vaø dung naïp toát ôû beänh nhaân tröôûng thaønh HIV döông tính Lactobacillus casei Shirota Caân baèng heä vi sinh vaät ñöôøng ruoät, giaûm hoaït tính enzyme phaân, coù taùc ñoäng tích cöïc ñoái vôùi ung thö maët baøng quang vaø ung thö coå töû cung, khoâng aûnh höôûng tôùi heä mieãn dòch cuûa ngöôøi khoûe maïnh Lactobacillus plantarum DSM9843 (299v) Caân baèng heä bi sinh vaät ñöôøng ruoät, taêng haøm löôïng acid beùo maïch ngaén trong phaân Saccharomyces boulardii Döï phoøng tieâu chaûy do khaùng sinh, ñieàu trò vieâm ruoät keát do Clostridium difficile, döï phoøng tieâu chaûy ôû beänh nhaân söû duïng dinh döôõng qua oáng Chuûng trong söõa chua (Streptococcus thermophilus hay L. delbrueckii subsp bulgaricus Khoâng coù taùc duïng treân tieâu chaûy do rotavirus, khoâng coù hieäu öùng taêng cöôøng mieãn dòch khi bò tieâu chaûy do rotavirus, khoâng coù taùc duïng leân hoaït tính enzyme phaân Vaøo cuoái naêm nhöõng naêm 1940 coù hai nghieân cöùu phaùt trieån veà heä vi sinh vaät ñöôøng ruoät naøy. Đaàu tieân, thaáy raèng thuoác khaùng sinh boå sung trong thöùc aên ñaõ thuùc ñaåy taêng tröôûng cuûa vaät nuoâi. Mong muoán khaùm phaù cô cheá naøy ñaõ aûnh höôûng tôùi vieäc taêng cöôøng nghieân cöùu veà thaønh phaàn cuûa heä vi sinh vaät ñöôøng ruoät naøy vaø caùch thöùc maø noù taùc ñoäng leân vaät chuû. Thöù hai, caøng ngaøy caøng coù nhieàu vaät nuoâi bò beänh, cung caáp cho nhöõng thí nghieäm ñeå khaùm phaù heä sv trong ñöôøng ruoät bôûi nhöõng vaät chuû coù saün. Vaø cuoái cuøng cho thaáy raèng L. acidophilus khoâng laø vi khuaån lactobacillus duy nhaát coù trong ruoät non maø coù nhieàu sinh vaät khaùc caàn ñöôïc nghieân cöùu ñeå söû duïng laøm probiotics. Nhöõng nghieân cöùu tieáp sau ñoù cho thaáy coù khoaûng 1014 vi sinh vaät thuoäc khoaûng 400 loaøi khaùc nhau toàn taïi ôû trong ruoät (Moore & Holdemann 1974), chính vì vaäy vieäc nghieân cöùu veà nhöõng sinh vaät coù theå söû duïng laøm probiotic ngaøy caøng ñöôïc môû roäng. [30] Sau nhieàu nghieân cöùu, ngöôøi ta ñaõ toång keát laïi ñöôïc raát nhieàu sinh vaät coù theå söû duïng laøm probiotic. Ñieàu naøy seõ ñöôïc trình baøy ôû muïc tieáp theo. Caùc thaønh phaàn cuûa Probiotics Baûng 2.3: Nhöõng vi sinh vaät ñöôïc xem nhö laø probiotic (Holzapfel et al. 2001) [5] Lactobacillus Bifidobacterium Other lactic acid Bacteria Non-lactic acid bacteria L. acidophilus L. amylovorus L. casei L. cripatus L. delbrueckii subsp.Bulgaricus L. gallinarum L. gasseri L. johnsonii L. paracasei L. plantarum L. reuteri L. rhamnosus B. adolescentis B. animalis B. bifidum B. breve B. infantis B. lactis B. Longum Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Lactococcus lactis Leuconostoc mesenteroides Pediococcus acidolactici Streptococcus thermophilus Sporolactobacillus inulinus Bacillus cereus var. Toyoi Escherichia coli Nissle 1917 Propionibacterium freudenreichii Saccharomyces cerevisiae Saccheromyces boulardii Tieâu chí choïn loïc chuûng probiotic [2], [3], [33], [34] Caùc sinh vaät ñöôïc löïa choïn laøm probiotic phaûi ñaùp öùng ñöôïc caùc tieâu chuaån nhö: Tieâu chuaån veà an toaøn Tieâu chuaån veà ñaëc ñieåm vaø chöùc naêng Ñaõ coù nhieàu nghieân cöùu, nhieàu thoâng tin veà nhöõng tieâu chuaån daønh cho probiotic, ta coù theå toång keát laïi nhö sau: Khía caïnh an toaøn cuûa probiotic bao goàm nhöõng ñieåm cuï theå sau: Coù ñònh danh chính xaùc Nhöõng chuûng söû duïng cho ngöôøi toát nhaát laø coù nguoàn goác töø ngöôøi Ñöôïc phaân laäp töø ñöôøng tieâu hoùa cuûa ngöôøi khoûe maïnh Ñöôïc chöùng minh laø khoâng coù khaû naêng gaây beänh Khoâng lieân quan tôùi beänh taät Khoâng gaây khöû lieân hôïp muoái maät Ñaëc ñieåm di truyeàn oån ñònh Khoâng mang caùc gen ñeà khaùng khaùng sinh coù theå truyeàn ñöôïc Tính an toaøn cuûa caùc chuûng probiotic laø ñieàu ñöôïc quan taâm haøng ñaàu. Coù moät soá phöông thöùc giuùp tieán haønh ñaùnh giaù tính an toaøn cuûa probiotic nhö: nghieân cöùu treân caùc ñaëc tính cuûa chuûng probiotic, nghieân cöùu veà döôïc ñoäng hoïc cuûa chuûng probiotic, nghieân cöùu caùc taùc ñoäng qua laïi giöõa probiotic vaø vật chuû. Caùc probiotic thöôøng thuoäc nhoùm vi sinh vaät GRAS (Generally Regarded As Safe) Baûng 2.4: Vi sinh vaät probiotics vaø tính an toaøn cuûa chuùng [2], [15] Vi sinh vaät Khaû naêng laây nhieãm Lactobacillus Khoâng gaây beänh, ñoâi khi gaây nhieãm truøng cô hoäi ôû caùc beänh nhaân suy giaûm mieãn dòch (AIDS) Lactococcus Khoâng gaây beänh Streptococcus Gaây beänh cô hoäi, coù S. thermophilus ñöôïc söû duïng trong caùc saûn phaåm söõa Enterococcus Gaây beänh cô hoäi, moät vaøi chuûng coù khaû naêng khaùng khaùng sinh Bacillus Chæ coù Bacillus subtilis ñöôïc söû duïng laøm probiotics Bifidobacterium Phaàn lôùn khoâng gaây beänh, moät soá gaây nhieãm truøng ôû ngöôøi Propionobacterium Coù tieàm naêng trong vieäc söû duïng laøm probiotic Saccheromyces Phaàn lôùn khoâng gaây beänh, moät soá gaây nhieãm truøng ôû ngöôøi Phaàn lôùn nhöõng vi sinh vaät söû duïng laøm probiotic cho ngöôøi ñeàu phaûi ñaït nhöõng yeâu caàu khaéc khe nhö ñaõ neâu treân. Coøn ñoái vôùi vaät nuoâi ta coù theå nôùi loûng nhöõng yeâu caàu naøy, tuøy thuoäc vaøo töøng loaïi vaät nuoâi vaø tính an toaøn khi söû duïng cuûa noù. Tröôùc khi moät probiotic coù theå mang laïi nhöõng lôïi ích treân söùc khoûe con ngöôøi chuùng thöôøng phaûi coù nhöõng ñaëc ñieåm sau: [2], [4], [23] Chuûng vi sinh vaät phaûi coù nhöõng ñaëc ñieåm phuø hôïp vôùi coâng ngheä ñeå coù theå ñöa vaøo saûn xuaát. deã nuoâi caáy. Coù khaû naêng soáng vaø khoâng bò bieán ñoåi chöùc naêng khi ñöa vaøo saûn phaåm. Khoâng gaây caùc muøi vò khoù chòu cho saûn phaåm. Caùc vi khuaån soáng phaûi ñi ñeán ñöôïc nôi taùc ñoäng cuûa chuùng. Ñeå toàn taïi ñöôïc noù phaûi coù ñaëc tính sau: Coù khaû naêng dung naïp vôùi acid (chòu pH thaáp ôû daï daøy) vaø dòch vò cuûa ngöôøi. Coù khaû naêng dung naïp vôùi muoái maät (laø ñaëc tính raát quan troïng ñeå probiotic coù theå soáng soùt ñöôïc khi ñi qua ruoät non). Coù khaû naêng baùm dính vaø nieâm maïc ñöôøng tieâu hoùa vaät chuû. Coù khaû naêng sinh caùc enzyme hoaëc caùc saûn phaåm cuoái cuøng maø vaät chuû coù theå söû duïng. Coù khaû naêng kích thích mieãn dòch nhöng khoâng coù taùc ñoäng gaây vieâm. Coù khaû naêng caïnh tranh vôùi heä vi sinh vaät töï nhieân, coù hoaït tính ñoái khaùng vôùi caùc vi sinh vaät gaây beänh, ñaëc bieät laø sinh vaät gaây beänh ñöôøng ruoät. Saûn xuaát caùc chaát khaùng vi sinh vaät ( ví duï nhö bacteriocin, hydrogen peroxide, acid höõu cô). Coù khaû naêng choáng ñoät bieán vaø caùc yeáu toá gaây ung thö. Sau ñaây laø moät soá chöùc naêng quan troïng cuûa nhöõng chuûng ñöôïc söû duïng laøm probiotic Khaû naêng baùm dính [1], [2], [10] Khaû naêng baùm vaøo beà maët vaø sau ñoù laø phaùt trieån trong ñöôøng tieâu hoùa ngöôøi ñöôïc xem laø ñieàu kieän tieân quyeát quyeát ñònh chöùc naêng cuûa probiotic. Nhöõng vi khuaån coù khaû naêng baùm dính vaøo beà maët ruoät seõ toàn taïi laâu hôn vaø do ñoù coù ñieàu kieän ñeå bieåu hieän nhöõng taùc ñoäng ñieàu hoøa mieãn dòch hôn laø nhöõng chuûng khoâng coù khaû naêng naùm dính Khaû naêng baùm dính seõ taïo neân moät moái töông taùc giöõa probiotic vaø beà maët nieâm maïc ruoät laø nôi chöùa caùc teá baøo lympho, ñieàu naøy seõ kích thích tính mieãn dòch taïi choã vaø toaøn boä cô theå. Do ñoù ngöôøi ta cho raèng chæ coù nhöõng chuûng probiotic coù khaû naêng baùm dính môùi taïo ñöôïc hieäu quaû caûm öùng mieãn dòch vaø laøm oån ñònh haøng raøo baûo veä nieâm maïc ruoät. Söï baùm dính cuûa probiotic cuõng taïo neân khaû naêng caïnh tranh gaén keát vaøo bieåu moâ ruoät, giöõa nhöõng vi khuaån gaây beänh vaø probiotic. Qua moät soá thöû nghieäm, ñeàu cho thaáy Lactobacillus acidophilus coøn soáng hay ñaõ cheát do nhieät ñeàu coù khaû naêng öùc cheá söï baùm dính cuûa caùc vi khuaån gaây beänh. Trong thöû nghieäm veà khaû naêng baùm dính cuûa probiotic ngöôøi ta thöôøng kieåm tra treân nhöõng doøng teá baøo ung thö tröïc traøng nhö HT-29 vaø Caco-2. Hai doøng teá baøo naøy ñöôïc bieät hoùa thaønh teá baøo ruoät, ñöôïc söû duïng nhö laø moät moâ hình cho bieåu moâ ruoät non. Nhöõng thöû nghieäm naøy cho ta bieát ñöôïc söï khaùc bieät veà khaû naêng baùm dính cuûa nhöõng chuûng probiotic khaùc nhau. Ngoaøi söû duïng hai doøng teá baøo treân, ngöôøi ta coøn coù theå nghieân cöùu baèng kyõ thuaät sinh thieát, baèng caùch sinh thieát moät maãu moâ sau moät thôøi gian söû duïng probiotic. Kyõ thuaät naøy ñöôïc xem laø cho keát quaû chính xaùc nhaát veà khaû naêng baùm dính cuûa probiotic. Tuy nhieân vaãn coøn gaëp nhieàu haïn cheá trong vaán ñeà veà ñaïo ñöùc cuûa vieäc laáy moâ, ñoøi hoûi ngöôøi thöïc hieän coù chuyeân moân cao, vaø coù theå maéc sai soá. Khaû naêng ñieàu hoøa mieãn dòch [1], [2] Nhöõng caûi thieän heä mieãn dòch bôûi probiotic coù theå ñöôïc trình baøy theo 3 caùch sau: Taêng cöôøng hoaït ñoäng cuûa ñaïi thöïc baøo, naâng cao khaû naêng thöïc baøo cuûa sv hay haït carbon Taêng khaû naêng saûn xuaát khaùng theå thöôøng laø loaïi IgG vaø IgM vaø interferon (nhaân toá khaùng virus khoâng ñaëc hieäu) Taêng cöôøng khaû naêng ñònh vò khaùng theå treân beà maët ruoät, thöôøng laø IgA Khaû naêng choáng laïi caùc yeáu toá gaây beänh [2], [5] Ñeå coù theå taùc ñoäng leân heä sinh thaùi vi khuaån ñöôøng ruoät thì ñieàu khaù quan troïng ñoù laø probiotic phaûi coù khaû naêng choáng laïi caùc vi khuaån gaây beänh baèng caùch tieát ra caùc khaùng sinh hay laø nhöõng chaát caïnh tranh. Vi khuaån probiotic taïo ra caùc chaát ña daïng maø öùc cheá caû vi khuaån Gram döông vaø Gram aâm. Nhöõng hôïp chaát naøy coù theå laøm giaûm khoâng chæ nhöõng sinh vaät mang maàm beänh coù theå soáng ñöôïc maø coøn aûnh höôûng ñeán söï trao ñoåi chaát cuûa vi khuaån vaø söï taïo ra caùc ñoäc toá. Qua nghieân cöùu cho thaáy caùc khaùng sinh vaø chaát caïnh tranh thöôøng thaáy ôû caùc chuûng probiotic laø: Bacteriocin Hydrogen peroxide Acid höõu cô (acid lactic, acid acetic..) Diacetyl… Cô cheá taùc ñoäng: caïnh tranh vôùi caùc nguoàn beänh ñeå ngaên chaën söï baùm dính vaøo ñöôøng ruoät, caïnh tranh dinh döôõng caàn thieát cho söï soáng soùt cuûa maàm beänh, taùc ñoäng khaùng ñoäc toá. Khaû naêng choáng ñoät bieán vaø caùc yeáu toá gaây ung thö [2], [5], [18] Trong nhieàu naêm qua, coù nhöõng nghieân cöùu cho thaáy vi sinh vaät trong thöïc phaåm hay trong heä sinh thaùi ruoät coù khaû naêng choáng ñoät bieán vaø choáng laïi caùc yeáu toá gaây ung thö. Cô cheù naøy ñöôïc nghieân cöùu vaø keát luaän nhö sau: Nhôø söï gaén keát vaø phaân huûy caùc chaát gaây ung thö Saûn xuaát caùc hôïp chaát khaùng ung thö Ñieàu hoøa nhöõng enzyme tieàn chaát gaây ung thö ruoät, nhö caùc enzyme phaân (nitroreductase, β-glucuronidase ) coù khaû naêng chuyeån caùc chaát tieàn sinh ung thö thaùnh chaát gaây ung thö trong tröïc traøng ÖÙc cheá khoái u baèng moät cô cheá ñaùp öùng mieãn dòch Nhöõng vaán ñeà vaãn coøn giôùi haïn trong moâ hình in vitro hay in vivo, vieäc môû roäng ra treân ngöôøi ñeå döï phoøng ung thö coøn ñang laø vaán ñeà coøn nhieàu tranh caõi. Qui trình choïn loïc caùc chuûng Probiotic Quaù trình choïn loïc chuûng probiotic xaây döïng theo hình 2.2 vaø 2.3 ñöôïc trình baøy sau ñaây: Tuyeån choïn vaø xaùc ñònh chuûng döïa treân kieåu hình vaø kieåu gen Teân chi, loaøi, kyù hieäu chuûng Ñaêng kyù trong baûo taøng gioáng quoác teá naøo? Xaùc ñònh chöùc naêng In vitro Treân ñoäng vaät Daùnh giaù ñoä an toaøn In vitro vaø treân ñoäng vaät Treân ngöôøi: pha 1 Pha 2: Thöû nghieäm muø keùp ngaãu nhieân goàm nhoùm thöû nghieäm vaø nhoùm ñoái chöùng uoáng thuoác vôø (DBPC) ñeå xaùc ñònh tính coâng hieäu cuûa chuûng hoaëc saûn phaåm Toát nhaát neân thöû nghieäm DBPC ñoäc laäp laàn 2 ñeå khaúng ñònh keát quaû Daùn nhaõn Teân chi, loaøi, kyù hieäu chuûng Soá löôïng toái thieåu vi khuaån soáng Ñieàu kieän baûo quaûn thích hôïp Thoâng tin lieân heä vôùi khaùch haøng PROBIOTIC Pha 3: Kieåm nghieäm möùc ñoä hieäu quaû treân ngöôøi So saùnh hieäu quaû ñieàu trò 1 beänh ñaëc tröng baèng probiotic vôùi phöông phaùp ñieàu trò thoâng thöôøng. Hình 2.1: Sô ñoà höôùng daãn cuûa FAO vaø WHO trong tuyeån choïn Probiobic Phaân laäp caùc doøng vi khuaån Saøng loïc in vitro Saøng loïc in vivo quy moâ nhoû Kieåm tra khaû naêng gaây beänh ñoái vôùi vaät chuû Khoâng ñaït OK? Ñaït Ñaït Thöû nghieäm in vivo quy moâ pilot OK? Khaû naêng gaây beänh ñoái vôùi ñieàu kieän nuoâi (neáu caàn) OK? OK? Loaïi boû PROBIOTIC Ñaït Ñaït Khoâng ñaït Khoâng ñaït Khoâng ñaït Hình 2.2 : Sô ñoà tuyeån choïn caùc vi sinh vaät duøng laøm Probiotic Caùc tieâu chuaån ñaùnh giaù hoaït tính cuûa vi sinh vaät Probiotics Caùc tieâu chuaån ñeå ñaùnh giaù hoaït tính cuûa vi sinh vaät Probiotics ñeàu döï treân cô sôû söï öùc cheá taêng tröôøng vi sinh vaät chæ thò cuûa caùc chuûng probiotic, ñöôïc khaùi quaùt nhö sau: Probiotics Söï baùm dính Chòu acid daï daøy Khaùng vi sinh vaät Chòu ñöôïc muoái maät Thöû nghieäm in vivo Hình 2.3: Sô ñoà khaùi quaùt hoùa tieâu chuaån ñaùnh giaù hoaït tính cuûa vi sinh vaät Caùc chæ tieâu vaø phöông phaùp treân seõ ñöôïc giôùi thieäu kó hôn ôû phaàn tieáp theo. Khaû naêng baùm dính (Adhesion assay) [9], [24], [41] Nguyeân taéc: döïa treân moái quan heä töông taùc giöõa probiotic vaø beà maët nieâm maïc ruoät laø nôi chöùa caùc teá baøo lympho. Ngoaøi ra söï baùm dính cuûa probiotic taïo neân khaû naêng caïnh tranh gaén keát vaøo bieåu moâ ruoät giöõavi khuaån gaây beänh vaø probiotic. Teá baøo Caco2 ôû noäi taïng thöôøng ñöôïc söû duïng trong nghieân cöùu in vitro döïa treân heä thoáng teá baøo baùm dính cuûa Lactobacilli khoâng geây beänh. Chuoãi teá baøo naøy ñöôïc söû duïng ñeå kieåm tra heän thoáng teá baøo baùm dính vaø söï xaâm nhaäp cuûa caùc vi sinh vaät chæ thò Teá baøo Caco2 ñöôïc nuoâi caáy taêng sinh khoái teá baøo trong Eagle’s minimum essential medium (MEM). Hoãn hôïp chöùa vi khuaån khoaûng 108tb/ml vaø 240µl MEM ñöôïc söû duïng ñeå uû vôùi teá baøo Caco2. Sau khi nuoâi uû, sinh khoái teá baøo ñöôïc nhuoäm vôùi dung dòch maøu Giema. Luùc naøy quan saùt ñöôïc caùc teá baøo Lactobacilli baùm chaët treân teá baøo Caco2 döôùi kính hieån vi ñoä phoøng ñaïi 100. Hình 2.4: Minh hoïa caùc vi khuaån probiotic baùm dính leân beà maët ruoät taùc ñoäng ñoái khaùng vôùi caùc vi khuaån gaây beänh [47] Khaû naêng chòu acid daï daøy [24], [41] Nguyeân taéc: pH cuûa daï daøy vaø ruoät thöôøng thaáp do caùc acid gaây ra nhö oxalic acid, butylic acid, folic acid....Chính vì vaäy caùc vi khuaån probiotic caàn phaûi chòu ñöôïc ñieàu kieän pH thaáp, hay laø dung naïp ñöôïc vôùi acid trong daï daøy vaø ruoät thì môùi coù theå phaùt huy ñöôïc taùc duïng probiotic cuûa mình. Ñeå kieåm tra khaû naêng naøy, ngöôøi ta nuoâi caáy caùc vi khuaån probiotic treân moâi tröôøng MRS vôùi ñieàu kieän pH laø 2.5 vaø ñoái chöùng treân MRS thoâng thöôøng. Sau ñoù quan saùt maät ñoä vi sinh vaät ôû böôùc soùng 600nm. Tieáp tuïc so saùnh söï soáng soùt döôùi ñieàu kieän naøy ôû caùc moác thôøi gian, töø 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7 vaø 24h. Khaû naêng chòu ñöôïc muoái maät [24], [41] Coù loaïi muoái maät: glycochalat Natri vaø Taruocholat Natri. Muoái maät coù chöùc naêng quan troïng trong vieäc tieâu hoùa vaø haáp thu lipid ôû ruoät non keùo theo söï haáp thu caùc vi ta min tan trong lipid nhö A, D, E, K. Khi xuoáng ñeán hoài traøng, 95% muoái maät ñöôïc taùi haáp thu roài theo theo tính maïch cuûa trôû veà gan vaø ñöôïc taùi baøi tieát, goïi laø chu trình ruoät gan. Coøn laïi 5% muoái maät ñöôïc ñaøo thaûi theo phaân coù taùc duïng giöõ nöôùc trong phaân vaø duy trì nhu ñoäng ruoät giaø. Chính vì khaû naêng naøy maø khaû naêng chòu ñöôïc muoái maät cuõng laø moät ñieàu kieän ñeå ñaùnh giaù hoaït tính cuûa probiotic, ñoøi hoûi caùc vi khuaån probiotic khoâng gaây aûnh höôûng gì tôùi löôïng muoái maät ôû trong ruoät. Ñeå kieåm tra khaû naêng naøy, töông töï nhö kieåm tra khaû naêng chòu pH thaáp, cuõng duøng moâi tröôøng MRS coù boå sung 0.3% muoái maät vaø ñoái chöùng treân MRS thoâng thöôøng. Sau ñoù so saùnh maät ñoä teá baøo vi khuaån ôû böôùc soùng 600µnm. Khaû naêng khaùng vi sinh vaät Ñieån hình veà nghieân cöùu khaû naêng khaùng vi sinh vaät cuûa probiotic ñoù chính laø nghieân cöùu cuûa Schillinger vaø Lucke [28]. Sau naøy phaùt trieån theâm nhieàu nghieân cöùu môùi, tuy nhieân taát caû nhöõng nghieân cöùu töø tröôùc tôùi giôø ñeàu döïa treân khaû naêng sinh khaùng sinh hay caùc chaát caïnh tranh ñeå ngaên chaën söï phaùt trieån cuûa caùc vi sinh vaät gaây beänh. Hình 2.5 seõ cho thaáy sô ñoà khaùi quaùt hoùa veà caùc phöông phaùp ñaùnh giaù hoaït tính khaùng vi vinh vaät döïa treân daïng vaät lieäu khaùc nhau. Turbidometric assay method well diffusion assay Spot on lawn Disc diffusion assay Agar spot test Duøng saûn phaåm thoâ (dòch nuoâi caáy) Saûn phaåm ñaõ qua tinh cheá (dòch nuoâi caáy ly taâm loaïi boû teá baøo) Hình 2.5: Sô ñoà khaùi quaùt hoùa caùc phöông phaùp in vitro trong kieåm tra ñaùnh giaù hoaït tính khaùng vi sinh vaät cuûa probiotic. Sau ñaây laø giôùi thieäu chi tieát hôn veà caùc phöông phaùp giôùi thieäu taïi baûng 2.5 Baûng 2.5: Caùc phöông phaùp kieåm tra khaû naêng khaùng vi sinh vaät Phöông phaùp Nguyeân taéc söû duïng Caùch thöïc hieän Turbidometric assay method (Ño ñoä ñuïc) [16], [31] ÖÙc cheá taêng tröôûng vi khuaån chæ thò baèng caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát cuûa vi khuaån Probiotic Trong moâi tröôøng loûng(1). Cho dòch ly taâm moâi tröôøng(2) nuoâi caáy LAB vaøo moâi tröôøng phaùt trieån cuûa vi khuaån chæ thò. Sau 21h ño OD ôû böôùc soùng 600nm, so saùnh % vôùi oáng ñoái chöùng khoâng söû duïng dòch ly taâm treân. Disc diffusion assay (khueách taùn qua voøng giaáy loïc) [7], [11], [19], [31] Nhö treân Treân moâi tröôøng agar(3). Thaám giaáy vaøo dòch ly taâm moâi tröôøng (2) nuoâi caáy LAB. Ñaët giaáy thaám leân beà maët moâi tröôøng agar ñaõ traûi vi khuaån chæ thò tröôùc ñoù. UÛ qua ñeâm, kieåm tra vuøøng khaùng khuaån. Well diffusion assay (khueách taùn qua gieáng thaïch) [12], [19], [20], [25], [41] Nhö treân Treân moâi tröôøng agar (3). Traûi vi khuaån chæ thò, ñuïc loã ñöôøng kính 8mm. Cho dòch ly taâm moâi tröôøng(2) nuoâi caáy LAB. UÛ qua ñeâm, kieåm tra vuøøng khaùng khuaån Ñaáu tranh tröïc tieáp cuûa Probiotic vôùi vi khuaån chæ thò Gioáng nhö treân. Tuy nhieân söû duïng tröïc tieáp dòch nuoâi caáy LAB. UÛ qua ñeâm, kieåm tra vuøøng khaùng khuaån Spot on lawn [12], [11], [31], Ñaáu tranh tröïc tieáp cuûa Probiotic vôùi vi khuaån chæ thò Treân moâi tröôøng agar (4). Nhoû dòch chöùa teá baøo LAB, coá ñònh baèng 1 gioït moâi tröôøng (5). Ñoå hoãn hôïp vi khuaån chæ thò vôùi 7ml moâi tröôøng (5) leân, ñeå ñoâng, ñöôïc hai maët keïp cuûa hai moâi tröôøng (4) vaø (5). UÛ qua ñeâm, kieåm tra vuøøng khaùng khuaån. Agar spot test (khueách taùn treân beà maët thaïch) [27], [19], [5] Ñaáu tranh tröïc tieáp cuûa Probiotic vôùi vi khuaån chæ thò. Treân moâi tröôøng agar (3). Traûi vi khuaån chæ thò, nhoû gioït moâi tröôøng (2) nuoâi caáy LAB. UÛ qua ñeâm, kieåm tra vuøøng khaùng khuaån. Giaûi thích theâm: Moâi tröôøng (1) BHI Broth Moâi tröôøng (2) MRS Broth Moâi tröôøng (3) BHI Agar 2% Moâi tröôøng (4) MRS Agar 2% Moâi tröôøng (5) BHI Agar 0,7% Kieåm tra vuøng khaùng khuaån laø ño voøng trong suoát khoâng coù söï phaùt trieån cuûa vi khuaån chæ thò. Agar spot test Well diffusion assay Disc diffusion assay Spot on lawn Hình 2.6: Minh hoïa caùc phöông phaùp kieåm tra hoaït tính khaùng vi sinh vaät [19] Thöû nghieäm in vivo [10], [41] Ñaây laø khaâu quan troïng trong quaù trình hình thaønh neân moät cheá phaåm Probiotic. Vì noù theå hieän ñöôïc tính an toaøn cuûa saûn phaåm cuõng nhö laø vaán ñeà veà ñaïo ñöùc. Moät cheá phaåm probiotic tröôùc khi trôû thaønh thaønh phaåm ñeå saûn xuaát vaø tieâu thuï, phaûi traûi qua coâng ñoaïn thöû nghieäm in vivo nhaèm kieåm tra aûnh höôûng cuûa cheá phaåm leân cô theå tieáp nhaän. Töùc laø kieåm tra ñoäc tính hay nhöõng bieán ñoåi xaáu leân cô theå tieáp nhaän khi söû duïng cheá phaåm naøy. Qui trình kieåm tra naøy coù theå baét ñaàu vôùi thöû nghieäm in vivo treân chuoät hoaëc thoû, sau ñoù môùi ñöôïc thöû nghieäm tröïc tieáp treân cô theå tieáp nhaän nhö gia suùc gia caàm vôùi cheá phaåm trong chaên nuoâi...Ñaëc bieät neáu laø cheá phaåm daønh cho ngöôøi thì vieäc thöû nghieäm caøng phaûi gaét gao vaø ñoøi hoûi tính chính xaùc, tính an toaøn cao. ÖÙng duïng Probiotics trong chaên nuoâi [1], [3] Phöông phaùp chaên nuoâi hieän ñaïi trong ñoù bao goàm caùc ñieàu kieän vaø cheá ñoä aên gaây ra stress vaø coù theå gaây ra nhöõng thay ñoåi trong thaønh phaàn cuûa heä vi sinh vaät maø laøm cho vaät nuoâi giaûm söï ñeà khaùng ñoái vôùi beänh taät. Probiotic ñöôïc boå sung vaøo thöùc aên ñeå taêng cöôøng toác ñoä taêng tröôûng cuûa vaät nuoâi vaø caûi thieän söùc khoûe cuûa chuùng baèng caùch taêng söï ñeà khaùng. Muïc ñích cuûa phöông phaùp tieáp caän probiotic laø ñeå caân baèng laïi heä vi sinh vaät vaø phuïc hoài söùc ñeà khaùng cuûa ñoäng vaät. Söï ñieàu trò nhö vaäy khoâng ñöa baát cöù hoùa chaát vaøo beân trong cô theå ñoäng vaät. Giaûm nguy cô nhieãm beänh vaø khoâng ñöa hoùa chaát ñoäc haïi vaøo trong chuoãi thöùc aên. Noù ñöôïc giaû ñònh raèng probiotic ñaõ taùc duïng ñeán caû vuøng daï daøy vaø taùc duïng leân beänh tieâu chaûy vaø caùc beänh nhieãm truøng khaùc. Tuy nhieân, gaàn ñaây coù nhöõng nghieân cöùu taïi moät soá quoác gia khaùc nhau ñaõ chæ ra raèng caùc taùc ñoäng naøy coù theå ñöôïc toång quaùt hôn. Caùc keát quaû thu ñöôïc ñaõ chöùng toû raèng moät soá vi khuaån ñöôïc söû duïng trong probiotic (lactobacilli) coù khaû naêng kích thích heä mieãn dòch. Ñieàu naøy ñöôïc ñaët ra hoaøn toaøn môùi ñoái vôùi nhöõng aûnh höôûng cuûa probiotics ñaõ bieát, trong ñoù noù coù theå taùc ñoäng tôùi tình hình beänh dòch veà ñöôøng ruoät, cuõng nhö phoøng choáng caùc beänh veà ñöôøng ruoät. Probiotic hieän nay ñaõ thay theá caùc hoùa chaát taêng tröôûng vaãn thöôøng quaûng baù cho caùc noâng traïi chaên nuoâi vaø söï yeâu caàu taêng khaû naêng khaùng beänh cuõng ñöôïc thöïc hieän. Yeâu caàu veà lôïi ích maø probiotic mang laïi trong chaên nuoâi gia suùc nhö sau: Taêng tröôûng nhanh Naâng cao khaû naêng sinh saûn Naâng cao söùc ñeà khaùng beänh taät Naâng cao naêng suaát vaø chaát löôïng söõa Naâng cao saûn xuaát tröùng Probiotic khoâng phaûi laø moät thöïc theå ñôn leû, nhöõng cheá phaåm probiotic khaùc nhau chöùa ñöïng heä vi sinh vaät khaùc nhau thì coù taùc ñoäng khaùc nhau. Ngay caû nhöõng chuûng khaùc nhau cuûa cuøng moät loaøi coù theå coù hoaït ñoäng trao ñoåi chaát khaùc nhau seõ aûnh höôûng ñeán keát quaû khi chuùng ñöôïc söû duïng nhö probiotic. Keát quaû tieâu cöïc coù theå ñöôïc giaûi thích ôû nhöõng vaät nuoâi coù söùc ñeà khaùng yeáu hay do giai ñoaïn taêng tröôûng cuûa vaät nuoâi, lieàu löôïng söû duïng, caùc ñieàu kieän veä sinh chuoàng traïi. Vôùi nhöõng ñieàu ngaïc nhieân mang laïi, cuõng nhö nhöõng keát quaû chöa nhö mong muoán cuûa probiotic, nhöng thöïc teá laø nhöõng keát quaû ñaït ñöôïc raát coù yù nghóa, baèng caùch söû duïng probiotic hôïp lyù, theo ñuùng caùc ñieàu kieän vaø söû duïng ñuùng phöông phaùp seõ mang laïi nhieàu lôïi ích cho vieäc boå sung nguoàn dinh döôõng trong chaên nuoâi. Trong chaên nuoâi gia caàm [4] Trong quaù trình caûi tieán di truyeàn, naêng suaát cuûa gaø thòt ñaõ ñöôïc caûi thieän ñaùng keå. Khi maø ñieàu naøy laø toát cho ngaønh chaên nuoâi gia caàm, vieäc taêng maät ñoä nuoâi vaø luùc ñoù thì thaùch thöùc beänh taät gia taêng gaây cho gia caàm deã nhieãm caùc loaïi nguoàn beänh khaùc nhau, ñaëc bieät laø vi khuaån ñöôøng ruoät nhö E.coli, Salmonella spp, Clostridium perfringens vaø Campylobacter spp… Söï nhaïy caûm vôùi maàm beänh daãn ñeán vieäc söû duïng caùc chaát kích thích sinh tröôûng choáng vi khuaån – caùc chaát voán caên baûn ñöôïc söû duïng ñeå taêng söùc khoeû cho ñöôøng ruoät vaø kieåm soaùt caùc kích thích phuï laâm saøng. Vôùi yù thöùc ngaøy caøng taêng cuûa xaõ hoäi veà söï khaùng thuoác cuûa vi khuaån, thì vieäc söû duïng khaùng sinh trong caùc lieàu thuoác chöõa beänh hoaëc phoøng beänh cho gia caàm ñaõ ñöôïc haïn cheá moät caùch nghieâm ngaët thaäm chí bò loaïi boû haún ôû raát nhieàu quoác gia. Töø laâu ñaõ coù nhieàu quan taâm ñeán vieäc tìm ra moät loaïi chaát ñeå thay theá khaùng sinh trong chaên nuoâi gia caàm. Vi khuaån soáng trong oáng tieâu hoùa cuûa gia caàm coù aûnh höôûng saâu saéc ñeán moät vaøi quaù trình sinh lyù cuûa vaät chuû (gia caàm). Vôùi suy nghó ñoù, ñieàu quan troïng laø phaûi hieåu cô cheá cuûa heä vi khuaån ñöôøng ruoät gia caàm nhaèm tìm ra caùc chaát thay theá thuoác khaùng sinh. Trong boái caûnh bình thöôøng, thì trong ñöôøng ruoät coù moät söï caân baèng tinh teá giöõa caùc vi khuaån coù lôïi vaø gaây beänh. Noù bò aûnh höôûng bôûi caùc töông taùc vaø quan heä coäng sinh vaø caïnh tranh. Coäng ñoàng vi khuaån ñoù khoâng chæ baûo veä boä maùy tieâu hoaù maø coøn taêng khaû naêng saûn xuaát trong ñoäng vaät chuû. Söû duïng Probiotic vaø Prebiotic laø hai phöông phaùp ñaõ ñöôïc nghieân cöùu vaø coù tieàm naêng giaûm bôùt nguoàn dòch beänh ñoái vôùi chaên nuoâi gia caàm vaø ñoàng thôøi naâng cao naêng suaát cuûa chuùng. Caùc chaát naøy môùi ñöôïc ñeà nghò duøng ñeå hoã trôï baûo veä nhieãm beänh cuûa thòt vaø caûi tieán phaûn öùng mieãn dòch cho gaø ( Theo Huang vaø coäng taùc vieân - 2004). Thöïc phaåm Probiotics vaø Prebiotics vaøo thöùc aên khoâng coøn laø nhöõng phöông phaùp môùi, maø thöïc teá, chuùng ñaõ ñöôïc söû duïng trong haøng theá kyû nhö laø moät thaønh phaàn töï nhieân cuûa thöùc aên hoaëc nhö thöùc aên leân men, thí duï nhö söõa chua (yoghurt). Beänh ñöôøng ruoät coù aûnh höôûng ñeán ngaønh chaên nuoâi gia caàm. Chuùng laøm giaûm naêng suaát, taêng tyû leä cheát vaø cuõng laø nguoàn nhieãm tieàm naêng cho caùc saûn phaåm gia caàm, vaø gaây neân maát an toaøn thöïc phaåm cho con ngöôøi. Vieäc söû duïng caùc thuoác khaùng sinh trong thöùc aên gia caàm ñaõ ñöôïc giaûm bôùt do vaán ñeà khaùng khaùng thuoác cuûa vi khuaån. Caùc chaát thay theá cho khaùng sinh trong dinh döôõng gia caàm caàn ñöôïc ñaùnh giaù nghieâm tuùc treân thöïc ñòa. Probiotics vaø Prebiotics laø caùc “thí sinh” thay theá khaû quan. Trong chaên nuoâi gia suùc [4] Gaàn ñaây, nhieàu baùo caùo nghieân cöùu chöùng minh hieäu quaû roõ raøng cuûa probiotic treân heo, bao goàm: Lactobacillus spp vaø Bifidobacteria spp laøm taêng troïng löôïng vaø giaûm tæ leä cheát non.Lactobacillus casei caûi thieän taêng tröôûng cuûa heo con vaø giaûm beänh tieâu chaûy, taùc duïng cuûa noù hieäu quaû hôn so vôùi vieäc duøng khaùng sinh lieàu thaáp. Enteracide, moät probiotic chöùa Lactobacillus acidophilus vaø Streptococcus faecium theâm vaøo thöùc aên cho heo con cai söõa kích thích söï taêng tröôûng vaø hoaït ñoäng cuûa heä thoáng tieâu hoùa. Söï theâm Streptococcus faecium vaøo khaåu phaàn aên cho heo con laøm taêng troïng löôïng vaø taêng hieäu quaû thöùc aên. Hoãn hôïp Lactobacillus spp. vaø Streptococcus spp. taêng söï sinh tröôûng vaø chöùc naêng mieãn dòch ôû heo con. Boät teá baøo vi khuaån tieâu hoùa töø Brevibacterium lactofermentum giaûm söï taùc ñoäng vaø söï nguy hieåm cuûa beänh tieâu chaûy ôû heo con. Heo con aên Bacillus coagulans coù tæ leä cheát giaûm vaø caûi thieän vieäc taêng troïng löôïng, söï chuyeån hoùa thöùc aên toát hôn heo con khoâng coù aên boå sung cuõng nhö so vôùi heo duøng khaùng sinh lieàu thaáp. Bacillus licheniformis caûi thieän troïng löôïng, chuyeån hoùa thöùc aên vaø giaûm beänh tieâu chaûy, tæ leä cheát non. Biomate 2B plus (B.licheniformis vaø B. subtilis) taêng hieäu quaû thöùc aên vaø taêng tröôûng cuûa heo con hôn duøng khaùng sinh. Heo con aên probiotic Bacillus toyoi hoaëc hoãn hôïp Saccharomyces cerevisae, Lactobacillus acidophilus vaø Streptococcus faecium laøm taêng troïng löôïng ñaùng keå so vôùi vieäc duøng khaùng sinh. Heo con aên thöùc aên boå sung naám men (Saccharomyces cerevisae) coù khuynh höôùng tieâu thuï nhieàu thöùc aên vaø taêng troïng hôn. Enterococcus faecium 18C23 ngaên chaën söï baùm dính cuûa E.coli taïo ñoäc toá ñöôøng ruoät vaøo lôùp maøng nhaày ruoät non cuûa heo. Ngoaøi vieäc trò beänh ôû heo con, coøn coù moät soá nghieân cöùu cho thaáy caùc lactobacilli cuõng coù khaû naêng ngaên chaën söï phaùt trieån cuûa caùc vi khuaån gaây beänh ñöôøng ruoät ôû traâu boø. Theo Trovatelli vaø Matteuzzi (1976) do quaù trình bieán ñoåi cuûa traâu boø ( do maät ñoä quaù ñoâng, söï sôï haõi, thieáu thöùc aên, söï di chuyeån quaù möùc) vaø trong nguoàn thöùc aên thieáu caùc vi khuaån coù lôïi neân söùc ñeà khaùng cuûa traâu boø bò suy giaûm. Ño ñoù, ngöôøi ta thöôøng cung caáp thöùc aên daïng leân men ñeå taïo moâi tröôøng môùi trong ruoät vaät nuoâi nhaèm mieãn nhieãm vôùi vi sinh vaät gaây beänh, ñoàng thôøi giuùp taêng troïng vaø taêng khaû naêng chuyeån hoùa thöùc aên Fastrack, moät saûn phaåm duøng cho ñoäng vaät nhai laïi, chöùa Lactobacillus acidophilus vaø Streptococcus faecium, taïo ra acid lactic, naám men giuùp boå sung vitamin B vaø nhöõng enzyme tieâu hoùa. ÔÛ beâ, Fastrack caûi thieän taêng troïng, giaûm beänh tieâu chaûy vaø nhöõng xaùo troän tieâu hoùa khaùc; taêng saûn löôïng söõa vaø söï theøm aên ôû boø; taêng löôïng thöùc aên ôû cöøu vaø deâ. Vi khuaån leân men lactic Ñaëc ñieåm vi khuaån [1], [8], [22], [29], [37] Đầu tiên xin giới thiệu vị trí của vi khuẩn lactic trong hệ thống phân loại: Vi khuaån lactic thuoäc laõnh giôùi vi khuaån, ngaønh Firmicutes, Cuøng vôùi ngaønh Actinobacteria, chuùng taïo thaønh nhoùm caùc vi khuaån Gram döông. Tuy nhieân so saùnh veà tæ leä base G+C thì ngaønh Firmicutes coù tæ leä thaáp traùi vôùi Actinobacteria coù tæ leä G + C cao. Caùc chi (gioáng) chuû yeáu cuûa vi khuaån lactic laø Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc vaø Lactobacillus. Ngoaøi ra chuùng coøn coù caùc chi khaùc nhö Carnobacterium, Aerococcus, Enterococcus, Vagococcus, Oenococcus, Pediococcus, Tetragenococcus, vaø Weissella. Ngoaøi ra Bifidobacterium tröôùc kia ñöôïc phaân loaïi thuoäc chi Lactobacillus (Lactobacillus bifidum) nay taùch ra thaønh chi Bifidobacterium. Chuùng coù nhieàu ñaëc ñieåm rieâng bieät maëc duø coù öùng duïng laøm probiotics gioáng chi Lactobacillus vaø moät soá Enterococcus, Lactococcus. Caùc vi khuaån lactic thöôøng ñöôïc öùng duïng laøm probiotics ñoù laø Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L. casei, L. casei rhamnosus, L. delbrueckii bulgaricus, L. fermentum, L. reuteri, Lactococcus lactis lactis, Lactococcus lactis cremoris, Bifidobacterium bifidum, B. infantis, B. adolecentis, B. longum, B. breve, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium. Hình 2.7: Vi khuaån leân men lactic trong heä thoáng phaân loaïi Baûng 2.6: Moät soá ñaëc ñieåm cuûa caùc chi vi khuaån lactic [37] Vì phaïm vi ñoà aùn coøn haïn cheá neân chæ thöïc hieän nghieân cöùu trong phaïm vi caùc vi khuaån thuoäc chi Lactobacillus. Sau ñaây laø ñaët ñieåm chung cuûa chi Lactobacillus: Teá baøo hình que, thöôøng coù nhieàu daïng: daøi, maûnh vaø ngaén (daïng tröïc caàu khuaån coccobacilli). Kích thöôùc teá baøo 0.5 – 1.2 x 1.0 – 10.0 µm. Trong quaù trình sinh tröôûng, teá baøo thöôøng taïo thaønh chuoãi ôû phase log. Khoâng di ñoäng, di ñoäng khi coù söï hieän dieän cuûa tieân mao. Khoâng taïo baøo töû, ôû daïng gram döông khi teá baøo coøn non, vaø gram aâm khi teá baøo giaø. Hình daïng khuaån laïc treân thaïch: daïng loài, meùp troøn, maøu traéng ñuïc, thöôøng coù ñöôøng kính 2-5 mm. Ít taïo saéc toá, coù theå taïo saéc toá vaøng, cam hay maøu gæ saét vaø maøu ñoû gaïch. Kò khí tuøy nghi ñoâi khi hieáu khí. Phaùt trieån maïnh treân moâi tröôøng thaïch, kò khí coù 5-10% CO2, catalase, cytochrome vaø benzidine aâm tính. Saûn phaåm cuûa quaù trình chuyeån hoùa carbohydrate hôn 50% laø lactate, coøn laïi laø acetate, formate, succinate, CO2 , ethanol. Khoâng taïo acid deã bay hôi coù soá nguyeân töû carbon hôn hai. Khaû naêng khöû nitrate keùm vaø taïo pH döôõi 6.0. khoâng hoùa loûng gelatin. Khoâng phaân huûy casein nhöng vaøi chuûng coù theå taïo moät löôïng nhoû ñaïm hoøa tan. Khoâng taïo indole vaø H2S. Nhu caàu dinh döôõng phöùc taïp: amino acid, peptide, caùc daãn xuaát acid nucleic, vitamin, muoái, acid beùo, ester vaø moät soá nguoàn carbonhydrate vaø ñaëc tröng theo loaøi. Nhieät ñoä phaùt trieån 5-530C, nhieät ñoä toái öu 30-400C Coù theå phaùt trieån toát ôû pH khoaûng 5 vaø pH toái öu laø 5.5-5.8 Ñöôïc tìm thaáy trong caùc saûn phaåm söõa, haït, saûn phaåm thòt, nöôùc giaûi khaùt, bia, röôïu, nöôùc eùp traùi caây, hoa quaû, döa chua, trong nöôùc thaûi, trong heä tieâu hoùa ngöôøi vaø nhieàu loaøi ñoäng vaät. Laø nhöõng sinh vaät ít gaây beänh, coù taùc duïng toát vôùi ñöôøng tieâu hoùa. Quaù trình leân men lactic [1], [37] Vi khuaån leân men lactic ñoàng hình Leân men acid lactic ñoàng hình löôïng acid lactic taïo neân chieám treân 80% vaø ñöôïc bieåu dieãn toùm taét baèng phöông trình: C6H12O6 à 2CH3-CHOH-COOH Söï hình thaønh neân acid lactic traûi qua haøng hoaït caùc giai ñoaïn trung gian vôùi söï tham gia cuûa caùc enzyme töông öùng. Giai ñoaïn ñaàu xaûy ra quaù trình hoaït hoùa hexose ñöôïc phaân caét ñeå hình thaønh triosephotphate. Chaát naøy ñöôïc chuyeån thaønh acid pryruvic roài thaønh acid lactic Vi khuaån leân men lactic dò hình Trong leân men lactic dò hình, taïo saûn phaåm ña daïng ngoaøi acid lactic coøn coù haøng loaït saûn phaåm phuï khaùc, caùc saûn phaåm phuï vaø acid lactic ñöôïc sinh ra vôùi soá löôïng phaân töû gam nhö nhau. Cuï theå laø: acid lactic 40%, acid succinic vaø röôïu etylic 20%, acid acetic 10% vaø caùc chaát khí coøn laïi 20%. Söï ña daïng cuûa saûn phaåm taïo thaønh khi leân men lactic dò hình vì vi khuaån thuoäc nhoùm naøy coù nhieàu heä enzyme neân quaù trình chuyeån hoùa ñöôøng phöùc taïp hôn ôû vi khuaån lactic ñoàng hình Khi noàng ñoä cuûa acid lactic ñaït 2-3% seõ öùc cheá hoaït ñoäng cuûa caùc vi sinh khaùc, keå caû E.Coli. Hình 2.8: Quaù trình leân men lactic cuûa LAB. (A): Leân men lactic ñoàng hình. (B): Leân men lactic dò hình [37] Caùc enzyme trong quaù trình: 1. Glucokinase; 2. Fructose-1,6-dòposphate aldolase; 3. Glyceradehyde-3-phosphate dehydrogenase; 4. Pyruvate kinase; 5. Lactate dehydrogenase; 6. Glucose-6-phosphate dehydrogenase; 7. 6-phosphogluconate dehydrogenase; 8. Phophoketolase; 9. Acetaldhyde dehydrogenase; 10. Alcohol dehydrogennase. Khaû naêng toång hôïp enzyme Caùc vi khuaån lactic coù khaû naêng toång hôïp moät soá löôïng lôùn caùc enzyme ngoaïi baøo kích thích heä thoáng tieâu hoùa nhö: enzyme amylase, protease, lipase, glycolase vaø lactic dehydrogenase. Proteolysis (khaû naêng phaân giaûi protein): vi sinh vaät toång hôïp protease giuùp phaân huûy protein thaønh nhöõng hôïp chaát ñôn giaûn coù theå tieâu hoùa ñöôïc. Hoaït tính naøy cuûa Lactobacilli trong ñöôøng ruoät giuùp phaân huûy protein vaø vaät chuû coù theå tieâu thu deã daøng. Lipolysis: Vi sinh vaät toång hôïp lipase giuùp phaân huûy caùc chaát beùo phöùc taïp thaønh nhöõng hôïp chaát ñôn giaûn. Ñieàu naøy coù theå höõu ích trong vieäc taïo ra caùc khaåu phaàn aên dinh döôõng vaø hôïp lyù cho treû em, ngöôøi giaø vaø ngöôøi ñang döôõng beänh. Nhieàu thí nghieäm ñaõ chöùng minh raèng Lactobacilli coù theå phaân huûy Cholesterol. Bieán döôõng lactose: Vi khuaån sinh acid lactic coù enzyme β-galactosidase, glycolase vaø lactic dehydrogenase cs theå saûn sinh acid lactic töø lactose. Acid lactic coù nhöõng lôïi ích nhö sau: Chöõa trò beänh khoâng dung naïp lactose do thieáu caùc enzyme bieán döôõng lactose. Taêng cöôøng khaû naêng tieâu hoùa protein trong söõa baèng vieäc laøm ñoâng tuï protein trong söõa. Taêng cöôøng vieäc söû duïng Calci, Phospho, Saét. Kích thích söï baøi tieát. Kích thích söï tieâu hoùa trong daï daøy. Baûo toàn nguoàn naêng löôïng trong quaù trình hoâ haáp. Khaû naêng toång hôïp vitamin vaø caùc chaát trao ñoåi coù lôïi cho söï taêng tröôûng Vi khuaån leân men lactic duøng laøm probiotic ñoùng vai troø noåi baät trong ruoät baèng vieäc toång hôïp vitamin nhö: vitamin B, acid folic, biotin (vitamin H), vitamin K. Khaû naêng saûn sinh caùc chaát khaùng khuaån Bacteriocin [12], [13], [21], [38], [43] Bacteriocin laø nhöõng hôïp chaát coù baûn chaát laø protein do vi khuaån sinh toång hôïp vaø coù khaû naêng öùc cheá söï phaùt trieån cuûa caùc gioáng vi khuaån khaùc coù lieân heä gaàn vôùi gioáng saûn xuaát. Bacteriocin ñöôïc sinh toång hôïp bôûi caû vi khuaån gram aâm vaø gram döông. Bacteriocin khaùc vôùi khaùng sinh ôû nhöõng ñieåm chuû yeáâu sau: Bacteriocin ñöôïc toång hôïp nhôø ribosome Teá baøo chuû mieãn dòch vôùi chuùng Phoå khaùng khuaån heïp, vì vaäy thöôøng chæ coù khaû naêng tieâu dieät nhöõng chuûng vi khuaån coù lieân heä gaàn vôùi chuûng saûn xuaát. Coù raát nhieàu gioáng vi khuaån sinh toång hôïp bacteriocin, trong ñoù lactic acid bacteria (LAB) ñöôïc quan taâm nhieàu nhaát do bacteriocin cuûa LAB coù phoå khaùng khuaån roäng vaø coù tieàm naêng ñöôïc duøng laøm chaát baûo quaûn thöïc phaåm vaø öùng duïng trong döôïc phaåm. Bacteriocin ñöôïc LAB toång hôïp chia thaønh 4 lôùp: Lôùp I: (Lantibiotic) laø nhöõng phaân töû peptide nhoû (<5kDa), chöùa nhöõng amino acid hieám vaø moät soá amino acid khöû nöôùc. Chòu ñöôïc nhieät, hoaït ñoäng oån ñònh treân caáu truùc maøng. Lantibiotic ñöôïc taïo thaønh ôû traïng thaùi baát hoaït vôùi trình töï leader peptide ôû ñaàu N, trình töï naøy seõ bò caét ñi trong quaù trình tröôûng thaønh ñeå phoùng thích phaân töû peptide hoaït hoùa. Lôùp II: laø nhöõng phaân töû bacteriocin nhoû (<10kDa), thöôøng goàm nhöõng phaân töû peptide hoaït ñoäng ôû maøng teá baøo, khoâng chöùa Lanthionine vaø beàn nhieät, phoå khaùng khuaån heïp. Lôùp naøy ñöôïc chia laøm ba nhoùm: IIA: peptides hoaït ñoäng choáng laïi Listeria spp. Trong nhoùm naøy coù pediocin PA-1. IIB: hình thaønh bôûi moät phöùc taïp cuûa hai peptide rieâng bieät. Trong nhoùm naøy coù lactococcin G vaø plantaricins. IIc: peptides nhoû, beàn vôùi nhieät, ñöôïc vaän chuyeån cuûa leader-peptides. Trong nhoùm naøy ñöôïc tìm thaáy loaïi bacteriocins: divergicin A vaø B. acidocin Lôùp III: laø nhöõng phaân töû protein lôùn (>30kDa) vaø beàn nhieät, lôùp naøy goàm nhöõng enzyme ngoaïi baøo (hemolysin vaø muramidase) coù hoaït tính sinh lyù cuûa bacteriocin. Bacteriocin daïng naøy ñöôïc thu nhaän töø moät soá gioáng Lactobacillus . Lôùp IV: laø nhöõng bacteriocin phöùc hôïp, ngoaøi protein coøn coù theâm thaønh phaàn lipid vaø carbohydrate. Hieän nay vaãn coøn nhieàu ñieàu chöa bieát veà caâu truùc vaø chöùng naêng cuûa bacteriocin thuoäc lôùp naøy bì chöa coù phaân töû naøo thuoäc lôùp naøy ñöôïc tinh saïch. Hình 2.9: cô cheá khaùng khuaån cuûa moät soá loaïi Bacteriocin [48] Giaûi thích: Lôùp I (Nisin): Daïng A Lanthibiotics goàm nhöõng phaân töû löôõng tính daøi coù theå tieâu dieät caùc teá baøo maãn caûm baèng caùch taïo loã treân maøng sinh chaát. Lôùp II (sakasin): Chuùng mang ñieän döông trong moâi tröôøng trung tính vaø chuùng chöùa moät vuøng kî nöôùc vaø/hoaëc moät vuøng löôõng cöïc. Chuùng coù theå laøm thaám maøng sinh chaát teá baøo ñích. Bacteriolysins (lysostaphin): taùc ñoäng phaù huûy vaùch teá baøo. Baûng 2.7: Moät soá Bacteriocin vaø ñaëc ñieåm cuûa chuùng [22] Loaøi Bateriocin Phoå taùc ñoäng Ñaëc ñieåm Lactococcus lactis subsp. lactis Nisin Vi khuaån gram döông Lôùp I: lantibiotic, 3.5 kDa, 34 amino acids, Lacticin 3147 Clostridium sp Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Streptococcus dysgalactiae Enterococcus faecalis Propionibacterium acne Streptococcus mutans Lôùp I: caáu thaønh töø 2 lantibiotic, 4.2 kDa, beàn vôùi nhieät. Lactococcus lactis subsp. cremoris Lactococcin B Lactobacillus Lôùp II: khoaûng 5 kDa, phoå taùc ñoäng heïp. Lactobacillus acidphilus Acidocin CH5 Vi khuaån gram döông Lactobacillus Lôùp II: caáu thaønh töø caùc phaân töû khoái löôïng lôùn. Lactacin F Lactobacillus fermentum Enterococcus faecalis Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus helveticus Lôùp II: 6.3 kDa, 57 amino acid, chòu ñöôïc nhieät ñoä 1210C trong 15 phuùt. Lactacin B Lactobacillus debrweckii Lactobacillus helveticus Lactobacillus bulgaricus Lactococcus lactis Lôùp III: 6.3 kDa, chòu ñöôïc nhieät, chæ ñöôïc toång hôïp khi nuoâi caáy ôû ñieàu kieän pH 5.0-6.0 Lactobacillus amylovorus Lactobin A Lactobacillus acidophilus Lactobacillus debrweckii Lôùp II: 4.8 kDa, 50 amino acid, phoå taùc ñoäng heïp. Lactobacillus casei Lactocin 705 Listeria monocytogens Lactobacillus plantarum Lôùp II: caáu thaønh töø 2 bacteriocin (moãi bacteriocin 3.4 kDA, 33 amino acid) Leuconostoc gelidum Leucocin A Lactobacillus Enterococcus faecalis Listeria moâncytogenes Lôùp II: 3.9 kDa, 37 amino acid, oån ñònh ôû pH thaáp, chòu ñöôïc 1000C ôû 20 phuùt. Leuconostoc mesenteroides Mesentericin Y105 Enterococcus faecalis Listeria monocytogenes Lôùp II: 3.8 kDa, 37 amino acid, chòu ñöôïc nhieät ñoä 600C trong 120 phuùt ôû pH 4.5 Peliococcus acidilactici Pediocin F vi khuaån gram döông Lôùp II: 4.5 kDa, thuoäc enzyme proteolytic, beàn vôùi nhieät, hoøa tan chaát höõu cô, hoaït ñoäng ôû khoaûng pH roäng. Pediocin PA-1 Listeria monocytogenes Lôùp II: 4.6 kDA, 44 amino acid. Pediocin AcH Vi khuaån gram aâm vaø gram döông Lôùp II: 4.6 kDa, 44 amino acid, phoå taùc ñoäng roäng. Pediococcus pentosaceous Pediocin A Lactobacillus Lactococcus Leuconostoc Pediococcus Staphylococcus Enterococcus Listeria Clostridum Lôùp II: 2.7 kDa, thuoäc enzyme proteolytic, toàn taïi ôû 1000C trong 10 phuùt. Lactobacillus sake Lactocin S Lactobacillus Leuconostoc Pediococcus Lôùp I: 3.7 kDa, hoaït ñoäng ôû pH 4.5-7.5 Sakacin P Listeria monocytogenes Lôùp II: 4.4 kDa, chòu nhieät Lactobacillus curvatus Curvacin A Listeria monocytogenes Enterococcus faecalis Lôùp II: 4.3 kDa Lactobacillus helveticus Helveticin J Lactobacillus bulgaricus Lactococcus lactis Lôùp III: 37 kDa, phoå taùc ñoäng heïp, giaûm hoaït ñoäng sau 30 phuùt ôû 1000C Caùc chaát coù khaû naêng khaùng khuaån khaùc Caùc LAB cuõng coù khaû naêng öùc cheá söï phaùt trieån cuûa caùc vi sinh vaät gaây beänh thoâng qua moät soá caùc saûn phaåm bieán döôõng khaùc ngoaøi bacteriocin nhu: hydrogen peroxide, cacbon dioxide vaø diacetyl, acid höõu cô chuû yeáu laø acid lactic. Quaù trình bieán döôõng cuûa LAB coù aûnh höôûng ñeán khaû naêng khaùng laïi caùc vi sinh vaät coù haïi caùc daïng hoaït ñoäng khaùc cuûa chuùng. Ñöôïc theå hieän roõ qua baûng sau: Baûng 2.8: Kieåu hoaït ñoäng ñoái khaùng cuûa caùc saûn phaåm bieán döôõng Saûn phaåm bieán döôõng Kieåu hoaït ñoäng ñoái khaùng CO2 ÖÙc cheá quaù trình decarboxylation, giaûm tính thaám qua maøng ( khöû Carboxyl). Diacetyl Taùc ñoäng leân protein gaén arginine. Hydrogen peroxide Lactoperoxide Oxy hoùa caùc protein cô baûn. Acid lactic Acid lactic khoâng bò phaân huûy maø thaám vaøo maøng laøm giaûm pH noäi baøo. Noù cuõng lieân quan tôùi quaù trình bieán döôøng nhö: phosphoryl oxy hoùa. Vi sinh vaät chæ thò Giôùi thieäu veà vi sinh vaät chæ thò (indicator strains) Vi sinh vaät chæ thò laø nhöõng vi sinh vaät gaây beänh roái loaïn heä tieâu hoùa coù nguoàn goác thöïc phaåm. Ñeå choïn loïc Probiotic, ngöôøi ta kieåm tra khaû naêng öùc cheá cuûa caùc vi sinh vaät probiotic leân söï sinh tröôûng phaùt trieån cuûa vi sinh vaät chæ thò. Moät soá ví duï veà caùc vi sinh vaät chæ thò naøy laø: Baûng 2.9: Moät soá vi sinh vaät chæ thò ñieån hình söû duïng trong nghieân cöùu choïn loïc probiotic Vi sinh vaät chæ thò Nguoàn nghieân cöùu Bacillus cereus Clostridium perfringens Listeria spp Staphylococcus aureus Carherine B. Lewus, Thomas J. Montville, USA, 1991 Listeria monocytogenes Escherichia coli Salmonella N. Chauteu, I. Castellanos, A.M. Deschamps. France, 1992 Helicobacter pylori Clostridium difficile Campylobacter jejuni Escherichia coli J. Nowroozi, M. Mirzaii, M. Norouzi, Iran, 2004 Escherichia coli Klebsiella pneumonia Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis Pediococcus acidilaticii Lactobacillus helveticus Jin-Woo Kim, S.N. Rajagopal, USA, 2001 Samonella Enteritidis Escherichia coli Clostridium perfringens Magdalena Kizerwetter-Swida, Marian Binek, Poland, 2005 Shigella dysenteriae Escherichia coli Salmonela typhi Yersinia enterocolitica V. Padmanabha Reddy, M.D. Christopher, I. Sankara Reddy, 2006 Raát nhieàu nghieân cöùu choïn Escherichia coli laø vi sinh vaät chæ thò, ñaëc bieät laø chæ thò cho nhöõng beänh lieân quan tôùi thöïc phaåm hay ñöôøng tieâu hoùa. Chính vì vaäy, ñeà taøi naøy ñaõ thöïc hieän choïn loïc probiotic baèng caùch kieåm tra söï öùc cheá sinh tröôûng cuûa probiotic leân vi khuaån chæ thò Escherichia coli. Vi khuaån chæ thò gaây beänh ñöôøng ruoät - Escherichia coli [4], [35] Ñaëc ñieåm hình daïng, nuoâi caáy vaø tính chaát sinh hoùa Vi khuaån E.coli coù nhieàu trong töï nhieân, trong ñöôøng ruoät cuûa ngöôøi vaø gia suùc. Trong ñöôøng ruoät, chuùng hieän dieän nhieàu ôû ñaïi traøng neân coøn goïi laø vi khuaån ñaïi traøng. Vi khuaån E.coli nhieãm vaøo ñaát, nöôùc… töø phaân cuûa ñoäng vaät. Chuùng trôû neân gaây beänh khi gaëp ñieàu kieän thuaän lôïi cho söï phaùt trieån cuûa chuùng. Phaân loaïi khoa hoïc: Vöïc (Domain): Bacteria Ngaønh (Phylum): Proteobacteria Lôùp (Class): Gamma Proteobacteria Boä (Ordo): Enterobacteriales Hoï (Familia): Enterobacteriaceae Chi (Genus): Escherichia Loaøi (Species): E. coli Hình daïng: Vi khuaån thuoäc loaïi tröïc khuaån gram aâm, di ñoäng baèng tieâm mao quanh teá baøo, khoâng taïo baøo töû, loaïi coù ñoäc löïc thì coù bao nang, loaïi khoâng coù ñoäc löïc khoâng coù bao nang. Kích th öôùc trung bình (0,5µ x 1-3µ) hai ñaàu troøn. Moät soá doøng coù khuaån mao (pili). Ñaëc ñieåm nuoâi caáy vaø sinh hoùa: Laø loaïi hieáu khí hay hieáu khí tuøy nghi. Nhieät ñoä thích hôïp 370C nhöng coù theå moïc treân 400C, pH 7,4. Treân moâi tröôøng thaïch dinh döôõng TSA taïo khoùm troøn öôùt (daïng S) maøu traéng ñuïc. Ñeå laâu khoùm trôû neân khoâ nhaên (daïng R). Kích thöôùc khoùm 2-3mm. Treân thaïch maùu: Coù chuûng dung huyeát aù, coù chuûng khoâng dung huyeát aù. Treân moâi tröôøng chaån ñoaùn chuyeân bieät EMB (Eozin Methyl Blue) taïo khoùm tím aùnh kim. Treân moâi tröôøng Rapid’ E.coli taïo khuaån laïc maøu tím. Treân moâi tröôøng Endo, SS taïo khoùm hoàng ñoû. Treân caùc moâi tröôøng ñöôøng: Leân men lactose sinh hôi, glucose, galactose. Leân men khoâng ñeàu saccarose vaø khoâng leân men dextrin, glycogen. Caùc phaûn öùng sinh hoùa: Indol döông tính, Methyl Red (phaûn öùng MR) döông tính, Voges-Proskauer (phaûn öùng VP) aâm tính vaø Citrat aâm tính, H2S aâm tính, , Lysine decarboxylase döông tính. E. coli 157:H7 E. coli Hình 2.10: Giôùi thieäu veà hình thaùi Escherichia coli [44], [45], [46] Ñaëc ñieåm khaùng nguyeân vaø ñoäc toá Goàm 4 loaïi khaùng nguyeân: O, K, H, F vaø noäi ñoäc toá gaây tieâu chaûy, ngoaïi ñoäc toá gaây tan huyeát vaø phuø thuûng. Ñoäc toá cuûa E.coli: Loaïi E.coli coù giaùp moâ (khaùng nguyeân K) gaây ngoä ñoä maïnh hôn loaïi khoâng giaùp moâ. Khaùng nguyeân K coù 13 loaïi KA, KB, KL. Ví duï coâng thöùc khaùng nguyeân cuûa moät E.coli laø: O55K5H21F5. Noäi ñoäc toá ñöôøng ruoät: Goàm 2 loaïi chòu nhieät vaø khoâng chòu nhieät. Caû hai loaïi naøy ñeàu gaây tieâu chaûy. Loaïi chòu nhieät ST (Thermostable): goàm caùc loaïi STa, STb. Loaïi khoâng chòu nhieät LT (Thermolabiles): goàm caùc loaïi LT1, LT2. Nhöõng doøng E.coli saûn sinh ñoäc toá (ETEC) goàm nhieàu type huyeát thanh khaùc nhau nhöng thöôøng gaëp nhaát laø caùc type O6H16, O8H9, O78H12, O157. Moät soá beänh ñieån hình do E.coli gaây ra cho gia suùc vaø gia caàm [49] Beänh gaây cho gaø Nguyeân nhaân: Do vi khuaån E.coli gaây ra. Phöông thöùc laây truyeàn: Laây qua tröùng do cô theå meï bò nhieãm beänh. Laây qua ñöôøng hoâ haáp hoaëc da, nieâm maïc. Laây qua voû tröùng do nhieãm baån töø phaân hoaëc moâi tröôøng cuûa chuoàng traïi bò nhieãm truøng. Laây qua thöùc aên, nöôùc uoáng bò nhieãm truøng.  Trieäu chöùng vaø beänh tích: Gaø con môùi nôû: Roán vieâm, öôùt, coù maøu xanh. Buïng söng to, loøng ñoû khoâng tieâu. Tieâu chaûy. Gaø con töø 1-5 tuaàn tuoåi: gaø soát cao, uoáng nhieàu nöôùc, khoù thôû, boû aên, söng maët, vieâm keát maïc maét. Vieâm maøng bao tim, vieâm maøng buïng, vieâm maøng quanh gan laøm cho bao tim ñuïc, maøng buïng coù dòch vieâm, quanh gan thöôøng phuû moät lôùp Fibrin maøu traéng ñuïc. Vieâm tuùi khí. Vieâm phoåi Gaø ñeû: giaûm tyû leä ñeû, gaø aên keùm, gaày oám daàn, moät soá con coù daáu hieäu vieâm khôùp. Moå khaùm cho thaáy: oáng daãn tröùng bò vieâm, laùch vaø gan thöôøng söng to vaø sung huyeát Vieâm maøng bao tim Vieâm maøng buïng Gan söng to sung huyeát Vieâm phoåi Hình 2.11: Aûnh höôûng do E.coli gaây ra ôû gaø [49] Beänh gaây cho heo: Beänh nhieãm truøng huyeát do E.coli ôû heo con Nguyeân nhaân : thöôøng xaûy ra ôû caùc ñaøn khoâng aám aùp, veä sinh keùm, thieáu hoaëc ít söõa ñaàu, nöôùc uoáng khoâng toát, söõa meï keùm laøm giaûm hoaëc maát nhu ñoäng ruoät, coù theå do thieáu maùu, thieáu vitamin (A, PP, B5…). Vi khuaån E.coli seõ xaâm nhaäp vaø nhaân leân trong ruoät, vaøo maùu vaø gaây nhieãm truøng maùu. Trieäu chöùng: Heo bò nhieãm beänh trong voøng 12h sau khi sanh vaø coù theå cheát trong voøng 48 giôø vôùi caùc bieåu hieän sau: Heo beänh löôøi vaän ñoäng, ñöùng rieâng ra khoûi ñaøn, uû ruõ, ñuoâi ruõ xuoáng hoâng. Ñoâi khi oùi möûa, run raåy vaø coù theå cheát sau khi hoân meâ, co giaät (tyû leä cheát coù theå 80-90%). Beänh tích: Vieâm maøng ngoaøi vaø van tim, sung huyeát thaän, laù laùch, coù theå vieâm da vaø khôùp. Beänh tieâu chaûy phaân traéng ôû heo con: Beänh thöôøng xaûy ra ôû giai ñoaïn heo con sô sinh ñeán giai ñoaïn cai. Nguyeân nhaân: Beänh xaûy ra ôû caùc ñaøn uùm khoâng ñuû aám, veä sinh chuoàng vaø thöùc aên nöôùc uoáng keùm, thieáu hoaëc ít söõa ñaàu, söõa meï keùm, thieáu maùu, thieáu vitamin. Beänh thöôøng keát hôïp nhieät ñoä quaù thaáp, möa laïnh, aåm öôùt, stress… Trieäu chöùng: Heo tieâu chaûy phaân maøu vaøng traéng, traéng xaùm, veà sau coù maøu vaøng xanh, muøi hoâi. Heo maát nöôùc, gaày suùt nhanh, buù keùm, ñi laïi khoâng vöõng vaø noân ra söõa ñoâng khoâng tieâu. Heo con beänh yeáu ñi raát nhanh neáu khoâng ñieàu trò kieäp thôøi thì heo yeáu daàn, loâng xuø vaø cheát (tyû leä cheát coù theå leân ñeán 80-90%). Beänh tích: Cô theå maát nöôùc, oám, phaân dính beát vaøo haäu moân. Maïch maùu ruoät vaø haïch ruoät sung huyeát caáp tính. Ít thaáy vieâm daï daøy ruoät xuaát huyeát, daï daøy chöùa söõa khoâng tieâu. Heo con bò tieâu chaûy phaân traéng Heo con yeáu daàn roài cheát Hình 2.12: Aûnh höôûng cuûa beänh tieâu chaûy phaân traéng leân heo con [49] Beänh phuø thuûng treân heo cai söõa: Beänh thöôøng xaûy ra treân heo cai söõa hoaëc sau cai söõa 1-3 tuaàn tuoåi. Beänh thöôøng xaûy ra treân nhöõng con lôùn nhaát ñaøn sau laây qua nhöõng con khaùc. Nguyeân nhaân: Do chuoàng traïi veä sinh khoâng toát, aåm thaáp. E.coli coù saün trong cô theå keát hôïp vôùi stress khi taùch meï thì seõ nhaân leân nhanh trong ruoät. Thay ñoåi thöùc aên ñoät ngoät, heo con khoâng coøn ñöôïc buù do ñoù seõ aên quaù nhieàu thöùc aên daãn ñeán khoâng tieâu hoùa heát thöùc aên. Söï sinh beänh: vi khuaån E.coli gaây beänh phaùt trieån trong nieâm maïc ruoät laøm saûn sinh ñoäc toá phaù huûy mao maïch daãn ñeán phuø thuûng khaép cô theå. Trieäu chöùng: Beänh thöôøng xaûy ra ñoät ngoät ôû giai ñoaïn vaøi ngaøy ñeán moät tuaàn sau cai söõa vaø treân heo lôùn troäi cuûa baày. Luùc môùi nhieãm beänh heo coù daáu hieäu keùm aên, keùm linh hoaït. Theå quaù caáp heo cheát ñoät ngoät vaø tröôùc khi cheát coù trieäu chöùng phuø. ÔÛ theå caáp tính, beänh dieãn bieán 2-3 ngaøy. Ngaøy ñaàu heo boû aên, sang ngaøy thöù 2 hoaëc ngaøy thöù 3 coù trieäu chöùng phuø. Trieäu chöùng phuø thuûng xuaát hieän chuû yeáu ôû vuøng ñaàu nhö: mí maét, vuøng haàu, goác tai, ñoâi khi söng caû maët. Phuø naõo, naõo bò cheøn eùp bôûi dòch thoaùt ra töø maïch maùu neân gaây nhuõn naõo daãn ñeán trieäu chöùng thaàn kinh nhö: co giaät kieåu bôi cheøo, ñi xieâu veïo, hay ñaâm ñaàu vaøo töôøng, ñi laïi khoâng ñònh höôùng. Do thuûy thuûng ôû thanh quaûn neân hay keâu khaøn gioáng tieáng chim. Nhieät ñoä khoâng taêng, sung huyeát ôû nieâm maïc vaø xanh tím ôû tai, moõm, choùp ñuoâi…Heo raát khoù thôû tröôùc khi cheát. Beänh tích: Vuøng môõ lieân keát döôùi da bò thuûy thuûng. Haïch vuøng beïn, haïch ruoät bò thuûy thuûng, xoang buïng chöùa dòch phuø, phuø thuûng ôû maøng trong ruoät. Thuûy thuûng mí maét, loã tai, ôû quanh tim, thanh quaûn. Baày heo beänh chæ naèm vaø coù tö theá ngoài kieåu choù Phuø thuûng ôû keát traøng vaø chöùa nhieàu dòch thuûy thuûng Xuaát huyeát ruoät non, phuø maøng treo ruoät vaø söng haïch maøng treo ruoät Hình 2.13: Aûnh höôûng cuûa beänh phuø thuûng treân heo cai söõa [49] Chöông 3: Vaät Lieäu & Phöông Phaùp Nghieân Cöùu Vaät lieäu Ñòa ñieåm thöïc hieän ñoà aùn Ñoà aùn ñöôïc thöïc hieän taïi heä thoáng phoøng thí nghieäm Khoa Moâi Tröôøng vaø Coâng Ngheä Sinh Hoïc. Tröôøng Ñaïi Hoïc Kyõ Thuaät Coâng Ngheä Thaønh Phoá Hoà Chí Minh. Heä thoáng phoøng goàm coù: Phoøng 15: phoøng thí nghieäm hoùa Phoøng 14: phoøng thí nghieäm vi sinh Phoøng 9 : phoøng thí nghieäm thöïc vaät Gioáng vi sinh vaät Vi khuaån leân men lactic do sinh vieân Nguyeãn Thò Bích Thuøy cung caáp töø keát quaû cuûa ñoà aùn toát nghieäp khoùa 05 - lôùp 05DSH - Khoa Moâi Tröôøng vaø Coâng Ngheä Sinh Hoïc – Tröôøng ÑH Kyõ Thuaät Coâng Ngheä TPHCM: “Phaân laäp caùc vi khuaån lactic coù nguoàn goác thöïc phaåm vaø döôïc phaåm mang hoaït tính probiotic” Vi khuaån E.coli M15 ñöôïc cung caáp töø Ñaïi Hoïc Y döôïc TP HCM. Baûng 3.1: Caùc chuûng ñöôïc kieåm tra hoaït tính probiotic Sản phẩm Teân saûn phaåm Kí hieäu caùc chuûng phaân laäp Söõa chua Söõa ñeå chua töï nhieân 1 S1a, S1b Söõa ñeå chua töï nhieân 2 S2 Söõa ñeå chua töï nhieân 3 S3 Söõa ñeå chua töï nhieân 4 S4 Kefir leân men töø PTN 1 S5 Kefir leân men töø PTN 2 S6 Nem Nem 1 N1 Nem 3 N3 Nem 4 N4 Nem 5 N5 Döa muoái Döa muoái 2 D2 Döa muoái 3 D3 Caø muoái chua Caø muoái C1 Cheá phaåm döôïc Biolactyl T1a,T1b, T1c Biosubtyl DL T2c L-Bio-M T3c Lactomin plus T4c Probio T7b Ybio T8b Thaønh phaàn vi sinh trong 1 goùi cheá phaåm goàm: + L-Bio: Lactobacillus acidophilus + Biolactyl: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus bungaricus, Streptococcus lactic. + L-Bio_M: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcus faecalis. + Lactomin plus: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcus faecalis. + Antibio Granules: Lactobacillus acidophilus. + Biosubtyl DL: Lactobacillus acidophilus, Bacillus subtillis. + Probio: Lactobacillus acidophilus. + Ybio: Lactobacillus acidophilus. Hoùa chaát Moâi tröôøng Moâi tröôøng Pepton Water: taêng sinh khoái vi khuaån E.coli Moâi tröôøng TSA (Tripton soya agar): giöõ gioáng vi khuaån E.coli Moâi tröôøng BHI (Brain Heart Infusion ): moâi tröôøng phaùt trieån cuûa E.coli söû duïng trong thí nghieäm thöû hoaït tính khaùng khuaån cuûa LAB BHI Broth 1000ml Beef heart infusion 250.0g Calf brain in fusion 200.0g Proteose peptone 10.0g NaCl 5.0g Na2HPO4.12H2O 2.5g Glucose 2.0g pH 7.4 ± 0.2, 250C BHI thaïch, boå sung 2% agar Moâi tröôøng MRS (DeMan, Rogosa, Sharpe) Broth: moâi tröôøng taêng sinh LAB MRS Broth 1000ml Glucose 20.0g Peptone 10.0g Beef extract 8.0g Yeast extract 4.0g CH3COONa 3.0g K2HPO4.3H2O 2,623g Mg2SO4.7H2O 0.2g MnSO4.4H2O 0.03786g Triamonium citrate 4.0g Tween 80 1ml Moâi tröôøng MRS thaïch: moâi tröôøng trong thí nghieäm thöû hoaït tính khaùng khuaån cuûa LAB: MRS loûng boå sung 2% agar. Hoùa chaát Coàn 700, 960 Caùc hoùa chaát pha moâi tröôøng dinh döôõng Duïng cuï vaø thieát bò Duïng cuï OÁng nghieäm coù naép OÁng nghieäm khoâng naép Ñóa petri Coác 50ml, 100ml, 250ml, 1000ml Erlen 250ml, 500ml Pitpet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml Pipet man 10µl-100 µl, 20 µl-200 µl, 100 µl-1000 µl Ñaàu típ 100 µl, 1000 µl OÁng ly taâm eppendorf OÁng ñuïc loã Giaáy thaám Que caáy, que gaép, que taêm boâng, que trang Thöôùc ño cm, mm Ñuõa thuûy tinh Giaù ñeå oáng nghieäm, roå nhöïa Boâng thaám nöôùc Boâng khoâng thaám nöôùc Bao nilon haáp, daây thun, giaáy goùi Thieát bò Tuû caáy vi sinh (Brlad France) Tuû uû (Memmert Germany) Tuû saáy (Memmert Germany) Tuû laïnh Toshiba Autolave (Huxky Ñaøi Loan) Maùy ño quang (Hach) Maùy ly taâm (Tuttligen Germany) Maùy ño pH (Hach-Germany) Caân phaân tích (Orbital Germany) Beáp töø (Billy – England) Maùy nöôùc caát (Branstead USA) Phöông phaùp nghieân cöùu Chuaån bò gioáng vi sinh vaät Chuaån bò gioáng vi khuaån leân men lactic: Gioáng vi khuaån leân men lactic ñöôïc cung caáp töø oáng nghieäm thaïch nghieäm MRS agar, ñöôïc baûo quaûn trong tuû laïnh 40C. Chuaån bò moâi tröôøng: Pha moâi tröôøng MRS loûng Phoái vaøo moãi oáng nghieäm 10ml MRS loûng Ñaäy naép hoaëc laøm nuùt boâng, cho vaøo bòch haáp Ñem haáp khöû truøng baèng Autoclave1200C, 15 phuùt, 1 atm Nuoâi caáy LAB: Moïi thao taùc ñöôïc thöïc hieän sau khi ñaõ saùt truøng duïng cuï, tuû caáy, vaøo thaùo taùc döôùi ngoïn löûa ñeøn coàn. Laáy sinh khoái, caáy chuyeån vaøo oáng nghieäm chöùa MRS loûng. Quaán parafin quanh mieäng oáng nghieäm ñeå nuoâi caáy kò khí. Ñem uû ôû 370C töø 16-24h. Chuaån bò gioáng E.coli: Gioáng LAB ñöôïc cung caáp töø oáng nghieäm thaïch nghieäm MRS agar, ñöôïc baûo quaûn trong tuû laïnh 40C. Chuaån bò moâi tröôøng: Pha moâi tröôøng Peptone Water Phoái vaøo moãi oáng nghieäm 10ml Peptone Water. Ñaäy naép hoaëc laøm nuùt boâng, cho vaøo bòch haáp Ñem haáp khöû truøng baèng Autoclave1200C, 15 phuùt, 1 atm Nuoâi caáy E.coli taêng sinh khoái: Moïi thao taùc ñöôïc thöïc hieän sau khi ñaõ saùt truøng duïng cuï, tuû caáy, vaøo thaùo taùc döôùi ngoïn löûa ñeøn coàn. Laáy sinh khoái, caáy chuyeån vaøo oáng nghieäm chöùa Peptone Water. Ñem uû hieáu khí 24h, 370C Söû duïng E.coli sau khi nuoâi caáy qua ñeâm pha loaõng 10-2 ( töông ñöông 10-5 tb/ml) ñeå kieåm tra hoaït tính khaùng khuaån cuûa caùc vi khuaån lactic. Chuaån bò moâi tröôøng test Moâi tröôøng BHI agar (2%), Moâi tröôøng MRS agar (2%): Pha moâi tröôøng theâm agar 2% treân moãi lít moâi tröôøng. Ñun soâi moâi tröôøng cho agar tan ñeàu, cho vaøo bình Erlen. Laøm nuùt boâng, bòt laïi baèng nilon hoaëc giaáy baïc. Ñóa petri, röûa saïch, saáy khoâ, goùi giaáy, boû bòch. Ñem haáp khöû truøng baèng Autoclave, 1200C, 15 phuùt, 1 atm. Ñoå ñóa khi moâi tröôøng ôû 60-700C, moãi ñóa ñoå khoaûng 15ml Ñeå agar ñoâng, boû vaøo tuû uû qua ñeâm ñeå kieåm tra vaø loaïi boû ñóa bò nhieãm. Baûo quaûn trong tuû laïnh 40C. Tröôùc khi söû duïng boû vaøo saáy 600C, 15p Moâi tröôøng BHI loûng (0.7%) Pha moâi tröôøng theâm agar 0.7 % treân moãi lít moâi tröôøng. Ñun soâi moâi tröôøng cho agar tan ñeàu. Phoái vaøo 7ml/ oáng nghieäm. Laøm nuùt boâng hoaëc ñaäy naép oáng nghieäm Ñem haáp khöû truøng baèng Autoclave, 1200C, 15 phuùt, 1 atm. Ñeå nguoäi, baûo quaûn ôû tuû laïnh 40C. Moâi tröôøng peptone water Pha moâi tröôøng Phoái 8ml/oáng nghieäm Laøm nuùt boâng hoaëc ñaäy naép oáng nghieäm Ñem haáp khöû truøng baèng Autoclave, 1200C, 15 phuùt, 1 atm. Ñeå nguoäi, baûo quaûn ôû tuû laïnh 40C. Boá trí thí nghieäm Thí nghieäm kiểm tra khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp Spot on lawn Nguyeân taéc: döïa vaøo söï ñoái khaùng tröïc tieáp giöõa vi khuaån leân men lactic vaø vi khuaån chæ thò. Taïo ñieàu kieän moâi tröôøng thích hôïp cho caû hai vi khuaån phaùt trieån. Chuaån bò: Dòch nuoâi caáy E.coli qua 21h. Pha loaõng 10-2 ñöôïc noàng ñoä söû duïng laø 105 teá baøo/ml Dòch nuoâi caáy LAB trong MRS loûng 18- 24h, ôû 370C Ñóa moâi tröôøng MRS agar, saáy khoâ ôû 600C. Moâi tröôøng BHI (0.7% agar) giöõ ôû nhieät ñoä 500C Thöôùc ño voøng khaùng (cm, mm) Caùch thöïc hieän nhö sau: Ñoå ñóa mt MRS (2% agar) Nhoû 10µl LAB (nuoâi caáy kò khí 24h, 370C) leân maët thaïch uû (1) E.coli nuoâi caáy taêng sinh qua 21h Huùt 1ml dòch nuoâi caáy vaøo 7ml BHI (0.7% agar). (2) Ñoå hoãn hôïp VK chæ thò + BHI agar (2) leân beà maët thaïch MRS (1) UÛ hieáu khí 24-48h, 370C Kieåm tra söï taïo voøng khaùng. Ño ñöôøng kính voøng khaùng Ñoái chöùng: thay vì gioït dòch chöùa LAB, gioït MRS loûng. Laøm ñoái chöùng khoâng coù söï ñoái khaùng. Thí nghieäm kiểm tra khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp Agar spot test (khueách taùn treân beà maët thaïch) Nguyeân taéc: Döïa treân söï ñoái khaùng tröïc tieáp cuûa vi khuaån leân men lactic vôùi vi khuaån chæ thò ngay taïi vò trí nhoû vi khuaån leân men lactic. Chuaån bò: Dòch nuoâi caáy E.coli qua 21h. Pha loaõng 10-2 ñöôïc noàng ñoä söû duïng laø 105 teá baøo/ml Dòch nuoâi caáy LAB trong MRS loûng 18- 24h, ôû 370C Ñóa moâi tröôøng BHI agar, saáy khoâ ôû 600C. Caùch thöïc hieän: Traûi 0.1 ml dòch chöùa E.coli moâi tröôøng BHI agar (2%) Nhoû 10µl dòch nuoâi caáy LAB leân beà maët ñóa UÛ hieáu khí, 370C, 18-24h Kieåm tra söï taïo voøng khaùng. Ño ñöôøng kính voøng khaùng Ñoái chöùng: nhoû gioït moâi tröôøng MRS loûng leân ñóa, ñaùnh daáu vò trí. So saùnh vôùi caùc vò trí gioït chöùa LAB. Thí nghieäm xaùc ñònh khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp disc diffusion assay (khueách taùn qua voøng giaáy loïc) Chuaån bò: Giaáy loïc ñöôøng kính 8mm Moâi tröôøng Peptone water 8ml moãi oáng nghieäm Dòch nuoâi caáy E.coli (21h, 370C) . Pha loaõng 10-2 ñöôïc noàng ñoä söû duïng laø 105 teá baøo/ml Dòch nuoâi caáy LAB trong MRS loûng 18- 24h, ôû 370C Caùch thöïc hieän: Ñoå ñóa mt BHI agar (2%) Traûi 0.1 ml dòch chöùa E.coli Ly taâm dòch nuoâi caáy LAB Cho 20µl dòch ly taâm Ñaët giaáy thaám UÛ hieáu khí 24h, 370C Kieåm tra söï taïo voøng khaùng. Ño ñöôøng kính voøng khaùng LAB sau khi nuoâi caáy trong MRS loûng qua ñeâm 18-24h, laáy 1,2ml dòch nuoâi caáy cho vaøo oáng effendorf, ñem ly taâm 14000prm trong 10 phuùt. Ñaët naêm mieáng giaáy thaám treân beà maët agar. Ñoái chöùng: mieáng ôû trung taâm chæ thaám vaøo MRS broth Giaáy thaám phaûi ñöôïc khöû truøng tröôùc khi söû duïng. Duøng keïp khöû truøng qua ngoïn löûa ñeøn coàn ñeå gaép giaáy thaám. Thí nghieäm kiểm tra khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp Agar well diffusion assay (khueách taùn qua gieáng thaïch) Chuaån bò: Dòch nuoâi caáy E.coli (21h, 370C) . Pha loaõng 10-1, 10-2 ñöôïc noàng ñoä söû duïng laø 105-106 teá baøo/ml. Khaûo saùt hai noàng ñoä naøy Dòch nuoâi caáy LAB trong MRS loûng 18- 24h, ôû 370C. Ñem ly taâm 14000 voøng/ phuùt, trong 10 phuùt. Loaïi boû sinh khoái. OÁng ñoàng ñuïc loã ñöôøng kính 8mm. Khaûo saùt ñoä daøy moâi tröôøng laø 5mm töông öùng vôùi 25ml moâi tröôøng/ñóa, 3mm töông öùng vôùi 15ml moâi tröôøng/ñóa. Caùch thöïc hieän: Traûi 0.1 ml dòch chöùa E.coli moâi tröôøng BHI agar (2%) Ñuïc loå treân thaïch ñöôøng kính 8mm Laáy 0.1ml dòch nuoâi caáy LAB (nuoâi caáy kò khí 24h, 370C) vaøo loã. UÛ hieáu khí, 370C, 18-24h Kieåm tra söï taïo voøng khaùng. Ño ñöôøng kính voøng khaùng Quaù trình ñuïc loã: Môû naép ñóa petri, duøng oáng ñoàng ñöôøng kính 8mm, khöû truøng treân ngoïn löûa ñeøn coàn, ñeå nguoäi, ñuïc 5 loã treân thaïch. Laáy que gaép, khöû truøng, ñeå nguoäi, gaép thaïch ra khoûi taïo gieáng thaïch. Hô khöû truøng naép petri, ñaäy naép petri. Ñoái chöùng: gieáng ôû trung taâm ñóa, cho 0.1ml MRS broth ñeå ñoái chöùng. 3.2.3.4 Thí nghieäm xaùc ñònh khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp Turbidometric assay (ño ñoä ñuïc) Nguyeân taéc cuûa phöông phaùp ño ñoä ñuïc: Baèng maùy quang phoå ño maät ñoä teá baøo vi sinh vaät coù trong dòch nuoâi caáy ôû böôùc soùng 600nm. Thí nghieäm ñöôïc tieán haønh vôùi 2 nghieäm thöùc: Nghieäm thöùc 1: xaùc ñònh hoaït tính döïa treân söï öùc cheá vi khuaån chæ thò E.coli baèng caùc chaát ñöôïc sinh ra trong quaù trình trao ñoåi chaát cuûa caùc chuûng LAB. Nghieäm thöùc 2: xaùc ñònh hoaït tính treân söï öùc cheá vi khuaån chæ thò E.coli baèng caùc chaát ñöôïc sinh ra trong quaù trình phaùt trieån cuûa caùc chuûng LAB nhöng ñaõ loaïi boû yeáu toá acid lactic baèng caùch trung hoøa bằng dung dòch NaOH 1N. Chuaån bò: Dòch nuoâi caáy E.coli (21h, 370C) . Pha loaõng 10-2 ñöôïc noàng ñoä söû duïng laø 105 teá baøo/ml Dòch nuoâi caáy LAB trong MRS loûng 18- 24h, ôû 370C. Nghieäm thöùc 1: Ñem ly taâm dòch nuoâi caáy LAB 14000 voøng/ phuùt, trong 10 phuùt. Loaïi boû sinh khoái. Nghieäm thöùc 2: Trung hoøa dòch nuoâi caáy veà pH 6 baèng NaOH 1N, tieán haønh thanh truøng 800C trong 10 phuùt. Ñem ly taâm 14000 voøng/ phuùt, trong 10 phuùt. Loaïi boû sinh khoái. Coâng thöùc tính nhö sau: %OD= Vôùi: OD: laø giaù trò ño OD cuûa oáng coù chöùa hôïp chaát khaùng khuaån. ODdc: laø giaù trò ño OD cuûa oáng ñoái chöùng khoâng coù chöùa hôïp chaát khaùng khuaån. Caùch thöïc hieän: Dòch nuoâi caáy E.coli nuoâi caáy taêng sinh qua 24h, pha loaõng 10-2 Laáy 1ml 1ml dòch ly taâm LAB Cho vaøo 8ml BHI+1ml MRS Broth UÛ hieáu khí 24h, 370C Ño OD Cho vaøo 8ml BHI UÛ hieáu khí 24h, 370C Ño OD So saùnh ñoä ñuïc, keát luaän Coù theå laäp theo baûng sau: Nghieäm Thöùc 1 Nghieäm Thöùc 2 OÁng kieåm tra hoaït tính 1ml dòch nuoâi caáy E.coli qua 21h, noàng ñoä 105 teá baøo/ml. + 1ml dòch ly taâm moâi tröôøng nuoâi caáy LAB sau 18-24h. + 8ml moâi tröôøng peptone water. 1ml dòch nuoâi caáy E.coli qua 21h, noàng ñoä 105 teá baøo/ml. + 1ml dòch ly taâm ñaõ trung hoøa acid baèng NaOH 1N. + 8ml moâi tröôøng peptone water. OÁng ñoái chöùng 1ml dòch nuoâi caáy E.coli qua 21h, noàng ñoä 105 teá baøo/ml. + 1ml MRS loûng + 8ml moâi tröôøng peptone water. Chöông 4: Keát Quaû vaø Bieän Luaän Kieåm tra khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp Spot on lawn Phöông phaùp naøy coù daïng gioáng chieác baùnh Sandwich vôùi 2 maët keïp laø moâi tröôøng MRS agar vaø BHI agar, khaû naêng khaùng vi sinh vaät chæ thò döïa treân söï tieáp xuùc tröïc tieáp giöõa chuùng vôùi vi khuaån lactic. Theo nghieân cöùu cuûa Carherine B. Lewus vaø Thomas J. Montville (1991) voøng khaùng khuaån theå hieän raát roõ raøng vôùi khaû naêng laëp laïi cao vaø nhanh choùng. Cho ñến gần ñaây, Bilge H. Cadirci vaø Sumru Citak (2005) nhận đñịnh rằng phöông phaùp naøy döôøng nhö cho keát quaû toát nhaát. Tuy nhieân, hoaït tính khaùng vi sinh vaät ôû ñaây laø hoaït tính toång hôïp cuûa taát caû caùc saûn phaåm cuûa quaù trình trao ñoåi chaát cuûa vi khuaån lactic nhö: acid lactic, acid acetic, diacetyl, bacteriocin…Vì vaäy, ñeå xaùc ñònh hoaït tính rieâng cuûa töøng chaát khaùng vi sinh vaät cuûa vi khuaån lactic caàn coù caùc phöông phaùp boå sung. Khi thöïc hieän phöông phaùp naøy moät soá khoù khaên thöôøng gaëp laø: Ñeå thöïc hieän kieåm tra, ta phaûi traûi moät lôùp moûng moâi tröôøng MRS, roài nhoû moät löôïng nhoû vi khuaån LAB leân treân beà maët agar. Sau ñoù, nhoû tieáp 1 gioït moâi tröôøng BHI (0,7% agar) leân treân vi khuaån lactic ñeå coá ñònh chuùng treân beà maët thaïch. Neáu löôïng moâi tröôøng BHI nhoû leân quaù lôùn seõ röûa troâi vi khuaån lactic. Ñeå traûi moät lôùp moûng moâi tröôøng BHI 0,7 % agar chöùa vi khuaån chæ thò E. coli leân treân beà maët MRS agar ñaõ nhoû vi khuaån lactic, ta caàn hoùa loûng moâi tröôøng BHI ôû nhieät ñoä 500 C. ÔÛ nhieät ñoä naøy, E.coli deã bò toån thöông vaø BHI deã hoøa laãn vôùi MRS agar. Ngöôïc laïi, neáu haï nhieät ñoä thaáp hôn, moâi tröôøng deã ñoâng, khoâng taïo ñöôïc lôùp moûng ñeàu treân MRS agar nhö mong muoán. BHI agar töø oáng nghieäm ñöôïc chuyeån sang ñóa petri baèng caùch roùt tröïc tieáp treân ngoïn löûa ñeøn coàn, nguy cô bò nhieãm vi khuaån hay baøo töû töø khoâng khí raát cao. MRS agar sau khi ñoå ñóa saáy khoâ 15 phuùt ñeå beà maët ñóa khoâ, khoâng bò ñoïng nöôùc traùnh bò nhieãm do nöôùc. Qua thöû nghieäm phöông phaùp naøy, vì nhöõng khoù khaên gaëp phaûi cuõng nhö ñieàu kieän taïi phoøng thí nghieäm khoâng thuaän lôïi ñeå thöïc hieän, phöông phaùp naøy bò taïm ngöng ñeå tieán haønh phöông phaùp khaùc. Kiểm tra khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp Agar spot test (khueách taùn treân beà maët thaïch) Töông töï nhö phöông phaùp treân, ñaây laø phöông phaùp kieåm tra khaû naêng khaùng vi sinh vaät chæ thò döïa treân söï tieáp xuùc tröïc tieáp giöõa chuùng vôùi vi khuaån lactic. Tuy nhieân, ôû ñaây moâi tröôøng BHI ñöôïc traûi tröôùc leân ñóa Petri vaø caáy gioáng vi sinh vaät chæ thò. Ngaøy hoâm sau vi khuaån lactic nuoâi tröôùc trong moâi tröôøng MRS môùi ñöôïc nhoû leân maët thaïch seõ taïo voøng khaùng khuaån xung quanh gioït vi khuaån lactic. Töông töï nhö phöông phaùp thöù nhaát, phöông phaùp naøy cuõng nhaèm ñaùnh giaù khaû naêng khaùng vi sinh vaät cuûa taát caû caùc saûn phaåm cuûa quaù trình trao ñoåi chaát nhöng quy trình thöû nghieäm ñôn giaûn hôn. Tuy nhieân vaãn gaëp khoù khaên laø: Khi löôïng vi khuaån lactic quaù ít seõ khoâng ñuû öùc cheá vi sinh vaät chæ thò Löôïng vi khuaån lactic quaù lôùn seõ traøn treân maët thaïch hoøa laãn vôùi E.coli neân khoâng nhaän ñöôïc keát quaû khaùng. Nhö vaäy ñoái vôùi phöông phaùp 1 vaø 2 noàng ñoä vi khuaån lactic trong dung dòch MRS vaø noàng ñoä vi sinh vaät chæ thò caàn ñöôïc toái öu hoùa ñeå ñaït keát quaû thöû nghieäm mong muoán. C1 Dòch nhoû LAB bò traøn treân beà maët thaïch N3 Löôïng nhoû LAB quaù ít T7b Löôïng nhoû LAB quaù ít T8b Dòch nhoû LAB bò traàn treân beà maët thaïch Hình 4.1: Thử nghiệm khoâng thaønh coâng phöông phaùp Agar spot test Nhö vaäy, taïi phoøng thí nghieäm tröôøng Ñaïi Hoïc Kyõ Thuaät Coâng Ngheä, phöông phaùp naøy bò taïm ngöng ñeå tieán haønh phöông phaùp khaùc. Kiểm tra khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp Disc diffusion assay (khueách taùn qua voøng giaáy loïc) Khaùc vôùi hai phöông phaùp treân, trong phöông phaùp naøy vi khuaån lactic khoâng ñoái khaùng tröïc tieáp vi sinh vaät chæ thò maø chæ coù saûn phaåm trao ñoåi chaát cuûa chuùng khueách taùn qua moâi tröôøng thaïch aûnh höôûng leân taêng tröôûng cuûa vi sinh vaät chæ thò. Trong taøi lieäu phöông phaùp naøy thöôøng ñöôïc tieán haønh song song vôùi moät trong nhöõng phöông phaùp treân. AÙp duïng phöông phaùp naøy ta coù theå taùch rôøi aûnh höôûng cuûa töøng yeáu toá khaùng khuaån. Ví duï nhö taùc duïng khaùng khuaån cuûa acid höõu cô coù theå loaïi tröø nhôø trung hoøa dòch nuoâi caáy sau khi ly taâm loaïi boû teá baøo; taùc duïng cuûa H2O2 ñöôïc loaïi tröø nhôø xöû lyù dòch ly taâm vôùi enzyme catalase…. Baèng caùch ñoù coù theå ñaùnh giaù hoaït tính khaùng khuaån cuûa bacteriocin do vi khuaån lactic toång hôïp. Khueách taùn qua voøng giaáy loïc (disc diffusion assay) töông töï phöông phaùp cuûa Kirby Bauer thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå kieåm tra tính maãn cuûa vi sinh vaät ñoái vôùi khaùng sinh [9]. Voøng giaáy thaám ñöôïc ñaët leân beà maët ñóa Petri ñaõ cấy vi sinh vật chỉ thị roài thaám dòch nuoâi caáy vi khuaån lactic li taâm roài. Tuy nhieân, khi thöû nghieäm phöông phaùp naøy ñaõ khoâng thaønh coâng. Keát quaû theå hieän theo nhö hình 4.4. T1a T8b C1 T7b Hình 4.2. Thöû ngieäm khoâng thaønh coâng phöông phaùp Disc diffusion assay Töø keát quaû naøy coù moät soá nhaän xeùt nhö sau: Ñoä haáp thuï caùc chaát khaùng khuaån thu ñöôïc töø dòch ly taâm bò haïn cheá ôû möùc 20µl, cho thaáy löôïng chaát ñöôïc duøng ñeå thöû hoaït tính laø quaù ít. Caùc chaát khaùng khuaån ñöôïc thaám trong giaáy loïc coù söï khueách taùn leân moâi tröôøng thaïch laø khoâng cao. Caû hai nhaän ñònh naøy ñeàu giaûi thích cho keát quaû khoâng thaønh coâng. Tuy phöông phaùp naøy coù khaû naêng taùch rieâng kieåm tra ñònh tính caùc chaát khaùng khuaån (acid lactic, H2O2, bacteriocin…), nhöng qua thöû nghieäm nhaän thaáy noàng ñoä chaát khaùng khuaån ñöôïc sinh ra laø khoâng cao, vaø phöông phaùp naøy haïn cheá veà theå tích ñöa vaøo giaáy loïc. Vì vaäy phöông phaùp khoâng mang laïi yù nghóa cao trong vieäc taùch rieâng ñònh tính töøng chaát. Nhö vaäy, taïi phoøng thí nghieäm tröôøng Ñaïi Hoïc Kyõ Thuaät Coâng Ngheä, phöông phaùp naøy bò taïm ngöng ñeå tieán haønh thöû nghieäm phöông phaùp khaùc. Kiểm tra khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp Agar Well Diffusion Assay (khueách taùn qua gieáng thaïch) Phöông phaùp Agar well diffusion assay hay coøn goïi laø phöông phaùp khueách taùn qua gieáng thaïch, vi sinh vaät chæ thò ñöôïc traûi moät lôùp moûng treân beà maët moâi tröôøng BHI agar, cho dòch nuoâi caáy LAB (coù theå laáy dòch ly taâm) vaøo gieáng, ngay taïi gieáng chöùa LAB phaùt trieån vaø tieát caùc chaát ñoái khaùng vôùi vi khuaån chæ thò, ngaên caûn söï phaùt trieån cuûa vi khuaån chæ thò xung quanh gieáng. Töông töï nhö phöông phaùp treân, khueách taùn qua gieáng thaïch (well diffusion assay) laø phöông phaùp ñaùnh giaù aûnh höôûng caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát cuûa vi khuaån lactic leân vi sinh vaät chæ thò maø khoâng caàn söï tieáp xuùc tröïc tieáp giöõa chuùng, cuõng nhö khaû naêng ñaùnh giaù rieâng taùc ñoäng cuûa bacteriocin sau khi loaïi boû taùc ñoäng cuûa caùc yeáu toá khaùc nhö acid höõu cô, H2O2…. Phöông phaùp naøy coù öu ñieåm so vôùi phöông phaùp treân laø gieáng thaïch coù khaû naêng chöùa moät theå tích dòch ly taâm lôùn hôn ñaùng keå so vôùi dòch thaám vaøo giaáy loïc, neân khaû naêng khueách taùn caùc chaát khaùng khuaån vaøo moâi tröôøng thaïch cuõng cao hôn so vôùi phöông phaùp dics diffusion assay. Ñeå ño ñöôïc voøng khaùng khuaån thöïc söï baèng phöông phaùp naøy, beà daøy moâi tröôøng BHI trong ñóa Petri caàn ñöôïc chuaån hoùa. Moâi tröôøng quaù daøy ngaên caûn söï khueách taùn cuûa caùc chaát khaùng khuaån trong thaïch. Noàng ñoä vi khuaån chæ thò cuõng aûnh höôûng leân ñoä trong suoát cuûa voøng khaùng khuaån. Ñieàu naøy cho thaáy söï töông öùng giöõa chaát khaùng khuaån vôùi maät ñoä teá baøo vi khuaån chæ thò. Sau khi thöû nghieäm phöông phaùp vôùi ñoä daøy khaùc nhau (5mm, 3mm), ñoä daøy 3mm töông öùng vôùi 15 ml moâi tröôøng thaïch laø thích hôïp. Töông töï noàng ñoä vi khuaån chæ thò ñeå nhaän roõ voøng khaùng khuaån laø 105 teá baøo/ml. Hình 4.3 theå hieän roõ keát quaû thu ñöôïc. Moâi tröôøng daøy (5mm) vaø E.coli 106 teá baøo/ml Moâi tröôøng thích hôïp (3mm) vaø E.coli 105 teá baøo/ml Hình 4.3. So saùnh keát quaû C1 ôû hai ñóa moâi tröôøng vôùi ñoä daøy vaø noàng ñoä vi khuaån chæ thò khaùc nhau Vieäc chuaån hoùa cho phöông phaùp naøy coøn can phaûi thöïc hieän chuaån hoùa noàng ñoä vi khuaån leân men lactic trong MRS loûng. Khi caáy chuyeån vaøo moâi tröôøng loûng löôïng sinh khoái laáy khoâng ñoàng ñeàu. Theo ñoù sau khi nuoâi caáy qua 18-24h, löôïng teá baøo taêng sinh trong moâi tröôøng cuõng khaùc nhau. Khi söû duïng cuøng moät theå tích dòch nuoâi caáy cuûa caùc chuûng ñeå tieán haønh thí nghieäm noàng ñoä teá baøo /ml seõ khoâng ñöôïc coá ñònh, vì vaäy maø keát quaû coù ñoä tin caäy thaáp hôn. Vieäc chuaån hoùa naøy ñöôïc thöïc hieän döïa treân döïng ñöôøng chuaån veà noàng ñoä teá baøo vi khuaån. Khi tieán haønh ño voøng khaùng ôû ñóa petri, phöông phaùp ño raát thoâ sô, chæ döïa treân maét thöôøng vaø duøng thöôùc mm ñeå ño. Keát quaû naøy coù khoâng ñoä tin caäy cao, chöa coù ñoä nhaïy trong keát quaû, vì theá caàn phaûi nghieân cöùu moät phöông phaùp khaùc coù ñoä nhaïy cao hôn. T1a (d= 17 mm) T7b (d= 17 mm) N3 (d= 16 mm) C1 (d=18mm) Hình 4.4: Voøng khaùng cuûa nhöõng chuûng ñieån hình Hai möôi hai chuûng vi khuaån lactic ñöôïc kieåm tra hoaït tính khaùng khuaån toång quaùt nhôø phöông phaùp khueách taùn qua gieáng thaïch vôùi ñoä daøy moâi tröôøng vaø noàng ñoä E.coli thích hôïp laø: ñoä daøy 3mm vaø noàng ñoä 105 teá baøo/ml. Ñöôøng kính voøng khaùng khuaån ñöôïc ño bao goàm caû ñöôøng kính gieáng thaïch (Hình 4.2 vaø Baûng 4.1). Ta coù coâng thöùc tính beà roäng vaønh khaùng khuaån: Beà roäng vaønh khaùng khuaån = [d voøng khaùng – d gieáng thaïch]/2 (mm) Schillinger vaø Lucke (1989) cho raèng khi beà roäng vaønh khaùng khuaån > 1 mm thì khaû naêng khaùng cuûa caùc vi khuaån lactic ñoái vôùi vi sinh vaät chæ thò coi nhö laø maïnh; khi giaù trò naøy naèm trong khoaûng 0,5 – 1 mm töông öùng khaû naêng khaùng trung bình. Coøn theo nghieân cöùu cuûa V. Rosenfeldt Nielsen, C. N. Jacobsen, A. E. Hayford, P. L. Molller, K. F. Michaelsen, A. Perrehaard, B. Sandstrom, M. Tvede, M. Jakobsen (1999) thì beà roäng vaønh khaùng khuaån ñöôïc xeùt trong khoaûng 2-5mm cho khaû naêng khaùng trung bình vaø treân 5mm cho khaû naêng khaùng maïnh. Gaàn ñaây, V. Padmanabha Reddy, M.D. Christopher, I. Sankara Reddy (2006) ño ñöôïc beà roäng voøng khaùng khuaån 3-5mm cuûa Lactobacillus acidophilus ñoái vôùi vi sinh vaät chæ thò E.coli. Theo baûng 4.1, beà roäng voøng khaùng khuaån ño ñöôïc cuûa chuùng toâi khoâng khaùc bieät vôùi caùc taùc giaû neâu treân. Beà roäng vaønh khaùng khuaån phuï thuoäc vaøo noàng ñoä chaát khaùng khuaån trong dòch ly taâm. Moät soá taùc giaû coøn coâ ñaëc dòch teá baøo ly taâm 5, 10 laàn ñeå taêng noàng ñoä chaát khaùng khuaån nhaèm taêng beà daøy vaønh khaùng khuaån [36] Baûng 4.1. Đường kính vòng kháng khuẩn đo đường bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion assay) Soá TT Chuûng Giaù trò trung bình ñöôøng kính voøng khaùng khuaån (mm) Giaù trò trung bình beà roäng vaønh khaùng khuaån (mm) Phaân loaïi hoaït tính khaùng khuaån 1 T8b 18.0 5.0 +++ 2 C1 18.0 5.0 +++ 3 T1a 17.0 4.5 +++ 4 T7b 17.0 4.5 +++ 5 D3 16.0 4.0 ++ 6 N3 16.0 4.0 ++ 7 T1c 15.0 3.5 ++ 8 T3c 15.0 3.5 ++ 9 S6 15.0 3.5 ++ 10 N4 14.0 3.0 ++ 11 S2 14.0 3.0 ++ 12 S4 14.0 3.0 ++ 13 N1 13.0 2.5 + 14 T2c 13.0 2.5 + 15 N5 10.0 1.0 + 16 S1a 10.0 1.0 + 17 S1b 10.0 1.0 + 18 S3 10.0 1.0 + 19 T1b 10.0 1.0 + 20 D2 10.0 1.0 + 21 T4c 8.0 0 0 22 S5 8.0 0 0 Ñeå tieän theo doõi vaø ñaùnh giaù hoaït tính khaùng khuaån cuûa caùc chuûng vi khuaån lactic phaân laäp ñöôïc trong phoøng thí nghieäm, chuùng toâi ñeà nghò phaân loaïi hoaït tính khaùng khuaån (taïm thôøi ñoái vôùi vi khuaån chæ thò E.coli) nhö sau: Beà daøy vaønh khaùng khuaån >4.0 mm töông öùng hoaït tính maïnh (+++) Beà daøy vaønh khaùng khuaån = 3.0mm ¸ 4.0 mm töông öùng hoaït tính trung bình (++) Beà daøy vaønh khaùng khuaån < 3.0 mm töông öùng hoaït tính yeáu (+) Beà daøy vaønh khaùng khuaån = 0 mm töông öùng khoâng coù hoaït tính (0) Nhö vaäy, trong soá boán phöông phaùp khueách taùn trong moâi tröôøng thaïch laø spot on lawn, agar spot test, dics diffusion assay, vaø well diffusion assay, thì phöông phaùp cuoái cuøng sau khi chuaån hoùa veà ñoä daøy moâi tröôøng vaø noàng ñoä vi sinh vaät coù theå aùp duïng ñeå so saùnh hoaït tính khaùng khuaån cuûa caùc chuûng vi khuaån nguoàn goác khaùc nhau qua ñöôøng kính voøng khaùng. Tuy nhieân, ñeå keát quaû coù theå so saùnh baèng phöông phaùp thoáng keâ caàn taêng soá laàn laëp laïi. Chuùng toâi ñaõ aùp duïng phöông phaùp naøy ñeå so saùnh hoaït tính khaùng khuaån toång theå ñoái vôùi E.coli cuûa 22 chuûng vi khuaån lactic. Ñeå xaùc ñònh baûn chaát khaùng khuaån laø do acid lactic, H2O2 hay bacteriocin, caàn tieán haønh moät soá phöông phaùp boå sung nhö trung hoøa dòch teá baøo ly taâm, boå sung catalase….Ngoaøi ra, caùc phöông phaùp khueách taùn qua moâi tröôøng thaïch chæ coù theå aùp duïng ñeå saøng loïc ban ñaàu trong quy trình tìm kieám caùc chuûng coù hoaït tính probiotic. Ñeå so saùnh mang tính ñònh löôïng caàn tìm kieám nhöõng phöông phaùp coù ñoä tin caäy cao hôn. Thí nghieäm xaùc ñònh khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp Turbidimetric assay (ño ñoä ñuïc) Teá baøo vi sinh vaät laø moät thöïc theå neân khi hieän dieän trong moâi tröôøng laøm cho moâi tröôøng trôû neân ñuïc. Ñoä ñuïc cuûa huyeàn phuø tæ leä thuaän vôùi maät ñoä teá baøo. Do ñoù, thoâng qua vieäc ño ñoä ñuïc baèng maùy quang phoå keå ôû böôùc soùng nhaát ñònh cuûa dòch huyeàn phuø teá baøo ta coù theå ñònh tính ñöôïc maät ñoä teá baøo ôû ñieàu kieän caàn khaûo saùt. Khi thöïc hieän phöông phaùp ño ñoä ñuïc, chuùng toâi coù thay ñoåi quy trình so vôùi taøi lieäu tham khaûo [16], [31]. Thay vì tieät truøng dòch ly taâm baèng phöông phaùp loïc, chuùng toâi khöû truøng tröôùc eppendorf tube duøng ñeå ly taâm, sau ly taâm chæ thanh truøng Pasteur ôû 80o C 10 phuùt ñeå traùnh bieán tính bacteriocin vaø ñôn giaûn hoùa thao taùc. Moïi thao taùc caáy truyeàn ñeàu ñöôïc baûo ñaûm ñieàu kieän voâ truøng. Phöông phaùp naøy vaãn döïa treân nguyeân taéc chung cuûa caùc phöông phaùp phaùt hieän chaát khaùng vi sinh vaät laø ño khaû naêng öùc cheá taêng tröôûng cuûa vi khuaån chæ thò cuûa caùc chaát khaùng khuaån ñöôïc sinh ra töø quaù trình trao ñoåi chaát cuûa vi khuaån leân men lactic. Khoâng gioáng nhö boán phöông phaùp ñaõ thöïc hieän ôû treân, phöông phaùp ño ñoä ñuïc döïa treân söï khueách taùn caùc chaát khaùng khuaån trong moâi tröôøng loûng. Tæ leä phaàn traêm OD E. coli uû vôùi dòch ly taâm teá baøo vi khuaån LAB so vôùi OD E. coli uû vôùi ñoái chöùng (thay dòch ly taâm LAB baèng moâi tröôøng MRS cuøng theå tích) cho ta tæ leä soáng soùt cuûa E. coli sau khi uû vôùi caùc chaát khaùng khuaån trong dòch nuoâi caáy teá baøo LAB. Nhö vaäy bieân ñoä thay ñoåi cuûa caùc giaù trò ño ñöôïc vaø tính ñöôïc roäng hôn so vôùi phöông phaùp well diffusion assay (Hình 4.5 vaø Baûng 4.2). Cuõng treân cô sôû phöông phaùp naøy coù nhieàu öu ñieåm so vôùi caùc phöông phaùp tröôùc, ngoaøi vieäc khaûo saùt hoaït tính khaùng khuaån toång quaùt, chuùng toâi böôùc ñaàu tìm hieåu baûn chaát khaùng khuaån trong dòch nuoâi caáy vi khuaån LAB ly taâm. Thöïc hieän quaù trình nuoâi caáy vi khuaån leân men lactic trong MRS loûng vôùi ñieàu kieän kò khí, dòch nuoâi caáy ñem phaân tích haøm löôïng H2O2 sinh ra. Keát quaû cho thaáy H2O2 khoâng ñöôïc sinh ra trong quaù trình nuoâi caáy kò khí, nhö vaäy hai chaát khaùng khuaån ñaùng quan taâm coøn laïi laø acid höõu cô vaø bacteriocin. Ñeå loaïi boû taùc duïng cuûa acid höõu cô trong hoaït tính khaùng khuaån, chuùng toâi tieán haønh trung hoøa dòch nuoâi caáy LAB roài môùi ñem ly taâm tieáp ñoù tieán haønh quy trình ño ñoä ñuïc nhö treân. Keát quaû cuõng ñöôïc trình baøy trong baûng 4.2. OÁng nghieäm beân phaûi: Dòch nuoâi caáy C1 ly taâm (khoâng trung hoøa) uû vôùi E. coli OÁng nghieäm beân phaûi: Dòch nuoâi caáy C1 ly taâm (sau khi trung hoøa) uû vôùi E. coli OÁng nghieäm beân traùi : ñoái chöùng (thay dòch nuoâi caáy C1 baèng moâi tröôøng MRS cuøng theå tích) Hình 4.5: Kieåm tra hoaït tính baèng phöông phaùp ño ñoâ ñuïc Baûng 4.2. Tæ leä soáng soùt cuûa E. coli sau khi uû vôùi dòch nuoâi caáy LAB ly taâm Soá TT Chuûng vi khuaån lactic Tæ leä soáng soùt cuûa E.coli (%) khi uû vôùi dòch ly taâm khoâng trung hoøa Tæ leä soáng soùt cuûa E.coli (%) khi uû vôùi dòch ly taâm sau khi trung hoøa 1 T8b 4.6 56.1 2 C1 4.1 52.7 3 T1a 3.2 62.1 4 T7b 4.5 57.1 5 D3 15.3 80.1 6 N3 4.2 63.2 7 T1c 48.2 74.3 8 T3c 20.0 68.8 9 S6 34.3 63.4 10 N4 41.9 67.9 11 S2 12.3 76.8 12 S4 34.0 54.3 13 N1 15.8 55.8 14 T2c 63.2 63.5 15 N5 48.1 65.6 16 S1a 45.7 58.0 17 S1b 85.1 76.0 18 S3 46.5 58.1 19 T1b 92.6 80.3 20 D2 57.0 57.6 21 T4c 89.5 77.5 22 S5 53.2 73.5 Töø baûng 4.2 ta coù theå thaáy raèng tæ leä soáng soùt cuûa E. coli caøng thaáp thì hoaït tính khaùng vi sinh vaät caøng cao. Nhö vaäy ñeå so saùnh tröïc tieáp khaû naêng öùc cheá taêng tröôûng E. coli cuûa caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát vi khuaån LAB, chuùng toâi söû duïng ñaïi löôïng (100% – tæ leä % soá soùt cuûa E. coli) vaø bieåu dieãn treân ñoà thò 4.1. Ñoà thò 4.1: Tæ leä öùc cheá taêng tröôûng E. coli cuûa dòch nuoâi caáy vi khuaån lactic ly taâm khoâng trung hoøa vaø sau khi trung hoøa Ñoà thò 4.1 cho thaáy: Tæ leä öùc cheá taêng tröôûng vi sinh vaät chæ thò cuûa dòch nuoâi caáy LAB ly taâm khoâng trung hoøa thöôøng lôùn hôn maãu töông öùng sau khi trung hoøa (19/22 tröôøng hôïp) Ñieàu naøy hôïp lyù vì trung hoøa nhaèm loaïi boû taùc duïng cuûa acid höõu cô trong hoaït tính khaùng khuaån. Tröôøng hôïp S1b, T1b vaø T4c cho keát quaû ngöôïc laïi. Tuy nhieân caùc chuûng naøy khoâng gaây chuù yù ñaëc bieät vì tæ leä öùc cheá E. coli cao nhaát xaáp xæ 20%, thuoäc loaïi thaáp nhaát so vôùi caùc chuûng coøn laïi. Nhieàu chuûng coù theå öùc cheá treân 80% taêng tröôûng cuûa E. coli khi khoâng trung hoøa (T8b, C1, T1a, N3, S2, N1), nhöng sau khi loaïi boû taùc duïng cuûa acid höõu cô taïo thaønh thì khaû naêng öùc cheá coøn laïi treân döôùi 40%. Nhieàu chuûng hoaït tính khaùng E. coli laïi khoâng phaûi do acid höõu cô taïo thaønh maø chuû yeáu do yeáu toá khaùc, raát nhieàu khaû naêng laø do bacteriocin (T2c, N5, S1a, D2) vaø hoaït tính naøy cuõng xaáp xæ 40%. So saùnh vôùi keát quaû phöông phaùp khueách taùn trong gieáng thaïch (well diffusion assay) nhìn chung ta coù theå phaân bieät nhöõng chuûng coù hoaït tính maïnh vaø yeáu baèng caû hai phöông phaùp, ví duï moät soá chuûng ñöôïc ñaùnh giaù laø coù hoaït tính maïnh trong well diffusion assay öùc cheá treân 90% taêng tröôûng E. coli (maãu khoâng trung hoøa). Ngöôïc laïi nhieàu chuûng laøm giaûm ñoä ñuïc E.coli töông töï nhöng beà daøy vaønh khaùng khuaån laïi nhoû (T3c, S2, N1). Coù veû raèng nhöõng chuûng öùc cheá taêng tröôûng vi sinh vaät chæ thò caøng maïnh do taùc ñoäng cuûa acid höõu cô thì beà daøy vaønh khaùng khuaån caøng lôùn. Coù theå ñoù laø do khaû naêng khueách taùn cuûa bacteriocin trong moâi tröôøng thaïch keùm hôn acid höõu cô. Ñoà thò 4.2 bieåu dieãn töông quan giöõa tæ leä soáng soùt E. coli (A%) theo phöông phaùp ño ñoä ñuïc theo beà roäng vaønh khaùng khuaån (mm) vôùi soá lieäu xöû lyù vaø ñoà thò veõ baèng phaàn meàm Statgraphics. Ñoà thò 4.2: Söï töông quan giöõa phöông phaùp ño ñoä ñuïc (turbidimetric assay method) vaø phöông phaùp khueách taùn qua gieáng thaïch (well diffusion assay) Phöông trình bieåu dieãn töông quan laø: A(%) = 24.2 + 14.7 D ñöôïc thieát laäp vôùi heä soá töông quan (correlation coefficient) laø 0.8366 vaø R2 = 66.3 %. Nhö vaäy, veà maët thoáng keâ coi nhö khoâng coù söï töông quan giöõa keát quaû cuûa hai phöông phaùp khueách taùn qua gieáng thaïch ño ñoä ñuïc. Toùm laïi, phöông phaùp khueách taùn qua gieáng thaïch chæ cho keát quaû ñònh tính laïi toán nhieàu thôøi gian vaø coâng phu, coøn phöông phaùp ño ñoä ñuïc cho keát quaû mang tính ñònh löôïng hôn vì vaäy coù theå deã daøng söû duïng ñeå ñaùnh giaù hoaït tính khaùng vi sinh vaät cuûa caùc thaønh phaàn chaát khaùng khuaån. Chuùng toâi ñeà nghò phaùt trieån phöông phaùp naøy trong Phoøng thí nghieäm trong coâng vieäc tuyeån choïn caùc chuûng LAB laøm probiotics hay saûn xuaát bacteriocin. Chöông 5: Keát Luaän & Kieán Nghò Keát Luaän Ñeå choïn loïc caùc chuûng coù tieàm naêng probiotics, tuyeån choïn khaû naêng khaùng vi sinh vaät ñoùng vai troø quan troïng nhaát vaø laø haøng raøo tuyeån choïn ñaàu tieân caàn aùp duïng. Trong boán phöông phaùp thöû nghieäm treân moâi tröôøng thaïch laø spot on lawn, agar spot test, dics diffusion assay vaø well diffusion assay thì phöông phaùp thöù tö laø cho keát quaû trong phoøng thí nghieäm cuûa chuùng toâi. Phöông phaùp naøy duøng ñeå ñaùnh giaù hoaït tính toång hôïp caùc chaát khaùng khuaån do vi khuaån lactic sinh ra trong quaù trình trao ñoåi chaát. Ñeå thöïc hieän caùc phöông phaùp naøy ñaõ toái öu hoùa ñieàu kieän laø: Söû duïng moâi tröôøng thaïch daøy 3mm töông öùng vôùi 15ml moâi tröôøng. Söû duïng E.coli noàng ñoä 105 teá baøo/ml duøng cho taát caû caùc phöông phaùp kieåm tra söï ñoái khaùng. Trong caùc phöông phaùp söû duïng ñeå kieåm tra hoaït tính khaùng vi sinh vaät chæ coù phöông phaùp ño ñoä ñuïc (turbidometric assay method) cho keát quaû ñònh löôïng. AÙp duïng phöông phaùp naøy coù theå ñaùnh giaù aûnh höôûng rieâng reõ cuûa caùc chaát khaùng vi sinh vaät chæ thò. Baèng phöông phaùp well diffusion assay chuùng toâi xaùc ñònh ñöôïc naêm chuûng coù voøng khaùng khuaån toát nhaát laø: C1, T8b, T1a, T7b, N3. Trong ñoù C1 vaø N3 coù nguoàn goác töø thöïc phaåm laø caø muoái vaø nem.