Đề tài Thử nghiệm sinh ống mầm và thử nghiệm dalmau trong định danh candida albicansvà candida non– albicans (2007)

THỬ NGHIỆM SINH ỐNG MẦM VÀ THỬ NGHIỆM DALMAU TRONG ĐỊNH DANH CANDIDA ALBICANS VÀ CANDIDA NON– ALBICANS (2007) TÓM TẮT Mục tiêu: xác định hiệu quả của thử nghiệm sinh ống mầm (TNSOM) và thử nghiệm Dalmau (sinh bào tử bao dày) trong định danh Candida albicans và Candida non-albicans. Đối tượng và phương pháp: nghiên cứu mô tả cắt ngang được tiến hành trên 323 chủng Candida spp. lưu trữ tại bộ môn Ký Sinh Trùng – Vi Nấm Học, Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch, TP. HCM. Khả năng sinh ống mầm trong huyết thanh gộp của người và sinh bào tử bao dày trên môi trường khoai tây-cà rốt-Tween 80 được so sánh với kết quả định danh C. albicans và C. non- albicans bằng môi trường CHROMagar (tiêu chuẩn vàng) để tính độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm với phần mềm STATA 8.0. Kết quả: C. albicans chiếm ưu thế hơn C. non-albicans trong toàn bộ mẫu khảo sát (70,61% so với 29,39%) cũng như theo vị trí phân lập (63,56% ở âm đạo và 91,84% ở miệng). Độ nhạy và giá trị tiên đoán âm của thử nghiệm SOM (99,57% và 98,75%) cao hơn Dalmau (58,80% và 49,44%) một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,001); độ đặc hiệu tuy thấp hơn (87,78% so với 93,33%) nhưng không có ý nghĩa thống kê ( p = 0,27 ). Kết luận: C. albicans là tác nhân chủ yếu trong số các chủng thu thập được từ bệnh nhân. Thử nghiệm sinh ống mầm trong môi trường huyết thanh gộp của người có thể được sử dụng để phân biệt C. albicans và C. non-albicans trong tình hình thực tế tại Việt Nam. ABSTRACT Objective: to determine the efficacy of serum test (ST) and Dalmau test for identification of C. albicans and C. non-albicans. Study design: A cross-sectional study was conducted with 323 Candida spp. samples stored at Department of Parasitology - Mycology, Phạm Ngọc Thạch University of Medecine, HCM city. Candida spp. samples were identified by using gold standard test as CHROMagar coincidentally with the serum test and Dalmau’s test. The sensitivity, the specificity, positive predictive value and negative predictive value were calculated. Results: C. albicans was the dominant compared to C. non-albicans in all samples (70.61% vs 29.39%, respectively), as well as in vaginal samples (63.56%) and oral samples (91.84%). Serum test had higher sensitivity (99.57%), negative predictive value (98.75%) than Dalmau’s test. No statistics difference in specificity of these two diagnostic test. Conclusion: C. albicans was the most common species were isolated in this study. Serum test can be used as a method in identification of C. albicans and C. non-albicans in Viet nam. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh do Candida phổ biến khắp thế giới, trên mọi lứa tuổi, mọi chủng tộc, không phân biệt phái tính và có thể xảy ra ở bất kỳ cơ quan nào, nhất là da và niêm mạc. Đây cũng là bệnh cơ hội thường gặp ở cơ địa suy giảm miễn dịch, đặc biệt trên 90% đối tượng nhiễm HIV/AIDS(Error! Reference source not found.). Candida spp. còn là tác nhân đứng hàng thứ tư trong nhiễm khuẩn huyết bệnh viện, chiếm 6,6 – 21%(Error! Reference source not found.). Tỉ lệ tử vong do nhiễm Candida máu là 26 – 75%(Error! Reference source not found.). Trong các thể lâm sàng, thường gặp nhất là viêm âm đạo (VÂĐ). Khoảng 13 triệu trường hợp được ghi nhận hằng năm với khoảng 75% phụ nữ bị nhiễm nấm âm đạo ít nhất một lần trong đời, 40 – 50% tái phát 2 – 3 lần/năm và VÂĐ mãn tính chiếm khoảng 5%(Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.). Về tác nhân gây bệnh, không phải tất cả các trường hợp nhiễm nấm Candida đều do C. albicans; hơn một phần ba số mẫu được xét nghiệm có thể nhiễm các loài C. non-albicans như: C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata, C. pseudotropicalis, C. parasilosis, hoặc những loài rất kháng trị như C. lusitaniae. Sự phân bố Candida spp thay đổi theo từng vùng địa lý (Error! Reference source not found.) và nhạy cảm khác nhau với hoạt chất kháng nấm. Điều này ảnh hưởng không ít đến hiệu quả điều trị nếu áp dụng một cách “phiến diện” phác đồ trên y văn vào Việt Nam. Nhiều phương pháp được xây dựng để phân biệt các loài Candida spp., từ những phương pháp đơn giản, cổ điển, căn cứ vào hình thái học hoặc sinh học của chúng (thử nghiệm huyết thanh, Dalmau, sinh hóa …) đến những phương pháp hiện đại như các kỹ thuật sinh học phân tử hoặc dựa vào khả năng sinh màu trên môi trường CHROMagar Candida. Mỗi phương pháp đều có ưu khuyết điểm riêng về giá trị và các khía cạnh khác. So với điều kiện hiện nay ở Việt Nam, các phương pháp kinh điển có vẻ phù hợp hơn, tuy nhiên tỉ lệ phát hiện C. albicans và C. non-albicans cũng như khả năng tiên đoán của thử nghiệm sinh ống mầm và thử nghiệm Dalmau là bao nhiêu, có tin cậy được hay không so với các kỹ thuật hiện đại ? Từ cơ sở trên, khảo sát này được tiến hành nhằm lựa chọn phương pháp định danh thích hợp, có thể hỗ trợ trong điều trị, các nghịên cứu dịch tễ học cũng như các thử nghiệm đánh giá invitro, invivo về thuốc kháng nấm liên quan đến bệnh lý Candida spp. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm của thử nghiệm sinh ống mầm (TNSOM) và thử nghiệm Dalmau trong định danh C. albicans và C. non-albicans trên các chủng Candida spp. phân lập từ bệnh nhân. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Khảo sát mô tả cắt ngang được tiến hành từ tháng 01/2007 đến tháng 07/2007, tại Bộ môn Ký Sinh Trùng – Vi Nấm Học, Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch, TP. HCM, với mong muốn áp dụng kết quả vào các trường hợp nhiễm nấm Candida spp. Áp dụng công thức tính cỡ mẫu ước lượng một tỷ lệ ở mức tin cậy 95%, sai số cho phép 5%, với p tham khảo bao gồm độ nhạy, độ đặc hiệu của TNSOM và Dalmau lần lượt là 94,7%, 82,80% và 98,60%, 99,99% cho phép xác định cỡ mẫu cần cho nghiên cứu là  219. Toàn bộ 323 chủng Candida spp. lưu trữ trong glycerin 10%, ở – 20oC, được đưa vào khảo sát. Các chủng này được phân lập từ các trường hợp viêm âm đạo hoặc đẹn miệng do nấm trong năm 2005 và 2006 tại các bệnh viện tuyến 1 TP. HCM. Sau khi phục hồi bằng môi trường Sabouraud Dextrose Agar chloramphenicol ủ ở nhiệt độ phòng, các chủng nấm được cấy lên CHROMagar Candida (tiêu chuẩn vàng) để định danh C. albicans (CA) và C. non-albicans (CNA) dựa trên màu sắc khúm nấm. Sử dụng huyết thanh gộp của người, thu thập từ khoa xét nghiệm bệnh viện Chợ Rẫy, để khảo sát đặc điểm sinh ống mầm (thử nghiệm huyết thanh); và môi trường khoai tây-cà rốt-Tween 80 để đánh giá khả năng sinh bào tử bao dày (kỹ thuật Dalmau). Xử lý số liệu bằng Stata 8.0. Trình bày kết quả dưới dạng bảng, biểu. Sử dụng tần số, tỉ lệ để mô tả các biến số. Phân tích độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, tiên đoán âm của các thử nghiệm bằng 2 Mc Nemar (khoảng tin cậy 95%, p). KẾT QUẢ Bảng 1: Đặc điểm mẫu nghiên cứu Đặc tính n (%) Vị trí phân lập (N = 323) Âm đạo Miệng 225 (69,66) 98 (30,34) Chủng Candida C. albicans C. non- albicans Phối hợp 226 (69,96) 90 (27,86) 7 (2,17) Âm đạo (n = 225) C. albicans C. non- albicans 143 (63,56) 82 (36,44) Miệng (n = 98) C. albicans C. non- 90 (91,84) 8 (8,16) albicans C. non- albicans (n = 90) C. dubliniensis C. tropicalis Loài khác 8 (8,89) 3 (3,33) 79 (87,78) C. albicans chiếm ưu thế trong 323 mẫu khảo sát nói chung (69,96%), ở âm đạo và miệng nói riêng (63,56% và 91,84%). Có 2,17% trường hợp nhiễm phối hợp C. albicans và C. non-albicans. C. dubliniensis và C. tropicalis chiếm tỷ lệ thấp (3,33% và 8,89%) so với các loài C. non-albicans khác (87,78%). Nhóm C. non-albicans này bao gồm chủ yếu các chủng sinh màu hồng (C. glabrata hoặc C. krusei), chỉ có 2 khúm màu kem (C. parapsilosis). Bảng 2: Các giá trị của thử nghiệm SOM CHROMAgar CA CNA Tổng CA 232 11 243 SOM CNA 1 79 80 Tổng 233 90 323 Se = 99,57% (97,63 – 99,99) Sp = 87,78% (79,18 – 93,74) PV = 95,47% (92,04 – 97,72) PV = 98,75% (93,23 – 99,97) Các giá trị của TNSOM đều cao trong việc phân biệt C. albicans (CA) và C. non-albicans (CNA). Bảng 3: Các giá trị của thử nghiệm Dalmau CHROMAgar Tổng CA CNA CA 137 6 143 Dalmau CNA 96 84 180 Tổng 233 90 323 Se = 58,80 (52,19 – 65,18) Sp = 93,33 (86,05 – 97,51) PV = 95,80 (91,09 – 98,44) PV = 49,44 (39,21 – 54,24) Khả năng phát hiện C. non-albicans của thử nghiệm (TN) Dalmau cao nhưng lại thấp đối với C. albicans. Do đó, PV cao và PV thấp. Độ đặc hiệu của 2 phương pháp không khác biệt nhưng độ nhạy của SOM cao hơn có ý nghĩa thống kê (2McNemar hiệu chỉnh, psp = 0,27, pse < 0,001) BÀN LUẬN Đặc tính của mẫu nghiên cứu Tổng số đối tượng nghiên cứu là 323 mẫu Candida spp. được thu thập từ nhiều khảo sát khác nhau, bao gồm 69,66% mẫu phân lập từ âm đạo và 30,34% từ miệng (bảng 1). Trong số đó, C. albicans chiếm 69,96%, C. non-albicans chiếm 27,86%, còn lại 2,17% mẫu nhiễm phối hợp C. albicans và C. non-albicans. Tuy nhiên, khi khảo sát giá trị của thử nghiệm huyết thanh cũng như kỹ thuật Dalmau, mỗi mẫu phối hợp chỉ được tính là 1 chủng Candida sp. và được xếp vào nhóm C. albicans vì sự hiện diện của C. albicans ở những mẫu phối hợp sẽ tạo ra ống mầm trên canh cấy huyết thanh và bào tử bao dày trên môi trường khoai tây-cà rốt-Tween80 làm các chủng C. non-albicans không được nhận diện. Đây chính là hạn chế của 2 kỹ thuật được đánh giá so với tiêu chuẩn vàng (cấy trên CHROMAgar). Như vậy, tỷ lệ phân bố thực sự giữa C. albicans là (226+7)/(323 + 7) = 70,61%, C. non-albicans là (90+7)/(323 + 7) = 29,39%. Các tỷ lệ này được sử dụng để bàn về sự phân bố giữa 2 nhóm Candida. C. albicans và C. non-albicans phân bố tương tự các báo cáo trong và ngoài nước (bảng 1): C. albicans giữ vai trò vượt trội trong các bệnh lý do Candida spp.(Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.) vì chúng sống hoại sinh trên cơ thể người và dễ dàng chuyển sang gây bệnh khi có yếu tố thuận lợi. Xét riêng về C. non-albicans, nhìn chung, kết quả 29,39% cao hơn y văn(Error! Reference source not found.) nhưng thấp hơn so với Trần Thị Lợi (84,20%)(Error! Reference source not found.) và Parazzini (57,30%)(Error! Reference source not found.). Nguyên nhân có thể do mẫu khảo sát của Trần Thị Lợi chỉ bao gồm các trường hợp nhiễm Candida spp. tái phát; khác với nghiên cứu này, chủ yếu là các đối tượng đến khám lần đầu. Thực tế y văn cũng đã ghi nhận C. non-albicans chiếm trên 33% các trường hợp viêm tái phát(Error! Reference source not found.) vì C. albicans nhạy với thuốc kháng nấm hơn. Nhưng sự tái phát chưa hẳn là lý do duy nhất ! Thật vậy, các mẫu nhiễm Candida spp. của Parazzini cũng không phân biệt lần đầu hay tái phát và được định danh bằng CHROMagar. Phải chăng yếu tố địa lý hoặc tuổi mãn kinh đã góp phần cho tỉ lệ C. non-albicans của Parazzini cao hơn kết quả hiện tại ? Tóm lại, C. albicans vẫn phổ biến trong các trường hợp bệnh do Candida spp. như bối cảnh chung của thế giới. Tuy nhiên, gần 1/3 (29,39%) trường hợp nhiễm C. non-albicans không phải là nhỏ. Việc vận dụng phác đồ điều trị theo y văn vào thực tế Việt Nam, e rằng sẽ không đem đến hiệu quả mong muốn vì tác dụng kháng nấm tùy thuộc vào từng loài Candida. trong khi phổ nấm gây bệnh lại thay đổi theo vị trí địa lý! Nhiều báo cáo chứng tỏ Fluconazole hiệu quả với C. albicans hơn các loài Candida khác(Error! Reference source not found.). Nếu chọn phác đồ hiệu quả ưu tiên cho C. albicans như ở nhiều nước trên thế giới, sẽ có nguy cơ thất bại đối với bệnh nhân nhiễm C. non-albicans, một tác nhân chiếm tỉ lệ không nhỏ và đang có khuynh hướng gia tăng ở nước ta. Vì vậy cần thực hiện những nghiên cứu dịch tễ học về các tác nhân Candida ở Việt nam cũng như những thử nghiệm lâm sàng nhằm đưa ra phác đồ điều trị thích hợp và quan tâm hơn nữa đến việc định danh Candida gây bệnh. Giá trị của thử nghiệm SOM Kết quả từ bảng 2 cho thấy thử nghiệm SOM có độ nhạy cao (99,75%) xấp xỉ với tiêu chuẩn vàng CHROMagar (100%) nhưng độ đặc hiệu thấp hơn (87,78% so với 100%), xuất phát từ 12,2% dương giả xảy ra ở C. tropicalis và C. dubliniensis. Đối với C. tropicalis, búp của tế bào hạt men có khả năng phát triển thành ống mầm, nhất là khi ủ trên 3 giờ, dễ chẩn đoán lầm với C. albicans(Error! Reference source not found.). Trường hợp C. dubliniensis, một loài C. non-albicans được phát hiện gần đây, có nhiều đặc tính sinh học và hình thái tương tự C. albicans(Error! Reference source not found.), bao gồm khả năng sinh ống mầm và bào tử bao dày. Vì vậy, cần phối hợp với các phương pháp khác như CRA, cấy trên SDA ủ ở 42 – 450C, lên men đường… để phân biệt với C. albicans. Các giá trị tiên đoán của TNSOM cũng đáng tin cậy (PV = 95,47%, PV = 98,75%), nếu kiểm soát được thời gian ủ canh cấy, độ chính xác của thử nghiệm này có thể còn cao hơn. Giá trị của kỹ thuật Dalmau Theo bảng 3, độ nhạy của kỹ thuật Dalmau là 58,80%, thấp hơn nhiều so với Casal & Linares (82,80%)(Error! Reference source not found.). Nói cách khác, 41,20% trường hợp nhiễm C. albicans nhưng lại được định danh C. non-albicans. Sự hình thành bào tử bao dày của C. albicans liên quan đến nồng độ oxy, chất dinh dưỡng và nhiệt độ ủ (18 – 260C)(10). Thật vậy, nghiên cứu được tiến hành vào mùa hè (32 – 380C); môi trường khoai tây-cà rốt-Tween 80 được điều chế tại bộ môn nên nồng độ dinh dưỡng có thể chưa đạt hàm lượng tối ưu; sự lưu trữ, cấy chuyển nhiều lần các chủng Candida spp. cũng làm giảm khả năng hình thành bào tử bao dày của C. albicans. Phải chăng đó là những lý do gây ra sự khác biệt ? Độ đặc hiệu 93,33% (bảng 3) thấp hơn so với thử nghiệm sinh bào tử bao dày trên canh cấy Rice-Tween 80 của Cetinkaya Z. & cs. (100%)(Error! Reference source not found.). Nguyên nhân có thể do 2,48% (8/323) C. dubliniensis trong mẫu nghiên cứu được xác định là C. albicans vì bào tử bao dày của chúng tương tự về hình dạng và cách sắp xếp. Ngược lại, Cetinkaye Z. đã không ghi nhận bất kỳ trường hợp nào nhiễm tác nhân này. Tuy vậy, về điều trị, có thể chấp nhận dương giả do sai lầm trong xếp loại C. dubliniensis thành C. albicans vì phác đồ điều trị C. albicans vẫn hiệu quả đối với C. dubliniensis(Error! Reference source not found.). Mặc dù giá trị tiên đoán âm thấp (49,44%) nhưng nồng độ ức chế tối thiểu của các thuốc kháng nấm đối với C. non-albicans nói chung, cao hơn C. albicans(Error! Reference source not found.). Nếu chẩn đoán lầm C. albicans thành C. non-albicans, phác đồ của C. non-albicans vẫn diệt được C. albicans. Tuy nhiên cần lưu ý tác dụng phụ và sự tốn kém do liều cao một cách vô tình! So sánh TNSOM và TN Dalmau So với phương pháp Dalmau, các giá trị của thử nghiệm SOM rất đáng tin cậy để được lựa chọn trong phân biệt C. albicans và C. non-albicans (biểu đồ 1). Khả năng dương giả của TNSOM tuy cao hơn nhưng đều rơi vào C. dubliniensis hoặc C. tropicalis nên không ảnh hưởng đáng kể đến thực hành lâm sàng vì C. albicans có mức độ đáp ứng thuốc tương tự C. dubliniensis và nếu đảm bảo thời điểm đọc kết quả sẽ loại trừ được sự sinh ống mầm của C. tropicalis. Về kỹ thuật, ống mầm rất dễ nhận diện dưới kính hiển vi, trong khi màu sắc khúm nấm trên môi trường CHROMAgar ít nhiều bị ảnh hưởng bởi tính chủ quan của người đọc cũng như tuổi của canh cấy. Tương tự, bào tử bao dày có thể bị che lấp khi mật độ vi nấm dầy đặc hoặc bị ngoại nhiễm nấm mốc. Dù độ đặc hiệu chưa hoàn hảo, nhưng TNSOM vẫn có nhiều ưu điểm: kết quả nhanh sau 2 – 3 giờ (CHROMAgar hoặc Dalmau: 48 – 72 giờ), chi phí không cao, thao tác đơn giản. Vấn đề còn bàn cãi là loại huyết thanh nào sẽ cho kết quả cao nhất ? Nếu sử dụng huyết thanh gộp từ bệnh nhân sẽ có nguy cơ ảnh hưởng đến khả năng sinh ống mầm gây âm tính giả do đã hoặc đang điều trị thuốc kháng nấm. Theo y văn, huyết thanh ngựa thường được sử dụng, tuy nhiên khi so sánh 4 môi trường : huyết thanh gộp của người, huyết thanh ngựa, peptone, nước luộc đậu nành, Arora DR & cs. đã ghi nhận huyết thanh gộp của người là môi trường tốt nhất kích thích sự hình thành ống mầm của C. albicans(1). Hơn nữa, việc thu thập huyết thanh ngựa hiện nay ở Việt Nam chưa được dễ dàng. Do vậy, vẫn có thể sử dụng huyết thanh người thu thập từ bệnh viện và nên chọn lọc từ các trường hợp đến kiểm tra sức khỏe tổng quát, định kỳ hoặc chỉ mắc các bệnh nội khoa thông thường … để giảm thiểu tối đa khả năng hiện diện thuốc kháng nấm trong máu. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ C. albicans giữ vai trò chính trong các chủng phân lập từ bệnh nhân viêm âm đạo hoặc đẹn miệng do nấm. Các loài C. non-albicans, mặc dù kém ưu thế hơn nhưng chiếm một tỉ lệ không nhỏ (29,39%) có thể dẫn đến thất bại trong điều trị nếu lựa chọn phác đồ theo y văn thế giới, những nơi mà C. albicans chiếm 80 – 95% các trường hợp nhiễm nấm Candida spp. Thử nghiệm SOM chứng tỏ rất phù hợp với thực tế Việt Nam về giá trị chẩn đoán, giá thành cũng như tính đơn giản, nhanh chóng trong định danh C. albicans và C. non-albicans. Huyết thanh người thu thập7 từ bệnh nhân không mắc các bệnh nhiễm khuẩn và không điều trị kháng nấm trước đó vẫn tỏ ra hữu hiệu trong thử nghiệm này. Cần tiến hành các nghiên cứu qui mô về sự phân bố của Candida spp. và hiệu quả kháng nấm đối với các loài gây bệnh nhằm đưa ra phác đồ điều trị thích hợp ở Việt Nam.