Đề tài Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 và bước đầu chuyển gen HA1 tạo các dòng rễ tơ chuyển gen ở cây thuốc lá

MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cúm gà (avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của các loài chim, kể cả gia cầm và thuỷ cầm, do các subtype khác nhau thuộc nhóm virus cúm A gây nên. Do có sức đề kháng tự nhiên tốt nên một số loài chim mang virus gây bệnh, nhưng không có biểu hiện của bệnh. Đây là mối nguy hiểm lan truyền bệnh cho các loài gia cầm khác. Ngoài ra, chúng còn là nơi cung cấp nguồn tàng trữ biến đổi nguồn gen tạo nên các subtype mới. Các subtype virus cúm A gây bệnh trên người đều có nguồn gốc tiến hoá biến thể và biến chủng từ động vật và sau khi thích ứng trên người thì gây bệnh, trước đây đã tạo nên những vụ dịch thảm khốc, rồi biến mất sau một thời gian lại tái hiện và gây nên đại dịch mới. Năm 2004 các đại dịch cúm gia cầm tại các nước châu Á (bao gồm dịch do H5N1 gây ra tại Trung Quốc, Nhật, Nam Triều Tiên, Thái Lan, Việt Nam, Indonesia, Campuchia và Lào; do H7N3 (Pakistan); do H5N2 ( Đài Loan) đã gây thiệt hại hàng trăm triệu gia cầm, làm chết hàng chục người ở Việt Nam và tại Thái Lan. Chủng H5N1 điển hình ở châu Á có tính kháng nguyên và di truyền giống với chủng A/Vietnam/1203/04. [1] Để phòng chống sự lây lan mạnh mẽ của đại dịch cúm gia cầm, hàng năm Việt Nam cần một lượng vaccine rất lớn để tiêm chủng cho hàng trăm triệu con gà vịt. Ngoài những công nghệ sẵn có Việt Nam đang tìm kiếm những công nghệ sản xuất vaccine có ý nghĩa kinh tế, an toàn và hiệu quả cao. Vaccine ăn được có nguồn gốc từ thực vật sẽ là nguồn vaccine đáp ứng được các tiêu điểm đó và sẽ đem lại nhiều lợi ích cho ngành thú y và được xem là hướng đi phù hợp với những nước đang phát triển vì mục đích chăm sóc sức khoẻ cộng đồng như Việt Nam. Chuyển gen mã hóa các vaccine tái tổ hợp vào thực vật cụ thể là vào các cây trồng là nguồn thức ăn chính cho con người, động vật nuôi là một trong những hướng đi chính hiện nay. Tuy nhiên bên cạnh đó, một xu hướng cũng được bắt đầu quan tâm nghiên cứu và ứng dụng là sử dụng hệ thống nuôi cấy sinh khối tế bào để sản xuất các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Do tế bào thực vật có ưu thế nuôi cấy dễ dàng, môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, dễ dàng sản xuất một lượng sinh khối lớn trong khoảng thời gian ngắn và quan trọng hơn cả tế bào thực vật nuôi cấy in vitro không mang các mầm bệnh cho người. Với mục đích tạo cơ sở cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine cúm A/H5N1, căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương pháp khả thi, chúng tôi lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sỹ là: “Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 và bước đầu chuyển gen HA1 tạo các dòng rễ tơ chuyển gen ở cây thuốc lá”. 2. Mục tiêu của đề tài - Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ của virus H5N1. - Bước đầu chuyển vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA1 vào cây thuốc lá tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn A.rhizogens. 3. Nội dung nghiên cứu - Ghép nối gen HA1 mã hóa tiểu phần protein vỏ virus H5N1 vào vector mang pENTR 221/cal để tạo vector tái tổ hợp. - Kiểm tra vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ của virus H5N1. - Tạo vector chuyển gen vào thực vật mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ của virus H5N1 và biến nạp vào vi khuẩn A. rhizogens. - Bước đầu chuyển vector tái tổ hợp mang cấu trúc gen HA1 vào cây thuốc lá tạo rễ tơ thông qua A.rhizogens. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cúm A/H5N1 1.1.1. Cấu tạo Cúm gia cầm (Avian Influenza, AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Đây là nhóm virus có biên độ chủ rộng, được phân chia thành nhiều phân type khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt vỏ của hạt virus [48]. Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 -120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Dal. Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm - negative single strand [61] (Hình 1). Hình 1.1. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A. Ghi chú: A: Các dạng hình thái khác nhau của virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử; B: Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị phức hợp enzyme polymerase của virus). C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge). Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus. Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các dấu ấn khác của virus [16], [73]. Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử NA và HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm [61], [63]. Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9), và sự tái tổ hợp (reassortment) giữa các phân type HA và NA, về mặt lý thuyết, sẽ tạo ra nhiều phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh. Mặt khác, virus cúm A có đặc tính quan trọng là dễ dàng đột biến trong gen/hệ gen (đặc biệt ở gen NA và HA), hoặc trao đổi các gen kháng nguyên với nhau, trong quá trình xâm nhiễm và tồn tại lây truyền giữa các loài vật chủ. Các subtype này gây nhiễm cho hầu như phần lớn mọi loài sinh vật bao gồm các loài lông vũ (gà, chim và thuỷ cầm), lợn, ngựa, chồn đất, hải cẩu, cá voi và loài người. Trên cơ sở trình tự gen và sắp xếp gen trong hệ gen, virus cúm A có 8 phân đoạn (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ virus, có độ dài tổng số khoảng 13.500 nucleotide, mã hóa cho 11 protein tương ứng của virus (hình 2). Hình 1.2. Cấu trúc bộ gen (hình trái) gồm 8 gen là 8 đoạn RNA sợi đơn âm (-ssRNA) và mô hình (hình phải) thể virus cúm H5N1 gồm các protein và các đoạn –ssRNA. (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge). 1.1.2. Độc lực và tính thích ứng vật chủ Độc lực gây bệnh của virus cúm A Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại: Loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza), và loại độc lực thấp (LPAI - Low pathogenic avian influenza), cả hai loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên [41]. - HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48h sau nhiễm. Loại này rất nguy hiểm gây lo ngại cho cộng đồng. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin [17], [65]. - LPAI: là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ. Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế bào, và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm [17], [65]. Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1 Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A/H5N1 là chim hoang dã (chủ yếu là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong tự nhiên rất khó kiểm soát. Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ của chúng trong quá trình lây truyền ở tự nhiên [25]. Hình 1.3. Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của virus cúm A (Nguồn: qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1101&ID=3194) Nhờ đặc tính luôn thay đổi kháng nguyên trong tự nhiên, virus cúm A có khả năng xâm nhiễm ở nhiều loài vật chủ trung gian khác nhau như gia cầm, một số loài động vật có vú (hải cẩu, cá voi, ngựa, lợn) và cả ở người, tạo nên tính thích ứng lan truyền “nội loài” như gà - gà, hay “ngoại loài” như gà - lợn; gà - lợn - người. Vịt (vịt trời) và một số loài thuỷ cầm khác (ngỗng) luôn luôn là vật chủ tàng trữ nguồn virus gây nhiễm [21], [66], [67]. Đặc điểm thích ứng vật chủ này là điều kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi, tái tổ hợp các phân đoạn gen, đặc biệt là các phân đoạn gen kháng nguyên (gen “độc” HA và NA) giữa các chủng, tạo ra một chủng virus cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới của chúng đặc biệt khi chúng vượt qua được “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây bệnh từ gia cầm sang người và giữa người với người [21], [34], [36]. 1.1.3. Khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1 Virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hô hấp, gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp, và cũng có thể tác động gây tổn thương nhiều cơ quan khác trong cơ thể của các động vật cảm nhiễm, do đó còn được gọi là virus hướng đa phủ tạng [53] [65]. Khả năng gây bệnh của virus cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng chủng virus. Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn ở đường hô hấp của chim hoang dã và gia cầm nhiễm, nhưng một số chủng cường độc (H5, H7, và H1, H2, H3) có thể gây bệnh nặng ở hầu hết các cơ quan trong cơ thể, gây nên dịch cúm ở gia cầm và ở người, có lẽ do tính thích ứng thụ thể sialic của chúng [58], [71]. Hầu hết các chủng virus cúm A nhân lên rất tốt trong phôi gà sau lần cấy truyền thứ nhất, tuy nhiên các chủng cường độc phân type H5, H7 gây chết phôi gà ngay sau vài giờ, cả khi hàm lượng virus rất thấp chưa được nhân lên nhiều, và có thể gây bệnh cúm thực nghiệm trên chuột lang, chuột Hamster, chồn đất [25], [36]. Sau khi bị nhiễm virus cúm A, cơ thể vật chủ sinh ra đáp ứng miễn dịch chống lại virus bảo vệ cơ thể, nhưng đáp ứng miễn dịch này có thể không có tác dụng bảo vệ hoàn toàn cho những lần nhiễm sau, do virus cúm A luôn có sự biến đổi kháng nguyên của nó trong quá trình lưu hành ở tự nhiên, và không có đáp ứng miễn dịch chéo giữa các chủng virus cúm A [65]. Do đó, khi xuất hiện những biến chủng virus cúm A có đặc tính kháng nguyên khác với các chủng virus trước đó, cơ thể nhiễm sẽ không hoặc ít có đáp ứng miễn dịch bảo hộ thích ứng với chủng virus cúm mới. Đây là nguyên nhân làm cho gia cầm và con người thường bị mắc bệnh cúm nhiều lần trong năm, và các đợt dịch cúm xảy ra về sau thường nặng nề hơn và có thể gây nên đại dịch cúm mới [26]. Khả năng gây bệnh của biến chủng virus cúm mới giảm hoặc biến mất, khi cơ thể có được đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với biến chủng đó và chúng trở nên thích nghi lây nhiễm ở loài vật chủ mới [67], ví dụ: virus A/H1N1, A/H2N2, A/H3N2 là nguyên nhân của các đại dịch cúm trên người trước đây và đã thích nghi lây nhiễm ở người. Tuy nhiên, các chủng này vẫn thường gây ra các vụ dịch cúm tản phát hàng năm ở người, do khả năng biến đổi kháng nguyên của chúng [34]. Đây cũng chính là nguồn virus trao đổi gen với các chủng virus cúm đang lưu hành ở gia cầm, để thích ứng lây nhiễm gây bệnh cho nhiều loài khác ngay cả trên người [22], [64], [65], [67]. 1.1.4. Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm [49], [53]. Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp của HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này, và cuối cùng là giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm. Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra trong nguyên sinh chất), và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào nhiễm nhờ vai trò của enzyme neuraminidase. Thời gian một chu trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt virus mới của virus cúm chỉ khoảng vài giờ. Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử, và rơi vào quá trình chết theo chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ [60], [65]. Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và các RNA vận chuyển. Phức hợp protein – RNA của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào [18]. Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase. Các sợi này không được Adenine hóa (gắn thêm các Adenine - gắn mũ) ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào. Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’, sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus. Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng “nảy chồi” của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của virus. Sau cùng các RNP của virus được hợp nhất với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid. Các NA phân cắt các liên kết này và giải phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác [49], [50]. Hình 1.4. Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A/H5N1 trong tế bào chủ (Nguồn: 1.2. Kháng nguyên HA Hemagglutinin hay Haemagglutinin là glycoprotein kháng nguyên tìm thấy trên bề mặt của virus cúm cũng như nhiều vi khuẩn và virus khác. Nó có tác dụng gắn virus vào tế bào bị nhiễm. Tên gọi của HA bắt nguồn từ việc protein HA có khả năng ngưng kết hồng cầu (hem: bao vây). 16 loại kháng nguyên HA khác nhau được đánh dấu từ 1 đến 16. H16 mới được phát hiện ở virus phân lập từ mòng biển đầu đen tại Thuỵ Điển và Na Uy năm 2005 [15]. Ba loại protein HA đầu tiên (H1, H2 và H3) được tìm thấy phổ biến ở virus cúm người [43]. Cấu trúc: Hình 1.5. Mô hình cấu trúc protein 3 chiều của HA (Nguồn: HA là một glycoprotein màng tạo thành từ 3 tiểu phần giống hệt nhau. Nó có hình trụ, dài khoảng 135 Ǻ. 3 monomer tạo thành lõi xoắn alpha ở giữa; 3 đầu hình cầu chứa vị trí gắn sialic acid. Những monomer HA được tổng hợp, glycosyl hoá, rồi cắt thành hai chuỗi polypeptide nhỏ hơn: HA1 và HA2. Mỗi monomer bao gồm một chuỗi xoắn dài HA2 neo bám vào màng virus và một hạt HA1 lớn ở đầu [51]. Phân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus cúm A (ở A/H1N1 là 1778 bp, ở H9N1 là 1714 bp, ở H5N1 là khoảng 1704 - 1707 bp). Đây là gen chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt virus cúm, gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2. Vùng nối giữa HA1 và HA2 gồm một số amino acid mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide, đó là điểm cắt của enzym protease, và đây là vùng quyết định độc lực của virus [19], [30]. Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 63.103 Dal (nếu không được glycosyl hóa) và 77.103 Dal (nếu được glycosyl hóa, trong đó HA1 là 48.103 Dal và HA2 là 29.103 Dal) [40], [46]. Chức năng: Cho phép nhận biết tế bào đích của động vật có xương sống và hoàn thành quá trình nhận biết bằng cách gắn kết với thụ thể chứa sialic acid của những tế bào này; và cho phép đưa bộ gen của virus vào tế bào đích bằng cách hợp nhất màng endopisome của tế bào chủ với vỏ ngoài virus [52]. Cơ chế hoạt động: HA gắn kết với phân tử glycoprotein trên bề mặt của tế bào đích, dẫn đến các phân tử virus kết dính với tế bào vật chủ. Màng tế bào sẽ bao bọc lấy virus và phần màng này sẽ tách ra hình thành một màng mới nằm trong tế bào gọi là endosome, endosome chứa virus được bao gói. Tế bào sau đó bắt đầu cố gắng phân giải những thành phần bên trong endosome bằng cách acid hoá phần bên trong nó và biến nó thành một lysosome (thể sinh tan). Tuy nhiên, ngay khi pH trong endosome xuống 6.0, cấu trúc vốn được gấp lại của phân tử HA trở nên không bền, mở ra một phần và giải phóng một chuỗi peptide rất kị nước nằm trong phân tử protein. Chuỗi fusion protein này hoạt động như một mỏ neo, gắn vào màng của endosome và khoá lại. Sau đó, ở pH thấp hơn, phần còn lại của HA sẽ gấp lại hình thành một cấu trúc mới, rút mỏ neo lại và kéo màng endosome vào sát màng virus rồi hợp nhất hai màng này. Ngay lúc này, các thành phần của virus, bao gồm RNA genome, tự do hoà vào tế bào chất [43]. 1.3. Tình hình nghiên cứu cúm A và vấn đề nghiên cứu vaccine cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới 1.3.1. Tình hình nghiên cứu cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới Cúm A/H5N1 là một virus có độc lực cao, và gây bệnh trên người trong các vụ dịch cúm gà những năm 1996 - 2008, đặc biệt ác liệt là do virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI, highly pathogenic avian influenza) gây ra kể từ năm 2003 cho đến nay và phát sinh nhiều dưới dòng (sublineage) và nhóm/phân nhóm (clade) có độc lực rất cao [36], [53]. Chủng virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959. Có thể gọi cúm A/H5N1 phân lập năm 1959 tại Scotland là virus cúm A/H5N1 cổ điển (danh pháp: A-Ck-Scotland-(59)(H5N1) (số đăng ký: X07869). Từ đó cho đến nay, H5 và N1 đã có thay đổi lớn xét về cấu trúc thành phần gen và kháng nguyên miễn dịch [37]. Sau gần 40 năm không phát hiện, cúm A/H5N1 xuất hiện tại Quảng Đông (1996), và Hồng Kông (1997) với biến đổi sâu sắc, không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng và gây chết người bệnh. Cúm A/H5N1 giai đoạn 2003 đến nay, cơ bản về cấu trúc vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực (tính gây bệnh), loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên - miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với nhiều biến chủng H5N1 trước đây [38], [57], [72]. Nhằm ngăn chặn dịch bệnh lây lan, trong hơn mười năm qua, trên thế giới đã có hàng trăm triệu gia cầm đã bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi và kinh tế. Đặc biệt, số người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1, mỗi năm một cao hơn, theo thống kê số người bị nhiễm cúm gia cầm H5N1 báo cáo với Tổ chức Y tế thế giới (WHO), từ năm 2003 đến tháng 6/2008, đã có tới 385 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó, 243 trường hợp đã tử vong chiếm tới 63,11%. Việt Nam và Indonesia là các 2 quốc gia có số người nhiễm và tử vong cao nhất do virus cúm A/H5N1 trên thế giới. Tính gây bệnh của A/H5N1 thể độc lực cao không chỉ giới hạn ở chức năng điểm cắt protease của HA và hoạt tính của NA, mà là hiệu ứng của sản phẩm đa gen và khả năng tái tổ hợp tạo virus mới với đặc tính gây bệnh và độc lực khác nhau là vấn đề cần tính đến. Hàng ngàn công trình nghiên cứu về cúm A nói chung và cúm A/H5N1 nói riêng, đặc biệt trong 5 năm gần đây, trong đó có phát triển công nghệ và các loại vaccine gây miễn dịch cho gia cầm và chuẩn bị đối phó với đại dịch có thể xảy ra ở người. Virus cúm A/H5N1 có 3 trong 4 tính chất cần có để tạo một đại dịch: có khả năng lây nhiễm trên người, gần như tất cả mọi người đều chưa có đáp ứng miễn dịch bảo vệ và virus có khả năng gây chết cao. Trong số 16 nước có người chết do cúm gia cầm, Inonesia và Việt Nam được WHO xác định là quốc gia “điểm nóng” có thể cúm A/H5N1 có được các điều kiện thuận lợi để tiến hóa thích nghi lây nhiễm và trở thành virus của người. Không giống như dịch cúm A/H5N1 giai đoạn 1996 - 2002, có thể khống chế bằng cách tiệu diệt và loại trừ loài gia cầm trong vùng dịch để cắt đứt nguồn lây. Cúm A/H5N1 thể độc lực cao giai đoạn 2003 đến nay, với sự xuất hiện nhiều genotype khác nhau, đặc biệt là genotype Z, lan truyền từ Nam Trung Quốc đến các nơi khác trên thế giới, đây vẫn là thách thức đối với cộng đồng và cần nghiên cứu ứng dụng các phương pháp khác nhau để khống chế sự lây truyền một cách có hiệu quả. Theo số liệu thống kê năm 2006, virut cúm gia cầm đã làm số người chết ở Indonesia 45 người, Trung Quốc là 8 người, Thái Lan là 3 người, và cho đến nay, chủng A/Vietnam/1203/2004 (Viet04) là một trong những chủng có độc tính cao nhất ở động vật có vú, như chồn và chuột. Trước tình hình lây lan của dịch cúm A/H5N1. Trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu như: Nghiên cứu định type, biến đổi di truyền và gen học tiến hóa của virus cúm A/H5N1 được các cơ quan nghiên cứu của Việt Nam tiến hành ngay từ những tháng đầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm cuối năm 2003. Những chuỗi gen giúp xác định phân type H5, phân type N1 và các gen cấu trúc đã được Viện Công nghệ Sinh học, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Thú y giải mã và công bố trên Ngân hàng gen [35], [44]. Trên cơ sở phân tích trình tự gen kháng nguyên H5 và N1, các tác giả khẳng định nguồn gốc của virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và người tại Việt Nam cùng nhóm với virus H5N1 phân lập tại Trung Quốc [35]. Các biến chủng H5N1 của Hồng Kông, Trung Quốc phân lập những năm 1997 - 2001 và Hàn Quốc, Đài Loan (phân lập năm 2003) đều có nguồn gốc từ chim cút và ngỗng (A/Goose/Guandong/1/96) vùng Quảng Đông (Trung Quốc), đó là các biến chủng thuộc dòng Quảng Đông [35]. Như vậy, virus cúm gia cầm gây bệnh ở gia cầm và người tại Việt Nam là cúm H5N1 type A thuộc thế hệ mới đã có biến đổi cơ bản về gen H5 và gen N1, nhưng vẫn có cùng nguồn gốc với H5N1 từ vùng địa lý Nam Trung Quốc và Hồng Kông. Các chủng phân lập những năm 2004-2006 đã được nghiên cứu khá chi tiết về góc độ gen học và quan hệ phân tử với các chủng trong vùng và thế giới, kết quả khẳng định virus H5N1 vùng Nam và Đông Nam Á thuộc nhóm di truyền VTM (viết tắt: Vietnam-Thailand-Malaysia), có những đặc tính sinh học nhất định khác với các nhóm vùng Trung Quốc và Hồng Kông [21], [45]. Năm 2007, xuất hiện thêm biến chủng H5N1 dưới dòng Phúc Kiến tại Việt Nam, đã và đang làm phức tạp thêm vấn đề dịch tễ học và quan hệ kháng nguyên và miễn dịch, do tỷ lệ tương đồng kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) thấp so với các chủng phân dòng Quảng Đông, tuy nhiên vẫn còn có khả năng bảo hộ miễn dịch [1]. Vấn đề chẩn đoán và xây dựng phương pháp phát hiện nhanh và phân biệt cúm A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệt các phân type HA và NA đã được các nhà khoa học Việt Nam quan tâm, kết hợp nghiên cứu với các tổ chức thế giới. Phát hiện nhanh H5N1 và các phân type khác bao gồm việc sử dụng kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc sinh học phân tử đã được xây dựng thành phương pháp [70]. Nghiên cứu vaccine và miễn dịch, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã có những đóng góp nhất định về tạo chế phẩm kháng nguyên, tạo vaccine di truyền ngược hoặc vector tái tổ hợp trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam [1]. Về nghiên cứu sản xuất vaccine, Viện Công nghệ sinh học được giao đề tài độc lập cấp Nhà nước “Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm” và “Đánh giá chất lượng vaccine phòng bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm tại Việt Nam bằng chủng NIBRG-14” trong giai đoạn 2006 - 2008, kết hợp với Viện Thú y, Xí nghiệp thuốc Thú y trung ương (VETVACO), Công ty Thuốc thú y trung ương II (NAVETCO), Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y trung ương, thực hiện nghiên cứu có được vaccine sản xuất từ chủng NIBRG-14 [2]. 1.3.2. Nghiên cứu phát triển vaccine cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới Trong tự nhiên, “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” là các hiện tượng xảy ra liên tục theo thời gian, còn “trộn kháng nguyên” tái tổ hợp subtype Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) thường định kỳ xảy ra giữa các loài mắc nhằm tạo nên các biến thể virus cúm mới mà hệ miễn dịch của cơ thể vật chủ không có khả năng nhận dạng đáp ứng và kịp hình thành miễn dịch. H5N1 sử dụng thụ thể sialic xâm nhập tế bào [71]. Hemagglutinin cùng với protein enzyme neuraminidase, được xác định là protein có vai trò kháng nguyên và độc lực [62] và các protein kháng nguyên có nguồn gen từ các chủng H5N1 của Việt Nam, cũng được nghiên cứu sản xuất bằng kỹ thuật tái tổ hợp và sử dụng với các mục đích khác nhau, trong đó có thử nghiệm làm kháng nguyên kích thích miễn dịch và chẩn đoán. Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tính chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch. Đối với dịch cúm A/H5N1 ở gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người [36]. Kháng thể đặc hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vaccine, và đó là các kháng thể kháng HA, NA, MA và nhiều loại hình khác của virus đương nhiễm, góp phần vô hiệu hóa virus cúm đúng đối tượng khi chúng xâm nhập vào. Có nhiều loại kháng thể, nhưng trước hết chỉ kháng thể kháng HA(H5) có vai trò tiên quyết quan trọng trong quá trình trung hòa virus cho bảo hộ miễn dịch. Các vaccine phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới [17] Vaccine truyền thống: bao gồm vaccine vô hoạt đồng chủng và dị chủng. Vaccine vô hoạt đồng chủng (homologous vaccine), đó là các loại vaccine được sản xuất chứa cùng những chủng virus cúm gà giống như chủng gây bệnh trên thực địa. Vaccine vô hoạt dị chủng (heterologous vaccine) là vaccine sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa, nhưng có kháng nguyên NA dị chủng. Vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen: là loại vaccine được sản xuất dựa trên sử dụng kỹ thuật gen loại bỏ các vùng “gen độc” đang được nghiên cứu và đưa vào sử dụng phổ biến, bao gồm: Vaccine tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền: sử dụng virus đậu gia cầm làm vector tái tổ hợp song gen H5 và N1 phòng chống virus type H5N1 và H7N1. Ví dụ, hãng Merial của Pháp sản xuất vaccine TrovacAIV-H5 lấy nguồn gen H5 từ chủng A/Turkey/Ireland/83 (H5N2), sử dụng được cho gia cầm lúc 1 ngày tuổi. Vaccine dưới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và tách chiết làm vaccine. Vaccine tái tổ hợp có vector dẫn truyền: sử dụng adenovirus hoặc Newcastle virus hoặc virus đậu chim làm vector dẫn truyền, lắp ghép gen kháng nguyên H5 vào hệ gen của adenovirus, tạo nên virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống virus cúm A/H5N1. Vaccine DNA: sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp chứa gen HA, NA, NP, M2 đơn lẻ hoặc đa gen [42]. Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo: được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ gen, trong đó các gen kháng nguyên H5 có vùng "độc" đã được biến đổi bằng kỹ thuật gen [59]. Có 3 loại vaccine đã được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vaccine trên thế giới hiện nay, đó là NIBRG-14 (NIBSC), VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1-PR8/CDC-rg (CDC). Hai chủng cúm A/H5N1 cung cấp nguồn gen H5 và N1 là A/Vietnam/1194/2004(H5N1) hoặc A/Vietnam/1203/2004(H5N1). Trung Quốc cũng là nước sản xuất nhiều giống virus vaccine chống cúm, ví dụ, Viện Nghiên cứu Thú y Harbin (Cáp - Nhĩ - Tân) đã thành công trong việc tạo giống vaccine vô hoạt nhũ dầu đơn chủng lấy nguồn gen H5 và N2 từ chủng A/Turkey/England/N-28/73(H5N2), loại subtype H5N2 có độc lực yếu; hay giống vaccine vô hoạt nhũ dầu đơn chủng lấy nguồn gen H5 và N1 từ chủng A/Goose/Guangdong/1996(H5N1), loại có độc lực yếu [59]. Các loại vaccine này đã được nhập và sử dụng tại Việt Nam từ năm 2006 cho đến nay. Vaccine thế hệ mới chủng NIBRG-14: Chủng NIBRG-14 là giống virus vaccine nhược độc (attenuated vaccine) thế hệ mới, thuộc loại hình vaccine được xóa gen bằng công nghệ gen (gene-deletion vaccines), được lắp ráp nhân tạo bằng kỹ thuật di truyền ngược (reverse genetics –based technology) và thích ứng nhân lên khi nuôi cấy trên phôi gà. Phương pháp di truyền ngược được sử dụng để tạo ra chủng virus nhân tạo nhược độc làm vaccine, cụ thể hệ gen của chủng nhân tạo NIBRG-14 này được tái tổ hợp gen trên cơ sở sử dụng chủng gốc PR8/34 (A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)) cung cấp 6 gen khung là PA, PB1, PB2, NP, MA, NS làm nền, còn các gen kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) được lấy từ chủng cúm cường độc gây bệnh phân lập năm 2004 tại Việt Nam (A/Vietnam/1194/2004(H5N1)) [59]. Bằng thao tác kỹ thuật gen, gen H5 đã bị đột biến làm mất hẳn 4 amino acid RRRL, cùng với một số đột biến điểm ở các bộ mã ở hai đầu của vùng “độc”, làm thay đổi 3 amino acid tại vùng gây độc. Như vậy về mặt miễn dịch học, mặc dù virus được xử lý làm mất độc tính gây bệnh nhưng vẫn giữ nguyên bản chất đặc tính kháng nguyên bề mặt giống hệt như virus cúm A/H5N1 đã lấy mẫu ban đầu, do vậy, có khả năng tạo kháng thể kháng lại kháng nguyên bề mặt loại virus H5N1 gây bệnh trong tự nhiên. 1.4. Kỹ thuật chuyển gen thông qua A.rhizogens và ứng dụng 1.4.1. Giới thiệu vi khuẩn A.rhizogens Agrobacterium là các loài vi khuẩn đất, thuộc nhóm Gram (-), yếm khí, khi xâm nhập qua vết thương, các loài vi khuẩn này gây ra các triệu chứng bệnh trên thực vật như tạo khối u hay lông rễ. Agrobacterium thuộc họ Rhizobiaceae, chi Agrobacterium có 4 loài chính: Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogens, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rubi. Trong đó A. tunefaciens và A. rhizogenes là hai loài được nghiên cứu nhiều nhất là vi khuẩn gây ra bệnh khối u (crown gall) và bệnh lông rễ (hairy root) ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm. Tác nhân gây bệnh của hai loài vi khuẩn trên đã được xác định là do sự có mặt của Ti (tumour inducing) ở A. tumefaciens và Ri (root-inducing) ở A. rhizogenes [23]. Khi tế bào thực vật bị thương, sẽ tiết ra các polyphenol hấp dẫn các vi khuẩn, tại đây nó chuyển đoạn T-DNA (transfer DNA) từ T-plasmid hay R-plasmid vào hệ gen của tế bào vật chủ. Nhìn chung, cơ chế của quá trình xâm nhiễm và cơ chế phân tử của quá trình vận chuyển T-DNA vào tế bào vật chủ của hai loài vi khuẩn này được chính minh là tương tự nhau [56]. Tuy nhiên, sự hình thành khối u ở vi khuẩn A. tumefaciens do gen mã hóa sinh tổng hợp auxin quy định. Trong khi đó các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin ở vi khuẩn A. rhizogenes có vai trò rất nhỏ trong quá trình hình thành rễ tơ ở thực vật [24], [56]. Giống như Ti-plasmid, Ri-plasmid là phân tử DNA mạch vòng, sợi kép, có trọng lượng phân tử lớn, từ 200 - 800 kb, gồm hai vùng chính là T-DNA và vir (virulence). Dựa vào khả năng sinh tổng hợp các opine ở rễ tơ - nguồn cacbon và nito cho vi khuẩn. Ri-plasmid được chia làm hai nhóm chính: agropine và mannopine và một số nhóm phụ được tìm thấy và phân loại sau này như: cucumopine và mikimopine. Trong đó các chủng thuộc nhóm agropine (A4, 15834, LBA9402, 1855) được chứng minh là độc hơn so với các chủng thuộc nhóm mannopine (8196, TR7, TR101) và các chủng này được sử dụng chủ yếu trong các nghiên cứu tạo rễ tơ ở thực vật [13], [56]. T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropine bao gồm hai vùng chính là vùng biên trái TL-DNA và biên phải TR-DNA. Hai vùng này đều có kích thước khoảng 15 - 20 kb và được xen kẽ bởi một đoạn DNA, đoạn DNA này sẽ không được chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ. Vùng TR-DNA mang các gen mã hóa tổng hợp DNA (tms1 và tms2), vùng TL-DNA bao gồm 18 khung đọc (ORFs) trong đó có bốn loci 10, 11, 12 và 15 mã hóa cho rol A, B, C và D (root locus). Các Ri-plasmid của các chủng A.rhizogenes thuộc nhóm mannopine, cucumopine và mikimopine chứa vùng T-DNA đơn, có cấu trúc giống như vùng TL-DNA của các chủng thuộc nhóm agropine nhưng khuyết gen rolD [20], [24]. Hình 1.6. Cấu trúc Ri plasmid Các gen rolA, rolB and rolC đóng vai trò quan trọng trong quá trình cảm ứng tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật. Sự biểu hiện đồng thời của ba gen này gây nên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm. Các rễ tơ đặc điểm sinh trưởng, phân nhánh mạnh và phát triển nhanh hơn rất nhiều so với rễ bình thường [54]. Trong 3 gen rol trên, gen rolB đóng vai trò quan trọng hơn cả, khi gen rolB được biểu hiện, mô tế bào thực vật đã cảm ứng tạo kiểu hình rễ tơ, trong khi đó khi bất hoạt gen rolB không tạo được kiểu hình rễ tơ [20]. 1.4.2. Hệ vector nhị thể Kích thước lớn của Ri-plasmid và Ti-plasmid gây nhiều khó khăn trong quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium và trong các thao tác sử dụng để thiết kế gen vào các vector này. Mặt khác các enzyme giới hạn có thể cắt DNA của Ti-plasmid ở nhiều chỗ khác nhau, trong khi công nghệ gen lại cần những vị trí cắt duy nhất cho hoạt động của một số enzyme giới hạn. Thêm vào đó, ở A.tumefaciens, một số gen mã hóa sinh tổng hợp auxin được sử dụng làm chỉ thị chọn lọc có tính trội nhưng lại cản trở quá trình tái sinh bình thường ở thực vật. Với các lí do trên đây, các nhà khoa học đã cải tiến Ti-plasmid thành một hệ vector nhị thể gồm có vector chuyển gen (mang cấu trúc T-DNA) và vector bổ trợ (mang các gen vir) đảm nhiệm chức năng vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật [11]. Vector chuyển gen trong hệ vector nhị thể ở A.tumefaciens có thể sử dụng để chuyển gen thông qua A.rhizogenes. Khi nhiễm A.rhizogenes với thực vật sẽ làm chuyển T-DNA từ vector chuyển gen cùng với T-DNA của A.rhizogenes vào genome thực vật [7]. Sự tái sinh thành cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A.rhizogenes có thể xảy ra thông qua sự phát triển phôi soma hoặc sự phát sinh cơ quan từ rễ. Tuy nhiên, thực vật tái sinh từ lông rễ thường bị biến đổi hình thái: lá bị gấp nếp, hệ thống rễ ăn nghiêng, sinh trưởng cằn cỗi và khả năng sinh sản kém. Hình 1.7. Hình ảnh tạo khối u gây ra do A. tumefaciens (trái) và rễ tơ do A. rhizogenes (phải). 1.4.3. Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất dược phẩm sinh học tái tổ hợp Tế bào thực vật nói chung và rễ tơ nói riêng với ưu thế nuôi cấy dễ dàng, môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, dễ dàng sản xuất một lượng sinh khối lớn trong khoảng thời gian ngắn và quan trọng hơn cả tế bào thực vật không mang các mầm bệnh cho người [27], [33] được xem là một trong những xu hướng hiện nay được sử dụng để biểu hiện các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Đặc biệt rễ tơ có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng vì thế loại bỏ được dư lượng của các chất này trong sản phẩm tạo ra. Hơn nữa các rễ tơ có thể được nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Thêm vào đó, so sánh với thực vật chuyển gen, nuôi cấy mô tế bào thực vật có ưu điểm lớn trong công tác sản xuất các dược phẩm sinh học tái tổ hợp là không đòi hỏi diện tích canh tác, không chịu ảnh hưởng vào khí hậu, mùa vụ, sản phẩm thu được không mang các yếu tố độc hại từ thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ và rút ngắn được rất nhiều thời gian trong trồng trọt. Đặc biệt hơn cả ở hệ thống nuôi cấy lỏng các mô tế bào thực vật việc biểu hiện dược phẩm sinh học tái tổ hợp ra ngoài môi trường nuôi cấy giúp làm đơn giản hơn rất nhiều trong quá trình tinh sạch các dược phẩm sinh học này [4]. Cho tới nay, đã có nhiều nghiên cứu sản xuất thành công các protein tái tổ hợp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy rễ tơ như SEAP (human secreted alkaline phosphatase) [32], protein huỳnh quang kết hợp với protein ricin B (GFP-ricin B) [47], fungal phytase [39], và đặc biệt hơn cả là các kháng thể và các chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của kháng thể [29], [68] (hình 1.8). Hình 1.8. Nuôi cấy rễ tơ G.glabra a: bằng hệ thống bioreactor b, c: thu hoạch sinh khối rễ sau 30 ngày nuôi cấy (Nguồn: CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị 2.1.1. Vật liệu a. Thực vật: Giống thuốc lá Nicotiana tabacum L. K326 đang nuôi cấy trong điều kiện in vitro do Phòng Công nghệ Tế bào Thực Vật-Viện Công nghệ sinh học cung cấp. b. Chủng vi khuẩn: - Chủng vi khuẩn E. coli One Shot TOP 10 (Invitrogen). - Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 (Viện Sinh học phân tử và Dược học, Trường Đại học Heidelberg, CHLB Đức) c. Các vector: - HA của virus H5N1 đã được tối ưu hóa mã để biểu hiện ở thực vật do Viện Công nghệ sinh học cung cấp. - Vector chuyển gen pK7WG2D(1) (phụ lục 2) - Vector pENTRTM221/cal nhận từ Viện Sinh học phân tử và Dược học, Trường Đại học Heidelberg, CHLB Đức. Vector này được thiết kế mang đoạn signal peptide calreticulin nằm giữa hai vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2 và hai điểm cắt của enzyme giới hạn là SacI và HindIII nằm ở đầu 3’ của đoạn tín hiệu dẫn (phụ lục 2). - Vector chuyển gen pPTN289 mang gen gus được sử dụng để kiểm tra qui trình chuyển gen sử dụng trong nghiên cứu (phụ lục 2) 2.1.2. Hóa chất a) Các môi trường nuôi cấy: - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: LB, YMP. - Môi trường nuôi cấy thực vật: WPM, MS. Thành phần của các loại môi trường được trình bày trong phụ lục 1. b) Các loại kháng sinh: Kanamycin, Cefotaxim, Carbecillin, Spectinomycine. c) Một số hóa chất khác: Kit tinh sạch DNA -AccuPrep® Gel Purification Kit, Gateway® LR ClonaseTM II, thang DNA 1kb và các loại enzyme giới hạn SacI, HindIII. Các hóa chất được cung cấp bởi các hãng: New England Biolabs (Anh), Amersham Pharmacia Biotech (Thụy Điển), Chemicals (Đức), Sigma (Mỹ), Duchefa (Hà Lan), Invitrogen (Mỹ). 2.1.3. Thiết bị Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: box cấy vô trùng, bình nuôi cây, nồi khử trùng, bể ổn nhiệt, máy nuôi lắc, máy đo pH, máy quang phổ… Một số thiết bị dùng trong sinh học phân tử: máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh, máy soi gel, máy ly tâm, máy xung điện Gel Pluser, máy hút chân không .., cùng với các trang thiết bị khác của phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm gen, Viện Công nghệ sinh học. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp nhân đoạn gen HA1bằng kỹ thuật PCR a. Thiết kế mồi cho gen HA1 Cơ sở lý thuyết Mồi là các đoạn trình tự dài 15 - 30 nucleotide có khả năng bắt cặp với trình tự bổ sung tương ứng, có vai trò làm điểm khởi đầu cho quá trình tổng hợp chuỗi nucleotide trong phản ứng PCR theo chiều 5’ - 3’. Mỗi đoạn gen được nhân lên nhờ một cặp mồi đặc hiệu nằm ở hai đầu đoạn gen đó. Phương pháp Cặp mồi HA1_SacI_F (5’-GGGGAGCTCGATCAGATCTGCATTGGAT-3’) và HA1_HindIII_R (5’-GGGAAGCTTTTACCTTCTTTCTCTCTGTGG-3’) được thiết kế với mục đích khuyếch đại vùng gen HA1 dựa vào trình tự gen HAop (pUC18/HA1) (phụ lục 3). b. Kỹ thuật PCR Cơ sở lý thuyết Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi polymerase) dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung và phản ứng kéo dài đoạn trình tự mồi nhờ enzym Taq DNA polymerase để khuếch đại theo hàm mũ các đoạn DNA quan tâm lên hàng triệu lần. Phương pháp Cấu trúc gen HA1 được nhân lên bằng kỹ thuật PCR_với cặp mồi đặc hiệu HA1_Sacl_F/HA1_HindIII_R/HA1. Để đảm bảo độ chính xác cao cho thí nghiệm, chúng tôi sử dụng Pfu DNA polymerase để thay thế Taq-polymerase trong phản ứng PCR. Sản phẩm PCR được chạy điện di kiểm tra bằng gel agarose 0,8%, sử dụng đệm TAE 1X trước khi tiến hành các bước thí nghiệm tiếp theo. Phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen HA1 quan tâm từ HAop được tiến hành với thành phần được trình bày trong bảng 2. 1 và chu kỳ nhiệt trong bảng 2.2. Trong đó, nhiệt độ gắn mồi được xác định dựa trên nhiệt độ bắt mồi của cặp mồi đã được thiết kế. Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (100 µl) 1 Nước deion khử trùng 59 2 Buffer 10x 10 3 dNTPs 8 4 MgCl2 10 5 DNA (50ng) 4 6 Taq polymerase 1 7 Primer F 4 8 Primer R 4 Tổng 100 Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR Bước Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ 1 Biến tính 95 3 phút 1 2 Biến tính 95 30 giây 30 3 Gắn mồi 57 30 giây 4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30 giây 5 Hoàn tất chuỗi 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞ 2.2.2. Phương pháp ghép nối đoạn gen HA1vào pENTR221/cal a. Phản ứng cắt enzyme giới hạn - Vector pENTR/cal: là vector tiếp nhận, trên vector này có tín hiệu dẫn calreticulin nằm giữa hai vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2 và hai điểm cắt của enzyme giới hạn là SacI và HindIII nằm ở đầu 3’ của đoạn tín hiệu dẫn. Hai vị trí tái tổ hợp attL1 và attL2 sẽ phục vụ cho bước thiết kế vector chuyển gen bằng công nghệ Gateway cloning (mục 2.2.4). Trên vector còn có gen kháng kháng sinh kanamycin và vị trí gắn mồi M13, phục vụ cho việc chọn lọc các dòng khuẩn lạc mang plasmid mong muốn. - Sản phẩm PCR – đoạn gen HA1 (mục 2.2.1) được tinh sạch theo bộ kit AccuPrep® PCR Purification Kit (Bionner). SacI attL1 attL2 HindIII 1 AATGCCAACT TTGTACAAAA AAGCAGGCTC ATTTAACTTT AAGAAGGAGA TATATACCAT 61 GGCTACTCAA CGAAGGGCAA ACCCTAGCTC TCTCCATCTA ATTACTGTAT TCTCTCTGCT 121 CGTCGCTGTC GTCTCCGCTG AGCTCTCTAG AAAGCTTGAC CCAGCTTTCT TGTACAAAGT TGGC CCC Hình 2.1. Cấu trúc attL1_Cal/SacI&HindIII/attL2 nằm trong vector pENTR/Cal - Phản ứng cắt enzyme giới hạn: Đoạn gen HA1 và pENTR/cal được cắt bằng enzyme giới hạn SacI và Hind III theo bảng 2.3 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O deion 9,5 µl 2 Buffer 10x 10 µl 3 DNA (~1µg) 80 µl 4 Enzyme (SacI + HindIII) 0,25 + 0,25 Phản ứng được ủ ở 370C trong vòng 2-4 h b. Phản ứng lai ghép nối đoạn gen HA1vào pENTR221/cal Sản phẩm PCR – đoạn gen HA1 được ghép nối vào vector pENTR/cal tạo plasmid tái tổ hợp mang gen HA1 (ký hiệu pENTR/cal/HA1). Bảng 2.4. Thành phần phản ứng lai STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước 0 2 Buffer 10x 1 3 Sản phẩm cắt (pENTRY) 5 4 Sản phẩm cắt (HA1) 3 5 Enzyme ligation 1 Tổng thể tích 10 Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ 220C trong 1 giờ 30 phút. Đặt phản ứng trong đá và chuẩn bị thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli DH5α. 2.2.3. Biến nạp sản phẩm ghép nối gen vào tế bào khả biến E. coli DH-5α bằng phương pháp sốc nhiệt a. Chuẩn bị tế bào khả biến - Cơ sở lý thuyết Tế bào nuôi cấy trên môi trường mới đến đầu pha log và được làm sạch nhờ việc rửa nhiều lần bằng CaCl2 0,1M. Dưới tác dụng của muối CaCl2, thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi thay đổi nhiệt độ đột ngột. Tế bào chứa DNA tái tổ hợp có khả năng biểu hiện các gen kháng kháng sinh nên được chọn lọc trên môi trường chứa chất kháng sinh đó. - Phương pháp tạo tế bào khả biến Tế bào khả biến E. coli One Shot TOP 10 được tạo theo phương pháp của Sambrook và cộng sự (1998) có cải tiến ở bước rửa cặn khuẩn trong CaCl2 0,1M sau khi ly tâm. Bước này được lặp lại ba lần, để trong đá lần đầu và thứ hai 30 phút, lần thứ ba 45 phút. b. Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E.coli DH-5α Sản phẩm phản ứng ligation được biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli DH-5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Quá trình biến nạp được thực hiện như sau: • Bổ sung 5 µl sản phẩm phản ứng lai vào tế bào khả biến và đảo nhẹ • Ủ trong đá 15 – 30 phút. • Sốc nhiệt ở 420C trong 1 phút 30 giây. • Để trong đá 15 - 30 phút. • Bổ sung 200 µl LB lỏng. • Nuôi lắc 200v/phút ở 370C trong 1giờ. • Cấy trải 100 µl dịch biến nạp trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc (Kanamycin 50 mg/L). • Nuôi qua đêm ở 370C c. Kiểm tra khuẩn lạc dương tính bằng kỹ thuật colony PCR Kỹ thuật colony-PCR cũng giống như PCR, nhưng chỉ khác là mẫu DNA được thay bằng khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao (94-950C), màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp này sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu. d. Đọc trình tự Để chắc chắn rằng plasmid pENTR/cal/HA1 có mặt trong các dòng khuẩn lạc và đoạn gen HA1 ghép nối chính xác, chúng tôi tiến hành đọc trình tự các pENTR/cal/HA1 sử dụng cặp mồi đặc hiệu M13F/R. e. Tách chiết plasmid từ tế bào vi khuẩn Chúng tôi tiến hành nuôi cấy khuẩn lạc mang pENTR/cal/HA1 đã được kiểm tra đọc trình tự trong môi trường LB lỏng có bổ sung Kanamycin 50 mg/L ở 370C qua đêm. Các tế bào E.coli mang plasmid sau khi nuôi cấy đến pha cân bằng thì được ly tâm thu cặn. Thành và màng tế bào được phá vỡ bằng kiềm và chất tạo sức căng bề mặt. Sau đó, DNA hệ gen và protein được tủa lại bằng muối potassium acetate và SDS, phần tủa bị loại bỏ khỏi dung dịch chứa DNA plasmid bằng ly tâm. Dịch DNA được cố định trên màng của cột tinh sạch, sau khi rửa và hòa tan trong nước, DNA được thu lại bằng ly tâm tốc độ cao. Phương pháp tách chiết plasmid được thực hiện theo protocol của kit Plasmid Extraction Kit (Bionner) hoặc theo Sambrook và cộng sự (1998). 2.2.4. Tạo vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway a. Cơ sở lý thuyết Kỹ thuật Gateway là một kỹ thuật dòng hóa phổ biến, nó mang lại hiệu quả cao và nhanh chóng khi phân tích chức năng, biểu hiện protein và dòng hóa đoạn DNA. Dựa vào điểm đặc hiệu trong hệ thống tái tổ hợp của phage I. Kỹ thuật Gateway cho phép chuyển đoạn DNA giữa các vector tách dòng khác nhau trong khi vẫn duy trì định hướng chính và cấu trúc đọc, thay thế việc sử dụng enzym cắt giới hạn và enzym nối hiệu quả. Kỹ thuật này là một phương pháp có hiệu quả cao cho việc tách dòng có định hướng của các sản phẩm PCR. Kỹ thuật này gồm có hai loại phản ứng LR và BP (Invitrogen). Trong nghiên cứu này phản ứng LR được thực hiện giữa vector tiếp nhận và vector đích pK7WG2D (1) dưới sự xúc tác bởi hỗn hợp enzym LR ClonaseTM II . Đoạn gen cần quan tâm sau khi đưa vào vector tiếp nhận (ví dụ, pENTR/HA1), ở bên sườn có hai điểm tái tổ hợp (attL1 và attL2). Chuyển đoạn gen quan tâm vào vector đích (ví dụ, pK7WG2D (1)), vector này chứa tất cả trình tự cần biểu hiện và cũng chứa hai điểm tái tổ hợp (attR1 và attR2) ở giữa hai điểm có đoạn gen chọn lọc âm tính ccdB. Trộn hai plasmid, att1 và att2 là hai điểm định hướng và đặc hiệu để tái tổ hợp, mỗi một điểm trên vector này chỉ tái tổ hợp với một điểm tương ứng trên vector kia mà không kết hợp với vị trí khác, nhưng nó sẽ kết hợp với những điểm xác định theo thứ tự phân tử., vì vậy, attL1 phản ứng với attR1, còn attL2 phản ứng với attR2. Hai sự tái tổ hợp này tạo ra dòng biểu hiện, một là giữa attL1 và attR1 thứ hai là attL2 và attR2. Sản phẩm của hai sự tái tổ hợp sẽ tạo ra một plasmid như mong muốn và các sản phẩm phụ. Plasmid mới có hai sự lựa chọn: Kháng kháng sinh và chọn lọc âm tính. Vì vậy, tế bào sau khi được biến nạp sản phẩm LR đều là những dòng khuẩn lạc dương tính trên môi trường có kháng sinh chọn lọc. Tuy nhiên, để xác định chính xác các plasmid tái tổ hợp mới được tạo thành đúng như mong đợi, các phản ứng cắt bằng enzym giới hạn và PCR cũng sẽ được thực hiện. b. Phương pháp Phản ứng lai LR: - Sản phẩm tách plasmid được tinh sạch và định lượng được sử dụng cho phản ứng LR. - Thành phần phản ứng LR được bổ sung vào ống eppendorf 1,5ml ở nhiệt độ phòng và đảo nhẹ. Bảng 2.5. Thành phần phản ứng LR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Plasmid pENTR/HA1 ( 50 - 100 ng) 0,5 2 Vector pK7WG2D 1 3 Nước deion khử trùng 2,5 Tổng 4 - Làm tan hỗn hợp enzyme LR Clonase và bổ sung vào ống 1 µl enzyme LR Clonase để phản ứng xảy ra và đảo nhẹ nhàng vài lần bằng tay rồi ly tâm để hỗn hợp bám trên thành ống xuống hoàn toàn. - Ủ phản ứng ở 250C trong 90 phút. - Bổ sung 1 µl dung dịch proteinase K để kết thúc phản ứng, đảo nhẹ nhàng. Ủ ở 370C trong 10 phút. Vector pK7WG2D là vector đích nằm trong hệ thống Gateway. Với 2 vị trí tái tổ hợp attR1, attR2 và gen ccdB - gen mã hóa plasmid F gây ức chế sự sinh trưởng của tế bào E.Coli. Khi thực hiện phản ứng LR, hai vị trí này sẽ được trao đổi với 2 điểm tái tổ hợp khác trên vector pENTR/HA1 là attL1 và attL2. Kết thúc phản ứng sẽ tạo được dòng biểu hiện mà gen cần chèn nằm giữa hai vị trí attB1 và attB2. Cấu trúc vector pK7WG2D được trình bày tại phụ lục 2. Biến nạp - Chuyển 3 µl phản ứng LR vào 50 µl tế bào khả biến E.Coli DH5α. - Ủ trong đá 15 - 30 phút. - Xung điện ở điều kiện 2,5kV, 200Ω, 25 µF. - Bổ sung 300 µl YMP lỏng, nuôi lắc 200 v/p trong 1 giờ ở 280C. - Cấy trải 50 - 100 µl khuẩn lên môi trường YMP đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc cefotaxim 500 mg/L. Ủ đĩa 2 ngày ở tủ 280C. * Chọn dòng bằng colony-PCR Lựa chọn 10 dòng khuẩn lạc mọc trên đĩa chứa kháng sinh chọn lọc để thực hiện phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu HA1_Sac I_F và HA1_Hind III_R. Phản ứng này được thực hiện tương tự như phản ứng PCR thông thường, chỉ khác là DNA được thay bằng dịch khuẩn. Sản phẩm colony-PCR được điện di kiẻm tra trên gel agarose 0,8%. Chọn các khuẩn lạc dương tính với phản ứng colony-PCR để tiến hành nuôi lỏng trong môi trường YMP qua đêm ở 280C (50 ml YMP lỏng có bổ sung 100 µl cefotaxim 500 ml/L). Dịch khuẩn sử dụng cho việc tách chiết plasmid. Sau đó, thực hiện phản ửng cắt plasmid tách được bằng hai enzyme SacI và HindIII. Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme SacI và HindIII STT Thành phần Thể tích 1 Nước deion 4,5 2 Đệm Tango 2X 2 3 Enzyme HindIII 1 4 Enzyme SacI 1 5 DNA 1,5 Tổng 10 - Bổ sung lần lượt các thành phần trên của phản ứng vào ống eppendorf 0,5 ml, ủ ở 370C trong 2 giờ. - Chạy điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 0,8% - Vector chuyển gen mang gen mong muốn sẽ được sử dụng để chuyển vào vi khuẩn A. rhizogenes bằng xung điện tạo vector tái tổ hợp. 2.2.5. Biến nạp vector chuyển gen vào A. rhizogenes ATCC15834 a . Chuẩn bị tế bào khả biến A. rhizogenes ATCC15834 50 ml tế bào vi khuẩn A. rhizogenes nuôi cấy trên môi trường mới đến đầu pha log được thu lại bằng ly tâm lạnh. Cặn của tế bào vi khuẩn được làm sạch bằng cách rửa nhiều lần bằng nước khử ion và glyxerol 10% đã được làm lạnh trước. Các thao tác được thực hiện trong box vô trùng. Bước cuối cùng bổ sung 0,5 ml glycerol 10% chia đều 50 µl vào 10 ống eppendorf và giữ ở tủ -850C. b. Phương pháp biến nạp bằng xung điện Cơ sở lý thuyết Dưới tác động của điện trường cực lớn, lỗ màng tế bào mở ra, nhờ đó DNA di chuyển theo điện trường dễ dàng xâm nhập vào tế bào. Khi ngừng xung điện, cấu trúc màng tế bào hồi phục trong môi trường LB và giữ DNA lại trong tế bào. Tế bào chứa DNA tái tổ hợp có khả năng biểu hiện các gen kháng kháng sinh nên được chọn lọc trên môi trường chứa chất kháng sinh đó. Phương pháp - Rửa cuvette bằng cồn 700, rửa lại bằng nước khử ion vô trùng rồi thấm khô. - Tế bào khả biến đặt trong đá 15 phút. - Bổ sung 1 µl plasmid vào 50 µl tế bào khả biến và trộn nhẹ. - Chuyển tất cả hỗn hợp dịch tế bào khả biến và plasmid vào cuvette. - Xung điện: 2,5 kV, 25 µF, 200 Ω. - Bổ sung 500 µl YMP và mix nhẹ. - Chuyển sang ống eppendoft 2ml. - Nuôi lắc ở 280C trong 1 giờ. - Chuyển dịch ra đĩa môi trường YMP bổ sung 100 mg/L Spectinomycine Sự có mặt của vector chuyển gen được kiểm tra bằng phản ứng colony-PCR (mục 2.2.3. c) với cặp mồi đặc hiệu hoặc bằng phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn SacI và HindIII (mục 2.2.2. a). 2.2.6. Chuyển cấu trúc mang gen mã hóa protein vỏ virus vào thuốc lá thông qua vi khuẩn A. rhizogenes ATCC15834 a. Cơ sở lý thuyết A. rhizogenes là vi khuẩn mang thành phần Ri plasmid có thể chuyển một gen mong muốn vào genome tế bào thực vật. Chủng A. rhizogenes ATCC15834 mang vector chuyển gen nhị thể, vùng vir được thiết kế sẵn trong tế bào vi khuẩn, trong khi T-DNA là vector chuyển gen pK7WG2D (1) mang cấu trúc HA1 vừa thiết kế được chuyển vào tế bào bằng xung điện. b. Quy trình Quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá N. tabacum K326 thông qua vi khuẩn A. Rhizogenes ATCC15834 được tiến hành theo phương pháp của Topping có cải tiến (Topping, 1998). Các bước chính như sau: - Chuẩn bị chủng A. rhizogenes ATCC15834 mang cấu trúc HA1: một ngày trước khi biến nạp, nuôi một khuẩn lạc vào 5 ml YMP lỏng có bổ sung cefotaxim 500 mg/L, nuôi lắc 200 v/p ở 28oC. - Chuẩn bị mảnh lá thuốc lá có kích thước 1 cm2 được làm tổn thương bằng lưỡi dao cắt bốn cạnh xung quanh, đặt trên môi trường WPM trong 2 ngày. - Hút 1 ml dịch khuẩn nuôi lỏng ở trên cho vào 50 ml YMP lỏng, đo OD600 = 0,7 - 1 là có thể được sử dụng cho biến nạp. - Các mảnh lá sau 2 ngày nuôi cảm ứng trên môi trường WPM, được nhặt ra một bình tam giác mới có bổ sung 5 ml MS. - Đổ dịch khuẩn vào bình tam giác có chứa các mảnh cấy lá thuốc lá ở trên. - Sau 30 phút chuyển các mảnh cấy lên giấy thấm đã khử trùng, thấm khô và cấy lên môi trường WPM. Sau 2 ngày chuyển sang môi trường WPM có bổ sung kháng sinh cefotaxim 500 mg/L và kanamycin 100 mg/L. - Sau 2 - 4 tuần các mảnh cấy bắt đầu cảm ứng tạo rễ được cắt và chuyển sang môi trường WPM có bổ sung cefotaxim 400 mg/l và kanamycin 100 mg/l. 2.2.7. Phương pháp đánh giá cây trồng chuyển gen a. Sàng lọc cây chuyển gen bằng chất chọn lọc Do không phải toàn bộ các tế bào và các mẫu chuyển gen đều mang gen chuyển nên nhất thiết phải tiến hành sàng lọc các tế bào chuyển gen. Dựa vào các gen chọn lọc được thiết kế trong vector chuyển gen mà người ta sử dụng các kháng sinh phù hợp để thu được các tế bào, mẫu mang gen chuyển. Gen chọn lọc điển hình là các gen mã hóa cho các loại enzyme có khả năng khử độc đối với kháng sinh như kanamycin (nptII), hygromycine (hyg), gentamycine (gent),… hoặc chất diệt cỏ glyphosate hay basta (bar),… Chỉ những tế bào mang gen biến nạp có thể sống sót trên môi trường chứa chất kháng sinh hoặc chất diệt cỏ [3]. Các loại vector này đã được ứng dụng và mang lại thành công trong việc chọn lọc nhiều đối tượng cây trồng chuyển gen như cây đu đủ, cây hồng, cây lúa, cây bông vải, cây thuốc lá, … [2], [5], [6], [10], [14]. b. Phương pháp nhuộm mô tế bào Có thể nhuộm hóa tế bào để khẳng định sự của mặt của sản phẩm thông qua một loại gen chỉ thị được sử dụng phổ biến trong chuyển gen thực vật là gen gus hay gen uidA. Gen gus nằm ở locus uid của vi khuẩn E. coli và mã hóa cho enzyme β-glucuronidase. Đây là một enzyme hydrolase có khả năng phân hủy các hợp chất có gốc β- glucuronide tạo thành chất trung gian, khi chất này bị oxi hóa sẽ có màu xanh đậm đặc trưng. Do đó, enzyme này được xác định rất dễ dàng và thuận tiện bằng hợp chất indole- β-glucuronide. Người ta thường sử dụng dung dịch muối 5-Br-4-Cl-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexylamine (X-Gluc) để nhuộm mô tế bào [8], [15]. Sản phẩm sơ cấp 5-Br-4-Cl-3indolyl vẫn còn là một chất dễ tan, không màu. Nhưng ngay sau đó sản phẩm này bị ôxy hóa và dimmer hóa thành một phức hệ không tan có màu xanh. Sự có mặt của ferri và ferrocyanide trong dung dịch nhuộm làm tăng quá trình hình thành sản phẩm cuối cùng, đồng thời cũng góp phần hạn chế việc khuếch tán sản phẩm sơ cấp đến vùng không có gus [3]. Các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen được ngâm trong dung dịch đệm cơ chất X-Gluc. Sau 24-48 giờ mẫu nhuộm được tẩy hết diệp lục bằng Ethanol 70% và quan sát trên kính lúp soi nổi. Biểu hiện hoạt động của gen gus sau khi chuyển vào tế bào thực vật là phản ứng tạo màu đặc trưng trên các tế bào, mô, bộ phận của cây chuyển gen. Nhuộm gus được thực hiện trong thí nghiệm xác định biểu hiện tạm thời, mô sẹo, chồi mầm và rễ mới tái sinh. Nhuộm gus cũng để khẳng định gen chuyển được di truyền sang thế hệ sau khi nhuộm phôi của hạt hình thành từ cây chyển gen [3], [12]. 2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu Thiết kế mồi, và dữ liệu trình tự DNA được xử lý bằng phần mềm Lasergene version 7 của DNASTAR Inc., USA; BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., 1990); BioEdit version 7 (Tom Hall, Department of Microbiology , North Carolina State University, NC) và Primer3 Input Version 4 ( [9]. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách dòng gen HA1 HA1 là một trong ba tiểu phần cấu tạo nên protein HA, cho phép nhận biết tế bào đích của động vật có xương sống và hoàn thành quá trình nhận biết bằng cách gắn kết với thụ thể chứa sialic acid của những tế bào này. Trên cơ sở trình tự của gen HA1 đã được xác định, với mục đích ghép nối đoạn gen HA1 vào vector pENTR/cal (mục 2.2.2) ở 2 vị trí cắt của enzyme giới hạn SacI và HindIII, chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu HA1_SacI_F (mồi xuôi) và HA1_Hind III_R (mồi ngược) để nhân đoạn gene HA1 từ gen HAop (đây là gen đã được tối ưu hóa mã để biểu hiện ở thực vật) được Phòng công nghệ tế bào thực vật cung cấp. Cặp mồi được thiết kế tạo được mã mở đầu và mã kết thúc cho gen HA1 khi được nhân lên và có chứa điểm nhận biết của enzyme cắt giới hạn SacI và Hind III. Với các yêu cầu trên, chúng tôi đã thiết kế cặp mồi có các thông số trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1. Trình tự và các thông số cần thiết của hai mồi HA1_F và HA1_R Mẫu Mồi Trình tự Tm (0C) HA1 HA1_F 5’-GGGGAGCTCGATCAGATCTGCATTGGAT-3’ 74 HA1_R 5’-GGGAAGCTTTTACCTTCTTTCTCTCTGTGG-3’ 69 Từ nguồn nguyên liệu ban đầu là gen HAop (pUC18/Haop) chứa đoạn gen HA1, chúng tôi tiến hành nhân đoạn gen HA1 bằng phản ứng PCR. 3.1.1. Kết quả PCR nhân đoạn gen HA1 50ng DNA plasmid pUC18/HAop được sử dụng trong phản ứng PCR để nhân đoạn gene HA1 sử dụng cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế ở trên. Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agrose 0,8% với thang DNA 1kb (Hình 3.1 A). Kết quả cho thấy, chúng tôi đã nhận được một đoạn DNA có kích thước khoảng gần 1000 bp phù hợp với chiều dài của gen HA1 quan tâm mà theo tính toán lý thuyết là 978bp. Đồng thời, kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR là đặc hiệu và đủ hàm lượng cho mục đích tách dòng gen. 3.1.2. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR 1000 bp 978 bp 1000bp A B Hình 3.1. Kết quả PCR và tinh sạch gen HA1 từ pUC18/HAop A. Sản phẩm nhân đoạn gen HA1 bằng cặp mồi HA1_SacI_F và HA1_HindIII_R B. Sản phẩm tinh sạch gen HA1 M: Thang marker DNA 1kb. Để ghép nối sản phẩm PCR - đoạn gen HA1 vào vector tách dòng có hiệu quả thì sản phẩm PCR phải được làm sạch, loại bỏ các thành phần tạp chất có trong sản phẩm PCR như: mồi, đệm, enzyme vv… Khi dung dịch qua cột tinh sạch, DNA sẽ được gắn vào các phân tử có ái lực cao với chúng cố định trên màng lọc của cột. Dịch đệm cùng agarose được loại bỏ nhờ ly tâm với tốc độ cao. DNA được thu lại bằng nước khử ion. Sản phẩm tinh sạch được kiểm tra trên gel agarose 0,8% (hình 3.1 B) Kết quả trên hình 3.1 B cho thấy, sản phẩm tinh sạch có hàm lượng cao, không bị đứt gẫy, đúng với kích thước như tính toán lý thuyết, đảm bảo cho các bước thí nghiệm tiếp theo. 3.1.3. Ghép nối đoạn gen HA1 vào vector pENTR/cal Hình 3.2. Kết quả cắt đoạn gen HA1 và pENTR/cal bằng enzyme giới hạn SacI và HindIII 2500 bp 2544 bp 978 bp 1000 bp Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch và vector pENTR/cal (mục 2.2.2.a), sẽ được cắt bởi enzyme giới hạn SacI và HindIII để tạo đầu dính. Sau đó sản phẩm PCR và pENTR/cal được tinh sạch qua cột và thực hiện phản ứng lai để ghép nối đoạn gen HA1 vào vector pENTR/cal. Plasmid tái tổ hợp được tạo ra từ phản ứng lai sẽ được biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli DH-5α bằng phương pháp sốc nhiệt để chọn lọc, nhân nhanh plasmid với số lượng lớn. Kết quả ở hình 3.2 cho thấy, sau khi cắt bằng enzyme giới hạn SacI và HindIII, chúng tôi thu được 2 vạch điện di đúng kích thước như lý Hình 3.3. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pENTR/HA1 vào E.Coli thuyết của vector pENTR/cal (giếng số 1) và sản phẩm PCR - gen HA1 (giếng số 2). Kết quả của quá trình biến nạp vào tế bào E.Coli DH-5α được thể hiện ở hình 3.3 cho thấy, chúng tôi đã thu được rất nhiều khuẩn lạc mọc được trên môi trường chọn lọc (LB bổ sung kháng sinh Kanamycin 50mg/L). Từ đây, có thể kết luận tạm thời đã biến nạp thành công plasmid tái tổ hợp pENTR/HA1 vào tế bào E.Coli. Tuy nhiên, các khuẩn lạc này có thể mang vector tái tổ hợp hoàn chỉnh hoặc chỉ là khuẩn lạc mang các plasmid thông thường không chứa gen mong muốn hay gen đích bị đứt gẫy. Vì vậy, để có thể chọn lọc được những dòng khuẩn lạc mang vector chứa gen HA1 như mong muốn, chúng tôi tiến hành PCR các khuẩn lạc thu được với mồi M13. Hình 3.4. Kết quả điện di 7 khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc Chúng tôi tiến hành lựa chọn 7 khuẩn lạc trong số các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc. Khuẩn lạc được lựa chọn là những khuẩn lạc tròn đều, không quá to hoặc quá nhỏ, được đánh số lần lượt từ 1 đến 7. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agrose 0,8% cho thấy, mẫu 1, 2, 4, 6, 7 dương tính, kết quả thể hiện trên hình 3.4. Sau khi thu được 5 dòng dương tính, chúng tôi tiến hành giữ dòng trong glyxerol 100% bảo quản ở nhiệt độ -800C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Đồng thời tiến hành đọc trình tự các dòng dương tính đã thu được. Kết quả đọc trình tự cho thấy, trình tự thu được giống với trình tự HA1 theo thiết kế ban đầu với tỷ lệ 100%. Kết quả đọc và phân tích trình tự (hình 3.5) đã chứng tỏ gen HA1 đã được chuyển vào vector pENTR. Ngoài ra, việc xác định trình tự cũng đã cho thấy các vị trí enzyme giới hạn, trình tự đoạn tín hiệu calreticulin và các vị trí attL1 và attL2 không bị lỗi đảm bảo cho phản ứng LR Gateway xảy ra chính xác. < - - - - - - calreticulin - - - - - - - - - -- - - -- - - -- - - - - - - calreticulin - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - --> < - - - - HA1 - - - - - - - - - HA1 - - - - - - - - - - HA1 - - - - - - - - - - HA1 - - - - - - - - - - HA1 - - - - - - - - - - HA1 - - - - - - - - - - HA1 - - - - - - - - - - HA1 - - - - - - - - - - HA1 - - - - - - - - - - HA1 - - - - - - - - - - HA1 - - - - - - - - - - HA1 - - - - - - - - - - HA1 - - - - - - - - - - HA1 - - - - - - - - - - HA1 - - - - - - - - - - HA1 - - - - - - - - - - HA1 - - - - - - - - - - - - - - >< - - - - - attL2 - - - - - - - - - - attL2 - - - - - Hình 3.5. Trình tự ghép nối gen HA1 trên vector pENTR221/cal Trình tự đoạn gen HA1 được trình bày tại phụ lục 3. Từ kết quả trên, chứng tỏ rằng đoạn gen HA1 đã được chèn thành công vào vector pENTR/cal tạo ra vector tái tổ hợp pENTR/cal/HA1 làm nguyên liệu cho việc thiết kế vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway®. 3.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA1 bằng kỹ thuật Gateway®. 3.2.1. Tạo vector tái tổ hợp theo phản ứng LR Kỹ thuật Gateway là một phương pháp nhân dòng phổ biến, cho phép gắn trình tự DNA mong muốn vào hệ thống vector một cách nhanh và nhạy. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện phản ứng LR (mục 2.2.4.b) giữa plasmid tiếp nhận pENTR/cal/HA1 và vector đích pK7WG2D. Sản phẩm của phản ứng LR là một vector tái tổ hợp được kí hiệu là pK7WG2D/cal/HA1, là vector chuyển gen cần thiết kế để chuyển vào cây tạo ra giống cây trồng có khả năng tạo vaccine thực vật khi con người sử dụng. Để thu nhận được dòng plasmid pK7WG2D/cal/HA1, hỗn hợp phản ứng LR được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH-5α. Sản phẩm của quá trình biến nạp được nuôi trên môi trường chọn lọc có chứa kháng sinh. Kết quả thu được một lượng lớn khuẩn lạc trên đĩa thạch. Những khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch là những khuẩn lạc có mang plasmid pK7WG2D mà gen ccdB của nó đã bị đột biến hoặc mang vector pK7WG2D/HA1. Do đó, để chọn ra những dòng khuẩn lạc như mong muốn (mang vector chuyển gen), chúng tôi đã tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR colony và phản ứng cắt bằng hai enzyme giới hạn SacI và Hind III. 3.2.2. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR Chúng tôi tiến hành chọn 10 khuẩn lạc để tiến hành phản ứng colony-PCR với mồi đặc hiệu. Những khuẩn lạc được chọn là những khuẩn lạc tròn đều, không quá to hoặc quá nhỏ. Kết quả colony-PCR được thể hiện ở hình 3.6. 1000 bp 978 bp Hình 3.6. Kết quả PCR colony pK7WG2D/cal/HA1 Qua hình 3.6 cho thấy, 10 khuẩn lạc thí nghiệm đều cho kết quả dương tính, xuất hiện một băng vạch có kích thước 978 bp cho thấy kết quả biến nạp đã thành công. 3.2.3. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn Chúng tôi tiếp tục sử dụng 10 khuẩn lạc vừa thu được để tách plasmid và tiến hành phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế. Kết quả thể hiện ở hình 3.7. Hình 3.7. Kết quả cắt pK7WG2D/cal/HA1 bằng SacI và Hind III M: Thang marker DNA 1kb 1 – 10: Các mẫu pK7WG2D/cal/HA1 11: mẫu pK7WG2D 11.159 bp 10000 bp 1201 bp 1000 bp 978 bp 434 bp 500 bp Theo lý thuyết, vector pK7WG2D(1) có kích thước 12794bp với 4 điểm cắt nhận biết của hai enzyme giới hạn SacI và Hind III. Theo tính toán, khi cắt pK7WG2D bằng SacI và Hind III sẽ thu được 3 đoạn có kích thước 434bp, 1201bp và 11159 bp, và khi cắt plasmid pK7WG2D/cal/HA1 sẽ thu được 4 đoạn, gồm 3 đoạn của vector pK7WG2D và 1 đoạn gen HA1 mới ghép nối thêm. Nhìn vào hình 3.7, cho thấy thực tế thí nghiệm thu được trùng với các tính toán lý thuyết. Qua đó có thể khẳng định, chúng tôi đã biến nạp thành công vector chuyển gen pK7WG2D/cal/HA1. 3.3. Kết quả biến nạp pK7WG2D/cal/HA1 vào vi khuẩn A.rhizogenes Chúng tôi sử dụng 50-100 ng plasmid pK7WG2D/cal/HA1 để biến nạp vào tế bào khả biến A.rhizogenes. Sản phẩm của quá trình biến nạp được nuôi trên môi trường YMP chọn lọc có chứa 100 mg/L Spectinomycin, ủ đĩa ở 28oC. Sau 2 ngày, kết quả thu được một lượng lớn khuẩn lạc trên đĩa thạch. Để chọn ra những dòng khuẩn lạc như mong muốn (mang vector chuyển gen), chúng tôi đã tiến hành kiểm tra bằng phản ứng colony-PCR. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony- PCR. Chọn 10 dòng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch để tiến hành phản ứng PCR colony bằng cặp mồi đặc hiệu trên gen: HA1_Sac I _ F và HA1_Hind III_R. Sản phẩm phản ứng được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, kết quả thể hiện trong hình 3.8 1000 bp 978 bp Hình 3.8. Kết quả clony-PCR bằng cặp mồi HA1_SacI_F và HA1_Hind III_R M: Thang marker DNA 1kb Giếng 1 - 10: Các dòng khuẩn lạc. Qua kết quả thu được ở trên, cho thấy: có 8 trong 10 dòng khuẩn lạc được lựa chọn cho kết quả dương tính với phản ứng PCR với 1 băng duy nhất có kích thước 978bp (trừ dòng số 1 và 10 cho kết quả âm tính). Với tỷ lệ như vậy, cho thấy đã biến nạp thành công vector pK7WG2D/cal/HA1 vào vi khuẩn A. rhizogens. Như vậy, chúng tôi đã tạo được chủng A. rhizogens ATCC15834 mang plasmid tái tổ hợp pK7WG2D/cal/HA1. Đây chính là nguồn nguyên liệu phục vụ cho mục đích chuyển gen tạo vaccine thực vật. 3.4. Kiểm tra hệ thống tạo rễ tơ chuyển gen thông qua A.rhizogenes sử dụng gen chỉ thị Gus Để kiểm tra trước khả năng biến nạp thành công gen HA1 vào rễ tơ thuốc lá thông qua vi khuẩn A. rhizogens, chúng tôi sử dụng vector pPTN289 mang gen Gus (pPTN289/Gus), là gen chỉ thị mã hóa enzyme glucuronidase, enzyme này sẽ phân giải cơ chất X-Gluc (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylamine) và chuyển thành màu xanh các mô mang gen chuyển (mục 2.2.7.b). Sau khi đưa được vector pPTN289/Gus vào vi khuẩn A. rhizogens, chúng tôi tiến hành biến nạp vào mảnh lá cây thuốc lá đã được cảm ứng trong môi trường WPM trước 2 ngày. Hình 3.9. Mảnh lá thuốc lá cảm ứng trên môi trường WPM Sau hai ngày nuôi cộng sinh, chúng tôi tiến hành cấy chuyển các mảnh lá sang môi trường WPM có bổ sung Cefotaxim 500 mg/L và ppt 2mg/L. Tỷ lệ chọn lọc sơ bộ của các mảnh lá trên môi trường chọn lọc được thể hiện qua bảng 3.2. Bảng 3.2. Tỷ lệ mô lá chuyển gen pPTN289/gus trên môi trường chọn lọc Tổng số mô lá Số mô sống sót sau 1 tuần Số mô sống sót sau 2 tuần Số mô sống sót sau 3 tuần Số mô sống sót sau 4 tuần Số mô cảm ứng tạo rễ 200 135 103 97 91 10 Qua bảng 3.2, chúng tôi nhận thấy số lượng mô lá sống sót trên môi trường chọn lọc giảm dần theo thời gian, điều này cho thấy khả năng những mô lá tồn tại và phát triển được là những mô mang các tế bào đã được chuyển gen. Tuy nhiên, chúng tôi cũng nhận thấy một số lượng lớn các mô sống sót và phát triển trên môi trường chọn lọc nhưng không cảm ứng tạo rễ. Sau 3 - 4 tuần, chỉ có 10/90 mô lá sống sót trên môi trường chọn lọc bắt đầu cảm ứng tạo rễ tơ. Tiến hành nhuộm số rễ thu được trong dung dịch X-gluc ở điều kiện 370C qua đêm, thu được kết quả thể hiện ở hình 3.10. Như vậy thông qua kết quả biểu hiện của gen Gus ở các dòng rễ tơ thuốc lá chuyển gen, có thể tạm thời kết luận, phương pháp chúng tôi đang tiến hành có khả năng thành công cao với tỉ lệ cảm ứng tạo rễ tơ chuyển gen là 5% (10/200). Hệ thống nuôi cấy và tạo rễ tơ chuyển gen ở thuốc lá để sản xuất các dược phẩm sinh học tái tổ hợp đã được sử dụng trong rất nhiều nghiên cứu [28], [31], [69]. Phương pháp nuôi cấy đơn giản, không đòi hỏi nhiều thời gian: trong khoảng từ 3-4 tuần có thể tạo được các dòng rễ tơ chuyển gen ổn định; và sau 6-8 tuần có thể đưa vào nuôi cấy lỏng tạo sinh khối để sản xuất các protein tái tổ hợp. Phương pháp này cũng có thể được sử dụng để thử nghiệm các cấu trúc gen mới biểu hiện trong các tế bào thực vật [55]. Trong giới hạn nghiên cứu của đề tài, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu tạo rễ tơ thuốc lá chuyển gen HA1 thông qua A.rhizogenes. Hình 3.10. Kết quả biến nạp A. rhizogens mang vector pPTN289/Gus A. Rễ âm tính B. Rễ dương tính (chuyển xanh do gen Gus) 3.5. Kết quả chuyển gen HA1 vào mảnh lá thông qua A. rhizogens để tạo các dòng rễ tơ chuyển gen HA1 Để chuẩn bị cho thí nghiệm này, chúng tôi cũng tiến hành cảm ứng mảnh lá cây thuốc lá trong môi trường WPM trước 2 ngày. Đồng thời, chúng tôi tiến hành nuôi khuẩn A. rhizogens mang vector pK7WG2D/HA1 trong môi trường YMP bổ sung kháng sinh spectinomycin 100 mg/L. Hình 3.11. Mảnh lá cảm ứng trong môi trường WPM Sau hai ngày cảm ứng, các mảnh lá được sử dụng để biến nạp (mục 2.2.6). Các mảnh lá được nuôi cộng sinh từ 2-3 ngày và được cấy chuyển các mảnh lá sang môi trường WPM có bổ sung kháng sinh Cefotaxim 500 mg/L và kanamycin 100 mg/L để chọn lọc. Tỷ lệ chọn lọc và hình ảnh của các mảnh lá trên môi trường chọn lọc được thể hiện qua bảng 3.3 và hình 3.10. Bảng 3.3. Tỷ lệ mô lá chuyển gen pK7WG2D/cal/HA1 trên môi trường chọn lọc Tổng số mô lá Số mô sống sót sau 1 tuần Số mô sống sót sau 2 tuần Số mô sống sót sau 3 tuần 200 143 97 92 Qua bảng 3.3, tương tự như kết quả chuyển gen chỉ thị Gus, số lượng mô lá sống sót trên môi trường chọn lọc giảm dần theo thời gian, và hiện nay (sau 3 tuần) một vài mô lá sống sót bắt đầu cảm ứng tạo rễ tơ (hình 3.11). Các dòng rễ tơ này sẽ tiếp tục được kiểm tra bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR và lai miễn dịch. Các dòng rễ tơ chuyển gen sẽ được chuyển sang nuôi cấy lỏng tạo sinh khối để tách chiết protein HA1 tái tổ hợp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng trình tự nucleotide tín hiệu Calreticulin ở đầu 5’ của gen HA1, đoạn tín hiệu này có chức năng dẫn protein tái tổ hợp biểu hiện ra môi trường nuôi cấy giúp làm đơn giản hơn rất nhiều trong quá trình tinh sạch các protein tái tổ hợp ở các bước tiếp theo [55]. Hình 3.10. Mô lá chuyển gen pK7WG2D/HA1 trên môi trường chọn lọc Hình 3.11. Rễ tơ ở các mô lá chuyển gen KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I. Kết luận 1. Đã ghép nối thành công gen HA1 mã hóa tiểu phần protein vỏ virus H5N1 vào vector pENTR221/cal, tạo vector tái tổ hợp pENTR/cal/HA1. 2. Đã thiết kế được vector chuyển gen vào thực vật - pK7WG2D/cal/HA1- mang cấu trúc gen mã hóa protein vỏ của virus H5N1 bằng kỹ thuật lai Gateway phục vụ cho mục đích chuyển gen tạo vaccine thực vật. Vector này đã được biến nạp thành công vào vi khuẩn A.rhizogenes ATCC15834 để tạo các dòng rễ tơ chuyển gen biểu hiện vaccine tái tổ hợp HA1. 3. Đã kiểm tra khả năng thành công của quy trình chuyển gen tạo rễ tơ thông qua A.rhizogens sử dụng vector chuyển gen pPTN289 mang gen chỉ thị gus. Kết quả đã thu được các dòng rễ tơ mang gen gus với tỉ lệ cảm ứng tạo rễ tơ chuyển gen là 5%. 4. Thành công bước đầu trong việc chuyển gen HA1 vào cây thuốc lá tạo rễ tơ thông qua A. rhizogenes. Đã chọn lọc được 92 mô sống sót sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, trong số đó 3 mô đã bắt đầu cảm ứng tạo rễ tơ trên môi trường chọn lọc. II. Kiến nghị Để tiếp tục phát triển các kết quả nghiên cứu, chúng tôi đề xuất một số kiến nghị như sau: 1. Tiếp tục sàng lọc và đánh giá khả năng chuyển gen và mức độ biểu hiện của protein HA1 ở rễ tơ thuốc lá chuyển gen. 2. Sử dụng vector chuyển gen pK7WG2D/cal/HA1 đã thiết kế thành công để chuyển vào các cây trồng khác (cây họ cà, họ bầu bí, họ đậu vv…) tạo ra sự đa dạng và nâng cao hiệu suất trong việc tạo vaccine thực vật. TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tài liệu tiếng Việt 1. Bùi Quang Anh (2006), Báo cáo tình hình cúm gia cầm tại Việt Nam, Hội nghị phòng chống dịch cúm gia cầm do Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn. 2. Lê Trần Bình (2008), Phát triển cây trồng chuyển gen ở Việt Nam, Bộ sách chuyên khảo, NXB Khoa học và Công nghệ. 3. Lê Trần Bình (2003), Tài liệu thực hành công nghệ tế bào thực vật, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. 4. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 5. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2003), Tạo cây Hông (Paulownia fortune) chuyển gen kháng sâu thông qua Agrobacterium. 6. Trần Thị Cúc Hòa, Lê Trần Bình, Bùi Bá Bổng (2004), Chuyển nạp gen kháng sâu cryIAb và cryIAc vào các giống lúa bằng phương pháp Agrobacterium và chọn lọc Mannose, Nông nghiệp-Nông thôn-Môi trường, 6, tr. 21-26. 7. Nguyễn Ánh Hồng (2000), Cơ sở Khoa học Công nghệ chuyển gen ở thực vật, NXB Nông nghiệp Hà Nội. 8. Lê Đình Lương (2002), Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 9. Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học trong sinh học, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội. 10. Đỗ Tiến Phát, Đinh Thị Phòng, Chu Hoàng Hà (2008), Đánh giá ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn tới hiệu quả chuyển gene vào cây bông (Gossypium hirsutum L) thông qua Agrobacterium tumefaciens, Tạp chí Công nghệ sinh học, 6(4A), tr. 689-695. 11. Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen ở thực vật, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 12. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu và ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 13. Lê Duy Thành (2001), Cơ sở di tryền chọn giống thực vật, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 14. Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2008), Tạo cây thuốc lá kháng bệnh khảm dưa chuột bằng ký thuật RNAi, Công nghệ sinh học, 6(4A), tr. 679-687. 15. Hà Minh Trung, Vũ Đình Phú, Ngô Vĩnh Viễn, Mai Thị Liên (2002), Công nghệ tuyển chọn và nhân giống cây có múi sạch bệnh, Cục trồng trọt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. II. Tài liệu tiếng Anh 16. Alam, K., M.N. Nagi, O.A. Badary, O.A. Al-Shabanah, A.C. Al-Rikabi, and A.M. Al-Bekairi (1999), The protective action of thymol against carbon tetrachloride hepatotoxicity in mice, Pharmacol Res, 40(2): p. 159-63. 17. Alexander, D.J. (2007), Summary of avian influenza activity in Europe, Asia, Africa, and Australasia, 2002-2006. Avian Dis, 51(1 Suppl): p. 161-6. 18. Basler, C. (2007), Influenza viruses: basic biology and potential drug targets, Infect Disord Drug Targets, 7(4): p. 282-93. 19. Bosch, F., M. Orlich, H. Klenk, and R. Root (1979), The structure of the hemagglutinin: a determinant for the pathgencity of Influenza virus, Virology, 95: p. 197-207. 20. Britton, M.T., M.A. Escobar, and A.M. Dandekar (2008), The oncogenes of Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes in Agrobacterium: From Biology to Biotechnology, T. Tzfira and V. Citovsky, Editors. Springer: New York, p. 524-65. 21. Chen, H., G. Deng, Z. Li, G. Tian, Y. Li, and P. Jiao (2004), The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in southern China, Proc Natl Acad Sci USA, 101: p. 10452-10457. 22. Chen, L., C. Davis, H. Zhou, N. Cox, and R. Donis (2008), Genetic compatibility and virulence of reassortants derived from contemporary avian H5N1 and human H3N2 influenza A viruses. PLoS Pathog, 4(5): p. e1000072. 23. Chilton, M.D., and e. al. (1982), Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells, Nature, p.432-34. 24. Christey and M.C. (2001), Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants. In Vitro Cell, Dev, Biol-Plant, p. 687-700. 25. de Wit, E. and R.A.M. Fouchier (2008), Emerging influenza, J Clin Virol, 41: p. 1-6. 26. Doherty, P., S. Turner, R. Webby, and P. Thomas (2006), Influenza and the challenge for immunology. Nat Immunol, 7(5): p. 449-55. 27. Doran, P.M. (2000), Foreign protein production in plant tissue cultures. Curr Opin Biotechnol, 11(2): p. 199-204. 28. Drake PMW, Chargelegue DM, Vine ND, van Dolleweerd CJ, Obregon P, and M. JKC (2003), Rhizosecretion of a monoclonal antibody protein complex from transgenic tobacco roots. Plant Molecular Biology, 52(1): p. 233-241. 29. Drake, P.M.W., D.M. Chargelegue, N.D. Vine, C.J. van Dolleweerd, P. Obregon, and J.K.C. Ma (2003), Rhizosecretion of a monoclonal antibody protein complex from transgenic tobacco roots. Plant Molecular Biology, 52(1): p. 233-241. 30. Gambotto, A., S. Barratt-Boyes, M.d. Jong, G. Neumann, and Y. Kawaoka (2008), Human infection with highly pathogenic H5N1 influenza virus. Lancet, 371(9622): p. 1464-1475. 31. Gaume A, Komarnytsky S, Borisjuk N, and R. I (2003), Rhizosecretion of recombinant proteins from plant hairy roots. Plant Cell Rep, 21(12): p. 1188-1193. 32. Gaume, A., S. Komarnytsky, N. Borisjuk, and I. Raskin (2003), Rhizosecretion of recombinant proteins from plant hairy roots. Plant Cell Rep, 21(12): p. 1188-93. 33. Hellwig, S., J. Drossard, R.M. Twyman, and R. Fischer (2004), Plant cell cultures for the production of recombinant proteins. Nat Biotechnol, 22(11): p. 1415-22. 34. Hilleman, M. (2002), Realities and enigmas of human viral influenza: pathogenesis, epidemiology and control. Vaccine, 20(25-26): p. 3068-3087. 35. Hoa, L.T., D.D. Khang, P.V. Chi, N.V. Hai, T.N. Hai, N.T.B. Nga, and L.T. Binh (2006), Molecular characterization of the H5 gene for the highly pathogenic A/H5N1 strains isolated in Vietnam during 2004 - 2006. Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agriculture, p. 68-71. 36. Horimoto, T. and Y. Kawaoka (2001), Pandemic threat posed by avian influenza A viruses. Clin Microbiol Rev, 14: p. 129-149. 37. Horimoto, T. and Y. Kawaoka (2006), Strategies for developing vaccines against H5N1 influenza A viruses. Trends Mol Med, 12(11): p. 506-514. 38. Hulse-Post, D., K. Sturm-Ramirez, J. Humberd, P. Seiler, E. Govorkova, S. Krauss, C. Scholtissek, P. Puthavathana, C. Buranathai, T. Nguyen, H. Long, T. Naipospos, H. Chen, T. Ellis, Y. Guan, J. Peiris (2005), Role of domestic ducks in the propagation and biological evolution of highly pathogenic H5N1 influenza viruses in Asia. Proc Natl Acad Sci USA, 102(30): p. 10682-10687. 39. Jin, U.H., J.A. Chun, J.W. Lee, Y. Young Byung, S.W. Lee, and C.H. Chung (2004), Expression and characterization of extracellular fungal phytase in transformed sesame hairy root cultures. Protein Expr Purif, 37(2): p. 486-92. 40. Keawcharoen, J., A. Amonsin, K. Oraveerakul, S. Wattanodorn, T. Papravasit, S. Karnda, K. Lekakul, R. Pattanarangsan, S. Noppornpanth, R. Fouchier, A. Osterhaus, S. Payungporn, A. Theamboonlers, and Y. Poovorawan (2005), Characterization of the hemagglutinin and neuraminidase genes of recent influenza virus isolates from different avian species in Thailand. Acta Virol, 49(4): p. 277-280. 41. Kelly, T.R., M.G. Hawkins, C.E. Sandrock, and W.M. Boyce (2008), A review of highly pathogenic avian influenza in birds, with an emphasis on Asian H5N1 and recommendations for prevention and control. J Avian Med Surg, 22(1): p. 1-16. 42. Kodihalli, S., H. Goto, D. Kobasa, S. Krauss, Y. Kawaoka, and R. Webster (1999), DNA vaccine encoding hemagglutinin provides protective immunity against H5N1 influenza virus infection in mice. J Virol, 73: p. 2094-2098. 43. Krug, R. M, W. Yuan, D.L. Noah, and A.G. Latham (2003), Intracellular warfare between human influenza viruses and human cells: the roles of the viral NS1 protein. Virology, 309: p. 181 – 189. 44. Le, Q., M. Kiso, K. Someya, Y. Sakai, T. Nguyen, K. Nguyen, N. Pham, H. Nguyen, S. Yamada, Y. Muramoto, T. Horimoto, A. Takada, H. Goto, T. Suzuki, Y. Suzuki, and Y. Kawaoka (2005), Avian flu: isolation of drug-resistant H5N1 virus. Nature, 437(7062): p. 1108. 45. Li, K., Y. Guan, J. Wang, G. Smith, K. Xu, and L. Duan (2004), Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature, 430: p. 209-213. 46. Luong, G. and P. Palese (1992), Genetic analysis of influenza virus. Curr Opinion Gen Develop, 2: p. 77-81. 47. Medina-Bolivar, F., R. Wright, V. Funk, D. Sentz, L. Barroso, T.D. Wilkins, W. Petri, Jr., and C.L. Cramer (2003), A non-toxic lectin for antigen delivery of plant-based mucosal vaccines. Vaccine, 21(9-10): p. 997-1005. 48. Munster, V.J., C. Baas, P. Lexmond, T.M. Bestebroer, J. Guldemeester, W.E. Beyer, E. de Wit, M. Schutten, G.F. Rimmelzwaan, A.D. Osterhaus, and R.A. Fouchier (2009), Practical considerations for high-throughput influenza A virus surveillance studies of wild birds by use of molecular diagnostic tests. J Clin Microbiol, 47(3): p. 666-73. 49. Murphy, B. and R. Webster (1996), Orthomyxoviruses. Lippincott-Raven Publishers, p. 1397-1445. 50. Nayak, D., E. Hui, and S. Barman (2004), Assembly and budding of influenza virus. Virus Res, 106(2): p. 147-165. 51. Neumann, G, M.A. Whitt, and Y. Kawaoka (2002), A decade after the generation of a negative-sense RNA virus from cloned cDNA – What have we learned. Journal of General Virology, 83: p. 2635 – 62. 52. Neumann, G. and Y. Kawaoka (1999), Genetic engineering of influenza and other negative-strand RNA viruses containing segmented genomes. Advances in Virus Research, 53: p. 265 – 300. 53. Nicholson, K., J. Wood, and M. Zambon (2003), Influenza. Lancet, 362: p. 1733-1745. 54. Palazón, J., and e. al. (1997), Effect of rol genes from Agrobacterium rhizogenes TL-DNA on nicotine production in tobacco root cultures. Plant Physiol Biochem, 35: p. 155-62. 55. Pham NB. (2009), Production and secretion of recombinant sweet-tasting thaumatin from suspension cells and hairy roots of Nicotiana tabacum. University of Heidelberg, PhD Thesis. 56. Sevon, N. and K.M. Oksman-Caldentey (2002), Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation: root cultures as a source of alkaloids. Planta Med, 68(10): p. 859-68. 57. Subbarao, K. and C. Luke (2007), H5N1 viruses and vaccines. PLoS Pathog, 3(3): p. e40. 58. Suzuki, Y (2005)., Sialobiology of influenza: molecular mechanism of host range variation of influenza viruses. Biol Pharm Bull, 28(3): p. 399-408. 59. Tian, G., S. Zhang, Y. Li, Z. Bu, P. Liu, J. Zhou, C. Li, J. Shi, K. Yu, and H. Chen (2005), Protective efficacy in chickens, geese and ducks of an H5N1-inactivated vaccine developed by reverse genetics. Virology, 341(1)(153-162). 60. Uiprasertkul, M., R. Kitphati, P. Puthavathana, R. Kriwong, A. Kongchanagul, K. Ungchusak, S. Angkasekwinai, K. Chokephaibulkit, K. Srisook, N. Vanprapar, and P. Auewarakul (2007), Apoptosis and pathogenesis of avian influenza A (H5N1) virus in humans. Emerg Infect Dis, 13(5): p. 708-712. 61. Urnovitz, H.B. and W.H. Murphy (1996), Human endogenous retroviruses: nature, occurrence, and clinical implications in human disease. Clin Microbiol Rev, 9(1): p. 72-99. 62. Wagner, R., M. Matrosovich, and H. Klenk (2002), Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections. Med Virol, 12(3): p. 159-166. 63. Wagner, R., M. Matrosovich, and H.D. Klenk (2002), Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections. Rev Med Virol, 12(3): p. 159-66. 64. Weber, T. and N. Stilianakis (2007), Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds. Emerg Infect Dis, 13(8): p. 1139-1143. 65. Webster, R.G. (1998), Influenza: an emerging disease. Emerg Infect Dis, 4(3): p. 436-41. 66. Webster, R.G., Y. Guan, M. Peiris, D. Walker, S. Krauss, N.N. Zhou, E.A. Govorkova, T.M. Ellis, K.C. Dyrting, T. Sit, D.R. Perez, and K.F. Shortridge (2002), Characterization of H5N1 influenza viruses that continue to circulate in geese in southeastern China. J Virol, 76: p. 118-126. 67. Weiss, R.A. (2003), Cross-species infections. Curr Top Microbiol Immunol, 278: p. 47-71. 68. Wongsamuth, R., and P.M. Doran (1997), Production of monoclonal antibodies by tobacco hairy roots. Biotechnol Bioeng, 54(5): p. 401-415. 69. Wongsamuth, R. and P. Doran (1997), Production of monoclonal antibodies by tobacco hairy roots. Biotechnol Bioeng, 54(5): p. 401-415. 70. Wu, W., Y. Chen, P. Wang, W. Song, S. Lau, J. Rayner, G. Smith, R. Webster, J. Peiris, T. Lin, N. Xia, Y. Guan, and H. Chen (2008), Antigenic profile of avian H5N1 viruses in Asia from 2002 to 2007. J Virol, 282(4): p. 1798-17807. 71. Yamada, S., Y. Suzuki, T. Suzuki, M. Le, C. Nidom, Y. Sakai-Tagawa, Y. Muramoto, M. Ito, M. Kiso, T. Horimoto, KShinya, T. Sawada, M. Kiso, T. Usui, T. Murata, Y. Lin, A. Hay, L. Haire, D. Stevens, R. Russell, S. Gamblin, J. Skehel, and Y. Kawaoka (2006), Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A viruses to human-type receptors. Nature, 444(7117): p. 378-382. 72. Zhao, Z., K. Shortridge, M.G. M, Y. Guan, and X. Wan (2008), Genotypic diversity of H5N1 highly pathogenic avian influenza viruses. J Gen Virol, 89(9): p. 2182-2193. 73. Zhou, H., M. Jin, Z. Yu, X. Xu, Y. Peng, H. Wu, J. Liu, H. Liu, S. Cao, and H. Chen (2007), Effective small interfering RNAs targeting matrix and nucleocapsid protein gene inhibit influenza A virus replication in cells and mice. Antiviral Res, 76(2): p. 186-93. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần các loại môi trường Môi trường Thành phần YMP đặc 0,4 g/l Yeast extract + 0,5 g/l K2HPO4.3H2O + 10 g/l mannitol + 2 g/l MgSO4.7H2O + 0,1 g/l NaCl + 15 g/l bacto agar, pH = 7 YMP lỏng 0,4 g/l Yeast extract + 0,5 g/l K2HPO4.3H2O + 10 g/l mannitol + 2 g/l MgSO4.7H2O + 0,1 g/l NaCl, pH = 7 LB đặc 5 g/l Yeast extract + 10 g/l Bacto tryptone + 10 g/l NaCl + 15 g/l bacto agar, pH = 7 LB lỏng 5 g/l Yeast extract + 10 g/l Bacto tryptone + 10 g/l NaCl, pH = 7 WPM đặc WPM I (20ml/L) + WPM II (10ml/L) + WPM III (10ml/L) + WPM IV (10ml/L) + WPM V (10ml/L) + 30 g đường + 8 g thạch, pH = 5,8 WPM lỏng WPM I (20ml/L) + WPM II (10ml/L) + WPM III (10ml/L) + WPM IV (10ml/L) + WPM V (10ml/L) + 30 g đường, pH = 5,8 MS đặc 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + 30 g đường + 8 g thạch, pH = 5,8 MS lỏng 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + 30 g đường, pH = 5,8 ½ MS 10 ml/L MS I + 5 ml/L MS II + 5 ml/L MS III + 5 ml/L MS IV + 5 ml/L MS V, pH = 5,8 Phụ lục 2: Sơ đồ các vector chuyển gen dùng trong thí nghiệm - Cấu trúc của vector pENTR 221/cal - Cấu trúc của vector pK7WG2D(1) - Cấu trúc vector pPTN289, nằm trong chủng vi khuẩn Agrobacterium EHA101 Phụ lục 3. Trình tự gen HAop và HA1 a. Trình tự gen HAop (pCU18/HA1) BssHII AscI BamHI BclI GGCGCGCCGGATCCGAAAAGATTGTGCTTTTGCTTGCTATTGTGTCTCTTGTGAAGTCTG 1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ CCGCGCGGCCTAGGCTTTTCTAACACGAAAACGAACGATAACACAGAGAACACTTCAGAC E__K__I__V__L__L__L__A__I__V__S__L__V__K__S__D BglII ATCAGATCTGCATTGGATACCACGCTAACAACTCTACTGAGCAAGTGGATACAATTATGG 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ TAGTCTAGACGTAACCTATGGTGCGATTGTTGAGATGACTCGTTCACCTATGTTAATACC __Q__I__C__I__G__Y__H__A__N__N__S__T__E__Q__V__D__T__I__M__E AAAAGAACGTGACTGTTACTCACGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCACAACGGAAAGT 121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ TTTTCTTGCACTGACAATGAGTGCGAGTCCTATAAGAACTTTTCTGAGTGTTGCCTTTCA __K__N__V__T__V__T__H__A__Q__D__I__L__E__K__T__H__N__G__K__L TGTGCGCTCTTGATGGTGTTAAGCCACTTATTCTTAGGGATTGCTCTGTTGCTGGATGGC 181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ ACACGCGAGAACTACCACAATTCGGTGAATAAGAATCCCTAACGAGACAACGACCTACCG __C__A__L__D__G__V__K__P__L__I__L__R__D__C__S__V__A__G__W__L TTCTTGGAAACCCAATGTGTGATGAGTTCATTAACGTGCCAGAGTGGTCTTATATTGTGG 241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ AAGAACCTTTGGGTTACACACTACTCAAGTAATTGCACGGTCTCACCAGAATATAACACC __L__G__N__P__M__C__D__E__F__I__N__V__P__E__W__S__Y__I__V__E AflII AGAAGGCTAACCCAGTGAACGATCTTTGCTACCCTGGTGATTTCAACGATTACGAAGAGC 301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ TCTTCCGATTGGGTCACTTGCTAGAAACGATGGGACCACTAAAGTTGCTAATGCTTCTCG __K__A__N__P__V__N__D__L__C__Y__P__G__D__F__N__D__Y__E__E__L TTAAGCACCTTCTTTCTAGGATTAACCACTTCGAGAAGATTCAGATTATTCCAAAGTCAT 361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ AATTCGTGGAAGAAAGATCCTAATTGGTGAAGCTCTTCTAAGTCTAATAAGGTTTCAGTA __K__H__L__L__S__R__I__N__H__F__E__K__I__Q__I__I__P__K__S__S CTTGGTCATCTCACGAGGCTTCTCTTGGAGTTTCTTCTGCTTGCCCATACCAGGGAAAGT 421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ GAACCAGTAGAGTGCTCCGAAGAGAACCTCAAAGAAGACGAACGGGTATGGTCCCTTTCA __W__S__S__H__E__A__S__L__G__V__S__S__A__C__P__Y__Q__G__K__S CATCTTTCTTCAGGAACGTTGTTTGGCTTATTAAGAAGAACTCTACTTACCCAACTATTA 481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ GTAGAAAGAAGTCCTTGCAACAAACCGAATAATTCTTCTTGAGATGAATGGGTTGATAAT __S__F__F__R__N__V__V__W__L__I__K__K__N__S__T__Y__P__T__I__K BglII EcoRI AGAGGTCTTACAACAACACTAACCAGGAAGATCTTTTGGTTCTTTGGGGAATTCACCACC 541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ TCTCCAGAATGTTGTTGTGATTGGTCCTTCTAGAAAACCAAGAAACCCCTTAAGTGGTGG __R__S__Y__N__N__T__N__Q__E__D__L__L__V__L__W__G__I__H__H__P CAAATGATGCTGCTGAACAGATTAAGTTGTACCAGAACCCAACTACTTACATTTCTGTGG 601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ GTTTACTACGACGACTTGTCTAATTCAACATGGTCTTGGGTTGATGAATGTAAAGACACC __N__D__A__A__E__Q__I__K__L__Y__Q__N__P__T__T__Y__I__S__V__G GAACTTCTACTCTTAACCAGAGGCTTGTGCCAAGAATTGCTACTAGGTCTAAGGTGAACG 661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ CTTGAAGATGAGAATTGGTCTCCGAACACGGTTCTTAACGATGATCCAGATTCCACTTGC __T__S__T__L__N__Q__R__L__V__P__R__I__A__T__R__S__K__V__N__G EcoRI AflII GACAATCTGGAAGGATGGAATTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAACGATGCTATTAACT 721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ CTGTTAGACCTTCCTACCTTAAGAAGACCTGATAAGAATTCGGTTTGCTACGATAATTGA __Q__S__G__R__M__E__F__F__W__T__I__L__K__P__N__D__A__I__N__F TCGAGTCTAACGGAAACTTCATTGCTCCAGAGTACGCTTACAAGTTGGTGAAGAAGGGTG 781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ AGCTCAGATTGCCTTTGAAGTAACGAGGTCTCATGCGAATGTTCAACCACTTCTTCCCAC __E__S__N__G__N__F__I__A__P__E__Y__A__Y__K__L__V__K__K__G__D ScaI ATAGTACTATTATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGAAACTGCAACACTAAGTGCCAAACTC 841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ TATCATGATAATACTTCAGACTCGAACTCATGCCTTTGACGTTGTGATTCACGGTTTGAG __S__T__I__M__K__S__E__L__E__Y__G__N__C__N__T__K__C__Q__T__P CAATGGGAGCTATTAACTCTTCTATGCCATTCCACAACATTCACCCACTTACTATTGGAG 901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ GTTACCCTCGATAATTGAGAAGATACGGTAAGGTGTTGTAAGTGGGTGAATGATAACCTC __M__G__A__I__N__S__S__M__P__F__H__N__I__H__P__L__T__I__G__E AGTGCCCAAAGTACGTGAAGTCTAACAGGCTTGTGCTTGCTACTGGACTTAGGAACTCTC 961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ TCACGGGTTTCATGCACTTCAGATTGTCCGAACACGAACGATGACCTGAATCCTTGAGAG __C__P__K__Y__V__K__S__N__R__L__V__L__A__T__G__L__R__N__S__P CACAGAGAGAAAGAAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTGAGGGAGGATGGC 1021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ GTGTCTCTCTTTCTTCCCCTGAAAAGCCTCGATAACGACCTAAGTAACTCCCTCCTACCG __Q__R__E__R__R__G__L__F__G__A__I__A__G__F__I__E__G__G__W__Q AGGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATACCATCACTCTAACGAGCAAGGATCTGGATATG 1081 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ TCCCTTACCAACTACCTACCATGCCTATGGTAGTGAGATTGCTCGTTCCTAGACCTATAC __G__M__V__D__G__W__Y__G__Y__H__H__S__N__E__Q__G__S__G__Y__A CTGCTGATAAGGAATCTACTCAGAAAGCTATTGATGGTGTTACTAACAAGGTGAACTCTA 1141 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ GACGACTATTCCTTAGATGAGTCTTTCGATAACTACCACAATGATTGTTCCACTTGAGAT __A__D__K__E__S__T__Q__K__A__I__D__G__V__T__N__K__V__N__S__I BstBI TTATTGATAAGATGAACACTCAGTTCGAAGCTGTTGGAAGAGAGTTCAACAACCTTGAGA 1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ AATAACTATTCTACTTGTGAGTCAAGCTTCGACAACCTTCTCTCAAGTTGTTGGAACTCT __I__D__K__M__N__T__Q__F__E__A__V__G__R__E__F__N__N__L__E__R GAAGGATTGAGAACCTTAACAAGAAAATGGAAGATGGATTCCTTGATGTGTGGACTTACA 1261 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ CTTCCTAACTCTTGGAATTGTTCTTTTACCTTCTACCTAAGGAACTACACACCTGAATGT __R__I__E__N__L__N__K__K__M__E__D__G__F__L__D__V__W__T__Y__N ACGCTGAGTTGCTTGTGCTTATGGAAAACGAGAGGACTCTTGATTTCCACGATTCTAACG 1321 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ TGCGACTCAACGAACACGAATACCTTTTGCTCTCCTGAGAACTAAAGGTGCTAAGATTGC __A__E__L__L__V__L__M__E__N__E__R__T__L__D__F__H__D__S__N__V TGAAGAACCTTTACGATAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGATAACGCTAAAGAGCTTGGAA 1381 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ ACTTCTTGGAAATGCTATTTCACTCCGAAGTCGAATCCCTATTGCGATTTCTCGAACCTT __K__N__L__Y__D__K__V__R__L__Q__L__R__D__N__A__K__E__L__G__N BglII ACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGATAACGAGTGCATGGAATCTGTGAGATCTG 1441 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ TGCCAACGAAGCTCAAGATGGTGTTCACGCTATTGCTCACGTACCTTAGACACTCTAGAC __G__C__F__E__F__Y__H__K__C__D__N__E__C__M__E__S__V__R__S__G ScaI AflII GAACTTACGATTACCCACAGTACTCTGAAGAAGCTAGGCTTAAGAGGGAAGAGATTTCTG 1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ CTTGAATGCTAATGGGTGTCATGAGACTTCTTCGATCCGAATTCTCCCTTCTCTAAAGAC __T__Y__D__Y__P__Q__Y__S__E__E__A__R__L__K__R__E__E__I__S__G GTGTTAAGTTGGAGTCTATTGGTATTTACCAGATTCTTTCTATTTACTCTACTGTGGCTT 1561 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ CACAATTCAACCTCAGATAACCATAAATGGTCTAAGAAAGATAAATGAGATGACACCGAA __V__K__L__E__S__I__G__I__Y__Q__I__L__S__I__Y__S__T__V__A__S CTTCTCTTGCTCTTGCTATTATGGTGGCTGGACTTTCTCTTTGGATGTGCTCTAACGGAT 1621 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ GAAGAGAACGAGAACGATAATACCACCGACCTGAAAGAGAAACCTACACGAGATTGCCTA __S__L__A__L__A__I__M__V__A__G__L__S__L__W__M__C__S__N__G__S BamHI PacI CTCTTCAGTGCAGGATCTGCATTGGATCCTTAATTAA 1681 ---------+---------+---------+------- GAGAAGTCACGTCCTAGACGTAACCTAGGAATTAATT __L__Q__C__R__I__C__I__ b. Trình tự gen HA1 10 20 30 40 50 60 GATCAGATCT GCATTGGATA CCACGCTAAC AACTCTACTG AGCAAGTGGA TACAATTATG 70 80 90 100 110 120 GAAAAGAACG TGACTGTTAC TCACGCTCAG GATATTCTTG AAAAGACTCA CAACGGAAAG 130 140 150 160 170 180 TTGTGCGCTC TTGATGGTGT TAAGCCACTT ATTCTTAGGG ATTGCTCTGT TGCTGGATGG 190 200 210 220 230 240 CTTCTTGGAA ACCCAATGTG TGATGAGTTC ATTAACGTGC CAGAGTGGTC TTATATTGTG 250 260 270 280 290 300 GAGAAGGCTA ACCCAGTGAA CGATCTTTGC TACCCTGGTG ATTTCAACGA TTACGAAGAG 310 320 330 340 350 360 CTTAAGCACC TTCTTTCTAG GATTAACCAC TTCGAGAAGA TTCAGATTAT TCCAAAGTCA 370 380 390 400 410 420 TCTTGGTCAT CTCACGAGGC TTCTCTTGGA GTTTCTTCTG CTTGCCCATA CCAGGGAAAG 430 440 450 460 470 480 TCATCTTTCT TCAGGAACGT TGTTTGGCTT ATTAAGAAGA ACTCTACTTA CCCAACTATT 490 500 510 520 530 540 AAGAGGTCTT ACAACAACAC TAACCAGGAA GATCTTTTGG TTCTTTGGGG AATTCACCAC 550 560 570 580 590 600 CCAAATGATG CTGCTGAACA GATTAAGTTG TACCAGAACC CAACTACTTA CATTTCTGTG 610 620 630 640 650 660 GGAACTTCTA CTCTTAACCA GAGGCTTGTG CCAAGAATTG CTACTAGGTC TAAGGTGAAC 670 680 690 700 710 720 GGACAATCTG GAAGGATGGA ATTCTTCTGG ACTATTCTTA AGCCAAACGA TGCTATTAAC 730 740 750 760 770 780 TTCGAGTCTA ACGGAAACTT CATTGCTCCA GAGTACGCTT ACAAGTTGGT GAAGAAGGGT 790 800 810 820 830 840 GATAGTACTA TTATGAAGTC TGAGCTTGAG TACGGAAACT GCAACACTAA GTGCCAAACT 850 860 870 880 890 900 CCAATGGGAG CTATTAACTC TTCTATGCCA TTCCACAACA TTCACCCACT TACTATTGGA 910 920 930 940 950 960 GAGTGCCCAA AGTACGTGAA GTCTAACAGG CTTGTGCTTG CTACTGGACT TAGGAACTCT 970 CCACAGAGAG AAAGAAGG MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN …………………………………………………………...i LỜI CẢM ƠN ………………………………………………………………ii MỤC LỤC …………………………………………………………………iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ……………………………………………vi DANH MỤC CÁC BẢNG ………………………………………………..vii DANH MỤC CÁC HÌNH ………………………………………………..viii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Cúm A/H5N1 3 1.1.1. Cấu tạo 3 1.1.2. Độc lực và tính thích ứng vật chủ 5 1.1.3. Khả năng gây bệnh của virus cúm A/H5N1 7 1.1.4. Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ 8 1.2. Kháng nguyên HA 10 1.3. Tình hình nghiên cứu cúm A và vấn đề nghiên cứu vaccine cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới 12 1.3.1. Tình hình nghiên cứu cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới.. 12 1.3.2. Nghiên cứu phát triển vaccine cúm A/H5N1 ở Việt Nam và trên thế giới 16 1.4. Kỹ thuật chuyển gen thông qua A.rhizogens và ứng dụng 19 1.4.1. Giới thiệu vi khuẩn A.rhizogens 19 1.4.2. Hệ vector nhị thể 21 1.4.3. Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất dược phẩm sinh học tái tổ hợp 23 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị 25 2.1.1. Vật liệu 25 2.1.2. Hóa chất 25 2.1.3. Thiết bị 26 2.2. Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1. Phương pháp nhân đoạn gen HA1bằng kỹ thuật PCR 26 2.2.2. Phương pháp ghép nối đoạn gen HA1vào pENTR221/cal 28 2.2.3. Biến nạp sản phẩm ghép nối gen vào tế bào khả biến E. coli DH-5α bằng phương pháp sốc nhiệt 30 2.2.4. Tạo vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway 32 2.2.5. Biến nạp vector chuyển gen vào A. rhizogenes ATCC15834 35 2.2.6. Chuyển cấu trúc mang gen mã hóa protein vỏ virus vào thuốc lá thông qua vi khuẩn A. rhizogenes ATCC15834 36 2.2.7. Phương pháp đánh giá cây trồng chuyển gen 37 2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu ………………………………………. 39 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1. Kết quả tách dòng gen HA1 40 3.1.1. Kết quả PCR nhân đoạn gen HA1 40 3.1.2. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR 41 3.1.3. Ghép nối đoạn gen HA1 vào vector pENTR/cal 42 3.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA1 bằng kỹ thuật Gateway®. 47 3.2.1. Tạo vector tái tổ hợp theo phản ứng LR 47 3.2.2. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR 48 3.2.3. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn 48 3.3. Kết quả biến nạp pK7WG2D/cal/HA1 vào vi khuẩn A.rhizogenes 49 3.4. Kiểm tra hệ thống tạo rễ tơ chuyển gen thông qua A.rhizogenes sử dụng gen chỉ thị Gus 51 3.5. Kết quả chuyển gen HA1 vào mảnh lá thông qua A. rhizogens để tạo các dòng rễ tơ chuyển gen HA1 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC …………………………………………………………………. 66