Đề tài Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase trong nấm mốc

LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. TS. Nông Văn Hải – Phó Viện trưởng, Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Trưởng phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Quyền Đình Thi, Chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi”, thuộc Chương trình trọng điểm cấp Nhà nước: “Phát triển và ứng dụng Công nghệ sinh học trong lĩnh vực Nông nghiệp và phát triển nông thôn đến 2020”do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn chủ trì, đã tạo điều kiện cho tôi được tham gia nghiên cứu, hoàn thành luận văn theo hướng nghiên cứu của đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Sinh – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn. Tôi xin bày tỏ biết ơn tới toàn thể các cán bộ Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học đặc biệt là TS. Lê Thị Thu Hiền và KS. Vũ Hải Chi đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi rất tận tình trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin gửi tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp lòng biết ơn sâu sắc vì sự quan tâm, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Học viên Nguyễn Thị Mai Hương NHỮNG TỪ VIẾT TẮT AS Acetosyringone ATP Adenosine triphosphate bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid EtBr Ethidium bromide xylB Xylanase B Hph Hygromycin photpotransferase encoding gene IM Induction medium kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria – Bertani LC Luria – Complete MES (2 – N – morpholine) – ethane sulfonic acid PCR Polymerase Chain Reaction RNase Ribonuclease RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulphate TAE Tris – acetate – EDTA vir Virulence region MỤC LỤC MỞ ĐẦU Trong nhiều năm gần đây, nhu cầu sử dụng enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật ngày càng tăng, đặc biệt là enzyme xylanase. Xylanase được sử dụng trong nhiều ngành sản xuất công nghiệp trên toàn thế giới [18, 29]. Một trong những ứng dụng quan trọng của xylanase là được dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Sự có mặt của xylanase trong thức ăn chăn nuôi có tác dụng thúc đẩy quá trình tiêu hóa, từ đó cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột của động vật [4, 13]. Ngoài ra, xylanase còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác ví dụ: phân hủy rác thải; làm trắng trong công nghiệp sản xuất giấy… [22, 29]. Trong tự nhiên, rất nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc tiết ra xylanase [22], trong đó xylanase do nấm mốc tiết ra được quan tâm hơn cả bởi chúng có hàm lượng cao và ổn định. Nấm mốc Aspergillus hay còn gọi là nấm sợi, là nhóm nấm đa dạng và phân bố rộng trong tự nhiên. Với tiềm năng vô cùng phong phú, Aspergillus được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất enzyme cũng như trong các ngành nghiên cứu cơ bản về cơ chế sinh lý và sinh hóa và cơ chế di truyền vi sinh vật từ nhiều năm nay trên thế giới [9, 11]. Do nhu cầu sử dụng xylanase trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là lĩnh vực sản xuất thức ăn chăn nuôi ngày càng tăng. Bởi vậy, nghiên cứu sản xuất và ứng dụng enzyme xylanase có chất lượng cao, ổn định từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhờ công nghệ chuyển gen đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu [22, 31]. Chuyển gen vào nấm dựa trên nền tảng của công nghệ DNA tái tổ hợp, để cải biến hệ gen của nấm mốc nhằm đáp ứng nhu cầu của con người về các sản phẩm protein cũng như enzyme để sản xuất trên qui mô công nghiệp. Hơn nữa, kỹ thuật chuyển gen cho phép chọn lựa promoter đặc hiệu cũng như các chủng vi sinh vật chuyển gen mong muốn, nhờ vậy đặc tính của enzyme tái tổ hợp đã được cải thiện [22]. Hiện nay, kỹ thuật chuyển gen thông vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được sử dụng phổ biến trên thế giới để chuyển gen vào thực vật. Bởi đây là một hệ thống chuyển gen có hiệu suất cao, ổn định và đơn giản. Agrobacterium đã và đang được nghiên cứu, áp dụng để chuyển gen vào nấm mốc [3, 9]. Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase trong nấm mốc” Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và Phòng Công nghệ DNA ứng dụng – Viện Công nghệ sinh học. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài Mục tiêu Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ chuyển gen để thiết kế Ti–plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B. Trên cở sở đó tạo các chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp phục vụ công tác chuyển gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B vào A. niger. Nội dung nghiên cứu - Thiết kế vector tách dòng trung gian pKS_xylB_hph dựa trên vector pBluescript II KS (-) mang hai cấu trúc biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B:(GpdA promoter + xylanase gene + TrypC terminator) và (GluA promoter + hph gene + TrypC terminator). - Thiết kế Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph dựa trên vector pCAMBIA1300 mang hai cấu trúc biểu hiện biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B: (GpdA promoter + xylanase gene + TrypC terminator) và (GluA promoter + hph gene + TrypC terminator. - Tạo các chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph để làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm mốc. - Chuyển vector biểu hiện pCB_xylB_hph vào nấm mốc A. niger thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1. Xylanase và ứng dụng trong công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi 1.1.1. Xylanase và sự phân hủy sinh học xylan Xylanase (Endo – 1,4 – ß – xylanase (1,4 – D – xylan xylanohydrolase: E.C. 3.2.1.8)) là enzyme quan trọng nhất tham gia thủy phân xylan [13, 29]. Xylanase thủy phân xylan bằng cách cắt đứt các liên kết ß – 1,4– glycoside, tạo thành các xylo – oligo [30]. Tuy nhiên, do cấu trúc của xylan rất phức tạp nên để phân cắt nó hoàn toàn cần một lượng lớn enzyme xylanase [19]. Xylanase được tách chiết từ vi khuẩn, nấm chẳng hạn như: Trichoderma, Bacillus, Cryptococcus, Aspergillus, Penicillium, Aureobasidium, Fusarium, Chaetomium, Phanerochaete, Rhizomucor, Humicola, Talaromyces…[22]. Hình 1. 1: Cấu trúc hóa học của xylan Xylan là thành phần chính cấu tạo nên hemicellulose của thành tế bào thực vật và là một trong số hợp chất polysaccharide quan trọng nhất trong tự nhiên [12, 28]. Xylan chủ yếu tìm thấy trong cấu trúc thứ cấp của thành tế bào thực vật và tạo thành pha giữa giữa lignin và các hợp chất polysaccharide khác [29]. Xylan cũng là một trong những polysaccharid phổ biển nhất trong các loài thực vật thông thường, chiếm 30% tổng trọng lượng khô trong sinh khối thực vật nhiệt đới. Với cây gỗ mềm ở vùng ôn đới, xylan ít phổ biến hơn và chiếm khoảng 8% tổng trọng lượng khô [29]. Như vậy, vô tình xylan đã trở thành một trong những thành phần có trong thức ăn chăn nuôi [28]. Xylan đa dạng về cấu trúc và khối lượng phân tử. Xylan là polymer không đồng nhất, mạch thẳng, gồm các đơn phân d – xylose được liên kết với nhau bằng liên kết ß – 1,4 – glycoside. Trong tự nhiên, chúng được thay thế một phần bằng acetyl 4 – 0 – methyl – d – glucuronosyl và arabinofuranosyl tạo thành cấu trúc polymer không đồng nhất. Tác động của xylan về mặt cấu trúc vẫn còn chưa rõ ràng bởi những khó khăn trong việc tách chiết xylan từ nguyên liệu trong tự nhiên mà không bị biến đổi hay mất đi một số cấu trúc ban đầu của xylan cũng như sự liên kết của nó với các thành phần khác [18, 23, 29]. Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc phân hủy xylan, đặc biệt là vi sinh vật tiết ra enzyme xylanase. Ứng dụng của xylanase đã được Hoppe - Seyler báo cáo từ hơn một trăm năm qua [18]. Sự phân hủy sinh học bộ khung cấu tạo nên xylan phụ thuộc chủ yếu vào hai lớp enzyme: endo – 1,4 – ß - xylanase (1,4 – ß – D – xylanohydrolase; EC 3.2.1.8), lớp enzyme này thủy phân liên kết 1,4 – ß - Glucosid nối với xylose và ß – xylosidases (1,4 – ß – D – xylan xylanohydrolase; EC 3.2.1.37), lớp enzyme này thủy phân xylobiose và xylooligosaccharid ngắn nhờ hoạt động của enzyme endo – xylanase. Các enzyme loại mạch nhánh (debranching enzyme) chẳng hạn như α – glucuronidase và α – L – arabinifuranosidase và esterase chẳng hạn như acetylxylan esterases và ferulyl và p – coumaroyl esterase sẽ loại bỏ mạch nhánh acetyl và mạch nhánh phenol [29]. Ở cây gỗ rắn, xylan có công thức O – acetyl – 4 – O – methylglucuron – oxylan. Arabino – 4 – O – methylglucuroxylan tìm thấy trong cây gỗ mềm và arabinoxylan rất điển hình trong cây cỏ và thực vật bình thường khác [13]. Sự đa dạng của xylan dẫn đến sự đa dạng của enzyme xylanase [13]. Xylanase tiết ra từ vi sinh vật được chia làm hai họ enzyme thủy phân chính: họ 10 và họ 11 dựa trên trình tự tương đồng của amino acid [28]. Xylanase thuộc họ 10 nhìn chung có khối lượng phân tử lớn (>30 kDa), đa dạng và phức tạp hơn (có thể thủy phân cellulose và xylan), trong khi xylanase thuộc họ 11 có khối lượng phân tử nhỏ hơn (khoảng 20 kDa) và đặc hiệu hơn đối với xylan [13, 29]. Xylanase có trong nhiều loài sinh vật trong tự nhiên, ở sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn và đã được tìm thấy cả trong vi khuẩn ở nước, nấm, tảo biển, côn trùng. Cho đến nay, hầu hết xylanase được chiết xuất từ vi khuẩn và nấm [13, 29]. Trong đó, nấm sợi là nguồn vi sinh vật tiềm năng nhất để chiết xuất xylanase với hàm lượng cao [13, 29]. Trong nhiều thập kỉ gần đây, xylanase còn được tách chiết từ nấm gây bệnh trên các cây ngũ cốc nói riêng và vi sinh vật gây bệnh thực vật nói chung [29]. Hơn nữa, nhiều vi sinh vật tiết enzyme xylanase phân hủy xylan cũng có thể phân hủy cellulose do sự tương đồng của các liên kết (1,4 – ß – glucosid) giữa hai enzyme celllulase và xylanase. Một số loài Bacillus chỉ tiết ra xylanase, trong khi nhiều loài nấm sợi lại tiết ra lượng lớn protein ngoại bào và tạo thành xylanase thường kèm theo cả enzyme phân hủy cellulose, chẳng hạn như một số loài thuộc Trichoderma, Penicillium và Aspergillus [29]. Do đó, để ứng dụng xylanase đạt hiệu quả cao nhất cần phải loại bỏ ảnh hưởng của cellulase, hoạt động và bền vững với nhiệt độ. Ngày nay, xylanase đã và đang được chú trọng nghiên cứu rộng rãi trên toàn thế giới, từ Châu Âu, đến Châu Á và được áp dụng trong nhiều ngành công nghiệp [13, 30]. 1.1.2. Ứng dụng xylanase trong sản xuất thức ăn chăn nuôi Xylanase được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Xylanase hỗ trợ quá trình tẩy trắng trong công nghiệp sản xuất giấy thay vì phải sử dụng các hóa chất độc hại; xylanase tham gia quá trình xử lý rác thải nông, lâm nghiệp [8]; trong công nghiệp sản xuất bánh, xylanase được dùng để làm tăng độ phồng và giảm độ dính của bánh; xylanase được dùng trong công nghiệp sản xuất đồ uống, sản xuất nhiên liệu [20, 29]. Một trong những ứng dụng quan trọng của xylanase là được dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Sự có mặt của xylanase trong thức ăn chăn nuôi làm giảm độ nhớt trong đường tiêu hóa, giảm rối loạn tiêu hóa, tăng cường hấp thu thức ăn, nhờ vậy cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, giúp phân thải ra khô hơn [4, 5, 13, 27]. Ngoài xylanase, một số enzyme khác cũng được dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, bao gồm: mananase, ß – glucanase và cellulase, α – amylase, protease và phytase. Các loại enzyme này đều được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm qua trên toàn thế giới, từ Châu Âu, đến Châu Mĩ và Châu Á [5, 13, 27]. Do tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực mà xylanase đã thu hút mạnh mẽ sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Xylanase tách chiết từ Aspergillus đã được tách dòng và biểu hiện thành công. Đặc tính của enzyme này cũng đã được phân tích [13]. Những thành tựu trên là cơ sở để nghiên cứu tạo sinh vật chuyển gen mã hóa xylanase vào vật chủ mong muốn với mục đích thu lượng lớn enzyme phục vụ cho các ngành sản xuất công nghiệp. 1.2. Nấm mốc và ứng dụng của công nghệ chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens 1.2.1. Giới thiệu về nấm mốc Nấm mốc hay còn gọi là nấm sợi là vi sinh vật đa dạng nhất trong tự nhiên. Ước tính có khoảng 1,5 triệu loài nấm, trong đó chiếm số lượng lớn là các loài thuộc chi Aspergillus. Chúng là các vi sinh vật nhân chuẩn bậc thấp, sinh bào tử và sống hoại sinh nhờ khả năng sinh enzyme để phân hủy các hợp chất hữu cơ [8, 22]. Aspergillus là một chi thuộc ngành Eumycota và gồm rất nhiều loài phổ biến, ví dụ: A. niger, A. oryzae... Giống như các loài khác trong chi Aspergillus, A. niger sinh bảo tử có màu đen, vì thế chúng còn được gọi là mốc đen [33]. A. niger gây ảnh hưởng đến các sản phẩm nông sản sau khi thu hoạch nhưng chúng ít gây bệnh cho con người so với một số loài thuộc chi Aspergillus chẳng hạn như A. flavus, A. fumigatus. A. niger cũng đã được sử dụng từ rất lâu trong sản xuất thực phẩm, sản xuất citric acid, gluconic acid gluconic [33]. Nhờ khả năng tiết enzyme với hàm lượng cao, A. niger được sử dụng phổ biến trong sản xuất thực phẩm và được coi là loài một vi sinh vật quan trọng trong sản xuất công nghiệp [10, 13]. Ngoài ra, chúng còn được sử dụng trong sản xuất bánh, rượu, bia. Dựa trên lịch sử ứng dụng lâu đời trong sản xuất thực phẩm lên men, A. niger đã được coi là vi sinh vật an toàn và thân thiện với con người, mặc dù một số chủng (chiếm khoảng 3 – 10%) có thể sản xuất ra một số chất chuyển hóa thứ cấp gây độc trong điều kiện lên men như mycotoxin nhưng với hàm lượng rất thấp. Kỹ thuật chuyển gen đã được áp dụng để chuyển các gen mong muốn vào thực vật, nấm (nấm men) nhằm nâng cao năng suất, kháng sâu bệnh và nâng cao chất lượng sản phẩm [22]. Chuyển gen vào A. niger đã được khai phá từ những năm cuối thập kỉ 80 và đầu thập kỉ 90, trong gen mã hóa enzyme là một trong những mục tiêu được quan tâm nhất. Hiện nay, nhiều loại enzyme được sử dụng trong các ngành sản xuất công nghiệp, đặc biệt là các enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật tái tổ hợp bằng kỹ thuật di truyền bởi đặc tính của chúng đã được cải thiện [31]. A. niger là loài có khả năng sinh enzyme với hàm lượng cao và ổn định, do đó chúng trở thành vật chủ để biểu hiện các loại enzyme mong muốn [9, 10, 31]. Chuyển gen vào nấm thường được tiến hành theo hai cách: trực tiếp và gián tiếp. Kỹ thuật chuyển gen trực tiếp được thực hiện bằng xung điện, polyethylene glycol (PEG), và bom vi tiêu để chuyển gen vào thể nguyên sinh, bào tử, hay thể sợi nấm. Ngoài các kỹ thuật trên, một số các kỹ thuật chuyển gen khác được áp dụng ví dụ: chuyển gen nhờ các transposon hay nhờ các enzyme giới hạn. Tuy nhiên, các kỹ thuật này bộc lộ nhiều nhược điểm, chẳng hạn như tần suất tái tổ hợp tương đồng thấp; có thể chuyển nhiều loại gen, kể cả những gen không mong muốn [11, 16]; có thể tạo ra những vùng gen không mã hóa hoặc sau khi chuyển gen thường xảy ra hiện tượng sắp xếp lại genome hoặc tồn tại những trình tự có tốc độ sao mã cao [12]. Ngoài các kỹ thuật chuyển gen trực tiếp, chuyển gen có thể được thực hiện một cách gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Phương pháp này đã và đang được nghiên cứu và ứng dụng để chuyển gen vào nấm mốc [1, 9, 12]. 1.2.2. Agrobacterium và ứng dụng trong công nghệ chuyển gen thực vật và nấm 1.1.2.1. Giới thiệu về vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens Trong tự nhiên, chúng ta thường gặp ở vùng cổ rễ các loài thực vật hai lá mầm một loại khối u gồm khối các tế bào không phân hóa và phát triển không có tổ chức. Những tế bào trong khối u này mất khả năng phân cực và phân chia liên tục giống như tế bào ung thư ác tính ở động vật. Hình 1. 2: Khối u thực vật do Agrobacterium [18] Theo cơ chế hình thành, người ta phân biệt hai loại khối u chính: khối u di truyền và khối u cảm ứng. Khối u di truyền thường xuất hiện ở một vài cặp lai có tính hòa hợp không cao ở một nhiễm sắc thể riêng rẽ nào đó, đặc biệt khi lai các loài khác của chi thuốc lá Nicotiana hoặc của chi rau cải Brassica. Loại khối u cảm ứng được biết đến nhiều nhất là mụn cây do loài vi khuẩn A. tumefaciens gây nên [1]. Agrobacterium là chi vi khuẩn Gram âm (–), bao gồm các loài gây bệnh kí sinh và vi sinh vật sống trong đất. A. tumefaciens là loài vi khuẩn đất có khả năng chèn gen của mình vào tế bào vật chủ và sau đó sử dụng bộ máy của sinh vật chủ để biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng. A. tumefaciens sẽ tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, gây ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn cây–crown gall disease) [12, 18]. Cơ chế hình thành loại khối u cảm ứng này được nghiên cứu từ nhiều năm nay và mang lại nhiều thành tựu quan trọng trong chuyển gen thực vật [18]. A. tumefaciens được sử dụng như một hệ thống trung gian hữu hiệu để chuyển gen vào nhiều loài nấm, chẳng hạn như A. awamori, A. fumigatus, Penecillium digitatums [18, 19]. Không chỉ vậy, chuyển gen thông qua A. tumefaciens cũng đã được áp dụng để chuyển gen vào tế bào người [26]. Đến nay người ta đã khám phá được bản chất phân tử của quá trình cảm ứng phát sinh khối u do vi khuẩn A. tumefaciens gây ra ở thực vật. Trước hết là quá trình nhiễm khuẩn ở vùng tế bào của cây bị thương. Các tế bào bị thương tiết ra những hợp chất polyphenol thu hút các tế bào vi khuẩn A. tumefaciens. Tuy nhiên, vi khuẩn không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển gen vào chúng một đoạn DNA nhỏ (T – DNA: tranferred DNA) nằm trên một loại plasmid đặc biệt và gây nên trình trạng phát sinh khối u. Plasmid đặc biệt là Ti plasmid (tumor inducing) [12, 26]. T – DNA sẽ tạo ra khối u thực vật và sự phát triển của khối u sau đó sẽ không phụ thuộc vào sự có mặt của vi khuẩn Agrobacterium [19, 29]. 1.2.2.1. Ti plasmid Ti plasmid là một phân tử DNA vòng tương đối lớn, kích thước khoảng 150 kb – 200 kb. Tuy nhiên chỉ một đoạn 2 kb – 3 kb có khả năng thâm nhập vào genome của tế bào chủ. Đó là đoạn T – DNA [19, 26]. T – DNA được xác định bởi trình tự ở hai đầu khoảng 25 bp gọi là vùng biên (T – DNA borders), phần còn lại ngoài vùng biên sẽ không có chức năng gì trong quá trình chuyển gen [12, 26]. Trên T – DNA có các gen tạo khối u. Gen tạo khối u sau khi gắn vào hệ gen của tế bào chủ sẽ tham gia quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin. Đây là các hợp chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục và dẫn đến hình thành các khối u [12, 26]. Nhờ đặc điểm này, người ta có thể loại bỏ khả năng gây hại của T – DNA bằng cách thay các gen tạo khối u (oncogenes) nằm trong 2 đầu vùng biên bằng các gen mong muốn. Khi các gen tạo khối u bị loại bỏ, tế bào hoặc mô thực vật chuyển gen sẽ phát triển bình thường [1, 22]. Gen tổng hợp opine cần thiết để tổng hợp opine [12, 26]. Hợp chất này không được tổng hợp trong Agrobacterium mà chỉ được tổng hợp trong tế bào vật chủ vì gen điều khiển sự biểu hiện của gen sinh tổng hợp opine chỉ hoạt động trong tế bào nhân chuẩn [2]. Bằng cách này, vi khuẩn cảm ứng tế bào chủ tạo ra năng lượng và nguồn nitơ cần thiết cho chúng [12, 26]. Ngoài ra, Ti plasmid còn gồm 2 hệ gen: hệ gen gây độc vir và gen sinh tổng hợp opine. Vùng gen độc vir nằm trên Ti plasmid gồm nhiều gen độc khác nhau cùng tham gia quá trình vận chuyển T – DNA [11]. Khi xâm nhiễm vào tế bào vật chủ, các gen gây độc vir được biểu hiện, chuyển T – DNA sang tế bào chủ và khối u được tạo thành do sự hình thành auxin và cytokinin. Đây là các chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục [2, 12], dẫn đến thay đổi sự cân bằng hormon thực và hình thành các khối u. Tỷ lệ auxin so với cytokin tạo ra từ các gen vir sẽ quyết định hình thái khối u. Bên cạnh những gen chức năng, Ti plasmid gồm gen sinh tổng hợp amino acid hiếm, ví dụ: Một loại u tạo octopine và loại khác tạo nopanine, vì vậy người ta phân biệt 2 loại Ti plasmid là loại nopalin và loại octopine. Trình tự nucleotid của chúng chỉ khác nhau ở trình tự gen mã hóa các enzyme tham gia sinh tổng hợp nopalin và octopin [1]. Agrobacterium tumefaciens chủ yếu lây nhiễm thực vật qua các vết thương. Thực vật bị thương sẽ ứa ra hợp chất amino acid, trong đó đường và acid vô cơ là những yếu tố thu hút vi khuẩn xâm nhiễm bằng cách hóa hướng động. Khi vi khuẩn tiến đến vết thương trên cây, chúng tấn công vào bề mặt và tổng hợp các sợi cellulose, đồng thời thực vật tiết ra các hợp chất phenol, chẳng hạn như acetosyringone (AS), một hợp chất thường được sử dụng để cảm ứng gen vir. Một hệ thống điều hòa gồm hai thành phần cấu thành từ protein độc virA và virG được hoạt hóa nhờ sự có mặt của AS. Protein nhiễm sắc thể, chvE tương tác với virA làm tăng mức độ biểu hiện của gen vir trong môi trường có hợp chất monosaccharide. AS kích thích virA, một thụ thể liên kết màng, và virA kích thích virG. VirG bị kích thích sẽ tương tác với các yếu tố kích thích trên đoạn khởi đầu (promoter) điều khiển khung đọc (operon) của virA, virB, virC, virD, virE và virG và kết quả là làm tăng mức độ biểu hiện [12, 26]. . Tế bào chủ Nhân Vết thương thành tế bào thực vât Vết thương thành tế bào thực vât T-DNA đa hòa nhập Tế bào chất Preotein tương tác với virD2 Preotein tương tác Phức hợp T Phức hợp T hoàn thiện Hình 1. 3: Mô hình xâm nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật [19] VirC và virD đều bị endonuclease phân cắt, hai gen này liên kết với biên phải của T – DNA và cắt T – DNA sợi đơn ra khỏi Ti plasmid. Ngay lập tức trình tự này liên kết với virE2 để tránh tác dụng của endonuclease và hiện tượng tự bắt cặp lại. VirB2 – B11 hình thành T – pilus và kích thích virE2 đã được bao bọc bởi T – DNA dạng sợi đơn chuyển sang tế bào đích [12, 26]. Trong tế bào chủ, T – DNA sẽ hoạt động cùng gen nhân và mã hóa ra hormon và opine. Hormon kích thích sự phát triển của tế bào chủ, opine là nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn A. tumefaciens. Tuy nhiên, cho đến nay người ta vẫn chưa biết được đầy đủ cơ chế chính xác của quá trình này [26]. Trong tế bào vật chủ, đầu cùng C của virE2 hướng tới DNA trong nhân và sẽ hòa nhập vào hệ gen của tế bào chủ. Nếu không có trình tự tương đồng giữa trình tự gen của tế bào chủ và T – DNA được chuyển, T – DNA sẽ hòa nhập một cách ngẫu nhiên vào hệ gen của tế bào chủ. Tuy nhiên, nếu những đoạn gen mà có độ tương cao với hệ gen của tế bào chủ, chúng sẽ tái tổ hợp tương đồng. Tần suất tái tổ hợp tương đồng khác nhau khi chuyển những đoạn gen có kích thước khác nhau, nhưng hiệu quả chuyển gen sẽ tăng khi giảm tỷ lệ các đoạn tương đồng [26]. Hiện nay người ta đã thành công trong việc cải biến Ti plasmid bằng cách cắt bỏ hấu hết các đoạn gen gây phát triển khối u, chỉ để lại đoạn gen vir và phần T – DNA tối thiểu mang điểm ghép gen. Loại vector này đang được sử dụng rất hiệu quả trong việc đưa DNA lạ vào tế bào vật chủ [1]. 1.2.2.2. Các hệ thống vector dùng trong chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium * Vector liên hợp (cointegrate) Vì kích thước Ti plasmid quá lớn nên thao tác với chúng rất khó khăn. Giải pháp cho việc này là chuyển vùng T – DNA lên một vector nhỏ hơn. Điều này là hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế bào chủ. Hệ thống này gọi là hệ thống vector liên kết. Cả gen tiền ung thư và gen tổng hợp opine ở dạng T – DNA hoang dại đều được thay thế bởi gen chọn lọc (gen kháng kháng sinh). Gen sinh tổng hợp opine trên Ti plasmid cũng bị loại bỏ và chỉ giữ lại gen vir cần thiết cho việc hình thành bộ máy và cấu trúc đảm cho việc sao chép bền vững của plasmid trong A. tumefaciens. Vector liên hợp là một Ti plasmid vector mang một số đoạn chức năng của một vector thông thường khác của E. coli, và thường gồm những phần sau: i) Một vị trí thích hợp cho phép ghép nối các đoạn gen quan tâm (gen of interest = GOI), thường là có nguồn gốc từ một plasmid của vi khuẩn E. coli; ii) Gen chỉ thị có tính kháng kháng sinh để chọn lọc hoạt động được trong E. coli và A. tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật; iv) Đoạn khởi đầu của E. coli, không hoạt động ở A. tumefaciens. Như vậy, vector liên hợp thực chất là vector lai có chỗ cho GOI đi nhờ như một hành khách vào trong tế bào thực vật [1]. * Vector nhị thể (binary vector) Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần riêng biệt: Ti plasmid và vector T – DNA Khắc phục tình trạng khó nhân bản trong A. tumefaciens, loại vector nhị thể được thiết kế bao gồm các phần như sau: i) Vị trí ghép nối đa điểm; ii) Đoạn khởi đầu tái bản hoạt động cả ở E. coli và A. tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực vật.; iv) gen có khả năng vận chuyển (như oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông qua A. tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp; v) Đoạn T – DNA ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên phải bắt buộc phải có. Ngoài ra còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thích vận chuyển T – DNA [1, 19]. Hệ vector nhị thể được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản. Loại vector vận tải mang GOI giữa đoạn ngoại biên của T – DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật. Plasmid hỗ trợ được cải biến từ các Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật [1]. Với các kiểu plasmid như trình bày trên có thể tiến hành chuyển gen gián tiếp thông Agrobacterium vào nhiều loài nấm mốc khác nhau [1, 9, 11]. 1.2.3. Chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens 1.2.3.1. Kỹ thuật chuyển gen vào nấm mốc A. niger Nhờ khả năng chuyển DNA sang tế bào vật chủ và phổ vật chủ rộng mà chuyển gen nhờ A. tumefaciens trở thành kỹ thuật thông dụng để chuyển gen vào nhiều đối tượng khác nhau, ví dụ: thực vật, vi sinh vật [22, 26]. Nhiều loài thực vật chuyển gen nhờ Agrobacterium, trong đó chiếm số lượng lớn là các cây nông nghiệp, chẳng hạn như khoai tây, cà chua, đậu tương, cây bông và cây lúa đã mang lại năng suất và chất lượng cao, chống chịu với sâu bệnh [3, 9]. Đối với vi sinh vật, nấm men Saccharomyces serevisiae là đối tượng được sử dụng phổ biến nhưng lại không phải là vật chủ tối ưu để chuyển gen nhờ Agrobacterium. Hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacterium vào nấm men thấp hơn so với chuyển gen vào thực vật và thấp hơn so với các phương pháp truyền thống, ví dụ: xung điện [9]. Chuyển gen thông qua Agrobacterium đã được Nyilasi ứng dụng để chuyển gen kháng hygromycin B vào Zygomycetes [15]. Agrobacterium cũng được sử dụng để chuyển gen vào nấm sợi, chẳng hạn như: Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Trichoderm, Neurospora, trong đó phổ biến nhất là các loài Aspergillus, bao gồm: A. awamori, A. nidulans, A. niger [22]. Bảng 1. 1: Các loài nấm được dùng trong chuyển gen thông qua Agrobacterium [9] Ngành Phân ngành Lớp Bộ Họ Loài Myxomycota Eumycota Mastigomycoina Zygomycotina Ascomycotina Ascomycetes Eurotiales Eurotiaceae Aspergillus nidulans Sphaeriales Sordariaceae Neurospora crassa Basidiomycotina Homobasidiomycetes Agaricales Agaricaceae Agaricus bisporus Tricholomataceae Pleurotus ostreatus Deuteromycotiana Deuteromycetes Hyphomycetes Aspergillus niger Aspergillus awamori Fusarium solani Fusarium graminearum Trichoderma reesei Coelomycetes Melanconiaceae Colletotrichuni gloeosporioides Chuyển gen vào nấm mốc gián tiếp thông qua A. tumefaciens gồm một số bước sau: i) trước hết gen cần chuyển phải được nối ghép với một vector tách dòng của A. tumefaciens; ii) gen mong muốn phải được nối ghép vào giữa biên phải và biên trái của vector tách dòng để lợi dụng cơ chế chuyển gen của loài vi khuẩn này; iii) vector tái tổ hợp mang gen mong muốn phải được biến nạp vào tế bào A. tumefaciens có mang các vùng gen độc trong DNA của chúng, các gen độc sẽ cảm ứng vi khuẩn chuyển gen quan tâm sang tế bào chủ khi có mặt các chất cảm ứng; iv) chủng vi khuẩn chuyển gen sẽ được tiến hành nuôi nhiễm với bào tử nấm A. niger trong môi trường có bổ sung chất cảm ứng AS; v) nấm chuyển gen được chọn lọc và phân biệt với nấm không được chuyển gen dựa trên đặc tính của đoạn DNA được chuyển vào nấm hoặc dựa trên sự biểu hiện của gen được chuyển. Nấm chuyển gen tiếp tục được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc để làm ổn định nguồn gen [11, 22]. Như vậy, phương pháp chuyển gen vào nấm mốc thông qua Agrobacterium không khác nhiều so với phương pháp chuyển gen vào thực vật. Đó là chúng đều cần một sinh vật chuyển gen gián tiếp, một Ti plasmid tái tổ hợp đã ghép nối đoạn gen mong muốn, và đều phải có mặt chất cảm ứng… Tuy nhiên, với nấm mốc, quá trình chuyển T- DNA nhờ Agrobacterium được thực hiện thông qua quá trình nuôi chung (nuôi nhiễm) trên một giá thể đặc biệt là các màng lọc để thuận lợi cho việc chuyển màng sang môi trường chọn lọc thể chuyển gen [9]. 1.2.3.2. Thuận lợi và khó khăn * Thuận lợi Chuyển gen vào nấm mốc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens có nhiều ưu điểm và thuận lợi so với các các phương pháp truyền thống ví dụ: xung điện, PEG, bởi các lý do sau: Nguyên liệu từ nấm để nuôi nhiễm cùng với A. tumefaciens vô cùng đa dạng. Chúng có thể là bào tử, là thể nguyên sinh, hạt cầu, thể sợi nấm hay bào tử nảy mầm và thậm chí cả cặn tế bào [9, 11, 16]. Nhờ ưu điểm này đã loại bỏ được những trở ngại khi tái sinh thể nguyên sinh khi sử dụng kỹ thuật PEG. Phương pháp chuyển gen truyền thống vào Mucor dựa trên phương pháp PEG đòi hỏi phải có thể nguyên sinh hình thành từ khuẩn ty. Mặc dù hiệu suất chuyển gen cao, nhưng trên thực tế, phương pháp này đòi hỏi một lượng lớn enzyme để chuẩn bị thể nguyên sinh [18]. Hơn nữa, hiệu suất tái sinh thể nguyên sinh thường gặp nhiều khó khăn và ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố chẳng hạn như điều kiện sinh trưởng của bào tử nảy mầm (thành phần môi trường, thời gian nuôi cấy). Ngoài ra, phương pháp chuyển gen nhờ thể nguyên sinh phải không những đòi hỏi phải tối ứu đối với các enzyme dùng để chuẩn bị thể nguyên sinh [11] mà còn tốn thời gian và tiền của [17]. Tần suất chuyển gen cao: Hầu hết chuyển gen vào nấm thông qua Agrobacterium có tần suất cao hơn so với các phương pháp truyền thống [9, 11, 16]. Chuyển gen vào A. awamori thông qua Agrobacterium có hiệu suất cao gấp 400 lần so với các phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng PEG [9]; Với vật chủ là Colletotrichum gloeosporioides, hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacteium cao gấp 5 – 10 so với chuyển gen nhờ tế bào trần; Với một số vật chủ khác, chẳng hạn như Neurospora crassa, Trichoderma reesei, hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacterium tương tự với hiệu suất chuyển gen nhờ tế bào trần đã được tối ưu [9]. Tương tự, chuyển gen vào A. fumigatus thông qua vi khuẩn Agrobacterium, hiệu suất chuyển gen cao gấp 2 lần so với chuyển gen nhờ các hạt cầu [16]. Chuyển được những đoạn DNA có kích thước lớn. So với các phương pháp cũ chuyển gen vào tế bào trần chỉ có thể chuyển được những đoạn DNA có kích thước khoảng 40 kb, đoạn DNA ngoại lai nhỏ nhất có thể chuyển vào tế bào thực vật nhờ A. tumefaciens có thể lên đến 150 kb [9]. Các thể chuyển gen nhờ Agrobacterium thu được đều có copy duy nhất, và gen được chuyển hòa nhập một cách ngẫu nhiên vào genome của tế bào chủ [11, 16]. Phương pháp chuyển gen vào nấm mốc thông Agrobacterium là phương pháp nền tảng trong sản xuất thực phẩm bởi các chủng nấm mốc không chứa các yếu tố kháng kháng sinh vi khuẩn [9]. Ngoài ra, chuyển gen nhờ Agrobacterium là phương pháp thuận lợi để nghiên cứu chức năng của gen, nghiên cứu tạo gen đột biến [11, 29]. * Khó khăn Bên cạnh những thuận lợi trên, chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens cũng có bất lợi đó là không thích hợp để tạo ra chủng vi sinh vật nhằm thu lượng lớn sản phẩm protien do chỉ hòa nhập một sao duy nhất T – DNA trong khi cần nhiều bản sao để biểu hiện ra sản phẩm của gen. Tuy nhiên, nhược điểm này có thể khắc phục dễ dàng nhờ chuyển lượng lớn phân tử T – DNA có mang gen mong muốn hoặc thay đổi điều kiện khi nuôi nhiễm hoặc thay đổi gen chọn lọc [11]. Như vậy, rõ ràng hệ thống chuyển gen nhờ Agrobacterium là một hệ thống chuyển gen hiệu quả, đơn giản và là một công cụ hữu ích để chuyển gen vào nấm mốc [9, 11, 12, 16]. 1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen vào nấm mốc thông qua Agrobacterium Chuyển gen vào nấm thông qua A. tumefaciens là phương pháp được áp dụng phổ biến bởi tính ổn định, đơn giản và hiệu suất cao [13, 16]. Tuy nhiên, hiệu suất chuyển gen vào nấm thông qua Agrobacterium cũng khác nhau khi sử dụng các loài nấm khác nhau. Do đó, để hiệu suất chuyển gen đạt được cao nhất, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen cần được tối ưu hóa [18]. Nguyên liệu nấm Một trong những thuận lợi của phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium là nguyên liệu ban đầu dùng cho chuyển gen gen rất đa dạng. Nguyên liệu để nuôi chung với A. tumefaciens có thể là bào tử, thể nguyên sinh, thể sợi nấm… đều có thể chuyển gen thành công và hiệu suất chuyển gen ở các trường hợp này là ngang nhau. Trong khi một số loài nấm lại yêu cầu các nguyên liệu rất cụ thể. Một số loài thuộc zygomycetes chẳng hạn như Rhizopus oryzae, Mucor circinelloides, chỉ xuất hiện thể chuyển gen nếu nguyên liệu ban đầu là thể nguyên sinh; với loài Coccidioides immitis chuyển gen chỉ có thể sử dụng bào tử mầm; hiệu suất chuyển gen ở Agaricus bisporus khi dùng bào tử mầm làm nguyên liệu ban đầu sẽ cao hơn so với dùng thể sợi nấm [12]. Một nhân tố khác ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen vào nấm là thời gian bảo quản bào tử nấm. Nguyên liệu được bảo quản trong thời gian dài sẽ giảm hiệu quả chuyển gen trong quá trình nuôi nhiễm hoặc giảm tỷ lệ nảy mầm của bào tử so với nguyên liệu mới [12]. Agrobacterium và tế bào chủ Chủng giống sử dụng cho cho chuyển gen thông qua Agrobacterium cũng rất đa dạng, ví dụ: LBA 4404, EHA 105, LBA 1100. Hiệu suất chuyển gen khi sử dụng các chủng trên là như nhau nên thật khó để kết luận được sử dụng chủng nào là tốt nhất. Mỗi chủng nấm mang lại hiệu quả khác nhau với tế bào chủ khác nhau. Ngoài ra, với cùng một hiệu suất chuyển gen cũng rất đa dạng khi chuyển gen vào nấm được phân lập theo những cách khác nhau. Bởi vậy, không thể đưa ra kết luận chủng Agrobacterium nào thích hợp để chuyển gen vào nấm [12]. Nồng độ chất cảm ứng Trong hầu hết các nghiên cứu, AS được bổ sung trong giai đoạn nuôi nhiễm bởi đây là hợp chất cảm ứng gen vir cần thiết cho việc chuyển T – DNA. Nhưng trong quá trình nuôi cấy Agrobacterium không cần thiết bổ sung AS, nhiều trường hợp còn dẫn đến giảm hiệu suất biến nạp, chẳng hạn như đối với vật chủ là Fusarium oxysporum, Magnaporthe grisea [11, 12]. Tỷ lệ nuôi nhiễm Yếu tố ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chuyển gen là tỷ lệ nuôi nhiễm giữa vi khuẩn Agrobacterium và nấm mốc. Cần xác định tỷ lệ thích hợp cho mỗi chủng nấm [11]. Tăng tế bào Agrobacterium hoặc nấm có thể làm tăng hiệu suất chuyển gen. Tuy nhiên, cả hai yếu tố trên đều phải có những giới hạn nồng độ nhất định. Nếu bổ sung quá nhiều A. tumefaciens, hiệu suất chuyển gen có thể giảm do cạnh tranh dinh dưỡng và mật độ vi khuẩn quá dày, hơn nữa sẽ gặp khó khăn trong việc giết chết Agrobacterium khi chuyển sang môi trường chọn lọc thể nấm chuyển gen. Ngược lại, quá nhiều bào tử nấm, việc phân lập từng tế bào sau quá trình nuôi nhiễm sẽ gặp nhiều khó khăn [12]. Do vậy, quá trình nuôi nhiễm có thể thử nghiệm nhiều tỷ lệ khác nhau để chọn được tỷ lệ phù hợp sao cho hiệu suất cao nhất [11]. Điều kiện cùng nuôi nhiễm Điều kiện cùng nuôi nhiễm là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen. Điều kiện nuôi nhiễm nấm và Agrobacterium bao gồm thời gian, nhiệt độ và màng lọc. Nhiệt độ nuôi nhiễm có thể từ 22° – 37°C, song nhiệt độ tối ưu cho quá trình nuôi nhiễm từ 22° – 25°C, trong thời gian từ 2 – 3 ngày. Ngoài ra, nhiều loại màng lọc khác nhau như cellulose, nitrocellulose, Hybond N+ cũng sẽ cho hiệu suất chuyển gen khác nhau [11, 12]. Ngoài các yếu tố trên, còn một số các yếu khác cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen chẳng hạn như nồng độ chất kháng sinh, hoặc cũng có thể do Quy trình chuyển gen không phù hợp với tế bào chủ. Do vậy, để đạt hiệu suất chuyển gen cao nhất, điều kiện chuyển gen cần phải được tối ưu [12]. Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu 2.1.1. Nguyên liệu Vector và chủng giống Vector tách dòng pJET1.2/Blunt của hãng Fermentas; Vector pBluescript II KS (–) của hãng Stratagene; Vector biểu hiện Vector pCAMBIA1300. Các vector này được lưu giữ tại Phòng công nghệ ADN ứng dụng – Viện Công nghệ sinh học. Vector biểu hiện pAN7.1 – GluA do Phòng Công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ sinh học cung cấp. Các chủng vi sinh vật: Agrobacterium tumefaciens CV58C1 – pGV2260 của hãng Clontech (Mỹ); E. coli DH5α và E. coli DH10b của hãng Gibco BRL Life Technology (Mỹ). Các chủng giống này được lưu giữ tại Phòng Công nghệ ADN ứng dụng – Viện Công nghệ sinh học. A. niger VTCC – F – 017; gen mã hóa xylanase phân lập từ A. niger do Phòng công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ sinh học cung cấp. Các cặp mồi dùng trong PCR: Cặp mồi đặc hiệu cho hph: hph1: 5’ – TTC GAT GTA GGA GGG CGT GGA T – 3’ hph2: 5’ – CGC GTC TGC TGC TCC ATA CAA G – 3’ Mồi đặc hiệu cho xylB: XylBF: 5’ – GAA GGA TCC GAA TAT GCT CAC CAA G – 3’ XylBR: 5’ – TCA GCA GGA TCC TAC TGA ACA GTG – 3’ SeqXylF: 5’ – TCCGAAGTAGGTAGAGCGAGTA – 3’ 1 2.1.2. Hóa chất Enzyme giới hạn: Sma I, Hind III, Eco RI, Eco RV, Bgl II, Not I, Nco I, Kpn I của hãng Fermentas và Biolab. Các hoá chất dùng cho kỹ thuật PCR (đệm, MgCl2, dNTPs, enzyme Taq polymerase); Kit tinh sạch sản phẩm PCR GeneJETTM Gel Extraction Ki; Kit tinh sạch DNA plasmid Wizard®SV của hãng Promega (Mỹ). Kit tách dòng CloneJETTM PCR Cloning Kit của hãng Fermentas. Các hoá chất dùng để tách DNA tổng số, DNA plasmid của các hãng Amersham Bioscience (Anh), Sigma (Mỹ), Merck (Đức). Các chất kháng sinh: ampicillin; kanamycin; rifamycin; cefotaxim; hygromycin B Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Bảng 2. 1: Môi trường nuôi cấy các chủng vi sinh vật Môi trường/1l LB YEB SOC LC IM Cao nấm men 5 g 10 g 5 g 5 g - Tripton 10 g - 20 g 10 g - Pepton - 10 g - - - NaCl 10 g 5 g 10 mM 8 g - Agar 15 g 15 g - 15 g 15 g Hóa chất khác - Saccharose: 5 g MgSO4.7H2O: 2 mM KCl: 2,5 mM MgSO4:10 mM MgCl2: 10 mM Glucose: 20 mM - 0, 8 ml K2HPO4 1,25 M, pH: 4,8 20 ml MN* buffer (30 gMgSO4. 7H2O; 15 g NaCl) 1 ml CaCl2. 2 H2O 1% 10 ml FeSO4 0,01% 5 ml các nguyên tố vi lượng** 2,5 ml NH4NO3 20% 10 ml Glycerol 50% 40 ml MES 1 M, pH: 5,5 5 ml glucose 20% * MN buffer: 30 g MgSO4. 7H2O; 15 g NaCl, 1 l H2O ** Các nguyên tố vi lượng: 100 mg ZnSO4. 7H2O; 100 mg H3BO3; 100 mg MnSO4. H2O; 100 mg CuSO4. 5H2O; 100 mg Na2MoO4. 2H2O; bổ sung H2O đến 100 ml, khử trùng. 2.1.3. Thiết bị Tủ lạnh sâu –20°C, –70°C (Sanyo, Nhật Bản); Lò vi sóng (Samsung, Hàn Quốc); Pipetman các loại (Gilson, Pháp); Cân phân tích (Mettler Toledo 10–4g, Thụy Sĩ); Máy đo pH (Mettler, Thụy Sĩ); Máy ly tâm lạnh cao tốc; Máy ly tâm Eppendorf (Eppendorf 5415C, Đức); Máy PCR (MJ Research, Inc., Mỹ); Máy soi DNA (Minitransilluminator BioRad, Mỹ); Máy điện di (PowerPac 300, BioRad, Mỹ); Box cấy; Bể ổn nhiệt; Nồi khử trùng. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Các phương pháp sử dụng để nối ghép gen * Chuẩn bị vector và gen mong muốn cho phản ứng nối ghép gen – Tinh chế đoạn gen và vector: Để nối ghép gen vào một vector, trước hết chúng phải được với cùng một enzyme cắt giới hạn để tạo đầu cắt tương ứng cho phản ứng nối ghép gen. Ngoài ra, để phản ứng đạt hiệu suất cao cần tinh chế đoạn gen hoặc vector trước khi tiến hành lai. Phản ứng cắt lượng lớn để thôi gel và tinh sạch đoạn gen và vector quan tâm như sau: Thành phần phản ứng cắt: H2O: 48 µl Buffer: 10 µl Vector/plasmid: 40 µl Enzyme cắt giới hạn: 2 µl Tổng thể tích: 100 µl Ủ 37° – 2 giờ – Khử phosphate đối với vector Nguyên tắc: DNA plasmid sau khi cắt bằng enzyme hạn chế được loại nhóm phosphat ở đầu 5' nhờ enzyme phosphatase kiềm được tách từ ruột bê (CIP = Calf Intestinal Alkaline Phosphatase). Mục đích nhằm tránh hiện tượng đóng vòng trở lại của vector. Phương pháp: DNA plasmid (10 – 20 mg) được ủ với enzyme giới hạn trong 1 giờ. Lấy khoảng 0,3 mg điện di trên gel agarose 0,8% cùng với chỉ thị phân tử là DNA plasmid chưa xử lý bằng enzyme. Nếu như quá trình cắt chưa hoàn toàn, bổ sung thêm enzyme giới hạn và ủ tiếp. Khi DNA đã được cắt hoàn toàn, chiết mẫu với phenol : chloroform và tủa DNA bằng hai thể tích ethanol trong 15 phút ở 0°C. Ly tâm thu DNA ở 4°C, 12000 vòng/phút (v/p) trong 10 phút. Hoà cặn trong 90 ml 10 mM Tris.Cl (pH 8,3). Lấy khoảng 200 ng DNA điện di kiểm tra. Mẫu còn lại được giữ ở – 20°C. Thêm 10 ml dung dịch đệm dùng cho CIP và một lượng enzyme thích hợp, ủ ở điều kiện tương ứng. Chú ý: Lượng enzyme cần dùng và điều kiện ủ phụ thuộc vào đoạn cắt DNA mang đầu dính hay đầu bằng. Bảng 2. 1: Điều kiện khử photphat của các loại đầu dính Lượng enzyme Điều kiện ủ Đầu dính 5' 1 unit / 100 pmoles* ở 37°C trong 30 phút Đầu bằng 1 unit / 2 pmoles ở 37°C trong 15 phút. Sau đó thêm một lượng enzyme và tiếp tục ủ ở 55°C trong 45 phút. * 2 mg DNA mạch thẳng dài 5 kb khoản 1,4 pmoles. Sau khi ủ, thêm vào mẫu SDS và EDTA (pH 8,0) đến nồng độ cuối cùng tương ứng là 0,5 % và 5 mM. Trộn đều và thêm proteinase K 100 mg/ml. Ủ 30 phút ở 56°C. Proteinase K dùng để hoà tan CIP nhằm loại bỏ chúng hoàn toàn giúp cho quá trình gắn gen vào vector có hiệu quả. CIP cũng có thể bị làm bất hoạt bằng cách ủ 1 giờ ở 65°C hoặc 75°C trong 10 phút cùng với 5 mM EDTA (pH 8,0). Sau đó làm nguội phản ứng ở nhiệt độ phòng. Chiết DNA một lần bằng phenol, một lần bằng phenol : chloroform. Bổ sung Na – acetate 3M, pH 7,0 (nếu pH = 5,2 như thông thường thì EDTA trong dung dịch sẽ bị kết tủa khi nồng độ > 5 – 10 mM) theo tỷ lệ thể tích 1: 10. Trộn đều và thêm 2 lần thể tích ethanol 100%. Đảo đầu ống Eppendorf vài lần. Giữ ở 0°C trong 15 phút. Ly tâm 12000 v/p, 10 phút, 4°C để thu DNA. Rửa cặn bằng ethanol 70%, ở 4°C. Làm khô DNA và hoà trong TE (pH 7,6) và bảo quản ở – 20°C. Phản ứng khử phosphate được tiến hành như sau: H2O: 29 µl Buffer CIAP: 5 µl CIAP: 1 µl Vector: 15 µl Tổng thể tích: 50 µl Ủ 37° – 1giờ và dừng phản ứng ở 65° – 15 phút * Tinh chế các đoạn DNA và vector tách dòng trên gel agarose Để chuẩn bị nguyên liệu cho các phản ứng ghép nối gen với vector, ngoài các vector có sẵn trong các bộ Kit tách dòng như pJET1.2, pBluescript II KS(-), trong nội dung nghiên cứu này vector biểu hiện, vector tách dòng trung gian, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel 0,8 % agarose, sau đó cắt phần gel có băng DNA mong muốn và thu lại DNA bằng Kit tinh sạch Wizard®SV. Quy trình tinh sạch DNA gồm các bước sau: Làm tan gel Sau khi điện di xong, cắt phần gel chứa băng DNA tương ứng gel và chuyển vào ống Eppendorf, xác định lượng gel đã cắt được. Bổ sung dung dịch gắn màng với tỉ lệ 10 µl dung dịch/10 mg gel. Vortex và ủ ở 50 - 65˚C cho đến khi gel tan hoàn toàn. Gắn DNA Đưa cột SV vào ống Collection (cột tinh sạch). Chuyển hỗn hợp gel đã tan vào cột tinh sạch, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, bỏ phần dịch ở cột Collection. Rửa màng Bổ sung 700 µl dung dịch rửa màng (đã bổ sung cồn). Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, loại bỏ phần dịch phía ở ống phía dưới cột Collection. Rửa lại 1 lần bằng cách bổ sung tiếp 500 µl dung dịch rửa, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút. Loại bỏ phần dịch ở ống phía dưới cột Collection. Ly tâm tiếp cột 12000 v/p trong 1 phút, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút để bay hơi hết lượng cồn còn lại. Thu DNA Nhẹ nhàng chuyển cột SV sang 1 ống Eppendorf 1,5 ml sạch. Bổ sung 50 µl nước không có nuclease, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, ly tâm 12000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ cột SV và giữ DNA ở 4˚C hoặc -20˚C. Kiểm tra nồng độ DNA bằng cách điện di trên gel 0,8 % agarose. * Phản ứng ghép nối Phản ứng nối ghép ở đây được thực hiện theo Kit tách dòng CloneJETTM PCR Cloning Kit của hãng Fermentas. Đây là phương pháp được thiết kế đặc biệt để tách dòng gen mong muốn (hoặc sản phẩm PCR nói chung) được nhân lên bằng enzyme Taq DNA polymerase hoặc đã được cắt bằng enzyme giới hạn có vị trí nhận biết điểm cắt tương ứng. Quy trình nối ghép gen: Vetor và đoạn DNA ngoại lai sau khi được xử lý bằng enzyme giới hạn, tinh chế và được tiến hành nối ghép theo phản ứng như sau: H2O: 5µl T4 ligase buffer : 2µl Vector: 2µl T4 DNA ligase: 2µl Sản phẩm cắt enzyme: 9µl Tổng thể tích: 20µl Hỗn hợp phản ứng được trộn nhẹ nhàng và ủ ở 0° – 18°C trong 16 giờ. - Phương pháp ghép nối các đoạn DNA vào vector: các đoạn gen và vector sau khi được xử lý bằng enzyme giới hạn phù hợp sẽ được ghép nối với nhau nhờ enzyme T4 ligase, phản ứng thực hiện ở 14˚C trong 12 giờ. Đặc biệt trong nội dung nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng tính chất đặc biệt của 2 loại enzym giới hạn Bam HI (GGATCC) và Bgl II (AGATCT) có 4 điểm nhận biết ở giữa giống nhau, tạo ra đầu dính giống nhau là GATC. Nhờ vào đặc điểm này mà người ta có thể tiến hành ghép nối đoạn DNA được cắt bằng Bam HI với đoạn DNA được cắt bằng Bgl II, khi đó trong phân tử DNA lai điểm cắt của hai enzyme này bị thay đổi. 2.2.2. Biến nạp vào tế bào E. coli và A. tumefaciens * Biến nạp vào tế bào E. coli Nguyên tắc: Màng tế bào vi khuẩn dưới tác động của hoá chất hoặc điện trường sẽ bị thay đổi trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ khiến cho các phân tử DNA có thể chui vào. Sau đó, các tế bào được phục hồi lại trên môi trường nuôi cấy và các thể biến nạp sẽ được phát hiện trên môi trường chọn lọc. Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến E. coli H10b hoặc E. coli DH5α: Nhặt một khuẩn lạc cấy ria lên đĩa LB đặc, ủ ở 37°C qua đêm. Nhặt 1 khuẩn lạc trên đĩa ủ qua đêm và nuôi trong 2 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc 37°C qua đêm. Chuyển 300 µl dịch nuôi cấy sang 30 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc 37°C trong 3 giờ. Chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm đã được làm lạnh trên đá, ly tâm 5000 v/p, 4°C trong 10 phút để thu cặn. Hòa tan cặn nhẹ nhàng (có thể dùng đầu côn để làm tan tế bào) trong 0.7 đến 1.5 ml dung dịch CaCl2 (tùy theo lượng tế bào nhiều hay ít), ly tâm 5.000 v/p, 4°C, 10 phút để thu cặn. Tiếp tục lặp lại bước trên 1–2 lần. Bổ sung glycerol 60% theo tỷ lệ 1 : 2 so với lượng CaCl2 dùng để rửa, dùng pipet trộn đều nhẹ nhàng. Hút 80 µl – 100 µl vào ống Eppendorf 1.5 ml đã được giữ lạnh trên đá và cất ngay trên đá hoặc bảo quản ở tủ –80°C. Tế bào khả biến có thể dùng ngay hoặc để trên bình đá hay cất vào tủ lạnh dùng trong 3 ngày hoặc làm lạnh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở –80°. Quy trình biến nạp: Đặt tế bào khả biến E. coli DH10b hoặc E.coli DH5α vào đá khoảng 30 phút nếu tế bào khả biến cất giữ ở – 80°C. Bổ sung 5ml sản phẩm của phản ứng ghép nối ở trên vào mỗi ống tế bào E. coli DH10b hoặc E. coli DH5α, đảo nhẹ và ủ trong đá 15 phút. Sốc nhiệt ở 42°C trong 70 giây, đặt ngay vào đá 5 phút. Bổ sung 300 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc 37°C trong 1 giờ. Cấy trải toàn bộ dịch nuôi ra đĩa LB đặc có bổ sung ampicillin hoặc kanamycin (50mg/ml). Nuôi ở 37°C qua đêm, chọn các khuẩn lạc. * Phương pháp biến nạp vào tế bào A. tumefaciens Chuẩn bị tế bào khả biến A. tumefaciens Làm mới giống trên môi trường thạch YEB có bổ sung kháng sinh thích hợp. Nuôi cấy lắc vi khuẩn trong 2 ml môi trường LB ở 28°C, 6 – 8 giờ. Lấy 1 ml dịch vi khuẩn trên nuôi cấy tiếp ở 28°C qua đêm trên 100 ml môi trường LB lỏng + 0,1% glucose đến khi OD660nm đạt 1– 1,5. Làm lạnh mẫu trong đá 15 phút, ly tâm 5000 v/p, 20 phút để thu cặn tế bào Rửa cặn 3 lần trong 10 ml 1 mM HEPES (N–2–hydroxyethylpiperazine–N’–2–ethanesulfonic acid) pH 7,0; 1 lần trong 10 ml 10% glycerol. Cặn hòa lại trong 500 – 700 ml 10% glycerol. Chia 100 ml dịch tế bào vào mỗi ống Eppendorf, làm lạnh trong nitơ lỏng và bảo quản ở – 80°C. Quy trình biến nạp vào A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện Vector được đưa qua cột thôi gel để tinh sạch, nồng độ sau khi qua cột tinh sạch là 40 – 50 ng/µl. Làm tan tế bào khả biến (TBKB) trên đá 30 phút. Thêm 5 – 10 µl sản phẩm DNA ngoại lai. Để trên đá 10 phút, cuvet được ngâm cồn, chiếu đèn tím khử trùng rồi làm lạnh trong đá 5 phút, sau đó bổ sung dịch TBKB vào trong cuvet. Xung điện ở 25F, 2,5kV, 400Ω. Bổ sung 800 µl SOC vào cuvet, chia ra 3 ống Eppendorf, lắc ở 28°C trong 2 giờ. Trải đĩa với lượng lần lượt là 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl lên đĩa môi trường đặc YEB có bổ sung rifamycin, kanamycin, ampicillin và nuôi ở 28°C trong 2 ngày. Nhặt nuôi một số khuẩn lạc trong 5 ml – 7 ml YEB bổ sung kháng sinh thích hợp. 2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose Nguyên tắc: Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm, nên dưới tác động của dòng điện một chiều các đoạn DNA có khối lượng và kích thước khác nhau sẽ di chuyển trong điện trường từ cực âm sang cực dương. Quy trình: Agarose 0,8% được đun sôi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50° – 60°C, đổ dung dịch agarose vào khay gel đã cài sẵn răng lược thích hợp. Sau khoảng 30 phút, khi gel đã đông cứng, tháo lược, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel khoảng 2 mm. Tra mẫu: Mẫu DNA trộn cùng với đệm tra mẫu theo tỷ lệ thích hợp, tra mẫu vào các giếng trên bản gel. Tiến hành điện di với dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 100V, cường độ dòng điện 60 – 80 mA, quan sát sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue để ngừng vào thời gian phù hợp (thường sau khoảng 30 phút). Nhuộm DNA bằng EtBr: Bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr (nồng độ 10 mg/ml) trong thời gian 20 phút trên máy lắc nhẹ. Sau đó rửa sạch bản gel bằng nước cất. Quan sát và chụp ảnh: Gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại. Quan sát thấy DNA hiện lên dưới dạng các vạch sáng. Ảnh điện di được chụp trên máy Bio – Rad với tia UV có bước sóng 320 nm. 2.2.4. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR Phản ứng chuỗi polymerase do Mullis và cộng sự sáng chế ra năm đầu những năm 80 của thế 19. Kỹ thuật này cho phép nhân nhanh số lượng không hạn chế nguyên bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen của cơ thể sinh vật. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt, ví dụ Taq DNA polymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp trong ống nghiệm các đoạn DNA mới từ mạch khuôn trong môi trường có dư các dNTP và cặp mồi đặc hiệu. Một chu kỳ PCR bao gồm ba bước được lặp lại nhiều lần [25]: Biến tính DNA từ dạng sợi kép sang dạng sợi đơn bằng cách nâng cao nhiệt độ lên 94° – 95°C trong thời gian ngắn. Tiếp hợp đoạn mồi (primer) thông qua hạ nhiệt độ xuống 50° – 60°C. Hai đoạn mới là các oligonucleotide dài khoảng 15 – 30 base sẽ tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung với đoạn DNA tương đồng ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân. Enzyme polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi. Để tránh hiện tượng tiếp hợp không đặc hiệu, phản ứng tiếp hợp được thực hiện ở 72°C. Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng từ 1X đoạn DNA cần nhân sẽ có 2X đoạn được tổng hợp, sau n chu kỳ sẽ có 2n bản sao đoạn DNA mong muốn, chiều dài thực tế của đoạn DNA được nhân bản bằng đúng khoảng cách giữa hai đầu xuất phát của hai đoạn mồi. PCR bao gồm các thành phần sau đây: Một đoạn DNA khuôn. Một cặp mồi đặc hiệu có chiều dài 15 nucleotide – 30 nucleotide. Bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt. Phản ứng kết thúc, điện di kiểm tra 8 μl sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%. Thành phần phản ứng chạy PCR: dNTPs (10 mM) : 1ml Buffer (10 X) : 2.5ml Primer F (10 µM): 1ml Primer R (10 µM): 1ml Taq (5 U/ul): 0.2ml H2O: 18.3ml DNA plasmid: 2ml Tổng thể tích: 25 ml Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR của gen mã hóa xylanase và hph: 94°C 92°C 60°C 72°C 72°C 4°C 5 phút 43 giây 1 phút 1 phút 25chu kỳ 10 phút 2.2.5. Phương pháp tách chiết DNA plasmid lượng nhỏ Tế bào chứa plasmid cần tách chiết sẽ được nuôi cấy và để nhân lên đến giai đoạn cuối pha log. Tế bào sau đó được phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy rửa mạnh có trong dung dịch I và dung dịch II. DNA nhiễm sắc thể và protein trong tế bào được loại ra nhờ dung dịch III. DNA plasmid được kết tủa bằng cồn và thu lại nhờ ly tâm với tốc độ 12000 v/p. * Quy trình tách DNA plasmid từ E. coli Cấy một khuẩn lạc vào ống penicillin đã bổ sung 2 ml môi trường LB lỏng chứa kháng sinh thích hợp. Nuôi qua đêm ở 37°C trong điều kiện lắc 200 v/p. Lưu ý: Thể tích ống penicillin phải lớn gấp 4 lần thể tích nuôi cấy. Các ống phải đậy nắp không chặt quá. Dịch nuôi phải được nuôi cấy trong điều kiện lắc nhẹ. Chuyển 1,5 ml dịch nuôi sang ống Eppendorf. Ly tâm ở 11000 v/p ở 4°C trong 30 giây. Loại bỏ dịch môi trường để thu cặn tế bào. Lưu giữ những dịch nuôi cấy chưa sử dụng hết ở 4°C. Làm tan cặn tế bào trong 100 ml dung dịch Sol I (giữ trong đá) bằng máy vortex. Bổ sung 200 ml dung dịch Sol II (mới pha) vào mỗi Eppendorf. Đậy nắp chặt, đảo ngược Eppendorf vài lần và giữ trên đá trong 1 phút. Không được vortex. Bổ sung 150 ml dung dịch Sol III. Đậy nắp chặt, đảo ngược Eppendorf vài lần và giữ ở 0°C trong 3 – 5 phút. Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 4°C và hút chuyển dịch sang ống mới. Bổ sung một thể tích tương đương phenol : chloroform. Đảo lẫn hai pha bằng cách vortex và ly tâm ở 12000 v/p trong 2 phút ở 4°C. Hút chuyển pha trên sang ống mới. Tủa nucleic acid bằng cách bổ sung 2 lần thể tích ethanol 98%. Trộn đều bằng vortex và giữ ở – 20°C trong 3 giờ. Thu tủa bằng cách ly tâm 12000 v/p trong 20 phút ở 4°C. Loại sạch ethanol và bổ sung 1 ml ethanol 70%. Ly tâm thu tủa 12000 v/p trong 8 phút ở 4°C. Làm khô tủa bằng máy SpeedVac trong 5 phút hoặc để mở nắp trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Hoà tan DNA trong 50 ml H2O khử in vô trùng (hoặc 50 ml TE pH 8) chứa 20 mg/ml RNase. Kiểm tra DNA trên gel agarose 0,8 % và giữ mẫu ở – 20°C. * Quy trình tách DNA plasmid từ Agrobacterium Ly tâm 6000 v/p trong 5 phút để thu tủa tế bào. Bổ sung 10% lyzozyme vào dịch Sol I, bổ sung 150 µl Sol I vào 1 ống ppendorf, đánh tan. Bổ sung 150 µl Sol I, lắc đều + 150 µl Sol III, đảo đều, bổ sung 1 µl RNAse 1 mM/µl, ủ 37oC trong 1h, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút, thu dịch. Bổ sung 1ml EtOH 100%, ủ 3h, sau đó ly tâm 12000 v/p trong 15 phút, thu tủa, bổ sung 30 µl H2O. Điện di 8 µl để kiểm tra DNA plasmid bằng agarose 0.8% 2.2.6. Phân tích DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn Để xác định chính xác DNA ngoại lai đã được chèn vào vector mong muốn, DNA plasmid mang gen tái tổ hợp đã lựa chọn được cắt bằng enzyme giới hạn để kiểm tra. Enzyme hạn chế là một nuclease nội bào có khả năng nhận biết các đoạn DNA với các trình tự nucleotide nhất định, bám vào đoạn DNA đó và cắt cả hai sợi của phân tử DNA. Các enzyme hạn chế thường được sử dụng để cắt DNA: (i) Tạo đầu bằng, như Sma I, Eco RV cắt hai sợi DNA tại cùng một điểm tạo hai đầu bằng không có khả năng tự bắt cặp trở lại; (ii) Tạo đầu dính, như Hind III, Bam HI cắt theo vị trí lệch nhau trên hai sợi tạo các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại. Sau khi đã tách dòng thành công bằng các vector tách dòng, DNA plasmid thu được từ tách chiết plasmid tái tổ hợp cần kiểm tra lại trình tự đoạn gen được nhân bằng kỹ thuật cắt enzyme giới hạn. Enzyme giới hạn được sử dụng để cắt kiểm tra bao gồm: Eco RI và Kpn I, Sma I, Hind III, Bgl II, Nco I, Not I. Các dung dịch đệm thích hợp cho từng loại enzyme như sau: Eco RI Dung dịch đệm Eco RI Sma I Dung dịch đệm Tango Hind III Dung dịch đệm R Kpn I Dung dịch đệm Kpn I Bgl II Dung dịch đệm Tango Nco I Dung dịch đệm Tango Not I Dung dịch đệm Tango Phản ứng cắt được tiến hành với thành phần: H2O: 5.8 µl Buffer: 1.0 µl DNA plasmid: 3.0 µl Enzyme cắt: 0.2 µl Tổng thể tích: 10 µl Hỗn hợp phản ứng được trộn nhẹ nhàng và ủ ở 37°C trong 1, 5 giờ và kiểm tra kết quả bằng điện di agarose 0,8%. 2.2.7. Xác định trình tự gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng * Nguyên tắc chung Trình tự đoạn nucleotide quan tâm được xác định dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger: tạo ra các đoạn DNA một sợi hơn kém nhau một nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để xác định trình tự như dNTP, ddNTPs, DNA polymerase …Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR hoặc DNA plasmid tinh sạch) và mồi phù hợp. Phản ứng được thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã được đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen để đọc trình tự bao gồm: Mồi 3,2 pM, DNA plasmid 200 ng, BigDye và đệm tương ứng với tổng thể tích 15 µl. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR trong máy GenAmp® PCR System 9700 như sau: 96˚C - 1 phút; (96˚C - 10 giây; 50˚C - 5 giây; 60˚C - 4 phút) x 25 chu kỳ. Sau đó sản phẩn được giữ ở 4˚C. * Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp tủa EtOH/EDTA Bổ sung vào sản phẩm PCR 5 µl EDTA 125 mM, 60 µl EtOH 100% và để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Sau đó ly tâm 12000 v/p, 15 phút để tủa DNA có trong đó. Bỏ EtOH, rửa tủa bằng 60 µl EtOH 70%. Ly tâm 10000 v/p trong 10 phút. Làm khô tủa và bổ sung 10 µl Hi-DiTM Formamide để biến tính ở 95˚C trong 5 phút. Sau bước này, nguyên liệu được đưa vào máy đọc trình tự tự động ABI PRISMTM 3100 Genetic Analyzer. Các ống được điện di trong ống vi mao quản 80 cm x 50 µl. Kết quả được thu thập và xử lý bằng phần mềm ABI PRISMTM 3100 – Avant Data Collection v2.0 và DNA Sequencing Analysis 5.2. * Phân tích trình tự gen Kết quả giải trình tự gen được phân tích trên máy tính bằng các phần mềm Sequencing Analysis 5.2, Bioedit; Seqscape 2.5 và so sánh với trình tự của đoạn DNA với trình tự chuẩn. 2.2.8. Phương pháp nuôi nhiễm A. tumefaciens và A. niger * Chuẩn bị nấm sợi A. niger để thu bào tử Cấy ria từ ống giữ chủng A. niger trong glycerol ở – 80°C lên đĩa nuôi cấy có chứa môi trường PDA. Dịch còn lại giữ ở – 20°C. Ủ đĩa nuôi cấy ở 30°C trong 3 ngày, trong tối. Thu hoạch bào tử nấm: bổ sung 5 ml nước muối sinh lý vô trùng và dùng que trải gạt nhẹ nhàng lên bề mặt thạch để thu bào tử. Chuyển bào tử qua màng lọc vào ống falcon 15 ml và tiếp tục bổ sung thêm 5ml nước muối sinh lý. Ly tâm 10 phút, 8000 v/p, ở nhiệt độ phòng, bỏ dịch nổi và hòa tan cặn trong 1ml nước muối sinh lý. Xác định nồng độ bào tử và pha loãng đến nồng độ cuối cùng là 107 bào tử/ml bằng môi trường IM. * Chuẩn bị chủng A. tumefaciens A. tumefaciens mang Ti plasmid tái tổ hợp được cấy ria lên môi trường LC có bổ sung kháng sinh rifampicin 50 mg/ml để ngăn ngừa sự lây nhiễm các vi khuẩn khác và bổ sung đồng thời cả kanamycin 50 mg/ml để chọn lọc A. tumefaciens có mang Ti plasmid tái tổ hợp. Ủ đĩa ở 28°C trong 2 ngày Nhặt 2 khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy cho vào 20 ml môi trường LC đã bổ sung 50 mg/ml rifampicin và 50 mg/ml kanamycin, nuôi lắc ở 28°C, 250 v/p trong 24 giờ. Ly tâm dich nuôi cấy trong Eppendorf 1.5 ml trong 10 phút, 6000 v/p ở nhiệt độ phòng. Bỏ dịch nổi, thu cặn và tiếp tục rửa cặn bằng cách hòa tan cặn trong 250 µl dung dịch IM. Ly tâm 6000 v/p trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, bỏ dịch nổi. Hòa tan cặn trong 5 ml dung dịch IM có chứa 5µl AS nồng độ 0.2M Ủ dịch nuôi cấy ở 28°C từ 4 giờ – 5 giờ, lắc 100 v/p. Đo OD600nm và pha loãng ra nồng độ cuối cùng là 0.8 (4.108 – 5.108 vi khuẩn/ml). * Nuôi nhiễm A. tumefaciens và A. niger: Trộn 100 µl tế bào A. tumefaciens (OD600nm = 0.8) và 100 µl bào tử nấm (nồng độ = 107 bào tử/ml). Sử dụng kẹp vô trùng đặt màng lọc lên đĩa petri có chứa môi trường thạch IM đã bổ sung AS 0.2M. Dùng pipet hút 200 µl hỗn hợp bào tử nấm và vi khuẩn lên trên màng lọc và trải đều bằng que trải. Ủ đĩa ở 24°C trong 3 ngày. * Chọn lọc nấm chuyển gen: Dùng kẹp vô trùng chuyển màng lọc có hỗn hợp dịch nuôi cấy lên đĩa môi trường PDA đã bổ sung cefotaxim (50 mg/ml) và hygromycin (50 mg/ml) Ủ đĩa ở 30°C trong 3 ngày, trong tối cho đến khi xuất hiện bào tử. Nhặt khuẩn lạc sang môi trường chọn lọc để làm sạch và phân lập riêng rẽ từng bào tử. Giữ chủng và tiến hành các thí nghiệm kiểm tra cần thiết Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Gen mã hóa xylanase muốn được chuyển vào nấm mốc A. niger thông qua A. tumefaciens thì phải được gắn vào giữa hai vùng biên phải và trái (LB và RB) của T – DNA trên Ti plasmid. Để giải phóng T – DNA có đoạn DNA ngoại lai, A. tumefaciens được nuôi chung với bào tử nấm trong môi trường có bổ sung chất cảm ứng AS, cảm ứng gen vir để chuyển gen mong muốn sang tế bào chủ. Nấm mốc chuyển gen được chọn lọc dựa trên đặc tính của đoạn DNA ngoại lai hoặc biểu hiện ra sản phẩm protein. Thông thường, cơ thể chuyển gen được chọn lọc trên môi trường có bổ sung kháng sinh thích hợp [8]. Tiến hành khảo sát một số vector pCAMBIA1300, chúng tôi lựa chọn Ti plasmid vector pCB1300 vì vùng T – DNA của vector này có vị trí nhận biết của nhiều enzyme giới hạn phù hợp với chiến lược thiết kế vector đã đặt ra. Để tạo chủng Agrobacterium làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm, việc đầu tiên là thiết kế Ti plasmid vector biểu hiện, vector này được kí hiệu pCB_xylB_hph gen mã hóa xylanase (xylB) và gen kháng hygromycin B (hph). Vector tái tổ hợp Ti plasmid được kiểm tra bằng cắt enzyme giới hạn hoặc PCR hoặc giải trình tự gen trước khi chuyển vào Agrobacterium. Chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph được nuôi nhiễm với bào tử nấm A. niger. Nấm chuyển gen sẽ được tiếp tục chọn lọc trên môi trường có bổ sung chất kháng sinh thích hợp. Toàn bộ quy trình thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase trong nấm mốc được thể hiện chi tiết qua sơ đồ sau: 3.1. Thiết kế vector trung gian (pKS_xylB_hph) mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph 3.1.1. Lắp ghép xylB vào vector trung gian Để thiết kế vector trung gian pKS_xylB_hph, xylB và hph được lắp ghép vào vector trung gian pKS–. Tuy nhiên, cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong nấm mốc lại nằm trên vector pAN7.1 – GluA. Do vậy, hai cấu trúc trên được đưa lần lượt vào vector trung gian. Trước hết là tiến hành thiết kế vector trung gian mang cấu trúc biểu hiện xylB dựa trên vector pAN7.1 – GluA, tạo thành vector tái tổ hợp được kí hiệu là pAN_xylB. 3.1.1.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pAN_xylB mang xylB Muốn gen hoạt động và biểu hiện ra sản phẩm protein, gen phải nằm trong một kết cấu hoàn chỉnh gồm đoạn khởi đầu ở phía trước và đoạn kết thúc ở phía sau gen, đoạn khởi đầu và kết thúc này sẽ điều khiển gen hoạt động trong tế bào chủ thích hợp [6, 22, 39]. Bởi vậy, để xylB biểu hiện được, trình tự DNA mang mã di truyền của xylB phải được lắp ghép đúng chiều vào giữa đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc trên vector pAN7.1 – GluA [22]. Trước hết, trình tự của xylB được nối ghép vào vector tách dòng pJET1.2 để nhân lên lượng lớn, sau đó vector tái tổ hợp được cắt bằng enzyme Bgl II để thu lại đoạn gene mang trình tự xylB làm nguyên liệu lắp ghép vào vector pAN7.1 – GluA. Để có thể nối ghép xylB vào vector pAN7.1 – GluA, vector pAN7.1 – GluA phải được cắt mở vòng bằng enzyme giới hạn. Giữa đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc điều khiển khiển hoạt động của xylB có vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Bam HI, do đó enzyme Bam HI được sử dụng để cắt vector pAN7.1 – GluA. Kb M 1 2 ~ 8,3 kb ~ 0,7 kb 8 0, 75 0,5 Hình 3. 2: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm tinh sạch của vector pAN7.1 – GluA và gen mã hóa xylanase M: Marker 1 kb 1: Sản phẩm cắt của vector pAN7.1 – GluA bằng enzyme Bam HI 2: Sản phẩm cắt của gen mã hóa xylanase bằng enzyme Bgl II Vector pAN7.1 – GluA được mở vòng bằng Bam HI nên sản phẩm cắt thu được trên điện di đồ (Hình 3. 2) là một băng duy nhất có kích thước khoảng 8,3 kb. Sản phẩm cắt enzyme của gen mã hóa xylanase có kích thước khoảng 0,7 kb. Hai đoạn DNA này có kích thước phù hợp với lý thuyết. Do đó, chúng sẽ được tinh sạch và nối ghép với nhau nhờ T4 DNA ligase. Do trình tự nhận biết điểm cắt của Bgl II tương đồng với trình tự cắt của Bam HI nên chúng có thể nối ghép dễ dàng. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli để thu lượng lớn DNA plasmid tái tổ hợp. Trước tiên, các tế bào trong dịch nuôi cấy được thu nhận bằng cách ly tâm thu tủa. Tiếp đó chúng được xử lý bằng dung dịch I (có tác dụng rửa sạch tế bào), sau đó phá màng tế bào bằng dung dịch II. Các cấu trúc của tế bào cũng như các liên kết hydro trong phân tử bị phá vỡ. SDS cùng với EDTA trong dung dịch II còn có vai trò ức chế các nuclease do EDTA liên kết các ion Mg2+ (yếu tố cần thiết cho hoạt động của các nuclease), vì vậy ngăn không cho các nuclease phân giải DNA trong quá trình tách chiết. Tế bào vi khuẩn E. coli có chứa hai dạng DNA: DNA nhiễm sắc thể của E. coli và DNA plasmid nên việc tách riêng, làm sạch DNA plasmid là rất quan trọng. DNA plasmid được tách riêng dựa trên sự khống chế thời gian xử lý các dung dịch I, II, III. DNA nhiễm sắc thể có kích thước phân tử lớn lại liên kết chặt chẽ với protein trong phức chất nucleoprotein nên khoảng thời gian ngắn không kịp thoát ra ngoài. Trong khi đó, các phân tử DNA plasmid mạch vòng đã được giải phóng ra môi trường. Khi môi trường được xử lý tiếp với dung dịch III thì pH môi trường trở về khoảng acid yếu gắn với điểm đẳng điện của DNA. Vì vậy, DNA plasmid dễ bị kết tủa bằng cồn và được kiểm tra kích thước bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Hình 3. 3: Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang xylB 1 – 15: Plasmid tái tổ hợp của các dòng khuẩn lạc (kí hiệu pAN_xylB từ (1 – 15)) 16: Đối chứng – vector pAN7.1 – GluA Theo lý thuyết, các plasmid mang đoạn gen ngoại lai sẽ có kích thước lớn hơn plasmid không được chèn thêm đoạn gen ngoại lai (hay được gọi là plasmid gốc). Do vậy, độ cao thấp của các băng trên hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid so với băng đối chứng là cơ sở ban đầu để dự đoán dòng nào đã được chèn thêm đoạn DNA ngoại lai. Trên điện di đồ (Hình 3.3), hầu hết DNA plasmid tái tổ hợp đều cao hơn so với DNA plasmid đối chứng. 4 plasmid có thứ tự từ giếng 1 – 4 tương ứng với các dòng khuẩn lạc có kí hiệu pAN_xylB1; pAN_xylB2, pAN_xylB3 và pAN_xylB4 được tinh sạch và dùng làm khuôn cho PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho xylB: XylB – F và XylB – R kiểm tra sự có mặt của xylB trong vector pAN – GluA. Kb M 1 2 3 4 5 ~ 0,7 kb 0,7 Hình 3. 4: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của xylB trong vector tái tổ hợp pAN_xyB bằng PCR M:Marker 1 kb 1 – 5: Sản phẩm PCR của dòng khuẩn lạc pAN_xylB6– 10 Trên điện di đồ (Hình 3. 4), các băng ở giếng 1 – 5 tương ứng với dòng khuẩn lạc pAN_xylB(6 – 10), đều có kích thước khoảng 0,7 kb, bằng với kích thước lý thuyết của gen xylB. Do đó, chúng tôi khẳng định đã nối ghép thành công xylB vào vector pAN7.1 – GluA. PCR được sử dụng để kiểm tra chiều gắn của đoạn xylB trên vector pAN - GluA. Tuy nhiên, PCR bằng cặp mồi đặc hiệu của xylB không thể phân biệt được chiều gắn của xylB vì chúng chỉ nhân lên đúng trình tự của xylB. Kỹ thuật cắt enzyme giới hạn cũng không thể áp dụng được bởi không lựa chọn được enzyme phù hợp. Chính vì thế chúng tôi đã thiết kế mồi SeqXylB – F kết hợp với mồi XylB – R để kiểm tra chiều gắn của xylB bằng kỹ thuật PCR. Mồi SeqXylB – F sẽ bắt cặp với trình tự trên đoạn khởi đầu GpdA của xylB, mồi XylB – R sẽ bắt cặp trên trình tự xylB. Nếu xylB lắp ghép đúng chiều vào giữa đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc thì kích thước sản phẩm PCR sẽ khoảng 1,2 kb; ngược lại nếu lắp không đúng chiều PCR sẽ không có sản phẩm. Kb M 1 2 3 4 5 ~ 1,2 kb 1.5 1 Hình 3. 5: Điện di đồ kiểm tra chiều gắn của xylB trong vector tái tổ hợp pAN_xylB bằng PCR sử dụng cặp mồi Seq – F và XylB – R M: Marker 1 kb 1 – 5: Sản phẩm PCR của các dòng pAN_xylB (6 – 10) Sản phẩm PCR của plasmid tái tổ hợp ở giếng số 1 và giếng số 3 (Hình 3. 5) tương ứng với dòng khuẩn lạc có kí hiệu pAN_xylB1 và pAN_xylB3 xuất hiện băng đặc hiệu với kích thước khoảng 1,2 kb. Kích thước này đúng bằng kích thước lý thuyết. Như vậy, chúng tôi đã chọn được dòng plasmid tái tổ hợp mang xylB lắp đúng chiều vào giữa đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc trên vector pAN7.1 – GluA. Dòng plasmid pAN_xylB6 và pAN_xylB8 được nuôi lượng lớn và giữ chủng nhằm phục vụ cho các nghiên cứu sau. 3.1.1.2. Lắp ghép xylB trong vector pAN_xylB vào vào vector trung gian Sản phẩm để nối ghép vào vector trung gian pKS– là cấu trúc gồm: đoạn khởi đầu + xylB + đoạn kết thúc (GpdA + xylB + TrypC) hay còn gọi là cấu trúc biểu hiện xylB, cấu trúc này có kích thước khoảng 4,2 kb. Enzyme Eco RI và Sma I được dùng để cắt hoàn toàn cấu trúc (GpdA + xylB + TrypC) trên vector tái tổ hợp pAN_xylB. Theo lý thuyết, sản phẩm cắt enzyme thu được 4 băng, trong đó có hai băng có kích thước tương đương nhau, khoảng 4, 2 kb nên rất khó phân tách. Đó là hai đoạn tương ứng với đoạn gen có cấu trúc biểu hiện xylB và một đoạn khác cũng cắt từ vector pAN_xylB. Vì vậy, plasmid tái tổ hợp cần tiếp tục được kiểm tra lại bằng kỹ thuật PCR và kỹ thuật cắt enzyme giới hạn. Sau khi lựa chọn một số dòng cao hơn đối chứng âm (vector pAN7.1 – GluA). DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc này được tinh sạch và kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB trong vector tái tổ hợp pKS_xylB bằng PCR sử dụng cặp mồi SeqXylB – F và XylB – R. Kb M 1 2 3 4 1,5 1 ~ 1,2 kb Hình 3. 6: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB trên vector trung gian bằng PCR M: Marker 1 kb 1 – 4: Sản phẩm PCR của các dòng khuẩn lạc pKS_xylB(1, 3, 8, 9)) Trên điện đồ (Hình 3. 6), sản phẩm PCR rất đặc hiệu với kích thước khoảng 1,2 kb, sáng và rất đặc hiệu phù hợp với tính toán lý thuyết. Như vật, chúng đã chuyển thành công gen mã hóa xylanase vào vector trung gian pKS-. Như vậy, chúng đã chuyển thành công gen mã hóa xylanase vào vector trung gian và vector này bước đầu được kí hiệu là pKS_xylB. Các plasmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng cắt enzyme Sma I và Eco RI. Hai enzyme có điểm cắt ngoại, tức là điểm cắt ở hai đầu đoạn gen ngoại lai trên vector tái tổ hợp pKS_xylB. Theo lý thuyết, sản phẩm cắt enzyme của plasmid tái tổ hợp pKS_xylB sẽ có kích thước khoảng 3 kb và 4,2 kb. pKS pKS pKS M Kb ~ 4,2 kb ~ 3 kb 6 2,5 Hình 3. 7: Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp pKS_xylB bằng enzyme Sma I và Eco RI M: Marker 1 kb P: plasmid tái tổ hợp pKS_xylB9 pKS: Sản phẩm cắt của khuẩn lạc pKS_xylB bằng enzyme Sma I và Eco RI Vì cấu trúc GpdA promoter + xylB gene + TrypC terminator được cắt bằng Sma I và Eco RI để nối ghép vào vector KS- cũng đã được cắt bằng hai enzyme tương tự nên điểm cắt của hai enzyme này không bị mất đi. Do đó vector tái tổ hợp KS_xylB có thể dễ dàng được kiểm tra sự có mặt của xylB bằng cách cắt kiểm tra bằng Sma I và Eco RI. Sản phẩm cắt enzyme của tất cả các mẫu được kiểm tra trên hình ảnh điện di (Hình 3. 7) đều gồm 2 băng có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyế: 4,2 kb (kích thước của đoạn gen ngoại lai (GpdA promoter + xylB gene + TrypC terminator) và khoảng 3 kb (kích thước của vector KS-)). Như vậy, chúng tôi khẳng định đã chuyển thành công cấu trúc (GpdA promoter + xylB gene + TrypC terminator) vào vector trung gian. 3.1.2. Lắp ghép cấu trúc GluA promoter + hph gene + TrypC terminator vào vector trung gian Cấu trúc (GluA promoter + xylB gene + TrypC terminator) đã được lắp ghép thành công vào vector trung gian, tạo thành vector tái tổ hợp pKS_xylB. Tuy nhiên, việc chọn lọc/ sàng lọc các thể tái tổ hợp thông thường cần sự có mặt của các gen chỉ thị như các gen kháng kháng sinh [20]. Trên cơ sở vector pAN7.1 – GluA nhận được từ Phòng Công nghệ sinh học enzyme, chúng tôi tiến hành thiết kế vector tái tổ hợp mang gen kháng kháng sinh (hph) để làm nguyên liệu lắp ghép tiếp vào vector trung gian. 3.1.2.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pJET_hph Hph không thể lắp ghép trực tiếp vào vector trung gian vì theo chiến lược thiết kế vector đã đề ra, cấu trúc biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B nằm trên vector trung gian sẽ được chuyển vào Ti plasmid bằng cách cắt mở vòng Ti plasmid và vector trung gian bằng enzyme Kpn I do không chọn được enzyme khác thích hợp. Do đó, hai đầu của đoạn gen có cấu trúc biểu hiện xylB và hph trên vector trung gian phải là vị trí nhận biết của Kpn I. Trên vector trung gian đã được ghép nối với xylB chỉ có một điểm cắt của Kpn I. Muốn xuất hiện điểm cắt thứ hai của Kpn I, chúng tôi phải chuyển qua một vector pKS– khác và tạo thành vector tái tổ hợp có kí hiệu pKS_hph. Trên vector pKS– cũng có điểm cắt của Kpn I, tuy nhiên nếu chuyển trực tiếp cấu trúc biểu hiện hph từ vector tái tổ hợp pKS_hph sang vector trung gian sẽ làm mất điểm cắt của Kpn I, hoặc vẫn chỉ có một điểm cắt của Kpn I và vector trung gian được tạo thành sẽ rất khó để tinh chế và nối ghép với Ti plasmid vector vì không có enzyme nào thích hợp cho cả hai vector trên. Do vậy, cấu trúc biểu hiện hph nằm trên vector tái tổ hợp pKS_hph được tách dòng bằng vector pJET1.2. * Lắp ghép hph vào vector pKS– Vector pAN – GluA được cắt bằng enzyme Sma I và Hind III để thu đoạn gen gồm (đoạn khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC) và nối ghép với vector nhận pKS– cũng được cắt bằng hai enzyme tương tự. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli. Các DNA plasmid sẽ được điện di trên gel agarose 0,8 % cùng với đối chứng âm (vector pKS– không có đoạn chèn), một số plasmid đại diện ở các mẫu cao hơn đối chứng âm được dùng để kiểm tra sự có mặt của hph bằng kỹ thuật PCR bằng cặp mồi đặc hiệu của hph: hph1 và hph2. kb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0,6 Hình 3. 8: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của hph trong vector tái tổ hợp pKS_hph bằng kỹ thuật PCR M: Marker 100bp 1 – 9: sản phẩm PCR của plasmid tái tổ hợp pKS_hph (kí hiệu pKS_hph (1 – 9) Sản phẩm PCR của tất cả các dòng khuẩn lạc đều xuất hiện một băng duy nhất có kích thước khoảng 0,6 kb (Hình 3. 8). Kích thước này phù hợp với kích thước lý thuyết. Do đó, chúng tôi khẳng định đã chuyển được hph vào vector pKS–. DNA của các dòng plasmid tái tổ hợp pKS_hph (1 – 3) được dùng làm khuôn để tổng hợp cấu trúc gen bao gồm (đoạn khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC) bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi M13. Sản phẩm PCR nhận được là cấu trúc gồm (đoạn khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC) và sản phẩm PCR được dùng làm đoạn chèn vào vector pJET1.2. * Lắp ghép hph trong vector tái tổ hợp pKS_hph vào vector pJET1.2 Theo lý thuyết, sản phẩm PCR khi sử dụng cặp mồi M13 với khuôn là DNA plasmid pKS_hph có kích thước khoảng 2,5 kb. ~2,5kb kb 3 2,5 kb M 1 2 3 Hình 3. 9: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm PCR bằng mồi M13 của các plasmid tái tổ hợp pKS_hph 1 – 3: Sản phẩm PCR của các dòng khuẩn lạc (kí hiệu pKS_hph (1–3)) M: Marker 1 kb Kết quả PCR bằng cặp mồi M13 (Hình 3. 9) thu được một băng đặc hiệu có kích thước khoảng 0,6 kb. Sản phẩm PCR được nhân lên bằng enzyme đầu bằng, do đó chúng tôi đã gắn vào vector tách dòng đầu bằng pJET1.2 của hãng Fermentas được sử dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm trên thế giới. Vector này chứa điểm khởi đầu sao chép nên có khả năng sao chép độc lập với hệ gen của tế bào chủ E.coli. Trên vector có gen kháng chất kháng sinh (bla), nên chỉ có những tế bào nào có mang vector này mới có thể sống được trong môi trường có ampicillin. Đồng thời trên vector pJET1.2 còn chứa gen gây chết eco47IR mã hoá cho enzyme phân huỷ DNA nhân khi tồn tại trong tế bào vật chủ. Vì vậy vector gắn thêm đoạn ngoại lai sẽ làm lệch khung đọc của gen khiến enzyme được tổng hợp không còn hoạt tính như trước nữa. Thêm vào đó, vùng MCS (Multiple Cloning Site) của vector có chứa điểm nhận biết của nhiều enzyme hạn chế như Kpn I, Xho I, Xba I…nhằm phục vụ cho việc cắt kiểm tra sau khi đã tách dòng. Ngoài ra, trên vector mang trình tự hai mồi pJET1.2 xuôi và ngược nằm về hai phía của điểm gắn sản phẩm PCR cho phép nhân đoạn PCR được gắn vào sau tách dòng với số lượng lớn, phục vụ cho việc xác định trình tự gen. Sản phẩm PCR của cấu trúc biểu hiện gen hph được tiến hành gắn với vector pJET1.2, sau đó biến nạp các sản phẩm nối ghép vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α (là loại vi khuẩn được dùng khá phổ biến tại các phòng thí nghiệm vì chúng có khả năng tái bản cao). Các tế bào khả biến sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung amp (50 µg/ml) ở 37˚C qua đêm. Kết quả chúng tôi thu được rất nhiều khuẩn lạc và đã tiến hành tách chiết DNA plasmid của các khuẩn lạc này. Sau khi sơ bộ sàng lọc các dòng mang plasmid kích thước lớn hơn vector pJET1.2 (Hình 3. 10), chúng tôi đã xử lý enzyme giới hạn Sma I và Not I với 3 dòng khuẩn lạc pJET_hph (1 – 3). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Hình 3. 10: Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJET_hph mang cấu trúc (đoạn khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC) 1 – 23: DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc (kí hiệu là pJET_hph (1 – 23) 24: Đối chứng – vector pJET1.2 Vì ghép nối GluA promoter + hph + TrypC ter vào vector pJET1.2, chúng đã được xử lý với enzyme Sma I và Not I nên điểm cắt của hai enzyme không bị mất đi, chúng trở thành điểm cắt ở hai đầu của đoạn gen ngoại lai chèn vào vector pJET1.2. Trên điện di đồ (Hình 3. 11), sản phẩm cắt của các dòng tái tổ hợp pJET_hph (1 – 3) bằng enzyme Sma I và Not I đều gồm 2 đoạn tương ứng với hai băng có kích thước là 2,5 kb (kích thước của cấu trúc (đoạn khởi đầu GluA + gen hph + đoạn kết thúc TrypC) và 3 kb (kích thước của vecotr pJET1.2). Do đó, chúng tôi khẳng đã lắp ghép thành công cấu trúc biểu hiện gen kháng hygromycin B (GluA promoter + gen hph + TrypC ter) trong vector tái tổ hợp pKS_hph vào vector pJET1.2. Plasmid tái tổ hợp pJET_hph được nuôi lượng lớn để dùng làm nguyên liệu cho thiết kế vector trung gian mang gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B pKS_xylB_hph. Kb M 1 2 3 3 2,5 ~ 3 kb ~ 2,5 kb Hình 3. 11: Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJET1_hph bằng cắt enzyme Sma I và Not I M: Marker 1 kb 1 – 3: Sản phẩm cắt của các dòng khuẩn lạc (kí hiệu pJET_hph (1 – 3) bằng Sma I và Not I 3.1.2.2. Lắp ghép cấu trúc biểu hiện hph trong vector tái tổ hợp pJET_hph vào vector trung gian Cấu trúc biểu hiện xylB đã được nối ghép vào vector trung gian mà không làm mất điểm cắt của Sma I và Not I. Hơn nữa, điểm cắt của Kpn I trên vector tái tổ hợp pJET_hph cũng sẽ không bị mất nếu cắt vector tái tổ hợp pJET_hph bằng enzyme Not I vì Not I nằm phía sau Kpn I. Do đó, vector tái tổ hợp pJET1.2 và vector trung gian được cắt bằng enzyme Sma I và Not I, sau đó nối ghép lại với nhau bằng T4 DNA ligase. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào tế bào E. coli. DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc đã được tách chiết và kiểm tra sự có mặt của gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B bằng kỹ thuật PCR và kỹ thuật cắt enzyme. 3.1.3. Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung gian (pKS_xylB_hph) Theo lý thuyết, khi xử lý vector trung gian đã mang cả hai xylB và hph bằng Kpn I, sản phẩm cắt thu được là hai đoạn có kích thước 6,4 kb và 3 kb, trong đó 6,4 kb là kích thước tương ứng với hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph và 3 kb là kích thước của vector pKS-. Phản ứng cắt enzyme được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ 37°C trong 1,5 giờ. ~ 6,4 ~ 3 kb 1 M 2 3 kb 6 3 Hình 3. 12: Điện di sản đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pKS_xylB_hph bằng enzyme Kpn I DNA plasmid pKS_xylB_hph M: Marker 1 kb 2 – 3: Sản phẩm cắt của plasmid tái tổ hợp có kí hiệu pKS_xylB_hph(9, 18) bằng enzyme Kpn I Vì kích thước của sản phẩm cắt enzyme lớn, DNA plasmid được điện di cùng để làm đối chứng. Nhờ vậy dễ dàng phân biệt được sản phẩm cắt enzyme trong những trường hợp xử lý enzyme không hoàn toàn hoặc enzyme không hoạt động. Trên điện di đồ (Hình 3. 12), sản phẩm cắt enzyme của 2 dòng plasmid trên giếng số 2 và giếng số 3 gồm hai băng rất rõ nét. Một băng có kích thước khoảng 3 kb (kích thước của vector pKS–); một băng có kích thước 6,4 kb (kích thước của cả cấu trúc biểu hiện xylB và hph có trong vector trung gian). Kích thước này hoàn toàn phù hợp với kích thước lý thuyết. Để khẳng định chính xác trình tự được chuyển vào là trình tự xylB và trình tự hph, dòng plasmid tái tổ hợp có kí hiệu pKS_xylB_hph9 được tiếp tực kiểm tra bằng kỹ thuật PCR. Kb M 1 2 ~ 0,7 kb ~ 0,6 kb 0,6 Hình 3. 13: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong vector trung gian pKS_xylB_hph9 M: Marker 100 bp 1: Sản phẩm PCR của hph 2: Sản phẩm PCR của gen xylB Sản phẩm PCR của xylB và hph rất đặc hiệu (Hình 3. 13) và có kích thước đúng bằng kích thước lý thuyết: xylB có kích thước khoảng 0,7 kb và hph có kích thước khoảng 0,6 kb. Do vậy, chúng tôi khẳng định đã thiết kế thành công vector trung gian pKS_xylB_hph mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph. Dòng plasmid tái tổ hợp có kí hiệu pKS_xylB_hph được nuôi lượng lớn để dùng cho các nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase. 3.2. Thiết kế Ti plasmid mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph 3.2.1. Lắp ghép đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung gian vào Ti plasmid Để thiết kế Ti plasmid tái tổ hợp, vector pCAMBIA1300 được sử dụng làm vector nhận và đoạn chèn được thu nhận lại từ vector trung gian có kí hiệu pKS_xylB_hph cùng được cắt bằng enzyme Kpn I. Kpn I có vị trí cắt ở hai đầu của hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph nằm trên vector trung gian, do đó khi xử lý vector trung gian bằng Kpn I, chúng tôi sẽ thu được đoạn gen mong muốn để nối ghép với vector pCB1300, tạo thành vector biểu hiện. Vector này có cấu trúc bao gồm: (đoạn khởi đầu GpdA + xylB + đoạn kết thúc TrypC) và (đoạn khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC). Đoạn DNA chèn và vector nhận sau khi được cắt bằng enzyme giới hạn Kpn I và thu lại nhờ tinh chế sản phẩm trên gel agarose sẽ được nối ghép với nhau bằng phản ứng lai dưới sự hỗ trợ của enzyme T4 DNA ligase. Ti plasmid tái tổ hợp tạo thành mang hai cấu trúc biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B, có kích thước phân tử khoảng 15,4 kb. Kích thước này lớn hơn so với kích thước của vector pCB1300 do vậy, dưới điện trường, DNA plasmid của Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph sẽ di chuyển chậm hơn so với DNA plasmid của vector pCB1300. Một số khuẩn lạc được nhặt nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin (50 mg/ml) ở 37°C qua đêm, sau đó kiểm tra DNA plasmid để lựa chọn các dòng cao hơn trên hình ảnh điện ảnh di để tiến hành kiểm tra sự có mặt của xylB trong Ti plasmid tái tổ hợp. 3.2.2. Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong vector tái tổ hợp Ti plasmid Dòng khuẩn lạc có kí hiệu pCB_xylB_hph lần lượt được cắt kiểm tra bằng một enzyme là Kpn I, Bgl II và kết hợp hai enzyme Bgl II và Nco I. Enzyme giới hạn Kpn I để dùng để cắt vector trung gian pKS_xylB_hph với mục đích tinh chế đọan gen cần nối ghép với vector pCB1300 và vector nhận pCB1300 cũng được cắt mở vòng bằng Kpn I nên điểm cắt của Kpn I không bị mất. Vì vậy, khi xử lý DNA plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph bằng enzyme giới hạn Kpn I, kết quả thu được là hai đoạn gen có kích thước là 9 kb và 6,4 kb tương ứng với kích thước của pCB1300 và đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph. Trên hình ảnh điện di (Hình 3. 14), sản phẩm cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme Kpn I gồm hai băng với kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết. Vector pCB1300 được dùng để làm đối chứng chỉ có một băng duy nhất với kích thước khoảng 9 kb. Như vậy, chúng tôi khẳng định đã chuyển được toàn bộ kết cấu gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B vào Ti plasmid. ~15,4 ~10,7 ~ 9 ~ 6,4 ~ 4,7 1 2 3 4 5 6 M 7 8 kb Hình 3. 14: Điện di đồ sản phẩm cắt enzyme của Ti plasmid tái tổ hợp mang hai cấu trúc biểu hiện gen xylB và hph 1: Vector pCB1300 đối chứng 2: Ti plasmid pCB_xylB_hph đối chứng 3: pCB1300 cắt bằng Kpn I 4: Plasmid pCB_xylB_hph cắt bằng Kpn I 5: pCB1300 cắt bằng Bgl II 6: Plasmid pCB_xylB_hph cắt bằng Bgl II M: Marker 1 kb 7: Plasmid pCB_xylB_hph cắt bằng Bgl II và Nco I 8: pCB1300 cắt bằng Bgl II và Nco I Tiến hành khảo sát thêm một số điểm cắt của enzyme giới hạn trên vector tái tổ hợp pCB1300_xylB_hph, enzyme Bgl II và Nco I được dùng để cắt điểm cắt nội trên đoạn gen mang hai cấu trúc (GpdA promoter + xylB gene +trypC terminator) và (GluA promoter + hph gene + TrypC terminator). Vì Bgl II có vị trí nhận biết trên gen mã hóa xylB, nên Bgl II sẽ cắt mở vòng vector tái tổ hợp pCB1300_xylB_hph. Vector pCB1300 không có vị trí cắt của Bgl II do đó, DNA plasmid của pCB1300 sẽ không bị cắt, trên điện di đồ vẫn là sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp. Tương tự, Nco I có vị trí nhận biết trên gen mã hóa hph nên khi xử lý DNA plasmid tái tổ hợp bằng Bgl II và Nco I, kết quả sẽ gồm hai băng có kích thước khoảng 10,6 kb và 4,7 kb. Đồng thời, vector pCB1300 được cắt cùng với Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph để làm đối chứng. Với cả hai phương án xứ lý bằng enzyme giới trên đều không có điểm cắt trên vector pCB1300 do đó dễ dàng nhận thấy sự khác biệt giữa sản phẩm cắt của vector pCB1300 và vector lasmid tái tổ hợp pCB1300_xylB_hph trên điện di đồ. Như vậy, chúng tôi có thể khẳng định đã chuyển được đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph vào vector pCB1300. DNA plasmid tái tổ hợp được tách chiết lượng lớn và tinh sạch cho phản ứng xác định trình tự. Đoạn gen quan tâm được xác định trình tự theo phương pháp Sanger trên máy xác định trình tự tự động ABI Avant 3100. Trình tự nucleotide của mỗi mẫu được xác định cả hai chiều xuôi và chiều ngược. Trình tự được xử lý bằng các phần mềm ABI PRIMS 3100 Avant Data Collection v1.0 và DNA Sequencing Analysis v5. 2. Trình tự gen thu được tiếp tục được so sánh với các trình tự chuẩn trong ngân hàng gen Quốc tế EMBL/ Genbank/ DDBJ hoặc các trình tự ban đầu của gen nhờ các phần mềm Seqscrape v2. 6 và Bioedit v7. 0. 9 để kiểm tra độ chính xác của trình tự gen. 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| XylB ATGCTCACCAAGAACCTTCTCCTCTGCTTTGCCGCGGCTAAGGCTGCTCTGGCTGTCCCC M L T K N L L L C F A A A K A A L A V P 70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| XylB CACGACTCTGTCGCCCAGCGTTCGGATGCCTTGCACATGCTCTCTGAGCGCTCGACCCCG H D S V A Q R S D A L H M L S E R S T P 130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| XylB AGCTCGACCGGCGAGAACAACGGCTTCTACTACTCCTTCTGGACCGACGGCGGTGGCGAC S S T G E N N G F Y Y S F W T D G G G D 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| XylB GTGACCTACACCAACGGAGATGCTGGTGCCTACACTGTTGAGTGGCCCAACGTGGGCAAC V T Y T N G D A G A Y T V E W P N V G N 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| XylB TTTGTCGGTGGAAAGGGCTGGAACCCCGGAAGTGCGCAGGACATCACCTACAGCGGCACC F V G G K G W N P G S A Q D I T Y S G T 310 320 330 340 350 360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| XylB TTCACCCCTAGCGGCAACGGCTATCTCTCCGTCTATGGCTGGACCACTGACCCCCTGATC F T P S G N G Y L S V Y G W T T D P L I 370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| XylB GAGTACTACATCGTCGAGTCCTACGGCGACTACAACCCCGGCAGTGGAGGCACATACAAG E Y Y I V E S Y G D Y N P G S G G T Y K 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| XylB GGCACCGTCACCTCGGACGGATCCGTTTACGATATCTACACGGCTACCCGTACCAATGCT G T V T S D G S V Y D I Y T A T R T N A 490 500 510 520 530 540 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| XylB GCTTCCATTCAGGGAACCGCTACCTTCACTCAGTACTGGTCCGTCCGCCAGAACAAGAGA A S I Q G T A T F T Q Y W S V R Q N K R 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| XylB GTTGGCGGAACTGTTACCACCTCCAACCACTTCAATGCTTGGGCTAAGCTGGGAATGAAC V G G T V T T S N H F N A W A K L G M N 610 620 630 640 650 660 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| XylB CTGGGTACTCACAACTACCAGATCGTGGCTACCGAGGGTTACCAGAGCAGTGGATCTTCG L G T H N Y Q I V A T E G Y Q S S G S S 670 ....|....|....|... XylB TCCATCACTGTTCAGTAA S I T V Q * Hình 3. 15: Trình tự gen và trình tự amino acid của gen xylanase Chúng tôi sử dụng phần mềm Bioedit để phân tích và so sánh trình tự giải mã được của xylB với các trình tự gen này đã công bố trên ngân hàng gen EMBL. Kết quả, đoạn gen đã được giải mã có độ dài 678 bp, mã hóa cho 205 amino acid (23 kDa). Như vậy, gen mã hóa xylanase được chuyển vào nấm sẽ là mã hóa enzyme xylanase thuộc họ 11. Đây là những enzyme rất đặc hiệu trong việc phân hủy xylan [13, 29]. Như vậy, chúng tôi đã thiết kế thành công Ti plasmid tái tổ hợp mang hai cấu trúc biểu hiện gen xylanase và gen kháng hygromycin B. Vector này còn được gọi là vector biểu hiện gen mã hóa xylanase. 3.3. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph 3.3.1. Biến nạp Ti plasmid tái tổ hợp vào A. tumefaciens Để tạo ra được nguyên liệu chuyển gen thực vật, Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph phải được chuyển vào một tế bào để làm ổn định nguồn gen. Hơn nữa, tế bào sinh vật này phải có khả năng chuyển gen quan tâm vào vật chủ mong muốn. Cho đến nay, chuyển gen nhờ Agrobacterium đã và đang được áp dụng rộng rãi trong chuyển gen vào thực vật và một số vi sinh vật chẳng hạn như nấm, vi khuẩn. Các nghiên cứu trên thế giới về thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện trong nấm thường sử dụng đoạn khởi đầu GpdA promoter. GpdA là một promoter đặc hiệu cho nấm. Promoter này có nguồn gốc từ A. nidulans và A. bisporus [22]. Phương pháp biến nạp được sử dụng phổ biến là sốc nhiệt tuy nhiên hiệu suất không cao bằng phương pháp xung điện. Hơn nữa vector biểu hiện có kích thước lớn do đó chúng tôi đã lựa chọn phương pháp xung điện để biến nạp vào A. tumefaciens và sử dụng chủng vi sinh vật này làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm sợi. Chủng A. tumefaciens được sử dụng là chủng có mang một loại plasmid trợ giúp (helper plasmid) mà trên plasmid có mang gen kháng ampicillin, plasmid này hỗ trợ chuyển T – DNA vào tế bào chủ, do đó trên môi trường chọn lọc cho A. tumefaciens, ngoài rifamycin, chúng tôi còn bổ sung thêm kháng sinh ampicillin để chọn lọc cho chủng có mang plasmid trợ giúp. Sau khi biến nạp, tế bào mang vector biểu hiện được chọn lọc trên môi trường YEB đặc có bổ sung kháng sinh rifamycin, ampicillin để chọn lọc A. tumefaciens và kanamycin để chọn lọc A. tumefaciens có mang plasmid tái tổ hợp. 3.3.2. Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong Agrobacterium Các dòng plasmid tái tổ hợp trước tiên được cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn Kpn I. Các khuẩn lạc A. tumefaciens có chứa Ti-plasmid tái tổ hợp tạo được nhờ xung điện được phát hiện bằng phương pháp chọn lọc trên môi trường đặc hiệu, tách chiết DNA plasmid và tiếp tục được biến nạp trở lại tế bào E. coli và tiến hành các thí nghiệm phân tích phân tử tiếp theo. Sở dĩ cần phải thực hiện bước biến nạp trở lại DNA plasmid vào trong tế bào vi khuẩn E. coli vì số lượng bản sao của plasmid tái tổ hợp này trong tế bào Agrobacterium rất ít, không đủ để tiến hành các thí nghiệm kiểm tra sự có mặt của các kết cấu gen đưa vào. Các plasmid dự đoán có mang vector biểu hiện pCB1300_xylB_hph được tinh sạch và dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với hai cặp mồi nhân xylB và hph. Kết quả PCR trên hình 3. 16 cho thấy, chúng tôi đã đưa được plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph vào trong tế bào A. tumefaciens. Các dòng sau biến nạp được dùng làm nguyên liệu để chuyển vào nấm. 0,6 ~ 0,7 1 2 3 4 5 6 7 M kb Hình 3. 16: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của xylB trong Agrobacteirum bằng PCR 1–7: Sản phẩm PCR của plasmid tái tổ hợp tách từ Agrobacterium M: Marker 100 bp Vì cấu trúc biểu hiện gen xylB đã được chuyển cùng với cấu trúc biểu hiện gen hph vào A. tumefaciens. Do vậy, dòng plasmid tái tổ hợp tách từ Agrobacterium tiếp tục được kiểm tra bằng PCR sử dụng cặp mồi đặt hiệu của gen hph. Trên điện đồ (Hình 3. 17) sản phẩm PCR rất đặc hiệu với kích thước khoảng 0,6 kb. PCR là phương pháp đơn giản, hiệu quả và nhanh chóng để xác định chính xác cấu trúc của gen đã chuyển vào Agrobacterium. 1 2 3 4 5 6 7 M kb ~ 0,6 kb 0,6 Hình 3. 17: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của hph trong Agrobacteirum bằng PCR 1–7: Sản phẩm PCR của gen hph M: Marker 100 bp Như vậy, chúng tôi đã tạo được chủng Agrobacterium CV58C1 - pGV2260 mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph. Các dòng khuẩn lạc sau khi kiểm tra sẽ được lưu giữ để làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm. 3.4. Kết quả chuyển vector biểu hiện xylB và hph vào A. niger thông qua A. tumefaciens 3.4.1. Kết quả nuôi nhiễm Nồng độ bào tử thích hợp để nuôi nhiễm với Agrobacterium khoảng 108 bào tử/ml. Tế bào Agrobacterium đã được hoạt hóa trong môi trường IM lỏng có bổ sung AS. Nhờ sự có mặt của chất cảm ứng AS, các gen vir trở nên hoạt hóa, và quá trình chuyển gen vào nấm mốc được diễn ra dưới sự hỗ trợ của các gen vir. Bào tử nấm và tế bào Agrobacterium được nuôi nhiễm theo nhiều tỷ lệ khác nhau: 1: 1; 1: 3 và 1: 5. Hỗn hợp Agrobacterium và A. niger được trải đều lên màng lọc đã được đặt sẵn trên bề mặt của hai loại môi trường, môi trường IM đặc có bổ sung AS và môi trường IM đặc không bổ sung AS. Đĩa nuôi nhiễm được ủ ở 24 °C trong 3 ngày. Kết quả thu được rất khác nhau trên các đĩa nuôi nhiễm với tỷ lệ khác nhau. Ở đĩa nuôi nhiễm theo tỷ lệ 1:1 và 1: 3 xuất hiện ít nấm, chúng phát triển không đều so với đĩa nuôi nhiễm theo tỷ lệ 1: 5 (Hình 3. 18). Theo Beijersbergen và các tác giả khác (2001), tỷ lệ nuôi nhiễm giữa A. niger và Agrobacterium là 1 : 1 [9]; theo Sugui và các tác giả khác (2004), tỷ lệ nuôi nhiễm A. fumigatus và Agrobacterium là 1 : 10 [16]. Sau 3 ngày nuôi cấy ở 37°C, bào tử nấm đã xuất hiện tương đối nhiều trên tất cả các đĩa nuôi cấy. Sự phát triển mạnh của bào tử nấm có thể do nồng độ bào tử nấm ban đầu bổ sung trong giai đoạn nuôi nhiễm quá cao, hoặc thời gian nuôi cấy quá dài và ở nhiệt độ cao. Điều này có thể khắc phục được bằng cách giảm nồng độ bào tử nấm nuôi nhiễm, giảm thời gian và nhiệt độ nuôi nhiễm [11]. A B B Hình 3. 18: Kết quả nuôi nhiễm Agrobacterium và A. niger trên hai loại môi trường khác nhau A: Môi trường IM có bổ sung AS B: Môi trường IM không bổ sung AS. Đĩa nuôi nhiễm được nuôi ở 24°C trong 3 ngày kết quả thu được không cao. Nguyên nhân có thể do nhiệt độ và thời gian cho quá trình nuôi nhiễm chưa tối ưu. Theo Beijersbergen và các tác giả khác (2001), điều kiện nuôi nhiễm giữa A. niger và Agrobacterium là 2 ngày ở nhiệt độ phòng [9]. Theo Michielse và các tác giả khác (2008), nhiệt độ tối ưu cho quá trình nuôi nhiễm là từ 20°C – 25°C [11, 12]. Song, có thể nhiệt độ nuôi nhiễm khác nhau khi sử dụng các loài nấm khác nhau, chẳng hạn như, theo nghiên cứu của Sugui và các tác giả khác (2004), nhiệt độ tối ưu cho giai đoạn nuôi nhiễm Agrobacterium và A. awamori là 24°C trong 2 ngày [16]. Tỷ lệ bào tử nấm xuất hiện trên môi trường nuôi nhiễm có bổ sung AS mọc tốt hơn so với môi trường không bổ sung AS. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nhiều nghiên cứu về chuyển gen vào nấm nhờ Agrobacterium trên thế giới [9, 11, 12]. Theo Beijersbergen và các tác giả khác (2001), AS ảnh hưởng rõ rệt lên hiệu suất nuôi nhiễm giữa A. niger và Agrobacterium. Trên môi trường chọn lọc thể chuyển gen đã không xuất hiện khuẩn lạc nào nếu trong giai đoạn nuôi nhiễm không được bổ sung thêm AS. Ngược lại, nếu giai đoạn nuôi nhiễm có bổ sung AS thì xuất hiện 5 - 6 khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc bằng kháng sinh kháng hygromycin B [9]. Kết quả này cũng tương tự với kết quả của Wang và các tác giả khác (2008) khi nghiên cứu chuyển gen vào nấm P. digitatum thông qua Agrobacterium [17]. Theo nghiên Michielse và cs (2008), AS ảnh hưởng và cần thiết trong giai đoạn cùng nuôi, bởi nó cảm ứng gen vir chuyển T – DNA vào tế bào chủ, mặc dù AS không thật sự cần thiết trong giai đoạn chuẩn bị nguyên liệu nuôi nhiễm [9, 11]. Mặc dù hiệu suất chuyển gen vào nấm sợi thông qua Agrobacterium có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, tuy nhiên, rõ ràng có thể thấy AS làm giảm hiệu suất chuyển gen. Do vậy, bổ sung AS trong giai đoạn nuôi nhiễm là cần thiết để đạt hiệu suất chuyển gen cao nhất [9, 11, 12]. Khảo sát ảnh hưởng của màng lọc lên hiệu suất nuôi nhiễm, chúng tôi thử nghiệm hai loại màng lọc là cellulose và nitrocellulose. Kết quả là bảo tử đều mọc trên cả hai loại màng lọc, tuy nhiên chúng có sự phân bố khác nhau. Trên đĩa được sử dụng màng cellulose, nấm phát triển tốt hơn và mọc đều hơn trên khắp bề mặt giấy, trên đĩa được sử dụng màng nitrocellulose, nấm phát triển yếu hơn và thành từng cụm với màu đen sẫm so với đĩa nuôi nhiễm dùng màng cellulose. Qua kết quả nuôi nhiễm trên hai loại màng lọc, nuôi nhiễm trên màng cellulose nấm mọc tốt hơn so với màng nitrocellulose. Mặc dù màng lọc nitrocellulose được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi nhiễm với A. tumefaciens và nấm sợi [16], song trong một số nghiên cứu, hiệu suất chuyển gen rất thấp khi dùng màng nitrocellulose [12]. Không chỉ vậy, theo nghiên cứu của Sugui và các tác giả khác (2004), hiệu suất nuôi nhiễm trên màng nitrocellulose thấp hiệu suất nuôi nhiễm trên cellulose, chẳng hạn như nuôi nhiễm Agrobacterium với A. fumigatus trên màng nitrocelluse đã không xuất hiện khuẩn lạc nào [16]. Tuy nhiên, theo Michielse và các tác giả khác (2005), hiệu suất chuyển gen thấp hơn khi nuôi nhiễm trên màng nitrocellulose hoặc Hybon C, ví dụ như khi nuôi nhiễm Agrobacterium và A. infestans trên màng nitrocellulose, kết quả là không xuất hiện khuẩn lạc nào nhưng kết quả lại hoàn toàn ngược lại khi thay màng nitrocellulose bằng màng Nytran hoặc Hybon N+ [12]. Nguyên nhân của sự khác nhau trên đến nay vẫn chưa được biết rõ, song có thể thành phần hóa học của màng lọc ảnh hưởng đến sự phân bố và phát triển của Agrobacterium và bào tử nấm cũng như ức chế sự tương tác để vận chuyển T – DNA dẫn đến làm giảm hiệu suất chuyển gen [16]. 3.4.2. Chọn lọc thể nấm chuyển gen trên môi trường kháng sinh Các đĩa nuôi nhiễm theo tỷ lệ 1 : 5 trên môi trường có bổ sung AS sẽ được dùng cho nghiên cứu chọn lọc thể nấm chuyển gen trên môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh hyhromycin và cefotaxim. Màng lọc từ các đĩa nuôi nhiễm được tiếp tục sang môi trường chọn lọc PDA có bổ sung hygromycin (50mg/ml) và cefotaxim (50 mg/ml). PDA là môi trường đặc hiệu cho sự phát triển của nấm và hygromycin B là kháng sinh ức chế sự phát triển của nấm [18]. Màng lọc được chuyển sang môi trường chọn lọc và đĩa được ủ ở 37°C trong 3 ngày. Chúng tôi mới chỉ chọn được một khuẩn lạc duy nhất xuất hiện trên đĩa. Để sống sót trên môi trường có hygromycin, khuẩn lạc này chắc chắn phải mang gen kháng hygromycin, hơn nữa phải kháng lại cả cefotaxim vì cefotaxim là chất kháng sinh ức chế sự phát triển của Agrobacterium [11]. Do đó có thể khẳng định, khuẩn lạc trên không phải là Agrobacterium mà là dòng khuẩn lạc của nấm mang gen kháng hygromycin B. Kết quả nuôi nhiễm trong nghiên cứu tương đối thấp so với hiệu suất chyển gen của các nghiên cứu khác trên thế giới. Hiệu suất chuyển gen vào P. digitatum nhờ vi khuẩn Agrobacterium rất cao, từ 97% – 100% [17]. Kết quả nuôi nhiễm không cao có thể do giai đoạn chuẩn bị vật liệu chủng giống không tốt, hoặc do chủng giống Agrobacterium không phù hợp với A. niger. Theo Beijersbergen và các tác giả khác (2001), chuyển gen vào nấm mốc A. niger, chủng Agrobacterium được sử dụng để nuôi nhiễm là LBA1100 [9]. Chuyển gen vào nấm mốc A. awamori, chủng Agrobacterium được sử dụng là các chủng có kí hiệu LBA100a, LBA1119 hay EHA105, LBA1126 [12]. Nhiều nghiên cứu chứng minh, chuyển gen vào nấm thông qua Agrobacterium A281 có hiệu suất cao hơn so với các chủng khác, chẳng hạn như chuyển gen vào Criphonectria paratosis thông qua Agrobacterium A281 có hiệu suất cao hơn Agrobacterium LBA4404 [12]. Sự phát triển mạnh của nấm cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen do sự cạnh tranh dinh dưỡng. Hơn nữa, chủng nấm để nuôi nhiễm khi được chuẩn bị mới sẽ cho hiệu suất cao hơn so với vật liệu bảo quản trong thời gian dài [1]. Bào tử nấm dùng trong nuôi nhiễm đã được bảo quản ở 4°C trong 1 tuần, do đó có thể đây cũng là nguyên nhân ảnh hưởng đến kết quả nuôi nhiễm. Ngoài ra, giai đoạn xử lý Agrobacterium để thu cặn tế bào cũng có thể ảnh hưởng đến Ti plasmid, dẫn đến hiệu suất nuôi nhiễm thấp. Nấm chuyển gen sau khi chọn lọc trên môi trường có bổ sung kháng sinh hygromycin B sẽ tiếp tục được nuôi lượng lớn trong môi trường DPA lỏng để thu cặn tế bào. DNA tổng số tách từ khuẩn lạc này được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR. Trên hình ảnh điện di, sản phẩm PCR cuả gen kháng hygromycin B thu được rất đặc hiệu, tương ứng với kí