Đề tài Tạo mô hình tiểu đường trên chuột nhắt trắng và thử tác dụng hạ đường huyết một số chế phẩm tự nhiên

đại học quốc gia hà nội trường đại học khoa học tự nhiên ------------------------ Nguyễn Trung Quân Tạo mô hình tiểu đường trên chuột nhắt trắng và thử tác dụng hạ đường huyết một số chế phẩm tự nhiên Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 Luận văn thạc sĩ khoa học Người hướng dẫn khoa học: Ts. Hoàng Thị Mỹ Nhung Hà Nội - 2009 Lời cảm ơn Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS Hoàng Thị Mỹ Nhung – Bộ môn Tế Bào Mô Phôi và Lý Sinh, Khoa Sinh Học đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu, các phương pháp nghiên cứu khoa học để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban đốc Viện Y học cổ truyền Quân đội, TS. Nguyễn Thị Tuyết Nga và tập thể khoa Nghiên cứu Thực nghiệm, đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Sinh học đặc biệt là các thầy cô giáo thuộc bộ môn Tế Bào Mô Phôi và Lý Sinh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian qua. Cuối cùng, bằng tình cảm chân thành tôi xin gửi lời cảm ơn đến những người thân trong gia đình và bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua. Hà Nội, tháng 12 năm 2009 Tác giả Nguyễn Trung Quân Những chữ viết tắt ACTH Adrenocorticotropic hormone ADN Acid deoxyribonucleic Anti - GAD Glutamic acid decarboxylase antibodies β Tế bào beta- đảo tụy Langerhans CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát dịch bệnh Mỹ) CNT Chuột nhắt trắng Cv Coefficient of variation (Hệ số biến thiên) ĐTĐ Đái tháo đường FDA Food and Drug Administration ICA Islet cells antibodies IDM International Diabetes Mellitus LD50 Lethal dose 50% (Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) MLH Lipid Mobilising Hormon NOD Non-Obese Diabetic STH Somatotropic Hormon STZ Streptozocin (Streptozotocin) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) Mục lục Lời cảm ơn Những chữ viết tắt Mục lục Trang Mở đầu 1 Chương 1- Tổng quan……………………………………………............. 3 1.1. Tổng quan về bệnh ĐTĐ.……………………………........................ 3 1.1.1. Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới và ở Việt Nam…………………... 3 1.1.2. Chẩn đoán và phân loại bệnh ĐTĐ..................................................... 4 1.1.3. Sinh lý bệnh ĐTĐ…………………………….…............................... 6 1.1.4. Thuốc điều trị..………….……………………………...................... 10 1.2. Mô hình bệnh ĐTĐ trên động vật thực nghiệm………...................... 12 1.2.1. Khái lược về mô hình bệnh lý trên động vật thực nghiệm ………... 12 1.2.2. Streptozocin và cơ chế gây mô hình ĐTĐ typ 1..……........................ 13 1.2.3. Alloxan và cơ chế gây mô hình ĐTĐ typ 1………...………………. 16 1.2.4. Mô hình ĐTĐ typ 2……..………………………………................... 19 1.3. Cây Bông ổi (Lantana camara L)…………………………………... 19 1.3.1. Đặc điểm hình thái và phân bố.........…..…………........................... 19 1.3.2. Thành phần hóa học….……………….............................................. 21 1.3.3. Công dụng và tác dụng duợc lý……………………………………. 22 Chương 2- Đối tượng, Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 24 2.1. Đối tượng………………………………………………………...... 24 2.2. Vật liệu, hóa chất…………….......................................................... 24 2.3. Phương pháp nghiên cứu……………………………………........... 25 2.3.1. Thử gây mô hình ĐTĐ typ 1 bằng STZ và Alloxan trên CNT........ 25 2.3.2. Phương pháp thu dịch chiết từ cây Bông ổi….................................. 27 2.3.3. Phương pháp thử độc tính cấp của dịch chiết cây Bông ổi……….. 27 2.3.4. Sàng lọc tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết trên CNT bình thường……………………………………………............................ 28 2.3.5. Thử khả năng dung nạp glucose huyết trên CNT bình thường của dịch chiết Bông ổi………………………………………………….. 29 2.3.6. Thử tác dụng hạ glucose huyết trên CNT gây ĐTĐ typ 1 bằng STZ ……………………………………………………………… 30 2.3.7. Thử tác dụng hạ glucose huyết trên CNT gây ĐTĐ typ 2 bằng STZ và chế độ giàu dinh dưỡng…………………………………………. 31 2.3.8. Phương pháp định lượng glucose huyết…………………………… 32 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu………………………………………… 33 Chương 3- Kết quả và thảo luận……………………………............. 35 3.1. Gây mô hình ĐTĐ typ 1…………………………………………… 35 3.1.1. Gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên CNT bằng alloxan…………………… 35 3.1.2. Gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên CNT bằng STZ………………………. 38 3.2. Thu dịch chiết nghiên cứu và thử độc tính cấp của dịch chiết cây Bông ổi……………………………………………………………. 40 3.2.1. Thu dịch chiết Bông ổi……………………………………………. 40 3.2.2. Thử độc tính cấp dịch chiết cây Bông ổi ………………………… 41 3.3. Thử tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết cây Bông ổi trên CNT 43 3.3.1. Sàng lọc liều có tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết Bông ổi 43 3.3.2. Thử tác dụng dung nạp glucose huyết của dịch chiết Bông ổi trên CNT bình thường……………………………………………………. 46 3.3.3. Thử tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết cây Bông ổi trên mô hình ĐTĐ typ 1 được gây bằng STZ………………………………. 49 3.3.4. Thử tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết cây Bông ổi trên mô hình ĐTĐ typ 2 được gây bằng STZ và chế độ ăn…………..……. 51 Kết luận ……………………...................................................................... 54 Tài liệu tham khảo................................................................................. 55 Mở đầu Tiểu đường (đái tháo đường) là một trong những bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa có mức tăng nhanh chóng trong thời gian gần đây cả về số lượng cũng như chi phí điều trị trở thành gánh nặng về kinh tế và xã hội đối với nhiều quốc gia trên thế giới. Dự báo của các chuyên gia y tế từ những năm 90 của thế kỉ 20 đã và đang trở thành hiện thực “Thế kỉ 21 là thế kỉ của các bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa”. Theo WHO, năm 2025, sẽ có 300-330 triệu người mắc bệnh, chiếm tỷ lệ khoảng 5,4% dân số toàn cầu, trong đó ĐTĐ type 2 chiếm 85-95%. Với tốc độ phát triển nhanh chóng (tăng 170%), bệnh ĐTĐ ở các quốc gia đang phát triển sẽ trở thành “đại dịch”. ở Mỹ, theo thông báo của Trung tâm kiểm soát dịch bệnh CDC, bệnh ĐTĐ tăng 14% trong 2 năm (2003-2005) và cũng là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở Mỹ.[1,5,17] Việt Nam nằm trong số các quốc gia có số người mắc bệnh ĐTĐ tăng nhanh chóng. Số liệu điều tra quốc gia năm 2002-2003 thông báo tỷ lệ mắc bệnh trong cả nước là 2,7%. Hiệp hội ĐTĐ quốc tế và WHO phân loại tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường ở Việt Nam nằm trong khu vực 2 (tỷ lệ 2%-4,99%) cùng với các nước trong khu vực như Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia. [1] Với nhu cầu điều trị và dự phòng ĐTĐ, hàng loạt các thuốc tổng hợp đã được các tập đoàn, các công ty dược phẩm nghiên cứu và phát triển như sulfonylurea, các biguanid, thiazolidindion. Tuy nhiên các thuốc có nguồn gốc tổng hợp không phải là giải pháp tối ưu đối với quốc gia đang phát triển như Việt Nam, lý do đưa ra là giá thành điều trị cao, thuốc tổng hợp có phản ứng phụ với tác dụng không mong muốn. Thuốc có nguồn gốc thảo dược đang được các nước quan tâm và phát triển với ưu điểm là nguồn dược liệu sẵn có, dễ sử dụng, giá thành rẻ, ít tác dụng phụ dễ được cộng đồng chấp nhận, đặc biệt là các nước kém phát triển và đang phát triển. [11,12,17] Để đánh giá hiệu quả tiền lâm sàng của các thuốc có nguồn gốc thảo dược thì cần phải có những nghiên cứu đánh giá tác dụng dược lý. Những nghiên cứu này nhằm sàng lọc đánh giá hiệu quả tiền lâm sàng của các thuốc trước khi đưa vào thử nghiệm lâm sàng. Xây dựng các mô hình bệnh lý để thử thuốc có ý nghĩa quan trọng nhằm đáp ứng những tiêu chuẩn về phát triển các sản phẩm thuốc mới của Bộ Y tế – Việt Nam và WHO. Đã có một số các mô hình ĐTĐ được áp dụng ở Việt Nam, tuy nhiên vẫn cần có sự bổ xung nhằm mục đích hoàn thiện và phong phú các phương pháp đánh giá tác dụng hạ đường huyết của thuốc thảo dược. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài “Tạo mô hình tiểu đường trên chuột nhắt trắng và thử tác dụng hạ đường huyết một số chế phẩm tự nhiên” với các nội dụng chính: - Xây dựng mô hình tiểu đường (ĐTĐ) trên chuột nhắt trắng. - Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết cây Bông ổi (Lantana camara L. ) trên chuột nhắt trắng. Chương 1 Tổng quan tài liệu 1.1. Tổng quan về bệnh ĐTĐ Bệnh ĐTĐ, theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), là một hội chứng có đặc tính biểu hiện bằng tăng glucose máu do hậu quả của việc thiếu hoặc mất hoàn toàn insulin hoặc vì có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin”.[1,39,50] Các chuyên gia thuộc “ủy ban chẩn đoán và phân loại bệnh ĐTĐ Hoa Kỳ” lại đưa ra định nghĩa về ĐTĐ như sau: là một nhóm các bệnh chuyển hóa có đặc điểm là tăng glucose máu, hậu quả của sự thiếu hụt bài tiết insulin; khiếm khuyết trong hoạt động của insulin; hoặc cả hai. Tăng glucose máu mạn tính thường kết hợp với sự hủy hoại, sự tăng rối loạn chức năng và sự suy yếu chức năng của nhiều cơ quan đặc biệt là mắt, thận, thần kinh, tim và mạch máu.[1,26] Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới và Việt Nam * Trên thế giới: ĐTĐ là bệnh không lây nhiễm có tốc độ phát triển nhanh chóng nhất trên thế giới. Điều đáng lo ngại là ĐTĐ tăng nhanh chóng ở các nước đang phát triển. Theo thông báo của IDM: năm 1994 cả thế giới có 110 triệu người mắc bệnh ĐTĐ; đến năm 2000 con số này là 151 triệu người, dự báo đến năm 2010 con số này sẽ là 221 triệu người. [1,42] Bảng 1. Số liệu thông báo về tỷ lệ mắc ĐTĐ năm 1999 của một số quốc gia [1] Nước Dân số (triệu) Số ca TĐ (triệu) Tỷ lệ % Typ 1 (triệu) Typ 2 (triệu) Thái Lan 62 4,0 6,7 0,046 1,8 Mỹ 250 10 4,0 0,75 9,0 ấn Độ 1200 38 4,0 0,176 38 Hồng Kông 6,0 0,24 4,0 0,007 0,23 Pakistan 160 4,6 3,0 0,4 4,2 Đài Loan 20 0,424 2,1 0,004 0,04 Trung Quốc 1300 24 2,0 1,2 23 Indonesia 210 2,7 1,3 0,009-0,036 1,8-3,6 WHO dự tính đến năm 2025 sẽ có 300-330 triệu người mắc bệnh ĐTĐ chiếm 5,4% dân số toàn cầu, còn theo Quỹ ĐTĐ thế giới (WDF) sẽ khoảng 300-339 triệu. Trong đó ở các nước phát triển tăng 42%; các nước đang phát triển tăng 170%. Theo CDC, ở Mỹ bệnh ĐTĐ tăng 14% trong 2 năm, từ 18,2 triệu người mắc bệnh ĐTĐ năm 2003 đến 20,8 triệu người năm 2005.[42] Số liệu thống kê của WHO cho thấy ĐTĐ typ 2 chiếm 85-95% tổng số người mắc bệnh ĐTĐ. Nghiên cứu sàng lọc ở Nhật Bản và Trung Quốc cho thấy, tỷ lệ ĐTĐ typ 2: ĐTĐ typ 1 ở lứa tuổi học sinh trung học là 4:1.[1,50] * ở Việt Nam Kết quả điều tra quốc gia năm 2002-2003 về tình hình ĐTĐ [1] cho thấy: - Tỷ lệ ĐTĐ toàn quốc là 2,7%, trong đó ĐTĐ ở nữ là 3,7%, ở nam là 3,3%. - Xét theo khu vực thì vùng đô thị và khu công nghiệp có tỷ lệ mắc ĐTĐ là 4,4% trong khi ở vùng núi cao tỷ lệ này là 2,1%. - Tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ ở nhóm đối tượng có yếu tố nguy cơ, tuổi từ 30-64 chiếm tỷ lệ cao 10,5%. Tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose là 13,8%. Theo phân loại của Hiệp hội Đái tháo đường quốc tế và WHO, tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ của Việt Nam nằm trong khu vực 2 (tỷ lệ 2-4,99%) cùng với các nước trong khu vực như Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia thấp hơn so với các nước khu vực 3 (5%-7,99%) như Nhật Bản, Hàn Quốc, Singapore. [1] Chẩn đoán và phân loại bệnh ĐTĐ a) Chẩn đoán: Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh ĐTĐ, được Hiệp hội ĐTĐ Mỹ kiến nghị năm 1997 và được nhóm các chuyên gia về bệnh ĐTĐ của WHO công nhận vào năm 1998, tuyên bố áp dụng vào năm 1999 với 3 tiêu chí: (1) Có các triệu chứng của ĐTĐ lâm sàng; mức glucose huyết tương ở thời điểm bất kì ≥ 11,1mmol/l (200mg/dl). (2) Mức glucose huyết tương lúc đói ≥ 7,0mmol/l (126mg/dl) (3) Mức glucose huyết tương ≥ 11,1mmol/l (200mg/dl) ở thời điểm 2 giờ sau nghiệm pháp dung nạp glucose bằng đường uống 75 gam đường (loại anhydrous) hoặc 82,5 gam đường (loại monohydrat). [1,18] Bảng 2. Tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ theo IDM năm 2005. [1] Đặc điểm ĐTĐ typ 1 ĐTĐ typ 2 Khởi phát Rầm rộ, kết hợp nhiều triệu chứng Chậm, thường không có triệu chứng Biểu hiện lâm sàng - Sút cân nhanh chóng - Đái nhiều - Uống nhiều nước - Thể trạng béo - Tiền sử gia đình có người mắc bệnh đái tháo đường typ 2. - Đặc tính dân tộc , có tỷ lệ mắc bệnh cao. - Chứng gai đen (Acanthosis nigricans) - Hội chứng buồng trứng đa nang Nhiễm ceton Dương tính Thường không có C-peptid Thấp/mất Bình thường hoặc tăng Kháng thể - ICA dương tính - Anti-GAD dương tính - ICA âm tính - Anti-GAD âm tính Điều trị - Bắt buộc dùng insulin - Thay đổi lối sống - Dùng các thuốc hạ glucose máu bằng đường uống. - Dùng insulin Kết hợp với bệnh tự miễn khác Có Không b) Phân loại: * ĐTĐ typ 1 Phân loại theo hình thái miễn dịch - Typ 1a: Chiếm 80%, thể này có các loại tự kháng thể kháng tế bào đảo tụy thoáng qua ngay từ lúc khởi đầu của bệnh. Loại này ít khi kết hợp với một bệnh tự miễn dịch nào khác, thường có các typ HLA – B15, HLA –DR4. Thường xảy ra sau khi bị nhiễm virus gây phá hủy tế bào β. - Typ 1b: Các kháng thể kháng tế bào đảo tụy dai dẳng với hàm lượng cao. Thường kết hợp với các rối loạn miễn dịch khác như bệnh lý tuyến giáp; bệnh tuyến vỏ thượng thận; giảm chức năng tuyến sinh dục; thiếu máu ác tính. Đa số người bệnh là nữ giới có typ HLA- B8 và HLA- DR3. Phân loại theo diễn biến lâm sàng - ĐTĐ typ 1 thể không phụ thuộc insulin (thoáng qua) - ĐTĐ phụ thuộc insulin. * ĐTĐ typ 2 - Những rối loạn không đồng nhất biểu hiện bằng giảm nhạy cảm với insulin ở gan, cơ vân, mô mỡ và sự suy chức năng của của tế bào β, dẫn tới rối loạn bài tiết insulin. * ĐTĐ typ 1 không qua trung gian miễn dịch Đây là những trường hợp ĐTĐ thiếu insulin nhưng không có bằng chứng tự miễn. Thể bệnh này có yếu tố di truyền rất rõ. Đặc điểm lâm sàng là có những đợt thiếu insulin xen lẫn những giai đoạn bình thường. [1] 1.1.3. Sinh lý bệnh ĐTĐ a). Điều hòa cân bằng glucose máu Trong điều kiện sinh lý bình thường, glucose máu khoảng 5,6 mmol/l (100mg/dl). Khi cơ thể sử dụng nhiều glucid (lao động nặng, hưng phấn thần kinh, sốt,…) glucose máu có thể lên tới 6,7 – 8,3 mmol/l (120 – 150 mg/dl). Trong trạng thái ngủ nghỉ glucose máu có thể giảm tới 4,5 mmol/l (80mg/dl). Nếu vượt quá 8,9 mmol/L (160mg/dl) thì glucose bị đào thải qua thận, nếu giảm xuống dưới 3,3 mmol/L (60mg/dl) thì các tế bào thiếu năng lượng, có thể dẫn tới hôn mê. Bằng cơ chế điều hòa, cơ thể người bình thường được duy trì lượng glucose máu trong khoảng 4,5 – 6,7 mmol/l (80-120mg/dl). Cơ chế điều hòa được kiểm soát bởi hệ nội tiết và hệ thần kinh [18]. * Vai trò điều hòa của hệ nội tiết Một số nội tiết tố có tác dụng lên enzym chuyển hóa glucid qua đó tác động đến sự cân bằng glucose huyết. Có hai nhóm nội tiết tố kiểm soát đối lập nhau: - Insulin làm giảm glucose máu - Tập hợp các nội tiết tố và các chất làm tăng glucose máu • Insulin: Insulin do tế bào β của đảo tụy Langerhans tiết ra có tác dụng làm giảm glucose máu. Insulin là một protein gồm 51 acid amin, được chia thành 2 chuỗi alpha (21 acid amin) và β (gồm 30 acid amin), được nối với nhau bằng các cầu nối S – S. Thời gian bán hủy của insulin là 3- 5phút. Trung bình mỗi ngày tụy tiết ra 40-50 đơn vị insulin (IU), để đảm bảo nồng độ glucose trong máu được duy trì giới hạn từ 4,4-5,3 mmol/l (80-95 mg/dl). Nồng độ insulin cơ bản trong huyết tương cũng đảm bảo sự bài tiết glucose của gan với tỷ lệ 1,9-2,1mg/kg/phút. [1,18] Bảng3 . Tóm tắt vai trò sinh lý của insulin Tình trạng insulin cao (sau ăn) Tình trạng insulin thấp (lúc đói) Gan Thu nhận glucose Tổng hợp glycogen Tổng hợp lipid Mất khả năng tạo thể ceton Mất khả năng tổng hợp glycogen Sản xuất glucose Phân hủy glucogen Mất khả năng tạo mỡ Tổng hợp thể ceton Phân hủy glycogen Cơ Thu nhận glucose Oxy hóa glycose Tổng hợp glycogen Tổng hợp protein nền Mất khả năng thu nhận glucose Oxy hóa acid béo, thể ceton Phân hủy glycogen Phân hủy protein và tiết acid amin Mô mỡ Thu nhận glucose Tổng hợp lipid Thu nhận Triglycerid Mất khả năng thu nhận glucose Phân hủy lipid và bài tiết acid béo tự do Mất khả năng nhận triglyceride • Hệ đối kháng với insulin: Có tác dụng làm tăng glucose máu Adrenalin: kích thích tạo AMP vòng của tế bào đích, tăng hoạt hóa enzym phosphorylase ở gan làm tăng thoái hóa glucogen tạo glucose. Glucagon: tác dụng tương tự như adrenalin nhưng mạnh hơn và kéo dài hơn. Glucagon còn kích thích phân hủy mỡ do enzym lipase được hoạt hóa bởi AMP vòng. Glucocorticoid: ngăn cản glucose thấm vào tế bào (trừ tế bào não). Tăng hoạt hóa G-6-phosphatase làm tăng giải phóng glucose ở gan vào máu. Tăng tân tạo glucose từ protid. Thyroxin: tăng hấp thu đường ở ruột, tăng phân hủy glycogen. STH: tăng thoái hóa glycogen bằng cách ức chế enzym hexokinase. STH còn hoạt hóa insulinase. Insulinase và kháng thể chống insulin: trực tiếp phân hủy insulin. Hình 1. Kiểm soát tiết insulin trong tế bào beta * Vai trò của hệ thần kinh Đến nay các nhà khoa học đã phát hiện được hai trung tâm (A và B) ở vùng dưới đồi tham gia điều hòa glucose huyết thông qua hormon: - Trung tâm A: gồm những tế bào thần kinh, không có mặt của insulin vẫn thu nhận được glucose từ máu. Trung tâm này đại diện cho các tế bào không cần insulin vẫn thu nhận được glucose như: tế bào não, gan, hồng cầu. Khi glucose máu giảm xuống dưới 4,5mmol/l thì trung tâm A bị kích thích làm tăng tiết glucagon, adrenalin, ACTH, LMH để tăng tạo glucose đạt được nồng độ 5,6 mmol/l. - Trung tâm B: Đại diện cho các tế bào còn lại của cơ thể, phải có insulin mới thu nhận được glucose. Các tế bào loại này sử dụng được thể ceton như là một nguồn năng lượng bổ xung quan trọng. Khi thiếu insulin, trung tâm B sẽ huy động mọi cơ chế nội tiết làm tăng glucose máu, đủ thấm vào tế bào nhờ sự chênh lệch lớn về nồng độ glucose trong và ngoài tế bào. Tuy nhiên sự chênh lệch này phải đủ lớn (tăng gấp 4 lần bình thường) mới xảy ra sự khuếch tán. Nhưng khi đó thì cũng có lượng lớn glucose bị thận đào thải (gặp trong bệnh tiểu đường thiếu hụt insulin). [18] b). Cơ chế bệnh sinh ĐTĐ * Cơ chế bệnh sinh ĐTĐ typ 1 - Do yếu tố di truyền kém sản xuất insulin, phát bệnh tự nhiên, ít phụ thuộc vào điều kiện môi trường. Các gen có liên quan là HLA-DR3, HLA-D4 và DQW-8, còn gen kháng là HLA-DRW2, B7.[18] Bệnh gặp ở 0,2-0,5% số người trong quần thể và chiếm 5-10% số người mắc bệnh tiểu đường. Các giai đoạn trong ĐTĐ typ 1: - Giai đoạn 1. Bản chất di truyền – nhạy cảm gen - Giai đoạn 2. Khởi phát quá trình tự miễn. - Giai đoạn 3. Phát triển một loạt các kháng thể - Giai đoạn 4. Tổn thương chức năng tế bào β đảo tụy - Giai đoạn 5. Đái tháo đường lâm sàng, phá hủy hoàn toàn hoặc gần như hoàn toàn tế bào β đảo tụy. Biểu hiện lâm sàng là ĐTĐ phụ thuộc insulin có kèm biến chứng. [1] * Cơ chế bệnh sinh ĐTĐ typ 2 Sinh bệnh học ĐTĐ typ 2 diễn tiến qua 3 giai đoạn: Giai đoạn 1. Nồng độ glucose máu vẫn ở mức bình thường, nhưng có hiện tượng kháng insulin vì mức insulin tăng cao hơn mức bình thường trong máu. Giai đoạn 2. Tình trạng kháng insulin có xu hướng nặng dần và xuất hiện tăng glucose huyết sau bữa ăn. Giai đoạn 3. Sự kháng insulin không thay đổi, nhưng bài tiết insulin suy giảm và gây tăng glucose huyết lúc đói. Bệnh ĐTĐ biểu hiện ra bên ngoài. Hình 2. Các giai đoạn tiến triển của ĐTĐ typ 2 [17] Trong số các yếu tố môi trường đóng vai trò thúc đẩy sự phát triển bệnh thì béo phì là yếu tố thường được đề cập nhất. Béo phì làm gia tăng tình trạng kháng insulin. Nhiều bằng chứng cho thấy kiểm soát tốt tình trạng tăng cân béo phì sẽ làm giảm đáng kể tình trạng kháng insulin và kiểm soát glucose huyết tốt. [1,17] Tóm lại sự thiếu hụt trong bài tiết insulin và tình trạng kháng insulin là nguyên nhân gây ĐTĐ typ 2 và béo phì là yếu tố thúc đẩy phát triển bệnh. 1.1.4. Thuốc điều trị ĐTĐ Trước sự phát triển nhanh chóng của bệnh ĐTĐ, nhu cầu thuốc điều trị là rất lớn. Trên thị trường hiện nay có nhiều loại thuốc khác nhau chủ yếu là các thuốc có nguồn gốc tổng hợp và bán tổng hợp, dựa vào tác dụng và cơ chế có thể chia thành 3 nhóm sau đây: - Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin. - Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin. - Các thuốc chống tăng glucose huyết sau bữa ăn. a) Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin - Insulin điều hòa glucose huyết chủ yếu tại các mô đích là gan, cơ và mô mỡ. Sau khi bài tiết, insulin đến các mô đích gắn vào thụ thể (receptor) đặc hiệu là một glycoprotein gồm hai đơn vị α (nằm ngoài tế bào) và hai đơn vị β (nằm trong tế bào) được nối với nhau bằng cầu nối disulfid. Insulin gắn vào phần thụ thể α, kích thích tyrosin kinase của thụ thể β trong tế bào, khởi động chuỗi phản ứng làm tăng tính thấm màng tế bào với glucose, giúp glucose vận chuyển vào tế bào nhanh hơn. Sau khi vào tế bào, glucose được phosphoryl hóa thành glucose- 6 phosphat (G6P); từ đó G6P chuyển thành glycogen dự trữ hoặc tiếp tục bị oxy hóa để cung cấp năng lượng cho cơ thể. Các thuốc kích thích bài tiết insulin: - Các nhóm sulfonylurea: gắn vào các thụ thể của nó ở các tế bào β đảo tụy làm chẹn kênh K, gây khử cực màng tế bào. Kênh Ca2+ phụ thuộc điện thế mở ra cho phép Ca2+ vào trong tế bào. Nồng độ Ca2+ trong tế bào tăng khởi động vận chuyển các hạt chứa insulin đến bề mặt tế bào và giải phóng insulin ra ngoài. Trong nghiên cứu này cũng sử dụng gliclazid (Diamicron) liều 19,2mg/kg chuột tương đương với liều 80mg dùng cho người làm thuốc đối chứng dương. [6,11,13] - Nhóm Nateglinid (Starlig): Trong cơ thể nateglinid gắn vào thụ thể đặc hiệu (SUR 1) ở tế bào beta đảo tụy làm chẹn kệnh Ca2+, Ca2+ từ ngoài vào trong tế bào kích thích giải phóng insulin. [1,17] b) Các thuốc làm tăng nhạy cảm của mô đích với insulin - Các thuốc nhóm biguanid: ức chế tân tạo glucose tại gan, tăng tổng hợp glycogen. Cải thiện khả năng hấp thu glucose ở các tế bào đích (tế bào cơ và tế bào mỡ). Tác động trực tiếp lên các chất vận chuyển (GLUT1 và GLUT4) tăng khả năng vận chuyển glucose vào tế bào. - Các thuốc nhóm thiazolidinedion: thuốc cải thiện tình trạng kháng insulin, tăng tổng hợp glycogen và giảm sản xuất glucose ở gan. Thiazolidindion là chất đồng vận chọn lọc trên receptor gamma tăng sinh - hoạt hóa peroxisom nhân điều hòa gen chuyển hóa lipid và glucid kiểm soát chuyển hóa tại mô đích (cơ, mỡ). Thiazolidin đòi hỏi sự có mặt của insulin. c) Thuốc chống tăng glucose huyết sau bữa ăn Acarbose là thuốc ức chế enzym α- glucosidase của tế bào niêm mạc ruột. Do tác dụng ức chế enzym này, thuốc làm giảm hoặc chậm lại quá trình hấp thu tinh bột, dextrin và các disaccharid ở ruột non, tránh được tình trạng tăng glucose huyết sau ăn. Ngoài ra thuốc còn ức chế cạnh tranh glucoamilase, sucrase. * Nhóm thuốc thảo dược: - Nhiều thuốc tân dược được sử dụng điều trị ĐTĐ có hiệu quả tốt tuy nhiên hầu hết các thuốc đều có tác dụng phụ không mong muốn khi sử dụng trong thời gian dài do vậy phát triển thuốc có nguồn gốc từ thảo dược là điều tất yếu. Trong nước có nhiều nghiên cứu chứng minh được hiệu quả hạ glucose huyết trên thực nghiệm của một số loại thảo dược như: quả chuối hột (Musa balbisiana) [15], hoa của cây Cơm cháy tròn (Sambucus nigra ssp. canadensis (L.) R. Bolli)[4], quả Dứa dại (Pandanus odoratissimus L.)[12], cây Dừa cạn (Catharanthus roseus)[14], Rễ cây Chóc máu (Salacia cochinchinensis)[11], Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa (L.) Pers.)[6,7], Thổ phục linh (Smilax glabrra) [17]v.v…[10] 1.2. Mô hình bệnh ĐTĐ trên động vật thực nghiệm 1.2.1. Khái lược về mô hình bệnh lý trên động vật thực nghiệm Mô hình động vật là mô hình mà ở đó động vật được gây bệnh hoặc tổn thương tương tự như trên người. Những điều kiện thử nghiệm này thường được gọi là mô hình bệnh lý trên động vật. Việc sử dụng các mô hình động vật cho phép các nhà nghiên cứu thực hiện các thử nghiệm tiền lâm sàng, để bảo đảm an toàn cho các nghiên cứu lâm sàng. Để có một mô hình phù hợp phản ánh một cách xác thực, các bệnh được mô hình hóa phải tương tự về nguyên nhân và cơ chế gây bệnh giống như ở người. Mô hình động vật thường được sử dụng trong nghiên cứu y sinh học (nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh, hoặc trong chẩn đoán, điều trị hoặc phát triển các thuốc nghiên cứu mới). Các mô hình bệnh lý trên động vật có thể có bản chất tự nhiên hoặc được gây ra bằng các tác nhân vật lý, hóa học hoặc sinh học. Ví dụ như: - Dùng metrazol (pentylenetetrazol) trong mô hình bệnh động kinh. - Làm tắc động mạch não giữa để gây mô hình bệnh đột quỵ. - Tiêm virus hoặc vi khuẩn gây mô hình nhiễm khuẩn hoặc các bệnh cúm. - Sử dụng các tia ion phóng xạ để gây khối u. - Chọn lọc di truyền chuột NOD gây mô hình ĐTĐ đường. - Cắt buồng trứng để gây bệnh loãng xương. - Dùng Plasmodium yoelii gây mô hình bệnh sốt rét. Việc nghiên cứu và ứng dụng các mô hình bệnh lý trên các loài động vật (khỉ, chó, mèo, thỏ, chuột cống, chuột nhắt trắng…) đã trở nên phổ biến đặc biệt là trong nghiên cứu y dược học. [20,48] Một số các lĩnh vực khác cũng sử dụng mô hình động vật cho các nghiên cứu của mình như tâm lý học, xã hội học quan sát hành vi động vật (mô hình hành vi). Hiện nay các nhà nghiên cứu đã phát triển rất nhiều các phương pháp khác nhau trên cùng một loại mô hình bệnh nhằm tìm ra các mô hình phù hợp nhất và gần nhất với các trường hợp bệnh lý trên người. 1.2.2. Mô hình ĐTĐ typ 1 ĐTĐ typ 1 là do sự tổn thương tế bào beta đảo tụy (do tự miễn) các mô hình ĐTĐ cũng được phát triển dựa trên nguyên tắc trên. Mô hình ĐTĐ typ 1 được xây dựng bằng nhiều con đường nhưng cơ bản có 2 phương pháp phổ biến: * Gây ĐTĐ typ 1 bằng hóa chất: Alloxan: - Chuột cống (40-200mg/kg theo đường tiêm tĩnh mạch hoặc màng bụng). - Chuột nhắt (50-200mg/kg theo đường tiêm tĩnh mạch hoặc màng bụng). - Thỏ (100-150 mg/kg tiêm màng bụng). - Chó (50-75 mg/kg tiêm màng bụng). [45] Streptozocin: - Chuột cống (35-65mg/kg tiêm màng bụng hoặc tĩnh mạch). - Chuột nhắt (100- 200mg/kg tiêm màng bụng hoặc tĩnh mạch). - Chuột Hamster (50 mg/kg tiêm màng bụng). - Chó (20-30 mg/kg tiêm tĩnh mạch). [45] * Gây ĐTĐ typ 1 bằng phương pháp lai tạo và chọn lọc giống Có 5 mô hình trên động vật được gây ĐTĐ typ 1 bằng phương pháp lai tạo và chọn lọc giống: - Chuột nhắt NOD (nonobese diabetic). - Chuột cống BB (Bio-Breeding) - Chuột cống LETL (Long Evans Tokushima Lean) - Chuột cống KDP (Komeda diabetes Prone) - Chuột cống LEW-iddm (Lew- insulin dependent diabetes mellitus). [20, 22,29,32,45] Trong khuôn khổ cho phép của luận văn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu gây mô hình bệnh ĐTĐ typ 1 bằng hóa chất (alloxan và streptozocin). a) Streptozocin và cơ chế gây mô hình ĐTĐ typ 1 Streptozocin còn có tên khác là Streptozotocin, N-(Methylnitrosocarbamoyl) - α - D - glucosamine. * Tính chất vật lý & hóa học: - STZ gồm hai chuỗi α và β – stereoisomers. Tinh thể màu hơi vàng, trắng đục, hòa tan trong nước, ketone, cồn thấp độ, ít tan trong dung môi hữu cơ phân cực, không tan trong dung môi hữu cơ không phân cực. Chất tinh khiết dễ hút ẩm không khí và nhạy cảm với ánh sáng. STZ phân hủy thành diazomethane trong dung dịch kiềm ở 00C. - Công thức mạch thẳng: C8H15N3O7 - Trọng lượng phân tử: 265,22 g/mol - Thời gian bán hủy: 5- 15 phút Hình 3. Cấu trúc hóa học của streptozocin * Lịch sử phát triển Streptozocin là một kháng sinh được phân lập vào cuối thập niên 50 của Thế kỉ 20. Thuốc được các nhà nghiên cứu công ty Dược Upjohn (một công ty của Pfizer) ở Michigan phát hiện từ một chủng nấm sợi Streptomyces achromogenes có trong mẫu đất lấy ở bang Kansas (Mỹ). Upjohn đăng kí phát minh và bản quyền vào tháng 8 – năm 1958 và được trao giấy chứng nhận số U.S. Patent 3.027.300 tháng 3 năm 1962. Giữa thập niên 60 (TK20) các nhà khoa học đã phát hiện ra tính độc chọn lọc của STZ đối với các tế bào beta đảo tụy, trong khi các tế bào này lại điều tiết nồng độ glucose huyết bằng cách tiết ra các hormon insulin. Đây là một gợi ý sử dụng thuốc để gây mô hình ĐTĐ typ 1, và điều trị ung thư tụy. Năm 1982, FDA đã trao giấy phép lưu hành thuốc điều trị ung thư tế bào đảo tụy dưới tên thương mại là Zanosar. [35] Hình 4. Streptozocin của hãng Sigma * Tác dụng: - STZ chủ yếu được sử dụng trong điều trị ung thư tế bào đảo tụy di căn. STZ cũng hiệu quả trong điều trị u ác tính tế bào ưa bạc. - STZ được ứng dụng để gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên động vật thực nghiệm nhằm nghiên cứu các thuốc, chế phẩm điều trị bệnh ĐTĐ. - STZ cũng được nghiên cứu làm thuốc kháng sinh nhưng không được dùng cho mục đích thương mại. * Cơ chế hoạt động của STZ: - Khi được hấp thụ vào các tế bào beta, STZ được phân cắt thành glucose và một nửa còn lại là methylnitrosourea. Vì có tính alkyl hóa nên tác động tới các đại phân tử sinh học (ADN) dẫn tới phá hủy tế bào beta. Đích hướng tới là các ADN ty thể, qua đó tác động đến các chức năng tín hiệu quá trình trao đổi chất trong ty thể của tế bào beta, điều này cũng giải thích STZ có khả năng ức chế tiết insulin. - Tính chọn lọc của STZ với tế bào beta: STZ là chất đồng đẳng nitrosourea trong đó N- methyl-N-nitrosourea được liên kết với C-2 của hexose. Nitrosoure tan trong lipid nên được hấp thụ dễ dàng vào mô qua màng sinh chất, kết quả của việc thay thế hexose là STZ ít tan trong lipid. STZ được tích lũy chọn lọc trong tế bào beta đảo tụy qua kênh vận chuyển glucose GLUT2 ái lực thấp nằm trong màng sinh chất. Do vậy những tế bào không biểu hiện kênh vận chuyển glucose sẽ kháng với STZ. Quan sát này cũng giải thích độc tính của STZ lớn hơn so với N-methy-N-nitrosourea trong các tế bào xuất hiện kênh vận chuyển GLUT2 kể cả khi 2 chất này đều alkyl hóa ADN tương tự nhau. - Tính độc của STZ đối với tế bào beta: tính độc của STZ phụ thuộc vào hoạt tính alkyl hóa ADN của nhóm methylnitrosourea, đặc biệt là vị trí O6 của guanine. Sự vận chuyển của các nhóm methyl từ STZ tới các phân tử ADN gây nên tổn thương kéo theo một loạt chuỗi sự kiện khác kết quả là dẫn tới bẻ gãy các phân tử ADN. Sự glycosyl hóa protein có thể cũng đóng góp thêm một yếu tố tổn thương. Trong nỗ lực sửa chữa ADN , các enzym poly (ADP-ribose) polymerase bị kích thích quá mức dẫn tới làm giảm dự trữ NAD+ (sau đó là ATP). Sự suy kiệt trong dự trữ năng lượng của tế bào góp phần làm tế bào beta bị phân hủy. [35] Hình 5. Sơ đồ hoạt động của STZ [35] - Tính độc của STZ còn được biểu hiện ở con đường thứ 2 khi STZ tạo ra nitric oxide (NO) làm tổn thương ADN và ức chế chu trình Krebs. NO ức chế hoạt tính của enzym aconitase, đồng thời tăng cường loại bỏ gốc phosphate của ATP sẽ bổ xung cơ chất cho xanthine oxidase và tăng cường sản xuất axit uric. Xanthine oxidase tiếp tục xúc tác phản ứng tạo thành anion superoxyde (O2-), hydrogen pereoxide (H2O2) và gốc (OH-). Các dạng oxy phản ứng (reactive oxygen species) này cũng tập trung phá hủy ADN dẫn tới sự huy động các enzym sửa chữa ADN và mất NAD+ ,giảm dự trữ ATP dẫn tới sự phá hủy tế bào beta. Cũng có nghiên cứu chứng minh được sự giảm NAD+ cũng dẫn tới sự ức chế sinh tổng hợp và tiết insulin ở tế bào beta. [35] b) Alloxan và cơ chế gây mô hình ĐTĐ typ 1 Alloxan còn có tên khác là Mesoxalylurea 5- Oxobarbituric acid. * Tính chất vật lý & hóa học: - Công thức mạch thẳng: C4H2N2O4 .H2O - Trọng lượng phân tử: 160,01 g/mol - Tan trong nước. - Thời gian bán hủy: 1,5 phút. Hình 6. Cấu trúc hóa học của alloxan * Lịch sử phát triển: Alloxan được Brugnatelli phân lập lần đầu tiên vào năm 1818. Nhưng cho đến năm 1838, Friedrich Wohler và Justus Liebig mới công bố trong nghiên cứu về bản chất acid uric và những bổ xung về phân tích hóa học chi tiết các chất mới gồm có alloxan, alloxantin, uramil, dialuric và murexide. Năm 1943, Dunn, Sheehan và McLetchie (Trường Đại học Glasgow) báo cáo alloxan gây ra sự phá hủy tế bào đảo tụy ở thỏ. Mặc dù trước đó đã có những phát hiện về sự tăng glucose huyết khi sử dụng alloxan nhưng không được công bố, và thiếu những nghiên cứu kiểm chứng. Rất nhiều các nghiên cứu sau này đã chứng minh alloxan là hợp chất thích hợp gây ĐTĐ trên động vật thực nghiệm. Động vật được gây ĐTĐ bằng alloxan có những biểu hiện lâm sàng giống biểu hiện ĐTĐ lâm sàng trên người: sút cân, uống nhiều nước, đái nhiều, có đường trong nước tiểu, keton niệu, glucose máu và keton máu. [21,26,35] Hình 7. Alloxan của hãng Sigma * Tác dụng: - Alloxan được ứng dụng để gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên động vật thực nghiệm nhằm nghiên cứu các thuốc, chế phẩm điều trị bệnh ĐTĐ. *Cơ chế hoạt động: Cấu tạo của alloxan gần giống với cấu tạo phân tử glucose do đó alloxan được vận chuyển vào tế bào beta nhờ protein vận chuyển glucose GLUT2 (Glucose transporter 2). Tại đó, alloxan gây ra hai tác động sinh lý: Hình 8. Các phản ứng tạo ra các dạng oxy hoạt động gây độc tế bào β A, alloxan; AH•, gốc tự do alloxan; AH2, dialuric acid; GS•, gốc glutathione; GSSG, glutathione bị oxy hóa; OH•, gốc tự do hydroxyl; O•-, gốc superoxide. [35] - ức chế chọn lọc tiết insulin thông qua ức chế đặc hiệu enzym glucokinase (enzym nhạy cảm glucose của tế bào beta). - Gây ra trạng thái tiểu đường phụ thuộc insulin thông qua sự hình thành ROS (reactive oxygen species), dạng oxy phản ứng trong chuỗi phản ứng khử. Khi có mặt của các thiol nội bào đặc biệt là các glutathione, alloxan tạo ra các dạng oxy phản ứng trong chuỗi phản ứng khử với sản phẩm khử của nó là acid dialuric. Acid này tự oxy hóa tạo thành các gốc superoxide, hydro peroxide, gốc hydroxyl. Những gốc hydroxyl này gây nên sự phân hủy tế bào beta.[35] 1.2.3. Mô hình ĐTĐ typ 2 ĐTĐ typ 2 là sự rối loạn phức hợp liên quan đến các yếu tố di truyền, dịch tễ học, sự phát triển và môi trường của mỗi cá thể. Gây mô hình ĐTĐ typ2 thường dựa trên chế độ dinh dưỡng, hóa chất và yếu tố di truyền (gen), kết quả làm tăng glucose huyết và kháng insulin ở mô ngoại biên. [37] a) Chế độ dinh dưỡng kết hợp với hóa chất Chuột được nuôi bằng chế độ dinh dưỡng giàu lipid, glucid trong một thời gian dài (khoảng 4 tuần- 8 tuần), sau đó được tiêm STZ liều thấp (25-60mg/kg). Các chuột này có đặc điểm tăng glucose huyết không nhiều, đặc điểm nổi bật là sự tăng tiết insulin và được gọi là chuột Fat/feed. Mục đích của phương pháp này là tạo mô hình thiếu hụt và kháng insulin, mô phỏng theo kiểu ĐTĐ typ 2 ở người. [36,37,41,45,46] b) Hóa chất STZ kết hợp với Nicotinamide Gần đây, một mô hình gây ĐTĐ typ 2 được phát triển bằng cách kết hợp giữa STZ và nicotinamid điều trị trên chuột cống. Chuột cống được tiêm nicotinamid (180-230mg/kg, tiêm màng bụng) 15-30 phút trước khi tiêm STZ (50-65 mg/kg, tiêm tĩnh mạch) tăng glucose máu ổn định và từ từ mà không có sự thay đổi về nồng độ insulin máu. Do nicotinamide là một chất chống oxi hóa bảo vệ tế bào bằng hoạt tính dọn gốc tự do (STZ sinh ra gốc tự do) và hạn chế tổn thương tế bào beta đảo tụy trong ĐTĐ typ 2. [45] c) Chọn lọc và lai tạo Một số cá thể thuộc chủng chuột cống Wistar, chuột nhắt KK… có biểu hiện rối loạn dung nạp glucose và tăng glucose huyết và kháng insulin mạnh trong tự nhiên. Nhằm tạo ra các chủng chuột có biểu hiện tăng glucose huyết và kháng insulin mạnh, các nhà nghiên cứu đã lai tạo giữa chuột nhắt chủng KK có rối loạn dung nạp glucose với chuột béo bệu lông vàng, tạo ra con lai KK-Ay có glucose huyết tăng cao và kháng insulin mạnh. [17, 21,23, 29] Ngoài ra còn có chuột nhắt ob/ob(obese), db/db(diabetes), chuột cống ZDF (Zucker diabetic fatty), chuột cống GK (Goto-kakiraki)…[45] Trong luận văn này chúng tôi nghiên cứu gây mô hình bệnh ĐTĐ typ 2 trên CNT bằng chế độ dinh dưỡng cao cùng với hóa chất streptozocin liều thấp. 1.3. Cây Bông ổi Cây Bông ổi hay còn được gọi là Hoa ngũ sắc, Trâm anh, Trâm hôi, Tứ quý, Cây hoa cứt lợn, Mã anh đơn, Nhá khí mu (Tày) có tên khoa học Lantana camara L. hay Lantana. aculeata L., Lantana camara L. var. aculeata Mold thuộc họ Cỏ roi ngựa Verbenaceae. [2,8,9] 1.3.1. Đặc điểm hình thái và phân bố * Đặc điểm hình thái: Cây nhỏ, dạng bụi, cao 1-2 m. Thân vuông, phủ lông nháp và có gai gập xuống. Cành vươn dài, lá mọc đối hình trái xoan, dài 3-9cm, rộng 3-6 cm, gốc tròn hoặc hình tim, đầu nhọn, mép khía răng đều, mặt trên sẫm bóng, phủ lông cứng, mặt dưới nhạt có lông mềm. Cụm hoa mọc ở kẽ lá và đầu cành, là những bông co lại thành đầu giả hình cầu, đường kính 1-3cm. lá bắc dạng lá; hoa không cuống, màu đỏ, trắng, vàng, tím, da cam xen kẽ. Đài hình chuông, có lông; tràng có ống hình trụ hẹp, 4-5 cánh tròn, có hai môi không rõ; nhị 4-5; bầu nhẵn. Quả hạch, hình cầu, vỏ ngoài nạc bao bọc trong đài. Mùa hoa quả: tháng 4-9. [2,9] Hình 9. Cây Bông ổi (Lantana camara L.) * Phân bố: Chi Latana L. có khoảng 150 loài trên thế giới. Phần lớn là cây bụi, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Mỹ. Một số loài ở vùng nhiệt đới châu Phi và ấn Độ. Vùng Đông Nám á có 2 loài có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ là Bông ổi (Lantana camara L.) và Bông ổi ba lá (Latana trifolia L.) ở Việt Nam, chi Latana L. chỉ có một loài là cây Bông ổi, chưa rõ thời điểm du nhập. Cây mọc tự nhiên khắp nơi, nhất là các tỉnh trung du và vùng đồi thấp ven biển. Độ cao phân bố của cây lên tới 600m. * Sinh thái: Bông ổi là cây ưa sáng, chịu hạn và có thể sống được trên nhiều loại đất. Cây thường mọc rải rác trong các quần thể cây bụi ở đồi, ven đường đi, ven rừng hoặc bờ nương rẫy. Cây mọc ở nơi có nhiều ánh sáng thường ra hoa quả nhiều . Cây có thể được trồng bằng hạt, có khả năng tái sinh tốt. 1.3.2. Thành phần hóa học *Lá cây Bông ổi: Lá chứa 0,2% tinh dầu với các hợp chất sesquiterpen, có thể là caryophylen và L-α-phelandren (10-12%). Lá còn chứa các chất triterpen, acid oleanonic, Lantaden A, Lataden B, lantaden C, acid lantanolic, icterogenin, acid 22- β- acetocylantic, acid lantic, acid 22-β- dimethylacryloyl – oxylantanolic, 5- glycosid phenylpropanoid verbacosid, isonuomiosid A và calceolariosid E, 2 flavonoid glycosid camarosid E, 2 flavonoid glycosid camarosid (4’, 5 – dihydroxy – 3,7-dimethoxyflavon – 4’- O- β – D- glucopyranosid) và pectolinarigenin – 7 – O – β – glycosid. Trong tinh dầu ở lá có 62 hợp chất được xác định. Thành phần chủ yếu được xác định bao gồm caryophylene (13,57%), α-caryophyllene (11.76%), germacrene D (10.88%), isocaryo-phyllene (9.59%), γ-muurolene (6.85%) and γ-elemene (5.65%). [2,9,30] * Thân cây Bông ổi: Thân cây chứa 9 hợp chất triterpen là hỗn hợp α – amyrin và β – amyrin, acid oleanolic, acid 3β- acetoxyolean – 12 – en – 28 – oic, lantaden A, lantaden B, acid betulinic, acid oleanonic, acid pomolic, và một số hợp chất khác campestrol, stigmasterol và β – sitosterol. * Rễ cây: chứa 6 oligosaccharid và 6 iridoid glucosid được nhận dạng là stachyose, verbascose, ajugose, verbascotetraose, lantanose A, lantanose B, thevesid, lamiridosid và geniposid. Rễ còn chứa 8 triterpenoid là acid lantanolic, acid 22β – O – angeloyl – lantanolic, acid oleanolic, acid 22β – hydroxyolenonic, acid 19α- hydroxyursolic và acid 3β – isovaleroyl – 19α – hydroxyurlic. * Hoa chứa 0,07% tinh dầu. * Hạt chứa 9% dầu béo trong đó có các acid béo: acid linoleic, acid oleic, acid stearic, acid palmitic. [2] Toàn cây có hederagenin, acid 25 – hydroxy – 3 – oxoolean – 12 – en – 28 – oic, umuhengenin (5- hydroxy – 6, 7, 3’, 4’, 5’ – pentamethoxyflavon). [2] 1.3.3. Tác dụng dược lý và công dụng * Tác dụng dược lý - Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm: cao nước lá bông ổi có tác dụng kháng vi khuẩn gram dương trên in vitro: Bacillus subtilis, Micrococcus glutamicus, Staphylococcus aureas. - Tác dụng chống sốt rét in vitro, dùng chủng K1 kháng đa thuốc của Plasmodium falciparum. Vỏ rễ Bông ổi có tác dụng khá với IC là 5 - 10àg/ml, mạnh nhất trong số 49 cây thuốc chữa sốt rét trong y học Tanzania. - Tác dụng trên hồi tràng ruột lang cô lập: cao nước lá Bông ổi gây co hồi tràng ruột lang cô lập; mức độ co phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của thuốc. - Gây ngộ độc: Động vật ăn lá và ngọn cây tươi của Bông ổi liều 10g/kg sẽ bị ngộ độc với triệu chứng: chán ăn, táo bón, vàng da và nhạy cảm ánh sáng. Cơ quan bị tổn thương nhiều nhất là gan gây ứ mật. Qua nghiên cứu cho thấy Lantaden A, lantaden C và các hợp chất triterpenoid pentacyclic có trong lá gây độc cho gan. [2,9,34] * Tính vị, công năng theo y học cổ truyền - Lá Bông ổi có mùi hôi, tính mát, hơi độc, có tác dụng hạ sốt, giải độc, tiêu sưng. - Hoa có vị ngọt nhạt, tính mát, có tác dụng cầm máu. - Rễ có vị ngọt dịu, đắng, tính mát, có tác dụng hạ sốt, tiêu độc, giảm đau. * Công dụng và liều dùng - Lá Bông ổi chữa táo bón làm ra mồ hôi, viêm phế quản xuất tiết. Ngày 20 -30g cây tươi sắc uống. - Dùng đắp ngoài vết thương lở loét hoặc cầm máu. Còn dùng lá giã đắp hoặc nấu nước để rửa chữa ghẻ lở; viêm da, các vết chàm. - Lá chườm nóng trị thấp khớp. - Hoa trị ho, lao kèm ho ra máu và cao huyết áp, ngày dùng 12g. - Rễ trị sốt lâu không dứt, quai bị, phong thấp, đau xương, đau răng, chấn thương bầm dập, khí hư. Ngày 30-60g cây tươi sắc uống. - Chữa ho ra máu, phổi kết hạch, lao phổi: hoa Bông ổi phơi khô 6-10g hoặc để cây tươi 15-20g, nấu nước, hãm hoặc chế siro uống. - Chữa ĐTĐ: toàn cây bỏ rễ 40g sắc uống thay chè. Ngoài ra, ăn thêm củ mài, củ súng hoặc bột thiên hoa phấn, ngày 10g. [2,9] - Theo y học cổ truyền ấn Độ: dùng nước ép lá tươi trộn với sữa bò trị rắn cắn và côn trùng cắn. Dịch chiết lá trộn với nước ép quả chanh điều trị vết thương bên ngoài. [41] - Một nghiên cứu tổng quan của ấn Độ, Việt Nam xếp Bông ổi vào nhóm các loài thực vật có tác dụng điều trị ĐTĐ và họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) cũng có nhiều loài có triển vọng điều trị ĐTĐ. [ 2, 8,19, 28,38,48] Chương 2. Đối tượng, Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng 2.1.1. Dược liệu Cây Bông ổi có tên khoa học Lantana camara L. thuộc họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) được thu mua tại Trung tâm bảo tồn cây thuốc Văn Điển – Viện Dược liệu. Thân và lá cây Bông ổi tươi được phơi khô tự nhiên, dùng làm nguyên liệu chiết xuất dịch chiết cho nghiên cứu tiếp theo. 2.1.2. Động vật thí nghiệm Chuột nhắt trắng Mus musculus (chủng Swiss) cả 2 giống đực – cái, có trọng lượng 18-22 gam đảm bảo sinh lý khỏe mạnh, đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu, được Viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp. Hàng ngày chuột được nuôi bằng thức ăn tổng hợp do Viện Kiểm nghiệm vắc xin và sinh phẩm cung cấp. Chế độ quang chu kỳ 12 giờ sáng: 12 giờ tối. Đối với chuột được lấy máu xét nghiệm, lấy hết thức ăn khỏi lồng vào 16h hàng ngày. 2.2. Vật liệu - Ethanol 960, Nacl 0,9% (dung dịch tiêm truyền). - Hóa chất: Streptozocin, Alloxan mua của Hãng Sigma. - Thuốc đối chứng Diamicron MR (có hoạt chất chính gliclazide 80mg) của hãng Servier (Pháp). - Máy đo đường huyết máy đo đường huyết tự động One touch Ultra Easy của công ty Johnson-Johnson - tập đoàn Lifescan của (Mỹ). - Bộ kít thử One touch Ultra Easy của công ty Johnson-Johnson - tập đoàn Lifescan (Mỹ). - Bộ chiết ngấm kiệt thủy tinh. 2.3. Phương pháp Thử nghiệm gây mô hình ĐTĐ typ 1 Tối ưu hóa liều Alloxan, STZ là một việc làm quan trọng trong quá trình gây tăng đường huyết trên động vật thực nghiệm. Nếu dùng liều thấp động vật có thể tự phục hồi nồng độ glucose huyết trở về trạng thái ban đầu mà không cần bất kì sự can thiệp nào của thuốc. Nếu dùng liều cao chuột có thể bị ngộ độc hoặc chết làm ảnh hưởng đến thí nghiệm. Các nghiên cứu thử tác dụng hạ đường huyết của thuốc đều rất cần sự ổn định đường huyết trong thời gian dài (thường vượt quá thời gian thí nghiệm). Tế bào β đảo tụy bị phá vỡ thì sau một thời gian chuột chết. Liều gây mô hình ĐTĐ ổn định trong thời gian dài sẽ giúp đánh giá thuốc nghiên cứu một cách khách quan và hiệu quả. Hình 10. Sự thay đổi nồng độ glucose máu theo thời gian dùng alloxan (pha I-IV) và STZ (pha II - IV). [35] a) Gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên CNT bằng alloxan Qua nghiên cứu tài liệu cho thấy, hầu hết tiêm tĩnh mạch dùng liều 60-100mg/kg. Trong khi nếu tiêm màng bụng thì liều cao gấp 2-3 lần. Alloxan được tiêm tĩnh mạch ở các mức liều khác nhau: Lô 1: Chuột được tiêm Alloxan liều 40mg/kg Lô 2: Chuột được tiêm Alloxan liều 60mg/kg Lô 3: Chuột được tiêm Alloxan liều 80mg/kg Lô 4: Chuột được tiêm Alloxan liều 100mg/kg Định lượng glucose huyết vào ngày 0; ngày thứ 3; ngày thứ 7. Chuột có glucose huyết ≥ 10mmol/L được coi là thành công. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05. N0 N3 N7 b) Gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên CNT bằng STZ Có nhiều tài liệu đã công bố về các mức liều dùng STZ để gây mô hình, trong phạm vi nghiên cứu luận văn khảo sát mức liều từ 50-200mg. Kết quả khảo sát này dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Chuột được tiêm màng bụng STZ ở các mức liều khác nhau: Lô 1: Chuột được tiêm STZ liều 50mg/kg Lô 2: Chuột được tiêm STZ liều 100mg/kg Lô 3: Chuột được tiêm STZ liều 150mg/kg Lô 4: Chuột được tiêm STZ liều 200mg/kg Định lượng glucose huyết vào ngày 0; ngày thứ 3; ngày thứ 7. Chuột có glucose huyết ≥ 10mmol/L được coi là thành công. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05. N0 N3 N7 2.3.2. Phương pháp thu dịch chiết từ cây Bông ổi a) Dịch chiết nước Thân, lá cây Bông ổi khô 1kg được ngâm trong nước cất 2h trước khi sắc. Thân, lá cây được sắc 3 lần chiết theo tỷ lệ thể tích nước cho vào/ thể tích dịch chiết như sau: lần 1 (4:1), lần 2 (3:1), lần 3 (2:1). Gộp dịch chiết cả 3 lần đem lọc bằng giấy Whatman sau đó cô cao tới tỷ lệ đặc nhất có thể. Kết quả thu được cao đặc có tỷ lệ 3:1 (tương ứng 3g dược liệu khô/ml) . b) Dịch chiết Cao cồn Thân, lá cây Bông ổi khô 1kg nghiền nhỏ được ngâm trong cồn 700 trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau 24 giờ dùng bình ngấm kiệt thu dịch chiết bằng phương pháp nhỏ giọt và bổ xung cồn 700 liên tục. Dịch chiết thu hồi được lọc bằng giấy lọc Whatman. Dịch chiết được cô cao cách thủy bay hơi cồn. Cao cồn thu được tiếp tục được sấy khô 600C thu cắn. 2.3.3. Phương pháp thử độc tính cấp của dịch chiết cồn, nước từ cây Bông ổi Thử độc tính cấp được tiến hành trên chuột nhắt trắng. Chuột nhịn đói 16h trước khi nghiên cứu. Chuột được cho uống thuốc với các liều tăng dần. - Thể tích: cho uống 0,5ml/chuột (liều duy nhất trong đợt thực nghiệm). - Theo dõi liên tục diễn biến của chuột thí nghiệm trong vòng 24h đầu, tiếp tục theo dõi các biểu hiện sinh lý trong 72h tiếp theo. - Sau 07 ngày, mổ chuột còn sống ở các lô nhận xét đại thể. - Tính LD50 theo phương pháp Litchfield- Wilcoxon b) Dịch chiết nước 60 chuột được chia thành 6 lô nghiên cứu như sau: Lô 1 (chứng): Chuột được uống nước cất Lô 2: Chuột được uống dịch chiết với liều 15g/kg Lô 3: Chuột được uống dịch chiết với liều 30g/kg Lô 4: Chuột được uống dịch chiết với liều 45g/kg Lô 5: Chuột được uống dịch chiết với liều 60g/kg Lô 6: Chuột được uống dịch chiết với liều 75g/kg a) Dịch chiết cồn 60 chuột được chia thành 6 lô nghiên cứu như sau: Lô 1 (chứng): Chuột được uống nước cất Lô 2: Chuột được uống dịch chiết với liều 6g/kg Lô 3: Chuột được uống dịch chiết với liều 9g/kg Lô 4: Chuột được uống dịch chiết với liều 12g/kg Lô 5: Chuột được uống dịch chiết với liều 15g/kg Lô 6: Chuột được uống dịch chiết với liều 18g/kg 2.3.4. Sàng lọc tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết trên CNT bình thường a) Phương pháp sàng lọc tác dụng hạ glucose máu của dịch chiết nước trên CNT bình thường. Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, trọng lượng từ 18-22g 30 chuột nhắt trắng chia thành 5 lô, mỗi lô 6 con được dùng liều như sau: Lô 1 (chứng): Chuột uống nước cất Lô 2: Chuột uống dịch chiết với liều 3g/kg Lô 3: Chuột uống dịch chiết với liều 6g/kg Lô 4: Chuột uống dịch chiết với liều 10g/kg Lô 5: Chuột uống dịch chiết với liều 15g/kg Chuột được uống với thể tích hằng định 0,5ml/con với liều duy nhất. Chuột nhịn đói 12 giờ trước khi tiến hành thực nghiệm. Lấy máu lần 1, thời điểm 0h. Các lần tiếp theo cách nhau 1h sau khi uống thuốc (0h; 1h; 2h; 3h; 4h). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05. 0h 1h 2h 3h 4h b) Phương pháp sàng lọc tác dụng hạ glucose máu của dịch chiết cồn trên CNT bình thường. Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, trọng lượng từ 18-22g 30 chuột nhắt trắng chia thành 5 lô, mỗi lô 6 con được dùng liều như sau: Lô 1 (chứng): Chuột uống nước cất Lô 2: Chuột uống dịch chiết với liều 0,4g/kg Lô 3: Chuột uống dịch chiết với liều 0,8g/kg Lô 4: Chuột uống dịch chiết với liều 1,6g/kg Lô 5: Chuột uống dịch chiết với liều 3,2g/kg Chuột được uống với thể tích hằng định 0,5ml/con với liều duy nhất. Chuột nhịn đói 12 giờ trước khi tiến hành thực nghiệm. Lấy máu lần 1, thời điểm 0h. Các lần tiếp theo cách nhau 1h sau khi uống thuốc (0h; 1h; 2h; 3h; 4h). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05. 0h 1h 2h 3h 4h 2.3.5. Thử khả năng dung nạp glucose huyết trên CNT của dịch chiết Bông ổi. Chuột được nhịn đói trước khi thí nghiệm 16 giờ. Chuột được uống thuốc nghiên cứu và đối chứng. Tiếp đó, sau 3h cho uống dung dịch glucose 30% liều 3g/kg thể trọng (cho uống liều 0,2ml/chuột 20g). Định lượng glucose huyết sau khi uống dung dịch glucose ở các thời điểm 0h; 1/2h; 1h; 2h. 30 chuột nhắt trắng chia thành 5 lô, mỗi lô 6 con được dùng liều như sau: Lô 1: Chuột uống nước muối sinh lý (đối chứng âm) Lô 2: Chuột uống glyclazid liều 19,2 mg/kg (đối chứng dương) Lô 3: Chuột uống dịch chiết nước với liều 6,0g/kg Lô 4: Chuột uống dịch chiết cồn với liều 1,6g/kg -3h (uống thuốc) 0h 1/2h 1h 2h Chỉ số glucose huyết ở thời điểm 0; 1/2; 1; 2 so sánh với thời điểm -3h. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05. 2.3.6. Thử tác dụng hạ glucose huyết trên CNT gây mô hình ĐTĐ typ 1 bằng STZ Chuột nhắt trắng được nuôi ổn định glucose huyết trong điều kiện phòng thí nghiệm 3-5 ngày. Tăng glucose huyết bằng cách tiêm màng bụng STZ liều duy nhất 150mg/kg pha trong dung dịch đệm citrat (pH 4,5). Hình 11. Gây mô hình ĐTĐ typ1 bằng STZ Định lượng glucose huyết sau 72h, lựa chọn chuột có glucose huyết ≥ 10mmol/L và chia thành các lô nghiên cứu. Cho chuột uống thuốc và đánh giá tác dụng hạ glucose huyết tại thời điểm trước và sau khi uống thuốc. Lô uống dịch chiết được tiến hành so sánh cới lô đối chứng âm (uống dung môi pha thuốc) ; và lô chứng dương (uống glyclazid). Thí nghiệm được thiết kế như sau: - Lô 1: Chuột uống nước muối sinh lý (đối chứng âm) - Lô 2: Chuột uống glyclazid liều 19,2mg/kg (đối chứng dương) - Lô 3: Chuột uống cao nước liều 6,0g/kg. - Lô 4: Chuột uống cao cồn liều 1,6g/kg. Đo glucose huyết ở thời điểm 0h và 4h (thời điểm thuốc có nồng độ cao nhất) uống thuốc. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05. N0 N3 0 4h 2.3.7. Thử tác dụng hạ glucose huyết trên chuột gây ĐTĐ typ 2 bằng STZ và chế độ ăn Chuột nhắt trắng được nuôi chế độ giàu dinh dưỡng trong điều kiện phòng thí nghiệm 4 tuần. Hàng ngày chuột được ăn thức ăn tổng hợp do Viện Kiểm nghiệm Vắc xin & Sinh phẩm cung cấp có bổ xung 20ml sữa đặc có đường pha loãng và 0,1 ml mỡ động vật đưa thẳng vào dạ dày chuột. Sau 4 tuần chuột có trọng lượng > 35g/con được chọn ra để tiêm STZ với liều 80mg/kg. Định lượng glucose huyết sau 7 ngày, lựa chọn chuột có glucose huyết ≥ 10mmol/L và chia thành các lô nghiên cứu. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05. Hình 12. Chuột béo phì được tiêm STZ liều thấp. Chuột được chia lô và uống thuốc nghiên cứu trong 7 ngày tiếp theo. - Lô 1: Chuột uống nước muối sinh lý (đối chứng âm) - Lô 2: Chuột uống glyclazid liều 19,2mg/kg (đối chứng dương) - Lô 3: Chuột uống cao nước liều 6g/kg. - Lô 4: Chuột uống cao cồn liều 1,6g/kg. Tất cả các lô này được uống thuốc vào 8h sáng hàng ngày trong 7 ngày tiếp theo. Đến ngày cuối cùng chuột được kiểm tra đường huyết vào thời điểm 0h - 2h - 4h - 6h. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05. N(-7) N0 N7 0 2 4 6h 2.3.8. Phương pháp định lượng glucose huyết * Nguyên lý hoạt động Nguyên tắc hoạt động của phương pháp dựa trên chuỗi phản ứng tạo màu và được đo bằng phương pháp đo quang học để định lượng glucose huyết. Phản ứng 1: dưới xúc tác đặc hiệu của glucose oxidase (GOD) có trong kít thử, glucose trong máu phản ứng với oxy (O2) không khí trong máu tạo thành axít gluconic và hydro peroxide (H2O2). Phản ứng 2: Hydro peroxide tiếp tục phản ứng với O-Dianisidin tạo phức màu và được thiết bị đo quang học trong máy chuyển hóa định lượng biểu thị bằng số mmol/l hoặc mg/dl. Hình 13. Định lượng glucose huyết trước khi gây mô hình Định lượng glucose huyết của chuột bằng cách cắt bỏ 2mm đuôi, để máu chảy tự nhiên, thấm bỏ giọt đầu tiên, rồi nhỏ 1 giọt vào test thử gắn với máy đo glucose huyết. Sau 20 giây, ghi nhận kết quả nồng độ glucose huyết (mmol/L). Chỉ số glucose huyết được đo bằng máy đo glucose huyết tự động và bộ kit thử One touch Ultra Easy của Hãng Johnson-Johnson của Mỹ. 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu Chỉ số glucose huyết được so sánh giữa thời điểm trước và sau nghiên cứu; so sánh giữa các lô dùng thuốc và lô đối chứng ở cùng thời điểm. * Tỷ lệ tăng glucose huyết được tính theo công thức Tỷ lệ % tăng glucose huyết: X1% = B – A x 100 A X1 - Tỷ lệ % hạ glucose huyết A - Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B - Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đánh giá Sự khác biệt được kiểm định bằng thuật toán t-test student với với P<0,05 có ý nghĩa thống kê. * Tỷ lệ hạ glucose huyết được tính theo công thức dưới đây Tỷ lệ % hạ glucose huyết: X2% = B – A x 100 (43) A X2 - Tỷ lệ % hạ glucose huyết A - Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B - Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đánh giá Sự khác biệt được kiểm định bằng thuật toán t-test student với với P<0,05 có ý nghĩa thống kê. * Hệ số biến thiên: Hệ số biến thiên được dùng để so sánh hai mẫu có phương sai khác nhau để đánh giá độ phân tán của dãy số liệu. Hệ số biến thiên thấp thì dãy số liệu phân tán ít (số liệu tập trung hơn) hay kết quả chính xác hơn. Cv(%) = S x 100 X S - Độ lệch chuẩn X - Giá trị trung bình *Một mô hình thực nghiệm dược lý chỉ nói lên được một khía cạnh tác dụng của thuốc. Trong nghiên cứu này chúng tôi thử nghiệm tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết Bông ổi trên 3 mô hình khác nhau (mô hình thử khả năng dung nạp glucose, mô hình ĐTĐ typ 1 bằng STZ, mô hình ĐTĐ typ 2 bằng STZ và chế độ ăn). Sơ đồ nghiên cứu của đề tài: Sơ đồ 1. Sơ đồ nghiên cứu của luận văn Chương 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Gây mô hình ĐTĐ typ 1 Xuất phát từ nguyên nhân gây bệnh tiểu đường là sự thiếu hụt insulin do tế bào β- đảo tụy bị phá vỡ, các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều phương pháp gây ĐTĐ typ 1 trong đó có phương pháp sử dụng hóa chất Streptozocin và alloxan. Khi được dùng đường tiêm với liều thích hợp trên động vật thí nghiệm, STZ và alloxan này sẽ phá hủy tế bào β- đảo tụy, làm thiếu hụt insulin gây mô hình tiểu đường typ 1 trên động vật thí nghiệm. 3.1.1. Gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên CNT bằng alloxan Trên thế giới có nhiều nghiên cứu sử dụng alloxan gây tiểu đường typ 1, tuy nhiên liều sử dụng, đường dùng và động vật thí nghiệm công bố có nhiều điểm chưa tương đồng. Qua nghiên cứu tài liệu, chúng tôi nhận thấy các nghiên cứu thường sử dụng alloxan với liều tiêm tĩnh mạch đuôi từ 60 -100 mg/kg trên chuột nhắt trắng, liều tiêm màng bụng thường gấp 2 lần liều tiêm tĩnh mạch đuôi trên cùng động vật. Trên cơ sở tổng quan tài liệu chúng tôi lựa chọn động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng, đường dùng là đường tiêm tĩnh mạch đuôi chuột, liều dùng được khảo sát từ 40-100mg/kg trọng lượng chuột. Bảng 4. Kết quả gây ĐTĐ typ 1 bằng alloxan tiêm tĩnh mạch đuôi chuột Lô thử nghiệm Chỉ số glucose huyết trung bình (mmol/l) X ± SE Ngày 0 Ngày 3 Ngày 7 Lô 1 (liều 40mg/kg) 4,87 ± 0,89 8,95 ± 1,38• 83,77%* 9,11 ± 1,34• 87,06%* Lô 2 (liều 60mg/kg) 5,86 ± 1,24 11,85 ± 4,11• 102,21%* 12,22 ± 4,03• 108,53%* Lô 3 (liều 80mg/kg) 5,27 ± 0,49 27,28 ± 8,30• 417,64%* 30,7 ± 3,09• 482,54%* Lô 4 (liều 100mg/kg) 5,77 ± 0,66 30,9 ± 3,72• 435,52%* ** • Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05 của chỉ số glucose huyết tại thời điểm nghiên cứu so với ngày 0. *Tỷ lệ % tăng glucose huyết thời điểm nghiên cứu so với ngày 0 ** Chuột chết 100% Hình 14. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tỷ lệ tăng glucose huyết vào liều tiêm alloxan Từ bảng 4 và đồ thị hình 14 cho thấy, ngày thứ 3 sau khi tiêm alloxan chuột ở các lô 2,3,4 có chỉ số glucose huyết trung bình ≥ 10 mmol/l. Chỉ số glucose huyết các lô 1,2,3,4 ở ngày 3 so với ngày 0 khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05. Chỉ số glucose huyết tăng ở tất cả các lô và cao nhất là ở lô 4 (435,52%). Tỷ lệ % glucose huyết tăng khi tăng nồng độ alloxan, sự thay đổi rõ rệt biểu hiện ở bước chuyển liều từ lô 2(102,21%) sang lô 3 (417,64%) với tỷ lệ % tăng gấp 3 lần cho thấy ngưỡng phá hủy mạnh của alloxan đối với tế bào β đảo tụy. ở ngày thứ 7 tỷ lệ % tăng glucose huyết so với ngày 3 tăng không đáng kể nhưng sự phá hủy mạnh của alloxan đối với tế bào β đảo tụy đã gây chết chuột. Chỉ số glucose huyết các lô 1,2,3,4 ở ngày 7 so với ngày 0 khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05. Bảng 5. Tỷ lệ % gây mô hình thành công, tỷ lệ tử vong và hệ số biến thiên của alloxan Lô Tỷ lệ chuột được gây TĐ thành công (%) Tỷ lệ chuột chết (%) Hệ số biến thiên Cv(%) Ngày 3 Ngày 7 Ngày 3 Ngày 7 Ngày 3 Ngày 7 Lô 1 10 30 0 0 15,41 14,71 Lô 2 50 80 0 0 34,68 23,98 Lô 3 80 60 20 40 30,42 10,06 Lô 4 50 0 50 100 12,03 0 Tỷ lệ gây mô hình thành công cao nhất ở lô 3 (80% chuột có chỉ số glucose huyết ≥ 10mmol/l). Tuy nhiên hệ số biến thiên của lô này là khá cao (30,42%) và có chuột chết với tỷ lệ (20%). ở ngày thứ 7, chuột ở lô 2, 3 có chỉ số glucose huyết trung bình ≥ 10 mmol/l. Tỷ lệ thành công cao nhất ở lô 2 (80%) nhưng hệ số biến thiên cao (23,98%). Với sự phá hủy mạnh mẽ tế bào đảo tụy khi tăng dần liều alloxan, tỷ lệ chuột chết ở lô 3 là 40% , chuột ở lô 4 chết 10 con (chiếm 100%). Tăng liều alloxan tỷ lệ thuận với tỷ lệ tử vong và mức độ phá hủy đảo tụy mạnh (biểu hiện glucose huyết tăng cao). Với liều tiêm tĩnh mạch 60mg/kg vào ngày thứ 7 cho kết quả tốt nhất đáp ứng tiêu chuẩn gây ĐTĐ typ 1 (glucose huyết ≥ 10 mmol/l) và tỷ lệ tử vong thấp (0%) mặc dù hệ số biến thiên cao (23,98%). Cũng như nhiều kết quả nghiên cứu khác đánh giá dùng alloxan cho nghiên cứu gây ĐTĐ typ 1 có hệ số biến thiên cao do vậy sẽ khó đánh giá chính xác khi tiến hành các thí nghiệm thử tác dụng hạ đường huyết. Dùng alloxan để gây mô hình ĐTĐ typ 1 sẽ được cân nhắc khi không có nhiều sự lựa chọn. 3.1.2. Gây mô hình ĐTĐ typ 1 trên CNT bằng STZ Tương tự như những nghiên cứu alloxan, liều dùng, đường dùng của STZ trên các động vật thí nghiệm khác nhau được công bố có nhiều điểm chưa đồng nhất. Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn đường tiêm màng bụng với động vật thí nghiệm là CNT, liều dùng được nghiên cứu ở các mức khác nhau (50; 100; 150; 200 mg/kg). Bảng 6. Kết quả gây mô hình ĐTĐ typ 1 bằng STZ tiêm màng bụng Lô thử nghiệm Chỉ số glucose huyết trung bình (mmol/l) X ± SE Ngày 0 Ngày 3 Ngày 7 Lô 1 (liều 50mg/kg) 6,53 ±0,58 7,17 ± 0,99 9,8%* 10,48 ±2,22• 60,49%* Lô 2 (liều 100mg/kg) 6,66± 0,63 7,82± 0,61• 17,42%* 11,85± 0,96• 77,93%* Lô 3 (liều 150mg/kg) 8,08± 1,51 18,09 ± 0,82• 123,88%* 28,58 ± 2,77• 253,71%* Lô 4 (liều 200mg/kg) 7,54± 0,98 28,61± 0,97• 279,44%* 32,43 ± 1,01• 330,1%* • Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05 của chỉ số glucose huyết tại thời điểm nghiên cứu so với ngày 0. *Tỷ lệ % tăng glucose huyết thời điểm nghiên cứu so với ngày 0. Hình 15. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tỷ lệ tăng glucose huyết vào liều STZ Từ kết quả ở bảng 6 và đồ thị (hình 15), tỷ lệ tăng glucose huyết tỷ lệ thuận với liều tiêm màng bụng STZ. ở ngày thứ 3, tỷ lệ tăng glucose huyết ở lô 1, 2 thấp (9,8%; 17,42%) và tăng cao ở lô 3, 4 (123,88%; 279%), bước chuyển tăng mạnh giữa lô 2 và lô 3 cho thấy ngưỡng phá hủy tế bào β đảo tụy rõ ràng thể hiện chuột ở lô 3, lô 4 có chỉ số glucose huyết >10mmol/l và mức tăng glucose cao nhất ở lô 4 (279,44%). Ngày thứ 7 của nghiên cứu, cả 4 lô tỷ lệ tăng glucose huyết đều tăng so với ngày 0 có ý nghĩa thống kê với P 10mmol/l đáp ứng tiêu chuẩn nghiên cứu. Bảng 7. Tỷ lệ % gây mô hình thành công, tỷ lệ tử vong và hệ số biến thiên của STZ Lô Tỷ lệ chuột được gây ĐTĐ thành công (%) Tỷ lệ chuột chết (%) Hệ số biến thiên Cv (%) Ngày 3 Ngày 7 Ngày 3 Ngày 7 Ngày 3 Ngày 7 Lô 1 0 50 0 0 13,81 21,18 Lô 2 0 100 0 0 7,80 8,10 Lô 3 100 80 0 20 4,53 9,69 Lô 4 80 60 20 40 3,39 3,11 Kết quả bảng trên cho thấy, ở ngày thứ 3 lô 3, 4 có tỷ lệ thành công cao (100%, 80%) đáp ứng được tiêu chuẩn loại trừ ban đầu (≥10 mmol/, P<0,05), ở lô 4 xuất hiện chuột chết với tỷ lệ 20%. Hệ số biến thiên của lô 3, 4 thấp (4,53%; 3,39%). Ngày thứ 7 nghiên cứu, tất cả các lô tiêm STZ đều đáp ứng được tiêu chuẩn lựa chọn (≥ 10 mmol/, P<0,05). Tỷ lệ thành công cao nhất ở lô 2 (100%), nhưng lô này có hệ số biến thiên cao (8,1%) so với lô 3 ở ngày thứ 3. Lô 3, lô 4 xuất hiện chuột chết với tỷ lệ 20%, 40%, chỉ số glucose huyết tăng rất cao, do sự phá hủy mạnh tế bào β đảo tụy. Kết quả gây ĐTĐ bằng STZ liều 150 mg/kg ngày thứ 3 tương đương với kết quả công bố của nhiều nghiên cứu ở Việt Nam. [6,11] Từ những kết quả trên đây chúng tôi lựa chọn liều STZ 150 mg/kg đường tiêm màng bụng vào ngày thứ 3 để gây mô hình tiểu đường typ 1 cho nghiên cứu thử tác dụng hạ đường huyết của các dịch chiết tự nhiên tiếp theo nghiên cứu. 3.2. Thu dịch chiết nghiên cứu và thử độc tính cấp của dịch chiết Bông ổi 3.2.1. Thu dịch chiết Bông ổi a) Kết quả thu dịch chiết nước Bông ổi Thân, lá cây Bông ổi khô 1kg được ngâm trong nước cất 2h trước khi sắc. Thân, lá cây được sắc 3 lần chiết theo tỷ lệ thể tích nước cho vào/ thể tích dịch chiết được như sau: lần 1 (4:1), lần 2 (3:1), lần 3 (2:1). Toàn bộ các bước được trình bày ở sơ đồ dưới. Sơ đồ 2. Quy trình thu dịch chiết nước Bông ổi b) Kết quả thu dịch chiết cồn Bông ổi Thân, lá cây Bông ổi khô 1kg nghiền nhỏ được ngâm trong cồn 700 trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau 24 giờ dùng bình ngấm kiệt thu dịch chiết bằng phương pháp nhỏ giọt và bổ xung cồn 700 liên tục. Dịch chiết thu hồi được lọc bằng giấy lọc Whatman. Dịch chiết được cô cao cách thủy bay hơi cồn. Cao cồn thu được tiếp tục được sấy khô 600C thu cắn. Toàn bộ các bước được trình bày ở sơ đồ dưới. Sơ đồ 3. Quy trình thu dịch chiết cồn Bông ổi Hiệu suất chiết đạt 6,5% (1kg dược liệu chiết được 65g cắn). Pha 1,3g cắn trong 1ml nước cất (tương đương với 20g dược liệu khô/ml) được dịch chiết cồn dùng cho nghiên cứu. Trong nghiên cứu chúng tôi sử dụng liều dịch chiết cồn theo cắn (không sử dụng liều quy đổi tương đương dược liệu khô). 3.2.2. Thử độc tính cấp dịch chiết bông ổi Trong nghiên cứu bào chế, thử nghiệm thuốc và các chế phẩm tự nhiên giai đoạn tiền lâm sàng, việc thử độc tính cấp có vai trò quan trọng trong đánh giá hiệu lực an toàn của thuốc và phương hướng dùng liều cho các nghiên cứu tiếp theo. Nghiên cứu độc tính cấp của thuốc trên động vật thí nghiệm, chủ yếu là xác định liều chết trung bình hay là liều làm chết 50% số động vật thí nghiệm (LD50) trong những điều kiện nhất định. Chỉ số LD50 là cơ sở để đánh giá độc tính của thuốc, liều dùng thí nghiệm dược lý một cách đúng đắn. Theo kinh nghiệm nghiên cứu của một số tác giả liều có tác dụng dược lý khoảng 1/10 LD50.Cùng với liều an toàn của độc tính bán trường diễn, liều có tác dụng dược lý, LD50 là cơ sở liều dùng cho các nghiên cứu lâm sàng bằng các phương pháp tính toán ngoại suy. [16] Tuy nhiên chỉ căn cứ vào LD50 mà bỏ qua các dấu hiệu ngộ độc khác sẽ không khách quan. Trên thí nghiệm độc tính cấp diễn có thể quan sát thấy các triệu chứng bệnh lý quan trọng ở chuột không chết hoặc trước khi chết như: gãi mõm liên tục, chạy hoảng loạn, ngã xiêu vẹo, co giật, run rẩy, ra mồ hôi, tím tái ở tai, chân, đuôi, tư thế nằm, đứng... a) Kết quả thử độc tính cấp của dịch chiết nước cây Bông ổi Thể tích cho uống ở mỗi chuột là 0,5ml/con và là duy nhất trong đợt thực nghiệm. Chuột được uống dịch chiết nước liều từ thấp đến cao và bước nhảy liều được dùng trong thí nghiệm là 15g/kg (tăng dần theo mỗi lô). Liều cao nhất có thể cho uống trong đợt thực nghiệm là 75g/kg. Bảng 8. Kết quả thử độc tính cấp của dịch chiết nước cây Bông ổi Nhóm chuột Liều dùng (g/kg chuột) Số chuột thí nghiệm Số chuột chết Tỷ lệ chuột chết (%) 1 ĐC 10 0 0 2 15 10 0 0 3 30 10 0 0 4 45 10 0 0 5 60 10 0 0 6 75 10 0 0 Sau khi dịch chiết nước Bông ổi, chuột ở các lô hoạt động bình thường. Các biểu hiện sinh lý bình thường. Không nhận thấy biểu hiện ngộ độc trên chuột thí nghiệm trong thời gian theo dõi. Sau 72 giờ, các nhóm thí nghiệm đều không có chuột chết. Tiến hành mổ đại thể chuột các lô nghiên cứu nhận thấy: tim, gan, thận, phổi tươi nhuận; dạ dày, ruột hết thuốc. Không xác định được liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50) của Dịch chiết nước Bông ổi mặc dù cho chuột uống với thể tích và liều cao nhất có thể là 75g/kg trọng lượng. b) Kết quả thử độc tính cấp của dịch chiết cồn cây Bông ổi Thể tích cho uống ở mỗi chuột là 0,5ml/con và là duy nhất trong đợt thực nghiệm. Chuột được uống dịch chiết nước liều từ thấp đến cao và bước nhảy liều được dùng trong thí nghiệm là 3g/kg (tăng dần theo mỗi lô). Liều cao nhất có thể cho uống trong đợt thực nghiệm là 18g/kg. Bảng 9. Kết quả thử độc tính cấp của dịch chiết cồn cây Bông ổi Lô thử nghiệm Liều dùng (g/kg chuột) Số chuột thí nghiệm Số chuột chết Tỷ lệ chuột chết (%) 1 ĐC 10 0 0 2 6 10 0 0 3 9 10 0 0 4 12 10 0 0 5 15 10 0 0 6 18 10 0 0 Sau khi dịch chiết cồn Bông ổi, chuột ở các lô hoạt động bình thường. Các biểu hiện sinh lý bình thường. Không nhận thấy biểu hiện ngộ độc trên chuột thí nghiệm trong thời gian theo dõi. Sau 72 giờ, các nhóm thí nghiệm đều không có chuột chết. Tiến hành mổ đại thể chuột các lô nghiên cứu nhận thấy: tim, gan, thận, phổi tươi nhuận; dạ dày, ruột hết thuốc. Không xác định được liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50) của Dịch chiết cồn Bông ổi mặc dù cho chuột uống với thể tích và liều cao nhất có thể là 18g/kg trọng lượng. 3.3. Thử tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết cây Bông ổi trên CNT 3.3.1. Sàng lọc liều có tác dụng hạ glucose huyết Sàng lọc liều là bước cơ bản có ý nghĩa quan trọng nhằm xác định liều tối ưu nhất có tác dụng hạ glucose huyết phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo trên mô hình tiểu đường thực nghiệm. a) Dịch chiết nước cây Bông ổi Trên cơ sở kết quả nghiên cứu độc tính cấp, chúng tôi lựa chọn các bước liều như bảng dưới nhằm chọn ra liều dịch chiết nước Bông ổi có tác dụng hạ glucose huyết thấp nhất và có tác dụng chậm và thời gian kéo dài. Bảng 10. Kết quả sàng lọc liều có tác dụng hạ glucose huyết trên chuột bình thường của dịch chiết nước Bông ổi Lô thử nghiệm Chỉ số glucose huyết trung bình (mmol/l) X ± SE 0h 1h 2h 3h 4h Lô 1 (ĐC) 7,73 ± 0,79 7,46 ± 0,91 -3,49% 7,27 ± 0,78 -5,95% 6.96 ± 0,73 -9,96% 6,83 ± 0,82 -11,6% Lô 2 (3g/kg) 7,78 ± 0,88 7,32 ± 1,24 -5,91% 6,3 ± 1,00• -19,02%* 5,68 ± 1,05• -26,99% 5,06 ± 1,07• -34,9%* Lô 3 (6g/kg) 7,55 ± 0,95 7,01 ± 1,22 -7,15% 5,88 ± 0,99• -22,12%* 3,7 ± 0,82• -50,99%* 3,27 ± 0,53• -56,68%* Lô 4 (10g/kg) 8,16 ± 0,86 8,01 ± 1,18 -1,83% 6,53 ± 0,66• -19,98%* 5,83 ± 0,91• -28,55%* 5,23 ± 0,88• -35,91%* Lô 5 (15g/kg) 7,13 ± 0,68 6,61 ± 0,91 -7,29% 5,81 ± 0,33• -18,51%* 5,20 ± 0,76• -27,06%* 3,83 ± 0,82• -46,28%* • Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05 của chỉ số glucose huyết thời điểm nghiên cứu so với 0h. * Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05 của tỷ lệ % hạ glucose huyết của các lô 2,3,4,5 so với lô 1 ở cùng thời điểm. Hình 16. Đồ thị tỷ lệ hạ glucose huyết trên chuột bình thường của dịch chiết nước Bông ổi Từ bảng 10 và đồ thị hình 16 có thể nhận thấy, chỉ số glucose huyết biến đổi tỷ lệ nghịch với thời gian (thời gian càng dài thì tỷ lệ hạ glucose huyết càng nhiều). Thời điểm 1h sau khi uống dịch chiết tỷ lệ % hạ glucose huyết ở tất cả các lô giảm không đáng kể (sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê P>0,05). Tỷ lệ % hạ glucose huyết giảm dần ở các lô uống dịch chiết Bông ổi vào giờ thứ 2, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) giữa các lô uống dịch chiết và lô đối chứng. Tỷ lệ % hạ glucose huyết mạnh nhất vào thời điểm 4 giờ ở uống dịch chiết nước, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giưa các lô uống dịch chiết so với lô chứng. Sau 4 giờ uống thuốc, chỉ số glucose huyết trung bình ở lô số 4 (liều 6g/kg) có mức hạ thấp nhất. Tỷ lệ % hạ glucose huyết của lô này là 56,68% cao nhất trong tất cả các lô. Liều 6g/kg được chọn cho các nghiên cứu trên mô hình ĐTĐ tiếp theo. b) Dịch chiết cồn Bảng 11. Kết quả sàng lọc liều có tác dụng hạ glucose huyết trên CNT bình thường của dịch chiết cồn Bông ổi Lô thử nghiệm Chỉ số glucose huyết trung bình (mmol/l) X ± SE 0h 1h 2h 3h 4h Lô 1 (ĐC) 7,63 ± 1,01 7,52± 1,05 1,44% 7,28 ± 0,97 4,59% 7,13 ± 0,85 6,65% 6,85 ± 0,95 10,22% Lô 2 (0,4g/kg) 8,28 ± 0,67 7,76 ± 0,54 6,28% 7,28 ± 0,68• 12,08% 6,88 ± 0,81• 16,91% 6,33 ± 0,99• 23,55%* Lô 3 (0,8g/kg) 7,57 ± 0,86 7,20 ± 0,63 4,88% 6,73 ± 0,65• 11,09% 5,27 ± 0,95• 30,38%* 4,53 ± 0,97• 40,15%* Lô 4 (1,6g/kg) 8.47 ± 0,98 7,58 ± 0,91 10,5% 6,62 ± 1,08• 21,84%* 5,82 ± 0,83• 31,28%* 5,03 ± 0,78• 40,60%* Lô 5 (3,2g/kg) 8,48 ± 0,53 6,82 ± 0,34• 19,57%* 5,55 ± 0,69• 34,55%* 4,28 ± 0,62• 49,53%* 3,13 ± 0,56• 63,08%* • Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05 của chỉ số glucose huyết thời điểm nghiên cứu so với 0h. * Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05 của tỷ lệ % hạ glucose huyết của các lô 2,3,4,5 so với lô 1 ở cùng thời điểm. Hình 17. Đồ thị tỷ lệ hạ glucose huyết trên CNT bình thường của dịch chiết cồn Từ bảng 11 và đồ thị hình 17, cho thấy tác dụng của dịch chiết cồn Bông ổi đến chỉ số glucose huyết giảm dần theo thời gian. Thời điểm 1 giờ sau uống thuốc tỷ lệ hạ glucose huyết giữa các lô uống dịch chiết cồn so với lô chứng không có sự khác biệt (P> 0,05). Sau 2 giờ uống dịch chiết tỷ lệ % hạ glucose huyết xảy ra mạnh nhất ở lô 4 (-21,84%), lô 5 (-34,55%). Giờ thứ 3 sau uống thuốc các lô 3,4,5 đều có sự giảm mạnh tỷ lệ % hạ glucose huyết. Thời điểm 4 giờ các lô uống dịch chiết cồn có tỷ lệ % hạ glucose huyết mạnh nhất, sự khác biệt có ý nghĩa thống so với lô đối chứng (P<0,05). Kết quả cho thấy ở lô 5 có tỷ lệ % hạ glucose huyết cao nhất (-63,08%) với số glucose huyết thấp (3,13 mmol/l). So với lô 5 mức độ hạ đường huyết ở lô 4 (40,6%) sẽ an toàn và hiệu quả hơn không làm hạ glucose huyết quá thấp. Liều 1,6g/kg được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo trên mô hình. 3.3.2. Thử tác dụng dung nạp glucose huyết của dịch chiết Bông ổi trên CNT bình thường Thử khả năng dung nạp glucose huyết là một nghiệm pháp thường được dùng trong các nghiên cứu gần đây ở Việt Nam và trên thế giới. Cũng có một số nghiên cứu đi theo hướng thử khả năng ức chế hấp thụ glucose ở ruột qua đường thức ăn hoặc khi uống dung dịch glucose. Tuy nhiên trong nghiên cứu này tập trung vào khả năng dung nạp glucose của tế bào, một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá tác dụng của thuốc điều trị tiểu đường. ảnh hưởng của dịch chiết nước và dịch chiết cồn Bông ổi được thể hiện thông qua sự biến đổi nồng độ glucose huyết của chuột nhắt trắng bình thường sau khi uống glucose liều 3g/kg thể trọng. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng dưới đây. Bảng 12. Kết quả thử tác dụng dung nạp glucose huyết của dịch chiết Bông ổi trên CNT bình thường. Lô thử nghiệm Chỉ số glucose huyết trung bình (mmol/l) X ± SE - 3h 0h 1/2h 1h 2h Lô 1 (ĐC) 6,51 ± 0,51 6,28 ± 0,74 -3,53% 9,18 ± 1,04• 41,01% 7,76 ± 0,85• 19,21% 6,65 ± 0,66 2,15% Lô 2 Glyclazid (19,2 mg/kg) 7,4 ± 0,62 3,7 ± 0,51• -50,0% 8,56 ± 1,11• 15,67%* 5,35 ± 1,21• -27,70%* 4,78 ± 1,09• -35,41%* Lô 3 DC nước (6g/kg) 6,78 ± 0,59 5,67 ± 0,83• -16,37% 7,5 ± 0,95• 10,61%* 5,26 ± 0,93• -22,42%* 4,31 ± 1,09• -34,42%* Lô 4 DC cồn (1,6g/kg) 6,38 ± 0,78 5,18 ± 1,14• -18,80% 7,25 ± 0,82• 13,63%* 5,07 ± 1,04• -20,53%* 4,03 ± 1,25• -36,83%* • Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05 của chỉ số glucose huyết thời điểm nghiên cứu so với 0h. * Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05 của tỷ lệ % hạ glucose huyết của các lô 2,3,4 so với lô 1 ở cùng thời điểm. Hình 18. Đồ thị tác động của dịch chiết Bông ổi đến khả năng dung nạp glucose Từ bảng 12 và đồ thị hình 18 có kết quả như sau, thời điểm 1/2 giờ sau khi cho chuột uống glucose (3g/kg), tỷ lệ % glucose huyết tăng ở tất cả các lô vào (glucose đạt nồng độ cao nhất trong máu). Tỷ lệ này giảm dần vào thời điểm 1giờ và 2 giờ. ở thời điểm 1/2 giờ các lô 2,3,4 có tỷ lệ % tăng glucose huyết thấp hơn so với lô 1 (nước cất), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P0,05) về tỷ lệ % hạ glucose huyết giữa lô uống gliclazid (lô 2) và lô uống dịch chiết nước (lô 3), lô uống dịch chiết cồn (lô 4). Chứng tỏ dịch chiết nước Bông ổi (liều 6g/kg) và dịch chiết cồn Bông ổi (1,6g/kg) có khả năng làm tăng sự dung nạp glucose ở các tế bào. Có 2 giả thiết đặt ra giải thích cho khả năng này là: sự dung nạp glucose xảy ra ở tế bào não, gan, hồng cầu (các tế bào không cần insulin vẫn thu nhận được glucose); hoặc có sự kích thích tiết insulin, tăng nhạy cảm insulin với mô đích của 2 dịch chiết dẫn tới sự dung nạp glucose của các tế bào đích (tế bào gan, tế bào cơ, tế bào mô mỡ…). Với cơ chế nào thì điều này vẫn có ý nghĩa trong điều trị hạ glucose huyết ở những trường hợp bệnh nhân mắc tiểu đường. 3.3.3. Thử tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết cây Bông ổi trên mô hình ĐTĐ typ 1 được gây bằng STZ Dựa vào kết quả của nghiên cứu gây mô hình ĐTĐ typ 1 bằng STZ, chúng tôi xây dựng mô hình ĐTĐ typ 1 bằng STZ với liều 150mg/kg trên chuột nhắt trắng bằng đường tiêm màng bụng. Các lô nghiên cứu được uống thuốc thử nghiệm giống như thử tác dụng dung nạp glucose. Trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ đo chỉ số glucose huyết vào 2 thời điểm 0 giờ và 4 giờ sau khi uống thuốc. Bảng 13. Kết quả hạ glucose huyết của dịch chiết Bông ổi trên mô hình ĐTĐ typ 1 Lô thử nghiệm Chỉ số glucose huyết trung bình (mmol/l) X ± SE 0h 4h Tỷ lệ hạ glucose huyết sau 4h (%) p tỷ lệ % hạ glucose huyết so với lô 1 Lô 1 (ĐC) 17,80 ± 2,01 17,28 ± 1,48 -2,92% Lô 2 (Glyclazid 19,2 mg/kg) 18,08 ± 2,47 14,81 ± 1,50• -18,08% P2-1 <0,05 Lô 3 DC nước (6g/kg) 17,22 ± 1,87 12,33 ± 1,43• -27,04%* P3-1 <0,05 Lô 4 DC cồn (1,6g/kg) 18,50 ± 2,14 13,97 ± 1,29• -25,09%* P4-1 <0,05 • Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05 của chỉ số glucose huyết thời điểm nghiên cứu so với 0h. * Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P>0,05 của tỷ lệ % hạ glucose huyết của lô 3,4 so với lô 2. Hình 19. Đồ thị ảnh hưởng của dịch chiết Bông ổi đến glucose huyết của chuột ĐTĐ typ 1 bằng STZ Thời điểm 4 giờ được chọn cho nghiên cứu này xuất phát từ nghiên cứu sàng lọc liều tác dụng hạ glucose huyết. Trên chuột được gây mô hình TĐ typ 1 bằng STZ , dịch chiết nước (liều 6g/kg) và dịch chiết cồn (1,6g/kg) đều có tác dụng hạ glucose huyết, thể hiện ở tỷ lệ hạ glucose huyết cao (lô 3: 27,04% và lô 4: 25,09%). So sánh với lô đối chứng dùng nước cất (2,92%) thì cả 2 lô 3, 4 hạ thấp hơn nhiều và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P0,05). Gliclazid được sử dụng trong nghiên cứu này thuộc nhóm sulfonylurea thế hệ thứ 2 có tác dụng kích thích tế bào tuyến tụy tiết insulin. Sẽ là không phù hợp khi sử dụng gliclazid (thuốc thường dùng điều trị ĐTĐ typ 2) làm thuốc đối chứng dương để nghiên cứu trên mô hình ĐTĐ typ 1. Tuy nhiên khi so sánh với lô chứng cho thấy lô uống gliclazid có tỷ lệ % hạ glucose huyết (-18,08%), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng âm (uống nước cất) với P<0,05. Chứng tỏ rằng STZ liều 150mg/kg chuột bằng đường tiêm màng bụng chưa phá hủy hoàn toàn tế bào beta đảo tụy và chuột vẫn đáp ứng tốt với gliclazid. Những kết quả trên chứng minh dịch chiết nước và dịch chiết cồn đều có tác dụng làm hạ glucose huyết trên chuột được gây ĐTĐ typ 1 bằng STZ liều 150mg/kg bằng đường tiêm màng bụng. Cơ chế tác dụng của 2 dịch chiết Bông ổi có thể tương tự như glyclazid (kích thích bài tiết insulin). Tỷ lệ % hạ glucose huyết của dịch chiết nước và dịch chiết cồn Bông ổi tương đương với phân đoạn ethyl acetat rễ cây Chóc máu (-25,96%) [11] và gần bằng dịch chiết cồn Bằng lăng nước (-35,91%) [6] ở cùng thời điểm (4h) và mô hình gây ĐTĐ typ 1. 3.3.4. Thử tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết cây Bông ổi trên mô hình ĐTĐ typ 2 được gây bằng STZ và chế độ ăn. Mô hình ĐTĐ typ 2 được gây dựng dựa trên cơ sở nghiên cứu gây ĐTĐ typ 1 bằng STZ. Nhiều nghiên cứu trên lâm sàng đã chứng minh ở bệnh nhân bị TĐ typ 2 có hiện tượng phá hủy 50% tế bào beta đảo tụy, đa số các trường hợp này bệnh nhận trong tình trạng thừa cân. Xuất phát từ nghiên cứu trên chúng tôi xây dựng mô hình ĐTĐ typ 2 trên cơ sở gây chuột béo phì trong thời gian 4 tuần kết hợp với tiêm màng bụng STZ liều 80 mg/kg (1/2 liều gây ĐTĐ typ 1). Sau khi gây mô hình chuột ở các lô được chia nghiên cứu bảng dưới. Bảng 14. Kết quả hạ glucose huyết của dịch chiết Bông ổi trên mô hình ĐTĐ typ 2 Lô thử nghiệm Chỉ số glucose huyết trung bình (mmol/l) X ± SE 0h 2h 4h 6h Lô 1 (ĐC) 13,55 ± 2,71 13,23 ± 1,85 -2,36% 12,81 ± 2,13 -5,46% 12,7 ± 2.18 -6,27% Lô 2 (Glyclazid 19,2 mg/kg) 13,72 ± 1,68 11,3 ± 1,85• -17,63%* 10,07 ± 1,79• -26,60%* 9,20 ± 1,05• -32,94%* Lô 3 DC nước (6g/kg) 13,47 ± 1,29 11,52 ± 1,23• -11,47% 10,76 ± 1,47• -20,11%* 9,88 ± 1,32• -26,65%* Lô 4 DC cồn (1,6g/kg) 13,80 ± 2,84 12,15 ± 2,74• -11,96% 10,42 ± 1,69• -24,49%* 9,65 ± 1,63• -30,70%* • Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05 của chỉ số glucose huyết thời điểm nghiên cứu so với 0h. * Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05 (ở thời điểm 2h; 4h; 6h) của tỷ lệ % hạ glucose huyết ở các lô 2;3;4 so với lô 1. Hình 20. Đồ thị ảnh hưởng của dịch chiết Bông ổi đến glucose huyết của chuột ĐTĐ typ 2 bằng STZ và chế độ ăn Thời điểm 2 giờ, tỷ lệ % hạ glucose huyết giữa các lô nghiên cứu không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Thời điểm 4 giờ, các lô 2,3,4 có tỷ lệ % hạ glucose huyết cao, so với lô 1 sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P0,05). Thời điểm 6 giờ, chỉ glucose huyết tiếp tục hạ ở các lô, lô uống gliclazid có tỷ lệ hạ cao nhất (-32,94%), lô uống dịch chiết cồn (-30,7%), lô uống dịch chiết nước (-26,65%). Giữa lô đối chứng dương (gliclazid) và 2 lô uống thuốc nghiên cứu sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Dịch chiết nước liều (6g/kg) và dịch chiết cồn (1,6g/kg) có tác dụng hạ glucose huyết trên chuột được gây mô hình ĐTĐ typ 2 bằng chế độ ăn và STZ liều 80mg/kg. Cơ chế kích thích bài tiết insulin ở dịch chiết nước và dịch chiết cồn Bông ổi được bổ xung bằng kết quả của nghiên cứu trên mô hình ĐTĐ typ 2. Tóm tắt kết quả nghiên cứu Kết luận Từ các kết quả thu được rút ra một số kết luận sau: Xây dựng được mô hình ĐTĐ typ 1 bằng STZ liều 150mg/kg sau 3 ngày, liều 100 mg/kg sau 7 ngày tiêm màng bụng. Alloxan gây tăng glucose huyết không ổn định trong xây dựng mô hình ĐTĐ typ 1. Không xác định được LD50 bằng đường uống với liều cao nhất có thể cho uống của dịch chiết nước (75g/kg), dịch chiết cồn (liều 18g/kg). Dịch chiết nước liều 6g/kg và dịch chiết cồn liều 1,6g/kg có tác dụng hạ glucose huyết trên mô hình gây gây tăng glucose huyết ngoại sinh bằng glucose (khả năng dung nạp glucose ngoại sinh), trên mô hình ĐTĐ typ 1 (bằng STZ) và trên mô hình ĐTĐ typ 2 (bằng STZ và chế độ ăn). Định hướng nghiên cứu: - Tiếp tục hoàn thiện và ổn định mô hình gây ĐTĐ typ 1 bằng STZ, typ 2 bằng chế độ ăn giàu dinh dưỡng và STZ liều thấp. - Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết Bông ổi trên các mô hình ĐTĐ. Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng việt Tạ Văn Bình (2007), Những nguyên lý nền tảng bệnh đái tháo đường, tăng glucose máu, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, ĐoànThị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 1, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr. 260-262. Nguyễn Phương Dung, Lê Võ Định Tường (2001), “Kết quả bước đầu nghiên cứu một số cây thuốc, bài thuốc chữa bệnh đái tháo đường”, Tạp chí Y học thực hành, 8, tr. 50-52. Nguyễn Thu Hằng, Phạm Thanh Kỳ, Trần Vân Hiền (2004), “Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của hoa cơm cháy tròn (Sambucus nigra ssp.canadensis (L.) R. Bolli)”, Tạp chí Dược học, 336, tr. 13-14. Nguyễn Khánh Hòa, Đào Văn Phan, Nguyễn Duy Thuần (2002), “ Nghiên cứu sàng lọc tác dụng hạ đường huyết của chè Nhật bản, đỗ trọng, huyền sâm, nhàu”, Tạp chí Nghiên cứu y học, 20(4), tr. 33-37. Phùng Thanh Hương, Đỗ Thị Hà Phương, Nguyễn Xuân Thắng, Đỗ Ngọc Liên (2007), “Tác dụng hạ glucose huyết của cao chiết lá bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa (L.) Pers.) trên chuột tăng glucose huyết thực nghiệm”, Tạp chí Dược học, 377, tr. 11-17. Phùng Thanh Hương, Mai Thanh Vân, Hồ Thị Thanh Xuân, Nguyễn Xuân Thắng (2009), “ ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết lá bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa (L.) Pers.) lên hoạt độ enzym glucose 6 phosphatase và hexokinase của gan chuột thực nghiệm”, Tạp chí Dược học, 398, tr.37-40. Vũ Ngọc Lộ (2005), “Những dược liệu có tác dụng hạ đường huyết và trị tiểu đường”, Tạp chí Dược học, 353, tr. 7-8. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, tr. 542-543. Đào Văn Phan, Nguyễn Khánh Hòa, Phạm Hữu Điển (2005), “Tác dụng hạ đường huyết của Bạch truật, Câu kỷ tử và Cam thảo nam trên chuột nhắt trắng, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 38 (5), tr.12-16. Đỗ Thị Nguyệt Quế, Nguyễn Trần Thị Giáng Hương, Nguyễn Duy Thuần, Nguyễn Viết Thân, Nguyễn Thị Kim Huế (2009), “Bước đầu đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của rễ cây chóc máu (Salacia cochinchinesis) trên chuột nhắt bị tăng glucose huyết bằng streptozocin”, Tạp chí Dược học, 399, tr. 28-32. Nguyễn Thị Minh Thanh, Lại Thị Kim Dung, Trần Thanh Phong, Đỗ Ngọc Liên (2008), “Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của quả dứa dại (Pandanus odoratissimus L.) họ Dứa dại (Pandanaceae)”, Tạp chí Y học thực hành, 587+598 (2) -2008, tr. 56-58. Nguyễn Đức Diệu Trang, Đặng Văn Giáp, Võ Thị Cẩm Vy, Lê Quang Nghiệm ((2008), “Nghiên cứu tương đương sinh học của viên gliclazid 30mg phóng thích kéo dài”, Tạp chí Dược học, 389, tr. 13-15,34. Tạ Thành Văn, Nguyễn Thị Phương Thúy (2006), “Khảo sát tác dụng hạ đuờng huyết của dịch chiết cây dừa cạn (Catharanthus roseus) trên chuột nhắt trắng bình thường và chuột gây đái tháo đường bằng streptozocin”, Tạp chí Y học Việt Nam, 320 (3), tr.15-20. Đỗ Quốc Việt, Trần Văn Sung, Nguyễn Thanh Thúy (2006), “Sơ bộ nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của quả chuối hột (Musa balbisiana) trên chuột thực nghiệm”, Tạp chí Dược học, 361, tr. 8-10,30. Viện Dược Liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr. 199-207. Nguyễn Ngọc Xuân (2004), Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của Thổ phục linh (Smilax glabra roxb smilacaceae) trên súc vật thực nghiệm, Luận án tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội. Đại học Y Hà nội (2008), Sinh lý bệnh học, NXB Y học, tr 58-71 Tài liệu tiếng Anh Alagesaboopathi (2009), Ethnomedicinal plants and their utilization by villagers in Kumaragiri hills of Salem district of Tamilbadu, Ibdia, Afr. J. Trad. CAM (2009) 6 (3), pp. 222 - 227. Antonios Chatzigeorgiou, Antonios Halapas, Konstannious Kalafatakis and Elli Kamper (2009), The Use of Animal Models in the Study of Diabetes Mellitus, in vivo, 23, pp. 245-258. Anup Maiti, Saikat Dewanjee, Goutam Jana, Subhash C. Mandal (2009), Hypoglycemic effect of Swietenia macrophylla seeds against type II diabetes, Inter. J. Green Pharm., 2008, pp.224-227. Ashok D. Chougate, Shrimant N. Panakar, Pradeep M. Gurao and Akalpita U. Arvindekar (2007), Optimization of Alloxan dose is essential to Induce Stable Diabetes for Prolonged Period, Asian Journal of Biochemistry, 2 (6), pp. 402-408. Barbara LuBec, Michel Hosrmon, Harald Hoeger and Gert Lubec (1998), Aromatic hydroxylation in animal models of diabetes mellitus, The FASEB Journal, 12 , pp 1581-1587. Brian Siu, Jharna Saha, William E Smoyer, Kelli A Sullivan and Frank C Brosius (2006), Reduction in podocyte density as a pathologic feature in early diabetic nephropathy in rodents: Prevention by lipoic acid treatment, BMC Nephrology, 7 (6), pp. 1-11. Centers for disease control and prevention (2007), National Diabetes Fact Sheet 2007. Dhanabal S. P, Mohan Marugaraja M. K and Suresh (2008) B, Antidiabetic activity of Clerodendron phlomoidis Leaf Extract in Alloxan -Induced Diabetic Rats, Indian J. Pharm. Sci., 70 (6), pp. 841-844. Durgacharan A. Bhagwat, Suresh G. Killedar, Rahul S. Adnaik (2008), Anti-diabetic activity of leaf extraxt of Tridax procumbens, Inter. J. Green Pharm., 5, pp.126-128. Edwin jarald, Siddaheswar Balakrishnan Joshi and Dharam Chandra Jain (2008), Diabetes and Herbal Medicines, Iranian Journal of Pharmacology & Therapeutics, 7(1), pp 97 - 106. Hiroshi Ikegami, Tomomi Fujisawa, and Toshio Ogihara (2004), Mouse Models of Type 1 and Type 2 Diabetes Derived from the Same Closed Colony: Genetic Susceptibility Shared Between Two Types of Diabetes, ILAR Journal, 45 (3), pp.268-277. Jasim Uddin Chowdhuryl, Nemai Chandra Nandi and MD Nazrulislam Bhuiyan (2007), Chemical composition of leaf essential oil of Lantana Camara L. from Bangladesh, Bangladesh Journal of Botany, 36 (2), pp 194 - 195. [30] Ji Su Kim, Jung Bong Ju, Chang Won Choi and Sei Chang Kim (2006), Hypoglycemic and Antihyperlipidemic Effect of Four Korean Medicinal Plants in Alloxan Induced Diabetic Rats, Am. J. Biochem. & Biotech., 2 (4), pp.154-160. John P. Mordes, Rita Bortell, Elizabeth P. Blankenhorn, Aldo A. Rossini, and Dale L. Greiner (2004), Rat Models of Type 1 Diabetes: Genetics, Environment, and Autoimmunity, ILAR Journal, 45 (3), pp.278-291. Julie Takada, Miriam Helena Fonseca-Alaniz, Tarcila Beatriz Ferraz de Campos, Sandra Andreotti (2008), Metabolic recovery of adipose tissue is associated with improvement in insulin resistance in a model of experimental diabetes, Journal of Endocrinology , 198, pp. 51–60. Lenika Sagar, Rajesh Sehgal and Sudarshan Ojha (2005), Evaluation of antimotility effect of Lantana camara L. var. acuelata constituents on neostigmine induced gastrointestinal transit in mice, BMC Complementary and Alternative Medicine - Panjab University, Chandigarh – India. Lenzen S (2008), The mechanisms of alloxan- and streptozotocin-induced diabetes, Diabetologia, 51, pp. 216-226. Manway Liu, Arthur Liberzon, Sek Won Kong, Weil R. Lai, Peter J. Park, Isaac S. Kohane, Simon Kasif1(2007), Network-Based Analysis of Affected Biological Processes in Type 2 Diabetes Models, PLoS Genetics, 3, pp 32-39. Ming Zhang, Xiao-Yan Lv, Jing Li, Zhi-Gang Xu, and Li Chen (2008), The Characterization of High-Fat Diet andMultiple Low-Dose Streptozotocin Induced Type 2 Diabetes RatModel, Experimental Diabetes Research, vol 2008, pp. 1-9. Mohamed Bnouham, Abderrahim Ziyyat, Hassane Mekhfi, Abdelhafid Tahri, Abdelkhaleq Legssyer (2006), “Review: Medicinal plants with potential antidiabetic activity - A review of ten years of herbal medicine research (1990-2000)”, Int J Diabetes Metab 14 (1), pp. 25. Nigel Unwin and Amanda Marlin (2004), Diabetes Action Now: WHO and IDF working together to raise awareness worldwide, Diabetes Voices, 49 (2), June 2004. Papiaya Mitra Mazumder, Mamta Farswan, V. Parcha (2009), Effect of an isolated active compound (Cg-1) of Cassia glauca leaf on blood glucose, lipid profile, and atherogenic index in diabetic rats, Indian J Pharmacol, 41 (4), pp. 182-186. Reed M.J., Meszaros K, Entes L.J, Claypool M.D, Pinkett J.G, Gadbois T.M, Reaven G.M (2000), A new rat model of type 2 diabetes: the fat-fed, streptozotocin-treated rat, J. Metabolism, 49 (11), pp. 1390-1394. Sarah Wild, Bchir, Gojka Roglic, Andersgreen, Richard Sicree, Hilary (2004), Global Prevalence of Diabetes Estimates for the year 2000 and projections for 2030, Diabetes Care, 27 (5), pp. 1047-1053. Sarika Jain, Pandhi S, Singh A.P, Samir Malhotra, (2006), Efficacy of standardised herbal extracts in type 1 diabetes - an experimental study, Afr. J. Trad. CAM (2006), 3 (4), pp. 23 - 33. Sivaraj A, Devi K, Palani S, Vinoth Kumar P, Senthil Kumar P, David E (2009), Anti-hyperglycemic and Anti-hyperlipidemic effect of combined plant extract of Cassia auriculata and Aegle marmelos in streptozotocin (STZ) induced diabetic albino rats, Int.J. PharmTech Res, 1 (4), pp 1010-1016. Srinivasan K, Ramarao K (2007), Animal models in type 2 diabetes research: An overview, Indian J Med Res, 125, pp 451-472. Srinivasan K, Viswanad B, Asrat L, Kaul CL, Ramarao P (2005), Combination of high-fat diet-fed and low-dose streptozotocin-treated rat: a model for type 2 diabetes and pharmacological screening, Pharmacol Res. , 52(4), pp. 313-320. Tomonori Nakamura, Tomoko Terajima, Taeko Ogata, Koichi Ueno, Naotake Hashimoto, Kageyoshi Ono, and Shingo Yano (2006), Establishment and Pathophysiological Characterization of Type 2 Diabetic Mouse Model Produced by Streptozotocin and Nicotinamide, Biol. Pharm. Bull. 29(6), pp. 1167—1174. Udayan P.S, Satheesh George, Tushar K.V. and Indira Balachandran (2006), Medical plants used by the Malayali tribe of Servarayan hills, Yercad, Salem district, Tamil nadu, India, Zoos’ print journal, 21(4), pp. 2223-2224. William T. Cefalu (2006), Animal Models of Type 2 Diabetes: Clinical Presentation and Pathophysiological Relevance to the Human Condition, ILAR Journal, 47 (3), pp.186-198. World Health Organization & International Diabetes Federation (2006), Definition and diagnosis of diabetes mellitus and intermediate hyperglycemia.