Đề tài Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản

MỤC LỤC MỞ ĐẦU Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con người ngày càng được chú trọng đặc biệt là các sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe β-Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho con người, thú y từ khi chúng được giới thiệu trên thị trường vào năm 1938 và là loại kháng sinh được dùng nhiều nhất hiện nay. Liều lượng và cách dùng kháng sinh không đúng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị bệnh càng khó khăn. Ngoài ra còn gây lãng phí cho người bệnh vì có các bệnh do virut không chữa được bằng kháng sinh nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đoán các bệnh và ảnh hưởng sức khỏe của người bệnh. Hàm lượng lớn kháng sinh trong máu gây ra các bệnh về thận, đặc biệt ở người cao tuổi. Vì vậy kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng. Ở Việt Nam đã có rất nhiều công trình nghiên cứu tách và xác định đồng thời các kháng sinh β-Lactam trong các mẫu dược phẩm, sinh học, thực phẩm và môi trường chủ yếu là các công trình phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Phương pháp HPLC là phương pháp tách chọn lọc, độ nhạy cao, lượng mẫu bơm ít thời gian phân tích ngắn. Tuy nhiên phương pháp cũng có một số nhược điểm là phải sử dụng một lượng lớn dung môi để rửa cột, giá thành phân tích cao. Ngược lại, phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) lại sử dụng một lượng hóa chất không đáng kể, tiết kiệm chi phí từ 3 – 4 lần, lượng mẫu bơm nhỏ hơn trong HPLC hàng trăm lần, cỡ nl, cho độ tin cậy cao. Tách và xác định đồng thời kháng sinh β-Lactam bằng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) trong mẫu dược phẩm và sinh học là một hướng nghiên cứu mới, song với ưu điểm của nó thì phương pháp sẽ ngày càng thông dụng được áp dụng nhiều trong phòng thí nghiệm và phân tích mẫu dịch vụ. Vì vậy chúng tôi quyết định chọn đề tài là “ Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản” CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam [1,2,10,25] Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam. Gồm các nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin. Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA). Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên. Cấu trúc và phân loại: * Các penicillin Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng β-Lactam Hình 1.1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: (2S,5R,6R 3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S, 5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác nhau. Với M là gốc cation thường là: K, Na, H. Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau. Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin Tên kháng sinh R Hoạt tính Nhóm penicillin tự nhiên Penicillin G (PENG) Benzathin Benzyl Gồm các Penicillin tự nhiên và dẫn chất.Phổ hẹp: vi khuẩn gram(+). Không kháng β-lactamase Nhóm penicillin kháng penicilliiase Oxacillin (OXA) 6-[(5-methyl-3-phenyl-1,2-oxazole-4-carbonyl)amino] Là các Penicillin bán tổng hợp. Phổ hẹp như nhóm I. Kháng penicilliiase, không tác động vào vòng β – Lactam được. Cloxacillin (CLO) 6-{[3-(2-chlorophenyl )-5-methyl-oxazole-4-carbonyl]amino} Nhóm penicillin phổ rộng Ampicillin (AMP) 6-([(2R)-2-amino-2-phenylacetyl]amino) Phổ rộng, tác dụng cả khuẩn gram (+) và (-). Không kháng β-lactamase và penicilliiase Amoxicillin (AMO) 6-{[(2R)-2-amino-2-(4-hydroxyphenyl)-acetyl]amino} * Các cephalosporin Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác nhau bởi các gốc R Hình 1.2. Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R) 8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau. Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ. Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng trên gram âm yếu hơn thế hệ sau. Trong bản luận văn này, chúng tôi chỉ trình bày thế hệ I (CEP) và thế hệ III (CEF) Bảng 1.2. Phân loại và cấu trúc một số cephalosporin Thế hệ Kháng sinh R1 R2 R3 I: Phổ tác dụng trung bình, tác dụng mạnh nhất trên vi khuẩn gram (+), yếu nhất trên gram (-). Không bền và dễ bị β-lactamase phá hủy Cephalexin (CEP) H -CH3 III: Tác dụng tốt trên vi khuẩn gram (-), trên vi khuẩn gram (+) thì tác dụng kém penicillin và cephalosporin thế hệ I. Bền với β-lactamase Cefixim (CEF) H -CH=CH2 Tính chất: Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi hữu cơ phân cực vừa phải. Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa đồng thời nhóm –COOH và –NH2. Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp thụ). Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa= 2.5-2.8 tùy vào cấu trúc phân tử. Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng. Bảng 1.3. Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu Tên kháng sinh pKa1 Tên kháng sinh pKa1 Tên kháng sinh pKa1 PEN 2.74 AMO 2.8 CLO 2.7 AMP 2.7 CEP 2.6 CEF 2.75 OXA 2.72 Tác dụng: Cơ chế: Các penicillin có khả năng acyl hóa các D- alanin tranpeptidase, làm cho quá trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện. Sinh tổng hợp vách tế bào bị ngừng lại. Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, các penicillin còn hoạt hóa enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả là vi khuẩn bị tiêu diệt. Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của mang tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ rộng. Kháng thuốc: Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzim có tác dụng mở vòng β-lactam, theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng. Tất cả các cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi là kháng methicillin). Độc tính: Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc phản vệ.. Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và trong thời kỳ cho con bú. Chống chỉ định dị ứng với thành phần của thuốc. 1.2. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay Như trên cho thấy, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau. Kháng sinh chỉ có tác dụng với các bệnh do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus). Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp. Vì thiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở các nước đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cần thiết, không đúng chỉ định và không đúng cách. Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R. Gonzales [6,26], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp trên trong khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi,  không cần và không điều trị được bằng kháng sinh. Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở nên đề kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng vancomycin. Theo báo cáo của A.W. McCormick [13] năm 2003, tỉ lệ pneumococus kháng penicillin tăng nhanh ở Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004, 41% pneumococcus sẽ đề kháng penicillin. Tỉ lệ vi trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng 4 thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao.  Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với phương tiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế giới trong vòng 24 giờ. D.P. Raymond [17] mỗi năm ở Hoa kỳ có 2 triệu người bị nhiễm trùng vì lây lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi trùng kháng thuốc, gây tử vong cho 70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5 đến 10 tỉ đô-la Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J. Chalker [4], năm 1997 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnh nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian (dưới 5 ngày).  Theo [4] Qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít trẻ em. Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử vong. Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan... Phó giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60% tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện. Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng hoàn toàn. Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9%. Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là 42% Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng kháng sinh từ nhiều chục năm nay. Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các nhà chuyên môn đã thành lập “Liên Hiệp vì sự Sử  Dụng Kháng Sinh Hợp Lý” (Alliance for the Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm chống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát triển.    Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế Hoạch Toàn Cầu để Kiểm Soát Sự Đề Kháng Kháng Sinh”. Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế của tất cả các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng cường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu. Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngứa sự lưu hành của các thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang phát triển là thuốc giả mạo, không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất…… Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiêu của kháng sinh, hạn chế được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng.  1.3. Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam 1.3.1. Phương pháp quang học Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-lactam, đặc biệt trong dược phẩm. Các β-lactam hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ, chúng cũng tạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo. Trong nhiều trường hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích. Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các β-lactam với độ nhạy khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các β-lactam. A. Fernández-González và cộng sự [11] dùng Cu2+ thủy phân và tạo phức với AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thu được 4.10-7M (0.16 mg/l). Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy cho hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống, huyết thanh… Theo [18], F. Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp cải tiến sự thủy phân của kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl2, KCl 2M. Kết quả tạo ra phức màu vàng được đo tại bước sóng 335 nm. Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l và giới hạn phát hiện của AMP là 0.73 mg/l, AMP 0.76 mg/l Wei Liu và cộng sự [28], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ luminol-K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân tích một số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN là 0.5 mg/l, cefradine 0.04 mg/l, cefadroxil là 0.08 mg/l, 0.1 mg/l CEP. Kết quả được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP trong mẫu là 0.1 mg/l. Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này. 1.3.2. Phương pháp điện hóa Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam nhưng không phổ biến nhiều. Theo [7], Daniela P. Santos và cộng sự sử dụng sensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0.92 μM (0.39 mg/l) trong môi trường đệm axetat 0.1M pH=5.2. 1.3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất. Phương pháp HPLC với cột tách pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định các kháng sinh β-lactam trong các loại mẫu khác nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ chính xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng… Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi rửa giải. Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã mở rộng khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối với phân tích dư lượng, detector khối phổ (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể phát hiện và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp. Theo [29], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa. Điều kiện chạy sắc ký: cột Inertsil ODS2 (4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN – (C2H5)3N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong sữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25-100 μg/kg. J.M. Cha và cộng sự [19] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích β-lactam trong nước sông và nước thải. Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C18 (2.1 mm×50 mm, 2.5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C = Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phút A/B/C=50:40:10, 20 phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0.25 ml/phút; nhiệt độ cột 450C; thời gian 20 phút. Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước bề mặt, 13 – 18 ng/l với nước thải trước xử lý, 8 – 15 ng/l với nước thải sau xử lý. Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh quang, với ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao. Như trong [16] C.Y.W Yang và cộng sự dùng cột Spherisorb ODS2 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) phân tích AMO trong sữa bò (pha động: ACN/đệm photphat 10mM pH 5.6 – 24/76; detector huỳnh quang: 346 nm – 422 nm) đạt giới hạn phát hiện lần lượt 0.5 μg/kg và 0.3 μg/kg. Tuy vậy, do các β-lactam ít tạo phức phát huỳnh quang và cơ chế phát quang dựa trên phản ứng quang hóa [24, 16] nên chỉ áp dụng với số ít chất hoặc phân tích riêng từng chất chứ không áp dụng phân tích đồng thời nhiều kháng sinh cùng lúc được. Tác giả Ngô Quang Trung [5] đã xây dựng quy trình phân tích đồng thời 6 kháng sinh β_Lactam gồm: AMO, CEP, AMP, CLO, CEF, PENG trong nước thải bệnh viện tại khu vực Hà Nội. Tác giả sử dụng cột tách Supelcosil ODS 250 mm x 4.6 mm, 5 µm, pha động gồm đệm axetat 12 mM pH 4, 70%; ACN 20%, MeOH 10%. Detector UV-VIS đo ở bước sóng 212 nm. Xây dựng đường chuẩn các kháng sinh trong khoảng 0.1 – 1 mg/l, hệ số tương quan R > 99.8%. Giới hạn phát hiện LOD và LOQ là 0.4 và 0.1 mg/l Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ dẫn… để phân tích các β-lactam. Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương pháp đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ. 1.3.4. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau. L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M. Valcárcel [21] sử dụng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm điện di gồm 40 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8.5. Tiến hành phân tích tại thế điện di 10 kV, nhiệt độ 200C, thời gian bơm mẫu 10s. Phương pháp cho phép tách 6 kháng sinh gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích trong mẫu nước thải của trang trại chăn nuôi. Giới hạn phát hiện từ 0.14 đến 0.27 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 0.25 đến 0.86%, diện tích pic 1.3 đến 4.15%. Độ thu hồi trên 96%. Biyang Deng và cộng sự [15] đã sử dụng phương pháp điện di với detector điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp 0.31 μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95.77%, độ lệch chuẩn tương đối không lớn hơn 2.2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/ mẫu. Attila Gaspar và cộng sự [14] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh họ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis – CZE). Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6.8. Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện 14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon, cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim, ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0.42 – 1.62 mg/l. Trong đó CEP và CEF có giới hạn phát hiện tương ứng 1.62 và 0.89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l. Mục đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25, +4 và -180C). Kết quả cho thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau khi pha loãng. M.I.Bailon-Perez và cộng sự [22] sử dụng phương pháp CZE và detector UV – DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH 8 và 20% (v/v) ethanol, dùng kĩ thuật chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP, AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước ( nước sông, nước thải…). Giới hạn phát hiện tương ứng 0.8; 0.8; 0.25; 0.30; 0.30; 0.9; 0.08 μg/l cùng độ thu hồi đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 10%. Phương pháp MEKC cũng được M.I. Bail´on P´erez, L. Cuadros Rodr´ ıguez, C. Cruces-Blanco [23] xác định 9 loại kháng sinh β_Lactam gồm CLO, dicloxacillin, OXA, PENG, penicillinV, AMP, nafcillin, piperacillin, AMO trong mẫu dược phẩm. Các điều kiện tối ưu được chọn là 26 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH = 8.5 làm chất nền điện di và thế điện di 25 kV. Giới hạn phát hiện LOD 0.35 đến 1.42 mg/l, giới hạn định lượng 2.73 đến 5.74 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 1.5 đến 1.7%. Độ thu hồi từ 91 – 95.6%. .Nhìn chung, phương pháp quang học và phương pháp điện hóa rất dễ tiến hành, đơn giản nhưng chỉ xác định từng chất riêng rẽ, điều này rất khó cho việc phân tích các mẫu có đa thành phần. Với phương pháp HPLC kết quả tách tốt, độ chính xác, độ nhạy cao nhưng giá thành chi phí phân tích một mẫu lớn. Vì vậy phương pháp MEKC sẽ là bước phát triển mới khắc phục những nhược điểm của phương pháp quang, điện, HPLC mà kết quả đáng tin cậy. Trong bản luận văn này, chúng tôi nghiên cứu theo hướng của tác giả L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M. Valcárcel [21], M.I. Bail ´on P´erez, L. Cuadros Rodr´ ıguez, C. Cruces-Blanco [23] trong mẫu dược phẩm và sinh học. CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và nội dung nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng Xác định hàm lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và mẫu máu là một mảng đề tài rất thực tế và quan trọng. Như đã chúng tôi đã đề cập trong bản luận văn này, vấn đề lạm dụng không đúng hàm lượng kháng sinh đem lại rất nhiều tác hại và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người Trong đề tài này, đối tượng phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là penicillin (PENG), cloxacillin (CLO), oxacilin (OXA) ampicillin (AMP), amoxicillin (AMO), cephalexin (CEP), cefixim (CEF) là các kháng sinh β-lactam được sử dụng phổ biến hiện nay. 2.1.2. Nội dung nghiên cứu Nội dung đề tài cần giải quyết là: - Lựa chọn phương pháp nghiên cứu là phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với detector DAD Nghiên cứu chọn điều kiện tối ưu tách các kháng sinh b-lactam có thể tách và xác định đồng thời các kháng sinh b-lactam như: pH, nồng độ chất điện ly, điện thế, nhiệt độ…. Đánh gía thống kê phương pháp phân tích Áp dụng phân tích một số mẫu thuốc và mẫu máu Đánh giá ưu khuyết điểm của phương pháp 250C 2.2. Giới thiệu chung về phương pháp Điện di mao quản [7,8,20] Để thực hiện được nhiệm vụ của luận văn, kỹ thuật tách được chọn là phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) 2.2.1. Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản - Nguyên tắc của sự tách: là dựa trên cơ sở tính chất điện di (sự di chuyển - Mobility) của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong mao quản (đường kính 25 - 100 mm ID) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp bởi một nguồn thế cao một chiều (V: 15 - 40 kV) đặt vào hai đầu mao quản. Nghĩa là CEC là kỹ thuật tách được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển sự tách của các chất. Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít mẫu và các hoá chất khác phục vụ cho sự tách, nhưng số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất xẩy ra nhanh và hiệu quả cao. - Cơ chế điện di: Sự điện di của các phần tử chất tan (các ion) trong ống mao quản là cơ chế di chuyển khác nhau của chất tan ( chất phân tích ), dưới tác dụng của lực điện trường E nhất định (Electric Field Force: EFF) và tính chất (đặc trưng) của dòng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), trong sự phụ thuộc vào điện tích và kích thước của chúng. (Trong đó dòng EOF gọi là dòng điện di thẩm thấu, hay dòng điện thẩm). 2.2.2. Thiết bị của phương pháp điện di mao quản - Trang thiết bị của hệ: Theo nguyên tắc, để thực hiện điện di, hệ thống máy phải có các bộ phận chính như sau: 1. Buồng điện cực, bình điện di và các điện cực trơ (Au hay Pt), 2. Cột tách sắc ký (cột mao quản hay gọi tắt là mao quản), 3. Nguồn cấp thế cao một chiều (15-40 kV), tạo lực điện trường E, để điều khiển quá trình điện di (sắc ký) của các chất, 4. Bộ phận nạp mẫu vào mao quản (cột tách), 5. Bộ phận phát hiện các chất sau khi tách (detector), 6. Bộ phận điều nhiệt cho mao quản, 7. Bộ phận ghi nhận sắc đồ tách của các chất trong hỗn hợp mẫu. Các bộ phận này có thể xem trong sơ đồ nguyên lý mô tả ở hình 1. Hình 2.1. Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản 2.2.3 . Các quá trình xẩy ra trong mao quản Trong quá trình điện di, dưới tác dụng của lực điện trường E, do điện thế V đặt vào hai đầu mao quản tạo ra, trong mao quản có các quá trình là: 1. Sự xuất hiện lớp điện kép sát thành mao quản, 2. Trong mao quản có dòng điện i (5 – 200 mA), 3. Xuất hiện dòng điện di thẩm thấu, EOF, 4. Sự tương tác của các chất mẫu và pha động (MP) với thành mao quản, 5. Sự khuếch tán, hay hội tụ của vùng mẫu các chất, khi di chuyển, 6. Sự phân bố của các chất giữa 2 pha (động và tĩnh), khi mao quản có pha tĩnh thật hay pha tĩnh giả (Mixen, trong hệ MEKC), 7. Hiệu ứng nhiệt Jun, làm mao quản nóng lên, 8. Sự phân tán, gradient và truyền nhiệt từ tâm mao quản ra xung quanh. 9. Sự di chuyển (sự điện di) của các chất (như các ion âm, ion dương, và phần tử trung tính) trong mao quản. Đây là quá trình chính tạo ra sự sắc ký của các chất. Nhưng các quá trình trên (1-8) lại có tương tác và ảnh hưởng đến quá trình 9, nó có thể làm tốt và cũng có thể làm xấu quá trình điện di chuyển này của chất. Đó là các quá trình luôn xẩy ra trong mao quản của HPCEC. Trong 9 quá trình xẩy ra đó, chỉ có quá trình 9 là dẫn đến sự tách của các chất, nhưng các quá trình khác (1-8) lại ảnh hưởng đến quá trình 9, hoặc trực tiếp, hoặc gián tiếp. Vì thế, muốn có kết quả điện di tốt, nhất thiết chúng ta phải luôn xem xét tất cả các quá trình đó và các yếu tố liên quan đến các quá trình đó trong mao quản. Tức là phải tối ứu hoá các điều kiện điện di cho một loại đối tượng mẫu và các chất cần xác định, để có được hiệu quả tách cao. 2.2.4. Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao quản Sắc ký điện di mao quản rất đa dạng, nhiều kiểu, từ đơn giản đến hoàn chỉnh và phức tạp, nhưng tuỳ theo cơ chế, bản chất, và đặc điểm của sự tách (sự điện di) xẩy ra trong ống mao quản mà người ta thường phân chia thành các loại hay các kiểu (Mode) khác nhau, và gán cho mỗi kiểu một tên riêng, để dễ hiểu, hay phân biệt và sử dụng chúng cho thích hợp. Cụ thể các kiểu đó là: 1. Điện di mao quản cổ điển (Capillary Electrophoresis: CE) 2. Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis: CZE) 3. Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (Micell), (Micellary Capillary Electro-Kenetic:MEK hay MCEK). 4. Điện di mao quản Gel-Filter (sàng lọc hay rây phân tử), (Capillary Gel Electrophoresis: Gel-CE), 5. Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric Focusing : CIEF). 6. Điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Iso-Tacho-Phoresis: CITP). 2.2.5. Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen ( MCEK, hay viết ngắn gọn là MEKC) là một kiểu của kỹ thuật tách theo bản chất của sự điện di có sử dụng kết hợp cả tính chất của kỹ thuật điện di mao quản ( Capillary Electrophoresis) và sắc ký lỏng (LC) có pha tĩnh. Nó là một trong các kiểu tách sắc ký (separation mode) của kỹ thuật CE được ứng dụng rộng rãi trong sinh học, y học và dược. Nó là một kiểu kỹ thuật điện di mao quản có sức mạnh, tiện lợi và được ứng dụng cho việc tách cả các chất phân tử trung hoà và các chất mang điện tích (hợp chất liên kết ion). Vì thế nó bổ sung và làm phong phú về chủng loại của kỹ thuật điện di. Bản chất và trung tâm của sự tách ở đây là sự hình thành các phần tử Mixen (tiểu phân Mixen - pha tĩnh giả) trong ống mao quản và các tiểu phân này sẽ dẫn dắt và đóng góp khả năng của quá trình tách sắc ký điện di các chất trên nền của dung dịch chất đệm và chất điện ly trong ống mao quản. Sự tách sắc kí của các phân tử chất tan trung hoà bằng kỹ thuật MEKC được điều chỉnh bởi các chất hoạt động bề mặt nằm trong dung dịch MP điện di. Khi chất hoạt động bề mặt ở nồng độ cao hơn nồng độ ngưỡng của Mixen (giới hạn hình thành Mixen, CMC: Critial Micellary Concentration), ví dụ chất hoạt động bề mặt SDS (Sodium Dodecyl Sulfat), có CMC=9 mM, thì một tổ hợp của các phần tử tiểu phân của chất hoạt động bề mặt được tích tụ lại và chúng hình thành (hay tạo ra) trong ống mao quản các tổ hợp của các tiểu phân SDS. Nó chính là các Mixen (pha tĩnh giả). Các Mixen này là các tiểu phân có đầu kị nước của chất hoạt động bề mặt, định hướng vào trung tâm của Mixen và để cho đầu ưa nước của nó ra ngoài và sẽ tương tác với ion chất đệm, hay ion chất tan. Nghĩa là đầu mang điện tích của chất hoạt động bề mặt sẽ hướng ra chất đệm. Cấu trúc tiêu biểu của Mixen được mô tả trong hình 2.2. Các Mixen ở đây hoạt động như một pha tĩnh. Các phân tử của chất mẫu (chất phân tích) được phân bố vào trong cả Mixen và cả ở ngoài Mixen (trong pha động) theo một cân bằng động học, có hằng số phân bố Ki xác định, trong những điều kiện nhất định đã được chọn để chạy điện di và mỗi chất tan Xi sẽ có một hằng số phân bố Ki nhất định trong điều kiện đó. Nếu các Ki của các chất tan là khác nhau rõ rệt thì sẽ có được kết quả sắc kí điện di tốt. Phương pháp MEKC dùng để tách các chất phân tích có điện tích và không có điện tích. Đối với các chất có điện tích, các Mixen loại này chuyển động hoặc là cùng chiều hoặc là ngược chiều với dòng EOF, là tuỳ thuộc vào điện tích của chất hoạt động bề mặt và cấu trúc của Mixen . Các chất hoạt động bề mặt Aniônic, ví dụ như SDS, sẽ di chuyển về Anốt (cực dương), nghĩa là ngược chiều với hướng của dòng EOF. Trong dung dịch đệm điện di có pH trung tính và kiềm, khi dòng EOF di chuyển nhanh hơn tốc độ của Mixen , thì sự điện di thực (net movement) của Mixen là theo hướng của dòng EOF. Trong khi di chuyển như thế, các Mixen có thể tương tác với các phần tử chất tan (chất phân tích) như kiểu phân bố của sắc ký cột lỏng rắn (R-LC) theo cả tương tác ưa nước, tương tác kị nước và tương tác tĩnh điện, để tạo ra quá trình sắc ký của các chất mẫu, khi chạy qua cột mao quản trong quá trình điện di. Hình 2.2. Cấu trúc của các Mixen và dòng EOF trong MEKC ï: dòng EOF. O: Chất hoạt động bề mặt. ¢: Chất tan (chất PT).Þ : Dòng điện di của chất Đối với các phần tử chất tan trung tính, nó chỉ là sự phân bố của chất tan vào trong Mixen và ở ngoài Mixen (pha động điện di) theo một cân bằng động học có hằng số phân bố Ki nhất định trong điều kiện đã chọn. Chính sự phân bố theo kiểu cân bằng động học này gây ra (tạo ra) sự lưu giữ khác nhau của các chất tan, và tạo ra sự tách sắc ký các chất phân tích theo kiểu Mixen. Vì thế các Mixen trong ống mao quản của kỹ thuật tách này được gọi là pha tĩnh giả. Nhiều chất tan tương tác với Mixen khá bền, nó tồn tại trong Mixen dài hơn (lâu hơn) sự di chuyển của nó, khi các Mixen mang nó (các chất tan trung tính) một phần đi ngược chiều của dòng EOF. Khi mà các chất tan lại không tương tác với các Mixen, thì nó được dòng EOF mang một cách đơn thuần cùng với dòng EOF. Nhiều hợp chất kị nước tương tác rất mạnh với các Mixen, và nó bị lưu lại khá lâu trong mao quản, nên làm tăng thời gian lưu giữ của chất tan Cơ chế của sự tách các phần tử trung tính trong MEKC về cơ bản vẫn là kiểu tương tác phân bố của chất tan, tương tự như trong sắc ký cột lỏng-rắn (LC) hấp phụ, nhưng lại được điều khiển bới lực điện trường E của thế cao V giữa hai đầu mao quản tạo ra, mà không phải bằng áp suất đẩy pha động như trong HPLC. Trong kỹ thuật phân tích MEKC, các tính toán về hệ số dung tích ki’, số đĩa N của cột mao quản, độ phân giải R,... cũng dựa trên cơ sở tương tự với các tính toán của hệ sắc kí cột LC, và tất nhiên có bổ sung thêm một số yếu tố cho thích hợp và đúng đắn hơn cho hệ pha MEKC. Chính tỷ số giữa tổng số mol của chất tan (total moles of solute) ở trong Mixen (pha tĩnh giả), và tổng số mol của chất tan ở trong pha động (dung dịch đệm điện di), cũng được xem như là dung lượng của cột mao quản, và nó được biểu diễn theo công thức sau. ki’ = ( ti – t0 )/[t0.(1- ti/tmc)] = Ki.(VMC/VMP) (1) Trong đó: ti : Thời gian lưu của chất tan. t0 : Thời gian không lưu giữ của chất. tMC : Thời gian không lưu giữ của Mixen. Ki : Hệ số phân bố nhiệt động của chất tan giữa hai pha (VMC và VMP). Với VMC : Thể tích của pha Mixen , và VMP : Thể tích của pha động. Và tỷ số q = (VMC/VMP) cũng được gọi là tỷ số pha của hệ MEKC. Đồng thời từ biểu thức (1) chúng ta cũng rút ra được thời gian lưu của chất tan tR như sau. ti = [ t0.tMC.( 1+ ki’) ] / [ tMC + t0.ki’ ) ] (2) Nếu như mà ( tMC << t0.k’ ) thì chúng ta lại có: ti = [ tMC.( 1 + ki’) ] / ki’ ] (3) Nghĩa là thời gian lưu tR có quan hệ chặt chẽ với hệ số dung tích ki’. Khi hệ số ki’ lớn, thì thời gian lưu ti cũng lớn. Mặt khác, trong MEKC, tỷ số pha q là phụ thuộc vào nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong mao quản, và quan hệ này được biểu diễn bởi công thức sau đây. q = [V.( CSP- CMC )] / [ 1 – vmc.(CSP – CMC )] (4) Trong đó: V : Điện thế sử dụng để tạo ra điện trường E của sự điện di. CSP : Nồng độ của Mixen (mol/l.) CMC : Nồng độ giới hạn chuẩn của Mixen (mol/l.) Vmc : Tốc độ trung bình của Mixen . Ki : Hệ số phân bố của chất thứ i ở trong và ngoài Mixen . Và khi nồng độ Mixen không lớn, thì hệ số dung tích ki’, và tốc độ của dòng EOF, được tính như sau. ki’ = Ki.vmc .( CSP - CMC ) (5) vEOF = ( me + mMC ).E (6) Cùng với các tham số tR, ki’ , Rij đã nói ở trên, hệ số phân bố nhiệt động Ki của chất tan trong hệ MEKC, cũng là một đại lượng quan trọng có liên quan đến các quá trình xẩy ra trong mao quản và được xác định theo biểu thức sau. lnKi = (DH0/R.T) + ( DS0/R ) (7) Trong đó: DH0, DS0 là Entanpi và Entropi tiêu chuẩn của chất tan. R là hằng số khí, và T là nhiệt độ (oK) của cột mao quản. Biểu thức này cho chúng ta thấy hằng số phân bố Ki luôn luôn phụ thuộc vào nhiệt độ. Nó cũng là một hằng số nhiệt động. Nhìn chung, chúng ta thấy khi nhiệt độ tăng thì hệ số phân bố Ki đều giảm dần ở tất cả các chất. Với các chất khác nhau, thì hệ số Ki này cũng thay đổi rất khác nhau. Đó chính cũng là yếu tố thuận lợi cho sự tách trong kỹ thuật điện di. Đồng thời với các chất hoạt động bề mặt khác nhau thì cũng gây ảnh hưởng đến hệ số Ki khác nhau. Ngoài các đại lượng trên, độ phân giải R cũng là một thông số quan trọng của kỹ thuật MEKC. Độ phân giải Rij của hai chất , ví dụ như I và J trong hệ MEKC cũng được biểu thị bằng công thức sau đây theo ba thành phần cơ bản. Rij = A.z.ti (8) Trong đó: ________ Hiệu lực tách A: A = Ö (N/4) . (9) Độ chọn lọc z : z = [( a - 1 )/a] với a = k2’/k1’ (10) Thời gian lưu tR : ti = [k2’/(k2’+ 1)].{[(1 – t0/tmc )] / [1 + k1.( t0/tmc)]} (11) Trong đó: k’i : hệ số dung tích ti : Thời gian lưu của chất tan. t0 : Thời gian không lưu giữ của chất tmc: Thời gian không lưu giữ của Mixen. Công thức (8) và (9) này cho chúng ta thấy rằng, độ phân giải Rij có thể được nâng cao (làm tốt), khi tối ưu hoá được số đĩa N lớn nhất, khi chọn được điều kiện để có độ chọn lọc a và hệ số dung tích ki’ của các chất tan là phù hợp nhất. Để có được hệ số dung tích ki’ tốt, trong MEKC, có thể đạt được bằng cách thay đổi pH, thay đổi nồng độ của chất hoạt động bề mặt, thêm dung môi hữu cơ vào pha động (dung dịch đệm điện di). Nói chung, hệ số dung tích ki’ của chất tan là tăng tuyến tính cùng với sự tăng nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong một vùng nhất định. Song khi tăng nồng độ chất hoạt động bề mặt nhiều, thì một vấn đề xuất hiện ở đây là, nhất là khi dùng các chất hoạt động bề mặt loại ionic với nồng độ cao thường gây ra sự tăng cường độ dòng điện trong mao quản và hiệu ứng nhiệt Jun xuất hiện rõ rệt. Công suất điện trong vùng từ 5 - 7 W/m mao quản trong môi trường lực ion trung bình, thì cũng đã làm nhiệt độ mao quản đã tăng rõ rệt (có thể đến 10oC). Lúc này hiệu suất sắc ký bị giảm. Mặt khác với các ống mao quản có đường kính nhỏ (từ 25 - 100 mm), việc sử dụng từ trường điện thế V càng cao, thì đương nhiên sẽ càng làm nóng mao quản nhiều. Vì thế nên tránh dùng thế quá cao và cột mao quản đường kính (ID) lớn hơn 100 mm và cần phải điều nhiệt mao quản. Các chất hoạt động bề mặt được dùng trong MEKC cũng có thể tương tác với thành ống mao quản và cũng có thể ảnh hưởng nhất định đến dòng EOF, làm thay đổi sự tương tác hấp phụ giữa chất tan và thành ống mao quản. Hướng di chuyển của chất tan và của các Mixen, là cũng bị thay đổi trong sự phụ thuộc vào điện tích của Mixen và tốc độ của dòng EOF. Nói chung, các hệ đệm điện di có pH tương đối cao, thường được sử dụng để duy trì dòng EOF có tốc độ đủ lớn và đảm bảo hướng di chuyển ổn định của các Mixen. Bảng 2.1. Các chất hoạt động bề mặt dùng trong MEKC Loại chất Ví dụ CMC (mM) Số phần tử kết tụ (Mixen) Anionic SDS 14 62 Cationic DTAB 14 50 1,3 78 Non-Ionic Octylglucoside - - (không ionic) n-Dodecyl-b-D-maltoside 0,16 - Triton-X 0,24 140 Ionic kép CHAPS 8 10 (Zwitterionic) CHAPSO 8 11 Bile Salts Axít Chlolic 14 2-4 2.2.6. Phân tích định lượng trong phương pháp điện di mao quản Theo lý thuyết sắc ký, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn, thì thời gian lưu của chất là đại lượng đặc trưng để định tính (phát hiện) các chất. Còn chiều cao H của pic sắc ký hay diện tích S của pic là có liên quan chặt chẽ đến nồng độ Cx của chất. Trong một vùng nồng độ nhất định và không lớn, thì chúng ta luôn có biểu thức xác định mối quan hệ đó là: Hi = k1.Ci (12) và Si = k2.Ci (13) Trong đó: Hi và Si là chiều cao và diện tích của pic sắc ký của chất i. Ci là nồng độ của chất ứng với thời gian lưu tRi . k1, k2 là hằng số điều kiện thực nghiệm. Để phân tích định lượng các chất theo kỹ thuật CE, chúng ta dựa theo phương trình cơ bản trên và có thể dùng một trong hai phương pháp chuẩn hoá là phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm tiêu chuẩn để xác định nồng độ chất phân tích trong mẫu. 2.3. Thực nghiệm 2.3.1. Máy móc và dụng cụ - Máy điện di model 1602A của hãng HP3D (Đức) với detector DAD, kết nối với phần mềm HP chemstation - Mao quản silica trần – loại bubble cell, đường kính 50 µm, chiều dài 64.5 cm, chiều dài hiệu dụng 58 cm của hãng HP (Đức) - Mắc trắc quang UV – 1601PC của hãng Shimadzu - Máy đo pH TITROLINE của hãng SCHOTT – Đức - Bể siêu âm, máy ly tâm, hệ thống bơm chân không, cân phân tích, giấy lọc 0.45 μm; 0.2 μm của hãng Millipore (USA) - Các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác của Phòng thí nghiệm phân tích 2.3.2. Hóa chất - Các chất chuẩn PENG (Na), AMP.3H2O, AMO.3H2O, CLO (Na), CEP.H2O, CEF, OXA do Viện kiểm nghiệm Bộ Y tế ( 48 Hai Bà Trưng – Hà Nội) cung cấp - Nước deion được lọc qua giấy lọc 0.45µm của hãng Millipore (USA) - Axít Boric H3BO3, muối natri tetraborat Na2B4O7.10H2O, chất hoạt động bề mặt Natri dodecyl sunfat SDS, NaOH, NaH2PO4.2H2O, Na2HPO4… của hãng Merk ( Đức). - Đệm Borat được pha từ axit boric H3BO3, muối natri tetraborat Na2B4O7.10H2O với nước deion. Dung dịch được siêu âm 10 phút, lọc qua giấy lọc kích thước lỗ 0.2 μm và định mức tới thể tích mong muốn. Điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH và H3BO3, giá trị pH thay đổi cho phép ± 0.05 và được đo sau khi thêm SDS. Dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ thường - Dung dịch chuẩn được pha trong nước deion từ các chất chuẩn sau đó đem siêu âm 15 phút được dung dịch nồng độ 1000 mg/l. Dung dịch 1000 mg/l được pha loãng 10 lần thành 100 mg/l.( 1000 mg/l bảo quản trong 2 tháng và 100 mg/l bảo quản 1 tháng). Các dung dịch nồng độ thấp được pha từ dung dịch 100 mg/l và sử dụng trong ngày. Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh 40C, tránh ánh sáng trực tiếp. CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách β-Lactam 3.1.1. Chọn bước sóng phát hiện chất Để khảo sát phổ β-Lactam, detector được chọn là UV-Vis. Do các β-Lactam đều là những hợp chất không có mầu, hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại nên chúng tôi sử dụng máy quang phổ UV – 1601PC với khoảng quét phổ là 190 – 400 nm dùng cuvet thạch anh để xác định các bước sóng hấp thụ tối ưu của các chất này. Các chất được pha với nồng độ 10 mg/l trong 25 mM đệm Borat, 100 mM SDS, pH=9. Phổ thu được thể hiện hình 3.1 Hình 3.1 Phổ hấp thụ của các β-Lactam (nồng độ 10 mg/l ) Các hệ đệm đa axit hay đa bazơ có nhược điểm là có hấp thụ quang trong vùng UV hay UV-VIS gây khó khăn phát hiện chất.Vì thế phải quét phổ các chất đệm, xem xét sóng đo thích hợp để hạn chế ảnh hưởng Kết quả quét phổ cho ta thấy: các β-Lactam có phổ hấp thụ quang cao nhất ở 198 nm. Chúng tôi chọn bước sóng làm việc là 198 nm cho pic cao và đẹp nhất. Detector sử dụng của máy điện di là detector DAD của hãng HP 3.1.2. Mao quản và xử lý mao quản trước khi tách Trong kỹ thuật điện di việc sử dụng mao quản silica đường kính trong nhỏ hơn 100 µm sẽ làm mất ảnh hưởng của nhiệt jun sinh ra trong ống mao quản và do vậy mới cho phép áp vào hai đầu mao quản điện thế cao tới 20 – 30kV. Hơn nữa kích thước mao quản sẽ rất thuận lợi khi phân tích những mẫu có hàm lượng nhỏ như mẫu huyết thanh. Tuy nhiên, nếu mao quản có đường kính quá nhỏ thì thể tích mẫu nạp cũng bị giới hạn, điều này lại ảnh hưởng đến độ nhạy phát hiện. Khoảng đường kính trong của mao quản thường là 25 – 150 µm. Tốt nhất nên dùng mao quản có đường kính trong từ 25- 75 µm. Vì mao quản có ID lớn hơn 75 µm thường cho hiệu ứng nhiệt Iun lớn và khó khống chế nhiệt độ mao quản khi điện di. Để phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm loại mao quản chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này có đường kính trong là 50 µm Chiều dài mao quản cũng là yếu tố quan trọng, vì muốn áp thế cao vào hai đầu mao quản thì chiều dài mao quản phải đủ lớn. Về mặt lý thuyết, thế áp vào mao quản thông thường đảm bảo từ 200 – 600 V/cm là thích hợp. Việc chọn chiều dài mao quản chỉ có tính chất định tính phụ thuộc vào khoảng cách từ lọ mẫu đến detector và từ detector đến lọ đệm và tùy thuộc vào hỗn hợp chất mẫu cần tách. Mao quản của chúng tôi sử dụng là loại mao quản trần, có tổng chiều dài là 64.5cm, chiều dài hiệu lực là 58cm, loại bubble cell (có độ nhạy cao gấp 3 -5 lần so với cell thông thường) của hãng HP. Để tạo flowcell trên mao quản, tại chiều dài 58cm tính từ đầu mao quản loại bỏ lớp poliamit bằng cách đốt nóng một đoạn mao quản dài 2mm. Sau đó dùng giấy mềm tẩm axeton hoặc etanol lau sạch và lắp vào hệ điện di. Mao quản lần đầu tiên sử dụng được rửa lần lượt với NaOH 1M 10 phút, nước deion 10 phút và rửa với đệm chạy 30 phút. Sau khi chạy từ 3-4 lần thì hoạt hóa lại cột, rửa với NaOH 0.1M 3 phút, nước deion 3 phút và đệm chạy 10 phút. 3.1.3. Chọn phương pháp bơm mẫu Trong kỹ thuật điện di mao quản có thể đưa vào mao quản bằng ba phương pháp là phương pháp điện động học (electrokinetic), phương pháp thủy động học (hydrodynamic) và phương pháp Xiphong (siphon). Trong đó phương pháp điện động học và thủy động học được dùng rộng rãi Nguyên tắc của phương pháp điện là đặt một thế nhất định trong một thời gian nhất định vào đầu của hai điện cực, một điện cực nhúng trong lọ mẫu và một điện cực kia nhúng trong lọ đệm. Trong khi đó hai đầu của mao quản cũng được nhúng vào hai lọ mẫu và đệm nói trên. Như thế những ion mẫu sẽ di chuyển vào mao quản tạo thành vùng mẫu đầu mao quản. Ion nào có kích thước nhỏ, điện tích lớn sẽ được dẫn vào mao quản nhiều hơn. Trong mẫu nếu có hai chất phân tích có cùng nồng độ nhưng điện tích khác nhau thì lượng ion của những chất này được dẫn vào mao quản khác nhau. Do vậy nồng độ chất phân tích được nạp vào mao quản sẽ khác so với nồng độ mẫu thực. Sự sai khác này sẽ lớn nếu thời gian bơm mẫu dài. Trong thực tế điều này không đáng ngại vì người ta có thể loại trừ bằng cách bơm mẫu trong thời gian ngắn và ở những điều kiện như nhau trong mọi thí nghiệm nghiên cứu, thời gian bơm mẫu ngắn ảnh hưởng đến độ nhạy. Ngoài ra lượng mẫu bơm còn phụ thuộc vào độ dẫn của dung dịch mẫu, đặc biệt ở những mẫu có nồng độ muối cao mà ta không thể biết trước được như những mẫu nước tiểu. Trong phương pháp bơm mẫu thứ hai là bơm mẫu theo kiểu thủy động lực học bao gồm trong kiểu bơm mẫu này là bơm bằng áp suất hoặc xiphong. Nguyên tắc của phương pháp xiphong dựa trên sự chênh lệch độ cao của hai đầu ống mao quản được đặt cao thấp khác nhau một khoảng DH, một đầu nhúng vào lọ chứa mẫu và đầu kia nhúng vào lọ chứa đệm để mẫu tự xiphong vào ống mao quản trong thời gian nhất định. Như thế mẫu nạp vào được đặt ở đầu mao quản cao. Phương pháp này đơn giản nhưng khi nạp một lượng mẫu nhỏ cỡ vài nl thì khó chính xác và áp dụng cho những hệ điện di tự tạo đơn giản, độ lặp lại kém. Vì vậy ít được dùng. Phương pháp bơm mẫu bằng áp suất là dùng một áp suất thích hợp để nén vào lọ chứa mẫu và tạo chân không phía đầu kia mao quản trong một thời gian nhất định. Do lực áp suất đẩy và hút mà một lượng mẫu sẽ được bơm vào đầu mao quản. Áp suất hay được dùng từ 50 – 300 mbar. Mẫu được bơm vào sẽ có nồng độ đều và giống với nồng độ của chất tan trong mẫu phân tích. Trong phương pháp này chúng tôi chọn bơm mẫu theo phương pháp thủy động lực học với áp suất là 50 mbar và cách bơm mẫu này sẽ được dùng trong suốt quá trình thí nghiệm 3.1.4. Độ điện di và độ điện di hiệu dụng Trong kỹ thuật MEKC chất tạo Mixen có vai trò rất quan trọng, nó quyết định đến độ phân giải của quá trình tách. Các hạt Mixen hình thành trong dung dịch điện di đóng vai trò như pha tĩnh giả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dung loại Natri dodecyl sunphat (SDS), tức là Mixen được hình thành bởi các phân tử SDS. Theo lý thuyết, độ điện di [7,8] mtot(i) = ( mef + mEOF) = l/(ti .E) = (L.l)/(ti .V) (14) Thời gian lưu của chất tan i là: ti = (L.l)/(mtot(i) .V) (15) Trong đó: mtot(i) = (mef + mEOF ): Độ điện di tổng cộng (toàn phần) của chất tan. V: Điện thế được dùng đặt vào hai đầu ống mao quản, kV. l: Chiều dài hiệu dụng (56cm) và L là chiều dài tổng cộng của mao quản (64.5cm). E: Điện trường trong mao quản do thế V tạo ra. Điện trường E này do thế V (kV) đặt vào hai đầu ống mao quản và nó là lực chính điều khiển quá trình điện di của các chất và cả dòng EOF trong ống mao quản. Độ điện di hiệu dụng riêng µef của chất tan được tính theo công thức sau: µef = mtot - mEOF µtot = (L. l)/ ti .V = 64.5 . 56/ ti .V mEOF = (L.l)/ t0 . V = 64.5 . 56/ t0 . V Thời gian t0 được đo bằng cách dùng chất tan trung tính đánh dấu, chính chất tan này trong từng điều kiện nó nằm trong dòng EOF và sẽ di chuyển bằng tốc độ di chuyển của dòng EOF. Thời gian t0 được xác định bằng cách điện di metanol tinh khiết. Thực tế trong mỗi thí nghiệm chúng tôi quan sát thấy t0 trùng với tín hiệu nhiễu trên đường nền gây ra bởi dung địch đệm điện di. Vì thế trong các thí nghiệm chúng tôi đã sử dụng thời gian xuất hiện của tín hiệu này như thời gian t0 3.1.5. Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di Ảnh hưởng pH trong dung dịch đệm điện di được khảo sát với dung dịch điện di chứa: - 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 25 mM đệm Borat + 100 mM SDS - Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản 280C Gía trị pH thay đổi tại pH = 8.25; 8.0; 7.75; 7.5. Hình 3.2 Sắc đồ điện di của β-Lactam ở pH 8.25; 8.0; 7.75; 7.5 Bảng 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến thời gian di chuyển của β-Lactam pH Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO 8.25 5.47 8.38 9.37 9.48 10.83 11.78 12.404 13.44 8.0 5.58 8.35 9.95 10.12 11.11 12.09 12.74 13.08 7.75 5.67 8.34 10.62 10.88 11.41 12.37 12.84 13.32 7.5 5.83 8.41 11.43 11.87 12.36 13.05 14.11 14.43 Vì mao quản được sử dụng là mao quản thủy tinh silic. Khi cho mao quản silic không phủ tiếp xúc với dung dịch đệm có pH từ 7.5 đến 8.25 (>4), bề mặt mao quản tích điện âm nguyên nhân là do các nhóm silanol trên bề mặt mao quản phân ly proton, làm bề mặt mao quản mang tính âm điện (anionic), thì dòng EOF thường hướng theo phương từ anốt (cực dương) về phía catốt (cực âm). Khi có thêm chất hoạt động bề mặt SDS – dạng anionic, hình thành các Mixen. Các Mixen sẽ di chuyển về phía anốt (cực dương) nghĩa là ngược chiều với hướng của dòng EOF. Do từng tính chất riêng của các β-Lactam chúng phân bố vào Mixen khác nhau với hệ số phân bố khác nhau. Khi chất phân tích bám vào Mixen, chúng di chuyển cùng tốc độ Mixen, khi không bám vào Mixen, chúng di chuyển cùng tốc độ dòng điện di thẩm thấu. Kết quả là trong dòng EOF về phía cực âm là các phân tử trung hòa và các ion mang điện tích âm. Mixen và dòng EOF di chuyển khác tốc độ. Do hệ số phân bố vào Mixen khác nhau dẫn tới di chuyển tới cực âm với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau. Khi điện di ở pH từ 7.5 đến 8.25 làm cho dòng EOF và độ điện di µef của chất tan bị thay đổi theo. Trong dung dịch với gía trị pH cao hơn hay thấp hơn giá trị pI ( độ ion hóa) sẽ làm thay đổi điện tích của các chất tan. Nghĩa là khi thay đổi pH sẽ làm thay đổi chất tan bị dương điện hơn hay âm điện hơn hoặc ngược lại. Kết quả sẽ làm cho dòng EOF và độ điện di µef của chất tan cũng bị thay đổi theo. Điện di ở pH cao hơn giá trị pI (pI = -log I và I: độ ion hóa) làm cho chất tan có điện tích âm và nó sẽ di chuyển về phía anốt (đầu cực dương) chậm hơn dòng EOF. Như vậy cùng với tác dụng làm thay đổi điện tích của chất tan, sự thay đổi pH của dung dịch đệm điện di cũng làm thay đổi cả tốc độ của dòng EOF. Hơn nữa khi pH thay đổi nó cũng sẽ làm thay đổi sự tích điện của thành mao quản. Vì khi pH của pha động điện di thay đổi, sẽ làm thay đổi quá trình de-hydro, tách ion H trong nhóm –OH trên thành mao quản. Tức là làm thay đối lớp điện kép và thế Zêta. Qua đó mà tác động hay làm ảnh hưởng đến sự điện di của chất. Từ hình 3.3, ở pH =7.5 đến 8.25 độ điện di của PENG, OXA, CEF hầu như không bị ảnh hưởng. Đối với CLO độ điện di ko đổi pH 7.5 đến 8, đến pH 8.25 độ điện di cao hơn. Với CEP, AMP độ điện di thấp dần khi tăng dần gía trị pH, tại pH = 8.25 và 8.0 chân pic của CEP và AMP chưa tách ra được khỏi nhau. Nhận thấy càng tăng pH thì khả năng tách càng kém, thời gian di chuyển ngắn hơn và pic nhọn hơn. Ảnh hưởng này thể hiện rõ nhất ở AMP và CEP. Từ nghiên cứu, chũng tôi chọn pH =7.75 tốt nhất để tách các β-Lactam trong những nghiên cứu tiếp theo. 3.1.6. Ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm Cùng với pH của dung dịch đệm, chất điện ly trong pha động cũng có vai trò rất quan trọng và nó phải có nồng độ phù hợp. Trong thực tế người ta chọn chất đệm pH cũng chính là chất điện giải của sắc ký điện di.Tác động của chất điện giải thể hiện qua việc ổn định, duy trì dòng điện I và dòng điện thẩm EOF trong mao quản. Qua đó sẽ làm ảnh hưởng đến độ điện di hiệu dụng µef của chất phân tích. Trong hệ đệm, thì các hệ đệm đa axit, đa ba bazơ thường có hiệu lực tốt hơn các hệ đệm đơn axit, đơn bazơ. Vì các đa axit, đa bazơ có nhiều nấc phân ly, nên có khả năng đệm trong vùng pH rộng và tính linh hoạt cao. Các đệm dùng với nồng độ cao mà không gây hiệu ứng nhiệt lớn cho ống mao quản. Tiến hành chạy điện di thành phần đệm: 25 mM đệm Photphat - 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 100 mM SDS, pH =7.75 - Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản 280C Thực nghiệm nhận thấy, khi chạy điện di trong hệ đệm photphat thì chưa xuất hiện pic trước thời gian 15 phút. Vì vậy chũng tôi quyết định chọn đệm Borat cho các khảo sát tiếp theo. 3.1.7. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tạo mixen SDS Chất hoạt động bề mặt SDS được xem như pha tĩnh giả của sự tách vì thực chất nó vẫn chuyển động cùng với dòng điện di. Nồng độ SDS trong dung dịch đệm điện di có ảnh hưởng mạnh tới độ điện li hiệu dụng của các β-Lactam bởi nó liên quan đến sự hình thành hạt Mixen cũng như nồng độ Mixen trong dung dịch đệm điện di. Để khảo sát ảnh hưởng của SDS đến quá trình điện di, nồng độ SDS đã bị thay đổi tại ba giá trị là 75 mM; 100 mM và 125 mM. Các điều kiện khảo sát: - 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 25 mM đệm Borat, pH = 7.75 - Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản 280C Hình 3.4 Sắc đồ điện di của β-Lactam tại nồng độ SDS = 75 mM;100 mM và 125 mM Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ SDS đến thời gian lưu của β-Lactam Nồng độ SDS(mM) Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO 75 5.8 8.552 10.437 10.662 11.235 12.708 12.951 13.298 100 5.9 8.74 11.32 11.68 12.31 13.17 13.4 14.12 125 6.1 9.397 12.45 12.802 14.085 14.414 15.011 17.372 Thay đổi nồng độ chất hoạt động bề mặt SDS, gây ra sự thay đổi hấp thụ lên thành mao quản qua tương tác ionic hay hiệu ứng kị nước. Các chất hoạt động bề mặt được dùng trong MEKC cũng có thể tương tác với thành ống mao quản và cũng có thể ảnh hưởng nhất định đến dòng EOF, làm thay đổi sự tương tác hấp phụ giữa chất tan và thành ống mao quản. Hướng di chuyển của chất tan và của các Mixen cũng bị thay đổi trong sự phụ thuộc vào điện tích của Mixen và tốc độ của dòng EOF Chất hoạt động bề mặt là SDS là dạng anionic làm tăng dòng EOF, sẽ di chuyển về anot ( cực dương) nghĩa là ngược chiều với hướng của dòng EOF. Theo lý thuyết [7,8] Độ phân giải R cũng là một thông số quan trọng của kỹ thuật MEKC. Độ phân giải Rij của hai chất , ví dụ như I và J trong hệ MEKC cũng được biểu thị bằng công thức sau đây theo ba thành phần cơ bản. Rij = A.z.ti Trong đó: ________ Hiệu lực tách A: A = Ö (N/4) . Độ chọn lọc z : z = [( a - 1 )/a] với a = k2’/k1’ Thời gian lưu tr : ti = [k2’/(k2’+ 1)].{[(1 – t0/tm )] / [1 + k1.( t0/tm)]} Trong đó: k’i : hệ số dung tích ti : Thời gian lưu của chất tan. t0 : Thời gian không lưu giữ của chất Theo công thức, độ phân giải R có thể được nâng cao (làm tốt) khi tối ưu hóa được số đĩa N lớn nhất, khi chọn được điều kiện để có độ chọn lọc α và hệ số dung tích k’i của chất tan là phù hợp. Hệ số dung tích k’i nói chung là tăng tuyến tính cùng với sự tăng nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong một vùng pH nhất định. Càng tăng nồng độ thì thời gian lưu các chất β-Lactam càng tăng do ảnh hưởng của nồng độ các ion trong dung dịch càng lớn, tương tác với Mixen bền và lâu hơn sự di chuyển của nó, dẫn đến tốc độ di chuyển của các chất tan sẽ chậm hơn vì vậy thời gian lưu tăng, cường độ dòng cũng tăng, chiều cao pic bị thay đổi. Thời gian càng tăng thì pic sẽ càng bị kéo dãn và tù hơn. Độ điện di hiệu dụng của AMO và ClO tăng khi tăng nồng độ SDS, các chất còn lại độ điện di hiệu dụng hầu như không thay đổi, khả năng tách thay đổi nhiều, các pic tách hết chân. Song khi tăng nồng độ chất hoạt động bề mặt lên đáng kể, nhất là với loại ionic với nồng độ cao thường gây ra sự tăng cường độ dòng điện trong mao quản và hiệu ứng nhiệt Jun xuất hiện rõ rệt làm mao quản nóng lên. Tại nồng độ 125 mM nhận thấy tín hiệu nền xấu hơn so với nồng độ 75 mM và 100 mM, pic dãn rộng hơn. Nồng độ SDS 75mM hiệu quả tách cũng rất tốt nhưng chiều cao pic không bằng 100 mM, sẽ gây ảnh hưởng độ nhạy. Vì vậy chúng tôi chọn nồng độ SDS = 100 mM tối ưu để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo. 3.1.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm Cùng với pH của dung dịch đệm, chất điện giải (chất điện ly) trong pha động cũng có vai trò quan trọng và nó phải có nồng độ phù hợp. Trong thực tế, người ta cố gắng chọn chất đệm pH cũng đồng thời chính là chất điện giải của sắc ký điện di. Như vậy, pha động sẽ không phức tạp, không gây khó khăn ảnh hưởng đến hiệu quả tách sắc ký. Ở đây tôi chọn Natri tetraborat vừa là chất đệm pH vừa là chất điện giải Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ đệm tại bốn gía trị là 20 mM; 25 mM; 30 mM; 35 mM với điều kiện khảo sát như sau: - 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 100 mM SDS, pH = 7.75 - Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản 280C HÌnh 3.6 Sắc đồ điện di của β-Lactam tại nồng độ đệm 20 mM, 25 mM, 30 mM và 35 mM Bảng 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm tới thời gian lưu ( phút) Nồng độ đệm (mM) Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO 20 5.42 7.94 9.90 10.12 10.49 11.51 11.80 11.91 25 5.67 8.34 10.62 10.88 11.41 12.37 12.84 13.32 30 6.08 9.3 12.03 12.37 13.53 14.22 14.86 16.0 35 6.31 10.95 14.16 14.58 17.54 17.8 19.70 22.42 Khảo sát nồng độ đệm tại bốn giá trị, càng tăng nồng độ đệm thì độ điện di hiệu dụng của 7 kháng sinh β-Lactam càng tăng, thời gian lưu của chất tan tăng nhưng hiệu quả tách cũng không tốt. Trong ống mao quản, khi nồng độ đệm tăng, nghĩa là nồng độ các ion tăng, thường làm thay đổi, giảm độ lớn của lớp điện kép, ảnh hưởng đến sự tương tác tĩnh điện Culông của chất tan với thành mao quản. Lớp điện kép là một hiện tượng sinh ra rất tự nhiện trong mao quản. Lớp điện kép này thường làm cho vùng mẫu di chuyển không phẳng qua đó tạo ra sự doãng chân pic và cuối cùng làm giảm hiệu quả tách, cụ thể nhất ở nồng độ 35 mM. Lực ion của dung dịch cũng là yếu tố ảnh hưởng đến dòng EOF và quá trình sắc ký điện di các chất. Nồng độ đệm tăng, lực ion cũng tăng theo, lớp điện kép bị thu hẹp lại kết quả làm giảm thế Zeta và giảm luôn tốc độ của dòng EOF. Lực ion lớn, taọ ra dòng điện cao và có hiệu ứng nhiệt Jun lớn làm mao quản nóng lên, độ nét của pic cũng bị ảnh hưởng, làm giảm hiệu quả tách. Tại nồng độ đệm 30 mM và 35 mM nồng độ đệm cao nên pic đã bị dãn và tín hiệu nền xấu đi nhiều, hiệu quả tách cũng kém, pic của PENG và OXA bị dính chân vào nhau tại nồng độ 35 mM. Nồng độ đệm 20 mM, lực ion thấp hơn, giảm được cường độ dòng điện I, tăng sự hấp phụ của mẫu lên thành mao quản, tốc độ di chuyển của các chất tan nhanh hơn vì vậy hiệu quả tách kém, hai pic của CEF và CLO dính chân vào nhau. Do đó chúng tôi chọn nồng độ 25 mM đệm Borat là điều kiện tối ưu. 3.1.9. Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu Chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian bơm mẫu tại ba gía trị là 8s, 10s và 12s với điều kiện khảo sát như sau: - 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 25 mM đệm Borat, 100 mM SDS, pH = 7.75 - Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, nhiệt độ mao quản 280C HÌnh 3.8 Sắc đồ điện di tại thời gian bơm mẫu 8s, 10s và 12s Bảng 3.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu tới thời gian lưu ( phút) Thời gian bơm mẫu (s) Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO 8 5.74 8.48 10.76 11.03 11.63 12.63 1298 13.42 10 5.74 8.49 10.76 11.02 11.66 12.61 13.0 13.43 12 5.75 8.46 10.76 11.01 11.62 12.57 12.93 13.39 Khi nạp mẫu vào mao quản, lượng mẫu hay vùng mẫu nạp phải nhỏ hơn giới hạn cho phép (2% ≤ chiều dài l). Nếu vùng mẫu nạp vào quá lớn thì sự phân tán (mở rộng của vùng mẫu sẽ xuất hiện mạnh, do hiện tượng khuếch tán. Vùng mẫu càng lớn thì sự phân tán càng lớn. Lúc này độ phân giải và hiệu suất tách (Nef ) sẽ bị khử (bị giảm mạnh) theo sự phân tán mở rộng của vũng mẫu của chất phân tích trong mao quản. Ta có công thức [8]: (s)2 = (Winj)2/12 Với σ : Độ biến động hay độ lệch chuẩn của sự tách trong CE Winj : Độ rộng của mẫu được nạp vào đầu ống mao quản Từ công thức trên cho thấy, khi vùng mẫu Winj lớn, thì độ lệch chuẩn σ cũng lớn theo. Nghĩa là số đĩa lý thuyết của cột tách sẽ giảm. Hình 3.9 thể hiện mối quan hệ giữa chiều cao pic và thời gian bơm mẫu, khi tăng thời gian bơm mẫu, chiều cao pic tăng lên nhưng không đáng kể. Trong cùng một điều kiện, khi tăng thời gian bơm mẫu, thời gian lưu các chất hầu như không thay đổi chỉ có chiều cao các pic thay đổi. Bơm mẫu càng lâu thì chiều cao pic càng tăng, nhưng pic bị doãng chân thể hiện ở pic của CLO cụ thể nhất. Vì vậy chũng tôi chọn thời gian bơm mẫu 10s là điều kiện tối ưu. 3.1.10. Khảo sát ảnh hưởng thế điện di Khảo sát thế điện di tại ba gía trị 15 kV, 20 kV và 25 kV với điều kiện khảo sát như sau: - 7 chất kháng sinh cùng nồng độ 5 mg/l, 25 mM đệm Borat, 100 mM SDS, pH = 7.75 - Bơm mẫu 10s áp suất 50 mbar, nhiệt độ mao quản 280C HÌnh 3.10 Sắc đồ điện di thế điện di 15kV, 20kV và 25kV Bảng 3.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu tới thời gian lưu ( phút) Thế điện di (kV) Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO 15 7.98 11.85 15.29 15.68 16.38 17.69 18.16 18.94 20 5.91 8.55 10.77 11.02 11.72 12.68 13.15 13.51 25 4.30 6.43 7.92 8.09 8.73 9.48 9.89 10.03 Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có nguồn thế V một chiều nhất định đặt vào hai đầu của mao quản. Thế V này tạo ra lực điện trường E và dòng điện I trong mao quản, nó điều khiển và duy trì sự điện di của các chất. Thế V được dùng sao cho không cho dòng điện I quá lớn trong mao quản, dòng này chỉ nên nằm trong khoảng vùng từ 10-75 μA. Khi tăng thế điện từ 15kV đến 25kV, thời gian di chuyển của các β-Lactam càng giảm. Tại thế 15kV và 20kV đạt hiệu quả tách tốt, nhưng thời gian di chuyển của β-Lactam ở 15kV khá lớn tại 18.9 phút mới xuất hiện pic của CLO. Với thế 25kV, thời gian di chuyển ngắn hơn, độ điện di hiệu dụng lớn hơn so với 15kV, 20kV nhưng kết quả tách kém, pic CEF và CLO dính chân vào nhau. Vì khi tăng thế V, dòng điện I lớn sẽ gây ra hiệu ứng nhiệt Jun lớn, làm nóng mao quản gây ra sự doãng pic. Tức là làm giảm hiệu quả tách.. Vì vậy chúng tôi chọn thế tại 20kV là phù hợp. 3.1.11. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của mao quản Tiến hành khảo sát nhiệt độ của mao quản ba giá trị là 250C, 280C và 300C, với điều kiện khảo sát như sau: - 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 25 mM đệm Borat, 100 mM SDS, pH = 7.75 - Thế điện di 20 kV, bơm mẫu 10s, áp suất 50 mbar. HÌnh 3.12. Sắc đồ điện di ảnh hưởng của nhiệt độ tại 250C, 280C và 300C Bảng 3.6 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới thời gian di chuyển β-Lactam Nhiệt độ (0C) Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO 25 5.97 8.81 11.54 11.86 12.23 13.18 13.40 14.13 28 5.91 8.55 10.77 11.02 11.72 12.68 13.15 13.51 30 5.52 8.18 10.27 10.51 11.17 12.1 12.47 12.84 Theo [7,8] lnKi = (DH0/R.T) + ( DS0/R ) Trong đó: DH0, DS0 là Entanpi và Entropi tiêu chuẩn của chất tan. R là hằng số khí, và T là nhiệt độ (oK) của cột mao quản Biểu thức này cho ta thấy hằng số phân bố Ki luôn phụ thuộc vào nhiệt độ. Khi nhiệt độ tăng thì hệ số phân bố Ki đều giảm dần, tùy thuộc vào từng chất mà hệ số này thay đổi khác nhau. Cũng giống như khi tăng điện thế V làm ảnh hưởng tới hiệu ứng nhiệt Jun làm nóng thành mao quản. Nhiệt độ là yếu tố quan trọng. Sự tăng nhiệt độ ít ảnh hưởng đến số đĩa hiệu dụng Nef, song có trường hợp khi tăng nhiệt độ lại làm hỏng chất mẫu hay chất đệm nhất là làm thay đổi độ nhớt dung dịch , tạo ra gradient nhiệt độ và nồng độ chất, qua đó làm ảnh hưởng đến sự điện di. Song trong CE, sự gradient nhiệt độ luôn xảy ra nó chỉ khác nhau ở mức độ. Sự tiêu hao công suất điện từ trường sinh ra nhiệt càng nhiều, thì càng không có lợi. Đồng thời sự phân tán nhiệt độ qua thành mao quản ra ngoài, lại làm cho vùng tâm của cột mao quản có nhiệt độ cao hơn vùng sát thành. Sự khác nhau về nhiệt độ sẽ tạo ra sự khác nhau về độ nhớt dung dịch, chỗ nào có nhiệt độ cao hơn thì sẽ có độ nhớt thấp hơn và như thế cũng dẫn đến làm tăng tính không đồng nhất của dung dịch trong các vùng của cột mao quản. Khi nhiệt độ thay đổi 1 độ, thì dẫn đến sự thay đổi độ nhớt từ 2-3% và qua đó ảnh hưởng đến giá trị độ điện di μef của chất tan ( chất phân tích), chúng sẽ gây ra sự mở rộng pic. Tức là giảm hiệu quả tách, vì khi độ nhớt giảm sẽ làm giảm số đĩa hiệu dụng Nef của cột tách giảm theo. Hình 3.12, tại nhiệt độ 250C pic của OXA và CEF chưa tách hẳn, 300C pic các β-Lactam có tách rõ rệt nhưng pic lạ lại trùng với pic của CEP làm chiều cao CEP tăng lên. Chúng tôi chọn nhiệt độ tại 280C là điều kiện tối ưu. 3.1.12.Tổng kết điều kiện tối ưu Bảng 3.7 Tổng kết các điều kiện tối ưu Các yếu tố Điều kiện Detector DAD Số đo bước sóng chung 198 nm Kích thước mao quản Mao quản silica trần, tổng chiều dài 64.5cm, chiều dài hiệu dụng 56 cm, đường kính trong 50µm, loại bubble cell. Chất tạo mixen SDS Phương pháp bơm mẫu Thủy động hoc : 10s; 50 mbar Thế điện di 20 kV Dung dịch điện ly 25 mM đệm Borat + 100 mM SDS, pH = 7.75 Nhiệt độ 280C Hình 3.14. Sắc đồ điện di của β-Lactam tại điều kiện tối ưu. 3.2. Đánh giá phương pháp phân tích 3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn Từ phương trình Hi = k1.Ci khi tăng nồng độ chất phân tích thì chiều cao pic sắc ký cũng tăng lên, song lý thuyết chỉ ra rằng tỉ lê đó chỉ đúng trong một khoảng nhất định. Vì vậy chúng tôi phải khảo sát khoảng tuyến tính của chất phân tích. Chúng tôi tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính trong điều kiện tối ưu mục 3.1.12 của các β-Lactam trong khoảng nồng độ từ 1 đến 20 mg/l, mỗi nồng độ được đo lặp lại 3 lần Chúng tôi thu được kết quả như sau. Bảng 3.8 Chiều cao pic β-Lactam tại các nồng độ khác nhau. Nồng độ (mg/l) AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO 1 1.37 0.97 1.1 1.1 1.3 0.61 1.22 2 3 2.1 2.1 1.9 2.4 1.1 2.1 3 4.9 3.4 3.2 2.8 3.9 2 3.7 5 8.9 6.1 5.7 5.2 7.1 3.6 6.5 7 13.8 9.6 8.7 7.9 10.8 5.7 9.9 10 20.2 15.1 14.6 11.9 16.9 8.9 15.7 12 27.9 18.76 18.56 16.78 25.53 12.57 22.6 15 32.9 22.47 23.61 21.69* 36* 16.4 27.5 20 37.43 26.33 27.35 - * .- * 18.06 30.69 * Pic bị dính chân vào nhau. Khi tăng dần nồng độ lên, chúng tôi nhận thấy từ nồng độ 15 và 20 mg/l pic của PENG và OXA càng dính vào nhau, chân pic bị doãng rộng, pic không tách hết chân. Hiện tượng này được giải thích tương tự như mục 3.1.8. Hình 3.15. Sắc đồ điện di của β-Lactam tại nồng độ 15ppm Do lượng mẫu thực có hàm lượng thấp nên chúng tôi chọn khoảng nồng độ từ 1 đến 10mg/l nằm trong khoảng tuyến tính và khảo sát lập đường chuẩn. Dựa vào số liệu bảng 3.8 chúng tôi sử dụng phần mềm Origin Version 7.5 để xây dựng đường chuẩn. kết quả thu được như sau. Hình 3.16 Đường chuẩn của 7 loại β-Lactam nồng độ 1 -10 mg/l 3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng của đường chuẩn (LOQ) - Giới hạn phát hiện (LOD) được định nghĩa là nồng độ chất phân tích nhỏ nhất tạo thành tín hiệu phân tích có diện tích gấp 3 lần tín hiệu đường nền. Như vậy pic sắc ký của chất phân tích phải có chiều cao thoả mãn hệ thức sau: H ≥ 3σn (*) Trong đó: H là chiều cao pic sắc ký của chất phân tích σn là dao động của tín hiệu đường nền Giới hạn phát hiện là thông số đặc trưng cho độ nhạy của phương pháp phân tích. Để xác định LOD của các β-lactam chúng tôi tiến hành xác định LOD dựa vào đường chuẩn Theo (*) giới hạn phát hiện được tính theo công thức sau: LOD = 3×Sy/b Trong đó: Sy : là độ lệch chuẩn của phương trình đường chuẩn b : là hệ số góc của phương trình hồi qui - Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ) được định nghĩa là nồng độ chất phân tích nhỏ nhất mà phép phân tích vẫn định lượng được chính xác với độ tin cậy 95%. Theo lý thuyết thống kê thì giới hạn định lượng là nồng độ chất phân tích có tín hiệu phân tích gấp 10 lần tín hiệu nhiễu của đường nền. LOQ = 10×Sy/b Bảng 3.9 Giới hạn phát hiện của phương pháp Chất phân tích Phương trình y = a + bx Hệ số góc (b) Độ lệch chuẩn (Sy) LOD (mg/l) LOQ (mg/l) AMO y = 2.1228x - 1.2116 2.1228 0.383 0.54 1.8 CEP y = 1.5723x - 1.1256 1.5723 0.513 0.98 3.26 AMP y = 1.3448x - 0.6256 1.3448 0.3292 0.73 2.45 PENG y = 1.2186x - 0.5535 1.2186 0.3441 0.85 2.82 OXA y = 1.7448x - 1.0756 1.7448 0.5382 0.93 3.08 CEF y = 0.9325x - 0.7 0.9325 0.308 0.99 3.3 CLO y = 1.6192x - 1.0395 1.6192 0.5417 1.00 3.34 3.2.5. Độ chính xác của phép đo Để đánh giá sai số của phương pháp phân tích, chúng tôi tiến hành chọn ba mẫu tương ứng với khu vực: điểm đầu, điểm giữa và điểm cuối của khoảng tuyến tính đã được chọn ở trên. Các mẫu được chọn có nồng độ lần lượt là 1mg/l; 5mg/l và 10 mg/l. Tiến hành đo các mẫu trên với điều kiện tương tự như các điều kiện khi khảo sát khoảng tuyến tính. Mỗi mẫu tiến hành đo 8 lần. Sai số được tính theo công thức sau: Trong đó: Hi là chiều cao pic tính từ đường chuẩn Ht là chiều cao pic đo được trên sắc đồ Kết quả phân tích được trình bày trong bảng sau Bảng 3.10 Khảo sát độ chính xác của phương pháp phân tích (1mg/l) STT 1 2 3 4 5 6 7 8 TB AMO Ht 1.4 1.3 1.4 1.3 1.5 1.4 1.3 1.3 1.36 Hi 1.37 1.37 1.37 1.37 1.37 1.37 1.37 1.37 1.37 X% 2.14 5.38 2.14 5.38 8.67 2.14 5.38 5.38 0.55 CEP Ht 1 0.97 0.99 0.98 1 0.97 0.96 0.98 0.98 Hi 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 X% 1 2.06 0 1.02 1 2.06 3.13 1.02 0.89 AMP Ht 1.1 1.1 1.06 1 1.15 1.2 1.2 1.08 1.11 Hi 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 X% 0 0 3.77 10 4.35 8.33 8.33 1.85 1.01 PENG Ht 1 1 1 1.17 1.2 1.02 0.97 1 1.05 Hi 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 X% 10 10 10 5.98 8.33 7.84 13.4 10 5.26 OXA Ht 1.3 1.2 1.23 1.31 1.4 1.25 1.3 1.27 1.28 Hi 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 X% 0 8.33 5.69 0.76 7.14 4 0 2.36 1.36 CEF Ht 0.64 0.65 0.61 0.62 0.64 0.63 0.65 0.63 0.63 Hi 0.63 0.63 0.63 0.63 0.63 0.63 0.63 0.63 0.63 X% 1.56 3.08 3.28 2.11 1.56 0.32 2.63 0.47 0.49 CLO Ht 1.2 1.3 1.2 1.25 1.22 1.1 1.31 1.17 1.22 Hi 1.23 1.23 1.23 1.23 1.23 1.23 1.23 1.23 1.23 X% 2.5 5.38 2.5 1.6 0.82 11.82 6.11 5.13 0.92 Bảng 3.11 Khảo sát độ chính xác của phương pháp phân tích (5mg/l) STT 1 2 3 4 5 6 7 8 TB AMO Ht 8.8 8.8 8.7 8.86 9.1 9.13 8.92 8.86 8.9 Hi 8.9 8.9 8.9 8.9 8.9 8.9 8.9 8.9 8.9 X% 1.14 1.14 2.3 0.45 2.2 2.52 0.22 0.45 0.04 CEP Ht 6.2 6.14 6.03 5.97 6.11 5.98 6.12 6.22 6.1 Hi 6.1 6.1 6.1 6.1 6.1 6.1 6.1 6.1 6.1 X% 1.61 0.65 1.16 2.18 0.16 2.01 0.33 1.93 0.06 AMP Ht 5.7 5.6 5.5 5.62 5.67 5.81 5.79 5.8 5.69 Hi 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7 X% 0 1.79 3.64 1.42 0.53 1.89 1.55 1.72 0.24 PENG Ht 5.1 5 5 5.12 5.23 5.17 5.1 5.21 5.23 Hi 5.2 5 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 X% 1.96 0 4 1.56 0.57 0.58 1.96 0.19 0.57 OXA Ht 6.9 6.9 7.05 7.07 7.12 7.2 7.13 7.15 7.07 Hi 7.1 7.1 7.1 7.1 7.1 7.1 7.1 7.1 7.1 X% 2.9 2.9 0.71 0.42 0.28 1.39 0.42 0.7 0.5 CEF Ht 3.4 3.5 3.3 3.32 3.4 3.43 3.57 3.63 3.44 Hi 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 X% 5.88 2.86 9.09 8.43 5.88 4.96 0.84 0.83 4.54 CLO Ht 6.42 6.51 6.6 6.63 6.61 6.57 6.51 6.48 6.54 Hi 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 X% 1.25 0.15 1.52 1.96 1.66 1.07 0.15 0.31 0.63 Bảng 3.12 Khảo sát độ chính xác của phương pháp phân tích (10mg/l) STT 1 2 3 4 5 6 7 8 TB AMO Ht 20.1 19.8 20.3 21.1 21.8 21 21.6 20.8 20.8 Hi 20.2 20.2 20.2 20.2 20.2 20.2 20.2 20.2 20.2 X% 0.5 2.02 0.49 4.27 7.34 3.81 6.48 2.88 2.94 CEP Ht 15.1 14.2 14.7 14.9 15.3 15.5 14.9 14.6 14.9 Hi 15.2 15.2 15.2 15.2 15.2 15.2 15.2 15.2 15.2 X% 0.66 7.04 3.4 2.01 0.65 1.94 2.01 4.11 2.01 AMP Ht 14.8 14.9 14.7 14.3 13.9 14.1 14.5 15.1 14.5 Hi 14.6 14.6 14.6 14.6 14.6 14.6 14.6 14.6 14.6 X% 1.35 2.01 0.68 2.1 5.04 3.55 0.69 3.31 0.43 PENG Ht 12.2 11.7 12.1 11.5 11.8 11.9 12.3 12.4 12 Hi 11.9 11.9 11.9 11.9 11.9 11.9 11.9 11.9 11.9 X% 2.46 1.71 1.65 3.48 0.85 0 3.25 4.03 0.73 OXA Ht 17.1 17.2 17 16.7 16.7 17 17.1 16.8 17 Hi 16.9 16.9 16.9 16.9 16.9 16.9 16.9 16.9 16.9 X% 1.17 1.74 0.59 1.2 1.08 0.59 1.29 0.6 0.32 CEF Ht 9.3 9.4 9.2 8.92 8.97 9.23 9.15 9.21 9.17 Hi 9.1 9.1 9.1 9.1 9.1 9.1 9.1 9.1 9.1 X% 2.15 3.19 1.09 2.02 1.45 1.41 0.55 1.19 0.79 CLO Ht 16.2 16.3 15.9 16.2 16.4 16 15.7 16.2 16.1 Hi 16.1 16.1 16.1 16.1 16.1 16.1 16.1 16.1 16.1 X% 0.62 1.23 1.26 0.62 1.83 0.63 2.55 0.62 0.08 Nhận xét: Từ kết quả tính toán ở trên, chúng tôi nhận thấy đều nằm trong giới hạn cho phép (<15%). 3.2.6. Độ lặp lại của phép đo Một phương pháp phân tích tốt ngoài việc có sai số nhỏ còn yêu cầu có độ lặp lại cao. Để đánh giá độ lặp lại của phương pháp, chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại ở 3 nồng độ trên (1; 5; 10 mg/l). Dựa vào kết quả thực nghiệm của phần trước, tiến hành tính độ lặp lại theo công thức sau: Độ lệch chuẩn: Hệ số biến động: Trong đó: Hi là giá trị chiều cao pic của tín hiệu phân tích đo ở lần thứ i Htb là giá trị chiều cao pic của n lần đo (n = 8) S là độ lệch chuẩn của phép đo V là hệ số biến động của phép đo Gía trị độ lệch chuẩn S được tính toán trong phần mềm OriginVersion 7.5. Các kết quả tính toán được biểu diễn ở bảng sau: Bảng 3.13: Đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích Nồng độ AMO CEP Độ lệch chuẩn (S) Giá trị TB (STB) Hệ số biến động (V%) Độ lệch chuẩn (S) Giá trị TB (STB) Hệ số biến động (V%) 1 mg/l 0.0744 1.3625 5.46 0.0146 0.9813 1.49 5 mg/l 0.1495 8.89625 1.68 0.0946 6.0963 1.55 10 mg/l 0.708 20.8125 3.4 0.4106 14.9 2.76 Nồng độ AMP PENG Độ lệch chuẩn (S) Giá trị TB (STB) Hệ số biến động (V%) Độ lệch chuẩn (S) Giá trị TB (STB) Hệ số biến động (V%) 1 mg/l 0.0692 1.11125 6.22 0.0878 1.045 8.4 5 mg/l 0.1108 5.68625 1.95 0.0863 5.1163 1.69 10 mg/l 0.4138 14.5375 2.85 0.3137 11.988 2.62 Nồng độ OXA CEF Độ lệch chuẩn (S) Giá trị TB (STB) Hệ số biến động (V%) Độ lệch chuẩn (S) Giá trị TB (STB) Hệ số biến động (V%) 1 mg/l 0.0609 1.2825 4.75 0.0141 0.6331 2.23 5 mg/l 0.1117 7.065 1.58 0.1158 3.4438 3.36 10 mg/l 0.1915 16.955 1.13 0.1598 9.1725 1.74 Nồng độ CLO Độ lệch chuẩn (S) Giá trị TB (STB) Hệ số biến động (V%) 1 mg/l 0.0688 1.21875 5.64 5 mg/l 0.073 6.54125 1.12 10 mg/l 0.2295 16.1125 1.42 Qua bảng 3.13 đánh giá độ lặp lại của phép đo chúng tôi nhận thấy độ lệch chuẩn và hệ số biến động của chất phân tích tương đối nhỏ, mặc dù với nồng độ 1mg/l thì hệ số biến động lớn hơn so với nồng độ 5mg/l và 10mg/l xong các giá trị này vẫn nằm trong giới hạn. Như vậy phương pháp có độ lặp lại tốt. 3.3. Phân tích mẫu thực 3.3.1. Phân tích mẫu thuốc Bảng 3.14 Thông tin và đặc điểm từng loại thuốc Tên thuốc Đặc điểm Xuât xứ Hàm lượng Ampicillin Viên con nhộng, đóng vỉ, 10 viên/ vỉ Công ty cổ phần dược phẩm VIDIPHA Mỗi viên thuốc chứa 500mg AMP, còn lại là tá dược Cephalexin Viên con nhộng, đóng vỉ, 10 viên/ vỉ Công ty cổ phần dược phẩm Trung ương 2 - DOPHARMA Mỗi viên thuốc chứa 500mg CEP, còn lại là tá dược Br- Zaxin Viên con nhộng, đóng vỉ, 10 viên/vỉ Công ty cổ phần dược phẩm Overseas Laboteries - Ấn độ VN-5254-08 Mỗi viên thuốc chứa 250mg AMO và 250mg CLO, còn lại là tá dược Penicillin G Dạng bột Công ty cổ phần hóa – dược phẩm MEKOPHAR Lọ chứa 1.000.000 IU PENG (»600mg) Bristopen Dạng viên con nhộng, 10 viên/ vỉ Nhập khẩu bởi Công ty CP Dược phẩm TBYT Hà Nội HAPHARCO Mỗi viên chứa 500mg OXA Cefixim Dạng viên con nhộng, 10 viên/vỉ Công ty Saga Laboratories, India Mỗi viên chứa 200mg CEF Các mẫu được chuẩn bị bằng cách trộn đều 4 viên thuốc nén, lấy mẫu đại diện, mang đi cân một lượng chính xác m1 = 0.02g. Mẫu được hòa tan bằng nước deion, đem siêu âm 10 phút sau đó lọc qua giấy lọc cỡ 0.45μm và định mức bằng nước deion trong bình 20ml, ta được dung dịch A có nồng độ a mg/l. Hút 2.5ml dung dịch pha loãng 10 lần với nước deion thành dung dịch B trong bình 25 ml có nồng độ b mg/l. Từ dung dịch B pha thành các dung dịch có nồng độ thấp hơn có nồng độ Cx, được dùng trong ngày, tiến hành đo bằng phương pháp thêm chuẩn. Các dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh 40C, tránh ánh sáng. Hút 100 μl vào 4 bình 2ml, sau đó thêm dần 20 μl, 40 μl, 80 μl từ dung dịch chuẩn 100 mg/l vào 3 bình còn lại. Định mức bằng dung dịch điện ly chứa 25 mM đệm Borat + 100 mM SDS, pH = 7.75. Tiến hành chạy lặp lai .mỗi mẫu phân tích 3 lần với các điều kiện tối ưu như chạy đường chuẩn, lấy kết quả trung bình. Kết quả được xử lý bằng phần mềm thống kê origin 7.5 và excel. * Sau khi tính được nồng độ Cx theo phương pháp thêm chuẩn thì khối lượng của các β-Lactam tính trong khối lượng cân m1 được lấy theo các thể tích ban đầu được tính theo công thức sau m = V. Cx. F. 10-6 (g) Trong đó: m là khối lượng chất phân tích có trong m1 gam mẫu V: thể tích dung dịch được pha từ m1 (g) F: hệ số pha loãng 10-6: hệ số chuyển đổi từ μg sang g Công thức cuối cùng là m = 20. Cx. 200.10-6 (g) * Hàm lượng β-Lactam trong một viên thuốc được tính theo công thức sau % β-Lactam = (m / mthuoc) . 100% Với mthuốc = S 4 viên thuốc Sự khai khác về hàm lượng so với kết quả in trên nhãn là: * Đánh giá độ thu hồi theo phương pháp thêm chuẩn Ta có Cx là nồng độ ban đầu khi chưa thêm chất chuẩn β-Lactam Cs: nồng độ được thêm vào lượng dung dịch chuẩn DC Hx và Hs là chiều cao trung bình của các dung dịch tương ứng Theo đó Cs = Hs. Cx/ Hx Khi đó tính được lượng β-Lactam thêm vào là: DC’ = Cs – Cx (mg/l) Công thức thu hồi là : %H = (DC’/DC).100% Bảng 3.15. Kết quả độ thu hồi xác định β-Lactam theo phương pháp thêm chuẩn trong mẫu thuốc STT Tên hoạt chất DC Chiều cao (mAU) Thời gian lưu (phút) Cx + DC Cs %H Hiệu suất trung bình S%H/3 1 AMO 0 2.5 8.35 2.1 97.3 1 3.6 8.30 3.1 3.02 92.4 2 4.9 8.28 4.1 4.12 100.8 4 7.2 8.26 6.1 6.05 98.7 2 CLO 0 2.7 13.78 2.43 96 1 3.8 13.71 3.43 3.42 99 2 4.7 13.67 4.43 4.23 90 4 7.1 13.65 6.43 6.39 99 3 CEP 0 4.2 10.71 4.38 99.94 1 5.3 10.77 5.38 5.53 114.7 2 5.8 10.77 6.38 6.05 83.43 4 8.1 10.75 8.38 8.45 101.7 4 AMP 0 3.6 11.23 4.06 98.68 1 4.4 11.27 5.06 4.96 90.22 2 5.5 11.31 6.06 6.2 107.1 4 7.1 11.30 8.06 8.01 98.68 5 PENG 0 4.1 11.67 4.79 104.2 1 5.1 11.63 5.79 5.96 116.8 2 5.7 11.63 6.79 6.66 93.46 4 7.6 11.59 8.79 8.88 102.2 6 OXA 0 5.4 12.69 4.86 104.3 1 6.6 12.66 5.86 5.94 108 2 7.7 12.64 6.86 6.93 103.5 4 9.9 12.63 8.86 8.91 101.3 7 CEF 0 1.8 13.27 3.4 99.17 1 2.3 13.24 4.4 4.34 94.44 2 2.9 13.21 5.4 5.48 103.9 4 3.9 13.50 8.4 7.37 99.17 Bảng 3.16. Kết quả tính nồng độ Cx và sự sai khác hàm lượng so với kết quả in trên nhãn thuốc STT Tên hợp chất và hàm lượng ghi trên nhãn mthuốc (g) Nồng độ Cx (mg/l) Khối lượng thuốc tính theo Cx (g) %β-actamsx %β-Lactam đo Sai số S so với hàm lượng in trên nhãn 1 AMO 250mg và CLO 250 mg 2.43 AMO 2.1 CLO 2.43 AMO 0.0084 CLO 0.00972 AMO 81.97 CLO 81.97 AMO 84 CLO 97.2 AMO 0.025 CLO 0.186 2 CEP 500mg 2.3 4.38 0.018 87 87.6 0.007 3 AMP 500mg 2.43 4.06 0.016 82.3 81.2 0.013 4 PENG 600mg 0.65 4.79 0.019 92.3 95.8 0.038 5 OXA 500mg 2.45 4.86 0.024 81.6 97.2 0.191 6 CEF 200mg 1.185 3.4 0.014 67.5 68 0.007 Trong 6 loại thuốc phân tích thì thuốc chứa hoạt chất OXA có nhiều hàm lượng thuốc nhất, sau đó đến thuốc chứa CLO, PENG, AMO và cuối cùng là CEF và CEP. Hiệu suất thu hồi cao > 97.3%, đạt yêu cầu cho phép > 95% 3.3.2 Phân tích mẫu máu [3] Mẫu máu được lấy từ 2 người tình nguyện độ tuổi từ 20 đến 25, cách 2 tuần trước khi uống thuốc không dùng bất kỳ loại thuốc nào khác. Mỗi người tình nguyện uống 3 viên/ngày vào các buổi sáng, trưa, tối và uống liên tiếp trong 3 ngày. Viên cuối cùng của ngày thứ 3, sau khi uống 4 giờ thì lấy mẫu máu.. Lấy từ 1.5 đến 2ml lượng mẫu vào các ống ependorf. Ly tâm 15 phút ở 10.000 rpm để tách riêng phần hồng cầu, phần huyết thanh được bảo quản trong tủ lạnh -150C. Trước khi phân tích lẫy mẫu ra khỏi ngăn đá và để ở nhiệt độ phòng cho mẫu tan đá. Hút 50 μl huyết thanh vào ống ependorf thể tích 10 ml. Lọai bỏ protein bằng cách kết tủa nó với etanol tuyệt đối khoảng 200-300 μl, thêm 500 μl n-hexan và ly tâm 15 phút ở 10.00 rpm tách riêng biệt 2 lớp. Dịch chiết thu được lọc qua giấy lọc 0.45 μm. Hút 200 μl dịch lọc làm bay hơi bằng khí N2 sạch đến hết dung môi. Cặn được hòa tan bằng hỗn hợp 25 mM đêm Borat+100 mM SDS, pH= 7.75. Trộn đều bằng cách đặt vào bể siêu âm trong 2 phút. Dung dịch được đem đi đo bằng phương pháp thêm chuẩn. Mỗi mẫu đo được bơm lặp lại 3 lần. Kết quả mẫu được xử lý bằng phần mềm thống kê origin 7.5 và excel. Bảng 3.17 Kết quả phân tích hàm lượng kháng sinh β-Lactam trong mẫu máu. STT Tên loại thuốc uống Khối lượng ghi trên nhãn (mg/viên) Hàm lượng thêm vào (mg/l) Thời gian lưu (phút) Chiều cao pic (mAU) Cx Cs %H Hiệu suất trung bình 1 Amoxicillin 500 mg AMO 0 9.21 2.3 1.93 102.09 1 9.17 3.5 1.93 2.94 100.69 2 9.13 4.8 1.93 4.03 104.89 3 9.11 7.1 1.93 5.96 100.7 2 Cloxacillin 500 mg CLO 0 14.6 2.7 2.46 92.63 1 14.31 3.5 2.46 3.19 72.89 2 14.23 5.1 2.46 4.65 109.3 3 14.15 6.9 2.46 6.29 95.67 Thời gian lưu của AMO và CLO thay đổi so với mẫu chuẩn và mẫu thuốc là do khi xử lý mẫu máu chưa đuổi hết được dung môi hữu cơ là n-hexan bằng khí N2 nên thời gian lưu tăng lên. 3.4. Ưu nhược điểm của phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) Phương pháp MEKC là một phương pháp phân tích hiện đại cho độ tin cậy và hiệu quả tách cao. Phương pháp có thể xác định được trên nhiều đối tượng khác nhau bao gồm cả chất mang điện tích và chất trung tính. Phương pháp có một số đặc điểm cơ bản sau: - Lượng mẫu phân tích nhỏ, tốc độ phân tích nhanh, thao tác đơn giản hơn nhiều so với kỹ thuật phân tích HPLC. Chạy một mẫu sắc ký 7 chất chỉ trong vòng 14 phút. - Dung dịch pha động cũng như mẫu phân tích thường được pha trong nước deion và sử dụng rất ít. - Cột tách là ống mao quản nhỏ, rẻ, cho hiệu suất tách cao, dễ tái sinh hơn nhiều so với phương pháp HPLC. Tuy nhiên phương pháp cũng có một số nhược điểm sau: - Do flowcell nằm ngay trên mao quản nên độ nhạy của phương pháp thấp hơn nhiều so với phương pháp khác. Giới hạn của nó khoảng cỡ mg/l đối với detector UV-VIS, DAD. Trong khi đó các phương pháp khác như: HPLC có giới hạn nhỏ hơn nhiều. - Máy làm việc ở vùng điện áp rất cao nên phải cẩn trọng khi làm việc. - Lượng mẫu sử dụng nhỏ là một ưu điểm của phương pháp, đồng thời cũng là nhược điểm của nó. Khi lượng mẫu nhỏ dẫn đến sai số lớn khi phân tích hàm lượng lớn do hệ số pha loãng cao. Đối với mẫu có hàm lượng nhỏ, khi tăng thời gian bơm mẫu thì gây ra hiện tượng doãng pic, hiệu suất tách không cao. - Thời gian lưu của của dung dịch phụ thuộc rất nhiều vào thành phần đệm, dung dịch điện ly vì vậy đòi hỏi phải cẩn thận và tỉ mỉ. 3.5. Hướng phát triển của đề tài. Trong bản luận văn này, do điều kiện còn hạn chế nên chúng tôi chỉ xác định được hàm lượng của β_Lactam bằng phương pháp MEKC trong mẫu dược phẩm và mẫu máu. Phương pháp còn có thể được mở rộng phân tích trong những dạng nền mẫu khác nhau ví dụ như: mẫu nước tiểu, mẫu sữa,… hay các mẫu môi trường như: nước thải bệnh viện, nước thải trại chăn nuôi gia súc...Vì vậy rất cần có những nghiên cứu tiếp theo để phát triển phương pháp áp dụng vào thực tiễn hơn. KẾT LUẬN Qua cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, với mục đích ứng dụng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) để tách và xác định các kháng sinh AMO, AMP, CEP, PENG, OXA, CEF, CLO trong mẫu sinh học và dược phẩm, chúng tôi thu được kết quả như sau: Khảo sát và chọn được thông số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký: - Detector DAD – 198 nm - Chất tạo Mixen: SDS. Dung dịch điện ly : 25 mM đệm Borat + 100 mM SDS, pH = 7.75 - Thế điện di 20 kV - Sử dụng mao quản silica trần, tổng chiều dài 64.5cm, chiều dài hiệu dụng 56 cm, đường kính trong 50µm, loại bubble cell. - Nhiệt độ mao quản 280C Đánh giá phương pháp phân tích: - Xây dựng đường chuẩn các kháng sinh trong khoảng 1 – 10 mg/l, hệ số tương quan các đường chuẩn R2 > 0,99 - Giới hạn phát hiện LOD của các kháng sinh từ 0,54 mg/l đến 1 mg/l. Giới hạn định lượng LOQ từ 1,8 mg/l đến3,34 mg/l - Độ chính xác ở các nồng độ 1mg/l; 5mg/l; 10mg/l nằm trong khoảng 0 – 13.4 % - Hệ số biến động ở các nồng độ 1mg/l; 5mg/; 10mg/l nằm trong khoảng 1.12 – 8.4% 3. Phân tích hàm lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và mẫu máu. - Với mẫu thuốc: hiệu suất thu hồi đạt được từ 83.43%. đến 116.8%. - Với mẫu máu: hiệu suất thu hồi từ 72,89% tới 109.3%. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Bộ Y Tế (2007), Hóa dược, tập 2, NXB Y học, Hà Nội 2. Bộ Y Tế (2002), Dược điển Việt Nam, xuất bản lần thứ 3, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội 3. Lê Thị Huyền Dương (2000), Tách và phân tích đồng thời một số chất quan trọng trong nhóm vitamin A bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản, Luận án tiến sĩ, ĐH Quốc Gia Hà Nội 4. Ngọc Phương ( 2006), "Thảm họa lạm dụng kháng sinh cho trẻ", Báo laodong.com.vn, 10-10-2006. 5. Ngô Quang Trung (2008), Xây dựng qui trình phân tích đồng thời một số kháng sinh học b_lactam và nghiên cứu sự tồn dư tại một số khu vực bệnh viện Hà Nội, Luận văn thạc sĩ khoa học,ĐHQGHN 6. Nguyễn Văn Đích (2005), "Không nên lạm dụng kháng sinh", Báo y học và đời sống, số 27 7. Nguyễn Văn Ri (2007), Các phương pháp tách sắc ký, chuyên đề cao học trường ĐH KHTN - ĐHQG Hà Nội 8. Phạm Luận (2004), Cơ sở lý thuyết điện di mao quản hiệu năng cao, Sách chuyên đề cho sinh viên chuyên ngành hóa phân tích, ĐH Quốc Gia Hà Nội 9. Tạ Thị Thảo (2005), Bài giảng chuyên đề thống kê trong hóa phân tích, ĐH Quốc gia Hà Nội 10. Trường ĐH Dược Hà Nội (1999), Hóa Dược, Tài liệu lưu hành nội bộ cho sinh viên trường ĐH Dược Hà Nội, NXB ĐH Dược Hà Nội TIẾNG ANH 11. A. Fernández-González, R. Badía and M. E. Díaz-Gar (2003), "Micelle-mediated spectrofluorimetric determination of ampicillin based on metal ion-catalysed hydrolysis", Analytica Chimica Acta, 484(2), pp 223-231 12. Amber R. Solangi (2007), ”Development of new analytical methods for 4-quniolone antibacterials and cephalosporin antibiotics”, National Centre of Excellence in Analytical Chemistry/ University of Sindh 13. Althea W. McCormick (2003), " Geographic diversity and temporal trends of antimicrobial resistance in Streptococcus pneumoniae in the United States", Journal Nature medicine, 9: 424 - 430 14. Attila Gaspar, Melinda Andrasi, Szilvia Kardos (2002), "Application of capillary zone electrophoresis to the analysis and to a stability study of cephalosporins", Journal of Chromatography B, 775(2), pp 239–246 15. Biyang Deng, Aihong Shia, Linqiu Lia and Yanhui Kang (2008), "Pharmacokinetics of amoxicillin in human urine using online coupled capillary electrophoresis with electrogenerated chemiluminescence detection", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 48(4), 1249-1253 16. C. Y. W Ang, W.H. Luo, E.B. Hansen, j.p. Freeman, H,C. Thompson (1996), "Rapid determination of ampicillin in bovine milk by liquid chromatography with fluorescence detection", Journal of AOAC International, 80(1),. 107-190 17. D.P. Raymond (2001), " Impact of a rotating empiric antibiotic schedule on infectious mortality in an intensive care unit", Journal of Critical Care Medicin, 29(6):1101-1108 18. F. Belal, M. M. El-Kerdawy, S. M. El-Ashry and D. R. El-Wasseef (2000), "Kinetic spectrophotometric determination of ampicillin and amoxicillin in dosage forms", Il Farmaco, 55(11-12), pp 680-686 19. J.M. Cha, S. Yang, K.H. Carlson (2006), ,"Trace determination of β-lactam antibiotics in surface water and urban wastewater using liquid chromatography combined with electrospray tandem mass spectrometry", Journal of Chromatography A, 1115(1-2), 46-57 20. James W.Jorgenson (1992), High performance capillary electrophoresis, Agilent Technoligies 21. L.Nozal,L.Arce1,A.R´ıos2,M.Valcárcel(2004),"Development of ascreening method for analytical control of antibiotic Residues by micellar electrokinetic capillary chromatography", Journal of AnalyticaChimicaActa, 523(2004)21–28 22. M.I Bailon-Perez, A.M.Garcia-Campana, C. Cruces-Blanco, M. del Olmo Iruela (2008), "Trace determination of β-lactam antibiotics in environmental aqueous samples using off-line and on-line preconcentration in capillary electrophoresis", Journal of Chromatography A, 185(2), pp 273-280 23 M.I Bailon-Perez,L.CuadrosRodr´ ıguez,C.Cruces-Blanco (2006), " Analysis of different -lactams antibiotics in pharmaceutical preparations Using micellar electrokinetic capillary chromatography", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 43(2007) pp 746–752 24 Masaaki Kai, Hiromi Kinoshita, Mikio Morizono(2003),“Chromatographic determinations of a β-lactam antibiotic, cefaclor by means off luorescence, chemiluminescence and massspectrometry”, Journal of Mass Spectrometry,39(3), 329 – 340 25 Merk (1996), The Merck Index, 12th edition 26 R. Gonzales (2001), "linical infectious diseases", University of Chicago. Press, 23:757-762 27 Richard P. Wenzel, M.D Michael B. Edmond, M.D., M.P.H (2000), " Managing Antibiotic Resistance", New England Journal of Medicine, 343:1961-1963 28 Wei Liu, Zhujun Zhang, Zuoqin Liu(2007), "Determination of -lactam antibiotics in milk using micro-flow chemiluminescence system with on-line solid phase extraction", Analytica Chimica Acta,592(2), 187–192 29 WJ Blanchflower, Hewitt SA, Kennedy DG (1994), "Confirmatory assay for the simultaneous detection of five penicillins in muscle, kidney and milk using liquid chromatography - electrospray mass spectrometry", Analyst, 119(12), 2595-2601 PHỤ LỤC SẮC ĐỒ ĐIỆN DI VÀ ĐƯỜNG THÊM CHUẨN CỦA β-LACTAM TRONG MẪU THỰC * Mẫu thuốc: Hình 3.17. Sắc đồ điện di của β-Lactam trong mẫu thuốc Hình 3.18. Đường thêm chuẩn mẫu thuốc của β-Lactam phụ thuộc vào chiều cao pic. * Mẫu máu Hình 3.19 Sắc đồ điện di của β-Lactam trong mẫu máu. HÌnh 3.20 Đường thêm chuẩn của AMO và CLO trong mẫu máu phụ thuộc vào chiều cao pic