Đề tài Sinh trưởng của nấm men cố định trong gel alginate

ÑAÏI HOÏC QUOÁC GIA THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC BAÙCH KHOA KHOA KYÕ THUAÄT HOAÙ HOÏC LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP ÑAÏI HOÏC SVTH : HAØ MINH QUANG MSSV : 60302199 CBHD : PGS.TS LEÂ VAÊN VIEÄT MAÃN BOÄ MOÂN KYÕ THUAÄT THÖÏC PHAÅM TP Hoà Chí Minh, 01/2008 NHAÄN XEÙT CUÛA GIAÙO VIEÂN HÖÔÙNG DAÃN Ngaøy …… thaùng …… naêm …….. Chöõ kyù cuûa giaùo vieân höôùng daãn NHAÄN XEÙT CUÛA GIAÙO VIEÂN PHAÛN BIEÄN Ngaøy …… thaùng …… naêm …….. Chöõ kyù cuûa giaùo vieân phaûn bieän LÔØI CAÛM ÔN Vôùi khoaûng thôøi gian hôn boán naêm ngoài treân gheá giaûng ñöôøng, vaø ñaëc bieät laø hôn boán thaùng laøm luaän vaên toát nghieäp vöøa qua, em ñaõ tröôûng thaønh raát nhieàu trong vieäc nghieân cöùu cuõng nhö trong reøn luyeän nhaân caùch baûn thaân. Ñeå coù ñöôïc nhöõng ñieàu naøy, em xin göûi lôøi caûm ôn chaân thaønh nhaát ñeán taát caû caùc quyù thaày coâ tröôøng Ñaïi hoïc Baùch Khoa, vaø ñaëc bieät laø caùc thaày coâ trong Boä moân Coâng ngheä thöïc phaåm, nhöõng ngöôøi ñaõ giuùp ñôõ vaø dìu daét em raát nhieàu treân con ñöôøng trôû thaønh moät kyõ sö, moät trí thöùc treû trong töông lai. Em cuõng xin göûi lôøi caûm ôn chaân thaønh vaø saâu saéc nhaát ñeán thaày Leâ Vaên Vieät Maãn ñaõ taän tình höôùng daãn vaø chæ baûo vaø ñoäng vieân em trong suoát thôøi gian laøm luaän vaên vöøa qua. Xin traân troïng caûm ôn söï giuùp ñôõ taän tình cuûa anh Traàn Quoác Hieàn ñaõ taïo moïi ñieàu kieän thuaän lôïi cho em thöïc hieän ñeà taøi naøy. Con xin caûm ôn meï ñaõ heát loøng yeâu thöông, chaêm soùc vaø coå vuõ tinh thaàn cho con, giuùp con vöôït qua ñöôïc nhöõng giai ñoaïn khoù khaên nhaát trong coâng vieäc cuõng nhö trong cuoäc soáng. Sinh vieân Haø Minh Quang MUÏC LUÏC DANH MUÏC HÌNH CHÖÔNG 2: Hình 2. 1: Caùc phöông phaùp coá ñònh teá baøo 4 Hình 2. 2: Quaù trình leân men ethanol 4 Hình 2. 3: Caùc monomer cuûa acid alginic . 4 Hình 2. 4: Caáu truùc caùc block cuûa phaân töû cuûa acid alginic. A: Block G,B: Block M, C: Block MG. 4 Hình 2. 5: Söï lieân keát giöõa ion Ca2+ vaø goác G. 4 Hình 2. 6: Phöông phaùp taïo gel khueách taùn . 4 Hình 2. 7: Phöông phaùp taïo gel noäi . 4 Hình 2. 8: Con ñöôøng hình thaønh vaø phaân huyû diacetyl. 4 Hình 2. 9: Sô ñoà quy trình saûn xuaát bia öùng duïng kó thuaät leân men bia noàng ñoä cao. 4 Hình 2. 10: Söï thay ñoåi hình thaùi cuûa caùc teá baøo naám men S.cerevisiae (naám men chìm). A: tröôùc khi chòu taùc ñoäng cuûa aùp löïc thaåm thaáu, B: sau 15 phuùt tieáp xuùc vôùi dung dòch sorbitol 20% 4 Hình 2. 11: Söï thay ñoåi hình thaùi cuûa caùc teá baøo naám men chìm. (A): tröôùc khi chòu taùc ñoäng cuûa ethanol, (B): sau 15 phuùt tieáp xuùc vôùi dung dòch ethanol 10% (v/v). 4 CHÖÔNG 3: Hình 3. 1: Sô ñoà nghieân cöùu 4 Hình 3. 2: Sô ñoà quy trình saûn xuaát bia non trong nghieân cöùu. 4 Hình 3. 3: Giaûn ñoà naáu dòch nha . 4 Hình 3. 4: Quy trình coá ñònh naám men trong gel Ca-alginate. 4 CHÖÔNG 4: Hình 4. 1: Söï bieán ñoåi maät ñoä naám men trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. 4 Hình 4. 2: Hình chuïp caáu truùc gel Ca-alginate tröôùc khi leân men baèng kính hieån vi ñieän töû queùt. A,B: beà maët vaø loõi haït gel ôû ñoä phoùng ñaïi 300 laàn. C,D: beà maët vaø loõi haït gel ôû ñoä phoùng ñaïi 1000 laàn. 4 Hình 4. 3: Hình chuïp caáu truùc haït gel Ca-alginate sau quaù trình leân men baèng kính hieån vi ñieän töû queùt. A,B: beà maët vaø loõi haït gel ôû ñoä phoùng ñaïi 300 laàn. C,D: beà maët vaø loõi haït gel ôû ñoä phoùng ñaïi 500 laàn. 4 Hình 4. 4: Söï bieán ñoåi noàng ñoä ñöôøng khöû trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. 4 Hình 4. 5: Söï bieán ñoåi noàng ñoä FAN trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. 4 Hình 4. 6: Söï bieán ñoåi noàng ñoä ethanol taïo thaønh trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. 4 Hình 4. 7: Söï bieán ñoåi pH trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. 4 Hình 4. 8: Söï bieán ñoåi noàng ñoä diacetyl taïo thaønh trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. 4 Hình 4. 9: Söï bieán ñoåi maät ñoä naám men trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy 10 trieäu teá baøo/ml, thôøi gian suïc khí thay ñoåi töø 0 – 20h. 4 Hình 4. 10: Söï bieán ñoåi noàng ñoä ñöôøng khöû trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy 10 trieäu teá baøo/ml, thôøi gian suïc khí thay ñoåi töø 0 – 20h. 4 Hình 4. 11: Söï bieán ñoåi noàng ñoä FAN trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy 10 trieäu teá baøo/ml, thôøi gian suïc khí thay ñoåi töø 0 – 20h. 4 Hình 4. 12: Söï bieán ñoåi noàng ñoä ethanol sinh ra trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy 10 trieäu teá baøo/ml, thôøi gian suïc khí thay ñoåi töø 0 – 20h. 4 Hình 4. 13: Söï bieán ñoåi pH trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy 10 trieäu teá baøo/ml, thôøi gian suïc khí thay ñoåi töø 0 – 20h. 4 Hình 4. 14: Söï bieán ñoåi noàng ñoä diacetyl trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy 10 trieäu teá baøo/ml, thôøi gian suïc khí thay ñoåi töø 0 – 20h. 4 Hình 4. 15: Noàng ñoä moät soá saûn phaåm phuï taïo thaønh trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy 10 trieäu teá baøo/ml, thôøi gian suïc khí thay ñoåi töø 0 – 20h. 4 DANH MUÏC BAÛNG CHÖÔNG 2: Baûng 2. 1: Tæ leä M/G cuûa moät soá cheá phaåm acid alginic [63]. 4 Baûng 2. 2: So saùnh toác ñoä söû duïng glucose vaø toác ñoä taïo thaønh ethanol cuûa naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate [103]. 4 Baûng 2. 3: Söï hình thaønh moät soá saûn phaåm trung gian trong chu trình ñöôøng phaân cuûa naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate [103]. 4 Baûng 2. 4: Haøm löôïng moät soá saûn phaåm phuï trong bia non ñöôïc leân men baèng maám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel Ca-alginate. 4 Baûng 2. 5: Löôïng ethyl acetate vaø iso-amyl acetate trong bia non leân men baèng naám men coá ñònh trong gel alginate vaø naám men töï do. 4 Baûng 2. 6: Haøm löôïng diacetyl trong bia non cuûa naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel Ca – alginate. 4 Baûng 2. 7: Thôøi gian leân men caùc dòch nha noàng ñoä 12 – 30% (w/w) ôû 13oC, söû duïng S.cerevisiae coá ñònh trong gel alginate so vôùi naám men töï do. 4 Baûng 2. 8: Toác ñoä toång hôïp ethanol cuûa S.cerevisiae coá ñònh trong gel alginate trong quaù trình leân men caùc dòch nha noàng ñoä 12 – 30% (w/v) ôû 13oC 4 Baûng 2. 9: Khaû naêng soáng soùt cuûa naám men chìm S.cerevisiae coá ñònh trong gel alginate trong quaù trình leân men caùc dòch nha noàng ñoä 12 – 30% (w/w) ôû 13oC. 4 CHÖÔNG 3: Baûng 3. 1: Khoái löôïng nguyeân lieäu söû duïng cho moät meû naáu dòch nha trong nghieân cöùu. 4 CHÖÔNG 4: Baûng 4. 1: Söï bieán ñoåi maät ñoä naám men trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. 4 Baûng 4. 2: Söï bieán ñoåi noàng ñoä ñöôøng khöû trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. 4 Baûng 4. 3: Toác ñoää trung bình söû duïng ñöôøng khöû cuûa naám men trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. 4 Baûng 4. 4: Söï bieán ñoåi noàng ñoä FAN trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. 4 Baûng 4. 5: Söï bieán ñoåi noàng ñoä ethanol taïo thaønh trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. 4 Baûng 4. 6: Toác ñoätrung bình sinh toång hôïp ethanol trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. 4 Baûng 4. 7: Söï bieán ñoåi pH trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. 4 Baûng 4. 8: Söï bieán ñoåi noàng ñoä diacetyl taïo thaønh trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. 4 Baûng 4. 9: Noàng ñoä moät soá saûn phaåm phuï taïo thaønh trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. 4 Baûng 4. 10: Noàng ñoä moät soá saûn phaåm phuï taïo thaønh trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml, keát quaû phaân tích ñöôïc quy ñoåi thaønh bia non 5% ñoä coàn. 4 Baûng 4. 11: Noàng ñoä moät soá saûn phaåm phuï taïo thaønh trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. 4 Baûng 4. 12: Moät vaøi thoâng soá leân men chính dòch nha 24OBx, söû duïng maät ñoä gioáng caáy töø 10 – 40 trieäu teá baøo/ml, ñoä leân men 75% 4 Baûng 4. 13: Söï bieán ñoåi maät ñoä naám men trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy 10 trieäu teá baøo/ml, thôøi gian suïc khí thay ñoåi töø 0 – 20h. 4 Baûng 4. 14: Söï bieán ñoåi noàng ñoä ñöôøng khöû trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy 10 trieäu teá baøo/ml, thôøi gian suïc khí thay ñoåi töø 0 – 20h. 4 Baûng 4. 15: Toác ñoä trung bình söû duïng ñöôøng khöû trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy 10 trieäu teá baøo/ml, thôøi gian suïc khí thay ñoåi töø 0 – 20h. 4 Baûng 4. 16: Söï bieán ñoåi noàng ñoä FAN trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy 10 trieäu teá baøo/ml, thôøi gian suïc khí thay ñoåi töø 0 – 20h. 4 Baûng 4. 17: Söï bieán ñoåi noàng ñoä ethanol sinh ra trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy 10 trieäu teá baøo/ml, thôøi gian suïc khí thay ñoåi töø 0 – 20h. 4 Baûng 4. 18: Söï thay ñoåi toác ñoä trung bình sinh ethanol trong dòch leân men khi leân men chính dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, vôùi caùc thôøi gian suïc khí khaùc nhau. 4 Baûng 4. 19: Söï bieán ñoåi pH trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy 10 trieäu teá baøo/ml, thôøi gian suïc khí thay ñoåi töø 0 – 20h. 4 Baûng 4. 20: Söï bieán ñoåi noàng ñoä diacetyl tao thaønh trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy 10 trieäu teá baøo/ml, thôøi gian suïc khí thay ñoåi töø 0 – 20h. 4 Baûng 4. 21: Noàng ñoä moät soá saûn phaåm phuï taïo thaønh trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy 10 trieäu teá baøo/ml, thôøi gian suïc khí thay ñoåi töø 0 – 20h. 4 Baûng 4. 22: Noàng ñoä moät soá saûn phaåm phuï taïo thaønh trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy 10 trieäu teá baøo/ml, thôøi gian suïc khí thay ñoåi töø 0 – 20h, keát quaû phaân tích ñöôïc quy ñoåi veà bia non 5% ñoä coàn. 4 Baûng 4. 23: Moät vaøi thoâng soá leân men chính dòch nha 24OBx vôùi thôøi gian suïc khí thay ñoåi töø 0 – 20giôø, ñoä leân men 75% 4 TOÙM TAÉT LUAÄN VAÊN Hieän nay, bia laø moät trong nhöõng loaïi thöùc uoáng phoå bieán treân theá giôùi. Ñeå ñaùp öùng nhu caàu söû duïng bia ngaøy caøng gia taêng, caùc nhaø maùy saûn xuaát bia coù theå söû duïng nhieàu giaûi phaùp kó thuaät khaùc nhau. Giaûi phaùp trieån voïng nhaát laø söû duïng kó thuaät leân men bia noàng ñoä cao. Tuy nhieân vieäc söû dung naám men töï do ñeå leân men bia noàng ñoä cao coù khaø nhieàu nhöôïc ñieåm. Ñeå khaéc phuïc nhöõng nhöôïc ñieåm cuûa vieäc söû duïng naám men töï do, nhieàu nghieân cöùu söû duïng naám men coá ñònh trong saûn xuaát bia ñaõ ñöôïc thöïc hieän vaø thu ñöôïc caùc keát quaû ñaùng chuù yù. Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa maät ñoä gioáng caáy ban ñaàu vaø haøm löôïng oxi hoøa tan ban ñaàu trong dòch nha ñeán ñoäng hoïc quaù trình sinh tröôûng cuûa naám men coá ñònh trong gel alginate, quaù trình söû duïng cô chaát ñöôøng khöû, nitô amin vaø quaù trình hình thaønh moät soá saûn phaåm trao ñoåi chaát cuûa vi sinh vaät. Trong nghieân cöùu naøy chuùng toâi söû duïng chaát mang alginate – laø moät cheá phaåm ñöôïc saûn xuaát trong nöôùc töø loaøi taûo naâu phaùt trieån taïi vuøng bieån mieàn trung cuûa Vieät Nam. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU Nhö chuùng ta ñaõ bieát, bia laø moät trong nhöõng saûn phaåm leân men coù lòch söû laâu ñôøi nhaát. Theo caùc taøi lieäu coå, bia coù xuaát xöù töø Ai Caäp vaøo khoaûng theá kyû thöù 6 tröôùc Coâng nguyeân. Hieän nay, bia ñaõ trôû thaønh moät trong nhöõng loaïi thöùc uoáng phoå bieán treân theá giôùi. Ñeå ñaùp öùng nhu caàu söû duïng bia ngaøy caøng gia taêng, caùc nhaø maùy saûn xuaát bia coù theå söû duïng nhieàu giaûi phaùp kó thuaät khaùc nhau. Giaûi phaùp trieån voïng nhaát laø söû duïng kó thuaät leân men bia noàng ñoä cao. Thoâng thöôøng dòch nha trong quaù trình leân men bia coù noàng ñoä chaát khoâ 10 – 12OBal. Ngöôøi ta seõ thöïc hieän quaù trình leân men dòch nha vôùi noàng ñoä chaát khoâ cao (16 – 24OBal) ñeå thu ñöôïc saûn phaåm bia ñaäm ñaëc. Sau ñoù, bia ñaäm ñaëc ñöôïc pha loaõng vôùi nöôùc roài baõo hoøa CO2 ñeå taïo ra bia thaønh phaåm. Kó thuaät leân men bia noàng ñoä cao ñaõ mang laïi nhieàu öu ñieåm: Taêng naêng suaát cuûa nhaø maùy bia maø khoâng caàn ñaàu tö theâm nhieàu thieát bò. Caûi thieän moät soá chæ tieâu cuûa saûn phaåm nhö: ñoä trong, ñoä beàn keo cuûa saûn phaåm… Caûi thieän chæ tieâu vi sinh cuûa baùn thaùnh phaåm bia non. Taêng tæ leä theá lieäu, giuùp giaûm giaù thaønh saûn phaåm. Vi sinh vaät chuû yeáu ñöôïc söû duïng trong quaù trình leân men bia laø loaøi Saccharomyces cerevisiae. Nhöõng thaønh töïu veà kó thuaät di truyeàn, ñoät bieán vaø taùi toå hôïp gen ñaõ giuùp cho caùc nhaø khoa hoïc tìm ñöôïc nhöõng chuûng naám men môùi vôùi nhieàu ñaëc tính coâng ngheä öu vieät nhö chòu ñöôïc aùp suaát thaåm thaáu vaø noàng ñoä coàn cao. Tuy nhieân, vieäc söû duïng naám men töï do trong quy trình leân men bia noàng ñoä cao coù khaù nhieàu nhöôïc ñieåm nhö: Thôøi gian leân men daøi, löôïng cô chaát soùt cao. Khaû naêng taùi söû duïng naám men raát thaáp. Ñeå khaéc phuïc nhöõng nhöôïc ñieåm treân, nhieàu nghieân cöùu söû duïng naám men coá ñònh trong saûn xuaát bia ñaõ ñöôïc thöïc hieän. Keát quaû cho thaáy naám men coá ñònh coù nhieàu öu ñieåm hôn so vôùi naám men töï do: Hieäu suaát söû duïng cô chaát cao, ruùt ngaén thôøi gian leân men. Baûo veä naám men tröôùc nhöõng taùc ñoäng baát lôïi cuûa moâi tröôøng (aùp suaát thaåm thaáu cao, noàng ñoä coàn cao…) nhaèm oån ñònh hoaït tính cuûa naám men. Naâng cao khaû naêng taùi söû duïng cuûa naám men. Caùc nghieân cöùu tröôùc ñaây veà öùng duïng naám men coá ñònh trong quaù trình leân men bia noàng ñoä cao chuû yeáu khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa noàng ñoä cô chaát ñeán hoaït tính trao ñoåi chaát cuûa naám men coá ñònh vaø chaát löôïng bia thaønh phaåm. Trong nghieân cöùu naøy chuùng toâi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa maät ñoä gioáng caáy ban ñaàu vaø haøm löôïng oxi hoøa tan ban ñaàu trong dòch nha ñeán ñoäng hoïc quaù trình sinh tröôûng cuûa naám men coá ñònh trong gel alginate, quaù trình söû duïng cô chaát ñöôøng khöû, nitô amin vaø quaù trình hình thaønh moät soá saûn phaåm trao ñoåi chaát cuûa vi sinh vaät. Trong nghieân cöùu naøy chuùng toâi söû duïng chaát mang alginate – laø moät cheá phaåm ñöôïc saûn xuaát trong nöôùc töø loaøi taûo naâu phaùt trieån taïi vuøng bieån mieàn trung cuûa Vieät Nam. CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN 2.1. COÁ ÑÒNH TEÁ BAØO: 2.1.1. Ñònh nghóa: Kyõ thuaät coá ñònh teá baøo ñöôïc ñònh nghóa laø: “Kyõ thuaät bao boïc hoaëc ñònh vò caùc teá baøo coøn nguyeân veïn trong moät “vuøng khoâng gian nhaát ñònh” nhaèm baûo veä caùc hoaït tính xuùc taùc mong muoán” (Karel vaø coäng söï, 1985). Coá ñònh teá baøo laø söï baét chöôùc hieän töôïng caùc teá baøo vi sinh vaät coù khaû naêng phaùt trieån treân beà maët hay beân trong caáu truùc cuûa moät vaøi nguyeân lieäu coù trong töï nhieân [38]. Kó thuaät coá ñònh teá baøo baét ñaàu ñöôïc nghieân cöùu saâu roäng töø nhöõng naêm 70 cuûa theá kæ tröôùc. Nhieàu chaát mang cuõng nhö kó thuaät môùi ñaõ ñöôïc nghieân cöùu vaø aùp duïng nhaèm môû roäng vaø phaùt trieån caùc öùng duïng cuûa teá baøo coá ñònh [39]. 2.1.2. So saùnh teá baøo coá ñònh so vôùi teá baøo töï do: 2.1.2.1. Öu ñieåm: Taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho vieäc taùch sinh khoái ra khoûi moâi tröôøng leân men, ñôn giaûn hoùa quaù trình taùch sinh khoái vaø thu saûn phaåm leân men [5]. Taêng khaû naêng taùi söû duïng cuûa teá baøo [5, 13]. Taêng maät ñoä teá baøo söû duïng trong thieát bò leân men [5, 13]. Deã daøng ñieàu khieån maät ñoä teá baøo trong thieát bò leân men [13]. Haïn cheá söï aûnh höôûng cuûa caùc vi sinh vaät taïp leân teá baøo [56]. Thöïc hieän ñöôïc quaù trình leân men lieân tuïc maø teá baøo ít bò röûa troâi [5, 13]. Taêng khaû naêng choáng laïi caùc ñieàu kieän baát lôïi cuûa moâi tröôøng leân teá baøo nhö söï thay ñoåi veà nhieät ñoä, pH, aùp suaát thaåm thaáu hay söï xuaát hieän caùc chaát öùc cheá trong moâi tröôøng leân men [5, 13, 56, 69]. 2.1.2.2. Nhöôïc ñieåm: Khoâng aùp duïng cho caùc quaù trình leân men maø saûn phaåm thu ñöôïc laø sinh khoái vi sinh vaät hay caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát noäi baøo [5, 13]. Söï phaùt trieån sinh khoái beân trong chaát mang coù theå phaù hoûng caáu truùc cuûa noù, laøm cho caùc teá baøo bò röûa troâi ra khoûi chaát mang. Khi ñoù vieäc taùch vaø thu nhaän saûn phaåm cuõng khoù khaên nhö quaù trình leân men söû duïng teá baøo töï do [39]. Moät soá chaát mang vaø phöông phaùp coá ñònh coù theå laøm aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa teá baøo [5, 39]. Caáu truùc cuûa chaát mang coù theå aûnh höôûng ñeán quaù trình trao ñoåi chaát cuûa teá baøo vôùi moâi tröôøng [5, 39]. Chi phí cuûa vieäc söû duïng chaát mang cuõng nhö phöông phaùp coá ñònh seõ aûnh höôûng ñeán giaù thaønh saûn phaåm[7]. Nhö vaäy, öu ñieåm noåi baät cuûa kó thuaät coá ñònh laø giuùp cho teá baøo giöõ ñöôïc hoaït tính sinh hoïc oån ñònh trong thôøi gian daøi, teá baøo coá ñònh phuø hôïp coâng ngheä leân men lieân tuïc, khaû naêng taùi söû duïng cuûa teá baøo coá ñònh cao hôn so vôùi teá baøo töï do. Ngaøy naøy, vieäc öùng duïng teá baøo coá ñònh trong coâng nghieäp ngaøy caøng môû roäng vaø thu ñöôïc hieäu quaû cao [5, 13, 39] . 2.1.3. Caùc kó thuaät coá ñònh teá baøo: Ñeå thu ñöôïc hieäu quaû cao nhaát khi söû duïng teá baøo coá ñònh, ngoaøi vieäc löïa choïn gioáng vi sinh vaät vaø chaát mang, chuùng ta coøn phaûi löïa choïn kó thuaät coá ñònh phuø hôïp cho töøng loaïi teá baøo tuøy theo muïc ñích söû duïng. Moãi kó thuaät coá ñònh ñeàu coù öu nhöôïc ñieåm rieâng vaø chæ phuø hôïp cho moät soá loaøi vi sinh vaät cuõng nhö moät soá muïc ñích söû duïng. Döïa vaøo töông taùc giöõa teá baøo vaø chaát mang, caùc kó thuaät coá ñònh teá baøo coù theå chia laøm 4 nhoùm chính [41]: Coá ñònh teá baøo leân beà maët chaát mang raén (carrier – binding). Nhoát teá baøo trong caáu truùc gel (entrapment). Keát boâng teá baøo (aggregation). Vi bao teá baøo (microencapsulation). Khi löïa choïn phöông phaùp coá ñònh teá baøo caàn xem xeùt moät soá yeâu caàu sau: Khoâng gaây aûnh höôûng baát lôïi ñeán hoaït tính teá baøo. Ñaûm baûo ñöôïc hieäu quaû kinh teá. Kó thuaät coá ñònh ñôn giaûn deã thöïc hieän vaø öùng duïng vaøo saûn xuaát quy moâ lôùn. a Teá baøo haáp phuï treân beà maët Teá baøo lieân keát tónh ñieän treân moät beà maët Teá baøo lieân keát ñoàng hoùa trò treân moät beà maët Nhoát teá baøo beân trong caáu truùc gel Teá baøo keát boâng töï nhieân Teá baøo keát boâng nhaân taïo (lieân keát ngang) Vi bao teá baøo baèng polymer baùn thaám Vi bao teá baøo baèng maøng loûng Chaën teá baøo giöõa hai maøng membrane Chaát mang khoâng tan. Pha loûng. Chaát mang xoáp. Membrane. Taùc nhaân lieân keát ngang. Löïc tónh ñieän COÁ ÑÒNH TEÁ BAØO TREÂN BEÀ MAËT CHAÁT MANG RAÉN. NHOÁT TEÁ BAØO TRONG CAÁU TRUÙC GEL. KEÁT BOÂNG TEÁ BAØO. VI BAO TEÁ BAØO. Pha loûng Hình 2. 1: Caùc phöông phaùp coá ñònh teá baøo [41] 2.1.3.1. Kó thuaät coá ñònh teá baøo treân chaát mang raén (carrier – binding) Quaù trình coá ñònh teá baøo treân chaát mang raén thöïc chaát laø söï haáp phuï vaät lyù thoâng qua caùc lieân keát ion, tónh ñieän, lieân keát ñoàng hoaù trò hoaëc lieân keát ñaëc tröng giöõa teá baøo vaø chaát mang. Chieàu daøy cuûa lôùp teá baøo haáp phuï thöôøng raát moûng vaøo khoaûng 1mm vaø giaûm daàn trong quaù trình leân men [41]. Caùc chaát mang coù theå söû duïng laø caùc polysaccharide coù nguoàn goác töï nhieân (DEAE-cellulose, goã, muøn cöa, dextran…), polysaccharide toång hôïp (caùc daãn xuaát cuûa polystyrene, polyurethane…) hay caùc hôïp chaát voâ cô (ceramic, thuyû tinh xoáp, silicate…). Caùc chaát mang naøy coù theå ñöôïc söû duïng ngay hoaëc xöû lyù vôùi hoaù chaát nhaèm laøm taêng khaû naêng haáp phuï cuûa chuùng [41]. Öu ñieåm: Teá baøo deã daøng tieáp xuùc vôùi cô chaát do naèm treân beà maët cuûa chaát mang. Vì theá, quaù trình trao ñoåi chaát cuûa teá baøo ít bò aûnh höôûng. Beân caïnh ñoù, lieân keát giöõa teá baøo vaø chaát mang khaù beàn vöõng (ñoái vôùi lieân keát ñoàng hoùa trò) [41]. Nhöôïc ñieåm: Ñoái vôùi lieân keát ion hay löïc haáp phuï vaät lyù, lieân keát giöõa teá baøo vaø chaát mang khoâng beàn, caùc teá baøo deã bò röûa troâi. Vì vaäy, hieäu suaát coá ñònh teá baøo thaáp, khoaûng 40 – 60%. Maët khaùc, khaû naêng baûo veä teá baøo tröôùc nhöõng ñieàu kieän baát lôïi cuûa moâi tröôøng xung quanh thaáp do teá baøo ñöôïc coá ñònh treân beà maët chaát mang [16]. 2.1.3.2. Kó thuaät nhoát teá baøo trong caáu truùc gel (entrapment): Kó thuaät nhoát teá baøo trong caáu truùc gel laø quaù trình bao boïc teá baøo vaøo trong caáu truùc gel nhaèm ngaên caûn teá baøo khueách taùn ra moâi tröôøng xung quanh nhöng vaãn cho pheùp teá baøo trao ñoåi chaát vôùi moâi tröôøng xung quanh. Hình daïng cuûa chaát mang thöôøng laø caùc haït gel hình caàu coù ñöôøng kính töø 0.3-5mm [16]. Caùc loaïi chaát mang thöôøng söû duïng trong kó thuaät naøy chuû yeáu laø caùc chaát mang coù nguoàn goác höõu cô nhö polysaccharide (alginate, κ-carrageenan, agar, pectin…), protein (gelatin, collagen…) hay polymer toång hôïp (polyvinyl alcohol, polyacrylamide…). Trong ñoù, alginate laø chaát mang ñöôïc söû duïng phoå bieán trong ngaønh coâng ngheä leân men thöïc phaåm. Quaù trình trao ñoåi chaát giöõa moâi tröôøng beân trong vaø beân ngoaøi haït gel ñöôïc thöïc hieän do söï cheânh leäch noàng ñoä cô chaát ôû beân trong vaø beân ngoaøi haït gel vaø quaù trình naøy phuï thuoäc vaøo kích thöôùc, ñoä chaët cuûa haït gel, maät ñoä teá baøo beân trong haït gel vaø maät ñoä haït gel trong moâi tröôøng leân men [16]. Öu ñieåm: Ñaây laø phöông phaùp coá ñònh ñôn giaûn, deã toái öu hoùa quy trình coá ñònh, chi phi coá ñònh thaáp, haït gel coù ñoä beàn cao vaø coù theå chöùa ñöôïc maät ñoä teá baøo raát cao. Maët khaùc, haït gel baûo veä teá baøo coá ñònh tröôùc nhöõng ñieàu kieän baát lôïi cuûa moâi tröôøng (söï thay ñoåi nhieät ñoä, pH…). Beân caïnh ñoù, vieäc toái öu hoùa ñieàu kieän leân men cuõng nhö ñieàu khieån quaù trình coù theå thöïc hieän deã daøng [15]. Nhöôïc ñieåm: Teá baøo coù theå phaùt trieån treân beà maët haït gel vaø giaûi phoùng khoûi theå haït, laøm cho moâi tröôøng leân men chöùa hoãn hôïp teá baøo töï do vaø teá baøo coá ñònh. Noàng ñoä cô chaát vaø caùc saûn phaåm taïi beà maët haït gel vaø taâm haït coù söï khaùc nhau. Do ñoù hoaït tính vaø caùc ñaëc ñieåm sinh lyù cuûa teá baøo taïi caùc vò trí trong haït gel cuõng khaùc nhau. Maët khaùc, khí CO2 sinh ra do quaù trình leân men coù theå laøm nöùt vôõ haït gel [16, 41]. 2.1.3.3. Kó thuaät keát boâng teá baøo (aggregation) [16]: Moät soá loaøi vi sinh vaät nhö naám men coù khaû naêng töï keát laïi vôùi nhau thaønh moät khoái (keát boâng). Ta coù theå söû duïng hieän töôïng naøy nhö moät phöông phaùp coá ñònh ñôn giaûn vaø reû tieàn. Maët khaùc ta coù theå thay ñoåi ñieàu kieän moâi tröôøng (pH, nhieät ñoä…) hay söû duïng moät soá taùc nhaân hoùa hoïc nhö glutaraldehyde, diisocyanate nhaèm keát noái caùc teá baøo vôùi nhau thaønh nhöõng khoái haït. Tuy nhieân phöông phaùp naøy ít ñöôïc aùp duïng trong thöïc teá vì coù khaù nhieàu nhöôïc ñieåm: vieäc ñieàu khieån quaù trình coá ñònh heát söùc phöùc taïp vaø toán keùm, caùc taùc nhaân hoaù hoïc duøng ñeå keát boâng coù theå gaây haïi cho söùc khoeû ngöôøi tieâu duøng neân ít ñöôïc aùp duïng trong ngaønh coâng ngheä thöïc phaåm. Maët khaùc caùc taùc nhaân hoaù hoïc naøy gaây caûn trôû cho vieäc trao ñoåi chaát cuûa caùc teá baøo ôû taâm khoái haït. 2.1.3.4. Kó thuaät vi bao (microencapsulation) [41]: Kó thuaät vi bao goàm coù: Söû duïng bao vi theå (micorencapsulte type): teá baøo ñöôïc nhoát trong caùc bao vi theå baèng caùc polimer baùn thaám. Kieåu lipoxome: teá baøo ñöôïc nhoát trong maøng loûng töø caùc chaát mang coù tính löôõng cöïc (amphiphatic). Söû duïng membrane: teá baøo ñöôïc nhoát baèng maøng vi loïc hay sieâu loïc. Phöông phaùp naøy thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå lieân tuïc taùch saûn phaåm ra khoûi teá baøo. Tuy nhieân nhöôïc ñieåm cuûa phöông phaùp naøy laø söï vaän chuyeån caùc chaát coù phaân töû löôïng lôùn qua maøng coù theå bò taéc ngheõn. 2.1.3.5. Yeâu caàu löïa choïn chaát mang [19,40,55,70]: Khi löïa choïn chaát mang coá ñònh teá baøo, caàn xem xeùt caùc yeâu caàu sau: Khaû naêng vaø hieäu quaû coá ñònh teá baøo cao, giaù thaønh hôïp lyù, deã söû duïng vaø taùi sinh. Ñoä beàn cô, ñoä beàn hoùa vaø ñoä beàn sinh hoïc cao. Dieän tích beà maët chaát mang lôùn, caáu truùc xoáp, ñoàng nhaát, taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho vieäc trao ñoåi chaát cuûa teá baøo coá ñònh. Maët khaùc, chaát mang phaûi khoâng ñoäc vaø khoâng aûnh höôûng ñeán höông vò cuõng nhö chaát löôïng cuûa saûn phaåm Giöõ ñöôïc khaû naêng soáng soùt vaø hoaït tính teá baøo trong thôøi gian daøi. 2.2. COÁ ÑÒNH NAÁM MEN TRONG GEL ALGINATE: 2.2.1. Naám men bia: Naám men laø vi sinh vaät coù nhieàu öùng duïng trong saûn xuaát thöïc phaåm, ñaëc bieät laø trong saûn xuaát thöùc uoáng leân men nhö bia, röôïu vang... Trong quaù trình leân men bia, beân caïnh caùc saûn phaåm chính laø ethanol vaø CO2, naám men coøn taïo thaønh nhieàu saûn phaåm phuï nhö caùc acid höõu cô, caùc röôïu baäc cao, aldehyde vaø ester. Nhöõng saûn phaåm phuï naøy goùp phaàn aûnh höôûng ñeán höông vò chaát löôïng cuûa biab [1, 2, 4]. Phaân loaïi [1]: Trong ngaønh saûn xuaát bia, caùc gioáng naám men bia ñöôïc chia thaønh 2 nhoùm: Nhoùm naám men noåi coù caùc ñaëc tính: Nhieät ñoä leân men khoaûng 14 – 25OC. Khi keát thuùc quaù trình leân men, caùc teá baøo naám men noåi leân beà maët dòch leân men vaø khoâng theå thu hoài ñeå taùi söû duïng cho meû leân men tieáp theo. Leân men 1/3 ñöôøng tam raffinose. Nhoùm naám men chìm coù caùc ñaëc tính: Nhieät ñoä leân men khoaûng 6 – 12OC. Khi keát thuùc quaù trình leân men, caùc teá baøo keát chuøm vaø laéng xuoáng ñaùy thuøng leân men. Caùc nhaø saûn xuaát seõ thu hoài sinh khoái, xöû lyù vaø taùi söû duïng cho meû leân men keá tieáp. Coù khaû naêng leân men toaøn boä ñöôøng raffinose. Caáu taïo teá baøo: Saccharomyces cerevisiae laø loaøi vi sinh vaät ñôn baøo thuoäc nhoùm Eukariote. Teá baøo thöôøng coù hình caàu hay hình oval, ñöôøng kính teá baøo khoaûng 5-10µm. Hình thöùc sinh saûn chuû yeáu laø phöông phaùp naûy choài [2]. Thaønh phaàn hoaù hoïc cuûa teá baøo naám men: Thaønh phaàn hoaù hoïc cuûa teá baøo naám men phuï thuoäc vaøo chuûng naám men, traïng thaùi sinh lyù moâi tröôøng cuõng nhö ñieàu kieän nuoâi caáy. Trung bình teá baøo naám men chöùa 75% nöôùc vaø 25% chaát khoâ. Thaønh phaàn chaát khoâ cuûa naám men goàm: 30-50% protein, 24-40% glucid, 2-5% lipid, 5-11% khoaùng [2]. Toång hôïp naêng löôïng ôû naám men: Saccharomyces cerevisiae laø loaøi vi sinh vaät kò khí tuyø tieän. Chuùng coù khaû naêng phaùt trieån ôû moâi tröôøng coù hay khoâng coù oxi. Söï sinh tröôûng cuûa naám men trong ñieàu kieän hieáu khí nhanh maø maïnh hôn [2]. ÔÛ ñieàu kieän hieáu khí, Saccharomyces cerevisiae toång hôïp naêng löôïng theo con ñöôøng hoâ haáp hieáu khí, bieán ñöôøng maltose coù trong dòch nha thaønh CO2 vaø H2O vaø taêng sinh khoái. ÔÛ ñieàu kieän kò khí, Saccharomyces cerevisiae toång hôïp naêng löôïng baèng con ñöôøng leân men ethanol. Quaù trình leân men coàn ñöôïc baét ñaàu baèng chu trình ñöôøng phaân, chuyeån hoùa moät phaân töû ñöôøng maltose thaønh 4 phaân töû ethanol 4 phaân töû CO2 vaø 4 ATP (Hình 2.3). Hình 2. 2: Quaù trình leân men ethanol [2] 2.2.2. Alginate [6, 7, 26, 37, 44]: Alginate coù nhieàu trong thieân nhieân vaø ñöôïc thu nhaän töø nhieàu nguoàn goác khaùc nhau. Alginate coù trong thaønh phaàn caáu truùc cuûa taûo naâu (Phaeophyceae), chieám ñeán 40% khoái löôïng chaát khoâ. Alginate cuõng laø polysaccharide trong maøng bao nhaày một số loaïi vi khuaån. Tuy nhieân, caùc loaïi alginate thöông maïi hieän nay ñeàu coù nguoàn goác töø taûo naâu vaø ñöôïc söû duïng döôùi daïng muoái sodium, potassium, amonium hay calcium cuûa acid alginic [26, 36, 44]. Acid alginic laø moät copolymer khoâng phaân nhaùnh, bao goàm caùc monomer b-D-mannuronic acid (goïi taét laø M) vaø a-L-guluronic acid (G) lieân keát vôùi nhau thoâng qua lieân keát 1,4 – glucoside. Caùc monomer naøy phaân boá trong maïch alginic theo caùc block (Hình 2.5) [26]. Block M: goàm caùc goác acid mannuronic noái tieáp nhau Block G: goàm caùc goác acid guluronic noái tieáp nhau Block MG: goàm caùc goác acid mannuronic vaø acid guluronic luaân phieân noái vôùi nhau. Acid alginic thu ñöôïc töø caùc loaïi taûo khaùc nhau thì coù caùc tính chaát khaùc nhau chuû yeáu laø do tæ leä M/G vaø traät töï saép xeáp caùc block trong phaân töû. Söï khaùc nhau veà tæ teä M/G cuûa acid alginic thu ñöôïc töø caùc loaïi taûo khaùc nhau ñöôïc bieåu dieãn qua baûng 2.1. A B C Hình 2. 3: Caùc monomer cuûa acid alginic [26]. Hình 2. 4: Caáu truùc caùc block cuûa phaân töû cuûa acid alginic. A: Block G, B: Block M, C: Block MG [26]. Baûng 2. 1: Tæ leä M/G cuûa moät soá cheá phaåm acid alginic [26]. Acid alginic töø Tæ leä M/G Ascophyllum rodosum 1,85 Eckloniacava 2,64 – 3,08C Laminaria digitata 0,62 Laminaria hyperborea 1,28 Laminaria japonica 2,26b Macrocystis pyrifera 1,56 Undaria pinnatifida 1,45 – 2,65C b: maãu acid alginic thöông maïi. c: khoaûng thay ñoåi cuûa tæ soá M/G trong moät naêm. 2.2.3. Cô cheá taïo gel: Alginate thöôøng ñöôïc saûn xuaát döôùi daïng caùc daãn xuaát cuûa muoái tan nhö sodium alginate, potassium alginate. Khi caùc muoái naøy ñöôïc cho tieáp xuùc vôùi caùc ion kim loaïi ña hoùa trò nhö Ca2+, Zn2+, Pb2+… caùc ion kim loaïi ña hoùa trò seõ thay theá caùc ion ban ñaàu trong phaân töû alginate hình thaønh lieân keát ngang giöõa caùc lôùp trong caáu truùc maïng phaân töû alginate vaø taïo thaønh caáu truùc gel. Khaû naêng taïo gel cuûa alginate vôùi caùc ion kim loaïi ña hoùa trò giaûm daàn theo trình töï: Pb2+, Cu2+, Cd2+, Ba2+, Sr2+, Ca2+, Co2+... Acid gulurunic ñöôïc öu tieân lieân keát vôùi caùc ion ña hoaù trò baèng lieân keát ion (Hình 2.6). Trong ngaønh coâng ngheä thöïc phaåm, ion Ca2+ ñöôïc söû duïng laøm taùc nhaân taïo gel alginate vì haàu heát ion coøn laïi coù theå aûnh höôûng khoâng toát ñeán söùc khoeû cuûa ngöôøi söû duïng vaø coù khaû naêng gaây ñoäc cho naám men [6,7]. Coù hai phöông phaùp taïo gel alginate laø phöông phaùp taïo gel khueách taùn (difussion gelation) vaø phöông phaùp taïo gel noäi (internal gelation). 2.2.3.1. Phöông phaùp taïo gel khueách taùn: (diffusion gelation) Nguyeân taéc: khueách taùn caùc ion Ca2+ töø beân ngoaøi vaøo trong dung dòch alginate. Caùc ion Ca2+ seõ thay theá caùc ion kim loaïi ban ñaàu trong muoái alginate vaø taïo thaønh caùc lieân keát ngang, hình thaønh caáu truùc khoâng gian cho maïng gel [26]. Phöông phaùp thöïc hieän: ñaây laø phöông phaùp ñöôïc söû duïng roäng raõi trong kó thuaät coá ñònh teá baøo. Hoãn hôïp dung dòch alginate trong nöôùc vaø huyeàn phuø naám men ñöôïc nhoû gioït vaøo dung dòch chöùa ion Ca2+ thöôøng laø CaCl2 ñeå taïo thaønh caùc haït gel Ca-alginate coù chöùa naám men beân trong (Hình 2.7) [5,68]. Quaù trình taïo gel baét ñaàu töø beà maët ngoaøi cuûa gioït alginate. Khi tieáp xuùc vôùi ion Ca2+ trong dung dòch, beà maët ngoaøi cuûa gioït alginate laäp töùc bò gel hoaù. Do gel alginate coù caáu truùc xoáp neân caùc ion Ca2+ tieáp tuïc khueách taùn vaøo beân trong gioït alginate laøm cho caùc phaân töû alginate beân trong tieáp tuïc ñöôïc gel hoaù. Vì söï khueách taùn ion Ca2+ ñi töø beân ngoaøi haït gel ñeán taâm haït gel neân maät ñoä alginate treân beà maët haït gel cao hôn nhieàu laàn so vôùi taâm haït. Do ñoù tính ñoàng theå cuûa haït gel khoâng cao [5,25,68]. Öu ñieåm: phöông phaùp ñôn giaûn deã thöïc hieän, khoâng toán thôøi gian, chi phí thaáp. Nhöôïc ñieåm: tính ñoàng nhaát cuûa haït gel thaáp, hình daïng cuûa haït gel chæ coù theå laø hình caàu. 2.2.3.2. Phöông phaùp taïo gel noäi: (internal gelation) Nguyeân taéc: khueách taùn ñeàu ion Ca2+ ôû daïng voâ hoaït trong hoãn hôïp dung dòch alginate trong nöôùc vaø huyeàn phuø naám men, sau ñoù hoaït hoùa giaûi phoùng ra caùc ion Ca2+. Quaù trình gel hoaù dieãn ra beân trong haït alginate [5,26]. Phöông phaùp thöïc hieän: ngöôøi ta thöôøng söû duïng caùc muoái voâ cô khoâng tan cuûa calcium nhö CaCO3, CaSO4, hay moät vaøi muoái höõu cô khoâng tan cuûa canxi nhö Ca-EDTA, calcium citrate … Caùc muoái treân ñöôïc troän ñeàu trong hoãn hôïp dung dòch alginate trong nöôùc vaø huyeàn phuø naám men. Sau ñoù hoãn hôïp naøy coù theå ñöôïc cho vaøo khuoân ñeå haït gel coù ñöôïc hình daïng mong muoán [5,26]. Söû duïng moät soá taùc nhaân acid hoùa nhö D-glucono-d-lactone (GDL) nhaèm laøm giaûm pH cuûa dung dòch. Khi pH giaûm, ion Ca2+ ñöôïc giaûi phoùng daàn vaø tham gia vaøo quaù trình taïo gel vôùi alginate [5,26]. Öu ñieåm: haït gel coù tính ñoàng nhaát cao, ñoä beàn cuûa haït gel toát hôn khi taïo gel baèng phöông phaùp khueách taùn. Nhöôïc dieåm: Khoù thöïc hieän, chi phí cao, toán nhieàu thôøi gian. Hình 2. 5: Söï lieân keát giöõa ion Ca2+ vaø goác G.[5] Hình 2. 6: Phöông phaùp taïo gel khueách taùn [5]. Hình 2. 7: Phöông phaùp taïo gel noäi [5]. 2.2.4. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán ñoä beàn cuûa gel alginate: 2.2.4.1. AÛnh höôûng cuûa khoái löôïng phaân töû: Johansen vaø Flink (1986) ñaõ nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa khoái löôïng phaân töû alginate ñeán ñoä beàn gel vaø khaû naêng leân men cuûa naám men coá ñònh. Keát quaû thöïc nghieäm cho thaáy ñoä beàn gel (ñöôïc ño baèng khaû naêng choáng chòu ñoái vôùi löïc neùn eùp) taêng ñaùng keå khi taêng ñoä nhôùt dung dòch alginate ban ñaàu töø 5 – 70cP, nhöng khi ñoä nhôùt taêng cao hôn nöõa (250 – 600cP) thì ñoä beàn gel taêng raát ít (Yamagiwa vaø coäng söï, 1995; Johansen vaø Flink, 1986). 2.2.4.2. Aûnh höôûng cuûa tæ leä G/M: Tyû leä G/M laø tæ leä soá goác cuûa L-guluronic acid so vôùi soá goác D-mannuronic acid trong phaân töû alginate. Khi taêng tæ leä G/M thì ñoä beàn gel taêng vì ion Ca2+ öu tieân lieân keát vôùi block G. Do ñoù gel coù haøm löôïng G cao seõ khoâng bò phoàng nôû hay co ruùt, giöõ ñöôïc hình daïng toát hôn, khaû naêng taùi söû duïng naám men coá ñònh seõ cao hôn vaø khoâng aûnh höôûng ñeán khaû naêng khueách taùn glucose vaøo trong haït gel [25,35]. Tuy nhieân, khi gel coù haøm löôïng G cao laïi caûn trôû söï phaùt trieån cuûa naám men (Johansen vaø Flink, 1986). 2.2.4.3.AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä dung dòch alginate söû duïng ñeå taïo gel: Yamagiwa vaø coäng söï, (1995) ñaõ nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa noàng ñoä alginate ñeán ñoä beàn gel vaø khaû naêng leân men cuûa naám men coá ñònh. Hoï cho raèng ñoä beàn cuûa gel taêng khi taêng noàng ñoä dung dòch alginate söû duïng ñeå taïo gel vaø noàng ñoä alginate thích hôïp ñeå coá ñònh naám men khoaûng 2% [81]. 2.2.4.4.Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä vaø pH taïo gel: Theo Yamagiwa vaø coäng söï (1995), pH thích hôïp cuûa dung dòch alginate cho quaù trình taïo gel khoaûng 6 – 8. Caùc phaân töû alginate seõ bò thay ñoåi hình daïng khi pH cuûa dung dòch naèm ngoaøi khoaûng treân. Ñieàu naøy laøm cho ñoä beàn gel giaûm. Maët khaùc, nhieät ñoä thích hôïp cho quaù trình taïo gel khoâng ñöôïc vöôït quaù 25OC [81]. 2.2.5. Moät soá ñaëc ñieåm cuûa naám men coá ñònh trong gel alginate: Naám men coá ñònh trong gel alginate coù nhieàu ñieåm khaùc bieät so vôùi naám men töï do. 2.2.5.1. Hình thaùi caáu truùc: Naám men coá ñònh trong haït gel alginate coù hình daïng vaø kích thöôùc khaùc nhau, phuï thuoäc vaøo khoaûng khoâng gian beân trong haït gel, chuùng thöôøng coù xu höôùng keát tuï laïi vôùi nhau [43]. Melzoch vaø coäng söï (1994) vaø Doran vaø coäng söï (1985) ñaõ nghieân cöùu hình thaùi cuûa naám men coá ñònh trong gel Ca-alginate vaø nhaän thaáy raèng caùc teá baøo naám men coá ñònh coù kích thöôùc ña daïng vaø hình daïng khoâng ñoàng ñeàu. Söï phaùt trieån cuûa caùc teá baøo naám men trong haït gel phuï thuoäc vaøo khoaûng khoâng gian beân trong haït, chuùng seõ taän duïng toaøn boä caùc khoaûng troáng trong haït ñeå phaùt trieån toái ña. Vieäc phaûi chen chuùc nhau trong moät khoaûng khoâng gian chaät choäi nhö vaäy ñaõ taïo neân söï ña daïng veà hình daïng vaø kích thöôùc cuûa naám men coá ñònh [25,43,46]. 2.2.5.2. Khaû naêng sinh tröôûng: Ñaõ coù nhieàu coâng trình nghieân cöùu veà khaû naêng sinh tröôûng cuûa naám men coá ñònh, tuy nhieân caùc nghieân cöùu naøy chöa ñöa ra ñöôïc moät keát luaän nhaát quaùn. Moät soá taùc giaû khaùc keát luaän toác ñoä sinh tröôûng cuûa naám men coá ñònh cao hôn so vôùi naám men töï do. Hoï cho raèng chính taùc duïng baûo veä naám men cuûa chaát mang tröôùc nhöõng ñieàu kieän baát lôïi cuûa moâi tröôøng giuùp cho naám men coá ñònh phaùt trieån maïnh hôn so vôùi naám men töï do [68]. Tuy nhieân, moät soá taùc giaû khaùc laïi cho raèng caùc chaát mang ñaõ haïn cheá khaû naêng tieáp xuùc cuûa naám men ñoái vôùi cô chaát vaø O2, laøm cho caùc teá baøo beân trong haït gel bò thieáu dinh döôõng daãn ñeán toác ñoä sinh tröôûng giaûm [43]. Theo Melzoch vaø coäng söï (1994) caùc teá baøo naám men coá ñònh trong gel alginate sau khi ñöôïc hoaït hoùa, neáu ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng giaøu chaát dinh döôõng thì soá löôïng teá baøo seõ taêng leân raát nhanh (khoaûng 1010 teá baøo/mL gel) vaø sau ñoù haàu nhö khoâng ñoåi [46]. 2.2.5.3. Hoaït tính trao ñoåi chaát: Galazzo vaø Bailey (1990) ñaõ söû duïng phöông phaùp quang phoå coäng höôûng töø haït nhaân ñeå khaûo saùt söï bieán ñoåi cô chaát beân trong teá baøo cuûa naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate trong suoát quaù trình chuyeån hoùa glucose thaønh ethanol ôû nhieät ñoä 20oC. Hoï ñaõ quan saùt thaáy raèng söï taïo thaønh ethanol, glycerol cuûa caùc teá baøo naám men coá ñònh trong gel alginate cuõng cao hôn khoaûng 2 laàn so vôùi naám men töï do vì söï söû duïng glucose vaø haøm löôïng caùc saûn phaåm trung gian cuûa chu trình ñöôøng phaân (glucose-6-P, fructose-6-P, 3-P-glycerate) ôû naám men coá ñònh taêng khoaûng 2 laàn so vôùi naám men töï do. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 2.2, 2.3) [31,32]. Baûng 2. 2: So saùnh toác ñoä söû duïng glucose vaø toác ñoä taïo thaønh ethanol cuûa naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate [31]. Naám men töï do (mmol/L.phuùt) Naám men coá ñònh (mmol/L.phuùt) Toác ñoä söû duïng glucose 21,7 42,7 Toác ñoä toång hôïp ethanol 37,1 70 Toác ñoä toång hôïp Glycerol 3,5 6,9 Baûng 2. 3: Söï hình thaønh moät soá saûn phaåm trung gian trong chu trình ñöôøng phaân cuûa naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate [31]. pH moâi tröôøng Haøm löôïng mMol/L (mM) Toác ñoä mMol/ phuùt Glucose-6-P Fructose-6-P 3-P-Glycerate Glucose-6-P Fructose-6-P 3-P-glycerate Naám men töï do 5,5 1,4 0,8 0,1 14,5 26,7 1,8 4,5 0,7 0,3 0,1 17,3 32,2 1,9 Naám men coá ñònh 5,5 4,4 1,8 4,5 35,1 25 3,7 4,5 3,1 1,6 1,4 38,2 49 3,8 2.2.5.4. Khaû naêng chòu ñöïng caùc yeâu toá baät lôïi cuûa moâi tröôøng: Ethanol: Naám men bia töï do khoâng chòu ñöôïc haøm löôïng ethanol lôùn hôn 9% (v/v), nhöng khi chuùng ñöôïc coá ñònh thì khaû naêng naøy taêng leân ñaùng keå. Sau 5 phuùt tieáp xuùc vôùi ethanol 80% (v/v) thì naám men töï do bò tieâu dieät hoaøn toaøn trong khi soá teá baøo soáng naám men coá ñònh vaãn töông töï nhö ôû thôøi ñieåm ban ñaàu (Desimone vaø coäng söï, 2002). Maët khaùc, theo Nadodawithana vaø Steinkraus (1976) naám men coá ñònh coù khaû naêng giaûi phoùng ethanol noäi baøo ra ngoaøi moâi tröôøng toát hôn naám men töï do. Vì vaäy khaû naêng chòu ñöïng ethanol cuûa naám men coá ñònh toát hôn naám men töï do [29]. Nhieät ñoä vaø pH moâi tröôøng: Naám men coá ñònh coù khaû naêng chòu ñöïng söï thay ñoåi cuûa pH vaø nhieät ñoä toát hôn naám men töï do. Theo Buzas vaø coäng söï (1989), naám men S.cerevisiae nhoát trong gel alginate khoâng bò aûnh höôûng bôûi pH thaáp 2,5 – 3 trong moät khoaûng thôøi gian daøi. Maët khaùc, pH noäi baøo cuûa naám men coá ñònh khoâng thay ñoåi trong suoát quaù trình leân men, trong khi ñoù, pH noäi baøo cuûa naám men töï do laïi coù khuynh höôùng giaûm [18]. Aùp suaát thaåm thaáu cuûa moâi tröôøng: Naám men coá ñònh coù khaû naêng leân men dòch nha noàng ñoä cao toát hôn naám men töï do. Khaû naêng soáng soùt cuûa naám men coá ñònh trong gel alginate trong dung dòch ñöôøng glucose 20% laø 72% (Krisch vaø Szajaùni, 1997). Maët khaùc, theo Holceberg vaø Margalith (1981) naám men coá ñònh vaãn coù khaû naêng leân men dung dòch ñöôøng glucose töø 40 – 50% [42]. 2.2.5.5. Khaû naêng taïo höông vaø caùc saûn phaåm phuï cuûa quaù trình leân men: Hoaït tính trao ñoåi chaát cuûa naám men, ñaëc bieät laø söïï trao ñoåi acid amin aûnh höôûng ñeán höông vò vaø chaát löôïng bia thaønh phaåm. Acid amin coù lieân quan maät thieát ñeán caùc quaù trình sinh toång hôïp caùc hôïp chaát höông nhö diacetyl, ester, caùc aldehyde, röôïu baäc cao, caùc acid höõu cô. Caùc ester cuûa ethanol vaø caùc acid maïch trung bình, cuõng nhö ester cuûa acid acetic vaø röôïu baäc cao ñoùng vai troø quan troïng trong vieäc taïo ra höông ñaëc tröng saûn phaåm bia. Ngöôïc laïi, röôïu cao phaân töû, aldehyde vaø diacetyl laïi ñöôïc coi laø caùc yeáu toá gaây aûnh höôûng khoâng toát ñeán muøi vò cuûa saûn phaåm [78]. Röôïu baäc cao: Coù nhieàu coâng trình nghieân veà haøm löôïng röôïu baäc cao sinh ra trong quaù trình leân men chính. Maëc duø caùc keát quaû thu ñöôïc chöa nhaát quaùn nhöng caùc taùc giaû ñeàu cho raèng haøm löôïng röôïu baäc cao tuøy thuoäc vaøo möùc ñoä phaùt trieån cuûa teá baøo naám men cuõng nhö khaû naêng söû duïng FAN cuûa naám men. Valine, isoleucine vaø leucine coù aûnh höôûng tröïc tieáp ñeán quaù trình sinh toång hôïp caùc hôïp chaát höông nhö isobutanol, amyl alcohol vaø iso-amyl alcohol. Do taùc duïng baûo veä cuûa alginate tröôùc söï thay ñoåi cuûa nhieät ñoä, aùp suaát thaåm thaáu vaø löôïng ethanol… neân haøm löôïng moät soá loaïi röôïu baäc cao sinh ra khi leân men baèng naám men coá ñònh cao hôn naám men töï do (Sablayroles vaø Ball, 1995; Masschelein vaø coäng söï, 1985; Smogrovicovaù vaø Domeny, 1999) (baûng 2.4). Baûng 2. 4: Haøm löôïng moät soá saûn phaåm phuï trong bia non ñöôïc leân men baèng maám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel Ca-alginate. (mg/L) Naám men coá ñònh trong gel alginate Naám men töï do Propanol 14,1 12,4 Iso-butanol 9,9 10,6 Amyl alcohol 48,4 60,3 Iso-amyl alcohol 31,8 1,9 Ester: Caùc hôïp chaát ester taïo höông chính trong bia goàm coù: ethyl acetate (höông traùi caây), isoamyl acetate (höông chuoái), ethyl caproate vaø ethylcaprilate (höông taùo), 2-phenylethyl acetate (höông maät ong). Tuy nhieân caùc ester treân chæ coù taùc duïng taïo höông cho bia ôû noàng ñoä thaáp, chuùng gaây muøi khoù chòu khi noàng ñoä quaù cao (Meilgaard, 1975 vaø Peddie, 1990). Caùc ester chuû yeáu ñöôïc teá baøo naám men sinh toång hôïp trong pha logarite (60%) vaø moät phaàn ôû pha oån ñònh (40%). Masschelein vaø coäng söï (1985) cho raèng khaû naêng sinh toång hôïp caùc ester cuûa naám men coá ñònh cao hôn naám men töï do (Baûng 2.5). Taùc giaû cho raèng, haøm löôïng O2 hoøa tan coù trong dòch nha coù aûnh höôûng quyeát ñònh ñeán khaû naêng sinh toång hôïp caáu töû höông cuûa naám men vì O2 aûnh höôûng lôùn ñeán khaû naêng sinh tröôûng cuûa teá baøo cuõng nhö khaû naêng sinh toång hôïp caùc acid beùo, qua ñoù aûnh höôûng ñeán khaû naêng sinh toång hôïp caùc ester cuûa caùc acid beùo. Maët khaùc, khaû naêng toång hôïp ester cuûa naám men coá ñònh coøn phuï thuoäc vaøo nhieàu yeáu toá nhö chuûng naám men söû duïng, maät ñoä gioáng caáy, toác ñoä sinh tröôûng rieâng, nhieät ñoä, aùp suaát, nguoàn nitô vaø nguoàn carbon (Hammond, 1993) vaø Calderbank vaø Hammond, 1994). Baûng 2. 5: Löôïng ethyl acetate vaø iso-amyl acetate trong bia non leân men baèng naám men coá ñònh trong gel alginate vaø naám men töï do. Ester (mg/L) Naám men coá ñònh trong gel alginate Naám men töï do Ethyl acetate 18,8 15,2 Iso-amyl acetate 1,25 0,85 Diacetyl: Vicinal diketones (VDK) laø saûn phaåm phuï cuûa chu trình Iso–leucine, leucine, valine. Trong bia, hai hôïp chaát quan troïng nhaát cuûa VDK laø diacetyl (2,3-butanedione) vaø 2,3-pentanedione (hình 2.9) [78]. Wainwright (1973) cho raèng diacetyl laø saûn phaåm phuï cuûa quaù trình phaân huûy isoleucine, leucine, valine. Sau ñoù, teá baøo phaân huyû chuùng thaønh acetoin vaø cuoái cuøng thaønh 2,3-butanediol [77]. Diacetyl khoâng aûnh höôûng tích cöïc ñeán höông vò cuûa bia. Do ñoù haøm löôïng diacetyl trong saûn phaåm bia phaûi thaáp. Diacetyl ñöôïc hình thaønh trong suoát quaù trình leân men chính vaø phaàn lôùn bò phaân huyû trong quaù trình leân men phuï (Kurger, 1998; Van den berg vaø coäng söï, 1983)ï. Maët khaùc, theo Jones vaø Pierce (1964) caùc yeáu toá kích thích quaù trình sinh tröôûng cuûa naám men cuõng nhö söï coù maët cuûa caùc acid amin laøm taêng löôïng diacetyl. Willaert vaø Nedovic (2006) cho raèng teá baøo naám men coá ñònh coù khaû naêng toång hôïp diacetyl cao hôn caùc teá baøo töï do. Hoï ñaõ tieán haønh thí nghieäm vôùi caùc chaát mang khaùc nhau (baûng 2.6). Caùc taùc giaû cho raèng haøm löôïng enzyme acetohydroxy acid synthetase trong teá baøo coá ñònh cao hôn trong teá baøo töï do [78]. Hình 2. 8: Con ñöôøng hình thaønh vaø phaân huyû diacetyl [78]. Baûng 2. 6: Haøm löôïng diacetyl trong bia non cuûa naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel Ca – alginate [78]. Naám men coá ñònh Naám men töï do Diacetyl (mg/L) 0,7 0,4 2.3. ÖÙNG DUÏNG NAÁM MEN COÁ ÑÒNH TRONG LEÂN MEN BIA NOÀNG ÑOÄ CAO: 2.3.1. Khaùi nieäm leân men bia noàng ñoä cao: Leân men bia noàng ñoä cao laø quaù trình leân men dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ cao hôn thoâng thöôøng (trung bình khoaûng 16 – 18oP), sau ñoù saûn phaåm taïo thaønh (coù ñoä coàn cao) seõ ñöôïc pha loaõng ñeå taïo ra bia thaønh phaåm coù ñoä coàn nhö bia ñöôïc leân men töø dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ thoâng thöôøng (10 – 12oP). 2.3.2. Quy trình coâng ngheä saûn xuaát bia söû duïng phöông phaùp leân men bia noàng ñoä cao: Sô ñoà quy trình coâng ngheä: (Hình 2.9) Hình 2. 9: Sô ñoà quy trình saûn xuaát bia öùng duïng kó thuaät leân men bia noàng ñoä cao[1, 4]. Thuyeát minh quy trình: Nhìn chung quy trình coâng ngheä saûn xuaát bia baèng phöông phaùp leân men bia noàng ñoä cao cuõng töông töï nhö quy trình saûn xuaát bia truyeàn thoáng. Tuy nhieân, coù moät soá ñieåm khaùc bieät sau: Dòch nha ban ñaàu coù noàng ñoä chaát khoâ cao hôn so vôùi dòch nha söû duïng trong phöông phaùp leân men truyeàn thoáng. Dòch nha thu ñöôïc töø quaù trình naáu dòch nha thöôøng coù haøm löôïng chaát khoâ khoaûng 10-12OP. Ñeå thu ñöôïc dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ cao, ta coù moät soá giaûi phaùp nhö: giaûm löôïng nöôùc söû duïng trong quaù trình naáu dòch nha (nöôùc phoái troän nguyeân lieäu, nöôùc röûa baõ malt…), boå sung theâm ñöôøng glucose, maltose hay saccharose vaø trong dòch nha tröôùc khi leân men hay coâ ñaëc dòch nha tröôùc khi leân men. Tuy nhieân, ñoái vôùi phöông phaùp giaûm löôïng nöôùc ñeå naáu dòch nha, chuùng ta chæ coù theå thu ñöôïc dòch nha vôùi noàng ñoä chaát khoâ khoaûng 16-18OBal. Khi giaûm löôïng nöôùc söû duïng trong quaù trình naáu, hieäu suaát trích ly caùc chaát coù trong haït malt vaøo trong nöôùc cuõng giaûm. Do ñoù khi caàn dòch nha coù haøm löôïng chaát khoâ cao, caùc nhaø saûn xuaát thöôøng boå sung ñöôøng hay coâ ñaëc dòch nha ban ñaàu. Sau quaù trình leân men phuï, ta seõ thu ñöôïc dòch leân men coù haøm löôïng coàn vaø caùc thaønh phaàn khaùc cao hôn bia thaønh phaåm ñöôïc saûn xuaát theo phöông phaùp leân men truyeàn thoáng. Vì vaäy, ta caàn pha loaõng dòch leân men vôùi nöôùc roài baõo hoaø CO2 ñeå thu ñöôïc saûn phaåm bia coù noàng ñoä coàn vaø caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát khaùc vôùi noàng ñoä thích hôïp. Tieâu chuaån nöôùc duøng ñeå pha loaõng laø: Trong suoát, khoâng maøu, khoâng muøi, khoâng chöùa taïp chaát vaø caùc vi sinh vaät. Nöôùc phaûi loaïi ñöôïc khoâng khí, oxi hoaø tan toái ña laø 0,05 ppm. Maët khaùc, nöôùc phaûi coù caùc thaønh phaàn khoaùng vaø pH thích hôïp ñeå khoâng aûnh höôûng ñeán ñoä beàn keo cuûa bia sau khi pha loaõng [15]. 2.3.3. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình leân men bia noàng ñoä cao söû duïng naám men coá ñònh trong gel alginate: 2.3.3.1. Chuûng naám men söû duïng: Ñeå thu ñöôïc loaïi bia thaønh phaåm coù chaát löôïng toát, yeáu toá then choát ñaàu tieân laø chuûng naám men söû duïng. Vieäc löïa choïn moät chuûng naám men phuø hôïp cho ñieàu kieän saûn xuaát cuï theå laø tieàn ñeà cho söï thaønh coâng trong coâng ngheä saûn xuaát bia. Ñaëc ñieåm cuûa leân men bia noàng ñoä cao laø coù aùp suaát thaåm thaáu cuûa dòch nha ban ñaàu cao vaø haøm löôïng ethanol cao trong dòch leân men laøm aûnh höôûng ñeán khaû naêng trao ñoåi chaát cuûa naám men. Maët khaùc, haøm löôïng cô chaát trong dòch leân men cuûa leân men bia noàng ñoä cao lôùn hôn so vôùi leân men truyeàn thoáng, do ñoù chuûng naám men söû duïng phaûi coù hoaït löïc toát ñeå traùnh vieäc keùo daøi thôøi gian leân men vaø löôïng cô chaát soùt quaù lôùn trong bia non. Chính vì vaäy, yeâu caàu khi löïa choïn naám men söû duïng trong leân men bia noàng ñoä cao phaûi chòu ñöôïc aùp suaát thaåm thaáu vaø haøm löôïng ethanol cao, coù hoaït löïc leân men toát. 2.3.4.2. Maät ñoä teá baøo naám men gieo caáy Beân caïnh vieäc löïa choïn chuûng naám men thích hôïp, maät ñoä gioáng caáy cuõng laø yeáu toá quan troïng aûnh höôûng ñeán chaát löôïng cuûa saûn phaåm bia. Maät ñoä gioáng caáy ban ñaàu aûnh höôûng ñeán thôøi gian vaø hieäu suaát leân men. Maët khaùc, maät ñoä gioáng caáy coøn aûnh höôûng ñeán thaønh phaàn vaø tæ leä caùc saûn phaåm cuûa quaù trình leân men. Ñeán nay, chöa coù moät coâng trình nghieân cöùu naøo ñöôïc coâng boá veà maät ñoä gioáng caáy naám men coá ñònh trong leân men bia noàng ñoä cao. Chính vì vaäy, vieäc xaùc ñònh maät ñoä gioáng caáy naám men coá ñònh phuø hôïp ñeå toái öu hoùa quy trình leân men bia noàng ñoä cao söû duïng naám men coá ñònh ñaõ trôû thaønh moät vaán ñeà caáp thieát. Ñoái vôùi naám men töï do, khi taêng maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 107 – 108 teá baøo/ml thì maät ñoä teá baøo trong 1ml dòch leân men khi keát thuùc quaù trình leân men chính khoâng coù söï khaùc bieät (Huseyin vaø coäng söï, 2007), Maët khaùc, khi taêng maät ñoä gioáng caáy thì toác ñoä leân men taêng, haøm löôïng cô chaát soùt giaûm (Youssef vaø coäng söï, 1989). Beân caïnh ñoù, khi taêng maät ñoä gioáng caáy thì haøm löôïng caùc saûn phaåm phuï cuûa quaù trình leân men cuõng giaûm (Huseyin vaø coäng söï, 2007). Khi taêng maät ñoä gioáng caáy töø 10 – 20.106 teá baøo/ml dòch nha thì haøm löôïng diacetyl giaûm töø 0,45 mg/l xuoáng coøn 0,32 mg/l, caùc saûn phaåm phuï khaùc nhö aldehyde, ester cuõng giaûm (Kurger, 1998 vaø Van Den Berg vaø coäng söï, 1983). 2.3.3.3. Noàng ñoä dòch nha: Naám men coá ñònh chòu aùp suaát thaåm thaáu toát hôn naám men töï do. Khaû naêng soáng soùt vaø hoaït tính cuûa naám men S.cerevisiae trong gel Ca-alginate khaù oån ñònh vaø chæ giaûm khoaûng 20% sau khi leân men hôn 1,5 thaùng (Melzoch vaø coäng söï, 1994). Pratt vaø coäng söï (2000) cho raèng khi taêng aùp suaát thaåm thaáu thì hoaït tính cuûa teá baøo vaø ñoä leân men ñeàu giaûm. Söï thay ñoåi hình thaùi cuûa naám men töï do khi chòu taùc ñoäng cuûa aùp suaát thaåm thaáu trong dung dòch ñöôøng sorbitol 20%w/v ñöôïc trinh baøy treân hình 2.11. Khi khaûo saùt quaù trình leân men dòch nha coù noàng ñoä thay ñoåi töø 12 – 30% (w/v) söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate thì naám men coá ñònh ruùt ngaén thôøi gian leân men chính 50% so vôùi naám men töï do (baûng 2.8).Maët khaùc, toác ñoä sinh ethanol ñaït cöïc ñaïi ôû noàng ñoä dòch nha 24% (w/v) (baûng 2.9). Nguyeân nhaân do caáu truùc maïng gel ñaõ giaûm bôùt moät phaàn aùp suaát thaåm thaáu taùc ñoäng leân teá baøo coá ñònh. Chính vì vaäy, hoaït tính cuûa naám men coá ñònh trong gel alginate vaãn khoâng bò aûnh höôûng khi leân men dòch nha coù noàng ñoä ñeán 24% (Patkova vaø coäng söï 2000). Nhìn chung, naám men coá ñònh chòu ñöïng aùp suaát thaåm thaáu toát hôn so vôùi naám men töï do. Tuy nhieân, haït gel cuõng chæ coù khaû naêng baûo veä teá baøo khoûi aùp suaát thaåm thaáu ôû moät möùc ñoä nhaát ñònh. Theo Patkova vaø coäng söï (2000), khi noàng ñoä dòch nha 28% vaø 30% thì thôøi gian leân men vaø toác ñoä sinh ethanol ñeàu giaûm so vôùi khi leân men dòch nha coù noàng ñoä 24% (baûng 2.8, 2.9) [55, 56]. Baûng 2. 7: Thôøi gian leân men caùc dòch nha noàng ñoä 12 – 30% (w/w) ôû 13oC, söû duïng S.cerevisiae coá ñònh trong gel alginate so vôùi naám men töï do [55]. Naám men coá ñònh Naám men töï do Dòch nha (% w/w) 12 20 22 24 28 30 20* 24* Thôøi gian leân men (giôø) 115 159 187 187 234 234 336 336 Baûng 2. 8: Toác ñoä toång hôïp ethanol cuûa S.cerevisiae coá ñònh trong gel alginate trong quaù trình leân men caùc dòch nha noàng ñoä 12 – 30% (w/v) ôû 13oC [55]. Noàng ñoä dòch nha (%) 12 20 22 24 28 30 Noàng ñoä ethanol cuoái cuøng (% v/v) 6,0 7,4 8,1 9,5 10,5 10,0 Toác ñoä toång hôïp ethanol (g/l.h) 0,58 0,61 0,64 0,68 0,61 0,61 A B Hình 2. 10: Söï thay ñoåi hình thaùi cuûa caùc teá baøo naám men S.cerevisiae (naám men chìm). A: tröôùc khi chòu taùc ñoäng cuûa aùp löïc thaåm thaáu, B: sau 15 phuùt tieáp xuùc vôùi dung dòch sorbitol 20% [55]. 2.3.4.4. Nhieät ñoä vaø pH leân men: Nhieät ñoä laø moät yeáu toá raát quan troïng trong quaù trình leân men vì nhieät ñoä aûnh höôûng raát maïnh meõ ñeán söï sinh tröôûng vaø hoaït ñoäng trao ñoåi chaát cuûa naám men. Beân caïnh ñoù, nhieät ñoä coøn aûnh höôûng raát lôùn ñeán söï hình thaønh vaø tæ leä caùc saûn phaåm phuï cuûa quaù trình leân men. Trong leân men bia noàng ñoä cao, nhieät ñoä thaáp (khi söû duïng naám men chìm) keát hôïp vôùi aùp suaát thaåm thaáu cao cuûa dòch nha cuõng goùp phaàn öùc cheá söï phaùt trieån cuûa caùc vi sinh vaät coù haïi trong canh tröôøng leân men. Dragon vaø coäng söï (2004) cho raèng so vôùi noàng ñoä ban ñaàu cuûa dòch nha vaø tæ leä söû duïng theá lieäu thì nhieät ñoä coù aûnh höôûng nhieàu hôn ñeán khaû naêng sinh toång hôïp ethanol trong leân men bia noàng ñoä cao [27]. Willaert vaø Nedovic (2006) toång hôïp caùc nghieân cöùu khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä (5 – 20oC) leân quaù trình toång hôïp caùc hôïp chaát höông trong quaù trình leân men bia söû duïng naám men coá ñònh trong gel Ca-alginate vaø moät soá chaát mang khaùc. Caùc taùc giaû cho raèng caùc teá baøo coá ñònh trong gel sinh toång hôïp haøm löôïng caùc röôïu baäc cao vaø diacetyl ñeàu thaáp hôn so vôùi naám men töï do ôû taát caû caùc giaù trò nhieät ñoä khaûo saùt. Beân caïnh ñoù, ôû nhieät ñoä 5-15OC, haøm löôïng ester vaø acetaldehyde taïo thaønh cuûa naám men coá ñònh cuõng thaáp hôn so vôùi naám men töï do [78]. 2.3.4.5. Haøm löôïng oxygen hoaø tan: Quaù trình leân men bia ñöôïc thöïc hieän trong ñieàu kieän yeám khí. Tuy nhieân, khi baét ñaàu quaù trình leân men, moâi tröôøng caàn coù moät löôïng oxygen ñeå naám men sinh tröôûng vaø phaùt trieån. Neáu cung caáp löôïng oxygen khoâng ñuû seõ laøm giaûm khaû naêng soáng soùt cuûa naám men, laøm chaäm toác ñoä söû duïng acid amin do söï sinh tröôûng cuûa teá baøo bò kìm haõm. Ñieàu naøy laøm giaûm khaû naêng trao ñoåi chaát cuûa teá baøo. Maët khaùc, oxygen raát caàn thieát cho söï sinh toång hôïp caùc acid beùo, caùc sterol laø nhöõng chaát raát caàn thieát cho maøng teá baøo. Caùc acid beùo cuõng laø chaát giuùp teá baøo choáng chòu aùp suaát thaåm thaáu cao, noàng ñoä ethanol cao trong dòch leân men vaø chuùng laø tieàn chaát cuûa quaù trình toång hôïp caùc ester taïo höông. Tuy nhieân neáu löôïng oxygen dö thöøa thì caùc teá baøo seõ sinh naêng löôïng baèng con ñöôøng hoâ haáp hieáu khí, taêng sinh khoái maø khoâng leân men sinh toång hôïp ethanol. Vì vaäy, trong coâng ngheä saûn xuaát bia, thoâng thöôøng dòch nha ñöôïc suïc khí ñaït ñöôïc haøm löôïng oxi hoaø tan khoaûng 6 – 8 ppm tröôùc khi thöïc hieän quaù trình leân men ñeå ñaûm baûo cho söï phaùt trieån cuûa naám men. Theo O’Connor-Cox vaø Ingledew (1990) thì toác ñoä sinh ethanol cuûa naám men töï do trong tröôøng hôïp leân men bia coù suïc khí taêng 20% so vôùi khoâng suïc khí. Vieäc suïc khí sau khi caáy gioáng laøm taêng löôïng acid beùo tích luyõ trong teá baøo so vôùi vieäc chæ suïc khí tröôùc khi caáy gioáng. Caùc taùc giaû ñaõ cho raèng teá baøo naám men töï do taêng cöôøng söû duïng FAN khoâng phaûi ñeå taêng tröôûng sinh khoái maø chuû yeáu ñöôïc söû duïng ñeå sinh toång hôïp caùc röôïu baäc cao. Vieäc suïc oxy trong giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình leân men coù theå thay theá ñöôïc giaûi phaùp boå sung lipid, chaát chieát naám men vaøo dòch nha leân men bia noàng ñoä cao [35, 52, 53]. 2.3.4.6. Noàng ñoä cuûa saûn phaåm leân men: Saûn phaåm chính cuûa quaù trình leân men laø ethanol vaø khí cacbonic. Khi noàng ñoä cuûa ethanol trong moâi tröôøng leân men tích tuï ñeán moät giaù trò nhaát ñònh thì caùc teá baøo naám men baét ñaàu bò öùc cheá. Ñoái vôùi naám men töï do, khi noàng ñoä coàn döôùi 2% thì caùc hoaït ñoäng cuûa naám men vaãn xaûy ra bình thöôøng; nhöng khi vöôït quaù 2% thì khaû naêng naûy choài cuûa naám men baét ñaàu giaûm. Khi noàng ñoä ethanol taêng leân ñeán 5% thì khaû naêng naûy choài cuûa naám men chaám döùt nhöng quaù trình leân men vaãn tieáp dieãn. Patkova vaø coäng söï (2000) ñaõ nghieân cöùu khaû naêng soáng soùt cuûa naám men coá ñònh trong gel Ca-alginate döôùi taùc ñoäng cuûa caùc noàng ñoä ethanol taïo thaønh khaùc nhau khi leân men dòch nha 12 – 30%. Keát quaû cho thaáy raèng khaû naêng soáng soùt cuûa naám men coá ñònh trong suoát quaù trình leân men dòch nha noàng ñoä 12 – 24% khoâng thaáp hôn 95% khi noàng ñoä ethanol trong bia non treân 10%(v/v). Hoï cho raèng haït gel ñaõ coù taùc duïng baûo veä teá baøo [55]. Baûng 2. 9: Khaû naêng soáng soùt cuûa naám men chìm S.cerevisiae coá ñònh trong gel alginate trong quaù trình leân men caùc dòch nha noàng ñoä 12 – 30% (w/w) ôû 13oC [55]. Naám men töï do Naám men coá ñònh Noàng ñoä dòch nha (%) 12 24 12 20 22 24 28 30 Noàng ñoä ethanol cuoái cuøng(%v/v) 5,3 6,2 6,0 7,4 8,1 9,5 10,5 10,0 Khaû naêng soáng soùt cuûa teá baøo(%) 74 69 96 95 94 95 86 84 B A Hình 2. 11: Söï thay ñoåi hình thaùi cuûa caùc teá baøo naám men chìm. (A): tröôùc khi chòu taùc ñoäng cuûa ethanol, (B): sau 15 phuùt tieáp xuùc vôùi dung dòch ethanol 10% (v/v)[55] CHÖÔNG 3: NGUYEÂN LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 3.1. Nguyeân lieäu: 3.1.1. Nguyeân lieäu saûn xuaát dòch nha: Malt: loaïi malt vaøng duøng cho saûn xuaát bia coù xuaát xöù töø Australia do Coâng ty Ñöôøng Malt (Vieät Nam) cung caáp. Ñoä aåm cuûa malt 4,47%. Ñoä trích ly 79,2% Nöôùc: söû duïng nguoàn nöôùc thuûy cuïc taïi thaønh phoá Hoà Chí Minh. Hoa Houblon: coù xuaát xöù töø Australia do coâng ty Taân Vieät UÙc (Vieät Nam) cung caáp. Haøm löôïng α-acid ñaéng laø 8,24%. 3.1.2. Naám men: Söû duïng naám men Saccharomyces cerevisiae do Coâng ty TNHH Foster Tieàn Giang cung caáp. 3.1.3. Chaát mang coá ñònh teá baøo: Chaát mang coá ñònh naám men söû duïng trong baøi nghieân cöùu naøy laø sodium alginate. Cheá phaåm naøy ñöôïc chieát xuaát töø rong mô (Sargassum meclurei) do Vieän Coâng ngheä Sinh hoïc tröôøng Ñaïi hoïc Thuyû saûn Nha Trang cung caáp. Moät soá chæ tieâu hoaù lyù cuûa cheá phaåm: Ñoä aåm: 20,4%. Ñoä nhôùt (dung dòch sodium aginate 2% ôû 25OC): 436cP. Tæ leä M/G cuûa cheá phaåm 1,2 [6,7]. 3.2. Phöông phaùp nghieân cöùu: 3.2.1. Muïc ñích vaø noäi dung nghieân cöùu: 3.2.1.1. Muïc ñích: Khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa hai yeáu toá coâng ngheä laø maät ñoä gioáng caáy vaø haøm löôïng oxi hoaø tan coù trong dòch nha ban ñaàu ñeán ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men chính, söû duïng kó thuaät leân men bia noàng ñoä cao vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 3.2.1.2. Noäi dung nghieân cöùu: NOÄI DUNG NGHIEÂN CÖÙU Aûnh höôûng cuûa maät ñoä gioáng caáy ñeán ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men. Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng oxi hoaø tan coù trong dòch nha ñeán ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men. Nghieân cöùu ñoäng hoïc cuûa quaù trình sinh tröôûng cuûa naám men. Nghieân cöùu söï söû duïng cô chaát trong quaù trình leân men Nghieân cöùu söï hình thaønh saûn phaåm trong quaù trình leân men Khaûo saùt söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo naám men coá ñònh trong dòch leân men. Khaûo saùt haøm söï thay ñoåi haøm löôïng ñöôøng khöû trong quaù trình leân men. Khaûo saùt söï thay ñoåi löôïng Nito amin töï do trong quaù trình leân men. Khaûo saùt söï hình thaønh ethanol trong quaù trình leân men Khaûo saùt haøm löôïng caùc saûn phaåm phuï hình thaønh sau quaù trình leân men chính Hình 3. 1: Sô ñoà nghieân cöùu Thí nghieäm 1: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa maät ñoä gioáng caáy ñeán ñoäng hoïc quaù trình leân men. Ñieàu kieän thí nghieäm: Maät ñoä gioáng caáy ñöôïc thay ñoåi laàn löôït laø 10, 20, 30 vaø 40x106 teá baøo/ml dòch nha. Ñoä leân men khi keát thuùc quaù trình leân men chính khoaûng 75%. Khaûo saùt: Ñoäng hoïc quaù trình sinh tröôûng cuûa naám men: khaûo saùt söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo naám men coá ñònh trong dòch leân men. Ñoäng hoïc cuûa quaù trình söû duïng cô chaát trong quaù trình leân men: söï thay ñoåi haøm löôïng chaát khoâ, haøm löôïng ñöôøng khöû vaø haøm löôïng nitô amin töï do. Ñoäng hoïc cuûa quaù trình hình thaønh saûn phaåm trong quaù trình leân men: söï hình thaønh ethanol, söï thay ñoåi pH dòch leân men. Sau quaù trình leân men chính, xaùc ñònh haøm löôïng caùc saûn phaåm phuï (röôïu baäc cao, ester, aldehyde vaø diacetyl) hình thaønh. Thí nghieäm 2: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa haøm löôïng oxi hoaø tan coù trong dòch nha ban ñaàu ñeán ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men. Ñieàu kieän thí nghieäm: Maät ñoä naám men treân 1ml dòch nha ñöôïc choïn töø thí nghieäm treân laø 10x106 teá baøo/ml dòch nha. Dòch nha ñöôïc baõo hoaø oxi tröôùc khi tieán haønh leân men. Haøm löôïng oxi baõo hoaø trong dòch nha khoaûng 7,5 mg/L. Sau khi tieán haønh caáy gioáng, thôøi gian suïc khí ñöôïc thay ñoåi laàn löôït laø 0, 4, 8, 12, 16, 20h (söû duïng khoâng khí voâ truøng ñeå naïp vaøo bình leân men p = 1atm, t = 17OC). Ñoä leân men khi keát thuùc quaù trình leân men chính khoaûng 75%. Khaûo saùt: Ñoäng hoïc quaù trình sinh tröôûng cuûa naám men: khaûo saùt söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo naám men coá ñònh trong dòch leân men. Ñoäng hoïc cuûa quaù trình söû duïng cô chaát trong quaù trình leân men: söï thay ñoåi haøm löôïng chaát khoâ, haøm löôïng ñöôøng khöû vaø haøm löôïng nitô amin töï do. Ñoäng hoïc cuûa quaù trình hình thaønh saûn phaåm trong quaù trình leân men: söï hình thaønh ethanol, söï thay ñoåi pH dòch leân men. Sau quaù trình leân men chính, xaùc ñònh haøm löôïng caùc saûn phaåm phuï (röôïu baäc cao, ester, aldehyde vaø diacetyl) hình thaønh. 3.2.2. Quy trình coâng ngheä saûn xuaát bia trong nghieân cöùu: 3.2.2.1. Quy trình saûn xuaát bia non: (hình 3.2) Sinh khoái naám men coá ñònh Naáu dòch nha Leân men chính Malt ñaïi maïch Nghieàn Loïïc baõ Ñun soâi vôùi hoa houblon Loïc baõ houblon Nöôùc Hieäu chænh noàng ñoä chaát khoâ Chænh pH Tieät truøng Bia non Houblon Naám men Nhaân gioáng Coá ñònh naám men Baõ malt Baõ hoa Hình 3. 2: Sô ñoà quy trình saûn xuaát bia non trong nghieân cöùu. 3.2.2.2. Giaûi thích quy trình: Naáu dòch nha: Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi söû duïng 100% malt ñaïi maïch ñeå naáu dòch nha vì dòch nha naáu töø 100% malt laø moâi tröôøng cung caáp ñaày ñuû caùc thaønh phaàn dinh döôõng caàn thieát cho naám men. Trong khuoân khoå luaän vaên naøy, chuùng toâi khoâng khaûo saùt vaán ñeà söû duïng theá lieäu ñeå laøm giaûm giaù thaønh saûn phaåm. Khi naáu dòch nha chuùng toâi söû duïng phöông phaùp ñun soâi moät laàn. Tæ leä giöõa malt vaø nöôùc laø 1:4 (w/v) [1, 4]. Quy trình naáu dòch nha ñöôïc bieåu dieãn qua hình 3.3. Dòch nha sau khi naáu ñöôïc loïc baõ baèng vaûi loïc. Hình 3. 3: Giaûn ñoà naáu dòch nha [1, 4]. Dòch nha thu ñöôïc thöôøng coù noàng ñoä chaát khoâ khoaûng 16 – 18OBx. Houblon hoaù [1,4]: Söû duïng houblon daïng hoa vieân vôùi tæ leä 1,1 g hoa/L dòch nha (töông ñöông 0,1 mg α-acid/lít dich nha). Sau khi houblon hoaù, dòch nha ñöôïc loïc baõ houblon baèng vaûi loïc. Baûng 3. 1: Khoái löôïng nguyeân lieäu söû duïng cho moät meû naáu dòch nha trong nghieân cöùu. Nguyeân lieäu Löôïng söû duïng cho moät meû naáu Malt 0,8 kg Nöôùc 3,2 L Houblon vieân 1,1 g/L dòch nha sau loïc Hieäu chænh noàng ñoä chaát khoâ: Sau khi naáu löôïng dòch nha ñuû cho quaù trình leân men, chuùng toâi tieán haønh hoøa troän ñoàng nhaát caùc meû naáu, ño noàng ñoä chaát khoâ vaø tieán haønh coâ ñaëc chaân khoâng (nhieät ñoä coâ ñaëc laø 65OC) ñeå thu ñöôïc dòch nha coù noàng ñoä khoaûng 24OBx. Sau khi coâ ñaëc, dòch nha ñöôïc hoaø troän 1 laàn nöõa ñeå ñoàng nhaát caùc meû coâ ñaëc, chænh noàng ñoä chaát khoâ 24OBx, chænh pH ñeå chuaån bò cho quaù trình leân men. Chuùng toâi choïn giaûi phaùp coâ ñaëc chaân khoâng ñeå taêng noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu cho dòch nha nhaèm ñaûm baûo vaán ñeà dinh döôõng cho naám men trong quaù trình leân men noàng ñoä cao. Neáu söû duïng phöông phaùp coâ ñaëc ôû aùp suaát thöôøng thì nhieät ñoä cao trong quaù trình coâ ñaëc coù theå laøm giaûm haøm löôïng caùc chaát dinh döôõng coù trong dòch nha (phaûn öùng Maillard). Maët khaùc, khi boå sung syrup ñöôøng nhaèm laøm taêng noàng ñoä chaát khoâ cuûa dòch nha coù theå gaây maát caân baèng thaønh phaàn dinh döôõng cuûa dòch nha noàng ñoä cao. Chænh pH: Dòch nha sau khi houblon hoaù coù pH trong khoaûng 5,58 – 5,6, duøng acid lactic 10% ñeå chænh pH dòch nha veà 5,4. Tieät truøng: Dòch nha tröôùc khi tieán haønh leân men ñöôïc tieät truøng ôû 121OC thôøi gian 20 phuùt. Nhaân gioáng naám men: Naám men ñöôïc giöõ gioáng treân moâi tröôøng thaïch nghieâng (malt-algar) ôû nhieät ñoä 5OC, sau ñoù ñöôïc nhaân gioáng treân moâi tröôøng dòch nha. Naám men ñöôïc nhaân gioáng thaønh hai caáp: Caáp 1: moâi tröôøng nhaân gioáng 8OBx coù theå tích 15ml, thôøi gian nhaân gioáng laø 24h. Caáp 2: moâi tröôøng nhaân gioáng 8OBx coù theå tích 150ml, thôøi gian nhaân gioáng laø 24h. Nhieät ñoä nhaân gioáng laø nhieät ñoä phoøng (28-30OC). Sau khi nhaân gioáng caáp hai, ñeám soá teá baøo naám men sinh tröôûng trong dòch nha ñeå chuaån bò cho vieäc coá ñònh teá baøo. Coá ñònh teá baøo naám men: Quy trình coá ñònh: (hình 3.4) Haït naám men coá ñònh Nöôùc voâ khuaån Ngaâm haït Dòch nhaân gioáng Ly taâm taùch phaàn loûng Pha huyeàn phuø Alginate Hoøa tan Hoøa troän Haáp tieät truøng Taïo haït Röûa haït Nöôùc voâ khuaån CaCl2 Nöôùc Hình 3. 4: Quy trình coá ñònh naám men trong gel Ca-alginate [38]. Giaûi thích quy trình coá ñònh: Chuaån bò chaát mang: Hoøa tan sodium alginate daïng boät vaøo nöôùc caát ñeå taïo dung dòch coù noàng ñoä 5% (w/v). Gia nhieät ñeå sodium alginate tan hoaøn toaøn, tieät truøng dung dòch ôû nhieät ñoä 121OC, thôøi gian 20 phuùt roài laøm nguoäi veà nhieät ñoä phoøng. Chuaån bò dung dòch CaCl2: CaCl2 daïng boät ñöôïc pha vôùi nöôùc caát taïo thaønh dung dòch coù noàng ñoä 3% (w/v). Tieät truøng dung dòch ôû nhieät ñoä 121OC thôøi gian 20 phuùt. Sau ñoù laøm laïnh dung dòch veà nhieät ñoä 5OC. Pha huyeàn phuø naám men: Hoøa troän sinh khoái naám men thu ñöôïc sau khi ly taâm vôùi nöôùc voâ khuaån ñeå taïo dung dòch huyeàn phuø naám men coù maät ñoä teá baøo 100x106 teá baøo/ml. Taïo haït gel: Hoaø troän dòch huyeàn phuø naám men vôùi dung dòch sodium alginate ñaõ chuaån bò theo tæ leä 1:1 (v/v). Trong quaù trình hoaø troän traùnh taïo boït khí trong hoãn hôïp naám men – alginate. Duøng bôm nhu ñoäng nhoû töø töø hoãn hôïp naám men – alginate vaøo dung dòch CaCl2 3% (w/v) ñeå taïo caùc haït gel coù ñöôøng kính khoaûng 2 – 3,5 mm. Ngaâm haït gel vöøa taïo thaønh trong dung dòch CaCl2 3% (w/v) trong 4h ôû nhieät ñoä 5OC ñeå laøm taêng ñoä chaéc cuûa haït gel. Sau quaù trình ngaâm, chaét boû dung dòch CaCl2, haït gel ñöôïc röûa laïi hai laàn baèng nöôùc voâ khuaån ôû nhieät ñoä 5OC roài tieán haønh leân men. Leân men chính: Ñieàu kieän leân men: Nhieät ñoä leân men 17OC (ñaây laø giaù trò nhieät ñoä leân men toái thích cuûa chuûng naám men söû duïng). Maät ñoä teá baøo trong 1ml gel laø 50.106 teá baøo/ml, noàng ñoä alginate trong gel laø 2,5% Quaù trình leân men ñöôïc thöïc hieän trong caùc tank leân men 4L vôùi theå tích dòch nha trong moãi bình laø 1,8L. Trong quaù trình leân men, maãu phaân tích ñöôïc laáy sau moãi 12h. Khi laáy maãu, moät löôïng haït gel chöùa naám men coá ñònh töông öùng phaàn theå tích loûng cuûa dòch leân men cuõng ñöôïc laáy ra khoûi bình leân men. Caùc chæ soá cuûa dòch nha caàn xaùc ñònh tröôùc khi leân men: Noàng ñoä chaát khoâ. Noàng ñoä ñöôøng khöû. Noàng ñoä nitô amin töï do (FAN). pH. Caùc chæ soá caàn xaùc ñònh ñeå khaûo saùt ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men: Maät ñoä teá baøo treân 1ml dòch leân men. Noàng ñoä chaát khoâ. pH. Noàng ñoä ñöôøng khöû. Noàng ñoä nitô amin töï do (FAN). Noàng ñoä ethanol. Noàng ñoä diacetyl. Noàng ñoä röôïu baäc cao, ester, aldehyde trong bia non. 3.2.3. Caùc phöông phaùp phaân tích: 3.2.3.1. Noàng ñoä chaát khoâ: Ño baèng khuùc xaï keá, ñôn vò ño laø ñoä Brix. 3.2.3.2. pH: Söû duïng maùy ño pH. 3.2.3.3. Xaùc ñònh maät ñoä teá baøo naám men coá ñònh trong 1ml dòch nha: Raõ haït baèng dung dòch EDTA 5%, pha loaõng maãu ñeán noàng ñoä caàn thieát roài ñeám treân buoàng ñeám Thoma. 3.2.3.4. Noàng ñoä ñöôøng khöû: Nguyeân taéc: COONa NO2 NO2 NO2 NH2 + Phöông phaùp naøy döïa treân phaûn öùng taïo maøu giöõa ñöôøng khöû vôùi vôùi thuoác thöû 3,5 – dinitrosalicylic acid (thuoác thöû DNS). DNS coù maøu vaøng trong dung dòch kieàm seõ bò khöû thaønh acid 3–amino-5-nitrosalicylic coù maøu ñoû cam. Cöôøng ñoä maøu cuûa hoãn hôïp phaûn öùng tæ leä thuaän vôùi noàng ñoä ñöôøng khöû trong moät phaïm vi nhaát ñònh vaø ñöôïc ño baèng maùy quang phoå so maøu. Döïa theo ñoà thò ñöôøng chuaån cuûa hoãn hôïp ñöôøng khöû maltose, glucose, fructose vôùi thuoác thöû DNS, ta seõ tính ñöôïc haøm löôïng ñöôøng khöû cuûa maãu nghieân cöùu. Hôïp chaát taïo thaønh coù ñoä haáp thu maïnh nhaát ôû böôùc soùng 540 nm. 3.2.3.4. Noàng ñoä nitô amin – AOAC 945.30 [8]: Nguyeân taéc: Cô cheá phaûn öùng: Ninhydrin khöû Ninhydrin +R CH COOH NH2 + NH3+CO2+RCHO Khi pH lôùn hôn 4, seõ xaûy ra phaûn öùng tieáp theo. Khi ñoù ninhydrin seõ khöû vaø NH3 seõ tieáp tuïc phaûn öùng vôùi ninhydron taïo ra moät phöùc coù maøu xanh tím. OH Phöùc Ruheman (xanhtím) +NH3+ +H2O Cöôøng ñoä maøu cuûa hoãn hôïp phaûn öùng, tæ leä thuaän vôùi noàng ñoä nitô amin trong moät phaïm vi nhaát ñònh vaø ñöôïc ño baèng maùy quang phoå so maøu. Döïa vaøo keát quaû phaân tích cuûa maãu glycine chuaån ñaõ bieát noàng ñoä, ta seõ tính ñöôïc haøm löôïng nitô amin coù trong maãu nghieân cöùu. Hôïp chaát taïo thaønh coù ñoä haáp thu maïnh nhaát ôû böôùc soùng 570 nm. 3.2.3.5. Noàng ñoä ethanol – AOAC 913.02 [8]: Nguyeân taéc : Chöng caát moät löôïng maãu dòch leân men roài xaùc ñònh tæ troïng cuûa dòch caát (d), tra baûng tæ troïng cuûa hoãn hôïp ethanol – nöôùc ñeå xaùc ñònh noàng ñoä ethanol coù trong dòch leân men. 3.2.3.6. Noàng ñoä diacetyl – EBC 9.24 [9]: Nguyeân taéc: Phöông phaùp naøy döïa treân phaûn öùng giöõa diacetyl vaø thuoác thöû ortho-phenylenediamine taïo daãn xuaát 2,3,6-trimethylquinoxaline. Ñoä haáp thu cuûa dung dòch phaûn öùng tæ leä thuaän vôùi noàng ñoä diacetyl trong moät phaïm vi nhaát ñònh. Döïa vaøo keát quaû phaân tích cuûa maãu diacetyl chuaån ñaõ bieát noàng ñoä vaø thuoác thöû, ta seõ tính ñöôïc haøm löôïng diacetyl coù trong maãu nghieân cöùu. Hôïp chaát taïo thaønh coù ñoä haáp thu maïnh nhaát ôû böôùc soùng 335nm. 3.2.3.7. Noàng ñoä röôïu baäc cao, ester, aldehyde – AOAC 968.09 [8]: Nguyeân taéc: Döïa vaøo söï khaéc bieät giöõa aùi löïc haáp phuï khaùc nhau giöõa caùc chaát vôùi nguyeân lieäu nhoài coät saéc kí, caùc chaát khaùc nhau thì coù thôøi gian löu trong coät saéc kí khaùc nhau. Coät saéc kí söû duïng trong nghieân cöùu laø DB624/75 Met. Ñöôøng kính trong coät laø 0,53 µm. 3.2.4. Moät soá coâng thöùc tính toaùn: 3.2.4.1. Toác ñoä söû duïng ñöôøng khöû: (giaù trò trung bình): Trong ñoù: : löôïng ñöôøng ñaõ ñöôïc naám men söû duïng trong quaù trình leân men (g/L) t: thôøi gian leân men (g/L). 3.2.4.3. Toác ñoä sinh toång hôïp ethanol (giaù trò trung bình): Trong ñoù: : soá gam ethanol ñöôïc taïo thaønh trong quaù trình leân men (g/L). t: thôøi gian leân men (h). 3.2.4.4. Ñoä leân men: Ñoä leân men laø tæ soá giöõa haøm löôïng ñöôøng khöû ñaõ ñöôïc naám men söû duïng so vôùi haøm löôïng ñöôïng khöû ban ñaàu. Trong ñoù: : löôïng ñöôøng ñaõ ñöôïc naám men söû duïng trong quaù trình leân men (g/L) S0: haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu trong dòch nha (g/L). 3.2.4. Phöông phaùp phaân tích thoáng keâ: Chuùng toâi thöïc hieän moãi thí nghieäm vôùi ba laàn laëp laïi vaø duøng pheùp phaân tích ANOVA ñeå xaùc ñònh xem giaù trò trung bình cuûa caùc maãu khaùc nhau coù nghóa hay khoâng vôùi möùc yù nghóa a = 5%. Chuùng toâi söû duïng phaàn meàm StatGraphic ñeå xöû lyù soá lieäu thöïc nghieäm. CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN 4.1. AÛnh höôûng cuûa maät ñoä gioáng caáy ñeán ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men chính: 4.1.1. Giôùi thieäu: Chuùng toâi khaûo saùt ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men tónh, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ 24OBx ñeå xaùc ñònh maät ñoä gioáng caáy thích hôïp trong leân men bia noàng ñoä cao. 4.1.2. Keát quaû vaø baøn luaän: 4.1.2.1. Sinh khoái: Baûng 4. 1: Söï bieán ñoåi maät ñoä naám men trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. Thôøi ñieåm laáy maãu (h) Maät ñoä gioáng caáy ( trieäu teá baøo/ml) 10 20 30 40 Maät ñoä teá baøo trong dòch leân men (trieäu teá baøo/ml) 0 10,0 20,0 30,0 40,0 12 22,5 48,3 93,3 142,8 24 36,8 80,0 116,3 180,6 36 40,7 89,2 141,7 208,3 48 58,7 124,4 194,3 60 55,6 113,9 72 61,4 114,7 84 53,6 96 56,4 108 52,9 120 56,3 132 59,4 144 60,7 Sinh khoái (trieäu teá baøo/ml) Thôøi gian (giôø) Hình 4. 1: Söï bieán ñoåi maät ñoä naám men trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. A B C D Hình 4. 2: Hình chuïp caáu truùc gel Ca-alginate tröôùc khi leân men baèng kính hieån vi ñieän töû queùt. A,B: beà maët vaø loõi haït gel ôû ñoä phoùng ñaïi 300 laàn. C,D: beà maët vaø loõi haït gel ôû ñoä phoùng ñaïi 1000 laàn. A B C D Hình 4. 3: Hình chuïp caáu truùc haït gel Ca-alginate sau quaù trình leân men baèng kính hieån vi ñieän töû queùt. A,B: beà maët vaø loõi haït gel ôû ñoä phoùng ñaïi 300 laàn. C,D: beà maët vaø loõi haït gel ôû ñoä phoùng ñaïi 500 laàn. Vieäc xaùc ñònh maät ñoä teá baøo trong dòch leân men nhaèm xaùc ñònh khaû naêng sinh tröôûng cuûa naám men. Töø hình 4.1, ta thaáy trong 12h leân men ñaàu tieân löôïng sinh khoái taêng nhanh do dòch nha coù oxygen vaø nhieàu chaát dinh döôõng. Sau ñoù, löôïng sinh khoái taêng chaäm daàn, toác ñoä sinh tröôûng cuûa naám men giaûm daàn. Khi maät ñoä gioáng caáy laø 10 trieäu vaø 2o trieäu teá baøo/ml, soá teá baøo ñaït giaù trò cöïu ñaïi laø 61,4 ôû giôø leân men thöù 72 vaø 124,7 trieäu teá baøo/ml ôû giôø leân men thöù 48. Sau ñoù maät ñoä teá baøo töông ñoái oån ñònh cho ñeán khi quaù trình leân men chính keát thuùc. Khi khaûo saùt quaù trình leân men bia noàng ñoä cao bôûi naám men töï do, Huseyin vaø coäng söï (2007) cuõng thaáy raèng naám men sinh tröôûng vaø taêng soá löôïng teá baøo trong giai ñoaïn leân men ñaàu tieân, sau ñoù maät ñoä teá baøo khaù oån ñònh trong giai ñoaïn leân men tieáp theo, tuy nhieân, trong giai ñoaïn cuoái cuûa quaù trình leân men chính, maät ñoä teá baøo naám men trong dòch nha giaûm nheï do quaù trình töï phaân teá baøo. Nhö vaäy, khi so saùnh keát quaû thöïc nghieäm cuûa chuùng toâi vaø cuûa Huseyin vaø coäng söï (2007), chuùng ta nhaän thaáy raèng sinh khoái naám men khoâng bò giaûm ñi trong giai ñoaïn cuoái cuûa quaù trình leân men chính. Chaát mang ñaõ baûo veä naám men tröôùc nhöõng yeáu toá baát lôïi cuûa moâi tröôøng (aùp löïc thaåm thaáu cao, ñoä coàn cao, pH thaáp …) neân ñaõ haïn cheá hieän töôïng töï phaân teá baøo. Khi maät ñoä gioáng caáy ban ñaàu laø 30 trieäu vaø 40 trieäu teá baøo/ml, quaù trình leân men chính keát thuùc sau 48 giôø vaø 36 giôø leân men. Trong suoát thôøi gian naøy naám men coá ñònh sinh tröôûng lieân tuïc neân toång soá teá baøo luoân luoân taêng. Tuy nhieân, töø giôø leân men thöù 12 trôû ñi, toác ñoä sinh tröôûng cuûa naám men coá ñònh giaûm vaø thaáp hôn so vôùi 12 giôø leân men ñaàu tieân. Soá teá baøo ñaït cöïc ñaïi laàn löôït laø 194,3 vaø 208,3 trieäu teá baøo/ml vaøo thôøi ñieåm keát thuùc quaù trình leân men chính. Trong quaù trình leân men, söï phaùt trieån sinh khoái cuûa naám men coá ñònh trong maïng gel, söï khueách taùn cô chaát töø beân ngoaøi vaøo beân trong gel vaø söï khueách taùn cuûa saûn phaåm trao ñoåi chaát töø ben trong haït gel ra beân ngoaøi seõ laøm thay ñoåi caáu truùc maïng gel. Chuùng toâi söû duïng kính hieån vi ñieän töû queùt chuïp aûnh caáu truùc beà maët haït gel vaø caáu truùc ôû beân trong haït gel. Keát quaû ñöôïc bieåu dieãn treân hình 4.2, 4.3. Hình 4.2A cho thaáy: ôû ñoä phoùng ñaïi 300 laàn, beà maët haït gel khaù nhaün treân beà maët coù moät soá loã mao quaûn- laø nôi xaûy ra söï khueách taùn caùc chaát ra/vaøo haït gel. Ôû ñoä phoùng ñaïi 1000 laàn (hình 4.2C), ta thaáy coù moät soá teá baøo naám men ñöôïc haáp phuï treân beà maët haït gel. Hình 4.2B cho thaáy: beân trong haït gel coù raát nhieàu mao quaûn. Vôùi ñoä phoùng ñaïi 1000 laàn (hình 4.2D) ta thaáy caùc teá baøo naám men ñöôïc phaân boá ôû beân trong caáu truùc haït gel. Sau moät chu kì leân men, caáu truùc beà maët vaø beân trong haït gel bò bieán ñoåi. Ñoù laø do söï sinh tröôûng cuûa naám men ñöôïc coá ñònh beân trong haït gel vaø naám men ñöôïc haáp phuï treân beà maët haït. Ngoaøi ra söï khueách taùn cô chaát ra/vaøo haït gel, ñaëc bieät laø söï sinh toång hôïp CO2 cuûa naám men cuõng laø lyù do quan troïng laøm bieán ñoåi ñoä xoáp cuûa haït gel. Hình 4.3A vaø C cho thaáy beà maët haït gel trôû neân goà gheà hôn vaø coù nhieàu teá baøo hôn. Treân hình 4.3B vaø D ta thaáy maät ñoä teá baøo beân trong caáu truùc gel trôû neân daøy ñaëc, heä thoáng caùc mao quaûn beân trong haït gel cuõng ñöôïc laáp ñaày caùc teá baøo naám men neân khoâng coøn nhìn thaáy roõ treân hình chuïp vôùi ñoä phoùng ñaïi 300 vaø 500 laàn. Toùm laïi, khi maät ñoä gioáng caáy ban ñaàu caøng cao thì toác ñoä sinh tröôûng cuûa naám men seõ caøng lôùn vaø löôïng sinh khoái cöïc ñaïi thu ñöôïc trong quaù trình leân men caøng nhieàu. 4.1.2.2. Cô chaát: Ñöôøng khöû: Baûng 4. 2: Söï bieán ñoåi noàng ñoä ñöôøng khöû trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. Thôøi ñieåm laáy maãu (h) Maät ñoä gioáng caáy (trieäu teá baøo/ml) 10 20 30 40 Noàng ñoä ñöôøng khöû (g/L) 0 188,51 188,51 188,51 188,51 12 160,78 137,68 111,36 101,43 24 155.80 122,54 99,67 87,23 36 125,80 94,35 73,07 49,31 48 123,50 76,68 52,10 60 96,32 50,61 72 81,55 42,33 84 72,81 96 63,56 108 58,91 120 49,28 132 44,59 144 42,32 Baûng 4. 3: Toác ñoää trung bình söû duïng ñöôøng khöû cuûa naám men trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. Maät ñoä gioáng caáy (trieäu teá baøo/ml) 10 20 30 40 Toác ñoä trung bình söû duïng ñöôøng khöû (g/Lh) 1,02a±0,032 2,03b±0,07 2,84c±0,105 3,87d±0,175 Caùc giaù trò coù kyù hieäu khaùc nhau bieåu thò söï khaùc nhau coù nghóa (P < 0,05). Noàng ñoä ñöôøng khöû (g/L) Thôøi gian (giôø) Hình 4. 4: Söï bieán ñoåi noàng ñoä ñöôøng khöû trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. Söï thay ñoåi noàng ñoä ñöôøng khöû phaûn aùnh toác ñoä leân men. Keát quaû thöïc nghieäm cho thaáy khi taêng maät ñoä gioáng caáy ban ñaàu thì löôïng ñöôøng khöû thì löôïng ñöôøng khöû ñöôïc naám men söû duïng seõ caøng nhanh. Ví duï nhö khi löôïng gioáng caáy laø 30 trieäu vaø 40 trieäu teá baøo/ml chæ sau 12 giôø leân men naám men ñaõ söû duïng 40,9 vaø 46,2% toång löôïng ñöôøng khöû coù trong dòch nha ban ñaàu. Ñoái chieáu vôùi keát quaû treân hình 4.1 ta thaáy naám men coá ñònh sinh tröôûng raát nhanh trong 12 giôø leân men ñaàu tieân, ñaëc bieät laø ôû hai nghieäm thöùc vôùi löôïng gioáng caáy laø 30 vaø 40 trieäu teá baøo/ml. Nhö vaäy, ngoaøi vieäc sinh toång hôïp ra ethanol vaø CO2 laø hai saûn phaåm chính cuûa bia thaønh phaåm, naám men ñaõ söû duïng moät phaàn lôùn ñöôøng cho vieäc toång hôïp sinh khoái. Toác ñoä trung bình söû duïng ñöôøng cuûa 4 nghieäm thöùc ñöôïc trình baøy ôû baûng 4.4. khi taêng maät ñoä gioáng caáy töø 10 trieäu leân 40 trieäu teá baøo/ml, toác ñoä trung bình söû duïng ñöôøng cuûa naám men coá ñònh taêng töø 1,02 ñeán 3,87 (g/Lh). Quaù trình leân men chính ñöôïc xem laø keát thuùc khi ñoä leân men ñaït 75% (Patkova vaø coäng söï, 2000) töông ñöông vôùi löôïng ñöôøng khöû coøn 47 (g/L). Töø keát quaû thí nghieäm treân hình 4.4 ta thaáy vieäc taêng maät ñoä gioáng caáy seõ laøm ruùt ngaén thôøi gian leân men chính trong saûn xuaát bia. FAN: Baûng 4. 4: Söï bieán ñoåi noàng ñoä FAN trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. Thôøi ñieåm laáy maãu (h) Maät ñoä gioáng caáy (trieäu teá baøo/ml) 10 20 30 40 Noàng ñoä FAN (mg/L) 0 520,92 520,92 520,92 520,92 12 406,70 325,53 236,61 181,17 24 402,30 312,13 234,73 198,33 36 382,43 250,42 208,37 165,48 48 348,54 250,73 217,16 60 318,83 243,10 72 300,84 226,36 84 291,84 96 289,02 108 291,53 120 242,47 132 240,59 144 239,33 Noàng ñoä FAN (g/L) Thôøi gian (giôø) Hình 4. 5: Söï bieán ñoåi noàng ñoä FAN trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. Naám men söû duïng FAN ñeå toång hôïp protein phuïc vuï cho quaù trình taêng sinh khoái. Keát quaû treân hình 4.6 cho thaáy khi taêng löôïng gioáng caáy ban ñaàu, toác ñoä giaûm noàng ñoä FAN trong dòch leân men dieãn ra nhanh hôn vaø haøm löôïng FAN ñöôïc naám men söû duïng cuõng nhieàu hôn. Keát quaû naøy hoaøn toaøn phuø hôïp vôùi caùc keát luaän thu ñöôïc veà söï sinh tröôûng cuûa naám men treân hình 4.1. Khi söï sinh tröôûng cuûa naám men dieãn ra nhanh vaø nhieàu hôn thì haøm löôïng FAN trong moâi tröôøng leân men cuõng seõ giaûm ñi nhanh vaø nhieàu hôn. 4.1.2.3. Saûn phaåm: Ethanol: Baûng 4. 5: Söï bieán ñoåi noàng ñoä ethanol taïo thaønh trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. Thôøi ñieåm laáy maãu (h) Maät ñoä gioáng caáy (trieäu teá baøo/ml) 10 20 30 40 Noàng ñoä ethanol (%v/v) 0 0 0 0 0 12 0,31 1,17 1,60 1,64 24 1,42 1,83 2,33 2,61 36 2,51 3,92 4,14 4,46 48 3,24 4,36 5,37 60 4,12 5,82 72 5,19 6,25 84 5,85 96 6,61 108 7,55 120 7,74 132 8,38 144 8,75 Baûng 4. 6: Toác ñoätrung bình sinh toång hôïp ethanol trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. Maät ñoä gioáng caáy (trieäu teá baøo/ml) 10 20 30 40 Toác ñoä trung bình sinh ethanol (g/Lh) 0,48a±0.015 0,68b±0.018 0,88c±0.023 0,98d±0.034 Caùc giaù trò coù kyù hieäu khaùc nhau bieåu thò söï khaùc nhau coù nghóa (P < 0,05). Noàng ñoä ethanol (%v/v) Thôøi gian (giôø) Hình 4. 6: Söï bieán ñoåi noàng ñoä ethanol taïo thaønh trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. Keát quaû treân hình 4.7 cho thaáy khi maät ñoä gioáng caáy cao (30 vaø 40 trieäu teá baøo/ml) thì quaù trình sinh toång hôïp ethanol dieãn ra nhanh hôn trong giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình leân men. Tuy nhieân khi löôïng gioáng caáy ban ñaàu caøng cao thì noàng ñoä ethanol trong bia non laïi caøng giaûm. Neáu taêng löôïng gioáng caáy ban ñaàu töø 10 trieäu leân 40 trieäu teá baøo/ml thì ñoä coàn trong bia non giaûm töø 8,75% v/v xuoáng coøn 4,46% v/v. Khi so saùnh vôùi keát quaû khaûo saùt söï sinh tröôûng cuûa naám men treân hình 4.1, chuùng ta coù theå keát luaän laø trong quaù trình leân men bia khi söï sinh tröôûng cuûa naám men laø quaù lôùn thì söï sinh toång hôïp ethanol seõ bò giaûm ñi do naám men ñaõ chuyeån hoùa moät haøm löôïng lôùn ñöôøng thaønh sinh khoái teá baøo. Haøm löôïng ethanol trong bia caøng thaáp thì hieäu quaû kinh teá cuûa quaù trình leân men bia noàng ñoä cao caøng thaáp do khoâng theå pha loaõng hoaëc pha loaõng bia thu ñöôïc vôùi moät tæ leä nöôùc raát thaáp ñeå taïo ra saûn phaåm bia cuoái cuøng. Toác ñoä trung bình sinh toång hôïp röôïu cuûa naám men coá ñònh trong 4 nghieäm thöùc khaûo saùt ñöôïc trình baøy ôû baûng 4.7. Ta thaáy khi taêng maät ñoä gioáng caáy töø 10 trieäu ñeán 40 trieäu teá baøo/ml thì toác ñoä trung bình sinh toång hôïp ethanol cuûa naám men coá ñònh seõ taêng töø 0,48 (g/Lh) leân 0,98 (g/Lh). pH: Baûng 4. 7: Söï bieán ñoåi pH trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. Thôøi ñieåm laáy maãu (h) Maät ñoä gioáng caáy (trieäu teá baøo/ml) 10 20 30 40 pH 0 5,4 5,4 5,4 5,4 12 4,89 4,68 4,55 4,46 24 4,72 4,52 4,41 4,30 36 4,63 4,39 4,26 4,13 48 4,48 4,32 4,22 60 4,43 4,29 72 4,42 84 4,46 96 4,45 108 4,46 120 4,46 132 4,50 144 4,51 Nhìn chung giaù trò pH cuûa dòch nha giaûm daàn trong quaù trình leân men chính ôû 3 nghieäm thöùc vôùi maät ñoä gioáng caáy laø 20, 30 vaø 40 trieäu teá baøo/ml. ÔÛ maät ñoä gioáng caáy laø 10 trieäu teá baøo/ml, trong 72h leân men ñaàu tieân pH giaûm nhanh, sau ñoù, giaù trò pH töông ñoái oån ñònh ñeán khi keát thuùc quaù trình leân men chính. Giaù trò pH bia non cuûa 4 nghieäm thöùc khoâng cheânh leäch nhau nhieàu, khi maät ñoä gioáng caáy caøng cao thì pH cua bia non seõ caøng thaáp. Söï sinh toång hôïp caùc acid höõu cô lieân quan ñeán söï sinh tröôûng vaø troa ñoåi chaát cuûa naám men. Soá lieäu thöïc nghieäm cho thaáy khi maät ñoä gioáng caáy taêng, naám men coá ñònh sinh tröôûng nhieàu hôn pH cuûa maãu bia non thu ñöôïc cuõng thaáp hôn. Thôøi gian (giôø) pH Hình 4. 7: Söï bieán ñoåi pH trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. Diacetyl: Thôøi gian (giôø) Noàng ñoä diacetyl (mg/L) Hình 4. 8: Söï bieán ñoåi noàng ñoä diacetyl taïo thaønh trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. Baûng 4. 8: Söï bieán ñoåi noàng ñoä diacetyl taïo thaønh trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. Thôøi ñieåm laáy maãu (h) Maät ñoä gioáng caáy (trieäu teá baøo/ml) 10 20 30 40 Noàng ñoä diacetyl (mg/L) 0 0 0 0 0 12 0,956 1,097 1,254 1,448 24 1,109 1,934 2,264 2,647 36 1,336 2,195 2,369 2,267 48 1,470 1,976 1,868 60 1,593 1,753 72 1,789 1,521 84 1,686 96 1,624 108 1,607 120 1,586 132 1,186 144 0,996 Diacetyl laø moät trong nhöõng saûn phaåm phuï quan troïng cuûa quaù trình leân men. Diacetyl aûnh höôûng xaáu ñeán höông vò vaø chaát löôïng cuûa saûn phaåm bia. Töø ñoà thò 4.9 ta thaáy khi taêng maät ñoä gioáng caáy thì quaù trình sinh toång hôïp diacetyl dieãn ra seõ nhanh hôn vaø nhieàu hôn. Ngoaøi ra khi maät ñoä gioáng caáy caøng cao thì thôøi gian ñeå haøm löôïng diacetyl ñaït giaù trò cöïc ñaïi trong dòch leân men caøng ngaén. Keát quaû naøy cuõng phuø hôïp vôùi caùc nghieân cöùu tröôùc ñaây [1,4,34]. Diacetyl hình thaønh ôû giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình leân men chính laø saûn phaåm phuï cuûa quaù trình trao ñoåi caùc acid amin. Chính vì vaäy ôû giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình leân men, khi naám men phaùt trieån caøng maïnh thì haøm löôïng diacetyl sinh ra caøng nhieàu. Sau ñoù, diacetyl ñöôïc khöû bôûi heä enzyme cuûa naám men maø toác ñoä khöû diacetyl nhanh hôn toác ñoä taïo thaønh. Do ñoù haøm löôïng diaetyl giaûm. Ta thaáy, khi maät ñoä gioáng caáy taêng cao thì quaù trình khöû diacetyl cuõng dieãn ra sôùm hôn. Tuy nhieân haøm löôïng diacetyl trong bia non cuûa 4 nghieäm thöùc khaûo saùt raát khaùc bieät nhau. Neáu löôïng gioáng caáy ban ñaàu caøng cao thì löôïng diacetyl trong bia non caøng lôùn. Ñaây laø moät ñieåm baát lôïi trong saûn xuaát bia vì thôøi gian leân men phuï seõ keùo daøi. Theo hieäp hoäi bia Chaâu AÂu, haøm löôïng diacetyl cöïc ñaïi cho pheùp trong bia thaønh phaåm khoâng ñöôïc vöôït quaù 0,1 – 0,15 ppm (Willaert vaø Nedovic, 2006; Wainwright, 1973). Moät soá saûn phaåm phuï deã bay hôi khaùc: Baûng 4. 9: Noàng ñoä moät soá saûn phaåm phuï taïo thaønh trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. Maät ñoä gioáng caáy (trieäu teá baøo/ml) 10 20 30 40 Propanol (mg/L) 9,48 7,80 6,08 6,05 Pentanol (mg/L) 105,46 91,47 67,40 66,65 Ethyl acetate (mg/L) 30,63 24,94 16,01 15,40 Acetaldehyde (mg/L) 31,90 21,97 22,39 20,59 Baûng 4. 10: Noàng ñoä moät soá saûn phaåm phuï taïo thaønh trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml, keát quaû phaân tích ñöôïc quy ñoåi thaønh bia non 5% ñoä coàn. Maät ñoä gioáng caáy (trieäu teá baøo/ml) 10 20 30 40 Heä soá pha loaõng 1,75 1,25 1,07 Khoâng pha loaõng ñöôïc Propanol (mg/L) 5,42 6,24 5,68 Pentanol (mg/L) 60,26 73,18 62,99 Ethyl acetate (mg/L) 17,50 19,95 14,96 Acetaldehyde (mg/L) 18,23 17,58 20,93 Noàng ñoä (mg/L) Thôøi gian (giôø) Baûng 4. 11: Noàng ñoä moät soá saûn phaåm phuï taïo thaønh trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy thay ñoåi töø 10 trieäu teá baøo/ml ñeán 40 trieäu teá baøo/ml. Quaù trình toång hôïp caùc saûn phaåm phuï nhö röôïu baäc cao, ester vaø aldehyde gaén lieàn vôùi quaù trình sinh toång hôïp ethanol. Keát quaû thöïc nghieäm quy ñoåi veà bia non 5% ñoä coàn cho thaáy khi taêng maät ñoä gioáng caáy töø 10 trieäu teá baøo/ml leân 20 trieäu teá baøo/ml thì haøm löôïng propanol, pentanol vaø ehtylacetate taêng trong khi ñoù haøm löôïng acetaldehyde laïi giaûm, ôû maät ñoä gioáng caáy 30 trieäu teá baøo/ml, haøm löôïng propanol, pentanol, ethylacetate thaáp hôn hai nghieäm thöùc vôi maät ñoä gioáng caáy 10 trieäu vaø 20 trieäu teá baøo/ml, trong khi ñoù haøm löôïng haøm löôïng acetaldehyde laïi cao hôn (baûng 4.11). Khi taêng maät ñoä gioáng caáy thì haøm löôïng caùc saûn phaåm phuï cuûa quaù trình leân men coù xu höôùng taêng, tuy nhieân neáu maät ñoä gioáng caáy quaù cao nhö ôû hai nghieäm thöïc vôùi maät ñoä gioáng caáy laø 30 vaø 40 trieäu teá baøo/ml thì haøm löôïng caùc saûn phaåm phuï cuûa quaù trình leân men nhìn chung coù xu höôùng giaûm. Baûng 4. 12: Moät vaøi thoâng soá leân men chính dòch nha 24OBx, söû duïng maät ñoä gioáng caáy töø 10 – 40 trieäu teá baøo/ml, ñoä leân men 75% Thoâng soá khaûo saùt (giaù trò trung bình) 10 20 30 40 Thôøi gian leân men (h) 144 72 48 36 Ñoä leân men (%) 77,55 77,55 73,86 73,84 Noàng ñoä coàn trong bia non (%v/v) 8,75a 6,25b 5,37c 4,46d Heä soá pha loaõng 1,75 1,25 1,07 Caùc giaù trò coù kyù hieäu khaùc nhau bieåu thò söï khaùc nhau coù nghóa (P < 0,05). 4.1.2.4. Keát luaän chung: Khi taêng maät ñoä gioáng caáy ban ñaàu thì toác ñoä sinh tröôûng vaø löôïng sinh khoái trong dòch leân men seõ caøng taêng, thôøi gian leân men ñöôïc ruùt ngaén; tuy nhieân, haøm löôïng coàn trong bia non giaûm neân löôïng bia thaønh phaåm thu ñöôïc cuõng giaûm theo vaø haøm löôïng diacetyl trong bia non taêng neân keùo daøi thôøi gian leân men phuï. Töø caùc soá lieäu thöïc nghieäm, chuùng toâi choïn tæ leä gioáng caáy laø 10 trieäu teá baøo/ml laø giaù trò thích hôïp cho quaù trình leân men bia noàng ñoä cao vôùi naám men coá ñònh trong gel alginate. 4.2. AÛnh höôûng cuûa haøm löôïng oxi hoøa tan coù trong dòch nha ñeán ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men chính: 4.2.1. Giôùi thieäu chung: Chuùng toâi khaûo saùt ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men tónh, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx vaø ñöôïc suïc khí trong caùc khoaûng thôøi gian 0, 4, 8, 12, 16, 20 giôø trong giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình leân men. Haøm löôïng oxygen trong dòch nha vaøo thôøi ñieåm ban ñaàu cuûa quaù trình leân men laø 7,5 mg/L (p = 1atm, t = 17OC). 4.2.2. Keát quaû vaø baøn luaän: 4.2.2.1. Sinh khoái: Sinh khoái (trieäu teá baøo/ml) Thôøi gian (giôø) Hình 4. 9: Söï bieán ñoåi maät ñoä naám men trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy 10 trieäu teá baøo/ml, thôøi gian suïc khí thay ñoåi töø 0 – 20h. Baûng 4. 13: Söï bieán ñoåi maät ñoä naám men trong quaù trình leân men chính, söû duïng dòch nha coù noàng ñoä chaát khoâ ban ñaàu 24OBx, maät ñoä gioáng caáy 10 trieäu teá baøo/ml, thôøi gian suïc khí thay ñoåi töø 0 – 20h. Thôøi ñieåm laáy maãu (h) Thôøi gian suïc khí (giôø) 0 4 8 12 16 20 Maät ñoä teá baøo (106teá baøo/ml dòch leân men) 0 10 10 10 10 10 10 12 45,6 33,8 34,0 38,1 38,1 33,8 24 62,7 45,8 47,9 58,8 47,1 47,5 36 61,7 49,0 54,6 65,5 52,1 53,8 48 62,9 58,0 58,1 72,1 50,4 62,3 60 57,1 53,7 55,6 68,1 57,9 64,8 72 58,3 57,3 54,0 65,0 57,3 62,5 84 56,9 52,1 51,9 63,1 56,0 60,0 96 58,1 54,4 51,5 62,5 55,2 55,8 108 52,5 51,5 48,3 61,7 57,5 58,5 120 54,0 47,1 50,0 51,7 57,9 132 53,5 144 55,8 Vieäc xaùc ñònh maät ñoä teá baøo trong dòch leân men nhaèm xaùc ñònh khaû naêng sinh tröôûng cuûa naám men. Töø hình 4.11, ta thaáy trong 24h leân men ñaàu tieân, löôïng sinh khoái taêng nhanh do dòch nha coù oxygen vaø nhieàu chaát dinh döôõng. Sau ñoù löôïng sinh khoái taêng chaäm daàn, toác ñoä sinh tröôûng cuûa naám men giaûm daàn ôû caùc nghieäm thöùc coù thôøi gian suïc khí töø 0 – 12 giôø, löôïng sinh khoái trong canh tröôøng seõ ñaït giaù trò cöïc ñaïi ôû giôø leân men thöù 48, coøn ôû caùc nghieäm thöùc vôùi thôøi gian suïc khí töø 16 – 20 giôø, sinh khoái seõ ñaït giaù trò cöïc ñaïi ôû giôø leân men thöù 60. Nhö vaäy, khi thôøi gian suïc khí caøng keùo daøi thì khoaûng thôøi gian caàn thieát ñeå caùc teá baøo naám men coá ñònh taêng tröôûng vaø ñaït giaù trò cöïc ñaïi seõ caøng daøi hôn. Ñoù laø do khi taêng thôøi gian suïc khí seõ laøm taêng haøm löôïng oxygen hoøa tan trong canh tröôøng. Khi ñoù, naám men seõ söû duïng oxygen vaø chuyeån hoùa ñöôøng thaønh CO2, H2O vaø naêng löôïng. Phaàn naêng löôïng ñöôïc taïo ra trong ñieàu kieän hoâ haáp hieáu khí lôùn hôn raát nhieàu so vôùi ñieàu kieän leân men ethanol kò khí. Naám men seõ söû duïng phaàn naêng löôïng naøy cho quaù trình sinh tröôûng vaø taïo ra nhieàu teá baøo môùi. Khi haøm löôïng oxygen trong canh tröôøng caøng nhieàu thì söï sinh tröôûng cuûa naám men seõ caøng toát neân pha logarite ñöôïc keùo daøi. Hieän töôïng naøy laøm taêng khoaûng thôøi gian ñeå sinh khoái naám men ñaït ñöôïc giaù trò cöïc ñai. Trong taát caû 6 nghieäm thöùc ñaõ khaûo saùt, löôïng sinh khoái cao nhaát laø 72,1 trieäu teá baøo/ml ôû nghieäm thöùc coù thôøi gian suïc khí 12 giôø. Tuy nhieân löôïng sinh khoái trong caùc nghieäm thöùc khoâng cheânh leäch nhau nhieàu. Moät keát quaû ñaùng löu yù laø sau giai ñoaïn sinh tröôûng vaø ñaït giaù trò cöïc ñaïi, löôïng sinh khoái cuûa naám men coá ñònh khoâng thay ñoåi ñaùng keå cho ñeán khi keát thuùc quaù trinh leân men chính. Khi khaûo saùt quaù trình leân men bia