Đề tài Sản xuất xylanase theo phương pháp lên men bề mặt

1 I. GIỚI THIỆU: 1. Enzyme xylanase:  Định nghĩa: Xylanase là enzyme thủy phân mạch polysaccharide beta-1,4-xylan thành xylose, có nghĩa là nó thủy phân mạch hemicellulose (nhưng lại không ảnh hưởng gì đến cellulose). Hemicellulose là thành phần chính trong thành tế bào của thưc vật. Hình 1: Cơ chế thủy phân xylan  Cấu trúc: Hình 2: Cấu trúc không gian của enzym xylanase 2  Phân loại Có ít nhất là 3 cách để phân loại xylanase: Theo khối lượng phân tử và pI (Wong et al): - Xylanase có phân tử lượng cao: o pI cao (ở vùng base) o pI thấp (ở vùng acid) - Xylanase có phân tử lượng thấp: o pI cao (ở vùng base) o pI thấp (ở vùng acid) Theo cấu trúc tinh thể: - Family F Xylanase (glycosidase family 10): Miền hoạt động( catalytic domain) có dạng ống xylanh (cylindrical barrel). o Có hoạt tính của endocellulase. o Khối lượng phân tử lớn. - Family G Xylanase (glycosidase family 11): Miền xúc tác có dạng hình máng 2 lớp có nhiều nếp gấp (2 layered trough). o Không có hoạt tính cellulase. o Khối lượng phân tử thấp. Theo tính chất động học, cơ chất đặc trưng và sản phẩm tạo thành…  Cơ chế sinh tổng hợp enzyme Hình 3: Cơ chế sinh tổng hợp enzyme 3  Đặc tính: Tên khoa học: endo-1,4-β-xylanase (No EC 3.2.1.8) Loại: Hydrolase Cơ chất: Xylan Sản phẩm: Xylose Vi sinh vật: Aspergillus niger pH: 5 -6 (pH tối ưu 5.5) pI: 8.6 Nhiệt độ: 35 – 600C (nhiệt độ tối ưu 450C) Khối lượng phân tử: 13.5 – 14 kDa  Ứng dụng: Tẩy trắng giấy. Cải thiện nguồn dinh dưỡng của thức ăn gia súc. Làm trong nước rau quả. 2. Aspergillus niger: Hình 4 : Aspergillus niger 4  Đặc tính: Đây là loài nấm phát triển nhanh, sản sinh khuẩn lạc màu đen khi ủ ở 25 0C trong 10 ngày. Nó sinh ra mùi mốc. Loài nấm này phân bố rộng khắp. Nó được phân lập từ đất, không khí, cát biển, đầm lầy, sợi cây đước, nước ngọt chứa nguồn hữu cơ, nước bùn, thực phẩm, đặc biệt là trái cây và rau… Nó xuất hiện chủ yếu như là tác nhân gây ra nhiễm trùng mãn tính và thỉnh thoảng gây ra bệnh nấm phổi. A. niger phát triển mạnh trong môi trường thạch malt.  Phân bố: Loài Aspergillus phân bố rất nhiều trong tự nhiên, ở đất, ở xác thực vật, hoa quả và đặc biệt có nhiều ở vùng có khí hậu ấm áp. Một trong những chủng của loài đó được nghiên cứu kĩ trong các phòng thí nghiệm và qua quá trình sản xuất là Aspergillus niger. Chủng này trong quá trình phân hủy các chất glucid và các chất khác có khả năng tích luỹ ở môi trường một lượng axit hữu cơ và enzyme khá lớn.  Cấu tạo: Các khuẩn lạc bao gồm các màu cơ bản là màu trắng hoặc vàng mọc thành từng lớp dày đặc với đầu màu nâu tối hoặc màu đen và tạo thành bào tử dài khoảng 7-10µm, trong một số trường hợp có thể dày tới vài mm về chiều dài và có thể hơn 20µm về đường kính, khuẩn lạc có màu đen, trên những cuống bào tử có vô số những bào tử. Những bào tử này có thể nhìn rõ qua kính hiển vi. Hình dạng của cuống bào tử đính và sự hình thành hắc tố là điểm đặc trưng của Aspergillus niger. Cuống bào tử có 2 phần: o Phần thứ nhất: dài và to, có kích thước khác nhau, khoảng 10-20 µm về chiều dày. o Phần thứ hai ngắn hơn khoảng 2-3 µm, có màu nâu nhạt hay hoàn toàn đen. Đầu bào tử được chia thành 2 phần bởi vách ngăn: phần dạng túi màu nâu mọc ở trên và phần cuống ở dưới. Bào tử tự do có dạng cầu hoặc gần cầu, đường kính 3,5-5 µm, có thành nhám, màu nâu tối hoặc màu đen. Hình 5: Cấu tạo cuống bào tử cp - cuống bào tử đính v - thể bình s - cuống nhỏ c –các bào tử 5  Đặc điểm sinh lý: Vi sinh vật hiếu khí bắt buộc. Dị dưỡng hóa năng. Phương pháp sinh sản bằng bào tử. 3. Bã dầu cọ:  Cây dầu cọ: Cây dầu cọ thuộc: o Giới : Plantae o Ngành: Angiospermae. o Lớp : Monocots. o Bộ: Arecales. o Họ: Arecaceae. o Giống: Elaeis. o Loài: có 2 loài là: Elaeis guineensis (cọ dầu châu Phi) và Elaeis oleifera (cọ dầu châu Mỹ). Các cây trưởng thành là loại có một thân cây, có thể cao tới 20 m. Lá thuộc loại lá lông chim, có thể dài tới 3-5 m. Các cây non sinh ra khoảng 30 lá mỗi năm. Những cây trên 10 năm tuổi sinh ra khoảng 20 lá mỗi năm. Hoa mọc thành cụm dày dặc; mỗi hoa riêng rẽ là hoa nhỏ, có ba đài hoa và ba cánh hoa. Quả phải mất 5 đến 6 tháng kể từ khi thụ phấn để có thể chín; nó chứa lớp cùi thịt ngoài chứa nhiều dầu (vỏ quả), với một hạt duy nhất (nhân), cũng rất nhiều dầu. Không giống như họ hàng của nó là dừa, cọ dầu không sản sinh ra các chồi phụ; sự nhân giống được thực hiện bằng cách gieo hạt. Cây cọ dầu phát triển tốt trên đất pha cát và có khả năng chống chịu mặn tốt cũng như nó ưa thích các nơi sinh sống có nhiều nắng và lượng mưa bình thường (750–2.000 mm hàng năm), điều này giúp nó trở thành loại cây định cư bên các bờ biển nhiệt đới một cách tương đối dễ dàng. Cọ dầu cần độ ẩm cao (70– 80%) để có thể phát triển một cách tối ưu nhất và cho lại nhiều quả. Hình 6: Cây dầu cọ ở châu Phi 6  Quả dầu cọ: Cấu tạo: gồm 4 phần: o Ngoài cùng là lớp vỏ mỏng, khi chín đổi màu từ nâu sang đỏ cam. o Thịt quả có thớ, bao quanh hạt. o Tiếp theo là lớp vỏ cứng bên trong để bảo vệ hạt. o Hạt. Hình 7: Cấu tạo quả dầu cọ. Phân loại: có 3 loại dựa vào lớp vỏ cứng bao quanh hạt: - Dura: có vỏ cứng dày - Tenera: có vỏ cứng mỏng. - Pisifera: không có vỏ cứng. Hình 8: Các loại quả dầu cọ 7  Quy trình sản xuất bã dầu cọ: Hình 9: Quy trình sản xuất bã dầu cọ. Bảng 1: Thành phần hóa học của bã dầu cọ : Hàm lượng chất khô (%) 91.0 Protein thô (%) 15.2 Xơ thô (%) 16.0 Dung môi trích (%) 1.8 Tro (%) 3.8 Nitrogen tự do (%) 63.2 Calcium (%) 0.25 Phosphorus (%) 0.52 Magnesium (%) 0.16 Copper (Đồng) (ppm) 28.5 Ferrous (Sắt) (mg/kg) 4.05 Manganese (mg/kg) 225.0 Zinc (Kẽm) (mg/kg) 77.0 8 II. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ: Nguyên liệu CB môi trường Tiệt trùng Cấy giống Lên men Tinh sạch Sấy Nhân giống Enzym sạch Giống 9 III. THUYẾT MINH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ: 1. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG:  Mục đích: chuẩn bị  Môi trường: o Palm kernel cake: 10g o Môi trường Mandel: g/l - ure : 0.3 - peptone: 0.75 - dịch chiết nấm men: 0.25 - (NH4)2SO4 : 1.4 - KH2PO4 : 2 - CaCl2: 0.3 - MgSO4.7H2O : 0.3 -Các yếu tố vi lượng: (mg/l) FeSO4.7H2O: 5 MnSO4.4H2O : 1.6 ZnSO4.7H2O : 1.4 CoCl2.6H2O : 20 Với mỗi 10g cơ chất rắn bổ sung 15ml môi trường Mandel. Sau khi tiệt trùng, làm nguội và đưa về nhiệt độ 28±3ºC để cấy canh trường giống 104 tế bào/ml.  Thiết bị: Hình 10: Thiết bị khuấy trộn  Thông số công nghệ: Nhiệt độ phòng Tốc độ khuấy: 40 rpm Thời gian: 15-30phút 10 2. TIỆT TRÙNG MÔI TRƯỜNG:  Muc đích: tạo môi trường vô khuẩn chuẩn bị lên men  Các biến đổi: o Vật lý: Sự thay đổi về thể tích, khối lượng, tỉ trọng (nước bốc hơi), … o Hóa lý: Sự bốc hơi nước. o Hóa sinh: Enzym bị vô hoạt. o Sinh học: Ức chế, tiêu diệt vi sinh vật. o Cảm quan: Sự tổn thất của một số cấu tử mẫn cảm với nhiệt (vitamin, …).  Thông số công nghệ: o Áp suất: 1 atm o Nhiệt độ: 121oC o Thời gian: 45 phút  Thiết bị: nồi hấp tiệt trùng Hình 11: Thiết bị Autoclave nằm ngang 11 3. NHÂN GIỐNG:  Giống được cấy trên môi trường dịch nước nha ở 370C đến khi hình thành bào tử. Tế bào sau đó được thu nhận và đếm trực tiếp bằng buồng đếm  Môi trường nhân giống: o Thành phần (g/l): - Dịch chiết malt 30.0 - Peptone 5.0 - Agar 15.0 Môi trường được hấp tiệt trùng ờ 115oC trong 10 phút. Dịch chiết malt là nguồn cung cấp năng lượng cho vi sinh vật, peptone cung cấp nguồn Nitơ cho vi sinh vật, agar là tác nhân làm đông đặc môi trường  Các yếu tố ảnh hưởng: o Nhiệt độ: Nếu tiến hành nhân giống vi sinh vật ở nhiệt độ thấp hoặc cao hơn khoảng nhiệt độ tối ưu thì vi sinh vật sinh trưởng chậm hơn và hằng số tốc độ sinh trưởng của giống (μexpo) sẽ giảm xuống. o Oxy: Đối với nhóm vi sinh vật hiếu khí bắt buộc như Aspergillus niger, việc cung cấp oxy cho môi trường là rất cần thiết để giúp vi sinh vật tổng hợp năng lượng, duy trì các hoạt động trao đổi chất và tổng hợp sinh khối. o Thời gian: Theo lý thuyết, vào thời điểm đầu của giai đoạn ổn định, số lượng tế bào thu được trong canh trường là cao nhất và chúng có hoạt tính sinh lý ổn định. Do đó, ta kết thúc quá trình nhân giống để thu nhận sinh khối vào thời điểm này để đạt được hiệu quả kỹ thuật và kinh tế cao nhất.  Thông số công nghệ: o Nhiệt độ 37°C o Thời gian: 24-36h  Các cấp nhân giống: - Trong phòng thí nghiệm : Giống được nuôi trên môi trường thạch nghiêng . - Nhân giống giai đoạn phân xưởng: Sử dụng thiết bị nhân giống dạng hình trụ đứng, có cánh khuấy giúp đảo trộn đều canh trường 12 Hình 12: Minh họa các cấp nhân giống. 4. NUÔI CẤY:  Mục đích: khai thác tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển để thu enzyme.  Các gian đoạn phát triển của nấm mốc : o Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau: - Nhiệt độ tăng rất chậm. - Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa. - Thành phần dinh dưỡng có sự thay đổi. - Khối môi trường còn rời rạc. bắt đầu có - Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành. Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ. o Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: - Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trường trong lòng môi trường. - Trong giai đoạn này ta có thể hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng xám bằng mắt thường. - Môi trường được kết lại khá chặt. 13 - Độ ẩm môi trường giảm dần. - Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-450C. - Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi. - Enzyme xylanase được tổng hợp mạnh. - Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-300C là tốt nhất. o Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản như sau: - Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. - Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. Nhiệt dộ nuôi duy trì ở 300C,trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó lượng enzyme tạo ra sẽ giảm xuống . Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzyme rất cần thiết.  Các biến đổi: o Vật lý: tăng nhiệt độ o Hóa lý: ẩm bốc hơi, cấu trúc môi trường thay đổi o Hóa học: O2 giảm,CO2 tăng o Hóa sinh: sự hình thành enzyme, thay đổi tốc độ 1 số phản ứng hóa sinh o Sinh học: tăng sinh khối  Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình: o Nhiệt độ: Là một trong những thông số quan trọng quyết định đến sự thành công của của phương pháp lên men bề mặt. Khi nhiệt độ thấp, quá trình lên men kéo dài. Khi nhiệt độ quá cao, hoạt tính trao đổi chất của vi sinh vật bị giảm và các cấu tử mẫn cảm với nhiệt bị tổn thất. o Hàm ẩm: Nước làm cho cơ chất trương nở và tạo điều kiện cho vi sinh vật sử dụng tốt cơ chất. Tăng lượng ẩm có thể làm cho giảm độ xốp của cơ chất, do đó hạn chế lượng oxy chuyển vào cơ chất Tỷ lệ ẩm thấp dẫn đến giảm sự hòa tan chất dinh dưỡng của cơ chất rắn, độ trương nở thấp hơn và sức căng của nước cũng lớn hơn o Lượng giống cấy: Nếu lượng giống cấy ít, thời gian thu hồi sản phẩm sẽ kéo dài, năng suất không cao. Nếu lượng giống tăng, hoạt độ của xylanase cũng sẽ tăng nhanh dù sự sinh trưởng không tăng nhanh nhưng kéo theo là giai đoạn suy thoái cũng đạt nhanh hơn. 14 o Lượng oxy: A.niger là sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển bình thường khi đầy đủ oxy. Để đáp ứng điều kiện nuôi này môi trường nuôi phải xốp, rải thành lớp không dày quá 2,5÷3cm, phòng nuôi phải thoáng.  Thiết bị: Hình 13: Thiết bị lên men  Thông số công nghệ: Nhiệt độ: 28±3ºC Tỷ lệ ẩm giữa PKC và chất làm ẩm: 1:0.75 Canh trường giống: 104 tế bào/ ml với mỗi 10g cơ chất Thể tích thiết bị: 500 lít Thể tích hoạt động: 250 lít Lưu lượng khí: 1500 l/h Năng suất của hệ thống làm mát: 2.5kW  Đánh giá thiết bị: o Nhược điểm: Khó điều khiển quá trình nuôi cấy Tốn chi phí năng lượng cho việc thổi khí, cung cấp nhiệt. o Ưu điểm: Mặc dù có nhiều nhược điểm nhưng thống thiết bị này lại cho kết quả gần giống với kết quả đã nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, nghĩa là ta sẽ thu được xylanase với hoạt tính và hiệu suất cao nhất trong những điều kiện tối ưu. 15 5. TINH SẠCH: a. TRÍCH LY:  Mục đích: thu nhận enzyme.  Các biến đổi:  Vật lý:  Sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng, nhiệt độ của dung dịch.  Quá trình khuếch tán các chất hòa tan từ canh trường ra dung môi, song song đó, quá trình khuếch tán ngược chiều nước vào trong canh trường. Trao đổi ion Dịch enzyme sạch Canh trường Lọc gel Hòa tan kết tủa Kết tủa Ly tâm Trích ly Nước Bã Ly tâm 16  Hóa học:  Thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn – lỏng.  Sự thủy phân một số chất (đường, protein,…).  Hóa lý:  Sự hòa tan một số chất vào dung môi, làm tăng độ nhớt của dung dịch  Hóa sinh: Vô hoạt hệ enzyme thủy phân và oxy hóa – khử.  Cảm quan:  Màu dung dịch sậm hơn do xảy ra phản ứng Maillard.  Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly:  Chênh lệch nồng độ giữa canh trường và dung môi. Khi chênh lệch nồng độ lớn, lượng chất trích ly tăng.  Diện tích tiếp xúc của vật liệu rắn và dung môi càng lớn thì hiệu suất trích ly càng tăng, nhưng nếu vật liệu được nghiền quá mịn thì quá trình tách cặn sẽ khó.  Nhiệt độ có tác dụng tăng tốc độ khuêch tán và giảm độ nhớt, phân tử chất hòa tan chuyển động dễ dàng khi khuếch tán giữa các phân tử dung môi, tuy nhiên nhiệt độ là 1 yếu tố có giới hạn, vì khi nhiệt độ quá cao có thể xảy ra các phản ứng khác không cần thiết gây khó khăn trong quá trình công nghệ.  Thời gian trích ly càng dài thì lượng chất khuếch tán tăng, nhưng thời gian phải có giới hạn, khi đã đạt được độ trích ly cao nhất nếu kéo dài sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế.  Thiêt bị: Hình 14 : Thiết bị trích ly 2 vít nằm ngang tác động liên tục. 1-Máng nghiêng; 2-Bơm định lượng; 3-Bộ trao đổi nhiệt; 4-Vít tải; 5-Bộ định lượng; 6-Dẫn động; 7-Bơm; 8-Bộ trao đổi nhiệt; 9-Áo trao đội nhiệt.  Thông số công nghệ:  Nhiệt độ trích ly: 250C  Thời gian: 40-60 phút 17 b. LY TÂM LẦN 1:  Mục đích: tách sinh khối vi sinh vật và bã của canh trường.  Các biến đổi:  Vật lý:  Sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng, nhiệt độ của dung dịch.  Hóa học:  Thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn – lỏng.  Hóa lý:  Huyền phù tách ra thành 2 pha rắn - lỏng  Vi sinh: Hàm lượng vi sinh vật giảm.  Các yếu tố ảnh hưởng:  Sự chênh lệch khối lượng riêng của 2 pha rắn – lỏng: chênh lệch nhiều thì quá trình phân riêng sẽ dễ dàng hơn.  Tốc độ quay của roto: tốc độ quay nhanh thì quá trình ly tâm sẽ tốt hơn  Thiết bị: Sử dụng các con lốc ly tâm để tách riêng các phần tử rắn và lỏng có tỷ trọng khác nhau Hình 15: Thiết bị ly tâm lắng  Thông số công nghệ:  Tốc độ quay: 10000rpm  Thời gian: 10 phút  Nhiệt độ: 4oC  Họat độ riêng: 80.1 IU/mg  Độ tinh sạch:1  Hiệu suất: 100% 18 c. KẾT TỦA ENZYME:  Mục đích: tách enzyme ra khỏi dung dịch.  Nguyên lý: dùng các muối hòa tan háo nước làm tăng nồng độ dung dịch và làm enzyme bị mất nước, kết tủa.  Các biến đổi: Vật lý: tăng nhiệt độ. Hóa lý: Biến tính protein Kết tủa các tạp chất có phân tử lượng lớn Enzyme chuyển từ dạng lỏng sang dạng rắn. Hóa sinh: vô hoạt enzyme.  Các yếu tố ảnh hưởng:  Nồng độ dung dịch enzyme ban đầu càng loãng thì enzyme càng khó kết tủa và ngược lại.  Lượng muối hòa tan bổ xung càng nhiều thì khả năng kết tủa enzyme càng cao nhưng nếu quá cao thì khả năng kết tủa giảm.  Thiết bị: Hình 16: Thiết bị kết tủa.  Thông số công nghệ:  Nhiệt độ: tiến hành kết tủa ở nhiệt độ phòng.  Muối: Amoni sunfat 80%.  Thời gian: 10 – 18 h.  Họat độ riêng: 162 IU/mg  Độ tinh sạch: 2  Hiệu suất: 74% 19 d. LY TÂM LẦN 2:  Mục đích: thu nhận kết tủa.  Các biến đổi:  Vật lý:  Sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng, nhiệt độ của dung dịch.  Hóa học:  Thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn – lỏng.  Hóa lý:  Huyền phù tách ra thành 2 pha rắn - lỏng  Các yếu tố ảnh hưởng :  Sự chênh lệch khối lượng riêng của 2 pha rắn – lỏng: chênh lệch nhiều thì quá trình phân riêng sẽ dễ dàng hơn.  Tốc độ quay của roto: tốc độ quay càng nhanh thì quá trình ly tâm càng thuận lợi.  Thiết bị: giống ly tâm lần 1.  Thông số kỹ thuật: - Tốc độ quay: 10000rpm - Thời gian: 10 phút - Nhiệt độ: 4oC e. HÒA TAN:  Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lọc gel  Các biến đổi:  Enzyme chuyển từ dạng rắn sang dạng lỏng.  Nồng độ dung dịch enzyme giảm do mất các chất hòa tan.  Các yếu tố ảnh hưởng: Lượng dung dịch đệm càng nhiều thì khả năng hòa tan càng cao nhưng gây khó khăn trong quá trình lọc gel. Chêng lệch pH của dung dịch đệm và pI của enzyme càng cao thì hòa tan càng tốt  Thiết bị: dạng thiết dạng hình trụ có cánh khuấy.  Thông số công nghệ:  Dung dịch đệm: Phosphat ( 50mM, pH = 8 ). 20 f. SẮC KÝ LỌC GEL:  Nguyên lý của phương pháp : khác nhau về kích thước, hình dạng, cấu trúc không gian, phân tử lượng . Hình 17: Sắc ký lọc gel  Bản chất quá trình lọc gel:  Quá trình triển khai sắc ký được thực hiện thông qua sự tương tác của 2 pha: Pha tĩnh : là các hạt gel có cấu trúc mở, chứa liên kết ngang tạo thành mạng lưới không gian ba chiều được nhồi cố định trong cột. Bên trong và bên ngoài hạt gel có các mao quản kích thước nhỏ. Cả cột gel được giữ cân bằng bằng cách rửa qua dung dịch đệm. Pha động : là hỗn hợp gồm dịch enzyme và các tạp chất hòa tan khác có kích thước phân tử khác nhau được pha trong dung dịch đệm. Hình 18: Bản chất của quá trình lọc gel 21  Dung dịch mẫu chứa enzyme và các cấu tử hòa tan (pha động) có kích thước khác nhau được chạy qua cột. Những phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ mao quản của gel thường không thể đi vào bên trong hạt gel, vì thế chúng di chuyển trong khoảng không gian giữa các hạt. Những phân tử có kích thước nhỏ hơn thì có khả năng khuếch tán vào bên trong các hạt gel.  Các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình lọc gel:  Kích thước hạt gel: Chọn hạt gel có kích thước nhỏ nhằm khắc phục hiện tượng chảy tràn do trọng lực, chảy rối và tăng bề mặt tiếp xúc giữa pha động và pha tĩnh. Tuy nhiên, nếu gel có kích thước quá nhỏ, đặc biệt là các gel có cấu trúc mềm thì xuất hiện sự tăng áp suất trong quá trình sắc ký và dễ xảy ra hiện tượng đè nén cục bộ.  Dung dịch đệm chiết xuất: Tùy theo độ ổn định của gel và các cấu tử cần chiết tách mà lựa chọn dung dịch đệm có pH thích hợp.  Tốc độ dòng chảy qua gel: Tốc độ dòng chảy qua gel phụ thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm chiều dài cột, kiểu và kích thước hạt gel. Để đảm bảo an toàn chung cho sự rửa giải của cột gel thì tốc độ dòng chảy phải thấp hơn nhiều so với dòng chảy tự do. Tốc độ dòng chảy cao sẽ làm giảm độ khuếch tán của mẫu hoặc làm rộng miền khuếch tán nhưng chủ yếu là làm mất cân bằng nội tại giữa các cấu tử cần chiết tách và bề mặt mao quản gel. Tốc độ rửa giải quá thấp thì không những làm chậm quá trình phân tích mà còn có thể làm tăng sự phân tán của mẫu.  Thiết bị: Hình 19: Thiết bị lọc gel. 22  Thông số công nghệ:  Hạt nhồi cột: Sephadex G-200  Dung dịch rửa giải: đệm Na-Phosphate (0.05M, pH bằng 9)  Tốc độ rửa giải khoảng 11 mm/phút  Hoạt tính riêng xylanase thu được là 282.6 UI/mg  Độ tinh sạch: 3.5 lần  Hiệu suất thu hồi: 62%. g. SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION:  Mục đích: tinh sạch enzyme xylanase dựa vào sự tích điện khác nhau của các cấu tử.  Phương pháp thực hiện:  Nguyên lý của phương pháp: Phương pháp sắc ký trao đổi ion có thể coi là 1 dạng đặc biệt của sắc ký hấp phụ mà trong đó các cấu tử mang điện có khả năng tương tác tĩnh điện 1 cách thuận nghịch với pha tĩnh là các hạt nhựa mang điện trái dấu, còn pha động là các dung dịch điện ly.  Quy trình thực hiện gồm 4 bước: - Bước 1: nhồi hạt nhựa trao đổi ion vào cột - Bước 2: đưa các mẫu vào cột - Bước 3: các thành phần của mẫu có thể tích điện dương, âm hay trung hòa về điện, khi đi qua cột chỉ có phần tử mang điện trái dấu mới kết hợp với hạt nhựa, các phần tử khác do không bị giữ lại bởi pha tĩnh sẽ rời khỏi cột, trong đó có enzyme xylanase cần thu nhận. - Bước 4: tái sinh cột. Hình 20: Bản chất của quá trình trao đổi ion.  Trao đổi anion: Dịch sau khi qua cột lọc gel (nếu cần thì sử dụng thiết bị cô đặc chân không thùng quay, 400C đưa về nồng độ thích hợp) thêm vào dung dịch đệm Phosphate (0.05M, pH bằng 7). Do pI của xylanase bằng 8 nên xylanase sẽ tích điện dương. Qua cột trao đổi anion, xylanase sẽ không bị giữ lại trên cột. Ta sẽ thu nhận xylanase và những cấu tử khác không tích diện âm. Sau 1 thời gian hoạt động ta tiến hành tái sinh cột. 23 Thiết bị: Hình 21: Thiết bị trao đổi ion Thông số công nghệ: o Nhựa trao đổi anion: DEAE Sepharose FF (Sigma-Aldrich Co., USA) o Tốc độ dòng nhập liệu khoảng 3 mm/phút o Hoạt tính riêng xylanase thu được là 444.2 UI/mg o Độ tinh sạch: 5.5 lần o Hiệu suất thu hồi: 49%  Trao đổi cation: Dịch sau khi được trao đổi anion (nếu cần thiết thì cô đặc về nồng độ tích hợp) thêm vào dung dịch đệm Na-Phosphate (0.05M, pH bằng 9). Lúc này xylanase sẽ tích điện âm. Qua cột trao đổi cation để tách các cấu tử tích điện dương khác có trong dung dịch. Sau 1 thời gian, tiến hành tái sinh cột. Thiết bị: cột giống với cột trao đổi anion. Thông số công nghệ: o Nhựa trao đổi cation: CM Sepharose FF (Sigma-Aldrich Co., USA) o Tốc độ dòng nhập liệu khoảng 3 mm/phút o Hoạt tính riêng xylanase thu được là 1697.7 UI/mg o Độ tinh sạch: 21 lần o Hiệu suất thu hồi: 14%  Các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình trao đổi ion: Pha tĩnh: Phụ thuộc vào tính chọn lọc của nhựa trao đổi ion - Tính chọn lọc cao: các peak thu được tách rời nhau ra - Tính chọn lọc thấp: các peak thu được không hoàn toàn tách rời. - Đối với nhựa trao đổi cation: ion 1 điện tích sẽ giữ lại kém hơn ion 2 điện tích. - Đối với nhựa trao đổi anion: ion F – bị giữ lại ít nhất. 24 Pha động: Phụ thuộc bản chất ion đối (ion thuộc pha động) và nồng độ của nó. Dung dịch đệm: - Đối với các chất lưỡng tính có khả năng tích điện ở pH khác nhau, pH lớn hơn pI thì phân tử tích điện âm và ngược lại. - Do đó cần lựa chọn pH dung dịch đệm thích hợp. 6. SẤY:  Mục đích: làm bay hơi dung môi, thu nhận chế phẩm enzyme ở dạng bột.  Các biến đổi: o Vật lý: Nhiệt độ tăng. Khối lượng giảm. o Hóa lý: Dung môi bay hơi. Hỗn hợp chuyển sang pha rắn. o Hóa học : Độ ẩm giảm. o Hóa sinh: Vô hoạt phần nhỏ enzyme o Sinh học : Ức chế vi sinh vật.  Thiết bị: thiết bị sấy phun 2 giai đoạn. Hình 22: Thiết bị sấy phun 2 giai đoạn 25 Với hệ thống này giai đoạn 1 là sấy phun bình thường, giai đoạn 2 là sấy tầng sôi. Tuy phải tiêu tốn thêm một phần năng lượng cho sấy tầng sôi nhưng nhờ sấy tầng sôi nên hạt sản phẩm sau quá trình sấy đạt kích thước cần thiết, nghĩa là quá trình sấy tầng sôi tương đương với quá trình tạo hạt, do đó tiết kiệm chi phí thiết bị so với hệ thống sấy phun 1 giai đoạn và hệ thống sấy thăng hoa. Cấu tạo:  Cơ cấu phun sương: - Đầu phun ly tâm nhằm tăng hiệu quả của sấy phun, có thể chọn đầu phun có kích thước lỗ phù hợp, kích thước hạt sau sấy đồng đều. - Nguyên tắc: Mẫu nguyên liệu được bơm vào đầu phun theo ống trung tâm, dung dịch phun ra theo hướng vuông góc với trục của buồng sấy. Hình 23: Đầu phun ly tâm  Buồng sấy: - Buồng sấy là nơi hòa trộn mẫu sấy (dạng sương mù) và tác nhân sấy (không khí nóng). Buồng sấy có nhiều hình dạng khác nhau nhưng phổ biến nhất là buồng sấy hình trụ dứng, đáy côn. - Do sản phẩm là enzyme, dễ mất hoạt tính khi tiếp xúc lâu với nhiệt độ cao nên sử dụng hệ thống sấy phun có dòng sản phẩm cùng chiếu với tác nhân sấy Hình 24 : Buồng sấy phun.  Thông số công nghệ : o Thời gian lưu trong buồng sấy: 3-5s o Nhiệt độ tác nhân sấy đầu vào : 150oC 26 SẢN PHẨM  Sản phẩm dạng bột: Sản phẩm lên men của A.Clavatus Hình 25: Sản phẩm xylanase dạng bột từ A.Clavatus - Màu sắc: bột màu vàng sáng hay nâu. - Mùi: không có mùi lạ. - Cấu trúc: bột mịn, không bị hút ẩm. - Độ ẩm: 10% - Hoạt độ: 10000-30000 U/g - Nhiệt độ hoạt động: 40-550C, tối ưu ở 500C - pH hoạt động: 4-10, tối ưu ở 5-6  Xylanase NCB – X50: Hình 26: Sản phẩm xylanase NCB-X50  Cảm quan: - Dạng bột: bột màu vàng sáng. - Dạng lỏng: dung dịch màu đỏ nâu.  Hoạt tính: 5000 IU/g (ml) Hoạt tính được xác định: ở nhiệt độ 500C, pH 6.5, thủy phân xylan của lúa mạch (10 mg/ml) để giải phóng 1 µmol đường khử (xylose) trong 1 phút . Lượng enzyme sử dụng là IU  pH hoạt động: 5 – 7  Nhiệt độ hoạt động: 30 – 500C 27 IV. THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ: 1. Sản xuất xylanase bằng Aspergillus niger đột biến: a. Giới thiệu: Rất nhiều vi sinh vật , gồm có vi khuẩn, nấm men và nấm sợi, đã được nghiên cứu để sản xuất xylanase, trong đó nấm mốc là nguồn sản xuất có tiềm năng nhất. Trong quy mô sản xuất công nghiệp, xylanase được sản xuất chủ yếu bằng Aspergillus và Trichoderma. Xylanase đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: đồ uống, trích ly dầu… nhưng những năm gần đây, xylanase cũng đang được nghiên cứu trong ngành công nghiệp sản xuất giấy. Do đó, đòi hỏi nhu cầu tăng hiệu suất xylanase và giảm giá thành. Người ta đã nghiên cứu sản xuất xylanase bằng Aspergillus niger KK2 cho hiệu suất sản xuất vượt trội . b. Phương pháp thực hiện:  Vi sinh vật: Nấm Aspergillis niger KK2 đột biến (KFCC 11285, Korean Culture Collection of Microorganisms) được thu nhận từ A.niger KKS (ATCC 201201, Kang et al. 1994). Nấm được nuôi trên môi trường thạch khoai tây dextrose ở 280C trong 7 ngày và bảo quản ở -200C trong glycerol 30%.  Môi trường:  Rơm : 5g  Môi trường nền: g/100g (pH = 7) - CoSO4.7H2O : 0.01 - CuSO4.5H2O : 0.05 - KH2PO4 : 0.5 - Dịch chiết bắp (Corn step liquor-CSL) :1.0 - Dịch chiết nấm men : 0.05  Độ ẩm ban đầu: 65%. Môi trường được hấp tiệt trùng 30 phút ở 1210C. Sau khi làm nguội, cấy giống vào môi trường (5x105 tế bào/g rơm). Nuôi cầy ở 280C trong 5 ngày Sau khi nuôi cấy, thêm vào Erlen 200ml nước cất. Đo pH của hỗn hợp. Sau đó, thêm vào 200ml nước cất rồi ly tâm 10000rpm ở nhiệt độ phòng trong 5 phút để thu enzyme.  Đánh giá hoạt độ enzyme: Hoạt độ xylanase được kiểm tra bằng 1.5ml hỗn hợp phản ứng gồm 0.5ml dung dịch enzyme đã được pha loãng và 1ml birchwood xylan 2% (w/v) trong dung dịch đệm citrate 0.05M (pH 4.8). Hỗn hợp được ủ ở 500C trong 20 phút. Sau đó, xác định đường khử bằng phương pháp dinitrosalicylic acid (Miller 1959) với chất chuẩn là xylose. Một đơn vị hoạt độ của enzyme được định nghĩa là lượng enzyme giải phóng 1 μmol xylose trong 1 phút ở điều kiện trên. 28 c. Kết quả: Tóm lại, Aspergillus niger KK2 là 1 chủng vi sinh vật tiềm năng, được sử dụng cho việc sản xuất xylanase bằng phương pháp lên men bề mặt(SSF). Chủng vi sinh vật này không đòi hỏi lên men trên môi trường mắc tiền, và có thể sử dụng phụ phẩm ngành nông nghiệp . Do đó có thể giảm giá thành sản phẩm. Bảng 2: So sánh khả năng sinh tổng hợp xylanase của các loài 2. Cố định và tinh sạch xylanase của A.niger bằng polymer EudragitTM (L-100 và S-100): a. Giới thiệu: Polymer đã được ứng dụng thành công trong tinh sạch và cố định protein. Tuy nhiên, hai ứng dụng này chưa được ứng dụng đồng thời trong cùng một hệ thống. Nghiên cứu cho thấy rằng xylanase thương phẩm (PectinexTM 3 XL) của A.niger có thể được cố định trên methyl methacrylate, EudragitTM L-100 bằng lực hấp phụ yếu. EudragitTM L-100 được chọn từ 5 polymer khác nhau. Khi xylanase được hấp phụ lên EudragitTM L-100 đồng thời mất hạt tính của cellulase. Do đó, xylanase cố định được ứng dụng đặc biệt trong ngành công nghiệp giấy. b. Nguyên liệu và phương pháp: - PectinexTM 3 XL (sản phẩm của Novo Nordisk Ferment Ltd, Switzerland) có 3 hoạt tính enzyme: xylanase (1500 nkat/ml), cellulase (87.7 nkat/ml) và pectinase (102.7 µkat/ml) - EugraditTM (L-100 và S-100) là sản phẩm của Rohm Pharma GmbH, Weiterstadt, Germany và là một copolymer của methacrylic acid và methyl methacrylate. Tỷ lệ của ester và acid là 1:1 (EudragitTM L-100) và 2:1 (EudragitTM S-100) 29 c. Chuẩn bị dung dịch EudragitTM (L-100 và S-100): Hòa tan 1g EudragitTM L-100 với 40ml nước cất, thêm từ từ dung dịch NaOH 3M đến khi pH tăng đến 11. Sau khi polymer tan hoàn toàn, giảm pH của dung dịch xuống 7 bằng dung dịch HCl 3M và thêm nước cất đến khi thể tích dung dịch là 50ml. Dung dịch được bảo quản ở 40C. EudragitTM S-100 (2% w/v) được chuẩn bị tương tự như trên. d. Cố định xylanase trên EudragitTM (L-100 và S-100): Thêm PectinexTM 3 XL (130 µl – 1070 µl) vào 2.5 ml EudragitTM (L-100 và S-100) 2% và tăng thể tích lên 4ml bằng dung dịch đệm acetate 0.05M, pH 5.5. Sau khi ủ 1h ở 250C, polymer liên kết với enzyme được rửa như mô tả ở trên. Enzyme cố định cũng được rửa bằng NaCl 1M, 50% ethylene glycol và 0.2% Triton X-100. Hòa tan kết tủa trong dung dịch đệm acetate 0.05M, pH 5.5 đến khi thể tích cuối là 4ml. Hoạt độ của enzyme. Theo nghiên cứu, sau khi cố định bằng EudragitTM (L – 100 và S -100), chế phẩm enzyme không còn hoạt tính của cellulase. Enzyme sau khi cố định vẫn còn giữ lại 60% hoạt tính ban đầu. Hình 27: Hoạt độ của xylanase trong kết tủa thu được với những loại polymer khác nhau (*) EudragitTM S -100; (x) EudragitTM L – 100; (o) Aginate; (□) ProtanalTM ester SD-H; (◊) Chitosan Hình 28: Hoạt độ của cellulase trong kết tủa thu được với những loại polymer khác nhau (*) EudragitTM S -100; (x) EudragitTM L – 100; (□) ProtanalTM ester SD-H e. Sản phẩm: Có 2 dạng: - Sản phẩm dạng rắn: được hòa tan trong dung dịch đệm acetate 0.05M, pH 5.5 sau đó đem đi xúc tác. Sau khi xúc tác, thu hồi chế phẩm enzyme bằng cách kết tủa ở pH 4.5 sử dụng đệm acetate 0.05M - Sản phẩm dạng lỏng: được tiến hành xúc tác và thu hồi chế phẩm enzyme như trên. 30 V. PHỤ LỤC Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy: o Nhiệt độ: Là một trong những thông số quan trọng quyết định đến sự thành công của của phương pháp lên men bề mặt. Khi nhiệt độ thấp, quá trình lên men kéo dài. Khi nhiệt độ quá cao, hoạt tính trao đổi chất của vi sinh vật bị giảm và các cấu tử mẫn cảm với nhiệt bị tổn thất. Effect of cultivation temperature on SSF system of Aspergillus niger USM A1 I using PKC as substrate for 7 days. Symbols: xylanase activity and growth Theo kết quả thu được, sự tạo thành enzyme lớn nhất ở xung quanh nhiệt độ (28±3ºC) là 14.4U/g và sự sinh trưởng khoảng 1.8mg glucosamine/g cơ chất. o Hàm ẩm: Nước làm cho cơ chất trương nở và tạo điều kiện cho vi sinh vật sử dụng tốt cơ chất. Tăng lượng ẩm có thể làm cho giảm độ xốp của cơ chất, do đó hạn chế lượng oxy chuyển vào cơ chất Tỷ lệ ẩm thấp dẫn đến giảm sự hòa tan chất dinh dưỡng của cơ chất rắn, độ trương nở thấp hơn và sức căng của nước cũng lớn hơn 31 Effect of moisture content on SSF system of Aspergillus niger USM A1 I at ambient temperature (28±3ºC) for 7 days a) Effect of the ratio (tỉ lệ) between the substrate PKC to added distilled water as moistening agent. b) Effect of other moistening agents used at the moisture ratio of 1:0.75 (pkc: moistening agent) compared to distilled water Symbols: xylanase activity and growth Theo hình (a), tỷ lệ tối ưu giữa PKC và tác nhân ẩm là 1:0.75 với sự sản xuất enzyme là 19.5U/g cơ chất và sự sinh trưởng 1.6mg glucosamine/g cơ chất. Việc nấm sinh trưởng và sản xuất enzyme lớn nhất ở tỷ lệ nước thấp là thuận lợi trong việc giảm lây nhiễm, do hầu hết các loài vi khuẩn không thể sinh trưởng ở hàm ẩm thấp.Ngoài nước cất, các tác nhân ẩm khác là dung dịch muối khoáng và nước máy cũng được kiểm tra. Kết quả thu được ở hình (b), dung dịch muối khoáng và nước máy cho năng suất enzyme cao hơn nước cất và không có sự khác biệt lớn giữa dung dịch muối khoáng và nước máy. Do đó, sử dụng nước máy vì lý do kinh tế o Lượng giống cấy: Nếu lượng giống cấy ít, thời gian thu hồi sản phẩm sẽ kéo dài, năng suất không cao Nếu lượng giống tăng, hoạt độ của xylanase cũng sẽ tăng nhanh dù sự sinh trưởng không tăng nhanh nhưng kéo theo là giai đoạn suy thoái cũng đạt nhanh hơn 32 Effect of inoculum size on the SSF system of Aspergillus niger USM A1 I at ambient temperature (28±3ºC) for 7 days. Inoculum sizes of a) 103, b) 104, c) 105 spores/ml in sterile tap water as moistening agent. Symbols: xylanase activity and growth Theo kết quả thu được, thời gian để thu được hoạt độ enzyme lớn nhất khi sử dụng canh trường giống 103, 104 và 105 tế bào/ml là 12, 8 và 4 ngày tương ứng với năng suất 3.3, 4.4 và 3.6 U/g/ngày. Dựa trên tỷ lệ đó, lượng canh trường giống được chọn là 104 tế bào/ml o Nguồn cacbon thêm vào: 33 Effect of carbon sources supplemented to the SSF system. a) Effect of various carbon sources on growth and xylanase production at 5%(w/w). b) Effect of xylose concentration in the range of 1-9% (w/w). c) Effect of xylose concentration in the range of 0.25-1.0% (w/w). Cultivations were carried out at ambient temperature (28±3ºC) for 7 days . Symbols: xylanase activity and growth Theo hình (a), có một số nguồn cacbon khi thêm vào sẽ kìm hãm sự sản xuất enzyme nhưng cũng có nguồn cacbon thêm vào là chất cảm ứng làm tăng hoạt độ của enzyme so với khi không thêm nguồn cacbon. Trong đó, xylose được xem là chất cảm ứng hữu hiệu cho sự sản xuất xylanase. Kết quả cho thấy khi thêm xylose sẽ cho kết quả tăng 32% so với khi nuôi cấy không thêm xylose Ảnh hưởng của nồng độ xylose lên sự sản xuất xylanase cũng được kiểm tra trong khoảng 1-5% (hình b) và 0.25-1% (hình c). Theo hình b, hoạt độ enzyme cao nhất khi nồng độ xylose là 1% và giảm dần khi nồng độ xylose tăng dần. Sự sinh trưởng của nấm không có sự khác biệt đáng kể nào với sự tăng nồng độ xylose. Hình c cho thấy hoạt độ enzym tăng dần khi tăng nồng độ của xylose. Hoạt độ cao nhất khi nồng độ xylose là 0.75%. Khi nồng độ xylose vượt quá 0.75% thì hoạt độ enzym giảm dần. 34 o Nguồn nitơ thêm vào: Effect of nitrogen sources supplemented to the SSF system a) Effect of various nitrogen sources on growth and xylanase production at 0.075% (w/w) b) Effect of NaNO3 concentration in the range of 0.019-0.15% (w/w) Cultivations were carried out at ambient temperature (28±3ºC) for 7 days Symbols: xylanase activity and growth Theo hình (a), so với khi nuôi cấy không có nguồn Nitơ, sự có mặt của nguồn Nitơ cải thiện sự sản xuất xylanase khoảng 12-46%. Trong những nguồn Nitơ được kiểm tra, NaNO3 được nhận thấy làm tăng sự sản xuất xylanase khoảng 46% so với khi nuôi cấy không thêm nguồn Nitơ Ảnh hưởng của nồng độ NaNO3 giữa 0.018% và 0.15% lên sự sản xuất enzyme thu được trên hình (b). Kết quả thu được cho thấy hoạt độ enzyme thu được là cao nhất 34U/g cơ chất khi nồng độ NaNO3 là 0.075% (w/w) 35 Catalog Number Description Bead size (µ) Sephadex Gel-Filtration Resins G10120 Sephadex G-10 40-120 G15120 Sephadex G-15 40-120 G2550 Sephadex G-25 20-50 G2580 Sephadex G-25 20-80 G25150 Sephadex G-25 50-150 G25300 Sephadex G-25 100-300 G5050 Sephadex G-50 20-50 G5080 Sephadex G-50 20-80 G50150 Sephadex G-50 50-150 G50300 Sephadex G-50 100-300 G7550 Sephadex G-75 20-50 G75120 Sephadex G-75 40-120 G10050 Sephadex G-100 20-50 G100120 Sephadex G-100 40-120 27,121-7 Sephadex G-150 40-120 27,123-3 Sephadex G-200 40-120 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO (1) Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lê Doãn Diên, Hóa sinh công nghiệp, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, 443p (2) Các quá trình công nghệ cơ bản trong sản xuất thực phẩm, khoa kỹ thuật hóa học trường Đại học Bách Khoa, 360p (3) Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương, Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm, Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 152p (4) Y.S.Park, S.W.Kang, J.S.Lee, S.I.Hong, S.W.Kim, Xylanase production in solid state fermentation by Aspergillus niger mutant using statistical experimental designs. (5) Meryam Stadar, Ipsita Roy, Munishwar N. Gupta, Simultaneous purification and immobilization of Aspergillus niger xylanase on the reversibly solube polymer EudragitTM L-100 (6) Rob M.J Nout, Willem M. de Vos, Marcel H. Zwietering, Food fermentation, Wageningen Academic, 324p (7) Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản đại học quốc gia,534p (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14)