Đề tài Sản xuất biodiesel từ vi tảo: kỹ thuật nuôi cấy vi tảo thu lipid

i ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------------------oOo------------------- ĐỒ ÁN MÔN HỌC SẢN XUẤT BIODIESEL TỪ VI TẢO: KỸ THUẬT NUÔI CẤY VI TẢO THU LIPID SVTH: BÙI NGỌC ĐOAN CHIÊU MSSV: 60604048 GVHD: KS. HUỲNH NGUYỄN ANH KHOA Tp HCM, Tháng 6/2010 ii LỜI CÁM ƠN Đồ án môn học Sản xuất biodiesel từ vi tảo: Kỹ thuật nuôi cấy vi tảo thu lipid đƣợc thực hiện từ tháng 2 đến tháng 7/2010. Trong suốt quá trình đó, để hoàn tất tốt các nội dung nghiên cứu, em đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ nhiệt tình và cởi mở. Em xin đƣợc gửi đến: KS. HUỲNH NGUYỄN ANH KHOA, là cán bộ trực tiếp hƣớng dẫn em làm đồ án này, lời cảm ơn sâu sắc và chân thành. Chính nhờ sự hƣớng dẫn tận tình về mặt kiến thức và giúp đỡ về mặt tài liệu học thuật của thầy, em đã hoàn thành tốt các nội dung đề ra. TS. NGUYỄN THỊ HUYỀN, là cán bộ làm việc tại phòng 117B2, lòng biết ơn tri ân. Cô đã luôn tạo không khí thoải mái khi em vào phòng trao đổi học tập, điều đó có tác dụng động viên em rất nhiều. Tập thể quý thầy cô thuộc bộ môn Công nghệ sinh học nói riêng và khoa Kỹ thuật hóa học nói chung lòng biết ơn thật nhiều. Thầy cô là những ngƣời đã cung cấp các kiến thức cơ sở cũng nhƣ chuyên ngành cho em trong suốt quá trình lâu dài làm nền tảng cho những nghiên cứu về sau. iii TÓM TẮT ĐỒ ÁN Thực trạng ô nhiễm môi trƣờng và sự thiếu hụt nguồn năng lƣợng trong tƣơng lai chính là mối quan tâm hàng đầu của các quốc gia hiện nay, và biodiesel đƣợc xem là một giải pháp khả thi nhằm thay thế cho nguồn nhiên liệu diesel dầu hỏa sử dụng cho các phƣơng tiện giao thông vận tải lẫn trong công nghiệp. Trong khi các nguồn nguyên liệu sản xuất biodiesel thông thƣờng: dầu thực vật, mỡ động vật và nguồn dầu mỡ phế thải đều tỏ ra không thể đáp ứng nhu cầu biodiesel trên toàn thế giới, vi tảo lại thể hiện là một đối tƣợng rất tiềm năng cho lĩnh vực này nhờ vào khả năng sản xuất sinh khối lớn và nguồn lipid thu nhận từ các loài vi tảo cũng khá phù hợp để điều chế biodiesel. Tình hình nghiên cứu và áp dụng nuôi cấy vi tảo trên quy mô lớn ngày càng phổ biến trong nhiều lĩnh vực nhƣ: sản xuất thực phẩm chức năng và xử lý môi trƣờng, do đó việc ứng dụng nuôi cấy vi tảo trên các môi trƣờng sửa đổi để nâng cao năng suất lipid phục vụ sản xuất biodiesel là hoàn toàn có khả thi. Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý và sinh hóa của loài vi tảo Nannochloropsis oculata có thể dự đoán đƣợc đây là một loài vi tảo rất phù hợp với mục tiêu sản xuất biodiesel: năng suất sinh khối cao trong môi trƣờng quang tự dƣỡng, hàm lƣợng lipid nhiều và thành phần lipid dễ điều chỉnh theo điều kiện nuôi cấy. Từ đó đề xuất khảo sát các yếu tố môi trƣờng nhằm nuôi cấy Nannochloropsis oculata thu lipid với năng suất cao: môi trƣờng f/2, độ mặn trong khoảng 22-49g NaCl/L, nhiệt độ môi trƣờng 25-27 0 C, chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang ít tỏa nhiệt 400-500µmol/m2s, hạn chế nồng độ nitrogen và phosphorus. iv ABSTRACT Pollution and limitation of energy are the most important concerns of nations, and biodiesel is considered such as a possible solution to replace petroleum diesel, which is used for transportation and industry. While plant oil, animal fat and waste oil which are common for biodiesel production cannot satisfy biodiesel demand all over the world, microalgae express to be an essential candidate for this task due to high yield of biomass and compatible lipid component for biodiesel production. Researchs and applications in microalgae culturing on large scale become more and more common in many fields: functional food production and environment treatment, so using modified medium culture to improve lipid content in microalgae cells is really feasible. Studying in physiological and biochemical characteristics of Nannochloropsis oculata gives suggestion that N. oculata should be a suitable source for biodiesel production: produces high yield of biomass in autotrophic culture, accumulates high lipid content and easily be controlled lipid composition under different conditions. Hence some nutriments factors, temperature and light regimes are proposed to grow N. oculata with high lipid productivity: f/2 medium, salinity at 22-49g NaCl/L, temperature at 25-27 0 C, irradiance at 400-500µmol/m 2 s with cool white fluorescent tubes, limited nitrogen and phosphorus concentrations. v MỤC LỤC Đề mục Trang LỜI CÁM ƠN .....................................................................................................ii TÓM TẮT ĐỒ ÁN ............................................................................................ iii MỤC LỤC .......................................................................................................... v DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................... vii DANH SÁCH HÌNH .......................................................................................... ix DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ............................................................................. x 1. TỔNG QUAN VỀ BIODIESEL ................................................................... 1 1.1. Định nghĩa các dạng năng lƣợng và biodiesel ......................................... 1 1.1.1. Năng lƣợng không tái sinh ............................................................... 1 1.1.2. Năng lƣợng tái sinh ......................................................................... 2 1.2. Tầm quan trọng của biodiesel và khả năng thay thế cho nguồn nhiên liệu hóa thạch ......................................................................................................... 4 1.3. Nguyên tắc điều chế và nhu cầu về lipid trong sản xuất biodiesel ........... 7 1.4. Các nguồn nguyên liệu giàu lipid phục vụ cho việc sản xuất biodiesel và tiềm năng của vi tảo ........................................................................................ 9 2. NĂNG SUẤT LIPID VÀ ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG LÊN SỰ TÍCH LŨY LIPID CỦA MỘT SỐ LOÀI VI TẢO ........................................ 15 2.1. Các loại vi tảo có chứa nhiều lipid ........................................................ 15 2.2. Một số nghiên cứu về ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng lên sự tích lũy lipid ở vi tảo ............................................................................................ 16 2.2.1. Yếu tố nhiệt độ .............................................................................. 16 2.2.2. Yếu tố thành phần môi trƣờng ....................................................... 19 3. NUÔI VI TẢO NANNOCHLOROPSIS OCULATA THU LIPID NHẰM SẢN XUẤT BIODIESEL ................................................................................ 25 3.1. Nannochloropsis oculata ...................................................................... 25 3.1.1. Phân loại ........................................................................................ 25 3.1.2. Đặc điểm hình thái......................................................................... 25 vi 3.1.3. Đặc điểm sinh lý ............................................................................ 26 3.1.4. Đặc điểm sinh hóa ......................................................................... 26 3.2. Đề xuất mô hình thí nghiệm nghiên cứu sự tích lũy lipid theo điều kiện môi trƣờng ở Nannochloropsis oculata ......................................................... 27 3.2.1. Yếu tố nhiệt độ .............................................................................. 27 3.2.2. Yếu tố ánh sáng ............................................................................. 32 3.2.3. Yếu tố độ mặn ............................................................................... 36 3.2.4. Yếu tố thành phần môi trƣờng ....................................................... 38 4. KẾT LUẬN.................................................................................................. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 51 vii DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. 1: Các acid béo thƣờng có trong các nguồn nguyên liệu dùng sản xuất biodiesel .............................................................................................................. 9 Bảng 1. 2: So sánh vi tảo với các nguồn nguyên liệu sản xuất biodiesel ............ 11 Bảng 1. 3: So sánh các thuộc tính giữa dầu từ vi tảo, diesel thông thƣờng và tiêu chuẩn ASTM biodiesel [28]............................................................................... 12 Bảng 2. 1: Hàm lƣợng và năng suất lipid của các loài tảo khác nhau ................. 15 Bảng 2. 2: Sự sinh trƣởng và sản xuất lipid của C. vulgaris tại các nhiệt độ khác nhau [5] ............................................................................................................. 17 Bảng 2. 3: Năng suất sinh khối và năng suất lipid của Botryococcus braunii, Chlorella vulgaris và Scenedesmus sp. khi nuôi ở 10% CO2 trong 14 ngày ....... 20 Bảng 2. 4: Thành phần các acid béo của Botryococcus braunii, Chlorella vulgaris và Scenedesmus sp. khi nuôi cấy ở 10% CO2 trong 14 ngày................. 21 Bảng 2. 5: Tham số sinh trƣởng và sự sản xuất lipid của C. vulgaris ở các nồng độ NaNO3 khác nhau ......................................................................................... 23 Bảng 3. 1: Sự sinh trƣởng và sản xuất lipid của N. oculata tại các nhiệt độ khác nhau .................................................................................................................. 28 Bảng 3. 2: Thành phần acid béo (%w/w acid béo tổng) của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các nhiệt độ khác nhau ........................................................ 30 Bảng 3. 3: Sản lƣợng sinh khối và thành phần hợp chất hóa sinh của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các nhiệt độ khác nhau ....................... 31 Bảng 3. 4: Sản lƣợng sinh khối và hàm lƣợng lipid của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các độ mặn khác nhau ............................................................... 36 Bảng 3. 5: Thành phần acid béo (%w/w TFA) của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các độ mặn khác nhau ........................................................................ 37 Bảng 3. 6: Năng suất sinh khối và lipid của N. oculata trong hệ thống nuôi cấy bán liên tục với các hàm lƣợng CO2 khác nhau .................................................. 41 Bảng 3. 7: Tham số sinh trƣởng và sự sản xuất lipid của N. oculata ở các nồng độ NaNO3 khác nhau .............................................................................................. 42 Bảng 3. 8: Sản lƣợng sinh khối và thành phần hợp chất hóa sinh của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các nồng độ NaNO3 khác nhau .......... 44 viii Bảng 3. 9: Thành phần acid béo (%w/w TFA) của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các nồng độ NaNO3 khác nhau .......................................................... 44 Bảng 3. 10: Sản lƣợng sinh khối và thành phần hợp chất hóa sinh của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các nồng độ NaH2PO4 khác nhau ....... 46 Bảng 3. 11: Thành phần acid béo (%w/w TFA) của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các nồng độ NaH2PO4 khác nhau .............................................. 47 ix DANH SÁCH HÌNH Hình 1. 1: Sự hình thành các lớp nhiên liệu hóa thạch ......................................... 1 Hình 1. 2: Các dạng năng lƣợng tái sinh .............................................................. 2 Hình 1. 3: Bảng thống kê sử dụng các nguồn năng lƣợng .................................... 3 Hình 1. 4: Phản ứng chuyển vị ester .................................................................... 7 Hình 2. 1: Phần trăm các loại FAME trên tổng lƣợng FAME (g/100gFAME) của C. vulgaris tại các nhiệt độ sinh trƣởng khác nhau ................................................. 17 Hình 2. 2: Phần trăm các loại FAME trên tổng lƣợng FAME (g/100gFAME) của C. vulgaris tại các nồng độ NaNO3 khác nhau........................................................ 23 Hình 3. 1: Thành phần acid béo các lipid chính trong Nannochloropsis sp. ....... 27 Hình 3. 2: Phần trăm các loại acid béo methyl ester trên tổng lƣợng acid béo methyl ester (g/100gFAME) của N. oculata tại các nhiệt độ khác nhau ................. 29 Hình 3. 3: Ảnh hƣởng của mức độ chiếu sáng trên sự sinh trƣởng của tế bào và hàm lƣợng chlorophyll a đối với Nannochloropsis sp. ...................................... 33 Hình 3. 4: Sự phân phối các acid béo chính trong Nannochloropsis sp. đƣợc nuôi cấy theo mẻ dƣới ảnh hƣởng của mức độ chiếu sáng ......................................... 33 Hình 3. 5: Thành phần acid béo của Nannochloropsis sp. khi nuôi cấy trong điều kiện ổn định liên tục tại ba mức độ chiếu sáng................................................... 35 Hình 3. 6: Ảnh hƣởng nồng độ khí CO2 lên sự sinh trƣởng của N. oculata ........ 39 Hình 3. 7: Sự sinh trƣởng của N. oculata khi nuôi cấy bán liên tục trong môi trƣờng sục khí có chứa 2%, 5%, 10%, 15% CO2 ............................................... 40 Hình 3. 8: Phần trăm các loại FAME trên tổng lƣợng FAME (g/100gFAME) của N. oculata tại các nồng độ NaNO3 khác nhau ......................................................... 43 x DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT DW: dry weight khối lƣợng khô FAME: fatty acid methyl ester ester của acid béo và methyl f/2AW: f/2 artificial seawater môi trƣờng f/2 nƣớc biển nhân tạo EPA: eicosapentaenoic acid acid ω3 (C20:5) PUFA: polyunsatured fatty acid acid béo chƣa no mang nhiều nối đôi TFA: total fatty acid hàm lƣợng acid béo tổng v/v: volume/volume thể tích/thể tích vvh: volume/ volume/hour thể tích/thể tích/giờ vvm: volume/ volume/minute thể tích/thể tích/phút w/w: weight/weight khối lƣợng/khối lƣợng 1. TỔNG QUAN VỀ BIODIESEL 1 1. TỔNG QUAN VỀ BIODIESEL 1.1. Định nghĩa các dạng năng lƣợng và biodiesel 1.1.1. Năng lƣợng không tái sinh Nguồn năng lƣợng không tái sinh là những nguồn năng lƣợng thiên nhiên mà con ngƣời không có khả năng can thiệp vào sự hình thành cũng nhƣ quá trình tích lũy. Đó là dạng năng lƣợng không thể phục hồi, không thể tái tạo, hay không thể tái sử dụng. Tuy nhiên dạng năng lƣợng này đang đƣợc sử dụng trên phạm vi rộng lớn khắp toàn cầu, và cho thấy rằng không thể đáp ứng đƣợc nhu cầu sử dụng của con ngƣời trong tƣơng lai. Năng lƣợng không tái sinh đƣợc chia thành hai nhóm: năng lƣợng hóa thạch và năng lƣợng hạt nhân. - Năng lượng hóa thạch: là dạng năng lƣợng đƣợc hình thành dựa trên các quá trình địa chất dài hàng triệu năm xảy ra đối với xác động thực vật, nhƣ một dạng hóa thạch. Bao gồm than đá, dầu mỏ và khí thiên nhiên. Do quá trình hình thành lâu dài nhƣ vậy, nên khi bị con ngƣời khai thác hết sẽ không có khả năng phục hồi đƣợc. Một trong số các nhiên liệu hóa thạch ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi là diesel. Diesel là một loại nhiên liệu lỏng, là sản phẩm thuộc phân đoạn nhẹ của quá trình chƣng cất trực tiếp dầu mỏ với khoảng nhiệt độ sôi ở áp suất khí quyển từ 250 đến 3500C (cao hơn dầu hỏa và xăng) bao gồm các hydrocarbon khác nhau từ C14 đến C20. Nhiên liệu diesel đƣợc sử dụng chủ yếu cho động cơ diesel và một phần đƣợc sử dụng trong các tuabin cơ khí. Hình 1. 1: Sự hình thành các lớp nhiên liệu hóa thạch 1. TỔNG QUAN VỀ BIODIESEL 2 - Năng lượng hạt nhân: là dạng năng lƣợng đƣợc hình thành do khả năng phóng xạ của một vài nguyên tố. Có hai kiểu phản ứng hình thành nên năng lƣợng hạt nhân, đó là phản ứng phân hạch và phản ứng nhiệt hạch. 1.1.2. Năng lƣợng tái sinh Năng lƣợng tái sinh là dạng năng lƣợng thu đƣợc từ các nguồn mà con ngƣời xem là vô hạn. Sự vô hạn ở đây ngoài ý nghĩa nhiều đến mức không thể cạn kiệt, nên đƣợc hiểu theo nghĩa rộng hơn đó là có khả năng tái tạo trong một thời gian ngắn và liên tục. Dạng năng lƣợng này bao gồm: - Năng lƣợng mặt trời - Năng lƣợng gió - Năng lƣợng sóng - Năng lƣợng thủy triều - Năng lƣợng địa nhiệt - Năng lƣợng sinh khối Hình 1. 2: Các dạng năng lƣợng tái sinh Nguồn năng lƣợng tái sinh đang đƣợc sử dụng nhiều nhất là thủy năng. Song, nguồn năng lƣợng sinh khối cũng là một trong những nguồn đƣợc con ngƣời khai thác và sử dụng hiệu quả. Sinh khối đƣợc xem là nguồn năng lƣợng lớn thứ tƣ, ƣớc tính chiếm khoảng 14-15% tổng lƣợng năng lƣợng tiêu thụ trên 1. TỔNG QUAN VỀ BIODIESEL 3 thế giới. Ở các nƣớc đang phát triển, sinh khối thƣờng là nguồn năng lƣợng lớn nhất, trung bình đóng góp khoảng 35% trong tổng cung cấp năng lƣợng. Vì vậy, trong chiến lƣợc sử dụng các nguồn năng lƣợng cách hiệu quả thì năng lƣợng sinh khối luôn đƣợc xem là ƣu tiên hàng đầu và mang tính quyết định trong việc đáp ứng nhu cầu năng lƣợng của thế giới trong tƣơng lai [1]. Hiện nay, theo thuật ngữ về nhiên liệu, thì sinh khối (biomass) đƣợc xem là nhiên liệu ở dạng rắn, nhiên liệu sinh học (biofuel) là những nhiên liệu dƣới dạng lỏng thu nhận từ sinh khối và cuối cùng khí sinh học (biogas) là sản phẩm của quá trình phân giải yếm khí các chất hữu cơ [1]. Hai dạng nhiên liệu sinh học phổ biến nhất đó là biodiesel và bio-ethanol, là hai dạng nhiên liệu tƣơng ứng có thể thay thế đƣợc cho diesel và gasoline mà không cần cải tiến nhiều hoặc không cần cải tiến động cơ các phƣơng tiện giao thông cũng nhƣ máy móc sản xuất. Chúng đƣợc sản xuất chủ yếu từ sinh khối hay các nguồn năng lƣợng tái sinh khác và góp phần giảm thiểu khí thải từ việc đốt cháy nhiên liệu so với nhiên liệu hóa thạch tính trên cùng một đơn vị hiệu suất [80]. - Định nghĩa Biodiesel Biodiesel là hỗn hợp các alkyl monoesters thu nhận đƣợc từ quá trình chuyển vị ester dầu thực vật và mỡ động vật [80], có khả năng thay thế cho diesel từ dầu mỏ. Hình 1. 3: Bảng thống kê sử dụng các nguồn năng lƣợng 1. TỔNG QUAN VỀ BIODIESEL 4 1.2. Tầm quan trọng của biodiesel và khả năng thay thế cho nguồn nhiên liệu hóa thạch Gần đây, con ngƣời đang quan tâm đến hai vấn đề quan trọng, đó là môi trƣờng và sự khủng hoảng năng lƣợng. Đối với môi trƣờng, sự nóng dần lên của trái đất chính là tâm điểm. Mọi ngƣời đều biết rằng sử dụng nhiên liệu hóa thạch chính là nguyên nhân gây ra sự nóng dần lên của toàn cầu, vì vậy nguồn năng lƣợng sạch và có khả năng tái sinh sản xuất từ sinh khối nhằm thay thế cho nhiên liệu hóa thạch là rất cấp thiết để giảm thải CO2. Ngoài ra, sự khủng hoảng năng lƣợng khiến cho giá dầu thô trên thế giới ngày càng tăng, ảnh hƣởng đến tình hình năng lƣợng sử dụng trong gia đình cũng nhƣ trong khu vực [67]. Xét trên lĩnh vực môi trƣờng, giao thông vận tải và sản xuất công nghiệp là những nguồn thải chủ yếu của con ngƣời. Khảo sát tại liên minh Châu Âu, ngƣời ta nhận thấy có đến 20% khí thải nhà kính là do giao thông vận tải và 60% khí thải nhà kính xuất phát từ các khu công nghiệp [20]. Nông nghiệp là nguồn thải lớn thứ ba, tƣơng ứng khoảng 9% khí thải nhà kính, trong đó quan trọng nhất là các khí nitrous oxide N2O và khí methane CH4 [21]. Theo dự đoán, sự phát triển của các nền kinh tế mới đang tăng trƣởng nhƣ Ấn Độ và Trung Quốc sẽ làm gia tăng sự tiêu thụ năng lƣợng trên toàn cầu, dẫn đến thêm nhiều mối nguy hại cho môi trƣờng [35]. Khí nhà kính không chỉ góp phần gây ra hiện tƣợng nóng dần lên của trái đất mà còn gây ra nhiều ảnh hƣớng khác tới môi trƣờng và đời sống nhân loại. Các đại dƣơng hấp thụ khoảng một phần ba lƣợng CO2 thải ra mỗi năm do các hoạt động của con ngƣời. Khi nồng độ CO2 tăng lên trong không khí, lƣợng hòa tan trong nƣớc biển cũng tăng, dẫn đến giảm pH và nƣớc biển có tính acid hơn. Sự giảm pH là một điều kiện bất lợi có thể gây ra những hủy hoại nhanh chóng đối với các rặng san hô cũng nhƣ sự đa dạng sinh thái đại dƣơng, vốn có quan hệ to lớn trong đời sống các sinh vật đại dƣơng và trên cạn [55]. Chính sự nóng dần lên của trái đất đã, đang và sẽ tiếp tục ảnh hƣởng đến nhiều khía cạnh khác nhau của đời sống nhân loại và môi trƣờng trên toàn cầu, chúng ta cần không phải chỉ riêng lẻ một mà là một loạt các giải pháp để có thể cải thiện và khắc phục vấn đề bức bách này [40]. Xét trên lĩnh vực khủng hoảng năng lƣợng, sự sụt giảm nguồn nguyên liệu dầu thô dự trữ và những khó khăn trong việc trích ly và tinh luyện chúng dẫn đến sự gia tăng về giá thành [40]. Đây thực sự là những trở ngại lớn đối với vấn đề giao thông 1. TỔNG QUAN VỀ BIODIESEL 5 vận tải, vì cho tới hiện nay vẫn chƣa tìm ra đƣợc nguồn nguyên liệu nào có thể thay thế cho nguồn nguyên liệu hóa thạch với giá thành tƣơng đƣơng [80]. Tìm kiếm những nguồn nguyên liệu sạch và có khả năng tái sinh là một trong những vấn đề thách thức nhất mà con ngƣời đang phải đối mặt trong hiện tại lẫn về lâu dài. Đây là vấn đề liên quan mật thiết với sự phát triển kinh tế và sự thịnh vƣợng cũng nhƣ chất lƣợng cuộc sống, sự bền vững toàn cầu do đó đòi hỏi các nhà đầu tƣ phải có những quyết định lâu bền và những giải pháp dài hạn [80]. Hiện nay, nhiều lựa chọn đang đƣợc nghiên cứu và đƣa vào thực nghiệm, đã đạt đƣợc những mức độ thành công khác nhau trong các giai đoạn nghiên cứu và thực nghiệm khác nhau, bao gồm các nguồn năng lƣợng nhƣ năng lƣợng mặt trời, bao gồm cả nhiệt năng và quang năng, thủy điện, địa nhiệt, gió, nhiên liệu sinh học, và sự cô lập carbon, cùng những loại khác [19, 27]. Mỗi loại đều có những ƣu điểm cũng nhƣ những vấn đề vƣớng mắc, tùy thuộc vào khu vực áp dụng, những điều kiện khác nhau sẽ có mức độ phù hợp tốt hơn đối với từng loại phƣơng pháp. Mục tiêu quan trọng đó là giảm thiểu các khí thải từ các phƣơng tiện chuyên chở, nhƣ là thay thế dần từng bƣớc một nguồn nguyên liệu hóa thạch bằng những nguồn nguyên liệu tái sinh, trong đó nhiên liệu sinh học đƣợc xem là một cộng tác viên thực sự để đạt đƣợc những mục tiêu đó, đặc biệt trong tƣơng lai gần [80]. Trái đất nóng dần lên, do sự gia tăng nồng độ của khí nhà kính trong không khí, đã và đang là mối lo ngại quan trọng nhất về môi trƣờng [85]. Giảm bớt sự hình thành CO2 trong khí quyển, nhiệm vụ hàng đầu của việc làm giảm hiệu ứng nhà kính, có thể thực hiện bởi ba phƣơng pháp sau [6]: - Giảm bớt sử dụng nhiên liệu hóa thạch - Loại bỏ CO2 trong khí quyển - Thu hồi và cô lập hoặc tận dụng CO2 từ việc đốt nhiên liệu hóa thạch trƣớc khi nó đƣợc thải ra môi trƣờng. Sản xuất nhiên liệu sinh học có thể đem lại những cơ hội mới góp phần gia tăng sự đa dạng về các nguồn thu nhập cũng nhƣ các nguồn cung cấp năng lƣợng, cụ thể là đẩy mạnh việc làm ở các vùng nông thôn, phát triển sự thay thế dài hạn đối với nguồn nhiên liệu hóa thạch, và giảm bớt lƣợng khí thải nhà kính, đẩy mạnh việc loại bỏ Carbon từ các nhiên liệu vận tải và nâng cao sự an toàn trong việc cung cấp nhiên liệu [80]. 1. TỔNG QUAN VỀ BIODIESEL 6 Tìm kiếm những nguồn nguyên liệu thay thế đang là vấn đề nóng bỏng đối với nhiều nƣớc, đặc biệt là những nƣớc thiếu các nguồn tài nguyên năng lƣợng thông thƣờng. Vào những thập niên 1930 và 1940, dầu thực vật đã đƣợc sử dụng nhƣ là nhiên liệu diesel trong những trƣờng hợp khẩn cấp. Trong những năm gần đây, khi nền công nghiệp hiện đại phát triển ngày một rộng rãi và quy mô, nhu cầu về năng lƣợng đã gia tăng đột biến, vì vậy những nguồn năng lƣợng thay thế đang đƣợc thăm dò và nghiên cứu ráo riết. Trong tổng số các động cơ phƣơng tiện hiện nay, tỷ lệ phƣơng tiện sử dụng nhiên liệu diesel ngày càng phổ biến và đƣợc sử dụng nhiều hơn. Thêm vào đó, động cơ diesel cũng đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp [75]. Vì vậy, nhiên liệu diesel là nguồn sử dụng lớn nhất trong số các nhiên liệu dầu mỏ sử dụng cho động cơ, và tỷ lệ này tăng lên liên tục ngày qua ngày [11]. Từ đó, nhu cầu đối với biodiesel càng trở nên cấp thiết, và thuật ngữ “biodiesel” xuất hiện một cách thƣờng xuyên trong các bài báo cáo gần đây [24]. Biodiesel đƣợc sản xuất từ sinh khối dầu (biomass oils), chủ yếu là từ dầu thực vật. Biodiesel trở thành nguồn năng lƣợng đáng đƣợc chú ý vì những lý do nhƣ sau. - Thứ nhất, biodiesel là nguồn năng lƣợng tái sinh có thể đáp ứng cung và cầu. Ngƣời ta đã ƣớc tính đƣợc rằng lƣợng dầu mỏ dự trữ sẽ hoàn toàn cạn kiệt trong vòng 50 năm trở lại tính theo mức tiêu thụ hiện nay [70]. - Thứ hai, biodiesel cho thấy thân thiện với môi trƣờng hơn các loại nhiên liệu hóa thạch. Sử dụng biodiesel không làm gia tăng lƣợng khí thải carbon dioxide nhƣng lại có hàm lƣợng các khí sulfur thấp hơn hẳn [4, 82]. Thành phần khí thải sulfur và carbon monoxide giảm thiểu lần lƣợt là 30% và 10% khi sử dụng biodiesel. Lƣợng khí tạo thành trong quá trình đốt cháy nhiên liệu có thể ít lại, và sự giảm bớt carbon monoxide là nhờ vào hàm lƣợng oxygen cao có trong biodiesel. Hơn nữa, biodiesel không chứa các hợp chất dễ bay hơi và các hợp chất hóa học khác gây hại cho môi trƣờng. Gần đây, các cuộc điều tra cho thấy rằng sử dụng biodiesel giảm thiểu đƣợc 90% chất độc hại trong không khí và 95% các bệnh ung thƣ khi so sánh với diesel thông thƣờng [69]. - Thứ ba, biodiesel đem lại tiềm năng kinh tế đáng kể bởi vì trong tƣơng lai, các dạng năng lƣợng không tái sinh nhƣ nhiên liệu hóa thạch sẽ ngày một gia tăng giá thành là một điều không thể tránh khỏi [10]. - Cuối cùng, biodiesel tốt hơn diesel thông thƣờng ở nhiệt độ phát cháy và khả năng phân hủy sinh học [45]. 1. TỔNG QUAN VỀ BIODIESEL 7 Nguồn sinh khối không những sẽ trở thành nguồn cung cấp năng lƣợng bền vững mà còn góp phần vào cuộc sống xã hội trong khu vực nhờ giúp gia tăng các hoạt động thƣơng mại và tạo nhiều cơ hội việc làm cho nông dân. Vi tảo, thu nhận dƣới dạng sinh khối, là một nguồn năng lƣợng tái sinh rất tiềm năng, và chúng có thể đƣợc chuyển hóa thành năng lƣợng dƣới dạng nhiên liệu sinh học bao gồm dầu và gas. Vì vi tảo có hàm lƣợng nƣớc nhiều, do đó không phải toàn bộ lƣợng sinh khối có thể áp dụng thành năng lƣợng. Sử dụng phƣơng pháp nhiệt hóa học có thể sản xuất ra dầu và gas, và bằng các phƣơng pháp hóa sinh để sản xuất ra ethanol và biodiesel. Sản phẩm từ vi tảo có các đặc tính tƣơng tự nhƣ các sản phẩm từ dầu thực vật và dầu cá, vì vậy, nó có thể thay thế đƣợc cho dầu mỏ [67]. 1.3. Nguyên tắc điều chế và nhu cầu về lipid trong sản xuất biodiesel Biodiesel là hỗn hợp các ester giữa acid béo và alkyl thu đƣợc thông qua quá trình chuyển vị ester của dầu thực vật hay mỡ động vật. Nguồn nguyên liệu lipid dầu thực vật hay mỡ động vật bao gồm 90-98% khối lƣợng là các triglyceride và một lƣợng nhỏ các mono và diglyceride, acid béo tự do chiếm khoảng 1-5%, phần còn lại là các phospholipid, phosphatide, carotene, tocopherol, hợp chất sulphur, và một ít nƣớc [7]. Chuyển vị ester là một phản ứng phức tạp, bao gồm ba bƣớc chuyển đổi liên tiếp: triglyceride đƣợc chuyển hóa thành diglyceride, sau diglyceride chuyển hóa thành monoglyceride,và monoglyceride sẽ chuyển hóa thành các ester (biodiesel) và glycerol (phụ phẩm). Phản ứng chuyển vị ester tổng quát đƣợc mô tả trong hình sau, trong đó R1, R2, R3 tƣợng trƣng cho các hydrocarbon mạch dài, chính là các acid béo [80]. Hình 1. 4: Phản ứng chuyển vị ester 1. TỔNG QUAN VỀ BIODIESEL 8 Trong phản ứng chuyển vị ester, tác nhân phản ứng là dầu hay mỡ cùng các alcohol có mạch carbon ngắn (thƣờng là methanol), có sự hiện diện của chất xúc tác (thƣờng là NaOH). Mặc dù tỷ lệ phân tử gam giữa alcohol : dầu theo lý thuyết là 3:1 nhƣng thông thƣờng ngƣời ta áp dụng theo tỷ lệ 6:1 để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Mối quan hệ giữa nguyên liệu đầu vào và sản phẩm biodiesel đầu ra đạt tỷ lệ khoảng 1:1, nghĩa là theo lý thuyết, 1kg dầu sẽ tạo ra đƣợc 1 kg biodiesel [80]. Có thể sử dụng chất xúc tác đồng thể hay dị thể, acid, base hoặc enzyme lipase để tăng mức độ phản ứng chuyển vị ester, mặc dù đối với vài quá trình sử dụng các chất lỏng siêu tới hạn (methanol hoặc ethanol) có thể không cần dùng đến các chất xúc tác [84]. Trong công nghiệp, thƣờng sử dụng nhất là các chất xúc tác đồng thể có tính kiềm (ví dụ nhƣ NaOH hay KOH) trong các bình phản ứng có khuấy đảo, thực hiện theo mẻ [80]. Các phản ứng chuyển vị ester đƣợc xúc tác bởi các chất có tính kiềm có tốc độ phản ứng nhanh hơn 4000 lần so với xúc tác bởi acid [25]. Trong phân tử triglyceride, khối lƣợng glycerol là khoảng 41 g/mol, trong khi khối lƣợng các gốc acid béo dao động từ 650-790 g/mol. Chính thành phần các gốc acid béo tạo ra các nhóm hoạt động trong phân tử glyceride, và chúng có tầm ảnh hƣởng đáng kể đến tính chất của dầu thực vật và mỡ động vật [11]. Trong quá trình sản xuất biodiesel, ngƣời ta có thể sử dụng nguồn lipid từ dầu thực vật, mỡ động vật hoặc các loại dầu thải. Tuy nhiên, để sản xuất biodiesel đạt chuẩn nhiên liệu, tính chất của nguồn nguyên liệu rất quan trọng, ngay từ quá trình nghiên cứu ban đầu cho tới giai đoạn sản xuất, vì chất lƣợng của biodiesel phụ thuộc vào chất lƣợng nguồn nguyên liệu [11]. Những nguồn nguyên liệu giàu các acid béo chƣa bão hòa chứa nhiều nối đôi (polyunsaturated) thì dễ mắc phải quá trình oxy hóa hơn các nguồn lipid có nhiều acid béo bão hòa hay chỉ có một nối đôi trong mạch (monounsaturated) [11]. Tuy nhiên, biodiesel từ nguồn nguyên liệu chứa một lƣợng lớn các acid béo bão hòa sẽ có nhiệt độ điểm sƣơng (nhiệt độ biodiesel bắt đầu xuất hiện tinh thể) và nhiệt độ dòng chảy (nhiệt độ thấp nhất mà biodiesel vẫn có thể bơm và chảy đƣợc trong ống dẫn) cao. Thực tế cho thấy, biodiesel từ dầu thực vật có nhiệt độ điểm sƣơng và nhiệt độ dòng chảy thấp hơn biodiesel từ mỡ động vật [11]. Nếu nguồn nguyên liệu lipid chứa một lƣợng lớn các acid béo tự do và nƣớc thì quá trình chuyển vị ester sẽ gặp nhiều khó khăn vì chúng không thể chuyển hóa đƣợc thành biodiesel thông qua phản ứng xúc tác với kiềm. Đây là vấn đề vƣớng 1. TỔNG QUAN VỀ BIODIESEL 9 mắc khi sử dụng dầu đã qua chế biến, dầu thải nhà hàng, dầu cặn, mỡ động vật làm nguồn nguyên liệu sản xuất biodiesel dù đây là những nguồn nguyên liệu có giá thành rẻ [11]. Thành phần ester phổ biến nhất trong biodiesel là ester của các acid palmitic, acid stearic, acid oleic, acid linoleic và acid linolenic. Các loại nguyên liệu nhƣ đậu nành, hoa hƣớng dƣơng, hạt cải dầu (canola), cọ và lạc có thành phần lipid khá phù hợp nhƣ trên [26]. Trong số đó, methyl oleate đƣợc xem là thành phần chính lý tƣởng để sản xuất biodiesel. Một số ester khác nhƣ methyl palmitoleic cũng có những ƣu điểm, khi so với methyl oleate thì trội hơn về nhiệt độ đông đặc thấp [26]. Bảng 1. 1: Các acid béo thƣờng có trong các nguồn nguyên liệu dùng sản xuất biodiesel [26] 1.4. Các nguồn nguyên liệu giàu lipid phục vụ cho việc sản xuất biodiesel và tiềm năng của vi tảo Thông thƣờng, biodiesel chủ yếu đƣợc sản xuất từ dầu của đậu nành và các loại rau quả [9], cọ [2], hoa hƣớng dƣơng [4], hạt cây cải dầu [58] cũng nhƣ dầu phế thải từ các nhà hàng [8]. Số lƣợng nguyên tử carbon trong chuỗi mạch carbon của phân tử dầu diesel vào khoảng 15C, và điều này gần nhƣ tƣơng ứng với dầu thực vật với chuỗi carbon vào khoảng 14-18C. Các đặc điểm về cấu trúc của biodiesel cho thấy rằng biodiesel có thể ứng dụng để thay thế đƣợc cho năng lƣợng thông thƣờng. Hiện tại, giá thành của biodiesel thì cao gấp 2 lần so với diesel thƣờng. Chi phí sản xuất biodiesel bao gồm 2 phần chính, đó là chi phí cho nguồn nguyên liệu thô (dầu thực vật và mỡ động vật) và chi phí quá trình. Chi phí cho nguồn nguyên liệu thô chiếm khoảng 60-75% tổng chi phí nhiên liệu biodiesel [39]. Dù vậy, vẫn có thể tìm đƣợc một lƣợng lớn dầu mỡ giá thành thấp từ các chế phẩm phế thải nhà 1. TỔNG QUAN VỀ BIODIESEL 10 hàng và từ động vật [30], vấn đề chính khi sử dụng những nguồn dầu mỡ này đó là chúng thƣờng chứa nhiều acid béo tự do gây khó khăn cho quá trình sản xuất biodiesel thông qua quá trình chuyển vị ester [17]. Nguồn nguyên liệu thô có tỷ lệ triglyceride cao thì phù hợp hơn. Ví dụ nhƣ dầu thực vật là loại nguyên liệu có tỷ lệ triglyceride rất cao, do đó nó đƣơc sử dụng để sản xuất biodiesel trong vài năm qua [18]. Tuy nhiên, dầu thực vật còn là nguồn tiêu thụ của con ngƣời. Vì vậy sử dụng dầu thực vật sản xuất biodiesel có thể làm cho giá thành dầu thực vật dùng trong thực phẩm tăng cao, từ đó dẫn đến giá thành biodiesel cao và ngƣời tiêu dùng hạn chế sử dụng dù rằng biodiesel có nhiều ƣu điểm hơn so với diesel [80]. Dầu thực vật đƣợc sử dụng trong nhiều mục đích thƣơng mại và khả năng cung ứng dầu thực vật cho việc sản xuất biodiesel thì không thể đáp ứng nổi tiềm năng thƣơng mại của biodiesel trên một khu vực. Một ví dụ cụ thể đó là để đáp ứng đƣợc 10% chỉ tiêu tại EU từ việc sản xuất quy mô hộ gia đình, thì nguồn nguyên liệu thực sự cung cấp không đủ cho nhu cầu hiện tại, và sự đòi hỏi về diện tích canh tác thì vƣợt xa tiềm năng phát triển đất trồng đối với các loại cây trồng sản xuất năng lƣợng sinh học [68]. Mở rộng trồng trọt, áp lực trong sự thay đổi sử dụng đất trồng và sự gia tăng các cánh đồng canh tác có thể dẫn tới cạnh tranh đất đai và làm mất đi sự đa dạng sinh học do sự lấn chiếm rừng và các vùng sinh thái quan trọng [64]. Biodiesel sẽ không còn đƣợc xem là một giải pháp ƣu việt khi nó chiếm dụng nguồn cây trồng phục vụ cho những lợi ích khác của con ngƣời hay nguồn nguyên liệu của nó xâm lấn vào diện tích rừng và các môi trƣờng trọng yếu khác có liên quan mật thiết đến sự đa dạng sinh học [80]. Giá thành và những khó khăn trong việc thu nhận và tinh chế các nhiên liệu hóa thạch cùng những chính sách ở cấp độ khu vực cho tới quốc gia sẽ ngày càng thúc đẩy gia tăng sản xuất biodiesel hoặc các loại nhiên liệu tái sinh khác. Và để biodiesel có thể trở thành quen thuộc đối với ngƣời tiêu dùng thì giá cả của nó phải cạnh tranh đƣợc với diesel thông thƣờng. Do đó mục tiêu đặt ra là phải giảm bớt đƣợc chi phí cho nguồn nguyên liệu thô vốn chiếm 60-70% tổng chi phí nhiên liệu biodiesel [11]. Để không phải cạnh tranh với nguồn dầu thực phẩm, biodiesel nên đƣợc sản xuất từ các nguồn nguyên liệu giá thành rẻ nhƣ là các nguồn dầu phi thực phẩm, sử dụng dầu rán, mỡ động vật, dầu cặn, và dầu nhờn. Tuy nhiên, khối lƣợng dầu thải và mỡ động vật sẵn có thì không đủ để đáp ứng nhu cầu biodiesel hiện nay. Vì vậy, 1. TỔNG QUAN VỀ BIODIESEL 11 công nghệ sản xuất biodiesel chuyển tiếp qua một thế hệ mới, thế hệ thứ hai, lấy nguồn nguyên liệu là sinh khối vi tảo, có thể góp phần giảm bớt đƣợc những đòi hỏi bức thiết về mặt bằng nhờ có hiệu suất năng lƣợng cao hơn trên mỗi đơn vị diện tích đất cũng nhƣ không cạnh tranh ảnh hƣởng tới đất nông nghiệp. Hơn nữa, biodiesel cần phải có mức tác động môi trƣờng thấp hơn và bảo đảm có cùng chất lƣợng so với các nguồn nhiên liệu hiện nay [61]. Thực tế, vi tảo có hiệu suất dầu cao nhất trong số các cây trồng lấy dầu đa dạng khác. Có thể so sánh hiệu suất nuôi trồng vi tảo với việc khai thác các nguồn sinh khối khác qua bảng số liệu sau: Bảng 1. 2: So sánh vi tảo với các nguồn nguyên liệu sản xuất biodiesel khác [80] Nguồn Hàm lƣợng dầu (% khối lƣợng sinh khối) Năng suất lipid (L dầu/ha.năm) Đất sử dụng (m 2.năm/kg biodiesel) Năng suất biodiesel (kg biodiesel/ ha.năm) Bắp/Ngô (Zea mays L.) 44 172 66 152 Gai dầu (Cannabis sativa L.) 33 363 31 321 Đậu nành (Glycine max L.) 18 636 18 562 Jatropha (Jatropha curcas L.) 28 741 15 656 Camelina (Camelina sativa L.) 42 915 12 809 Canola/Cải dầu (Brassica napus L.) 41 974 12 862 Hƣớng dƣơng (Helianthus annuus L.) 40 1070 11 946 Hải ly (Ricinus communis) 48 1307 9 1156 Cọ dầu (Elaeis guineensis) 36 5366 2 4747 Vi tảo (lượng dầu thấp) 30 58700 0.2 51927 Vi tảo (lượng dầu trung bình) 50 97800 0.1 86515 Vi tảo (lượng dầu cao) 70 136900 0.1 121104 1. TỔNG QUAN VỀ BIODIESEL 12 Để giải quyết vấn đề thiếu hụt năng lƣợng toàn cầu, tìm kiếm các nguồn nguyên liệu sinh học giàu lipid để sản xuất biodiesel đạt hiệu quả cao đang thu hút rất nhiều sự quan tâm. Các vi sinh vật có chất dầu đƣợc kỳ vọng nhờ có chu kỳ sinh trƣởng ngắn, hàm lƣợng lipid cao và dễ dàng đƣợc cải tạo giống bởi các phƣơng tiện công nghệ sinh học. Vài loài vi tảo đƣợc liệt vào nhóm vi sinh vật giàu chất dầu phù hợp với nhu cầu sản xuất lipid [15]. Vi tảo đƣợc xem là đối tƣợng tiềm năng để sản xuất nhiên liệu bởi rất nhiều ƣu điểm nhƣ là hiệu suất quang hợp cao, sinh khối lớn và mức độ sinh trƣởng cao hơn khi so sánh với các loại cây trồng sản xuất năng lƣợng [50]. Trong số các nguồn sinh khối, vi tảo đƣợc xem là một nguồn sinh khối hiện đại và có nhiều tiềm năng nhất hiện nay bởi vì vi tảo có khả năng quang hợp hiệu quả hơn bất kỳ loại sinh khối thực vật nào khác, mà theo Hall in Ref, quá trình quang hợp của vi sinh vật là quá trình tái sinh sử dụng năng lƣợng mặt trời để chuyển hóa thành một dạng năng lƣợng dự trữ mới dƣới dạng các liên kết hóa học, ngoài ra con ngƣời hoàn toàn có thể chủ động sản xuất sinh khối vi tảo với số lƣợng lớn. Vì vậy nếu có thể thu hồi năng lƣợng với năng suất cao từ chúng thì sinh khối vi tảo đƣợc xem là một nguồn tài nguyên đầy hứa hẹn để sản xuất nhiên liệu [67], và vi tảo có thể đƣợc xem nhƣ một nguồn năng lƣợng thay thế cho nguồn năng lƣợng hóa thạch đang cạn kiệt dần [48]. Hơn nữa, theo tiêu chuẩn biodiesel của American Society for Testing Materials (ASTM), biodiesel từ dầu vi tảo có các thuộc tính tƣơng tự với biodiesel tiêu chuẩn, và nó cũng an toàn hơn vì có nhiệt độ phát cháy cao. Bảng 1. 3: So sánh các thuộc tính giữa dầu từ vi tảo, diesel thông thƣờng và tiêu chuẩn ASTM biodiesel [28] Thuộc tính Biodiesel từ vi tảo Diesel Tiêu chuẩn biodiesel ASTM Khối lƣợng riêng (kg/L) 0.864 0.838 0.84-0.90 Độ nhớt (mm2/s, cSt tại 400C) 5.2 1.9-4.1 3.5-5.0 Điểm phát cháy ( 0 C) 115 75 Tối thiểu 100 Điểm đông đặc ( 0 C) -12 -50-10 - Chỉ số acid (mg KOH/g) 0.374 Tối đa 0.5 Tối đa 0.5 Giá trị nhiệt năng 41 40-45 - Tỷ lệ H/C 1.81 1.81 - 1. TỔNG QUAN VỀ BIODIESEL 13 Những ƣu điểm khi nuôi cấy vi tảo nhƣ nguồn tài nguyên sinh khối: - Tảo đƣợc xem là các cơ thể sống có khả năng thu nhận năng lƣợng mặt trời để tạo ra các hợp chất hữu cơ rất hiệu quả [83]. - Tảo đƣợc xếp vào loài thực vật không có hệ mạch dẫn, đa phần đều thiếu cơ quan sinh sản phức tạp [83]. - Vi tảo dễ dàng nuôi cấy để sản xuất một số hợp chất đặc thù chọn lọc, có giá trị kinh tế với nồng độ cao nhƣ protein, carbohydrate, lipid và các sắc tố dựa vào các điều kiện sinh trƣởng đa dạng [83]. Từ đó có thể tối ƣu hóa môi trƣờng để thu đƣợc sinh khối với hàm lƣợng lipid cao. - Vi tảo thuộc vào nhóm vi sinh vật sinh sản theo chu kỳ phân đôi tế bào [83]. - Vi tảo có thể sống đƣợc ở môi trƣờng nƣớc biển, nƣớc lợ hoặc nƣớc ngọt. Mặc dù vi tảo sống trong môi trƣờng nƣớc, nhƣng không đòi hỏi cần nhiều nƣớc nhƣ các loại cây trồng khác [43]. Mặt khác, vi tảo cũng có thể thích nghi với môi trƣờng nƣớc thải, do đó không cần thiết phải tốn chi phí sử dụng nƣớc sạch [80]. - Hệ thống sản xuất sinh khối tảo dễ dàng thích nghi ở các quy mô và kỹ thuật khác nhau [83]. - Việc nuôi thu sinh khối vi tảo không đòi hỏi nhiều diện tích nhƣ khi trồng các loại cây lấy dầu khác [15], và năng suất sinh khối vi tảo cũng không phụ thuộc vào thời tiết hay ảnh hƣởng của môi trƣờng [43]. Biodiesel sản xuất từ vi tảo không làm ảnh hƣởng đến việc sản xuất thực phẩm và các sản phẩm khác từ thực vật [28]. - Vi tảo có mức độ sinh trƣởng rất nhanh, chu kỳ sinh trƣởng hoàn tất chỉ trong vài ngày [71], và có rất nhiều loài tảo chứa nhiều dầu [28], năng suất dầu trên mỗi đơn vị nuôi cấy vi tảo có thể cao vƣợt trội hơn so với năng suất dầu của cây có hạt chứa hàm lƣợng dầu nhiều nhất [43]. Thông thƣờng các loài vi tảo có hàm lƣợng dầu vào khoảng 20-50% [15]. Ví dụ nhƣ loài tảo Chlorella protothecoides khi nuôi theo phƣơng thức dị dƣỡng có thể tích lũy lipid đạt 55% khối lƣợng khô của tế bào sau 144h nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung bột cao ngô trong fermenter [87]. - Sản xuất sinh khối vi tảo có thể đƣợc xem là một phƣơng pháp cố định trực tiếp khí thải CO2 vì vi tảo sử dụng CO2 nhƣ nguồn Carbon nhờ khả năng quang hợp (1kg sinh khối khô đòi hỏi cần có 1.8kg CO2) [43]. - Nuôi cấy vi tảo không cần dùng các loại thuốc xịt cỏ hay thuốc trừ sâu [43]. 1. TỔNG QUAN VỀ BIODIESEL 14 - Các phần sinh khối vi tảo còn dƣ lại sau quá trình trích ly dầu có thể đƣợc dùng nhƣ nguồn thức ăn cho gia súc, hoặc làm phân bón, hoặc qua quá trình lên men tạo các sản phẩm ethanol hay methane [43]. - Toàn bộ quá trình từ việc nuôi thu sinh khối có hàm lƣợng lipid cao đến sản xuất biodiesel từ dầu vi tảo đều đã đƣợc nghiên cứu. Ở điều kiện phòng thí nghiệm, hàm lƣợng lipid lý tƣởng có thể đạt tới 56- 60% trên tổng sinh khối khô nhờ vào kỹ thuật di truyền hoặc kỹ thuật nuôi dị dƣỡng. Những tiến bộ kỹ thuật cho thấy rằng trong tƣơng lai việc sản xuất biodiesel từ vi tảo có thể đƣợc thực hiện trên quy mô công nghiệp [28]. 2. NUÔI VI TẢO SẢN XUẤT BIODIESEL 15 2. NĂNG SUẤT LIPID VÀ ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG LÊN SỰ TÍCH LŨY LIPID CỦA MỘT SỐ LOÀI VI TẢO 2.1. Các loại vi tảo có chứa nhiều lipid Một số loài vi tảo có thể tích lũy lipid đạt đến 75% (w/w) sinh khối khô nhƣng năng suất thấp, nhƣ là Botryococcus braunii. Một số loài vi tảo khác rất phổ biến cho việc sản xuất lipid đó là Chlorella, Crypthecodinium, Cylindrotheca, Dunaliella, Isochrysis, Nannnochloris, Nannochloropsis, Neochloris, Nitzschia, Phaeodactylum, Porphyridum, Schizochytrium, Tetraselmis vì có năng suất sinh khối cao nên năng suất lipid cao hơn nhiều mặc dù hàm lƣợng lipid chỉ đạt từ 20- 50% sinh khối khô [80]. Ngoài ra, thành phần lipid trong tế bào vi tảo cũng khác nhau tùy theo chủng loại. Đây thực sự cũng là một điểm đáng lƣu ý khi lựa chọn các loài vi tảo vì sẽ ảnh hƣởng đáng kể đến đặc tính của biodiesel đƣợc sản xuất từ lipid của chúng. Thành phần lipid trong vi tảo gồm có các acid béo bão hòa và chƣa bão hòa, chứa 12-22 nguyên tử carbon, và một số thuộc họ ω3 và ω6 [80]. Bảng 2. 1: Hàm lƣợng và năng suất lipid của các loài tảo khác nhau [80] Các loài vi tảo nƣớc mặn và nƣớc ngọt Hàm lƣợng lipid (% sinh khối khô) Sinh khối khô (g/L/ngày) Năng suất lipid (mg/L/ngày) Chlorella emersonii 25.0-63.0 0.036-0.041 10.3-50.0 Chlorella sorokiniana 19.0-22.0 0.23-1.47 44.7 Chlorella sp. 10.0-48.0 0.02-2.5 42.1 Chlorococcum sp. 19.3 0.28 53.7 Nannochloris sp. 20.0-56.0 0.17-0.51 60.9-76.5 Nannochloropsis oculata 22.7-29.7 0.37-0.48 84.0-142.0 Nannochloropsis sp. 12.0-53.0 0.17-1.43 37.6-90.0 Neochloris oleoabundans 29.0-65.0 - 90-134.0 Scenedesmus sp. 19.6-21.1 0.03-0.26 40.8-53.9 Spirulina maxima 4.0-9.0 0.21-0.25 - Tetraselmis suecica 8.5-23.0 0.12-0.32 27.0-36.4 Tetraselmis sp. 12.6-14.7 0.30 43.4 2. NUÔI VI TẢO SẢN XUẤT BIODIESEL 16 Theo số liệu trên, ta thấy trong số các loài vi tảo có hàm lƣợng lipid cao, Nannochloropsis oculata là một tiềm năng sáng giá. Mặc dù hàm lƣợng lipid tính theo phần trăm sinh khối khô chỉ trong khoảng 22.7-29.7%, thấp hơn một số loài nhƣ Chlorella emersonii, Chlorella sp., Nannochloris sp., Neochloris oleoabundans…, nhƣng do Nannochloropsis oculata nuôi theo phƣơng pháp tự dƣỡng có sức sinh sản cao, lƣợng sinh khối trong ngày lớn, năng suất lipid của loài này có giá trị cao đáng kể. Vì vậy có thể xem Nannochloropsis oculata là một loài vi tảo rất có tiềm năng trong việc sản xuất biodiesel. 2.2. Một số nghiên cứu về ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng lên sự tích lũy lipid ở vi tảo Năng suất dầu của vi tảo là khối lƣợng dầu đƣợc sản xuất trên mỗi đơn vị thể tích canh trƣờng vi tảo mỗi ngày, phụ thuộc vào mức độ sinh trƣởng của tảo và hàm lƣợng lipid có trong sinh khối. Xem xét qua một vài kết quả nghiên cứu, ta có thể thấy rằng hàm lƣợng và đặc tính của lipid trong tế bào vi tảo rất đa dạng, tùy thuộc vào sự thay đổi của điều kiện sinh trƣởng (nhƣ nhiệt độ và cƣờng độ chiếu sáng) hay thành phần dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi cấy (nhƣ nồng độ nitrogen, phosphate và sắt) [34, 44]. 2.2.1. Yếu tố nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hƣởng sâu sắc đến sự sinh trƣởng và sự tích lũy các thành phần hóa sinh trong tế bào vi tảo, đặc biệt là sự tích lũy lipid và sự thay đổi thành phần lipid nội bào. Một ví dụ cụ thể đó là Chlorella vulgaris trong thí nghiệm của Attilio và các cộng sự: loài vi tảo này đƣợc nuôi trong môi trƣờng cơ bản Bold, sử dụng CO2 có sẵn trong không khí (khoảng 300ppm) và NaNO3 là những nguồn cung cấp carbon và nitrogen duy nhất trong suốt quá trình thí nghiệm, nuôi cấy theo phƣơng thức quang tự dƣỡng trong 14 ngày dƣới ánh sáng liên tục có cƣờng độ 70µE/m 2 s, ở các nhiệt độ 25, 30, 35 và 380C [5]. Sự sinh trƣởng của C. vulgaris bị ảnh hƣởng mạnh mẽ khi nhiệt độ trên 30 0 C. Ở 350C, loài vi tảo này bắt đầu bị ức chế, cụ thể là mức độ sinh trƣởng đặc trƣng đã giảm 17% so với ở 300C. Khi tăng nhiệt độ lên cao hơn nữa (380C), sự sinh trƣởng của C. vulgaris bị ngừng đột ngột, sau đó các tế bào vi tảo bị chết. Điều này rất dễ nhận biết vì các tế bào sẽ thay đổi màu sắc, chuyển từ màu xanh sang màu nâu, và mức độ sinh trƣởng của tế bào vi tảo có kết quả là số âm [5]. 2. NUÔI VI TẢO SẢN XUẤT BIODIESEL 17 Khi nhiệt độ sinh trƣởng giảm từ 300C xuống còn 250C thì hàm lƣợng lipid trong tế bào C. vulgaris tăng, từ 5.9 lên 14.7%, trong khi đó mức độ sinh trƣởng vẫn duy trì không đổi. Kết quả năng suất lipid đã tăng từ 8 lên đến 20mg/L.ngày [5]. Bảng 2. 2: Sự sinh trƣởng và sản xuất lipid của C. vulgaris tại các nhiệt độ khác nhau [5] Nhiệt độ ( 0 C) µ - Tốc độ sinh trƣởng đặc trƣng (1/ngày) Sản lƣợng lipid (glipid/100gsinh khối khô) Năng suất lipid (mglipid/L.ngày) 25 0.14 ± 0.00 14.71 ± 0.30 20.22 ± 0.60 30 0.14 ± 0.00 5.90 ± 0.42 8.16 ± 0.65 35 0.12 ± 0.01 5.60 ± 0.59 8.21 ± 0.17 38 -0.01 ± 0.01 11.32 ± 0.20 -2.72 ± 1.62 Hình 2. 1: Phần trăm các loại FAME trên tổng lƣợng FAME (g/100gFAME) của C. vulgaris tại các nhiệt độ sinh trƣởng khác nhau [A4] (FAME: fatty acid methyl ester) Sau quá trình chuyển vị ester, phân tích các FAME thì thấy lƣợng acid palmitic (C16:0) trong C. vulgaris chiếm 60% (mol/mol) trên tổng lƣợng lipid [5]. Một điều đáng ghi nhận nữa là khi tăng nhiệt độ vƣợt quá nhiệt độ nuôi cấy tối ƣu (34-380C), hàm lƣợng acid oleic trong C. vulgaris sẽ tăng cao đáng kể [5]. Xem xét thêm các kết quả từ những nghiên cứu khác càng có thể chứng minh rằng nhiệt độ có một tầm tác động đáng kể trong quá trình nuôi cấy các loài vi tảo. Mỗi loài vi tảo thích ứng với một ngƣỡng nhiệt độ nhất định và ở các nhiệt độ khác nhau thì thành phần hóa sinh trong tế bào là khác nhau. 2. NUÔI VI TẢO SẢN XUẤT BIODIESEL 18 Nhƣ trong thí nghiệm của Susan M. Renaud và các cộng sự, bốn loài vi tảo nhiệt đới Australian bao gồm tảo cát Chaetoceros (CS256), 2 loài cryptomonad: Rhodomonas (NT15) và Crytomonas (CRF101) và 1 loài prymnesiophyte không xác định (NT19) đƣợc nuôi ở 5 nhiệt độ khác nhau. Thí nghiệm đƣợc thiết kế theo môi trƣờng f/2 ở nhiệt độ 25, 27, 30, 33 và 350C (nồng độ muối 25 ‰, pH 8.3, mật độ photon 80 μmol/m2.s; chu kỳ sáng : tối là 12 : 12 h) [62]. Ba loài Cryptomonas sp., Rhodomonas sp., và prymnesiophyte (NT19) đạt mức sinh trƣởng tối ƣu vào khoảng nhiệt độ từ 250C đến 300C, mức sinh trƣởng sẽ chậm hơn và số lƣợng tế bào giảm khi nhiệt độ vƣợt trên 300C. Điều này thì tƣơng đồng với các nghiên cứu trƣớc đây trên các loài tảo khác nhƣ Isochrysis sp., Nitzshia closterium, N. paleacea [63], Ochoromas danica, Chaetocerso gracilis, Porphyridium cruentum, Chlorella sp., và Nannochloropsis sp. [62]. Cụ thể là nhiệt độ tối ƣu vào khoảng 25-270C đối với loài Rhodomonas sp. (mức độ sinh trƣởng đặc trƣng, μ=0.27/ngày) và 27-300C đối với prymnesiophyte NT19, Cryptomonas sp., Chaetoceros sp., và Isochrysis sp. (μ=0.56, 0.33, 0.87 và 0.97/ngày). Khi nhiệt độ vƣợt quá 300C hoặc 330C thì tƣơng ứng Cryptomonas sp. và Rhodomonas sp. sẽ rơi vào phase suy vong, các quá trình chuyển hóa trong tế bào bị ngừng đột ngột và tế bào vi tảo sẽ chết. Chỉ có Chaetoceros sp. có khả năng chịu đƣợc nhiệt độ cao, vẫn duy trì mức độ sinh trƣởng bình thƣờng ở 33 và 35 0C (μ>0.78/ngày). Tại 300C Chaetoceros sp. có mật độ tế bào cao nhất, do đó lƣợng sinh khối cũng đạt cao nhất (0.17g/L) [62]. Khi tăng nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy, sự tổng hợp lipid của ba loài Chaetoceros sp., Rhodomonas sp., và prymnesiophyte NT19 có xu hƣớng giảm, lƣợng lipid giảm tuy nhỏ, nhƣng xét trên tỷ lệ thì lại rất đáng kể. Kết quả này tƣơng tự đối với Chaetoceros calcitrans, C. simplex [81] và Nitzschia sp. [63]. Tuy nhiên cũng có những kết quả phản ánh ngƣợc lại: đối với một số loài vi tảo khác sự tổng hợp lipid sẽ tăng khi ở nhiệt độ cao [81, 54]. Chaetoceros sp. có tỷ lệ về lipid cao nhất (16% DW; P<0.01) khi nuôi cấy ở 25˚C, trong khi Rhodomonas sp., Cryptomonas sp., NT19 và Isochrysis sp. có hàm lƣợng lipid cao đáng kể ở nhiệt độ trong khoảng 27-300C (lần lƣợt là 15.5, 12.7, 21.4 và 21.7% DW, P<0.05) [62]. Từ đó thấy rằng việc lựa chọn nhiệt độ phù hợp cho sự sinh trƣởng và tích lũy lipid khi nuôi cấy vi tảo nhẳm sản xuất biodiesel là rất quan trọng. 2. NUÔI VI TẢO SẢN XUẤT BIODIESEL 19 2.2.2. Yếu tố thành phần môi trƣờng Hàm lƣợng lipid trong vi tảo có thể tăng lên dƣới các điều kiện nuôi cấy khác nhau nhƣ sự thiếu hụt nitrogen [34, 79, 42], cƣờng độ chiếu sáng mạnh [37], nhiệt độ thấp [62], nồng độ muối cao [78], và nồng độ sắt cao [44]. Dƣới các điều kiện kích thích, nhiều loài vi tảo có thể đáp ứng bằng cách gia tăng hàm lƣợng lipid, thông thƣờng từ 30% tới 60% (w/w) tế bào khô [14]. 2.2.2.1. Thành phần Carbon Cả hai loại nguồn carbon phi hữu cơ (CO2) lẫn carbon hữu cơ (glucose, acetate…) đều đƣợc vi tảo sử dụng để sản xuất lipid. Do vi tảo có khả năng sử dụng CO2 nhƣ nguồn carbon chính trong thành phần dinh dƣỡng nhờ vào khả năng quang hợp, con ngƣời hƣớng đến việc cô lập CO2 từ các nguồn khí thải để tận dụng cho quá trình quang hợp của vi tảo, một mặt giảm đƣợc chi phí trong quá trình nuôi cấy vi tảo, mặt khác là giảm thiểu CO2 trong không khí, đáp ứng nhiệm vụ cải thiện môi trƣờng và khắc phục hiện tƣợng nóng dần lên của trái đất do các loại khí nhà kính [12]. Theo ƣớc tính, để sản xuất đƣợc 100 tấn sinh khối vi tảo thì có khoảng 180 tấn CO2 đƣợc sử dụng trong quá trình quang hợp dƣới điều kiện ánh sáng tự nhiên hoặc nhân tạo [5]. Để việc sản xuất biodiesel và làm giảm CO2 trong không khí đạt hiệu quả, các loài vi tảo phải đƣợc chọn lựa thỏa mãn các yêu cầu: sinh trƣởng mạnh, hàm lƣợng lipid nhiều và có khả năng thích nghi tốt khi mức độ CO2 cao [12]. Khi khảo sát yếu tố nồng độ CO2 đối với mức độ sinh trƣởng và sự tích lũy lipid trên một số loài tảo đƣợc lựa chọn nhằm sản xuất lipid, Chan Yoo và các cộng sự đã đạt đƣợc một số kết luận nhƣ sau [12]: Ba loài tảo Scenedesmus sp., Chlorella sp., và Botryococcus braunii đƣợc nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 10C, chiếu sáng liên tục 150µmol/m2s trong 2 tuần. Để rút ngắn thời gian phase lag, vi tảo trƣớc đó đƣợc nuôi trong môi trƣờng sục không khí có 2% CO2 trong 1 tuần trƣớc khi cấy mẫu. Môi trƣờng nuôi cấy thực sự thì sử dụng không khí chứa 10% CO2 hoặc khí thải từ ống khói với vận tốc 0.3v/v/m, nồng độ CO2 là 5.5%. - Đối với mức độ sinh trƣởng của tế bào khi nồng độ CO2 là 10% Trong ba loài đƣợc khảo sát thì Scenedesmus sp. là loài đạt năng suất sinh khối cao nhất. Sinh khối tối đa đạt đƣợc là 3.13g/L vào ngày thứ 14, năng suất sinh khối đạt 217.50 ± 11.24 mg sinh khối khô/L.ngày. Trong một nghiên 2. NUÔI VI TẢO SẢN XUẤT BIODIESEL 20 cứu khác của Morais và Costa [51], đối với hai loài Chlorella sp. và Scenedesmus sp. cô lập từ nhà máy nhiệt điện than đá, năng suất sinh khối của chúng cũng khá cao khi nồng độ CO2 từ 6-12%. Năng suất tối đa của hai loài này với 6% CO2 lần lƣợt là 87 và 85mg sinh khối khô/L.ngày. Hơn nữa, hai loài tảo này cũng có thể sống trong môi trƣờng chứa CO2 với nồng độ lên tới 18%, và năng suất sinh khối cao nhất của loài Scenedesmus obliquus là 140mg sinh khối khô/L trong một ngày với nồng độ CO2 là 12% [50]. Qua đó thấy rằng, khi nuôi ở 10% CO2, năng suất sinh khối của Scenedesmus sp. cao gấp 2-3 lần so với các nghiên cứu ở nồng độ khác, và cả ba loài tảo đƣợc khảo sát ở nồng độ CO2 này đều không gặp phải bất kỳ ảnh hƣởng xấu nào. Tuy nhiên, B. braunii lại có mức độ thích nghi chậm với nồng độ CO2 10%, do đó mức sinh trƣởng của loài này thấp hơn. Sục khí ở nồng độ cao hoặc sục khí liên tục CO2 2% sẽ làm giảm đáng kể pH của môi trƣờng [60]. Lee và các cộng sự [41] đã đề xuất rằng khi tăng mật độ tế bào ban đầu thì sẽ tăng đƣợc sức chịu dựng của vi tảo đối với nồng độ CO2 cao và giảm đƣợc thời gian thích nghi. Nhƣ vậy, nếu B. braunii đƣợc cho thích nghi với nồng độ CO2 thấp trƣớc đó, thì mức độ sinh trƣởng và sản lƣợng sinh khối sẽ có thể gia tăng mà không cần qua trải qua thời kỳ thích nghi [12]. - Đối với lipid và acid béo khi nồng độ CO2 là 10% Hàm lƣợng lipid tổng trong vi tảo theo nghiên cứu của Chan Yoo và các cộng sự đạt từ 6.25% tới 25.79% khối lƣợng khô. Từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14, các giá trị có xu hƣớng giảm. Hàm lƣợng lipid trong Scenedesmus sp. thì thấp hơn so với B. braunii, nhƣng do Scenedesmus sp. có năng suất sinh khối cao nên có năng suất lipid tổng cao nhất trong ba loài khảo sát. Bảng 2. 3: Năng suất sinh khối và năng suất lipid của Botryococcus braunii, Chlorella vulgaris và Scenedesmus sp. khi nuôi ở 10% CO2 trong 14 ngày [12]. Loài Năng suất sinh khối (mg sinh khối khô/L.ngày) Năng suất lipid tổng (mg/L.ngày) B. braunii 26.55 ± 7.66 5.51 ± 1.53 C. vulgaris 104.76 ± 10.73 6.91 ± 0.03 Scenedesmus sp. 217.50 ± 11.24 20.65 ± 0.13 Trong khi hàm lƣợng lipid của cả hai loài Scenedesmus sp. và C. vulgaris đều thấp hơn 11.92%, hàm lƣợng lipid tổng của B. braunii vào ngày thứ 7 và ngày thứ 14 lần lƣợt là 25.79% và 21.10%. Các kết quả khác lại cho thấy 2. NUÔI VI TẢO SẢN XUẤT BIODIESEL 21 rằng, hàm lƣợng lipid tổng có thể đạt đƣợc từ 20-50% là khá phổ biến, thậm chí một số loài vi tảo có thể tích lũy lipid tới 80% (w/w) sinh khối khô. Và nuôi cấy trên các điều kiện môi trƣờng khác nhau cũng có thể gia tăng đƣợc hàm lƣợng lipid tích lũy trong tế bào vi tảo [44]. Hàm lƣợng lipid tổng của B. braunii trong phase cân bằng sớm thì cao hơn trong phase sinh trƣởng theo hàm số mũ (phase log). Mặc dù hàm lƣợng lipid của cả ba loài tảo đƣợc Chan Yoo khảo sát với nồng độ 10% CO2 có thấp hơn một chút so với kết quả nghiên cứu trong các bản báo cáo khác, nhƣng chỉ xét trên phase cân bằng thì hàm lƣợng này lại cao hơn [12]. Bảng 2. 4: Thành phần các acid béo của Botryococcus braunii, Chlorella vulgaris và Scenedesmus sp. khi nuôi cấy ở 10% CO2 trong 14 ngày [12]. Loài C16:0 (% w/w acid béo) C16:1 (% w/w acid béo) C18:0 (% w/w acid béo) C18:1 (% w/w acid béo) C18:2 (% w/w acid béo) B. braunii 29.5 ± 0.8 3.4 ± 0.3 1.0 ± 0.2 44.9 ± 0.4 21.2 ±0.4 C. vulgaris 24.0 ± 0.1 2.1 ± 0.0 1.3 ± 0.2 24.8 ± 1.5 47.8 ± 1.6 Scenedesmus sp. 36.3 ± 7.1 4.0 ± 0.8 2.7 ± 0.7 25.9 ± 4.5 31.1 ± 11.5 Trong số các acid béo, thì acid palmitic, acid oleic, acid linoleic đƣợc xem là thành phần chính với tỷ lệ từ 21% tới 45% tên tổng hàm lƣợng lipid trong ba loài tảo, các acid palmitoleic và acid stearic chỉ là thứ yếu, tỷ lệ chiếm rất thấp. Đặc biệt, acid oleic, là acid béo đƣợc xem nhƣ là thành phần chính và rất lý tƣởng để sản xuất biodiesel, thì lại chiếm tới 44.9% hàm lƣợng lipid tổng trong B. braunii [12]. Tỷ lệ này là rất cao khi so sánh với tỷ lệ acid oleic đạt đƣợc là 28% trong bản báo cáo của Ranga Rao và các cộng sự [60]. Vì vậy, có thể kết luận rằng, nồng độ CO2 10% là một nồng độ khá tối ƣu để nuôi cấy vi tảo thu lipid nhằm mục đích sản xuất biodiesel. Để khắc phục nhƣợc điểm hàm lƣợng lipid tổng hơi thấp, ta có thể sử dụng nồng độ 10% CO2 kết hợp với một số yếu tố dinh dƣỡng tối ƣu khác, vấn đề chính là ở nồng độ này có thể thu đƣợc thành phần lipid phù hợp cho yêu cầu sản xuất biodiesel chất lƣợng cao, nhất là trên một số chủng cụ thể đƣợc lựa chọn. Vấn đề sinh trƣởng chậm của một số loài nhƣ B. braunii, ta có thể áp dụng một số biện pháp cải thiện nhƣ tiền thích nghi giống với nồng độ CO2 thấp để rút ngắn thời gian thích nghi khi nuôi cấy ở nồng độ CO2 cao. 2. NUÔI VI TẢO SẢN XUẤT BIODIESEL 22 - Khi nuôi bằng khí thải từ ống khói, nồng độ CO2 5.5% Hai trong ba loài tảo nêu trên, B. braunii và Scenedesmus sp. đƣợc nuôi ở hai chế độ để so sánh, đó là sục không khí và dùng khí thải từ ống khói có nồng độ CO2 là 5.5%. Năng suất sinh khối của B. braunii và Scenedesmus sp. với khí thải từ nhà máy lần lƣợt là 77 và 203mg/L.ngày. Năng suất lipid của B. braunii và Scenedesmus sp. đạt 21 và 39mg/L.ngày, tƣơng đƣơng với hàm lƣợng lipid là 24 và 18% [12]. Qua đó chứng tỏ rằng B. braunii vẫn giữ đƣợc hàm lƣợng lipid cao khi nuôi bằng khí thải nhƣ khi nuôi bằng khí chứa 10% CO2. Sinh khối và hàm lƣợng lipid trong các chủng Scenedesmus sp. thì tƣơng đƣơng khi nuôi ở 5% CO2 [66]. Thành phần acid béo của B. braunii và Scenedesmus sp. khi nuôi sục không khí và khí thải ống khói thì gần nhƣ không thay đổi, đặc trƣng cho mỗi loài. Tỷ lệ acid oleic trong B. braunii lần lƣợt là 56 và 59% lƣợng acid béo tổng khi nuôi bằng không khí và khí thải. Vì vậy kết luận rằng có thể sử dụng khí thải từ ống khói để nuôi B.braunii nhằm sản xuất biodiesel vì có hàm lƣợng lipid nhiều và trong đó thành phần acid oleic chiếm tỷ lệ rất cao [12]. 2.2.2.2. Thành phần Nitrogen Nitrogen là một yếu tố ảnh hƣởng sâu sắc đến sự chuyển hóa và tích lũy lipid trong nhiều loài vi tảo. Thêm vào đó, điều khiển nồng độ nitrogen khá dễ dàng và đây là một yếu tố có chi phí thấp khi so sánh với các yếu tố khác [14]. Vì vậy, thành phần và hàm lƣợng nitrogen bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy vi tảo để tăng năng suất lipid đã đƣợc nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Nhƣ đối tƣợng Chlorella vulgaris, khi đƣợc nuôi trong môi trƣờng cơ bản Bold, sử dụng CO2 có trong không khí (khoảng 300ppm) và NaNO3 là những nguồn cung cấp carbon và nitrogen duy nhất trong suốt quá trình thí nghiệm [5], nuôi cấy theo phƣơng thức quang tự dƣỡng trong 14 ngày dƣới ánh sáng liên tục có cƣờng độ 70µE/m2s, ở nhiệt độ 300C. Nồng độ nitrogen trung bình trong môi trƣờng nuôi cấy Chlorella vulgaris theo Guillard là 1.50g/L, do đó khi khảo sát sự giảm nồng độ nitrogen để kích thích sự tích lũy lipid, Attilio và các cộng sự đã nghiên cứu ở 2 nồng độ khác là 0.750 và 0.375g/L để so sánh với nồng độ trung bình [5]. Điều kiện hàm lƣợng nitrogen thấp trong môi trƣờng nuôi cấy thực sự làm gia tăng đáng kể sự tích lũy lipid trong vi tảo [34]. Vì vậy hàm lƣợng nitrate lần lƣợt đƣợc giảm đi còn ½ và ¼ 2. NUÔI VI TẢO SẢN XUẤT BIODIESEL 23 so với nồng độ tiêu chuẩn trong khi cƣờng độ chiếu sáng và tốc độ sục khí vẫn giữ nguyên trong suốt các thí nghiệm. Ảnh hƣởng của việc giảm thiểu nồng độ NaNO3 trên sự sinh trƣởng của C. vulgaris đƣợc tóm tắt trong bảng sau: Bảng 2. 5: Tham số sinh trƣởng và sự sản xuất lipid của C. vulgaris ở các nồng độ NaNO3 khác nhau [5] NaNO3(g/L) µ-Tốc độ sinh trƣởng đặc trƣng (1/ngày) Sản lƣợng lipid (glipid/100gsinh khối khô) Năng suất lipid (mglipid/L.ngày) 1.500 0.14±0.00 5.90±0.42 8.16±0.65 0.750 0.14±0.01 14.37±0.64 20.44±0.75 0.375 0.14±0.00 15.31±0.51 20.30±0.40 Qua đó ta thấy, trong khi tốc độ sinh trƣởng riêng của C. vulgaris thay đổi không đáng kể thì hàm lƣợng lipid tăng gấp 3 lần khi giảm nồng độ nitrate từ 1.500g/L còn 0.375g/L. Khi thay đổi nồng độ NaNO3, hàm lƣợng acid palmitic không thay đổi đáng kể [5]. Tuy nhiên, hàm lƣợng acid linolenic acid (C18:3) trong C. vulgaris thì phù hợp với tiêu chuẩn biodiesel sử dụng cho các phƣơng tiện vận chuyển ở Châu Âu (12%, mol/mol) [38]. Hình 2. 2: Phần trăm các loại FAME trên tổng lƣợng FAME (g/100gFAME) của C. vulgaris tại các nồng độ NaNO3 khác nhau [A4] (FAME: fatty acid methyl ester) Tuy nhiên trong kỹ thuật nuôi cấy vi tảo, nguồn nitrogen có thể đƣợc sử dụng dƣới nhiều dạng khác nhau, nhƣ là ammonia, nitrate, nitrite và urea. Tùy 2. NUÔI VI TẢO SẢN XUẤT BIODIESEL 24 thuộc vào đặc tính loài, việc sử dụng các nguồn nitrogen khác nhau đem đến những hiệu quả khác nhau. Nhƣ đối với Ellipsoidion sp, sử dụng ammonium làm nguồn cung cấp nitrogen sẽ đem lại mức độ sinh trƣởng và hàm lƣợng lipid cao hơn khi sử dụng urea và nitrate [88]. Neochloris oleoabundans khi nuôi bằng nitrate sẽ sinh trƣởng nhanh hơn và tích lũy lipid nhiều hơn khi nuôi với urea [42], nhƣng tế bào lại sinh trƣởng yếu trong môi trƣờng sử dụng nguồn nitrogen là ammonium. Thêm vào đó, nhiều nghiên cứu cho thấy rằng cả ba loại nguồn nitrogen là nitrate, ammonium và urea đều có thể đáp ứng tốt đối với Spirulina platensis [16, 74]. Trong số các nguồn nitrogen hữu cơ, urea đóng một vai trò quan trọng và thƣờng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy vi tảo trên quy mô lớn bởi vì giá thành của urea thì thấp hơn nhiều khi so với các nguồn nitrogen khác [14]. Ngoài ra, chế độ nuôi cấy ảnh hƣởng tới sự sinh trƣởng và thành phần hóa sinh trong tế bào vi tảo. Sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy fed-batch để điều chỉnh mức độ bổ sung môi trƣờng nhằm gia tăng năng suất [14]. Cải thiện năng suất lipid có thể thực hiện bằng biện pháp nuôi cấy fed-batch bổ sung gián đoạn nguồn nitrogen [79]. Thêm vào đó, trong phƣơng pháp nuôi cấy bán liên tục, nồng độ chất dinh dƣỡng ban đầu và mức độ khôi phục cũng đƣợc sử dụng để biến đổi các thành phần hóa sinh trong tế bào vi tảo [56, 22]. 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 25 3. NUÔI VI TẢO NANNOCHLOROPSIS OCULATA THU LIPID NHẰM SẢN XUẤT BIODIESEL 3.1. Nannochloropsis oculata 3.1.1. Phân loại Nguồn gốc: thuật ngữ Nannochloris bắt nguồn từ chữ Nannochlorid, vì vậy thể chính xác là Nannochloridopsis. Và Nannochloropsis là một cụm từ viết tắt từ thuật ngữ trên [32]. Nannochloropsis oculata thuộc vào lớp tảo Eustigmatophyceae, bộ Eustigmatales, họ Monodopsidaceae, chi Nannochloropsis [32]. Sự phân loại Nannochloropsis đã từng mắc phải nhiều nhầm lẫn. Đây là loài tảo có kích thƣớc rất nhỏ (nhỏ hơn 5 µm), màu hơi xanh, không có giai đoạn giao tử chuyển động để sinh sản hữu tính. Khi phân loại hình thái cơ thể sinh vật của chi tảo này, các nhà khoa học đã xem xét dựa trên những nhóm chính đó là Chlorophyceae, Tribophyceae và Eustigmatophyceae. Sử dụng kính hiển vi quang học để phân biệt hình thái giữa các loài tảo trên gặp phải nhiều hạn chế, do đó dẫn đến các nhận định sai lầm [32]. Hầu hết các tảo có hình dạng chung chung nhƣ thuộc tảo đơn bào, có lớp lục lạp đơn tại vách tế bào, vách tế bào trong suốt vô cấu trúc thiếu chất nhầy bao quanh, và chỉ sinh sản theo kiểu chia đôi thành 2 phần bằng nhau đều đƣợc liệt vào những loài của chi Nannochloris Naumann thuộc Chlorophyceae [53]. Nannochloropsis đƣợc Droop phát hiện ra vào năm 1955 tại các vùng nƣớc lợ bề mặt trong các hồ giữa những rặng đá. Antia và các cộng sự [3] đã phát hiện ra những điểm không tƣơng thích trong sự phân loại của Droop [32] dựa trên cơ sở thành phần các hợp chất trong lục lạp và vi cấu trúc, qua đó N. coccoides đƣợc xếp vào lớp Chlorophyceae trong khi N. oculata đƣợc xếp vào Eustigmatophyceae. Nannochloropsis là một chi mới bao gồm các loài rất nhỏ thuộc lớp Eustigmatophyceae, trong đó phổ biến nhất là loài Nannochloropsis oculata. 3.1.2. Đặc điểm hình thái Nannochloropsis oculata là loài tảo đơn bào, tự nổi trên môi trƣờng lỏng. Tế bào có dạng hình cầu với đƣờng kính khoảng 2-4µm, hoặc hình trụ với kích thƣớc là 3-4x1.5µm [32]. 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 26 Nannochloropsis oculata có một lớp màng ngoài mỏng hiện diện ở các giai đoạn nhất định trong chu kỳ sinh trƣởng của tế bào, thành tế bào trong suốt và không tạo hình dạng xác định, mang một lớp đơn các sắc tố diệp lục màu vàng xanh, là sắc tố đặc trƣng của nhóm Eustigmatophyceae, không có lớp màng nhầy bên ngoài [32]. 3.1.3. Đặc điểm sinh lý Nannochloropsis sp. là một chi thuộc dạng phiêu sinh vật tự dƣỡng, trong tế bào có các hợp chất chlorophylls [32]. Nannochloropsis oculata là loài vi tảo sống tối ƣu trong môi trƣờng nƣớc mặn, tuy nhiên đôi khi cũng hiện diện trong môi trƣờng nƣớc ngọt hay nƣớc lợ và sự thay đổi về hình thái là không đáng kể mấy [36]. Nannochloropsis oculata có khả năng sống trong một dải nhiệt độ khá rộng. Thích nghi tốt trong điều kiện môi trƣờng có nhiệt độ thấp, thậm chí là ở gần 00C [36]. Điều kiện sinh trƣởng tốt nhất của Nannochloropsis oculata ở khoảng 210C, mức độ chiếu sáng 52µmol photon/m2s, pH 8.4, mức độ sục khí 14.7 vvh [57]. Nannochloropsis oculata thuộc vào thể đơn bội [36], sinh sản vô tính theo kiểu phân đôi theo chiều ngang [32]. 3.1.4. Đặc điểm sinh hóa Khi điều kiện dinh dƣỡng đầy đủ, Nannochloropsis sp. thƣờng có khuynh hƣớng đầu tiên sẽ chuyển hóa carbon thành protein [52]. Tuy nhiên, dƣới các điều kiện thay đổi khác nhau, tế bào vi tảo bị kích ứng, sẽ có nhiều carbon đƣợc chuyển hóa thành lipid và carbohydrate. Ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng sẽ tác động lên thành phần lipid và các acid béo có trong tế bào vi tảo [77]. Các acid béo chủ yếu có trong Nannochloropsis sp. là C14:0, C16:0, C16:1, C20:4 và C20:5. Ngoài ra cũng có sự hiện diện của một số acid béo phụ khác nhƣ C18:0, C18:1, C18:2 và C18:4. Các acid béo này tồn tại ở ba dạng lipid trong tế bào vi tảo, đó là: galactolipid, phospholipid và lipid trung tính. Galactolipid của Nannochloropsis sp. giàu các acid béo C20:5 và C20:4, kết hợp với C16:0 và C16:1, một lƣợng nhỏ C14:0. Lipid trung tính của Nannochloropsis sp. thì chủ yếu là các triacylglycerol, gồm các acid béo C16:0 và C16:1, một ít acid béo C14:0 và C18:0. Phospholipid của Nannochloropsis sp. giàu C16:1, một lƣợng đáng kể C18:1 và C18:4, hàm lƣợng C16:0 thấp [77]. 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 27 Hình 3. 1: Thành phần acid béo của các nhóm lipid chính trong Nannochloropsis sp. [77] Đồ thị trên chứng tỏ rằng Nannochloropsis sp. là loài vi tảo quang tự dƣỡng phù hợp cho việc sản xuất acid eicosapentaenoic (C20:5; EPA). Vì vậy, Nannochloropsis sp. đƣợc xem là nguồn acid béo chƣa bão hòa ω3 quan trọng cho con ngƣời [13]. Ngoài ra, tỷ lệ acid palmitoleic (C16:1) cũng khá cao. Dƣới các điều kiện môi trƣờng khác nhau, tỷ lệ các thành phần lipid và acid béo trong tế bào vi tảo có thể thay đổi [77]. Nghĩa là ta hoàn toàn có khả năng điều khiển đƣợc quá trình sản xuất lipid trong tế bào Nannochloropsis sp. khi tìm đƣợc môi trƣờng tối ƣu tƣơng ứng. Vì vậy, có thể xem Nannochloropsis oculata là một loài tiềm năng dùng để sản xuất lipid phục vụ cho biodiesel. 3.2. Đề xuất mô hình thí nghiệm nghiên cứu sự tích lũy lipid theo điều kiện môi trƣờng ở Nannochloropsis oculata 3.2.1. Yếu tố nhiệt độ 3.2.1.1. Nghiên cứu của Attilio Converti, 2009 Attilio Converti và các cộng sự đã làm một nghiên cứu về sự ảnh hƣởng của nhiệt độ lên mức độ sinh trƣởng và hàm lƣợng lipid đối với Nannochloropsis oculata nhằm ứng dụng cho việc nuôi cấy loài vi tảo này phục vụ cho sản xuất biodiesel. Trong nghiên cứu này, Attilio Converti và các cộng sự đã thiết lập các thí nghiệm nuôi cấy N. oculata tại các nhiệt độ 15, 20 và 25 0 C trong môi trƣờng f/2 của Guillard, sử dụng nguồn cung cấp - 5 10 15 20 25 30 35 40 45 C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:4 C20:4 C20:5 % w /w li p id t ổ n g Lipid tổng Lipid trung tính Galactolipid Phospholipid 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 28 carbon là CO2 có sẵn trong không khí với tốc độ sục khí khoảng 300ppm, và nguồn cung cấp nitrogen là NaNO3. Các mẻ nuôi cấy tự dƣỡng thực hiện trong 14 ngày dƣới ánh sáng liên tục có mật độ dòng photon là 70µE/m2s. Mỗi thí nghiệm lập lại hai lần [5]. - Mức độ sinh trƣởng và sự sản xuất lipid Thay đổi điều kiện sinh trƣởng tối ƣu của N. oculata (200C) dẫn đến kết quả làm biến đổi đáng kể mức độ sinh trƣởng của loài vi tảo này. Bảng 3. 1: Sự sinh trƣởng và sản xuất lipid của N. oculata tại các nhiệt độ khác nhau [5] Nhiệt độ ( 0 C) µ - Tốc độ sinh trƣởng đặc trƣng (1/ngày) Sản lƣợng lipid (glipid/100gsinh khối khô) Năng suất lipid (mglipid/L.ngày) 15 0.06 ± 0.00 14.92 ± 0.82 9.11 ± 0.30 20 0.13 ± 0.00 7.90 ± 0.21 10.01 ± 0.22 25 0.07 ± 0.01 13.89 ± 0.61 10.10 ± 2.09 Khi nhiệt độ dƣới mức tối ƣu, mức độ tăng trƣởng giảm hơn một nửa, từ 0.13 giảm còn 0.06/ngày. Sự giảm rõ nét này cũng đƣợc ghi nhận khi nuôi cấy ở nhiệt độ cao, 250C [5]. Sự giảm thiểu đáng kể này chứng tỏ rằng N. oculata mặc dù có thể thích nghi trong một phổ rộng nhiệt độ nhƣ nêu trong phần trên, nhƣng là một loài khá nhạy cảm khi sinh trƣởng tại các nhiệt độ khác nhau. Vì vậy, nếu nhiệt độ càng hạ thấp hoặc càng tăng cao thì mức độ sinh trƣởng của loài vi tảo này càng bị hạn chế. Sự thay đổi nhiệt độ lại có ảnh hƣởng tích cực lên sự tích lũy lipid đối với N. oculata. Nhiệt độ tối ƣu cho sự sinh trƣởng của loài vi tảo này là 200C, nhƣng khi tăng hoặc giảm nhiệt độ nuôi cấy, sản lƣợng lipid tích lũy trong vi tảo tăng lên đáng kể, gần nhƣ gấp đôi so với ở 200C [5]. Nhiệt độ thay đổi ảnh hƣởng không tốt đến mức độ sinh trƣởng đặc trƣng nhƣng lại có tác động tích cực lên sự tổng hợp và tích lũy lipid trong tế bào vi tảo. Chính vì thế năng suất lipid của N. oculata khi nuôi cấy tại các nhiệt độ khác nhau lại gần nhƣ tƣơng đƣơng nhau, không hơn kém nhau nhiều lắm. Kết quả cho thấy, tại 250C, năng suất lipid của N. oculata đạt giá trị cao nhất, có thể lên đến 12.19mg/L.ngày [5]. - Sự thay đổi hàm lƣợng các acid béo trong thành phần lipid 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 29 Hình 3. 2: Phần trăm các loại FAME trên tổng lƣợng FAME (g/100gFAME) của N. oculata tại các nhiệt độ khác nhau [A4] (FAME: fatty acid methyl ester) Qua đồ thị trên ta thấy, tại 150C, hàm lƣợng C16:0 và C18:3 khá cao. Còn hàm lƣợng C18:1 lại rất thấp. Khi nhiệt độ tăng lên 250C, hàm lƣợng C18:1 tăng lên nhiều (khoảng 20%), trong khi đó C16:0 và C18:3 lại có xu hƣớng giảm [5]. 3.2.1.2. Nghiên cứu của Hanhua Hu và Kunshan Gao, 2006 Hanhua Hu và Kunshan Gao cũng đã khảo sát sự sinh trƣởng và thành phần lipid của Nannochloropsis sp. tại ba mức nhiệt độ khác nhau: 14 0 C, 22 0 C và 30 0 C. Trong nghiên cứu của mình, Hanhua Hu và Kunshan Gao đã thiết lập thí nghiệm nuôi cấy Nannochloropsis sp. tại các điều kiện nhƣ sau: môi trƣờng nuôi cấy f/2 nƣớc biển nhân tạo (f/2AW: f/2 artificial seawater), mức độ sục khí 200mL/phút với hàm lƣợng CO2 cao (2800µL/L), mức độ chiếu sáng 50µmol/m2s, thu mẫu vào ngày thứ 10 sau khi cấy giống vào môi trƣờng. Mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần [31]. - Mức độ sinh trƣởng và thành phần hợp chất hóa học trong tế bào Nannochloropsis sp. có khả năng sinh trƣởng tốt trong khoảng nhiệt độ 14-30 0 C [31]. Sản lƣợng sinh khối khô (mg/L) của cả ba chế độ nhiệt không có sự thay đổi đáng kể, ngoại trừ ở 300C mức sinh trƣởng có sự giảm nhẹ so với nhiệt độ tối ƣu là 220C [31]. Khi nhiệt độ môi trƣờng thay đổi ra khỏi khoảng nhiệt độ tối ƣu, dù cao hơn hay thấp hơn đều cho kết quả hàm lƣợng lipid tổng tăng đáng kể. Cụ thể là ở 220C, hàm lƣợng lipid trong tế bào vi tảo chỉ đạt 9%, trong khi ở 140C 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 30 và 30 0C hàm lƣợng lipid lần lƣợt đạt 19% và 15%. Hàm lƣợng carbohydrate và protein cũng có sự thay đổi nhẹ [31]. - Thành phần các acid béo trong tế bào vi tảo Khi nhiệt độ tăng, tỷ lệ acid palmitic tăng đáng kể, tuy nhiên hàm lƣợng EPA giảm. Dƣới các điều kiện stress nhiệt độ (nhiệt độ cao hoặc thấp), vi tảo đều đáp ứng gia tăng hàm lƣợng TFA. Nhƣng hàm lƣợng của các PUFA giảm dần khi nhiệt độ môi trƣờng tăng, cụ thể là hàm lƣợng các PUFA lần lƣợt đạt 40%, 35% và 27% tƣơng ứng với các nhiệt độ 14%, 22% và 30% [31]. Trong khi đó, tại cả 3 chế độ nhiệt khác nhau, hàm lƣợng các acid palmitoleic (C16:1) và acid oleic (C18:1) thay đổi không đáng kể. Đây là hai loại acid béo lý tƣởng sản xuất biodiesel. Vấn đề chính là lựa chọn chế độ nhiệt độ nuôi cấy sao cho các loại acid béo khác chiếm tỷ lệ phù hợp với tiêu chuẩn biodiesel. Hàm lƣợng acid palmitic quá cao sẽ làm tăng điểm đông đặc của biodiesel, còn hàm lƣợng EPA quá cao sẽ làm cho biodiesel dễ bị oxy hóa. Bảng 3. 2: Thành phần acid béo (%w/w acid béo tổng) của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các nhiệt độ khác nhau [31] Nhiệt độ (0C) 14 22 30 TFA (mg/g DW) 88 ± 1.3 64 ± 1.7 143 ± 3.7 Acid béo C14:0 4.7 ± 0.7 4.1 ± 0.2 5.5 ± 0.5 C16:0 23.3 ± 0.9 25.4 ± 0.6 40.1 ±1.4 C16:1 21.3 ± 1.1 25.6 ± 0.6 20.5 ± 1.3 C18:0 Tr Tr 1.0 ± 0.2 C18:1 8.4 ± 0.4 7.1 ± 0.3 4.2 ± 0.2 C18:2 4.3 ± 0.1 4.8 ± 0.1 6.8 ± 0.4 C20:1 1.3 ± 0.1 1.2 ± 0.1 Tr C20:4 3.2 ± 0.6 3.4 ± 0.7 2.7 ± 0.4 C20:5 31.7 ± 1.8 25.3 ± 1.0 16.4 ± 0.4 C22:6 Tr 1.4 ± 0.2 Tr Các loại khác Tr 1.4 ± 0.2 1.7 ± 0.3 Tr: trace, giá trị vết, dƣới 1%. 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 31 Bảng 3. 3: Sản lƣợng sinh khối và thành phần hợp chất hóa sinh của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các nhiệt độ khác nhau [31] Nhiệt độ ( 0 C) Sinh khối khô (mg/L) Lipid (%w/w) Carbohydrate (%w/w) Protein (%w/w) 14 388 ± 17.8 19 ± 0.8 12 ± 0.9 55 ± 4.1 22 403 ± 15.2 9 ± 0.5 11 ± 1.0 41 ± 2.9 30 318 ± 10.8 15 ± 0.7 11 ± 0.5 44 ± 2.7 3.2.1.3. Liên hệ mục tiêu sản xuất biodiesel Nguyên liệu trong sản xuất biodiesel chính là lipid từ vi tảo. Do đó năng suất lipid là mục tiêu chính khi nuôi cấy N. oculata cho mục đích sản xuất biodiesel. Ngoài ra, thành phần các acid béo trong nguồn lipid sản xuất biodiesel là rất quan trọng. Tỷ lệ acid béo bão hòa nhiều sẽ làm cho biodiesel dễ bị lắng cặn do acid béo bão hòa có khả năng xoắn cuộn và tạo thành kết tủa, do đó nhiệt độ đông đặc của biodiesel giàu acid béo bão hòa sẽ cao. Còn khi tỷ lệ acid béo chƣa bão hòa mang nhiều nối đôi cao, biodiesel lại dễ bị oxy hóa làm thay đổi tính chất của biodiesel. Hai loại acid béo lý tƣởng nhất để sản xuất biodiesel chính là C16:1 và C18:1. Chính vì vậy trong thí nghiệm của Attilio, khi nuôi cấy N. oculata ở 250C, ta thấy hàm lƣợng acid béo bão hòa và acid béo chƣa bão hòa mang nhiều nối đôi có xu hƣớng giảm, trong khi C18:1 là một nguyên liệu rất phù hợp để sản xuất biodiesel thì lại tăng lên nhiều. Thêm vào đó, tại 250C, năng suất lipid của N. oculata tuy không khác biệt đáng kể so với mức 150C và 200C, nhƣng vẫn là đạt giá trị năng suất cao nhất. Còn trong thí nghiệm của Hanhua Hu và Kunshan Gao, ta thấy sản lƣợng sinh khối ở cả 3 nhiệt độ nuôi cấy không có sự khác biệt đáng kể, nhƣng hàm lƣợng lipid tổng khi nhiệt độ cao hay thấp thì tăng gần nhƣ gấp đôi so với ở 220C. Hàm lƣợng acid béo bão hòa tăng nhẹ khi nhiệt độ từ 140C tới 220C, nhƣng tăng mạnh khi nhiệt độ tăng từ 220C tới 300C và hàm lƣợng acid béo mang nhiều nối đôi giảm đáng kể. Vì vậy khi kết hợp kết quả của 2 thí nghiệm, ta thấy cần tăng nhiệt độ để giảm hàm lƣợng EPA trong tế bào Nannochloropsis oculata, tuy nhiên không nên tăng nhiệt độ quá cao so với nhiệt độ tối ƣu để hàm lƣợng C16:0 chỉ tăng một lƣợng nhỏ. Do đó, điều kiện nhiệt độ thích hợp nuôi cấy N. oculata nhằm sản xuất biodiesel chính là ở 250C – 270C. 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 32 3.2.2. Yếu tố ánh sáng Tốc độ sinh trƣởng của tảo tự dƣỡng là một hàm không tuyến tính theo mức độ chiếu sáng. Tại mật độ dòng photon thấp, tốc độ sinh trƣởng gần nhƣ tuyến tính theo mức độ chiếu sáng; tuy nhiên, tại cƣờng độ sáng cao, tốc độ sinh trƣởng trở nên bão hòa (cân bằng) so với mức độ chiếu sáng. Các tế bào sinh trƣởng tại các mức độ chiếu sáng khác nhau có các đặc điểm sinh trƣởng khác nhau và cho thấy có sự thay đổi đáng kể trong thành phần hóa học tổng quát, hàm lƣợng sắc tố và hoạt động quang hợp [23, 65, 59, 76]. Theo kết quả khảo sát của Assaf Sukenik và Yael Carmeli về sự điều hòa hoạt động tổng hợp các thành phần acid béo của Nannochloropsis sp. thông qua chế độ chiếu sáng [77], ta có thể dự đoán rằng khi nuôi tế bào vi tảo Nannochloropsis oculata ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau bao gồm ánh sáng giới hạn sinh trƣởng, ánh sáng bão hòa sinh trƣởng và ánh sáng gây kìm hãm, thành phần các hợp chất hóa học và số lƣợng tế bào trong dịch nuôi cấy cũng sẽ có sự thay đổi. Trong nghiên cứu của Assaf Sukenik và Yael Carmeli, huyền phù Nannochloropsis sp. đƣợc nuôi trong môi trƣờng f/2, nƣớc biển thiên nhiên, ở 250C [29]. Trong suốt phase sinh trƣởng logarith, các mẫu đƣợc lấy để đo mức độ sinh trƣởng và thành phần sắc tố. Cuối phase sinh trƣởng thu mẫu để xác định thành phần lipid. Ảnh hƣởng của mức độ chiếu sáng đƣợc xác định bằng cách duy trì trạng thái ổn định điều kiện môi trƣờng trong thiết bị turbidostat 2.6L (là một thiết bị nuôi cấy liên tục), ánh sáng đƣợc cung cấp thông qua các đèn huỳnh quang trắng ít tỏa nhiệt, 20W (Osram, W. Germany) theo ba mức độ đƣợc ký hiệu là: growth-limiting (GLL) 35µmol /m2s; growth-saturating (GSL) 290 µmol/m 2 s và photoinhibiting (PIL) 550 µmol /m 2 s. Assaf Sukenik và Yael Carmeli đã thu đƣợc một số kết quả nhƣ sau [77]: - Mức độ sinh trƣởng và thành phần nội bào Mức độ chiếu sáng có mối liên hệ mật thiết với mức độ sinh trƣởng của huyền phù Nannochloropsis sp.. Mức độ sinh trƣởng tế bào sẽ đạt bão hòa khi mật độ dòng photon trên 200 µmol/m2s. Khi ánh sáng vƣợt qua một ngƣỡng nào đó, sẽ trở thành yếu tố ức chế sự sinh trƣởng của tế bào, cụ thể ở Nannochloropsis sp. là 500 µmol/m 2 s. Hảm lƣợng chlorophyll nội bào giảm theo hàm số mũ khi mức độ chiếu sáng tăng, đƣợc thể hiện qua đồ thị sau: 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 33 Hình 3. 3: Ảnh hƣởng của mức độ chiếu sáng trên sự sinh trƣởng của tế bào và hàm lƣợng chlorophyll a [S8] Mức độ sinh trƣởng của tế bào và hàm lƣợng chlorophyll a đƣợc xác định trong phase sinh trƣởng hàm số mũ, thành phần acid béo đƣợc xác định khi bắt đầu phase cân bằng. Hàm lƣợng chlorophyll a trong tế bào giảm hơn 85% khi mức độ chiếu sáng tăng 20 lần từ 30 tới 600 µmol/m2s. Những thay đổi về sắc tố nội bào có mối liên hệ với thành phần acid béo. Hình 3. 4: Sự phân phối các acid béo chính trong Nannochloropsis sp. đƣợc nuôi cấy theo mẻ dƣới ảnh hƣởng của mức độ chiếu sáng [77] 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 34 Tuy nhiên, để xác định ảnh hƣởng của mức độ chiếu sáng trên sự hình thành các hợp chất hóa học nội bào, thiết bị nuôi cấy turbidostat cần đƣợc điều chỉnh sao cho chế độ chiếu sáng (bao gồm thời gian chiếu sáng, góc độ chiếu sáng) không gây ảnh hƣởng tới sự sinh trƣởng của tế bào. Khi đƣợc nuôi cấy dƣới mức độ chiếu sáng GLL (35µmol /m2s), môi trƣờng nuôi cấy Nannochloropsis bị giới hạn về ánh sáng, và mức độ nhân đôi tế bào chỉ đạt 57% so với khi nuôi ở điều kiện ánh sáng bão hòa (GSL, 290 µmol /m 2s). Điều kiện ánh sáng PIL (550µmol /m2s) lại có tác dụng ức chế, gây giảm mức độ nhân đôi của tế bào một phần. Khi mức độ chiếu sáng tăng lên đến 850µmol /m2s, mức độ nhân đôi tế bào giảm nghiêm trọng. Điều đó cho thấy, Nannochloropsis sp. khá nhạy cảm với dòng photon có mật độ cao. Nồng độ các sắc tố quang hợp giảm đi khi cƣờng độ ánh sáng tăng. Hàm lƣợng carotenoid giảm không tƣơng xứng với lƣợng chlorophyll a. Kết quả là tỷ lệ giữa carotenoid:chlorophyll a tăng lên khi mức độ chiếu sáng tăng. Nồng độ protein vẫn duy trì không đổi, trong khi đó carbohydrate, lipid và các acid béo tăng khi tăng mức độ chiếu sáng. Tỷ lệ khối lƣợng acid béo trong tổng lƣợng lipid tăng khi tế bào đƣợc nuôi ở GSL, điều này cho thấy có sự tăng tƣơng ứng về triacylglycerol. Nhƣng khi nuôi cấy ở chế độ PIL thì hàm lƣợng lipid và các acid béo nội bào không gia tăng thêm nữa so với chế độ GSL. - Thành phần acid béo Thành phần acid béo trong Nannochloropsis sp. chủ yếu là C20:5, tiếp theo là C16:1, nhƣ đã nêu ở phần trên. Các kết quả nghiên cứu khi nuôi cấy theo mẻ cho thấy rằng mức độ chiếu sáng thực sự ảnh hƣởng nhiều đến thành phần acid béo trong tế bào vi tảo. Khi tăng cƣờng độ chiếu sáng, hàm lƣợng các PUFA nhƣ C20:4 và C20:5 giảm theo hàm số mũ, đồng thời hàm lƣợng C16:0 và C16:1 tăng lên. Những kết quả này đã đƣợc kiểm tra thông qua nuôi cấy điều kiện ổn định liên tục ở các mức độ chiếu sáng khác nhau. Khi nuôi ở điều kiện ánh sáng GLL, hàm lƣợng acid béo C20:4 và C20:5 đạt khá cao, lần lƣợt là 7.8 và 37.6%, hàm lƣợng C16:0 và C16:1 thấp. Khi nuôi ở điều kiện ánh sáng GSL và PIL thì hàm lƣợng C16:0 và C16:1 cao hơn, trong khi phần trăm C20:4 và C20:5 giảm mạnh. - Sự tổng hợp lipid Quá trình đồng hóa CO2 tạo thành các loại lipid trong tế bào vi tảo cũng phụ thuộc nhiều vào mức độ chiếu sáng. Dƣới điều kiện ánh sáng yếu, chỉ có 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 35 26% là triacylglycerol và tới 40% là các galactolipid, trong đó 26% là monogalactosyl diacylglycerol và 14% là digalactosyl diacylglycerol. Dƣới điều kiện ánh sáng bão hòa (GSL), sự tổng hợp triacylglycerol tăng lên và hàm lƣợng tổng galactolipid giảm xuống. Xu hƣớng này vẫn tiếp tục khi tăng mức độ chiếu sáng đến mức ức chế (PIL), cụ thể là chiếu sáng ở 550µmol /m2s thì Nannochloropsis sp. sẽ tổng hợp 50% triacylglycerol và chỉ có 24% là galactolipid, trong đó hàm lƣợng digalactosyl diacylglycerol chỉ giảm nhẹ, còn hàm lƣợng monogalactosyl diacylglycerol giảm mạnh. Phần carbon lipid còn lại chiếm khoảng 24-36% hàm lƣợng carbon lipid chính là các phospholipid, sắc tố và một số loại lipid khác chƣa xác định. Hình 3. 5: Thành phần acid béo của Nannochloropsis sp. khi nuôi cấy trong điều kiện ổn định liên tục tại ba mức độ chiếu sáng: GLL 35µmol /m2s, GSL 290µmol /m 2 s và PIL 550µmol /m 2 s [S8] - Liên hệ mục tiêu sản xuất biodiesel Chất lƣợng của biodiesel có liên quan mật thiết với tính chất nguồn cung cấp lipid. Nhƣ đã nêu ở phần trên, nguồn lipid phù hợp để sản xuất biodiesel là nguồn lipid có thành phần lipid chủ yếu là các triacylglycerol với hàm lƣợng các acid béo C16:1 và C18:1 càng cao càng lý tƣởng, hàm lƣợng các acid béo chƣa no mang nhiều nối đôi nhƣ C20:4 và C20:5 nằm trong một tỷ lệ giới hạn nhất định, thành phần acid béo lại phụ thuộc vào mức độ chiếu sáng. Do đó, khi nuôi cấy Nannochloropsis oculata nhằm mục đích cung cấp lipid sản xuất biodiesel cần phải thiết lâp chế độ chiếu sáng sao cho ánh sáng tối thiểu 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 36 đạt mức bão hòa sinh trƣởng (GSL). Tại mức độ chiếu sáng GSL (290 µmol /m 2 s), sinh khối thu đƣợc là hiệu quả nhất, hàm lƣợng C16:1 và C18:1 cao, tuy nhiên triacylglycerol chƣa cao lắm. Nhƣng nếu chiếu sáng ở mức PIL (550 µmol /m 2 s), ta thấy hàm lƣợng C16:1 và C18:1 có xu hƣớng giảm còn C20:5 lại bắt đầu tăng trở lại mặc dù lƣợng triacylglycerol đƣợc tổng hợp nhiều hơn. Chính vì vậy, để đạt hiệu quả tối ƣu trong nuôi cấy Nannnochloropsis oculata, hƣớng chiếu sáng đƣợc đề nghị sử dụng là trong khoảng ánh sáng bão hòa cao, gần đạt đến mức ức chế, nghĩa là vào khoảng 400 - 500 µmol /m2s. 3.2.3. Yếu tố độ mặn Hanhua Hu và Kunshan Gao khảo sát sự ảnh hƣởng của độ mặn môi trƣờng lên sự sinh trƣởng và thành phần các acid béo của Nannochloropsis sp. Thí nghiệm đƣợc thiết kế nhƣ sau: Nannochloropsis sp. đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng f/2AW, nhiệt độ 220C, mức độ sục khí 200mL/phút với hàm lƣợng CO2 cao (2800µL/L), mức độ chiếu sáng 50µmol/m2s, thu mẫu vào ngày thứ 10 sau khi cấy giống. Điều chỉnh độ mặn của nƣớc biển nhân tạo bằng NaCl ở các nồng độ nhƣ sau: 0.20, 0.36, 0.72, 1 hoặc 1.5M. Mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần [31]. - Sự sinh trƣởng và hàm lƣợng lipid trong tế bào Nannochloropsis sp. phát triển tốt nhất trong môi trƣờng có độ mặn là 31g/L (0.36M NaCl). Qua các nồng độ muối khảo sát, loài vi tảo này thể hiện khả năng duy trì tốt sự sinh trƣởng trong khoảng độ mặn 22 – 49g/L (0.2-0.72M NaCl) [31]. Hàm lƣợng lipid trong Nannochloropsis sp. khi đƣợc nuôi cấy ở khoảng độ mặn từ 22 – 49g/L xấp xỉ khoảng 11%. Tuy nhiên, khi nồng độ muối tăng lên đến 64g/L thì hàm lƣợng lipid tăng lên 18%, nghĩa là tăng hơn 50% so với các độ mặn thấp hơn [31]. Bảng 3. 4: Sản lƣợng sinh khối và hàm lƣợng lipid của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các độ mặn khác nhau [31] NaCl (M)/Độ mặn (g/L) Sinh khối khô (mg/L) Lipid (%w/w) 0.20/22 275 ± 13.9 12 ± 0.4 0.36/31 308 ± 15.4 11 ± 0.3 0.72/49 237 ± 10.3 11 ± 0.4 1.00/64 36 ± 5.1 18 ± 0.6 1.50/88 10 ± 2.3 - 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 37 - Thành phần các acid béo Các acid béo chiếm ƣu thế trong tế bào Nannochloropsis sp. là acid palmitic (C16:0), acid palmitoleic (C16:1) và EPA (C20:5ω3), bất kể là sinh trƣởng trong môi trƣờng nào. Tỷ lệ phần trăm acid oleic (C18:1) có xu hƣớng tăng khi tăng độ mặn môi trƣờng nuôi cấy. Trong khi đó, TFA lại có xu hƣớng giảm [31]. Tỷ lệ % của PUFAs giảm khi tăng nồng độ muối, cụ thể đạt giá trị là 39%, 36%, 35%, và 17% tƣơng ứng với các độ mặn 22, 31, 49 và 64g/L. Bảng 3. 5: Thành phần acid béo (%w/w TFA) của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các độ mặn khác nhau [31] NaCl (M)/Độ mặn (g/L) 0.20/22 0.36/31 0.72/49 1.00/64 TFA (mg/g DW) 90 ± 3.3 78 ± 2.5 46 ± 0.9 11 ± 0.7 Acid béo C14:0 3.1 ± 0.3 3.3 ± 0.1 4.1 ± 0.2 9.0 ± 0.3 C16:0 25.3 ± 1.1 24.9 ± 1.5 22.1 ± 1.0 29.8 ± 1.9 C16:1 24.0 ± 0.7 26.0 ± 1.2 27.8 ± 0.9 23.6 ± 0.8 C18:0 Tr Tr Tr Tr C18:1 4.5 ± 0.2 4.6 ± 0.3 6.2 ± 0.5 17.8 ± 1.1 C18:2 6.7 ± 0.3 7.8 ± 0.8 6.3 ± 0.1 4.7 ± 0.2 C20:1 2.6 ± 0.3 3.5 ± 0.2 3.2 ± 0.1 Tr C20:4 4.1 ± 0.1 4.0 ± 0.1 4.9 ± 0.2 3.9 ± 0.4 C20:5 27.0 ± 0.5 23.6 ± 0.9 23.7 ± 1.1 8.4 ± 0.4 C22:6 Tr Tr Tr Tr Các loại khác 1.7 ± 0.3 1.5 ± 0.5 1.5 ±0.6 1.7 ± 0.1 Tr: trace, giá trị vết, dƣới 1%. - Liên hệ mục tiêu sản xuất biodiesel Mục tiêu sản xuất biodiesel gắn liền với năng suất lipid trong quá trình nuôi cấy vi tảo. Vì vậy, mặc dù tại nồng độ muối cao (64g/L), hàm lƣợng C18:1 tăng cao đáng kể và C20:5 giảm mạnh, hàm lƣợng C16:0 và C16:1 không có sự biến đổi mạnh, nhƣng sản lƣợng sinh khối khô Nannochloropsis sp. lại quá thấp (36mg/L) nên không thể đáp ứng nhu cầu lipid trong sản xuất. Tế bào sinh trƣởng trong môi trƣờng có độ mặn 31 và 49g/L khi so với độ mặn 22g/L thì hàm lƣợng C20:5 có xu hƣớng giảm nhẹ, C18:1 và C16:1 lại 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 38 tăng. Mức độ sinh trƣởng trong môi trƣờng độ mặn 31g/L là cao nhất (sinh khối khô đạt 308mg/L). Mức độ sinh trƣởng của tế bào trong môi trƣờng độ mặn 49g/L cũng khá cao (237mg/L). Do đó có thể lựa chọn hai mức độ mặn này để nuôi cấy Nannochloropsis oculata nhằm thu lipid. Để có thể chọn đƣợc nồng độ muối phù hợp nhất, môi trƣờng nuôi cấy cần đƣợc khảo sát hai nồng độ muối trên kết hợp với các yếu tố khác nhƣ nồng độ nitrogen, phosphorus và CO2, nhiệt độ và mức độ chiếu sáng. 3.2.4. Yếu tố thành phần môi trƣờng 3.2.4.1. Thành phần carbon Các loài vi tảo sống trong đại dƣơng có khả năng quang hợp cao và dễ dàng đƣợc nuối cấy trong môi trƣờng nƣớc biển vốn hòa tan một lƣợng lớn CO2 [72]. Sự cố định CO2 nhờ vào quá trình quang hợp của vi tảo đồng thời chuyển hóa sinh khối thành dạng nhiện liệu lỏng đƣợc xem là một quá trình đơn giản và rất có giá trị đối với sự luân chuyển CO2 hiện nay, tạo nên một giải pháp an toàn cho môi trƣờng [79]. Nannochloropsis oculata là một loài vi sinh vật đáng đƣợc quan tâm trong lĩnh vực công nghệ sinh học về các đối tƣợng thuộc đại dƣơng vì N. oculata có hàm lƣợng lipid cao. Sheng – Yi Chiu và các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ CO2 trong dòng khí bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy lên sản lƣợng sinh khối và sự tích lũy lipid ở N. oculata, qua đó đánh giá hiệu quả năng suất lipid khi nuôi cấy theo mẻ và bán liên tục N. oculata [72]. Vi tảo N. oculata đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng f/2 [72], thiết bị quang phản ứng hình trụ bằng thủy tinh, nhiệt độ 26 ± 10C, dƣới ánh sáng 300µmol/m 2 s liên tục từ các đèn huỳnh quang ít tỏa nhiệt. Khí cung cấp vào (đƣợc lọc qua màng lọc 0.22µm) có các nồng độ CO2 khác nhau: 2%, 5%, 10% và 15%. Khí đƣợc sục từ đáy thiết bị với tốc độ sục là 200mL/phút (tƣơng đƣơng 0.25vvm) [72]. Sau đó, Sheng – Yi Chiu và các cộng sự đã rút ra đƣợc một số kết luận sau: - Sinh trƣởng của N. oculata dƣới các nồng độ CO2 khác nhau khi nuôi cấy theo mẻ [72] Dịch nuôi cấy theo mẻ đƣợc đặt ở 26 ± 10C, chiếu sáng liên tục 300µmol/m 2 s, sục khí bởi không khí (nồng độ CO2 xấp xỉ 0.03%), 2%, 5%, 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 39 10% và 15% CO2. Môi trƣờng đƣợc lấy mẫu sau mỗi 8h. Đƣờng cong sinh trƣởng của mỗi thí nghiệm đƣợc thể hiện trong đồ thị sau: Hình 3. 6: Ảnh hƣởng của nồng độ sục khí CO2 lên sự sinh trƣởng của N. oculata Mức độ sinh trƣởng đặc trƣng khi sục không khí và 2% CO2 lần lƣợt là 0.194/ngày và 0.571/ngày. Qua đồ thị ta thấy mức độ sục khí 2% CO2 kích thích sự sinh trƣởng của N. oculata cao nhất. Không chỉ có sinh khối, mà mức độ sinh trƣởng đặc trƣng khi nuôi cấy ở 2% CO2 cũng cao hơn khi nuôi N. oculata bằng không khí. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Hu và Gao [33]. N. oculata sinh trƣởng tốt nhất trong môi trƣờng giàu CO2 hơn trong không khí, có lẽ là nhờ nguồn carbon cung cấp cho vi tảo không bị hạn chế. Tuy nhiên, khi hàm lƣợng CO2 quá cao, 5 – 15%, sẽ gây ra sự ức chế đáng kể [72]. - Hàm lƣợng lipid của vi tảo tại các phase sinh trƣởng khác nhau [72] Hàm lƣợng lipid trong vi tảo đƣợc đo ở phase sinh trƣởng, phase cân bằng sớm và phase cân bằng. Các kết quả cho thấy hàm lƣợng lipid có mối liên hệ chặt chẽ với phase sinh trƣởng. Cụ thể là hàm lƣợng lipid trong N. oculata tại phase sinh trƣởng, phase cân bằng sớm và phase cân bằng lần lƣợt là 30.8, 39.7 và 50.4%. Kết quả này cho thấy hàm lƣợng lipid tích lũy trong tế bào tăng lên khi N. oculata bƣớc vào phase cân bằng. Liên hệ với nồng độ nitrate trong dịch nuôi cấy, các mẫu đƣợc đem xác định sự giảm hàm lƣợng nitrate tại các phase khác nhau, trong đó hàm lƣợng nitrate giảm dần từ phase sinh trƣởng trở đi, điều này ám chỉ rằng lƣợng nitrate bị thiếu hụt khi dịch nuôi cấy bƣớc vào phase cân bằng. Sự thiếu hụt chất dinh dƣỡng, cụ thể là thiếu hụt nitrogen đã làm gia tăng mức độ tổng hợp lipid. 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 40 - Ảnh hƣởng của nồng độ CO2 lên sự sinh trƣởng tế bào trong nuôi cấy bán liên tục [72] Trƣớc khi nuôi cấy trong môi trƣờng sục khí với nồng độ CO2 cao, N. oculata đƣợc trải qua giai đoạn thích nghi trong môi trƣờng 2% CO2 trƣớc khi cấy vào thiết bị nuôi cấy bán liên tục. Thêm vào đó, lƣợng giống cấy vào môi trƣờng có mật độ tế bào cao (xấp xỉ 0.4g/L). Hệ thống bán liên tục đƣợc vận hành trong 8 ngày và sự sinh trƣởng của tế bào đƣợc giữ ổn định bằng cách thay ½ lƣợng môi trƣờng mỗi ngày, duy trì dịch nuôi cấy luôn ở phase sinh trƣởng. Kết quả là mức độ sinh trƣởng của N. oculata khi sục khí với nồng độ CO2 2%, 5%, 10% và 15% là tƣơng đƣơng nhau. Mức độ sinh trƣởng đặc trƣng trung bình và mật độ tế bào tối đa (nồng độ sinh khối) lần lƣợt đạt từ 0.683 đến 0.733/ngày và 0.745 và 0.928g/L tại các nồng độ CO2 khác nhau. Khi sục khí với hàm lƣợng CO2 cao (5 – 15%) có thể gây ảnh hƣởng không tốt lên sự sinh trƣởng tế bào nhƣ thể hiện trong đồ thị nêu ở trên. Nhƣng khi tăng mật độ tế bào dịch cấy và trải qua quá trình thích nghi trƣớc với nồng độ CO2 2% thì có thể cải thiện đƣợc khả năng sinh trƣởng của vi tảo trong môi trƣờng sục khí với hàm lƣợng CO2 cao. Hình 3. 7: Sự sinh trƣởng của N. oculata khi nuôi cấy bán liên tục trong môi trƣờng sục khí có chứa 2%, 5%, 10%, 15% CO2 [72] 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 41 Kết quả này chứng tỏ rằng khi gia tăng mật độ tế bào trong dịch cấy và tạo điều kiện cho tế bào thích nghi trong môi trƣờng có nồng độ CO2 lý tƣởng thì quá trình nuôi cấy với nồng độ CO2 cao sau đó sẽ không gặp phải những tác dụng tiêu cực lên sự sinh trƣởng của tế bào vi tảo. - Sinh khối và năng suất lipid trong nuôi cấy bán liên tục Trong hệ thống nuôi cấy bán liên tục, N. oculata đƣợc thu mẫu vào thời gian trƣớc khi dịch nuôi cấy đƣợc thay ½ môi trƣờng mỗi ngày để xác định sinh khối và năng suất lipid. Bảng 3. 6: Năng suất sinh khối và lipid của N. oculata trong hệ thống nuôi cấy bán liên tục với các hàm lƣợng CO2 khác nhau [72] Nồng độ CO2 Tổng năng suất sinh khối (khối lƣợng tế bào khô, g/L.ngày) Tổng năng suất lipid (g/L.ngày) Phần trăm hàm lƣợng lipid (%) 2% 0.480 ± 0.029 0.142 ± 0.049 29.7 ± 2.0 5% 0.441 ± 0.044 0.113 ± 0.035 26.2 ± 1.9 10% 0.398 ± 0.069 0.097 ± 0.026 24.6 ± 1.7 15% 0.372 ± 0.022 0.084 ± 0.021 22.7 ± 1.9 (Hệ thống nuôi cấy bán liên tục thực hiện trong 8 ngày, ½ môi trƣờng mới đƣợc thay mỗi ngày. Thể tích thiết bị quang phản ứng là 800mL, thể tích dịch thải mỗi ngày là 400mL. Số liệu ±SD đƣợc đo mỗi ngày từ ngày 1 tới ngày 8). Khi tăng nồng độ CO2 từ 2 tới 15%, cả sinh khối lẫn năng suất lipid đều có xu hƣớng giảm. Khi nồng độ CO2 là 2%, 5%, 10%, 15% thì pH của môi trƣờng lần lƣợt tƣơng ứng là 7.8, 7.7, 7.3 và 7.0. Quá trình đồng hóa carbon để tổng hợp lipid sẽ giảm khi pH môi trƣờng giảm [90]. Điều này có thể là do khi môi trƣờng có pH càng cao thì lƣợng bicarbonate có thể dùng đƣợc cho sự tổng hợp mạch carbon trong lipid càng nhiều. Điều này nói lên rằng sự tích lũy lipid trong N. oculata có thể chủ yếu bị ảnh hƣởng bởi pH và hàm lƣợng lipid trong tế bào vi tảo sẽ giảm khi pH giảm [72]. - Liên hệ mục tiêu sản xuất biodiesel Nannochloropsis oculata nhạy cảm với nồng độ CO2 sục vào môi trƣờng nuôi cấy. Môi trƣờng giàu CO2 (2%) so với sục không khí sẽ làm tăng sự sinh trƣởng của N. oculata, nhƣng khi môi trƣờng chứa nhiều CO2 hơn nữa 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 42 (5-15%) thì loài vi tảo này lại bị ức chế mạnh. Tuy nhiên, khi nuôi cấy bán liên tục lại cho thấy rằng sự ức chế này hoàn toàn có thể khắc phục đƣợc nếu cho N. oculata trải qua quá trình thích nghi với nồng độ CO2 2% trƣớc khi sục khí ở các chế độ từ 5-15%. Vì vậy, để nuôi cấy N. oculata nhằm thu năng suất lipid lớn, tối ƣu nhất nên nuôi cấy ở nồng độ CO2 2%, lƣợng sinh khối và lipid đều đạt giá trị cực đại so với các nồng độ khác. Tuy nhiên, nếu muốn kết hợp nuôi cấy N. oculata vừa phục vụ mục đích sản xuất biodiesel vừa lợi dụng đặc tính quang hợp cao của loài này để cố định CO2, điều chỉnh chu trình tuần hoàn CO2 nhằm cải thiện tình trạng ô nhiễm môi trƣờng, N. oculata có thể đƣợc nuôi cấy ở nồng độ CO2 cao khi đã qua quá trình thích nghi với môi trƣờng giàu CO2 so với không khí. 3.2.4.2. Thành phần nitrogen - Thí nghiệm của Attilio và các cộng sự [5] Nannochloropsis oculata đƣợc nuôi trong môi trƣờng Guillard f/2, nguồn cung cấp carbon là CO2 trong không khí (khoảng 300ppm), nguồn cung cấp nitrogen là NaNO3, nuôi trong 14 ngày, dƣới điều kiện ánh sáng liên tục 70.0µE/m2s, nhiệt độ môi trƣờng là 200C. Nồng độ nitrogen thích hợp để nuôi N. oculata theo Guillard là 0.300g/L. Do đó, để khảo sát ảnh hƣởng của sự thiếu hụt nitrogen trong môi trƣờng nuôi cấy lên sự sinh trƣởng và thành phần lipid trong tế bào vi tảo, Attilio và các cộng sự đã thí nghiệm với các nồng độ NaNO3 là 0.300, 0.150, và 0.075g/L [5]. Bảng 3. 7: Tham số sinh trƣởng và sự sản xuất lipid của N. oculata ở các nồng độ NaNO3 khác nhau [5] NaNO3(g/L) µ-Tốc độ sinh trƣởng đặc trƣng (1/ngày) Sản lƣợng lipid (glipid/100gsinh khối khô) Năng suất lipid (mglipid/L.ngày) 0.300 0.13±0.00 7.88±0.21 10.01±0.16 0.150 0.10±0.00 13.01±0.39 13.61±1.10 0.075 0.10±0.00 15.86±0.59 16.41±0.11 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 43 Hình 3. 8: Phần trăm các loại acid béo methyl ester trên tổng lƣợng acid béo methyl ester (g/100gFAME) của N. oculata tại các nồng độ NaNO3 khác nhau [5] (FAME: fatty acid methyl ester) - Thí nghiệm của Hanhua Hu và Kunshan Gao Một thí nghiệm khác của Hanhua Hu và Kunshan Gao nhằm khảo sát nồng độ nitrate đối với sự sinh trƣởng, tích lũy lipid, và thành phần lipid trong tế bào cũng cho thấy rằng sự thiếu hụt nitrogen trong môi trƣờng nuôi cấy có tác dụng đáng kể lên các đặc điểm hóa sinh của loài vi tảo này. Thí nghiệm của Hu và Gao đƣợc thiết lập ở các chế độ nhƣ sau: tế bào vi tảo Nannochloropsis sp. đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng 220C, sục khí 200mL/phút với hàm lƣợng CO2 là 2800µL/L, mức độ chiếu sáng 50µmol/m 2s, hàm lƣợng nitrate đƣợc điều chỉnh dựa theo môi trƣờng f/2AW cơ bản: 150 (hàm lƣợng N thấp), 600 (hàm lƣợng N trung bình) và 3000µM NO3 - (hàm lƣợng N cao) với 36µM PO4 3- . Dùng NaNO3 để điều chỉnh hàm lƣợng N. Mỗi thí nghiệm đƣợc lập lại 3 lần [31]. Khi tăng nồng độ nitrate từ 150µM đến 600µM, sản lƣợng sinh khối của dịch nuôi cấy tăng 39%. Tuy nhiên, nếu tăng nồng độ này lên cao 3000µM thì lƣợng sinh khối lại có xu hƣớng giảm nhẹ [31]. Hàm lƣợng lipid trong vi tảo tăng cao khi nồng độ nitrate giảm mạnh. Lƣợng acid béo tổng tăng đáng kể với nồng độ nitrate thấp. Trong đó, hàm lƣợng C18:1, C16:1 và C16:0 có xu hƣớng tăng khi nồng độ nitrate giảm, còn acid C20:5 thì lại giảm khi nồng độ nitrate trong môi trƣờng thấp. Hàm lƣợng của PUFAs lần lƣợt đạt 12%., 23%, 41% tƣơng ứng với các nồng độ N thấp, trung bình và cao [31]. 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 44 Tuy nhiên, hàm lƣợng C18:1 trong kết quả của Hu và Gao có chút khác biệt so với trong thí nghiệm của Attilio và các cộng sự (C18:1 giảm khi giảm nồng độ nitrate). Sự khác biệt này có thể là do hai nghiên cứu thiết lập tại điều kiện nuôi cấy khác nhau (ánh sáng và nhiệt độ). Thêm vào đó có thể do Nannochloropsis sp. có vài điểm không tƣơng đồng với Nannochloropsis oculata. Thực tế, C18:1 chỉ là thành phần thứ yếu trong thành phần lipid của loài vi tảo này. Vì vậy, sự khác biệt này đƣợc xem là ảnh hƣởng không đáng kể trong quá trình nghiên cứu. Bảng 3. 8: Sản lƣợng sinh khối và thành phần hợp chất hóa sinh của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các nồng độ NaNO3 khác nhau [31] NaNO3 (µM) Sinh khối khô (mg/L) Lipid (%w/w) 150 220 ± 10.4 62 ± 2.8 600 305 ± 20.5 23 ± 0.9 3000 296 ± 15.6 13 ± 0.6 Bảng 3. 9: Thành phần acid béo (%w/w TFA) của Nannochloropsis sp. vào ngày thứ 10 tại các nồng độ NaNO3 khác nhau [31] NaNO3 (µM) 150 600 3000 TFA (mg/g DW) 403 ± 8.5 136 ± 5.7 105 ± 5.3 Acid béo C14:0 3.3 ± 0.2 3.7 ± 0.2 3.6 ± 0.3 C16:0 38.2 ± 1.2 33.9 ± 0.8 22.7 ± 1.4 C16:1 28.3 ± 0.9 23.7 ± 0.6 22.7 ± 1.1 C18:0 Tr Tr Tr C18:1 16.4 ± 0.8 13.4 ± 0.6 4.1 ± 0.1 C18:2 2.7 ± 0.5 4.2 ± 0.1 7.0 ± 0.8 C20:1 Tr Tr 3.3 ± 0.5 C20:4 1.1 ± 0.1 2.5 ± 0.2 3.6 ± 0.1 C20:5 7.9 ± 0.3 15.7 ± 0.8 29.9 ± 0.9 C22:6 Tr Tr Tr Các loại khác Tr 1.1 ± 0.2 2.3 ± 0.3 Tr: trace, giá trị vết, dƣới 1%. 3. NUÔI N. OCULATA SẢN XUẤT BIODIESEL 45 - Liên hệ mục tiêu sản xuất biodiesel Qua số liệu thu đƣợc ta thấy rằng, N. oculata có mức sinh trƣởng giảm khi giảm nồng độ NaNO3 và hàm lƣợng lipid thì gần nhƣ tăng gấp đôi. Kết quả này chứng tỏ rằng đây là một loài vi tảo phù hợp với mục tiêu nuôi cấy để sản xuất biodiesel, nhiệm vụ của các nhà nghiên cứu chính là tìm ra điều kiện môi trƣờng tối ƣu sao cho mức sinh trƣởng của vi tảo chỉ