Đề tài Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao

BỢ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC DÂN LẬP VĂN LANG KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC Đề tài GVHD : ThS. CAO NGỌC MINH TRANG Lớp : K13S2 SVTH : Nguyễn Thanh Bá Nguyễn Ngọc Minh Châu Nguyễn Ngọc Khánh Võ Hưng Minh Thư Phạm Ngọc Đan Thanh Trần Thị Yến Vân Phạm Huỳnh Mai Đặng Thị Bích Phương Nguyễn Thị Kim Sa Nguyễn Thị Thương Trần Lê Đình Đại Nguyên TP HCM – 11/2010 I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Sắc ký là những kỹ thuật tách và phân tích trong mợt hỡn hợp mẫu dựa trên những tính chất hoá học, vật lý và hoá lý của các chất trong những điều kiện nhất định. Các tính chất đó có thể là : Tính chất hấp phụ của chất rắn. Tính chất trao đởi ion, tạo cặp ion. Sự rây phân tử theo kích thước của chúng. Sự tạo phức và sự liên hợp phân tử. Sự phân bớ của các chất giữa hai pha khơng hoà tan vào nhau… Kỹ thuật sắc ký có hai loại dựa theo trạng thái của chất mẫu khi tiến hành tách sắc ký. Đó là: Kỹ thuật phân tích sắc ký khí. Kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng. Kỹ thuật sắc ký lỏng lại được chia thành hai nhóm : Sắc ký lỏng áp suất thường (sắc ký cở điển). Sắc ký lỏng hiệu suất cao (áp suất cao : HPLC). Kỹ thuật phân tích HPLC bao gờm hai nhóm : Sắc ký lớp mỏng áp suất cao (HPTLC). Sắc ký cợt lỏng áp suất cao hay sắc ký hiệu suất cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) là phương pháp chia tách trong đĩ pha động là chất lỏng cịn pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng đã phủ lên một chất mang rắn hay là một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hĩa học với các nhĩm chức hữu cơ. Trong nhóm HPLC, tuỳ theo bản chất của quá trình sắc ký của pha tĩnh trong cợt tách mà người ta chia thành : Sắc ký phân bớ (PC) của chất tan giữa hai pha khơng trợn nhau. Sắc ký hấp phụ thường (NP – HPLC). Sắc ký hấp phụ pha ngược hay pha đảo (RP – HPLC). Sắc ký trao đởi ion (IE – HPLC) và cặp ion (IP – HPLC). Sắc ký rây phân tử (FG – HPLC). Mợt cách tởng quát chúng ta có thể minh hoạ khái quát sự phân chia này theo sơ đờ : Sự phân chia trên đây là dựa theo tính chất của quá trình sắc ký nhưng cũng chỉ là tương đới. Vì trong nhiều trường hợp, quá trình tách sắc ký xảy ra khơng phải chỉ theo mợt tính chất (mợt cơ chế) duy nhất, mà đờng thời có thể theo hai hay nhiều cơ chế khác nhau cùng diễn biến trong cợt tách. II. SƠ ĐỜ THIẾT BỊ VÀ NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỢNG CỦA HỆ THỚNG HPLC 1. Sơ đờ thiết bị : (2) (3) Detect¬ (6) Recorder (7) Injector (4) Solvent (1) Column (5) Trong đó : (1) : Hệ thớng dung mơi (pha đợng).Tất cả các dung mơi dùng cho HPLC đều phải là dung mơi tinh khiết và cĩ ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung mơi tinh khiết phân tích. Tất cả các hĩa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hĩa chất tinh khiết phân tích. Nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra các peak trong quá trình phân tích. (2) : Hệ thớng Gradient. (3) : Bơm cao áp. Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến - 500 at (1at =0.98 bar) và bơm phải tạo dịng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999 ml/phút (hiện nay đã cĩ nhiều loại bơm cĩ áp suất rất cao lên đến 1200 bar). Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường cĩ áp suất tợ đa 412 bar. Tốc độ dịng 0.1- 9.999 ml/phút. (4) : Bợ phận tiêm mẫu. Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp khơng ngừng dịng chảy. Với dung tích là 5 - 100µl . Cĩ 2 cách lấy mẫu vào trong cột : Bằng tiêm mẫu thủ cơng (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động (Autosample). (5) : Cợt tách (cợt sắc ký). (6) : Detector là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên săc ký đồ để cĩ thể định tính và định lượng .Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp và phải thoả mãn các điều kiện sau : Có tính chất chọn lọc và đợ nhạy cao đới với chất phân tích. Hoạt đợng ởn định và bền vững trong các điều kiện phân tích. Khơng bị ảnh hưởng hoặc ít bị ảnh hưởng bởi các tác đợng của mơi trường như đợ ẩm, áp suất, nhiệt đợ… Đợ nhiễu tự thân của các detector nhỏ (7) : Bợ phận ghi và in kết quả : để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang. Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản cĩ thể vẽ sắc ký đồ,thời gian lưu,diện tích của Peak ,chiều cao .. Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nĩ cĩ thể lưu tất cả các thơng số, phổ đồ và các thơng số của peak như tính đối xứng, hệ số phân giải.... trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính tốn các thơng số. Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính tốn ra giấy để hồn thiện hồ sơ theo yêu cầu của người sử dụng. 2. Nguyên tắc hoạt đợng Hệ thớng dung mơi (1) đóng vai trò pha đợng được trợn với nhau theo tỉ lệ thích hợp (điều khiển bằng máy tính) và có thể thay đởi thành phần bởi hệ thớng gradient (2). Pha đợng được bơm liên tục qua cợt tách bằng bợ phận tiêm mẫu (4), sau đó được pha đợng đẩy vào cợt tách (5), quá trình tách xảy ra ở đây. Các chất sau khi ra khỏi cợt tách tại các thời điểm khác nhau lần lượt vào detector (6) thích hợp và được chuyển thành thế hiệu điện rời được khuyếch đại và chuyển đến bợ phận tự ghi. Và xử lý kết quả (7). 3. Ưu điểm của kỹ thuật HPLC Có áp suất và đợ phân giải cao. Vận tớc sắc ký nhanh. Các loại đầu dò dùng cho HPLC khơng làm hư hại mẫu phân tích, nên sau khi phân tích, có thể thu hời mẫu để thực hiện các loại nghiên cứu khác như phân tích phở, thử nghiệm hoạt tính sinh học… III. QUÁ TRÌNH SẮC KÝ TRAO ĐỞI ION TRONG KỸ THUẬT HPLC Trong việc cơ lập các hợp chất tự nhiên, với hỡn hợp mẫu chất ban đầu có chứa nhiều loại hợp chất khác nhau, nếu trong sớ đó có loại hợp chất có mang điện tích, sử dụng kỹ thuật sắc ký trao đởi ion để tách hợp chất đó ra khỏi hỡn hợp. Sắc kí trao đổi Ion (IC) là một quá trình cho phép phân tách các ion hay các phân tử phân cực dựa trên tính chất của chúng. Trong kỹ thuật này, yếu tớ chính liên quan đến việc lưu giữ và tách riêng các hợp chất dựa vào sự tương tác tĩnh điện hiện diện trong mẫu phân tích với các tâm có mang điện tích ngược dấu (với điện tích của hợp chất) của pha tĩnh. Trong IC : Pha đợng chỉ có thể là chất lỏng. Việc ứng dụng sắc ký trao đởi ion vào kỹ thuật HPLC đòi hỏi pha đợng phải đáp ứng được các yêu cầu sau : Trơ đới với pha tĩnh Phải hoà tan được mẫu phân tích Phải bền vững theo thời gian Có đợ tinh khiết cao. Nhanh đạt đến cân bằng trong quá trình tách. Phù hợp với detector sử dụng. Các loại dung mơi được sử dụng làm pha đợng trong HPLC : metanol, axetonitril, benzen, n-hexan, nước. Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hoá học là polymer, nên được gọi là các hạt nhựa. Bề mặt của hạt mang các nhóm chức ở dạng ion. Có hai loại nhựa: Nhựa trao đởi anion mang nhóm chức có điện tích dương nên nhựa bắt giữ các ion âm của pha đợng. Nhựa trao đởi cation mang nhóm chức có điện tích âm nên nhựa bắt giữ các ion dương của pha đợng. Sự bắt giữ xảy ra nhờ vào lực hút tĩnh điện giữa hai điện tích ngược dấu. Các nhựa trao đởi ion được sử dụng để tách các ion vơ cơ hoặc hữu cơ. Sự tách riêng các chất của mợt hỡn hợp dựa vào việc hợp chất nào của hỡn hợp có mang điện tích ngược dấu với điện tích của hạt nhựa, bị hạt nhựa bắt giữ trong cợt. Hợp chất mang nhiều điện tích gắn mạnh vào pha tĩnh, hợp chất nào mang ít điện tích thì gắn yếu và khơng mang điện tích thì khơng gắn và ra khỏi cợt trước. Các yêu cầu đới với pha tĩnh sử dụng trong HPLC : Trơ và bền vững với các điều kiện trong mơi trường sắc ký. Có khả năng tách chọn lọc mợt hỡn hợp chất tan trong điều kiện sắc ký nhất định. Tính chất bề mặt phải ởn định. Có đợ tinh khiết cao. Nhanh đạt các cân bằng đợng học. Cỡ hạt phài tương đới đờng nhất. Các nguyên liệu sử dụng làm pha tĩnh : Pha tĩnh trên nền silica gel. Pha tĩnh trên nền nhơm oxit. Pha tĩnh trên nền hợp chất cao phân tử. Pha tĩnh trên nền mạch Cacbon. Trong đó, silica gel được sử dụng nhiều nhất vì có nhiều ưu điểm như : khả năng chịu áp suất và pH cao (nếu xảy ra trong mợt thời gian ngắn), khơng trương nở trong dung mơi, bền nhiệt… Cơ chế của kỹ thuật sắc ký trao đởi ion được dựa trên sự gắn kết có tính chất thuận nghịch giữa các phân tử có mang điện tích được minh hoạ trong hình sau đây : RG- C+ + S+ RG- S+ + C+ R : pha tĩnh còn được gọi là nhựa (resin). G : nhóm chức mang điện tích được cớ định trên pha tĩnh. Còn được gọi là nhóm chức hoạt đợng của nhựa. C : đới –ion của G. S : chất hữu cơ có mang điện tích trái dấu với G. Trong sắc ký cợt nhời, pha tĩnh R có gắn thêm nhóm chức G mang điện tích. Giả sử cho đi ngang qua cợt mợt hỡn hợp mẫu chất ban đầu có chứa nhiều loại chất tan khác nhau, chất tan nào có mang điện tích ngược dấu với điện tích của hợp chất, thí dụ chất tan S, chất tan sẽ đuởi đới –ion C ra, thế chỡ vào, để được gắn vào pha tĩnh và như thế chất tan bị giữ lại trong cợt, trong khi đó những loại chất khác của hỡn hợp mẫu chất ban đầu sẽ khơng bị giữ lại nên đi ra khỏi cợt. Kỹ thuật này đã tách riêng được hợp chất S ra khỏi hỡn hợp ban đầu. Quá trình sắc ký trao đởi ion Quá trình gắn kết giữa các phân tử mang điện tích trái dấu là quá trình có tính chất thuận nghịch, cho phép tái tạo lại được chất trao đởi ion ban đầu để có thể sử dụng lại nhiều lần. Sự thành cơng hay thất bại của của quá trình thực nghiệm trao đỡi ion tuỳ thuợc vào ái lực tương đới của nhóm chức hoạt đợng của nhựa đới với các ion khác nhau, cũng như nờng đợ của ion đó. Ngoài ra, còn có mợt sớ yếu tớ khác như sự tương tác của phân tử mẫu chất ban đầu cũng như các vùng khơng bị ion hoá trên bề mặt nhựa trao đởi. TÀI LIỆU THAM KHẢO Th.S CAO NGỌC MINH TRANG – Giáo trình Phương pháp Hoá Sinh hiện đại