Đề tài Sắc ký lỏng phân bố hiệu năng cao

‹#› Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level Click to edit Master title style BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC DÂN LẬP VĂN LANG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC SẮC KÝ LỎNG PHÂN BỐ HIỆU NĂNG CAO ĐỀ TÀI: GVHD: Cao Ngọc Minh Trang Nhóm 1 Võ Song Thành Nguyễn Bá Vinh Trần Quang Phú Trần Hoài Minh Nguyễn Thị Thu Diệu Nguyễn Thị Bích Thảo Lương Thị Kim Thoa Trần Thị Ngọc Linh Nguyễn Thị Thuý An Nguyễn Thị Hồng Nội dung Cơ sở lý thuyết Sơ đồ thiết bị HPLC Tiến hành sắc ký Ứng dụng 4 1 2 3 Phần I: Cơ sở lý thuyết HPLC (High Performance Liquid Chromatography) phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography). Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích. Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều nghành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho nghành kiểm nghiệm thuốc. Khái niệm Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử).  Nguyên tắc Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và lọai sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết.  Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử. Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có một pha động. Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C .. Vào cột phân tích, kết quả các chất A, B, C.. Sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác.  Chất A + B + C Pha tĩnh Pha động F1 F2 F3 Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa rải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1). Và ngược lại, đối với mỗi chất, sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực F1, F2, F3. Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định. Còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn . Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột. F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột. Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau, kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột. Phần II: Sơ đồ thiết bị HPLC 1 - Bình đựng dung môi Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp. Cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 4 đường là 100%. Lưu ý: - Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích. - Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phân tích. Nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, Tạo ra các Peak tạp trong quá trình phân tích. 2 - Bộ khử khí Degasse Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động. Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ sảy ra. - Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của Peak thay đổi.- Trong trường hợp bọt quá nhiều Bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể Pump sẽ không hút được dung môi khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động. Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai. 3-Bơm Cao áp Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Pump phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250-500at (1at=0.98 bar) và pump phải tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999ml/phút. (hiện nay đã có nhiều loại Pump có áp suất rất cao lên đến 1200 bar). Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa 412 bar. Tốc độ dòng 0.1-9.999 ml/phút.Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt. Hiện tại bơm có 2 pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục. 4-Bộ phận tiêm mẫu (injection) Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy. Với dung tích của loop là 5-100ml. Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột: Bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động (Autosample). 5-Cột sắc ký Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10-30cm, đường kính trong 1-10mm, hạt chất nhồi cỡ 5-10 m. (ngoài ra còn có một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt....) Với chất nhồi cột cỡ 1.8 -5 m có thể dùng cột ngắn (3-10 cm) và nhỏ (đường kính trong 1-4.6 mm) loại cột naỳ có hiệu năng tách cao. Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận)hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còng dùng các loại hạt khác như: nhôm oxit, Polyme xốp, chất trao đổi ion. Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven column). 6-Detector Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên săc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại Detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích  A=k.C Trong: A là tín hiệu đo được C Nồng độ chất phân tích  k là hằng số thực nghiệm của Detector đã chọn  Tín hiệu này có thể là: độ hấp thụ quang; Cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện; độ dẫn nhiệt; chiết suất... Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai Detector sau:+ Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV+ Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang (đây là loại thông dụng nhất)+Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang. Là loại Detector có độ chọn lọc cao nhất.+Loại hiện đại đại hơn có Detector Diod Array, ELSD (Detector tán xạ bay hơi) các Detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất.  Ngoài ra còn có một số loại Detector khác là: + Detector điện hóa: Đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng …+ Detector chiết suất vi sai: Detector khúc xạ (thông thường dùng cho đo các chất đường)+ Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt … 6 - Bộ phận ghi tín hiệu  Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang+ Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của Peak, chiều cao...+ Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả các thông số, phổ đồ và các thông số của Peak như tính đối xứng, hệ số phân giải ... trong quá trình phân tích đồng thời sử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: Nồng độ, RSD,... 7-In kết quả Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ.  Phần III: Tiến hành sắc ký  CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ Điều kiện Hệ thống trang bị Pha tĩnh Loại pha tĩnh  Kích thước cột  Pha động Thành phần và tỷ lệ pH , tốc độ dòng, nhiệt độ ... Loại Detector, Hệ đường dẫn  Van tiêm mẫu,thể tích tiêm  1 -Chuẩn bị dụng cụ và máy móc Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi, tốc đô dòng, năng lượng đèn.... đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra. + Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về khả năng tách, và rửa đúng qui định sau mỗi lần chạy sắc ký 2-Chuẩn bị dung môi pha động  Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết HPLC Các hóa chất dùng phải là loại PA Pha dung môi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ đã nêu, để ổn định dung môi đúng thời gian theo chuyên luận đã yêu cầu. Lọc dung môi qua màng lọc 0.2 - 0.45 m, siêu âm đuổi bọt khí  3-Chuẩn bị mẫu đo HPLC Mẫu thử: Sử lý mẫu thử theo đúng chuyên luận, qui trình theo nguyên tắc:  - Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động -Phải lọc và ly tâm ,lọc mẫu qua màng lọc 0.2 - 0.45 m  Nồng độ mẫu ở mức vừa phải,không vượt quá khả năng tách của cột. 01 Mẫu chuẩn:  Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi, riêng về nồng độ các thành phần giông như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần. 02 4-Cách đo HPLC Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất, phần mền sắc ký. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc sau: + Chạy máy với dung môi pha động để đuổi bọt khí có trong hệ thống ống dẫn trước khi cho vào cột. + Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như: * Cấu hình máy  * Tỷ lệ các dung môi pha động  * Bước sóng,thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích yêu cầu. ỨNG DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN ASIATICOSID Chuẩn bị Đối tượng nghiên cứu Bột trích tinh rau má do Công ty TNHH ADC cung cấp. Dung môi, hóa chất Methanol, HPLC, Merck, Đức Thiết bị Máy HPLC phân tích LC-10 AD (Shimadzu, Japan). Máy HPLC điều chế LC- 20 A (Shimadzu, Japan). Máy cô chân không R-200, Buchi, Thụy Sỹ. Phương pháp nghiên cứu Thăm dò điều kiện trên HPLC phân tích Tiến hành thăm dò điều kiện thích hợp để tách asiaticosid từ bột trích tinh rau má trên máy HPLC phân tích, từ đó áp dụng qua máy HPLC điều chế. Do nếu trực tiếp thăm dò trên máy HPLC điều chế sẽ rất lãng phí dung môi. Điều kiện sắc ký Cột Supelcosil LC18 250 x 4.6 mm, 5 µm + guard column Hệ dung môi: MeOH – H2O Bước sóng: 203 nm Tốc độ dòng: 0,7 ml/min Mẫu: Bột trích tinh rau má được pha với nồng độ 3mg/ 5ml pha động Thể tích bơm mẫu: 20µl Kết quả 1. Sắc ký đồ của mẫu bột trích tinh rau má trên máy HPLC phân tích. Với điều kiện thích hợp nhất thăm dò được áp dụng qua máy sắc ký điều chế: Cột Discovery HS C18 250 x 21.2 mm, 10 µm + Guardcol Hệ dung môi: MeOH – H2O                             60           40 Bước sóng: 203 nm Tốc độ dòng: 20 ml/min Mẫu: Bột trích tinh rau má được pha với nồng độ 300mg/10ml pha động. Thể tích bơm mẫu: 10ml 2. Tiến hành tách asiaticosid trên máy HPLC điều chế từ bột trích tinh rau má Sau khi tìm được điều kiện thích hợp để tách asiaticosid từ bột trích tinh rau má, ta áp dụng điều kiện đó qua máy HPLC điều chế để bắt đầu tiến hành tách thu lấy asiaticosid. Điều kiện sắc ký Cột Discovery HS C18 250 x 21.2 mm, 10 µm + guard column Hệ dung môi: MeOH – H2O đã thăm dò được ở trên Bước sóng: 203 nm Tốc độ dòng: 20 ml/min Mẫu: Bột trích tinh rau má được pha với nồng độ 300mg/ 10ml pha động. Thể tích bơm mẫu: 10ml Thu nhận phân đoạn asiaticosid Tiến hành cô giảm áp phân đoạn asiaticosid tách được từ máy HPLC điều chế. Sau đó đem sấy chân không ở 50oC. Thu được asiaticosid ở dạng tinh thể màu trắng. Kết quả 2. Sắc ký đồ của bột trích tinh rau má trên máy HPLC điều chế. 3. Tinh chế asiaticosid lần 2 bằng máy HPLC điều chế để thu được asiaticosid tinh khiết Do ta thực hiện bơm mẫu overload nên phần asiaticosid thu nhận được chưa thực sự tinh khiết hoàn toàn, do đó ta phải tiến hành tinh chế lần 2 để có được asiaticosid tinh khiết hơn. Điều kiện sắc ký Cột Discovery HS C18 250 x 21.2 mm, 10 µm + guard column Hệ dung môi: MeOH – H2O Bước sóng: 203 nm Tốc độ dòng: 20 ml/min Mẫu: asiaticosid thu được ở trên được pha với nồng độ 200mg/ 10ml pha động. Thể tích bơm mẫu: 10 ml Kết quả 3. Sắc ký đồ của asaticosid được tinh chế lần 2 trên máy HPLC điều chế. KẾT LUẬN Sau thời gian tiến hành “Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao trong điều chế chất chuẩn asiaticosid” đã thu được một số kết quả sau: Điều chế được asiaticosid với lượng lớn. Sau khi điều chế được đã tiến hành kiểm tra độ tinh khiết, cấu trúc hóa học bằng NMR Tiết kiệm được nhiều công đoạn, dung môi, hóa chất, đặc biệt là thời gian. Không chỉ tách được asiaticosid mà đồng thời còn thu thêm được các chất khác như madecassosid… Qua quá trình tiến hành đề tài, không chỉ thu được các chất chuẩn mà còn đề ra được một phương pháp điều chế, phân lập ổn định, là cơ sở để điều chế các chất chuẩn có qui mô lớn trong tương lai. Thank you!