Đề tài Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên gel

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP : K13S2 Đề tài : SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRÊN GEL GVHD: ThS. Cao Ngọc Minh Trang SVTH: 1/ Bùi Thanh Tú 2/ Huỳnh Thị Kim Chi 3/ Lê Thị Anh Đào 4/ Bùi Thị Yến Sương 5/ Dương Ngọc Văn Long 6/ Nguyễn Quốc Cường 7/Bùi Thị Thu Hương 8/ Trương Thị Hoàng Hạnh 9/Phạm Thị Thu Sương 10/ Nguyễn Thị Mỹ Hằng 11/ Ngô Văn Lam 12/Nguyễn Anh Thư 13/ Trịnh Thị Huyền 14/Vương Thị Ngọc Diệp 15/Ngô Như Ngọc 16/Lê Thị Ngọc Tuyền Thành Phố HCM, Tháng 11 Năm 2010 PHẦN 1: GIỚI THIỆU VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO. HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography. Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển . Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích . Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều nghành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho nghành kiểm nghiệm Thuốc . Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng . PHẦN 2: KHÁI NIỆM – NGUYÊN TẮC CỦA SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRÊN GEL. I - Khái niệm : Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên gel là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh là gel. II- Nguyên tắc của quá trình sắc ký lỏng trên gel : Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và lọai sắc ký . Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử . Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột ,chúng ta cần có một pha động. Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A,B,C .. Vào cột phân tích ,kết quả các chất A,B,C.. Sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột gel. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác . PHẦN 3:HỆ THỐNG HPLC. I/ Máy HPLC gồm các bộ phận cơ bản được tóm tắt trên sơ đồ sau: Trong đó : 1- Bình chứa dung môi pha độüng 2- Bộ phận khử khí 3- Bơm cao áp 4-Bộ phận tiêm mẫu ( bằng tay hay Autosample) 5-Cột sắc ký ( Pha tĩnh ) ( để ngòai môi trường hay trong bộ điều nhiệt ) 6- Detector ( nhận tín hiệu ) 7-Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận,tín hiệu và sử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống HPLC. 8- In dữ liệu . II.1 - Bình đựng dung môi - Hiện tại máy HPLC thường có 04 đường dung môi vào đầu bơm cao áp .Cho phép chúng ta sử dụng 04 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 04 đường là 100 % . Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 04 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chi sử dụng tối đa là 03và 02 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn,hệ pha động đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định . Hiện 04 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải Gradial dung môi theo thời gian và công tác xây dựng tiêu chuẩn . Lưu ý : - Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC Hay dung môi tinh khiết phân tích . - Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phân tích . Nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền,tạo ra các Peak tạp trong quá trình phân tích . II.2 Bộ khử khí Degasse : - Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động . - Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ sảy ra - Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của Peak thay đổi . - Trong trường hợp bọt quá nhiều Bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể Pump sẽ không hút được dung môi (Bị e) khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động . Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai . II.3- Pump Cao áp : - Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký .Pump phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến - 500 at ( 1at =0.98 Bar) và pump phải tạo dòng liên tục .Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999 ml/phút .(hiện nay đã có nhiều loại Pump có áp suất rất cao lên đến 1200 bar) - Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa 412 Bar. Tốc độ dòng 0.1-9.999 ml/phút . - Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt . Hiện tại bơm có 2 Pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục . II.4 Bộ phận tiêm mẫu ( injection): Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy . Với dung tích của loop là 5 - 100ml . Có 02 cách lấy mẫu vào trong cột : Bằng tiêm mẫu thủ công( tiêm bằng tay ) và tiêm mẫu tự động( Autosample) . II.5 Cột sắc ký : Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao . - Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ ,chiều dài cột khoảng 10 -30cm ,đường kính trong 1-10mm ,hạt chất nhồi cỡ f = 5-10 mm.(ngoài ra còn có một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt....) -Với chất nhồi cột cỡ f = 1.8 -5 mm có thể dùng cột ngắn ( 3-10 cm ) và nhỏ ( đường kính trong 1-4.6 mm)loại cột naỳ có hiệu năng tách cao. - Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận) hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ ( pha đảo ) * Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven column) II.6 - Detector : - Là bộ phận Phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên săc ký đồ để có thể định tính và định lượng .Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loaüi Detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích A=k.C Trong : A là tín hiệu đo được C Nồng độ chất phân tích k là hằng số thực nghiệm của Detector đã chọn Tín hiệu này có thể là : độ hấp thụ quang ; Cường độ phát xạ ,cường độ điện thế ,độ dẫn điện ;độ dẫn nhiệt ;chiết suất .. Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai Detector sau : + Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV + Detector quang phổ tử ngoại khả kiến ( UV - VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang .đây là loại thông dụng nhất +Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang .Là loại Detector có độ chọn lọc cao nhất . +Loại hiện đại đại hơn có Detector Diod Array ,ELSD (Detector tán xạ bay hơi ) các Detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất . - Ngoài ra còn có một số loại Detector khác là : + Detector điện hóa : Đo dòng ,cực phổ ,độ dẫn ,điện lượng ..) + DetectorChiết suất vi sai : Detector khúc xạ ( thông thường dùng cho đo các chất đường ) + Detector đo độ dẫn nhiệt ,hiệu ứng nhiệt .. II.6 - Bộ phận ghi tín hiệu - Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang . + Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ,thời gian lưu,diện tích của Peak ,chiều cao .. + Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả các thông số,phổ đồ và các thông số của Peak như tính đối xứng,hệ số phân giải .... trong quá trình phân tích đồng thời sử lý ,tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như : Nồng độ,RSD, ... II.7 In kết quả : + Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ . Muốn có một kết quả tách tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện sắc ký tốt nhất cho một hỗn hợp mẫu ; Các điều kiện đó bao gồm : Pha tĩnh : - Loại pha tĩnh - Kích thước cột Pha động : Thành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng, nhiệt độ ... Nếu là chương trình rửa giải Isocratic Thành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng, nhiệt độ và chương trình dung môi ... Nếu là chương trình rửa giải Gradient. Hệ thống trang bị: - Loại Detector: - Van tiêm mẫu,thể tích tiêm - Hệ đường dẫn Các yếu tố khác : nhiệt độ ,độ nhạy của detector bước sóng phân tích PHẦN 4: CHỌN ÐIỀU KIỆN SẮC KÝ - Dựa vào thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích .....ta lựa chọn các điều kiện sắc ký phù hợp - Việc lựa chọn điều kiện sắc ký là công việc hết sức cần thiết trong quá trình xây dựng chương trình sắc ký . Chỉ khi lựa chọn điều kiên sắc ký tốt,phù hợp thì chúng ta mới có thể định tính,định lượng được các lọai thuốc đa thành phần một cách nhanh chóng và hiệu quả cao .