Đề tài Quy trình phát hiện Listeria trong thủy sản đông lạnh

1 LỜI MỞ ðẦU Listeria monocytogenes những năm gần đây nổi lên như một tác nhân gây bệnh từ thực phẩm quan trọng. ðây là một loại trực khuẩn Gram dương ngắn, nhỏ, khơng sinh bào tử, thường cĩ kiểu chuyển động xoay trịn quanh trục thân thành từng đợt rất đặc trưng trong tiêu bản giọt treo. Chúng cĩ thể phát triển trên mơi trường nuơi cấy đơn giản ở vùng pH giữa 5 và 9. Trên mơi trường thạch rắn, khuẩn lạc của chúng trơng như những giọt sương trong suốt, hơi nhuốm màu lam nhạt khi nhìn qua anh sang phản chiếu dưới gĩc 450. Về mặt sinh hĩa Listeria monocytogenes dễ bị nhầm với những vi sinh vật như Lactobacillus, Brochothrix, Erysipelothrix và Kurthia. Một số thử nghiệm sinh hĩa đã được áp dụng để phân biệt Listeria monocytogenes với các lồi Listeria khác như Listeria innocua, Listeria welshimeri và Listerisamurrayi. Xác định kiểu huyết thanh cũng là một cách định danh quan trọng đối với vi sinh vật này. Listeria thuộc loại ưa lạnh, cĩ thể phát tirển ở nhiệt độ thấp đến 2,50C và cao đến 440C. Các chuyên gia FDA khuyến cáo cần lưu ý việc làm vệ sinh ống dẫn lạnh trên trần vì đĩ là nơi cĩ điều kiện thuận lợi cho Listeria phát triển và tích tụ. Liều lượng gây bệnh của Listeria monocytogenes hiện vẫn chưa được biết. Bệnh bắt đầu từ đường tiêu hĩa với những triệu chứng như tiêu chảy, sốt nhẹ. Trường hợp nặng, chủng gây bệnh cĩ thể sinh sản trong các đại thực bào và gây nhiễm trùng máu. Vi khuẩn tác động lên hệ thần kinh trung ương, tim, mắt và cĩ thể xâm nhập vào bào thai trong bệnh mẹ gây sẩy thai, đẻ non hoặc nhiễm trùng thai nhi. Listeria monocytogenes đã được phân lập từ nhiều loại thực phẩm khác nhau như thịt, cá, rau, sữa và cà bề mặt nước. Cần lưu ý kiểm tra sự hiện diện của vi sinh vật ở mọi cơng đoạn trong quá trình chế biến thực phẩm, từ mơi trường, nguyên 2 liệu, điều kiện sản xuất, vận chuyển đến sản phẩm cuối cùng. Nấu chín thực phẩm là một biện pháp hữu hiệu để giảm nguy cơ nhiễm bệnh. 3 CHƯƠNG I: MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn đề. - ðất nước ta cĩ nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển ngành nuơi trồng thủy hải sản. Bờ biển Việt Nam khá dài và rộng, lại nằm trong vùng giao nhau giữa các dịng nước và cĩ khí hậu nhiệt đới nên trữ lượng hải sản rất dồi dào và cĩ giá trị kinh tế cao. Vì vậy, ngành đánh bắt nuơi trồng thủy hải sản ở nước ta khơng ngừng phát triển, khơng những đáp ứng mhu cầu trong nước mà cịn xuất khẩu ra thị trường nước ngồi như: Trung Quốc, ðài Loan, Hàn Quốc, Nhật, Mỹ, Anh…. Chất lượng vệ sinh thực phẩm hiện nay đang là mối quan tâm hàng đầu khi xuất khẩu thực phẩm sang các quốc gia khác, đặc biệt là đối với mặt hàng thủy hải sản đơng lạnh. - Tuy nhiên, việc xuất khẩu thủy hải sản của nước ta đang gặp khá nhiều khĩ khăn và một trong nhửng vấn đề đĩ là việc nhiễm các tác nhân gây bệnh, gây độc như: dư lượng kháng sinh, vi sinh vật gây bệnh…. và Listeria monocytogenes là một trong những tác nhân gây bệnh và gây ngộ độc trong sản phẩm thủy hải sản đơng lạnh. - Trong vấn đề ngộ độc thực phẩm, vi khuẩn Listeria monocytogenes gây ra bệnh Losteriosis. Ca đầu tiên của bệnh Listeriosis đã được nĩi đến cách đây 70 năm, nhưng phải đợi đến những năm 1980, vi khuẩn Listeria monocytogenes mới được chính thức xác nhận là tác nhân gây ngộ độc từ thực phẩm. Listeria monocytogenes hình thành nên các triệu chứng như; sốt, khĩ chịu, đau lưng. Nếu độc tố đủ mạnh, chúng sẽ gây ra ngộ độc thực phẩm cấp tính trong khoảng 12 giờ, với các triệu chứng như: nơn mửa, tiêu chảy, đau quặn bụng, nhức đầu… 4 - Với ý nghĩa khoa học và thực tiễn như vậy, chúng tơi quyết định thực hiện đề tài: “quy trình phát hiện Listeria trong thủy sản đơng lạnh”. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu. - Tìm hiểu tác nhân gây bệnh Listeria monocytogenes trong thủy sản và tìm hiểu các phương pháp xác định Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản đơng lạnh. 5 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu về thủy hải sản và tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới. 2.1.1. Giới thiệu chung về thủy hải sản. - Hải sản là bất kỳ động vật hoặc thực vật biển đươc phục vụ như thực phẩm và là thức ăn của con người. Hải sản bao gồm động vật biển như; cá và các động vất cĩ vỏ khác ( bao gồm cả động vật thân mềm và động vật giáp xác.). - Việc thu hoạch thủy hải sản tự nhiên được gọi là đánh bắt cá. Ngành đánh bắt cá và nuơi trồng thủy hải sản được biết đến như là: nuơi biển, nuơi trồng thủy sản, hoặc trong trường hợp của cá thì nuơi cá. Hải sản thường đươc phân biệt với thịt. Mặc dù, nĩ vẫn cĩ một số tính chất của động vật và nĩ được loại trừ trong một số chế độ ăn chay. Hải sản là một nguồn quan trọng trong việc bổ sung nguồn protein trong nhiều khẩu phần ăn trên thế giới, đặc biệt ở các vùng ven biển. - Hiện cĩ hơn 32000 lồi cá được sử dụng làm nguồn thực phẩm cho con người. Ví dụ như: cá đối, cá chép, cá da trơn, cá chim lớn, cá trích, cá thu, cá mè, cá cơm… và một số lồi khác. - Thủy hải sản đơng lạnh là thủy hải sản sạch được sơ chế, chế biến theo quy trình nghiêm ngặt về vệ sinh an tồn thực phẩm. Quy trình sơ chế, chế biến và đưa ra sản phẩm theo phương pháp IQF đưa ra sản phẩm đơng lạnh với chất lượng tốt nhất. Ngay từ khâu nguyên liệu được tuyển chọn kỹ lượng với chất lượng đảm bảo và sau đĩ sẽ được sản xuất trên dây truyền vơ trùng tuyệt đối đảm bảo vệ sinh an tồn thực phẩm, từ đĩ sẽ đưa ra các sản phẩm an tồn. Trước khi các sản phẩm đĩ đến tay người tiêu 6 dùng, chúng được kiểm tra bởi các cơ quan y tế và được cấp giấy phép vệ sinh an tồn thực phẩm. Chính vì vậy, thực phẩm đơng lạnh là sản phẩm cĩ chất lượng vệ sinh an tồn thực phẩm rất cao. 2.1.2. Tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản Việt Nam. - Trong 3 mùa hè liên tiếp, Viện dinh dưỡng quốc gia đã thực hiện đề tài nghiên cứu: “Thực trạng ơ nhiễm vi sinh vật vào thực phẩm thủy hải sản đơng lạnh và chế biến trên địa bàn Hà Nội”. Kết quả kiểm tra vi sinh vật tại phịng thí nghiệm 300 mẫu thực phẩm thủy hải sản đơng lạnh và chế biến sẵn (được lấy ngẫu nhiên) từ một số chợ và siêu thị trong 6 quận thành Hà Nội cho thấy 82 mẫu khơng đạt tiêu chuẩn vệ sinh an tồn thực phẩm. Trong đĩ cĩ 36 mẩu cá đơng lạnh, 29 mẫu tơm, cua sơ chế, 8 mẫu tép và 6 mẫu nem chả giị… - ðặt biệt cĩ tới gần 30% mẫu khơng đạt nhiễm một số loại vi sinh vật vượt quá giới hạn cho phép. Trong dĩ cĩ 49 mẫu khơng đạt tiêu chuẩn về Coliforms ( chiếm 16.3%), 34 mẫu khơng đạt về E.coli (11%), 28 mẫu khơng đạt về C.perfrigens (9.3%) và 7 mẫu khơng đạt về Vibrio parahaemolyticus(2.3%). Trong 28 mẫu nhiễm C.perfrigens chủ yếu là: mẫu mắm tơm, mắm tép… cĩ thể gây ngộ độc bất cứ lúc nào. Nguy hại hơn cả là trong hải sản đơng lạnh cĩ vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đươc xác nhận là nguyên nhân gây ra nhiều vụ ngộ độc thức ăn do cá biển và hải sản. Bệnh hầu hết xãy ra vào mùa hè đối với những người ăn gỏi cá và những thực phẩm chưa chín, cĩ thể gây ngộ độc, gây đau bụng, nơn, sốt, đặc biệt là gây ra tiêu chảy. 2.1.3. Tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản trên thế giới. 7 - Ngộ độc tiêu chảy được phát hiện vào năm 1976 từ con trai nhiễm độc tại Nhật Bản. - Ngộ độc Venerupin đầu tiên bùng phát do ăn hào và nghêu chỉ cĩ trong vùng biển nước Nhật vào một thời điểm đặt biệt nào đĩ trong năm, chất độc tạo ra bở nhiều sinh vật sinh sản mau lẹ, rất nhiều trong cuối mùa đơng, đơi khi xuất hiện ngồi khơi nước Bồ ðào Nha. Cơn bệnh cĩ thể làm hư gan, chết khoảng 1/3 nạn nhân. - Cuối năm 1987, ngộ dộc mất trí nhớ được để ý khi nĩ phát triển nhiều tại phía ðơng Canada thủ phạm là chất acid domoic, một chất độc neurotoxinmanh phát sinh từ tảo diatom Nitzschia punens trong nước lạnh.Nạn nhân sẽ bị mất trí nhớ trong một thời gian ngắn, một số ca dẫn đến tử vong. - Ăn phải tảo đỏ gây ra ngộ độc nguy hiểm, vào năm 1991 tại đảo Guam đã cĩ 13 trường hợp ngộ độc do ăn phải tảo đỏ Polycavemosa tsudai, cĩ 3 trong số đĩ bị chết. - Năm 2004 đã cĩ 53 cảnh báo về vượt quá giới hạn sulphit trong tơm. Trong đĩ mặt hàng tơm chín chiếm 31 cảnh báo, đây cũng là mặt hàng cĩ quy định sulphit nghiêm ngặt nhất (khơng quá 50 miligram/kg tơm). Quy định này cũng cĩ nghĩa là: mặc dù, nếu một nhà chế biến thực phẩm tuân thủ nghiêm các tiêu chuẩn đối với tơm nguyên liệu, nhưng sau khi nấu chín tơm thì cơng ty này vẫn cĩ thể vi phạm giới hạn tiêu chuẩn (do giới hạn quy định đối với tơm chín thấp hơn rất nhiều). - Năm ngối, đã cĩ 41 trường hợp bị Rasff cảnh báo lây nhiễm loại vi khuẩn Listeria monocytogenes. Trong đĩ, cá hồi xơng khĩi của ðan Mạch bị cảnh báo 19 lần và cá hồi của ðức bị 10 lần. 8 - Cũng theo hệ thống cảnh báo của Rasff, năm ngối cĩ 39 cảnh báo về sự xuất hiện của Histamin trong thủy sản. Trong đĩ, cá ngừ chiếm 31 cảnh báo và hầu hết là mặt hàng ướp lạnh, sau khi nhập khẩu đã được đĩng túi chân khơng ở Hà Lan. Nước bị cảnh báo nhiều nhất là Inđơnêxia. - Các thanh tra của Italia cũng đã phát hiện và cảnh báo 41 lần về việc lây nhiễm ký sinh trùng (Anisakis), chủ yếu trong cá thu tươi xuất xứ từ Nauy, ðan Mạch, và cá vây chân từ Anh. - Cảnh báo về dư lượng Cactimi trong thủy hải sản chiếm 43 lần, ít hơn một nửa so với số lượng cảnh báo hồi năm 2003 (103) lần, và chủ yếu liên quan đến các sản phẩm cá kiếm và nhuyễn thể chân đầu. Số lần cảnh báo về lây nhiễm thủy ngân trong cá kiếm năm 2004 là 30 lần, tăng nhẹ so với năm 2004. 2.2. Giới thiệu về vi khuẩn Listeria monocytogenes. 2.2.1. Lịch sử phát hiện. Hình 2.1: Vi khuẩn Listeria monocytogenes. 9 - Chi Listeria được đặt theo tên nhà ngoại khoa người Anh, Joseph Lister. Năm 1918, một loại vi khuẩn tương tự như Erysipelothrix rhusiopathiae được phân lập từ dịch não tủy của một quân nhân người Pháp. Chủng vi khuẩn này được lưu giữ tại viện Pasteur Paris, nhưng phải nhiều năm sau đĩ, vi khuẩn này mới được mệnh danh là Listeria monocytogenes. - Năm 1924, Murray và cộng sự, trong quá trình nghiên cứu một dịch bệnh trên các động vật thí nghiệm, đã phân lập được một chủng vi khuẩn từ các hạch Lympho của các động vật bị bệnh. Sau đĩ , lấy vi khuẩn này tiêm cho các con khỏe mạnh thì thấy ở chúng, cĩ hiện tượng tăng bạch cầu đơn nhân, tương tự như bệnh của quân nhân người Pháp nĩi trên. Vì vậy, ơng đặt tên cho nĩ là: Bacillus monocytogenes. Ba năm sau, tại Nam Phi, Piie khi đĩ đang nghiên cứu sự mang Yersinia peptis trên chuột đã phân lập được một vi khuẩn từ gan chuột và ơng đặt tên nĩ là Listeria hepatolytica. Trực khuẩn này khơng thể phân biệt với Bacillus monocytogenes và chủng vi khuẩn lưu giữ ở viện Pasteur Paris. Chính vì vậy, pirie đã đề xuất một tên mới chỉ chung cho các chủng này là Listeria monocytogenes. - Năm 1929, Nyfeldt phân lập được Listeria monocytogenes từ máu của một bệnh nhân bị sốt kèm theo viêm hạch và ơng tin rằng đĩ là tác nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm trùng. Tất nhiên, nhiều tác giả khác đã khơng đồng ý với lập luận của Nifeldt. Nhiều năm sau đĩ, những cơng bố kinh điển về bệnh nhiễm Listeria (Listeriosis) trên người, kể cả ở trẻ sơ sinh và người lớn, cho thấy những bằng chứng giống như trong y văn nhưng cĩ nhũng tranh luận rằng, khả năng truyền bệnh từ động vật sang người là cực kỳ hiếm. 10 - Năm 1950, những nghiên cứu đầu tiên, thực sự mang tính hệ thống về nhiễm Listeria trên người đã thực hiện. Tuy nhiên, phải mất thêm ba thập kỷ nữa, sau hàng loạt các báo cáo dịch được cơng bố mới thấy, nghiên cứu về Listeria monocytogenes từ chỗ tương đối bế tắc đã trở nên sáng sủa hơn. Từ đĩ tới nay, chủ đề này đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều chuyên ngành, khơng chỉ bởi vì tầm quan trọng của Listeria monocytogenes với sức khỏe cộng đồng, mà cịn là vì, vi khuẩn này đã trở thành một mẫu hình nghiên cứu thực nghiệm cho hiện tượng ký sinh nội bào khơng bắt buộc. 2.2.2 Phân loại. Hình 2.2. Vi khuẩn Listeria monocytogenes - Lồi khuẩn giống Listeria là những vi khuẩn hình que Gram dương, ngắn, chúng kỵ khí, dương tính với catalase, âm tính với oxidase, di động ở 20- 250C và khơng di động ở 370C. - Phân loại học của Listeria.spp trong giới vi sinh vật như sau:
Thuộc giới: Bacteria.
Ngành : Fitmicutes.
Lớp: Bacilli. 11
Bộ: Bacillales.
Họ: Listeriaceae.
Giống: Listeria. - Hiện tại cĩ 7 lồi Listeria được cơng nhận:
Listeria monocytogenes.
Listeria ivanovii.
Listeria innocua.
Listeria wells.
Listeria seeligeri.
Listeria grayi (lồi này hiện bao gồm cả lồi cấp dưới Listeria murayi.). - Trong đĩ, các lồi này chỉ cĩ 2 lồi gây bệnh qua thực nghiệm và tự nhiên, Listeria monocytogenes và Listeria ivanovii. Trước kia, chúng gây bệnh cho người và động vật, sau này chúng gây bệnh chủ yếu cho động vật. Cả 2 lồi này và lồi Listeria seeligeri đều sản sinh ra β_ haemolysis trên Sheep Blood Agar và đây chính là sợi dây nối kết với mầm bệnh. Tuy nhiên, Listeria seeligeri khơng gây bệnh vì thế khơng thể xem xét một cách riêng biệt đặc điểm này như là một giả định về khả năng gây bệnh của các lồi Listeria. 2.2.3. ðặc điểm chung của chi Listeria. - Mối liên quan giữa các lồi trong chi Listeria là chủ đề được tranh luận nhiều nhất. Ban đầu, chi này được cho là một thành viên của họ Corynebacteriaceae, bởi vì các đặc điểm hình thái học và sau đĩ nghiên cứu phân loại hĩa học lại cho thấy các lồi Listeria tương đối khác biệt so với Corynebacteriaceae. Cho đến năm 1984, trình tự từng phần với 16S rRNA đã khẳng định chính xác vị trí trên cây di truyền của chi Listeria 12 trong nhĩm Clostridium- Bacillus-Lactobacillus, với Brochothrix thermosphacta là gần nhất. - Chi Listeria ban đầu được mơ tả là đơn type với duy nhất một thành viên là Listeria monocytogenes. Những năm sau này, thêm 7 lồi khác được xác định: Listeria invanovii (trước đây gọi là Listeria monocytogenes serovar5), Listeria innocua, Listeria welshimeri, Listeria seeligeri, Listeria muarrayi, Listeria grayi và Listeria denitrificans. Listeria denitrificans được phân loại là Jonesia denitrifocans. Listeria murrays và Listeria grayi từng được cho là cĩ khác biệt so với các lồi Listeria khác để đảm bảo cho sự thành lập một chi mới, Murraya, nhưng ngày nay được xếp thành một lồi duy nhất Listeria grayi. Gần đây, Listeria ivanovii được chia thành hai lồi phụ là: subsp.ivanovii, và subsp.londonniensis. Trong số các lồi khơng thuộc “monocytogenes” chỉ duy nhất Listeria ivanovii được xác định là tác nhân gây bệnh trên người. 2.2.4. ðặc điểm hình thái và kháng nguyên. - Các lồi Listeria là trực khuẩn Gram dương cĩ kích thước ngắn (0.4- 0.5×0.5-2.0 µm). Chúng mọc trên các mơi trường nuơi cấy khơng acid, khơng sinh nha bào. Ở 200C, chúng chỉ di động bằng lơng mọc xung quanh than, nhưng sự di động khơng quan sát được ở 370C. Chúng là vi khuẩn kỵ khí khơng bắt buộc và cĩ thể mọc trên khoảng nhiệt độ dao động từ 0-450C ( tối ưu là 30-360C), mặc dù tốc độ mọc ở nhiệt độ thấp là chậm. Chúng cũng mọc trên một khoảng pH dao động rộng, một số chủng cĩ thể mọc ở pH 9.6, nhưng đạt điều kiện tối ưu ở mơi trường trung tính hoặc hơi kiềm. 13 - Kháng nguyên chính của các lồi Listeria là kháng nguyên thân (O) và kháng nguyên lơng (H).Quy trình định type huyết thanh hiện nay dựa trên các kháng nguyên này, đã phân loại được 6 nhĩm huyết thanh (1/2, 3, 4, 5, 6 và 7) và phân loại sâu hơn thành các serovar cho tất cả các lồi trừ Listeria grayu và Listeria invanoii. Trong khi Listeria invanoii và Listeria welshimeri cĩ thể được phân biệt với Listeria monocytogenes khẳng định type huyết thanh thì các lồi khác cĩ thể cĩ chung một hoặc nhiều kháng nguyên trùng với Listeria monocytogenes. Ví dụ, một số chủng Listeria seeligeri cĩ thể khơng phân biệt được về mặt kháng nguyên so với chủng thuộc Listeria monocytogenes ở nhĩ, huyết thanh ½. Cũng cần lưu ý rằng, mặc dù cĩ 13 serovar của Listeria monocytogenes mới được xác định hiện nay, trong khi hơn 90% các chủng phân lập trên lâm sang chỉ thuộc về 3 serovar: 1/2a; 1/2b va 4b, điều này làm hạn chế giá trị của kỹ thuật này trong các nghiên cứu dịch tễ học. Các đặc tính quan trọng được liệt kê ở Bảng 2.1 Dùng để phân biệt các lồi Listeria. Loại test L. m o n o cy to ge n es L. in n o cu a L. se el ig er i L. iv a n o vi i L. w el sh im er i Su bs p. gr a yi Su bs p. m u rr a yi Tan máu beta (β) CAMP test với S.aureus R.equi Khử Nitrate + + W - - - + W - + - - - - - - - - - - - 14 Acid từ D-Manitol L-Rhamnose D-Xylose α-Methyl-D- glucoside α-Methyl-D- mannoside - - + - + + - - V - + + - - - + + - + - - - + - - + - - V V - + - - V V + + V - V V Với (+) ≥ 90% các chủng dương tính. (-) ≤ 10% các chủng dương tính. (V) 11-89% các chủng dương tính. (W) các chủng dương tính yếu. 2.2.5. Cấu trúc. 2.2.5.1. Cấu trúc di truyền. - Genome của Listeria monocytogenes và Listeria innocua được giải trình tự cĩ độ dài là 2.94 Mbp với 2583 khung đọc mở và mol % G+C là 39. Listeria innocua cĩ genome dài 3.01 Mbp với 2973 khung đọc mở và thành phần mol 5% G+C là 37. Một điều đáng chú ý là nhiều protein được mã hĩa bởi vi khuẩn này mang độ tương đồng rất cao so với Bacillus subtilis. Listeria monocytogenes cĩ mức độ đa dạng thường ở nhiều quần thể, do vậy,chúng cĩ tới 331 gen mã hĩa cho các protein vận chuyển khác 15 nhau (11,6% trong số tất cả các gen dự kiến) và 209 các vị trí điều hịa quá trình dịch mã được tìm thấy trên loại vi khuẩn này. - Khoảng 0-79% các chủng Listeria monocytogenes cĩ chứa plasmid này ở dạng ẩn, sự đề kháng với cadmium là hiện tượng phụ thuộc plasmid và các plasmid đặc hiệu cho hiện tượng đề kháng với một hoặc nhiều loại kháng sinh đã được ghi nhận. Plasmid thường thấy trong các chủng Listeria monocytogenes thuộc nhĩm huyết thanh 1. 2.2.5.2. Cấu trúc tế bào. - Nhân: là vùng nhân nguyên thủy, chưa cĩ màng nhân nên khơng cĩ hình dạng cố định vì vậy cịn gọi là vùng nhân. - Ribosome: nằm tự do trong tế bào chất và chiếm tới 70% trọng lượng của tế bào chất. Ribosome gồm hai tiểu phần ( 50S và 30S), hai tiểu phần này kết hợp với nhau tạo thành ribosome 70S. - Lơng ( khuẩn mao ): là những sợi lơng rất mảnh, chúng cĩ tác dụng giúp vi khuẩn bám vào giá thể. - Màng tế bào: Màng cấu tạo bởi 2 lớp phospholipid (PL) chiếm 30 – 40% khối lượng của màng, các protein chiếm 60 -70% khối lượng các màng. ðầu phosphate của PL tích điện phân cực, ưa nước. ðầu hydrocacbon khơng tích điện, khơng phân cực, và cĩ tính kỵ nước. 16 Hình 2.3. Màng tế bào của vi khuẩn Listeria monocytogenes. - Chức năng chủ yếu của màng. - Khống chế sự qua lại của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao đổi chất. - Duy trì áp suất thẩm thấu bình thường của tế bào. - Là nơi sinh tổng hợp của thành phần tế bào và các polymer của bao nhầy. - Là nơi sinh tổng hợp của nhiều enzyme, các protein của chuỗi hơ hấp. - Cung cấp năng lượng cho sự hoạt động của tiên mao. - Tiên mao: chúng quyết định khả năng và phu7o7nmg pháp di động của vi khuẩn, tiên mao là nhũng sợi lơng dài, dưới kính hiển vi quang học chỉ cĩ 17 thể quan sát cấu trúc khi nhuộm theo phương pháp riêng. Dưới kính hiển vi điện tử cĩ thể thấy rõ cấu trúc của từng sợi tiên mao. - Thành tế bào: - Peptidoglycan chiếm 30 – 95%, là loại xốp, khá bền vững, cấu tạo bởi ba thành phần: - N-Acetylglucolsamin (NAG) - Acid N0- acetylmuramic (NAM) - Tetrapepid chứa cả D- và L- axit amin. - Thành tế bào rất dày, hấp thu và giữ lại màu tím khi nhuộm với thuốc nhuộm tím tinh thể. - Thành tế bào làm những nhiệm vụ sau : - Tham gia quá trình trao đổi chất. - Là nơi chứa đựng nhiều chất cĩ chứa hoạt tính sinh học. - Bao nhầy : - Bào vệ vi khuẩn trong điều kiện khơ hạn. - Bảo vệ vi khuẩn tránh khỏi bị thực bào. - Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn khi thiếu thức ăn. - Giúp vi khuẩn bám vào giá thể. Hình 2.4. Lơng roi của vi khuẩn Listeria monocytogenes. 18 2.2.6. Yếu tố độc lực. 2.2.6.1. Tổ hợp gen của Listeria monocytogenes. _ Gen prfA (prfA): hoạt hố quá trình lây lan cho tế bào chủ của vi khuẩn. _ Gen plcA (PI-PLC) (phosphatidy linocitol-specific phospholipase C) là protein được mã hố bởi gen plcA,33kDa), cĩ tác dụng dung giải màng khơng bào của thể thực bào. _ Gen plcB(PC-PLC) (phosphatidulcholine-spefic phospholipase C, là protein được mã hố bởi gen pclB, 29kDa):, cĩ tác dụng dung giải màng khơng bào của thể thực bào. _ Gen hly (LLO là protein được mã hố bởi gen hly, 58.5kDa), cĩ tác dụng giải phĩng vi khuẩn ra khỏi lkhơng bào của tế bào chủ. _ Gen mpl (Mpl metallprotease được mã hố bởi gen mpl,60kDa) là gen chứa 510 amino axit, cĩ vai trị tham gia vào quá trình hoạt động của gen plcB. _ Gen actA ( AtcA là protein được mã hố bởi gen ACTa,97kDa) cĩ chức năng giúp vi khuẩn lây lan từ tế bào này sang tế bào khác. _ Gen inlA (InlA là protein được mã hố bởi gen inlA, 80kDa). Protein InlA ảnh hưởng mạnh tới internalin khác, xố bỏ inlA thì sẽ dẫn tới biểu hiện inlB cao hơn, cĩ chức năng nội bộ hố tế bào chủ. _ Gen inlB (InlB là protein được mã hố bởi gen inlB, 67kDa), cĩ chức năng nội bộ hố tế bào chủ. _ Trong đĩ gen prfA cĩ vai trị như yếu tố điều hồ chính nhằm ổn định hoạt động của các gen plcA, plcB, hly, mpl, actA, inlA, inlB. Ngồi ra, cịn cĩ gen hly mã hố protein tạo ra sản phẩm Listeriolysin O (LLO) là tác nhân gây bệnh Listeriosis ở người và động vật, plcA mã hố tạo PI-PLC và gen 19 plcB mã hố tạo PC-PLC, gen inlA ,mã hố cho internalin A, gen inlB mã hố cho internalin B, gen inlC mã hố cho internalin C. tất cả các gen này đều phụ thuộpc vào gen prfA. 2.2.6.2. ðộc tố listeriolysin A (LLO). _ Listeriosin A (LLO) là một độc tố protêin được tiết bởi L.monocytogenes thĩat khỏi khơng bào và thực bào chủ cĩ trọng lựơng 58.6 kDa, hình thành 1 chuỗi polypeptide gồm 529 amino acid. Trình tự đầu N cĩ đặc điểm là phần đầu cĩ tính ái nước, mang điện tích dương và đượ theo sau bởi 20 đầu kỵ nước. trình tự này mã hố trực tiếp cho protein và được phân cắt sau vị trí lysine 25. kết quả là LLO được bắt đầu từ amino axit thứ 26 và cĩ trọng lượng phân tử là 55.8kDa, dài 504 axit amin. _ LLO thuộc nhĩm độc tố gắn lên cholesterol được hoạt hố bởi nhĩm thiol được tạo ra ở hầu hết các vi khuẩn Gram (+). _ Hoạt tính dung huyết của LLO cĩ liên quan đến pH của mơi trường. Nĩ hoạt động cao nhất ở pH 5.5 và gần như bị bất hoạt ở pH 7.0. Sự phát hiện này cĩ thể giải thích vai trị của LLO trong quá trình xâm nhiễm của Listeria monocytogenes. Sau quá trình thực bào, mơi trường acid của khơng bào chứa tế bào vi khuẩn sẽ hoạt hố LLO. Chính độc tố này xúc tiến quá trình ly giải khơng bào và vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chất, trong khi đĩ pH cao hơn sẽ làm giảm hoạt tính của LLO. 2.2.6.3. Vai trị của yếu tố độc lực. _ Listeria monocytogenes tồn tại trong mơi trường đa dạng như: mơi trường sống bao gồm đất, nước, thức phẩm, động vật. Gen prfA quy định sự biểu hiện của các gen cĩ tính độc đĩ. Bên ngồi tế bào chủ, gen prfA tồn tại ở 20 trạng thái hoạt động thấp. Khi ở bên trong tế bào chủ, gen prfAkích hoạt (prfA*) và biểu hiện các gen cần thiết cho cuộc xâm nhập vào tế bào chủ. _ Listeria monocytogenes xâm nhập vào tế bào của cơ thể vật chủ thơng qua cơ chế thực bào. Nếu Listeria monocytogenes vẫn cịn sống sau giai đoạn đầu xâm nhiễm này, nĩ được cơ thể vật chủ tiếp nhận nhờ protein bề mặt đượ gọi là internalin A (inlA) và internalin B (inlB). InlA tương tác với e- Carherin tạo điều kiện cho Listeria monocytogenes đi vào tế bào biểu mơ, InlB nhận diện Clq-R ( hoặc Met) cho phép Listeria monocytogenes xâm nhập vào trong nhiều loại tế bào của vật chủ. Sauk hi xâm nhiễm được vào tế bào vật chủ, Listeria monocytogenes phân giải khơng bào tạo ra các lỗ trên màng tế bào và hoạt giải độc tính lưu huỳnh PI-PLC kết hợp với PC- PLC, giúp LLO phân giảikhơng bào. 21 Hình 2.5. Cơ chế xâm nhập vào tế bào của vi khuẩn Listeria monocytogenes. 22 _ Sau khi phân giải khơng bào, Listeria monocytogenes được phĩng thích vào cytosol, tại đây chúng phát triển và nhân lên, trong giai đoạn này địi hỏi phải cĩ protein bề mặt khác như ActA để nĩ di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác, và tổng hợp actin. ðuơi actin cho phép vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chủ khác, nĩ phụ thuộc vào hoạt động của PC-PLC và Mpl. 2.2.7. Bệnh và triệu chứng của bệnh do vi khuẩn “Listeria monocytogenes” gây ra. 2.2.7.1. Bệnh do vi khuẩn “Listeria monocytogenes” gây ra. - Nhiễm Listeria ở phụ nữ mang thai:
Hội chứng này xuất hiện trong khoảng một phần ba các trường hợp nhiễm Listeria mặc dù tỷ lệ này cĩ thể cao hơn nhiều trong các đợt dịch. Hầu hết các trường hợp nhiễm khuẩn đều xãy ra vào 3 tháng cuối của thai kỳ. ða số phụ nữ mang thai bị nhiễm Listeria monocytogenes cĩ dấu hiệu: sốt , mệt mỏi và đau lưng, cĩ khi thấy bị tiêu chảy, đau bụng, buồn nơn hoặc nơn trong suốt thời kỳ nhiễm khuẩn. Vi khuẩn cĩ thể lây truyền qua rau thai dẫn đến nhiễm khuẩn tử cung, viêm màng đệm và màng ối, sinh non, hoặc bệnh khởi phát ở giai đoạn sớm ở những trẻ mới sinh. Phụ nữ nhiễm bệnh dễ bị sãy thai tự nhiên. Trẻ sơ sinh tuần lễ đầu tiên khởi phát bệnh với những dấu hiệu nhiễm khuẩn, khĩ thở, những tổn thương ở da, hội chứng u hạt nhiễm khuẩn đặc trưng bởi những ổ áp-xe rải rác ở gan, lách, tuyến thượng thận, phổi và những cơ quan khác. Nếu nhiễm khuẩn bào thai ở giai đoạn sớm thường đi kèm với những biến chứng sản khoa như : sinh non và viêm màng đệm và màng ối. − Nhiễm Listeria ở trẻ sơ sinh: 23
Gần giống như các trường hợp nhiễm khuẩn liên cầu nhĩm B ở trẻ sơ sinh, nhiễm Listeria ở trẻ sơ sinh cĩ thể được chia thành hai nhĩm khởi phát sớm và muộn. Khởi phát sớm là biểu hiện nhiễm khuẩn trong vịng 5 ngày, nhất là khoảng 48 giờ sau sinh. Bệnh khởi phát muộn thì phát bệnh sau 5 ngày từ khi sinh, trung bình là 14 ngày. Tỷ lệ tử vong cao tới 60% cho nhĩm khởi phát sớm và 25% cho nhĩm khởi phát muộn.
ða số các trường hợp bệnh khởi phát sớm bị truyền nhiễm Listeria monocytogenes từ trong tử cung qua nguồn vi khuẩn trong máu mẹ. Nhiễm khuẩn từ âm đạo là cực kỳ hiếm gặp. Biểu hiện kinh điển của bệnh khởi phát sớm là bệnh u hạt nhiễm khuẩn ở trẻ sơ sinh vời đặc tính là cĩ u hạt rải rác ở một số cơ quan nội tạng. Mặc dù biểu hiện điển hình hơn của dạng bệnh này là nhiễm khuẩn huyết kèm theo viêm phổi và viêm màng não. Cĩ thể cĩ ban sần và ban dạng gờ nhú. Trên thực tế thường khĩ phân biệt giữa bệnh Listeriosis khởi phát sớm và các thể khác của nhiễm khuẩn trẻ sơ sinh trên các bệnh cảnh lâm sàng đơn độc.
Trái ngược với thể khởi phát sớm của bệnh này, trẻ sơ sinh cĩ khởi phát muộn thường biểu hiện khỏe mạnh lúc trẻ mới sinh. Người ta cho rằng trẻ sơ sinh bị vi khuẩn ngay từ lúc mới sinh, nhưng do các yếu tố chưa biết nào đĩ, việc khởi phát bệnh bị chậm lại. Cũng giống như vậy, nhưng các trường hợp nhiễm khuẩn do nhiễm trùng bệnh viện xãy ra sau khi trẻ được sinh ra dã được ghi nhận trong nhiều báo cáo về các nhĩm nhiễm Listeria khởi phát muộn. Bệnh khởi phát muộn hay cĩ viêm màng não hoặc viêm não màng não (ở 90% các trường hợp). Khởi phát muơn thường âm thầm hơn so với thể bệnh khởi phát sớm với những triệu chứng thường gặp như trẻ bú kém hoặc bỏ bú, khĩ chịu và sốt. 24 - Nhiễm Listeria ở người trưởng thành.
Nhiễm Listeria ở người trưởng thành thường gặp trên các bệnh cảnh suy giảm miễn dịch, đặc biệt khi hệ miễn dịch của tế bào bị suy giảm như trong u hệ lympho, các hệ thống điều trị chống thải ghép trong các ca ghép cơ quan nội tạng hoặc ghép tủy xương tự thân hoặc cùng lồi, khi đĩ bệnh xãy ra điển hình dưới dạng một biến chứng muộn. Ngay trong thời kỳ đầu của đại dịch AIDS, Listeria monocytogenes khơng được coi là tác nhân gây bệnh quan trọng với bệnh nhân nhiễm HIV, và cĩ một số ý kiến giải thích khá thuyết phục cho hiện tượng này như hoạt tính kháng Listeria của cotrimoxazole được dùng trong điều trị dự phịng nhiễm Pneumocystis jiroveci trước đĩ. Những nghiên cứu gần đây lại cho thấy, nhiễm Listeria xãy ra ở bệnh nhân dương tính với HIV cao hơn 150-300 lần so với nhĩm đối chứng. Những bệnh mạn tính khác như nghiện rượu và tiểu đường cũng là điều kiện thuận lợi cho việc lây nhiễm Listeria monocytogenes.
Nhiễm Listeria tiến triển ở người trưởng thành cĩ thể được xếp thành ba nhĩm tùy theo các biểu hiện lâm sàng: bệnh liên quan đến hệ thống thần kinh trung ương (CNS) chiếm khoảng 75% các trường hợp, nhiễm khuẩn huyết nguyên phát và nhĩm các loại khác bao gồm phổ rộng các loại nhiễm trùng tại chỗ. - Nhiễm khuẩn hệ thần kinh:
Viêm màng não cĩ hoặc khơng cĩ dấu hiệu thần kinh cục bộ là biểu hiện hay gặp nhất của nhiễm Listeria hệ thần kinh trung ương. Giống như các trường hợp viêm màng não mủ khác, viêm màng não do Listeria thường khởi phát cấp tính với sốt cao, cứng gáy và sợ ánh sáng, nhưng cĩ thêm 25 các rối loạn vận động như run rẩy hoặc mất khả năng điều hịa. Co giật cũng thường hay xuất hiện hơn so với các thể khác của viêm màng não.
Biểu hiện của viêm màng não hay gặp nhất của nhiễm Listeria hệ thần kinh trung ương là viêm màng não, thường hay ảnh hưởng nhất đến vùng não sau. Thể này cĩ tiến triển theo kiểu hai thì điển hình: tiền triệu chứng khơng đặc hiệu như đau đầu, buồn nơn, nơn và sốt, tiếp đĩ là liệt dây thần kinh khơng đối xứng tiến triển, các dấu hiệu tiểu não hoặc liệt nhẹ nửa người và suy giảm ý thức. Tiên lượng bệnh xấu, tỷ lệ di chứng thần kinh cao ở các trường hợp sống sĩt. Nguồn gốc nhiễm khuẩn thần kinh là từ nhiễm khuẩn huyết, khơng cĩ bằng chứng cho thấy là lây bệnh từ những vị trí nhiễm bệnh khác. - Nhiễm khuẩn huyết:
Nhiễm khuẩn huyết nguyên phát là biểu hiện hay gặp thứ hai trong nhiễm Listeria tiến triển ở người lớn tuổi khơng mang thai, khoảng 25-50% các trường hợp. Khơng cĩ đặc điểm lâm sàng phân biệt cho thể hiện nhiễm Listeria này. Bệnh nhân cĩ thể bị tụt huyết áp nặng với bệnh cảnh lâm sang tương tự như trong shock nơi độc tố vi khuẩn Gram âm, là trường hợp cĩ thể kèm theo hội chứng suy giảm hơ hấp ở người lớn. - Viêm màng trong tim xãy ra trên các van tim đã cĩ tổn thương từ trước, hay gây tình trạng nghẽn mạch hệ thống. - Viêm dạ dày ruột cấp tính gây tiêu chảy ở những người bị suy giảm miễn dịch. - Nhiễm khuẩn ở động vật:
Trong số các động vật, bệnh do Listeria monocytogenes tác động chuyên biệt trên gia súc, cứu và dê với thời gian ủ bệnh từ 2-6 tuần. ðộng vật bị 26 nhiễm Listeria monocytogenes chủ yếu là qua thức ăn bị nhiễm Listeria monocytogenes, qua đường hơ hấphoặc do tiếp xúc trực tiếp. Sự phát bệnh xãy ra kèm theo sự suy giảm miễn dịch đối với tác nhân gây bệnh do các yếu tố gây stress (mang thai, sự đơng đúc, sự vận chuyển, điều kiện mơi trường kém). ðộng vật bị nhiễm bệnh do Listeria monocytogenes thường sốt, biếng ăn, suy nhược và bị mất phương hướng. 2.2.7.2. Các triệu chứng của bệnh do vi khuẩn “Listeria monocytogenes” gây ra. - Các triệu chứng của Listeriosis thường bắt đầu xuất hiện vài ngày sau khi ăn uống phải các loại thực phẩm bị nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, cĩ một số trường hợp thời gian kéo dài đến 2 tháng mới xuất hiện các dấu hiệu đầu tiên của bệnh. Các dấu hiệu và triệu chứng của bệnh thường gặp là: tiêu chảy, sốt 380C ( 100,40F) hoặc cao hơn, đau các cơ, cĩ các cơn ớn lạnh hoặc rung mình buồn nơn. - Nếu xuất hiện tình trạng nhiễm Listeria vào hệ thần kinh, một số các dấu hiệu bệnh và triệu chứng cũng gần tương tự với nhiễm Listeria khu trú. Bao gồm: sốt, đau các cơ và các cơn rung mình, ớn lạnh nhưng chúng thường diễn biến nặng hơn các triệu chứng và bệnh lý thường cĩ ở tình trạng lan tỏa. Cĩ những thay đổi về tâm thần. Cĩ xáo trộn về mặt nhận thức và tinh thần, cĩ cơn co giật, nhứt đầu, mất thăng bằng, đau ở cổ ( cổ cĩ thể bị cứng, khĩ chuyển động), cĩ cơn động kinh, mất kiểm sốt vận động các chi. 2.2.8. Cơ chế gây bệnh. 27 Hình 2.6. Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn Listeria monocytogenes. - Từ lâu, các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng vi khuẩn Listeria lây lan từ tế bào này sang tế bào khác trong cơ thể con người. - Sau khi xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hĩa, Listeria monocytogenes tiếp tục di chuyển qua dạ dày rồi đi vào các mơ ở ruột non của vật chủ, bao gồm các tế bào biểu mơ và các đại thực bào của mảng Peyer. Trong suốt quá trình di chuyển chúng sẽ khơng gây ra những thương tổn mơ học 28 nếu liều lượng khơng đủ lớn. Trong dịch lympho hoặc máu thì Listeria monocytogenes di chuyển rất nhanh đến hạch bạch huyết, lá lách và gan rồi nhanh chĩng đi sâu vào khơng bào, hầu hết vi khuẩn xâm nhập và phá hủy khơng bào nhờ kết hợp với pH thấp, các enzyme thủy phân và oxy hĩa trong khơng bào. - Từ khơng bào chúng sẽ dy chuyển vào tế bào chất và nhân lên trong vịng 30 phút sau khi xâm nhiễm, từ 40-60 phút ở trong tế bào gan và đại thực bào. Quá trình xâm nhiễm vào cơ quan hồn thành sau 5-7 ngày. Tuy nhiên, nếu khơng đạt được đáp ứng được miễn dịch ở tế bào bạch huyết CD8+ và gamma, interferon gián tiếp hoạt hĩa đại thực bào. Nếu tế bào của vật chủ khơng tạo ra đủ đáp ứng miễn dịch thì Listeria monocytogenes sẽ di chuyển đến các vị trí khác trong cơ thể như não và nhau thai. Gây ra hiện tượng sẩy thai ở phụ nữ, các dị tật bẩm sinh ở trẻ em, viêm màng não, gây tử vong cho thai nhi. - Vi khuẩn lớn lên trong một tế bào và di chuyển nhanh chĩngtạo thành một cấu trúc theo hình ngĩn tay nhơ ra từ tế bào và đẩy sang tế bào liền kề. Khi đĩ, vi khuẩn sẽ tiếp tục gây bệnh cho tế bào liền kề đĩ. - Giáo sư Ireton và nhĩm của ơng đã phát hiện ra một quá trình thứ hai hổ trợ việc lây lan của vi khuẩn sang những tế bào khỏe mạnh mà trước đây chưa được biết đến. Qúa trình này dần dần đã làm suy yếu khả năng tự vệ khỏi việc nhiễm bệnh của tế bào thứ hai. Vi khuẩn Listeria di chuyển qua tế bào chất của tế bào trong cơ thể người sử dụng một phần khung của tế bàogọi là sợi actin. Vi khuẩn Listeria cĩ màu xanh và sới actin cĩ màu đỏ. Sợi actin hình thành một cấu trúc dạng đuơi phía sau vi khuẩn. Những sợi 29 actin này, cĩ tác dụng đẩy vi khuẩn Listeria qua tế bào chất của té bào trong cơ thể người. - Màng tế bào hay lớp ngồi cùng của tế bào khỏe mạnh thơng thường căng ra. Tình trạng căng đĩ kỳ vọng là cĩ tác dụng ngăn chặn vi khuẩn Listeria khơng lây lan sang những tế bào chưa nhiễm bệnh liền kề. - Tuy nhiên phịng thí nghiệm của giáo sư Ireton phát hiện ra rằng một loại protein trong vi khuẩn Listeria gọi là InIC xuất hiện làm giảm đi độ căng của màng tế bào ở những tế bào nhiễm bệnh, điều này sẽ làm cho việc di chuyển của vi khuẩn để xuyên thủng màng tế bào và sau đĩ lây lan sang các tế bào khỏe mạnh liền kề dễ dàng hơn. Phịng thí nghiệm của giáo sư Ireton cũng đưa ra bản báo cáo cho thấy cách mà InIC làm giảm độ căng là ngăn chặn chức năng protein Tuba trong cơ thể người. Thơng thường, chức năng của Tuba trong tế bào người khơng nhiễm bệnh là tạo ra độ căng của màng tế bào. Protein InIC trong vi khuẩn Listeria đã khống chế sự hoạt động của Tuba, làm giảm độ căng và giúp vi khuẩn lây lan sang các tế bào liền kề. Vi khuẩn mang mầm bệnh cĩ thể lây lan bằng cách kiểm sốt độ căng của màng tế bào trong tế bào người. 2.2.9. Tình hình nhiễm listeria monocytogenes ở Việt Nam và trên thế giới. - ðến những năm 1980, thực phẩm được coi là tác nhân chính gây truyền nhiễm Listeriosis. - Vào những năm 1981, tại Canada , một trận đại dịch từ thực phẩm đã làm ảnh hưởng đến 41 bệnh nhân là do ăn phải cải bắp lây nhiễm từ các phân tử cừu bị nhiễm bệnh. - Vào năm 1983, ở Boston cĩ 49 người bị nhiễm bệnh Listeriosis do tiêu thụ phải sữa khơng được tuyệt trùng kỹ lưỡng. 30 - Năm 1985, các trận dịch bệnh lớn xãy ra ở Bắc Mỹ tại California bắt nguồn từ phomat mềm cĩ 142 người bị nhiễm, những phomat khác gây ra 122 trườnghợp bị nhiễm Listeriosis ở Switzerland. Trong khi ở Anh, cĩ 300 trường hợp bị nhiễm trùng Listeriosis. - Những năm 1990, ở Pháp dịch bện xãy ra do ăn phải lưỡi lợn, thịt lợn, phomat mềm bị nhiễm khuẩn. - Trong thời gian vừa qua, trước tình hình số lượng các mẫu cá tra đơng lạnh bị phát hiện nhiễm Listeria monocytogenes ngày càng gia tăng, thực hiện chỉ đạo của lãnh đạo bộ, cục quản lý chất lượng nơng lâm thủy hải sản (NAFIQAD) đã cĩ quyết định thành lập nhĩm cơng tác chủ trì thực hiện đề tài khoa học cấp cơ sở “Xác định nguyên nhân lây nhiễm và đề xuất giải pháp kiểm xốt mối nguy hiểm Listeria monocytogenes trong sản phẩm cá tra đơng lạnh”. Ngày 6/11/2009, cục đã tổ chức hội nghị nghiệm thu đánh giá kết quả thực hiện đề tài. - Theo số liệu các kết quả phân tích của đề tài cho thấy 162/485 mẫu (bao gồm 29/120 mẫu nguyên liệu được lấy tại các nhà máy chế biến, 79/186 mẫu vệ sinh cơng nghiệp sau khi vệ sinh, 8/28 mẫu tay cơng nhân, 24/36 mẫu bán thành phẩm) bị phát hiện nhiễm Listeria monocytogenes. - Vào ngày 19/3/2007, cơ quan quản lý thực phẩm Anh quốc cĩ lệnh thu hồi các loại bánh mì kẹp thịt, do cơng ty thực phẩm Anchor cung cấp cho hệ thống bệnh viện và trường học tại Luân ðơn, do sản phẩm này bị nhiễm vi khuẩn Listeria monocytogenes. - ðây khơng phải là lần đầu, mà từ nhiều năm qua vi khuẩn này đã gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm lớn tại một số quốc gia trên thế giới (Mỹ, Úc, Canada, Pháp, Bỉ…..). Chúng ta cĩ thể điểm qua vài vụ ngộ độc điển hình 31 như sau: Vào tháng 12 năm 1999, tại Pháp cĩ vụ ngộ độc do ăn phải hamburger cĩ nhiễm vi khuẩn Listeria gây cho 27 người mắc bệnh. Trong đĩ, cĩ 7 người chết. Theo thống kê của Mỹ, hàng năm số bệnh lây nhiễm Listeria khoảng 2500 người, với gần 500 người chết. Thống kê tại Anh từ năm 2001-2005 cĩ 1933 người mắc bệnh do vi khuẩn Listeria gây ra… - Trong những năm qua, những con cá hun khĩi, và bơ cĩ liên quan đến dịh Listeriosis do vi khuẩn Listeria gây ra tại Thụy ðiển và Finland. - Cơ quan hữu quan các nước trên từng cảnh báo về loại vi khuẩn này. ðồng thời cũng đề ra các biện pháp kiểm tra nghiêm ngặt nguồn nguyên liệu thực phẩm. Nguy cơ của loại vi khuẩn này khơng chỉ gây ra ngộ độc thực phẩm mà quan trọng hơn là chúng gây ra các bệnh lý nguy hiểm như xảy thai, viêm màng não, nhiễm trùng huyết. Thường giai đoạn ủ bệnh từ vài ngày đến 2 tháng. Chính vì vậy, người ta thường khơng nhận biết được ngay sự lây nhiễm của loại vi khuẩn này. Dấu hiệu khởi phát của bệnh là cĩ sốt, khĩ chịu, đau lưng. Nếu độc tố đủ mạnh chúng sẽ gây ra ngộ độc thực phẩm cấp tính trong khoảng 12 giờ, với các triệu chứng nơn mủa, tiêu chảy, đau quặn bụng, nhức đầu…. 2.2.10. Nguyên tắc điều trị. - Mặc dù trên invitro cho thấy cịn nhạy cảm với nhiều thuốc (trừ Cephalosporin và Fosfomycin), kết quả điều trị bằng liệu phápkháng sinh trong bệnh nhiễm Listeria tiến triển thường khơng tốt, một phần do sự chậm chễ trong việc bắt đầu điều trị bằng kháng sinh thích hợp khi chưa đưa ra được chẩn đốn sớm trong quá trình bệnh và một phần do nhiều bệnh nhân cĩ tình trạng suy giảm miễn dịch. Hơn nữa, Listeria monocytogenes là một loại vi khuẩn ký sinh nội tế bào khơng bắt buộc, và 32 nhiều thuốc kháng sinh cĩ khả năng thâm nhập bên trong tế bào kém. Thậm chí nếu cĩ thể thâm nhập được, các thuốc này cĩ thể khơng ổn định hoặc giảm hoạt tính trong điều kiện mơi trường này. - Khả năng thâm nhập nội bào kém và nhiều ý kiến cho rằng các β-lactam chỉ cĩ khả năng kìm khuẩn đối với Listeria monocytogenes, nhưng các aminopenicillins, amoxicillin và ampicillin được cho là các thuốc thích hợp trong các trường hợp Listeria xâm nhiễm làm gây bệnh Listeriosis. Mặc dù phải dùng ở liều cao hơn so với bình thường (8-12g/ngày, chia 2 lần). Nhiều tác giả khuyến cáo nên sử dụng thêm một aminoglycoside, như gentamicin 5-7mg/kg/ngày. Các mơ hình động vật thực nghiệm sử dụng ampicillin gắn liposomal hoặc phân tử nano cũng cho kết quả khả quan mặc dù hiện tượng này vẫn được đánh giá lại trên lâm sàng. - Thời gian tối ưu của liệu pháp kháng sinh cho bệnh Listeriosis vẫn chưa được xác định, điều này phụ thuộc vào nhiều biểu hiện lâm sàng khác nhau và các điều kiện thuận lợi để gây bệnh, nhưng nĩi chung được khuyến cáo tối thiểu là 2 tuần trong nhiễm khuẩn nguyên phát và nhiễm Listeria ở phụ nữ mang thai ít nhất 3 tuần với viêm màng não và bệnh ở trẻ sơ sinh. Liệu trình ngắn hơn cĩ thể làm bệnh tái phát. Viêm màng trong tim cĩ thể cần được điều trị tối 6 tuần. - Với những bệnh nhân khơng dung nạp với ampicillin +/- aminoglycoside, cotrimoxazole được coi là liệu pháp thay thế chấp nhận được. - Việc lựa chọn kháng sinh cho bệnh nhân trong trường hợp khơng dung nạp với cả ampicillin và cotrimoxazole là một vấn đề khĩ khăn. ðiều trị bằng Vancomycin cũng cho kết quả kém, và mặc dù các thuốc khác như carbapenem, fluoroquinolone thế hệ mới hơn, linezelid và 33 quinupristin/dalfopristin cĩ hoạt tính tốt trên invitro chống lại Listeria monocytogenes, nhưng kinh nghiệm với những thuốc này trên lâm sàng vẫn cịn rất hạn chế. - Kháng kháng sinh mắc phải ở các chủng phân lập trên lâm sàng tương đối hiếm gặp, mặc dù kháng tetracycline ở các chủng mang gen tetM đã được ghi nhận với khả năng kháng thuốc qua plasmid. Với nhiều loại kháng sinh khác cơ chế để kháng qua trung gian plasmid cũng đã được ghi nhận. 2.2.11. Cách phịng ngừa. - Giữ thức ăn ngồi giới hạn của vùng nhiệt độ nguy hiểm từ 40C đến 600C. - Thức ăn nào cần giữ lạnh thì phải giữ ở nhiệt độ 40C hoặc thấp hơn, cịn những thức ăn nĩng thì phải giữ ở nhiệt độ trên 600C trở lên. - Nấu chín tồn bộ thức ăn tươi cĩ nguồn gốc từ động vật. - Giữ vệ sinh tối đa lúc nấu nướng hay chuẩn bị bữa ăn. Chùi rữa dụng cụ, dao, thớt bằng dung dịch Javel pha lỗng trong nước. - Cẩn thận với các loại cá và đồ biển hun khĩi. - Rửa tay bằng savon. - Thường xuyên chùi rữa, tẩy trùng tủ lạnh. - Khơng nên dung thực phẩm cĩ mùi lạ. - Khơng dung thực phẩm quá thời hạn sử dụng. - Khơng để thực phẩm tươi sống chung với thức ăn đã nấu chin. - Thức ăn nấu chín dung ngay khơng để lâu ngày trong tủ lạnh. - Rữa kỹ thức ăn trước khi sử dụng. - Giữ thức ăn đã được nấu chín tách biệt khỏi rau, thực phẩm chưa chế biến. 34 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP XÁC ðỊNH VI KHUẨN L.MNOCYTOGENES. 3.1. Phương pháp xác định truyền thống. 3.1.1. Nguyên lý và phương pháp. − Sử dụng phương pháp cấy đếm Listeria monocytogenes trên mơi trường nuơi cấy chuyên biệt sau khi ủ ấm ở nhiệt độ 300C trong 48h. chọn các khuẩn lạc nghi ngờ khẳng định Listeria monocytogenes bằng các thử nghiệm sinh hĩa. 3.1.2. Phạm vi phát hiện vi khuẩn. − Phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn Listeria monocytogenes trong thủy sản. 3.1.3. Dụng cụ sử dụng. − Mẫu thực phẩm cần kiểm tra. − Bình tam giác 500ml, ống lên men (Durham). − Tủ ấm 30-500C. − Que cấy vịng. − Que cấy thẳng. − Kính hiển vi. − ðĩa petri. − Pipettes 25,10 và 1ml. − ống nghiệm cĩ nắp đậy. 3.1.4.Mơi trường để nuơi cấy. - Canh tăng sinh sơ cấp Listeria Enrichment Broth I(LB I). - Canh tăng sinh thứ cấp Listeria Enrichment Broth II (LB II) 35 - Mơi trường Enrichment Broth (EB) cải tiến từ mơi trường LB, được sử dụng trong mơi trường tăng sinh từng giai đọan. - Mơi trường Oxford Agar, nơi trường Palcam Agar. - Thạch máu. - Mơi trường thạch mềm BHI. - Rhamnose Phenol Red Broth (RPR), Xylose Phenol Red Broth (XPR). - Thuốc thử catalase, oxidase. 3.1.5.Quy trình phân tích vi khuẩn Listeria Monocytogenes. 3.1.5.1. Quy trình kiểm nghiệm vi khuẩn Listeria monocytogenes. 36 Thạch mềm, ủ ở 250C, 25-48h Thạch máu, ở 370C,2 4-48h Soi canh khuẩn BHI đã ủ ở 250C Canh RPR, ủ ở 370C, 48 giờ Thử nghiệm Catalas e. CAMP với S.aureus và R.equi Tan máu yếu Di động hình dù trong thạch mềm Âm tính Dương tính Dương tính Chuyển động xoay trịn Kết luận: Listeria monocytogenes (+)/(-) trong 25 mẫu thử nghiệm Canh XPR, ủ ở 370C, 48 giờ Thử nghiệm Oxydase S.aureus (+), r.equi (-) Âm tính Sơ đồ 3.1. Quy trình kiểm nghiệm vi khuẩn Listeria monocytogenes. ðồng nhất 25g mẫu trong 225ml LB I, ủ ở 300C, 24h. Cấy 0.1ml canh khuẩn sang 10ml mơi trường LB II ủ ở 300C,24h Ria lên đĩa Oxford Agar hoặc đĩa Palcam Agar, ủ ở 300C, 48h Chọn các khuẩn lạc đặc trưng của Listeria Ria lên đĩa thạch TSA, ủ qua đêm 37 3.1.5.2. Thuyết minh quy trình. a/ Tăng sinh. − ðồng nhất 25g mẫu trong 225ml mơi trường tăng sinh LB I trong 30 giây. Ủ 300C trong 24h. Chuyển 0.1 ml LB I sang ống 10 ml LB II, tiếp tục ủ ở 300C trong 24 giờ. − Quy trình tăng sinh một giai đoạn được thực hiện như sau : Cân 25g mẫu, thêm vào 225ml canh EB ( đã được làm ấm ở 450C nếu mẫu thử là các sản phẩm sữa và ở 300C đối với các sản phẩm khác ) và tiến hành đồng nhất mẫu trong 30 giây. Ủ ở 300C trong 48 giờ. − Quy trình tăng sinh một giai đoạn được thực hiện như sau: Cân 25g mẫu, thêm vào 225ml canh EB (đã được làm ấm ở 450C nếu mẫu thử là các sản phẩm khác ) và tiến hành đồng nhất mẫu trong 30 giây, ủ ở 300C trong 48h. b/ Phân lập. − Phân lập Listeria monocytogenes trên mơi trường OXFORD.
Dùng tăm bơng vơ trùng thấm dịch mẫu từ ống tăng sinh, trải sang ½ đĩa mơi trường Oxford Agar. Từ những vệt cấy này dùng que cấy vịng ria sang ½ đĩa cịn lại. Ủ ở 370C trong 24-48h. Trên mơi trường này khuẩn lạc Listeria monocytogenes cĩ màu xám hay màu nâu được bao quanh bởi vịng đen, khuẩn lạc lõm, nhỏ, đường kính khoảng 1mm. − Phân lập Listeria monocytogenes trên mơi trường PALCAM.
Dùng pipet hút 0.1 ml mẫu cho vào mơi trường thạch Palcam, sau đĩ tiến hành cấy trang ( trang đến khi thấy mơi trường lan đều mặt thạch là được). Sau đĩ, đem ủ ở 370C trong vịng 48 giờ. Sau 48 giờ lấy ra quan sát, ta thấy khuẩn lạc Listeria monocytogenes cĩ màu xám đến 38 xanh lá cây, cĩ tâm màu đen. Mơi trường xung quanh chuyển sang màu xanh đen. c/ Khẳng định Listeria monocytogenes bằng các thử nghiệm sinh hĩa. − Thử khả năng tan huyết.
Chọn khuẩn lạc điển hình trên mơi trường thạch Oxford, dùng que cấy vịng,cấy truyền sang mơi trường thạch máu, ủ ở 370C, 24-48 giờ. Trên mơi trường thạch máu, khuẩn lạc Listeria monocytogenes được bao quanh bởi vịng tán huyết hẹp do hiện tượng dung huyết dạng β vịng tan huyết trong và rõ. Trước khi tiền hành thử nghiệm khẳng định, cấy chuyền khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn Listeria monocytogenes sang mơi trường lỏng khơng chọn lọc, ủ ở 250C, trong 20 giờ. - Thử nghiệm Catalase.
Nguyên tắc: Các vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí tùy nghi chứa chuỗi điện tử cĩ cytochrome đều cĩ enzyme catalase (trừ các Streptococcus.spp). Enzyme catalase cĩ vai trị bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của oxy phân tử trong tế bào vi sinh vật. Các vi sinh vật cĩ khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tử tạo H2O2. Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H20 và O2, ngăn cản sự tích tụ của phân tử cĩ độc tính cao này trong tế bào. Sự thủy phân hydrogen peroxide sẽ giài phĩng O2 được ghi nhận qua sự sủi bọt khí.
Chủng làm đối chứng của thử nghiệm này là Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis. 39 Hình 3.1. thử nghiệm Catalase.
Phương pháp tiến hành: Hĩa chất dùng để tiến hành thử nghiệm là: Hydrogen Peroxide 30%, dung dịch đệm Photphate pH 7.0. − Thử trên lame.
Dùng que cấy thẳng cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt trêm lame, nhỏ 1 giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật trêm lame, nhỏ 1 giọt H2O2 0.5% rồi đậy lại bằng lamelle. Nếu dương tính sẽ xuất hiện bọt khí bị giữ lại giữa lame và lamelle. − Thử nghiệm trên đĩa Petri.
Nhỏ trực tiếp 1ml H202 30% lên sinh khối chủng thuần trên bề mặt thạch. Nếu dương tính sẽ xuất hiện sủi bọt quanh sinh khối. − Thử nghiệm Oxidase.
Nguyên tắc:  Xác định sự hiện diện của hệ enzyme oxidase ở vi sinh vật. Enzyme quan trọng nhất là cytochrome oxidase trong chuỗi truyền điện tử của hơ hấp hiếu khí với O2 là chất nhận điện tử cuối cùng , chỉ hiện diện ở 40 các lịai hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Họat tính cytochrome oxidase được phát hiện nhờ thuốc thử p- phenylenediamine. Trong điều kiện cĩ sự hiện diện của cytochrome C khử trong tế bào, thuốc thử này bị oxy hĩa thành một hợp chất indophenol cĩ màu xanh dương. Chủng dùng làm đối chứng là (+) Pseudomonas aerugnosa, (-) Acinetobacter lwoffi.
Phuơng pháp tiến hành.  Cách 1: cấy sinh khối chủng thuần lên ống thạch nghiêng Nutrien Agar, ủ ở nhiệt độ thích hợp trong 24-48 giờ. Nhúng một mành giấy lọc vào dung dịch 1% teramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride hoặc oxalate. Dùng que cấy vịng thu lấy sinh khối, dàn đều lên vị trí cĩ thuốc thử trên giấy lọc. Nếu khơng xuất hiện màu xanh thì phản ứng âm tính.  Cách 2: Cấy sinh khối chủng thuần lên ống thạch nghiêng Nutrien Agar, ủ ở nhiệt độ thích hợp trong 24-48 giờ. Nhỏ lên sinh khối vào giọt mỗi lọai thuốc thử mới pha là 1% p-aminodimethyaniline oxalate và 1% α-napthol trong ethanol. Nếu khơng xuất hiện màu xanh thì phản ứng âm tính. − Thử nghiệm tính di động.
Nguyên tắc.  Vi sinh vật họat động di chuyển được là nhờ tiêm mao. Khả năng di động cĩ thể dùng để phân biệt các vi sinh vật, khả năng này được quan sát nhờ sự tăng trưởng và di động của vi sinh vật vào bên trong thạch mềm.  Chủng dùng để làm đối chứng là: Serratia marcescens, Acinetobacter lwoffi. 41
Phuơng pháp tiến hành.  Sử dụng mơi trường thạch mềm chứa 0.5% agar. Mơi trường được đun tan chảy, phân phối thành dung tích 5ml vào ống nghiệm vơ trùng, hấp khử trùng ở 1200C trong 15 phút. Các ống mơi trường này được làm nguội ở trạng thái đứng và bảo quản 4-100C. Dùng que cấy thẳng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần sau khi ủ ở nhiệt độ thích hợp. Chủng được cấy bằng cách đâm sâu đầu que cấy xuyên vào giữa mơi trường trong ống nghiệm đến độ sâu khoảng 2cm . Các ống mơi trường được ủ ở 370C trong 24/48 giờ. Thực hiện song song với việc ủ ở điều kiện tương tự một ống mơi trường khơng được cấy vi sinh vật dùng làm ống đối chứng.  Ống đối chứng khơng cĩ vi sinh vật tăng trưởng, mơi trường trong. Nếu sử dụng mơi trường thạch mềm mà trong ống nghiệm cĩ Listeria monocytogenes thì Listeria monocytogenes sẽ mọc lan khỏi đường cấy theo hình dù và làm vẫn đục mơi trường xung quanh. − Khả năng biến dưỡng đường.
Nguyên tắc.  Xác định khả năng sử dụng một nguồn carbon nhất định của vi sinh vật để tăng trưởng.
Phương pháp tiến hành.  Ủ các ống canh trùng thử khả năng lên men đường ở 370C trong 7 ngày. Kết quả (+) (màu vàng) thường quan sát được trong vịng 24-48 giờ. Listeria monocytogenes lên men rhamnose nhưng khơng cĩ khả năng lên men xylose.  Thử nghiệm CAMP. 42
Nguyên tắc.  Phản ứng CAMP là phả ứng phối hợp giữa nhân tố protein tiết bởi các lồi Streptococcus nhĩm B với nhân tố β-hemolysin tiết ra bởi chủng Streptococcus aureus gây ra hiện tượng làm tan hồng cầu của cừu hoặc bị trên mơi trường thạch màu. Nhân tố CAMP cĩ vai trị tăng cường hoạt tính photpholipase C xúc tác thuỷ phân thành phần chủ yếu của màng hồng cầu cừu hoặc bị là β-hemolysin. Photpholipase C thuỷ phân lecithin ở màng ngồi tạo thành các diglyceride, photphatidyl choline và ceramide. Ceramide và diglyceride kết tụ với nhau thanh những giọt đặc. Nhân tố CAMP tác dụng lên các khối tụ này tạo ra khoảng trống trên màng ngồi giúp cho photpholipase C cĩ điều kiện tiếp xúc và thuỷ phân sphigomelin ở màng trong làm hồng cầu dễ vỡ. Trong thử nghiệm CAMP người ta tiến hành cấy chủng kiểm nghiệm cùng với một chủng Staphylococcus tạo nhiều β-lysin lên mơi trường thạch máu được bổ sung máu cừu hay bị. Nếu chủng kiểm nghiệm CAMP thì sẽ xuất hiện đường tan huyết ở vùng lân cận chung của đường cấy chủng kiểm nghiệm và Saccharomyces aureus.
Phương pháp tiến hành.  Trên đĩa thạch dung để thử CAMP, cấy Saccharomyces aureus thành một đường cấy mỏng, tương tự cấy Rhodocus equi để tạo thành 2 đường cấy song song cách nhau 4cm.  Cấy chủng nghi ngờ Listeria monocytogenes ở giữa, gần nhưng khơng chạm vào 2 đường cấy song song của Staphylococcus aureus và Rhodococus equi. Cĩ thể cấy một hoặc nhiều dịng vi khuẩn nghi ngờ Listeria monocytogenes làm chủng kiểm nghiệm để kiểm tra trên cùng 43 một đĩa. Cấy chủng đối chứng Listeria monocytogenes và chủng Listeria innocua thành hình vuơng gĩc nhưng khơng chạm vào nhau. Ủ đĩa ở 370C trong 20-36 giờ. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vùng cộng hưởng tan huyết ngay tại ranh giới của chủng kiểm nghiệm với Staphylococcus aureus hoặc giữa chủng thử nghiệm với Rhodococus equi. Phản ứng CAMP dương tính với Rhodococus equi sẽ tạo vùng tan huyết rộng (5-10mm) và cĩ hình dạng đầu mũi tên. Phản ứng dương tính với Staphylococcus aureus thường tạo vùng tan huyết hẹp ( khoảng 2 mm) cĩ dạng hình trịn. Listeria monocytogenes cho phản ứng CAMP dương với S.aureus và âm với Rhodococus equi. Ngược lại, Listeria innocua cĩ phản ứng CAMP âm với cả hai lồi Staphylococcus aureus và Rhodococus equi. 3.2. Phương pháp hiện đại. 3.2.1. Phương pháp ELISA. 3.2.1.1. Nguyên tắc. - Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch là phản ứng giữa một tế bào(kháng nguyên) vớimột kháng thể đặc hiệu. Tín hiệu của một phản ứng miễn dịh cĩ thể nhận biết thơng qua sự ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên kháng thể hoặc bằng cách sử dụng những kháng thể đã được đánh dấu bằng cách nhuộm hùynh quang, đồng vị phĩng xạ, hay enzyme. - Phương pháp ELISA là phương pháp hấp thụ miễn dịch liên kết enyme. Nguyên tắc kỹ thuật Elisa là sử dụng kháng thể đơn dịng hay cịn gọi là kháng thể sơ cấp phủ bên ngịai những giếng nhỏ nhằm mục đích thu giữ được phép thu giữ bằng cách sử dụng kháng thể thứ 2 cĩ gắn enzyme phát tín hiệu. Khi cho vào hỗn hợp phản ứng một cơ chất đặc hiệu của enzyme, 44 phản ứng xãy ra và làm đổi màu các sản phẩm làm đổi màu phản ứng.Vì vậy chúng ta cĩ thể phát hiện được sự hiện diện của kháng nguyên. 3.2.1.2. Quy trình thực hiện phân tích. Sơ đồ 3.2. Quy trình phát hiện Listeria monocytogenes. Thuyết minh quy trình.
Chuẩn bị mẫu.
Tăng sinh lần đầu : Thêm 25g mẫu vào 225ml dung dịch 3M Listeria Broth (LB), trộn đều, ủ ở 36=5-370C/24h. Cho mẫu vào giếng để 30 phút, ở 35-370C Thêm phức hợp kháng thể và enzyme Chuẩn bị mẫu ( tăng sinh lần 1 ở 30- 350C/24h, tăng sinh lần 2 ở 300C/22-24h. Thêm cơ chất, dể khỏang 10 phút ở 20-250C ðọc kết quả 45
Tăng sinh lần 2: Chuyển 0.1ml dung dịch tăng sinh lần 1 vào 9.9ml canh FRASER ủ ở 300C/22-24h.
Cách tiến hành phân tích bằng phản ứng ELISA.
Chuẩn bị: Xử lý nhiệt.
Chuyển 1ml mẫu từ canh Fraser vào 50µl dung dịch phụ trợ mẫu vào ống đã được dán nhãn, ngâm 15 phút trong nước sơi, để nguội. Mở hộpp Listeria VIA và để ở nhiệt độ phịng. Mở bao và tháo giếng ra rồi đặt ở chân đế.
Cách tiến hành:  Bước 1: ♦ Cấy mẫu và mẫu đối chứng, ghi lại vị trí cấy mẫu và dung pipep hút 200µlmẫu và dịch đối chứng vào giếng rồi rữa và đổ bỏ nước mỗi giếng 3 lần.  Bước 2: ♦ Thêm 200µl chất kết hợp vào mỗi giếng, đậy giếng, ủ ở 35-370C/30 phút. ♦ Rửa: đổ hết dung dịch trong giếng rồi rữa và đổ bỏ nước ở giếng rữa mỗi giếng 4 làn.  Bước 3: ♦ Thêm 200µl cơ chất vào mỗi giếng, ủ 20-250C/15 phút. Them 20µl dung dịch kết thúc giúp ổn định màu vào mỗi giếng ( nếu cần).  Bước 4: ðọc kết quả. ♦ ðọc bằng mắt thường nhờ bảng so màu hoặc sử dụng máy đọc. ♦ Nếu mẫu cĩ màu xanh lá cây đến xanh dương đậm thì mẫu dương tính. 3.2.2. Phương pháp lai phân tử. 46 3.2.2.1.Nguyên tắc. - Phương pháp sử dụng mẫu dị để phát hiện v sinh vật trong thực phẩm được dựa trên sự phát hiện một đọan gene đặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của vịec mẫu dị là quá trình lai phân tử. - Cơ sở của việc sử dụng mẫu dị là phương pháp lai phân tử. Qúa trình này bao gồm sự tách rời hai mạch đơi của chuỗi xoắn kép DNA và sự tái bắt cặp các trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. Sự lai phân tử xãy ra khi đoạnmồi cĩ trình tự nucleotide bổ sung với một vúng trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ mơi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ. Qúa trình lai phân tử chịu ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố: nồng độ DNA trong mơi trường, nhiệt độ và thời gianphản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của mơi trường. 3.2.2.2. Cách làm. - Hệ thống này sử dụng que với mẫu dị để phát hiện Listeria. Mẫu dị là những đọan Oligomer DNA đánh dấu bằng hĩa chất phát quang. Quy trình cĩ thể được chia làm 6 bước:
Phát vỡ tế bào thu nhận rRNA.
Mẫu dị DNA cĩ đuơi oligodeoxyadenylic nucleotide (dA) và mẫu dị phát hiện chứa fluorescenin isothiocynate (F) ở đầu 5’ và 3’của phân tử được đặt vào phản ứng.
Que thử được bao bọc bởi polydeoxythydien (dT) để gắn kết được với oligo dA của mẫu dị
Que thử được đặt vào ống đo chứa mẫu dị phát hiện được đánh dấu bằng enzyme. 47
Sau khi rữa, lọai bỏ phần enzyme thừa , que thử được đặt vào ống đo chứa cơ chất tạo màu.
Sau khi ủ để hiện màu, màu được phát hiện ở bước sĩng 450nm. 3.2.3.Phương pháp PCR. 3.2.3.1. Nguyên tắc. - Phương pháp PCR là một phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa trên khuơn là mơt trình tự DNA ban đầu, khuyếch đại, nhân số lượng bản sao của khuơn này thành hàng triệu bản sao nhờ họat động của enzymepolymerase và mơt cặp mồi đặc hiệu cho đọan DNA này. - Tồn bộ quá trình được lặp đi lặp lại 25-30 chu kỳ để một bản sao của mẫu DNA cĩ thể biến thành ha2ng tỷ bản sao trong vịng 3-4 giờ. 3.2.3.2. Cách làm.  Cách xác định Listeria monocytogenes bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi LM-F và LM-R. - Chủng vi sinh vật: Listeria monocytogenes. - Chuẩn bị thí nghiệm.
Trình tự gen hlyA đã được cơng bố trên ngân hàng gen.
Phần mềm BLAST dung để xác định trình tự gen đích hlyA của Listeria monocytogenes.
Cặp mồi LM-F và LM-R.
Hĩa chất sử dụng để tách chiết DNA tổng số.
Phương pháp tiến hành thí nghiệm cho phản ứng PCR.
Dựa trên trình tự gen hlyA của các chủng Listeria monocytogennes được cơng bố trên ngân hàng gen, cặp mồi LM-F và LM-R được thiết kế bao gồm 20bp/mồi cho sản phẩm PCR 468bp. 48 - Xác định tính đặc hiệu của mồi.
Tính đặc hiệu của mồi được khảo sát bằng cách kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi thiết kế với các khuơn DNA của vi khuẩn Listeria moocytogenes và khơng phải là vi khuẩn Listeria mococytogenes trong phản ứng PCR. - Phản ứng PCR.
DNA khuơn từ Listeria monocytogenes được thu nhận cho phản ứng PCR bằng cách tách à làm sạch DNA với chloroform hoặc sử lý nhiệt tế bào ở 1000C trong 10 phút. Tối ưu hĩa điều kiện PCR về nồng độ MG2+ (1 .5-4.0 mM), nồng độ mồi (0.1-0.5pmol/mồi) và nồng độ dNTPs (100- 250Mm/mỗi loại). Phản ứng PCR được thực hiện với thể tích hổn hợp 25ml vĩi chu trình nhiệt gồm 940C/3 phút,( 940C/ 1 phút, 600C/1 phút , 720C/ 1 phút)×30 trình, 720C/ 5 phút và 40C/5 phút. ðánh giá kết quả trên gel agarose 1% với 3ml sản phẩm. - Xác định độ nhạy của phương pháp.
Mơi trường nuơi cấy qua đêm của vi khuẩn Listeria monocytogenes là tr6n mơi trường LEB được định lượng, pha lỗng với mật độ thích hợp. Ly tâm thu sinh khối 1ml canh trường hịa tan trong 100ml TE, xử lý nhiệt thu DNA cho phản ứng PCR 3ml dịch tế bào đã qua sử lý nhiệt được sử dụng làm khuơn cho phản ứng PCR. ðánh giá kết quả nhờ điện di trên gel agarose 1% với 3ml sản phẩm. - Bộ gen DNA.
Bộ gen DNA của Listeria monocytogenes được tách và làm sạch dung là khuơn cho phản ứng PCR khuyết đại đoạn gen mục tiêu hlyA với cặp mồi LM-F và LM-R. Kết quả phản ứng PCR với khuơn DNA tinh sạch cho thấy một dãy DNA cĩ kích thước nằm trong khoảng kích thước sản phẩm 49 PCR đã được thiết kế sẵn. Với mục đích thu nhận DNA bản mẫu cho phản ứng PCR một cách đơn giản hơn, huyền phù Listeria monocytogenes được sử lý nhiệt ở 1000C trong 10 phút để phá vỡ tế bào, giải phĩng DNA, ly tâm 10000 vịng / 1 phút × 10 phút, thu dịch ly tâm chứa DNA làm khuơn cho phản ứng PCR. - Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR.
Nồng độ Mg2+: phản ứng PCR được thực hiện ở các nồng độ cuối cùng của Mg2+ từ 1.5mM-4.0Mm.
Nồng độ mồi: PCR được thực hiện tại các nồng độ mồi khác nhau từ 0.1- 05 pmol.
Dịch tế bào được xác định mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Pha lỗng dịch vi khuẩn với các nồng độ khác nhau, xử lý nhiệt các dịch huyền phù vi khuẩn, 3 ml dịch sinh khối vi khuẩn sau khi sử lý nhiệt dung làm khuơn cho phản ứng PCR cho thấy phản ứng PCR cho kết quả dương tính với mẫu cĩ mật độ tế bào 6 × 102/ phản ứng tương ứng với mật độ tế bào 2 × 104 CFU/ml. - Ưu điểm của phương pháp PCR.
Thời gian cho kết quả nhanh.
Cĩ thể phát hiện những vi sinh vật khĩ nuơi cấy. Việc nuơi tăng sinh là đơn giản hop7n và đơi khi khơng cần thiết.
Hĩa chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm và dễ tồn trữ hơn so với trường hợp huyết thanh học. Khơng cần dụng cụ nuơi cấy và mơi trường phân tích phức tạp, cĩ thể thực hiện ngay tại hiện trường.
Ít tốn kém về nhân sự, cĩ thể được tự động hĩa để làm giảm chi phí phân tích phát hiện các vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm. 50 - Nhược điểm của phương pháp PCR.
Sự ức chế hoạt tính ủa Tag DNA polymerase bởi thành phần của mẫu vật do mẫu thực phẩm thường cĩ những thành phần phức tạp. Tuy nhiên, việc chiết tách và tính chế DNA từ thực phẩm hay mơi trường trước khi thực hiện phương pháp PCR thường cho phép loại bỏ những hợp chất ức chế.
Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp nên trong đa số trường hợp cần cĩ bước nuối cấy làm giàu để cĩ được mật độ để phát hiện bằng PCR.
Phương pháp này khơng phân biệt được tế bào sống với tế bào chết. Do vậy , cĩ thể dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết . ngược lại, phương pháp này cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm sinh hay tế bào đã chết của các vi sinh gây bệnh, gây ngộ độc thực phẩm. 51 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận. - Tĩm lại, vi khuẩn Listeria monocytogenes là 1 lồi vi khuẩn gây ngơ độc thực phẩm nguy hiểm cho người ăn phải những thực phẩm bị lây nhiễm. - ðặc biệt, nĩ gây nguy hiểm đối với những phụ nữ mang thai, những người lớn tuổi, những cĩ hệ thống miễn dịch suy giảm và trẻ sơ sinh khi mắc phải vi khuẩn Listeria monocytogenes cĩ thể nguy hiểm đến tính mạng. - Trên thế giới hiện nay, vấn đề về vi khuẩn này hiện nay là vấn đề vơ cùng được quan tâm. Mặc dù, nĩ khơng xãy ra nhiều dịch bệnh tại Việt Nam. Nhưng tình hình lây nhiễm Listeria moncytogenes đã từng xuất hiện tại Việt Nam và trên thế giới với một mức độ càng ngày càng tăng cao. - Trên thế giới hiện nay, đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu về vi khuẩn Listeia monocytogenes và hiện nay ở các nước Châu âu vấn đề về vi khuẩn Listeria gây nhiễm vào thực phẩm hiện đang rất được quan tâm và kiểm sốt kỹ bằng các phương pháp hiện đại. - Nhưng tại Việt Nam vấn đề nguy hiểm này chưa đươc quan tâm đúng mức và chưa ĩ phương pháp phịng chống 1 cách đúng mức. 4.2. Kiến nghị. - Từ những nguy hiểm trên nên cĩ cách phịng chống sự lây nhiễm của vi khuẩn Listeia monocytogenes. - Nên kiểm tra nghiêm ngặt những thực phẩm tiêu dùng về mức độ vi khuẩn trong thực phẩm, đặc biệt là đối với vi khuẩn Listeria monocytogenes. 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. – Trần Linh Thước. [2] Vi khuẩn y học – PGS- Ts Lê Văn Phùng [3] Giáo trình vi sinh vật học thực phẩm – Kiều Hữu Ảnh. [4] Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh trong thủy sản – nhà xuất bản nơng nghiệp. [5] Aerobic and Facultative Gram-Positive Bacilli