Đề tài Quá trình sinh tổng hợp cồn

LÔØI CAÛM ÔN Vôùi khoaûng thôøi gian hôn boán naêm ngoài treân gheá giaûng ñöôøng, vaø ñaëc bieät laø hôn boán thaùng laøm luaän vaên toát nghieäp vöøa qua, em ñaõ tröôûng thaønh raát nhieàu trong vieäc nghieân cöùu cuõng nhö trong reøn luyeän nhaân caùch baûn thaân. Ñeå coù ñöôïc nhöõng ñieàu naøy, em xin göûi lôøi caûm ôn chaân thaønh nhaát ñeán taát caû caùc quyù thaày coâ trong tröôøng Ñaïi hoïc Baùch Khoa, vaø ñaëc bieät laø caùc thaày coâ trong Boä moân Coâng ngheä thöïc phaåm, nhöõng ngöôøi ñaõ giuùp ñôõ vaø dìu daét em raát nhieàu treân con ñöôøng trôû thaønh moät kyõ sö, moät trí thöùc treû trong töông lai. Em cuõng xin göûi lôøi caûm ôn chaân thaønh vaø saâu saéc nhaát ñeán thaày Leâ Vaên Vieät Maãn vaø coâ Toân Nöõ Minh Nguyeät ñaõ taän tình höôùng daãn vaø chæ baûo cho em trong thôøi gian laøm luaän vaên vöøa qua. Con xin caûm ôn boá meï ñaõ heát loøng yeâu thöông, chaêm soùc vaø coå vuõ tinh thaàn cho con, giuùp con vöôït qua ñöôïc nhöõng giai ñoaïn khoù khaên nhaát trong coâng vieäc cuõng nhö trong cuoäc soáng. Toâi xin göûi lôøi caûm ôn ñeán taát caû baïn beø toâi, nhöõng ngöôøi ñaõ cho toâi hieåu theá naøo laø moät tình baïn chaân thaønh vaø ñeïp ñeõ, nhöõng ngöôøi ñaõ luoân ôû beân caïnh toâi ñoäng vieân vaø giuùp ñôõ toâi. TpHCM, ngaøy 10 thaùng 01 naêm 2007 Sinh vieân Nguyeãn Thò Hieàn Löông MUÏC LUÏC Danh muïc caùc baûng Chöông 2: TOÅNG QUAN 3 Baûng 2.1: Thaønh phaàn cuûa dòch nho vaø röôïu vang thoâng thöôøng 3 Baûng 2.2: Thaønh phaàn caùc moät soá acid höõu cô chính trong dòch nho ñoû vaø röôïu vang ñoû 6 Baûng 2.3: Caùc ñaëc tính mong muoán cuûa naám men vang 10 Baûng 2.4: So saùnh caùc kyõ thuaät coá ñònh teá baøo 12 Baûng 2.5: Moät soá chaát mang söû duïng ñeå coá ñònh naám men trong saûn xuaát röôïu vang 14 Baûng 2.6: Toác ñoä söû duïng cô chaát vaø hình thaønh saûn phaåm cuûa naám men coá ñònh trong gel alginate vaø naám men töï do 26 Baûng 2.7: Caùc hôïp chaát höông chính cuûa röôïu vang taïo bôûi naám men coá ñònh vaø naám men töï do trong khoaûng nhieät ñoä 15 – 20oC 29 Baûng 2.8: Thaønh phaàn cuûa röôïu vang traéng leân men baèng 4 loaïi naám men coá ñònh trong gel alginate vaø naám men töï do 30 Baûng 2.9: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu ñeán ñoäng hoïc quaù trình leân men trong quaù trình leân men tónh röôïu vang ôû 30oC bôûi teá baøo coá ñònh saáy thaêng hoa (freeze-dried gluten supported biocatalyst – FGB), teá baøo töï do saáy thaêng hoa (freef reeze-dried cells – ffdc) vaø teá baøo coá ñònh chöa qua saáy (wet gluten supported biocatalyst – WGB) 33 Baûng 2.10: Caùc nguyeân nhaân cô baûn gaây ra hieän töôïng keùo daøi thôøi gian leân men hoaëc quaù trình leân men keát thuùc khi haøm löôïng ñöôøng soùt coøn raát cao 44 Baûng 2.11: Naêng suaát sinh coàn trong quaù trình leân men dòch nho bôûi naám men coá ñònh treân kissiris, g-alumina vaø alginate taïi 7, 13 vaø 27oC 47 Baûng 2.12: Caùc hôïp chaát deã bay hôi taïo thaønh trong suoát quaù trình leân men lieân tuïc röôïu vang söû duïng naám men coá ñònh treân mieáng taùo vaø quaù trình leân men tónh söû duïng naám men töï do. Quaù trình leân men ñöôïc thöïc hieän ôû 30oC 48 Chöông 3: NGUYEÂN LIEÄU vaø PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 51 Baûng 3.1: Thaønh phaàn cuûa dòch nho sau khi eùp 52 Baûng 3.2: Caùc chaát boå sung vaøo dòch nho khi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu ñeán quaù trình leân men 56 Baûng 3.3: Caùc chaát boå sung vaøo dòch nho khi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa haøm löôïng tannin ban ñaàu ñeán quaù trình leân men 56 Chöông 4: KEÁT QUAÛ vaø BAØN LUAÄN 66 Baûng 4.1: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu ñeán toác ñoä sinh tröôûng rieâng cöïc ñaïi cuûa naám men trong quaù trình leân men röôïu vang, söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 69 Baûng 4.2: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu ñeán haøm löôïng ñöôøng soùt trong quaù trình leân men röôïu vang, söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 72 Baûng 4.3: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu ñeán toác ñoä söû duïng ñöôøng cöïc ñaïi cuûa naám men trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 74 Baûng 4.4: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu ñeán toác ñoä söû duïng ñöôøng rieâng cöïc ñaïi trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 74 Baûng 4.5: Ñoä leân men öùng vôùi haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu khaùc nhau 75 Baûng 4.6: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu ñeán thôøi gian leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 75 Baûng 4.7: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu ñeán toác ñoä söû duïng ñöôøng trung bình trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 76 Baûng 4.8: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu ñeán haøm löôïng coàn ñaït ñöôïc trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 81 Baûng 4.9: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu ñeán toác ñoä sinh toång hôïp coàn cöïc ñaïi trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 82 Baûng 4.10: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu ñeán toác ñoä sinh toång hôïp coàn rieâng cöïc ñaïi trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 83 Baûng 4.11: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu ñeán toác ñoä sinh toång hôïp coàn trung bình cuûa naám men trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 84 Baûng 4.12: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu ñeán hieäu suaát sinh toång hôïp coàn trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 86 Baûng 4.13: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng tannin ban ñaàu ñeán toác ñoä sinh tröôûng rieâng cöïc ñaïi trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 93 Baûng 4.14: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng tannin ban ñaàu ñeán haøm löôïng ñöôøng soùt trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 96 Baûng 4.15: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng tannin ban ñaàu ñeán toác ñoä söû duïng ñöôøng cöïc ñaïi trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 96 Baûng 4.16: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng tannin ban ñaàu ñeán toác ñoä söû duïng ñöôøng rieâng cöïc ñaïi (chæ xeùt cho giaù trò cöïc ñaïi ñaàu tieân) trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 97 Baûng 4.17: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng tannin ban ñaàu ñeán thôøi gian leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 99 Baûng 4.18: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng tannin ban ñaàu ñeán toác ñoä söû duïng ñöôøng trung bình trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 99 Baûng 4.19: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng tannin ban ñaàu ñeán toác ñoä sinh toång hôïp coàn cöïc ñaïi trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 103 Baûng 4.20: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng tannin ban ñaàu ñeán toác ñoä sinh toång hôïp coàn rieâng cöïc ñaïitrong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 104 Baûng 4.21: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng tannin ban ñaàu ñeán toác ñoä sinh toång hôïp coàn trung bình trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 105 Baûng 4.22: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng tannin ban ñaàu ñeán hieäu suaát sinh toång hôïp coàn trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 106 Danh muïc caùc hình veõ Chöông 2: TOÅNG QUAN 3 Hình 2.1: Nho xanh vaø nho ñoû 4 Hình 2.2: Cô cheá cuûa quaù trình bieán ñoåi caùc hôïp chaát nitô bôûi naám men 6 Hình 2.3: Caùc acid khoâng bay hôi trong röôïu vang 6 Hình 2.4: Caáu truùc phaân töû cuûa acid tannic 8 Hình 2.5: Caùc kyõ thuaät cô baûn ñeå coá ñònh teá baøo 11 Hình 2.6: Caáu truùc cuûa alginate 18 Hình 2.7: Cô cheá taïo gel cuûa alginate theo phöông phaùp taïo gel töø beân ngoaøi 19 Hình 2.8: Cô cheá taïo gel cuûa alginate theo phöông phaùp taïo gel töø beân trong 20 Hình 2.9: Con ñöôøng hình thaønh caùc chaát taïo höông vò cho röôïu vang 28 Hình 2.10: Haøm löôïng ethanol (P) thay ñoåi theo thôøi gian öùng vôùi caùc noàng ñoä cô chaát khaùc nhau. 31 Hình 2.11: Toác ñoä söû duïng glucose cöïc ñaïi vaø toác ñoä taïo thaønh ethanol cöïc ñaïi khi haøm löôïng ñöôøng thay ñoåi 31 Hình 2.12: Söï thay ñoåi haøm löôïng ñöôøng theo thôøi gian. 32 Hình 2.13: Söï söû duïng glucose trong suoát quaù trình leân men. 33 Hình 2.14: Khaû naêng taïo coàn cuûa naám men trong suoát quaù trình leân men 33 Hình 2.15: Aûnh höôûng cuûa pH ñeán toác ñoä leân men cuûa naám men coá ñònh vaø naám men töï do 35 Hình 2.16: Aûnh höôûng cuûa pH ñeán khaû naêng soáng soùt cuûa naám men coá ñònh 35 Hình 2.17: Aûnh höôûng cuûa pH ñeán haøm löôïng coàn taïo thaønh trong suoát quaù trình leân men 36 Hình 2.18: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng SO2 ñeán quaù trình leân men röôïu vang traéng 37 Hình 2.19: Aûnh höôûng cuûa SO2 ñeán haøm löôïng coàn taïo thaønh trong suoát quaù trình leân men. 38 Hình 2.20: Aûnh höôûng cuûa tannin ñeán haøm löôïng coàn taïo thaønh trong suoát quaù trình leân men. 39 Hình 2.21: Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân men ñeán haøm löôïng coàn taïo thaønh trong suoát quaù trình leân men. 40 Hình 2.22: Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán ñoäng hoïc quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men coá ñònh treân DCM vaø naám men töï do 41 Hình 2.23: Söï chuyeån hoùa acid malic bôûi naám men töï do vaø naám men Schizosaccharomyces pombe coá ñònh khi söû duïng caùc haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu khaùc nhau. 43 Hình 2.24: Ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men röôïu vang ôû nhöõng nhieät ñoä khaùc nhau söû duïng naám men coá ñònh treân gluten. 46 Chöông 3: NGUYEÂN LIEÄU vaø PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 51 Hình 3.1: Quy trình eùp nho 51 Hình 3.2: Sô ñoà nghieân cöùu 53 Hình 3.3: Quy trình coá ñònh naám men trong gel alginate baèng phöông phaùp taïo gel töø beân ngoaøi 54 Chöông 4: KEÁT QUAÛ vaø BAØN LUAÄN 66 Hình 4.1: Söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo naám men trong quaù trình leân men röôïu vang, söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 200 – 360g/L) 67 Hình 4.2: Söï thay ñoåi toác ñoä sinh tröôûng rieâng cuûa naám men trong quaù trình leân men röôïu vang, söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 200 – 360g/L). 68 Hình 4.3: Söï thay ñoåi noàng ñoä chaát khoâ trong quaù trình leân men röôïu vang, söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 200 – 360g/L). 70 Hình 4.4: Söï thay ñoåi haøm löôïng ñöôøng trong quaù trình leân men röôïu vang, söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 200 – 360g/L). 71 Hình 4.5: Söï thay ñoåi toác ñoä söû duïng ñöôøng trong quaù trình leân men röôïu vang, söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 200 – 360g/L). 72 Hình 4.6: Söï thay ñoåi toác ñoä söû duïng ñöôøng rieâng trong quaù trình leân men röôïu vang, söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 200 – 360g/L). 73 Hình 4.7: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu ñeán toác ñoä söû duïng ñöôøng trung bình trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 76 Hình 4.8: Söï thay ñoåi haøm löôïng nitô amin töï do trong quaù trình leân men röôïu vang, söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 200 – 360g/L). 78 Hình 4.9: Söï thay ñoåi haøm löôïng nitô ammonium trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 200 – 360g/L). 79 Hình 4.10: Söï thay ñoåi haøm löôïng coàn trong trong quaù trình leân men röôïu vang, söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 200 – 360g/L). 80 Hình 4.11: Söï thay ñoåi toác ñoä sinh toång hôïp coàn trong trong quaù trình leân men röôïu vang, söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 200 – 360g/L). 82 Hình 4.12: Söï thay ñoåi toác ñoä sinh toång hôïp coàn rieâng trong trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 200 – 360g/L). 83 Hình 4.13: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu ñeán toác ñoä sinh toång hôïp coàn trung bình trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 84 Hình 4.14: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu ñeán hieäu suaát sinh toång hôïp coàn trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 85 Hình 4.15: Söï thay ñoåi pH trong trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 200 – 360g/L). 86 Hình 4.16: Söï thay ñoåi haøm löôïng acid toång trong trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 200 – 360g/L). 87 Hình 4.17: Söï thay ñoåi haøm löôïng acid deã bay hôi trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 200 – 360g/L). 88 Hình 4.18: Söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo naám men trong quaù trình leân men röôïu vang, söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng tannin ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 1,8 – 17,8g/L). 91 Hình 4.19: Söï thay ñoåi toác ñoä sinh tröôûng rieâng cuûa naám men trong quaù trình leân men röôïu vang, söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng tannin ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 1,8 – 9,8g/L). 92 Hình 4.20: Söï thay ñoåi toác ñoä sinh tröôûng rieâng cuûa naám men trong quaù trình leân men röôïu vang, söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate khi haøm löôïng tannin ban ñaàu laø 17,8g/L. 93 Hình 4.21: Söï thay ñoåi noàng ñoä chaát khoâ trong quaù trình leân men röôïu vang, söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng tannin ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 1,8 – 17,8g/L). 94 Hình 4.22: Söï thay ñoåi haøm löôïng ñöôøng trong quaù trình leân men röôïu vang, söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng tannin ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 1,8 – 17,8g/L). 95 Hình 4.23: Söï thay ñoåi toác ñoä söû duïng ñöôøng trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng tannin ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 1,8 – 17,8g/L). 96 Hình 4.24: Söï thay ñoåi toác ñoä söû duïng ñöôøng rieâng trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng tannin ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 1,8 – 17,8g/L). 97 Hình 4.25: AÛnh höôûng cuûa haøm löôïng tannin ban ñaàu ñeán toác ñoä söû duïng ñöôøng trung bình trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 99 Hình 4.26: Söï thay ñoåi haøm löôïng nitô amin töï do trong quaù trình leân men röôïu vang, söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng tannin ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 1,8 – 17,8g/L). 100 Hình 4.27: Söï thay ñoåi haøm löôïng nitô ammonium trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng tannin ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 1,8 – 17,8g/L). 101 Hình 4.28: Söï thay ñoåi haøm löôïng coàn trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng tannin ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 1,8 – 17,8g/L). 102 Hình 4.29: Söï thay ñoåi toác ñoä sinh toång hôïp coàn trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate khi haøm löôïng tannin ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 1,8 – 17,8g/L. 103 Hình 4.30: Söï thay ñoåi toác ñoä sinh toång hôïp coàn rieâng trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng tannin ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 1,8 – 17,8g/L). 104 Hình 4.31: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng tannin ban ñaàu ñeán toác ñoä sinh toång hôïp coàn trung bình trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 105 Hình 4.32: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng tannin ban ñaàu ñeán hieäu suaát sinh toång hôïp coàn trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate. 106 Hình 4.33: Söï thay ñoåi pH trong quaù trình leân men röôïu vang, söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng tannin ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 1,8 – 17,8g/L). 107 Hình 4.34: Söï thay ñoåi haøm löôïng acid toång trong quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng tannin ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 1,8 – 17,8g/L). 108 Hình 4.35: Söï thay ñoåi haøm löôïng acid deã bay hôi trong quaù trình leân men röôïu vang, söû duïng naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate (haøm löôïng tannin ban ñaàu thay ñoåi trong khoaûng 1,8 – 17,8g/L). 109 Danh muïc moät soá thuaät ngöõ vaø chöõ vieát taét ADH : enzyme alcohol dehydrogenase CD : Naám men coá ñònh DCM : Delignified Cellulosic Material DEAE-cellulose : diethylaminoethyl-cellulose EEFA : ethyl ester fatty acid FGB : freeze-dried gluten supported biocatalyst, laø teá baøo coá ñònh saáy thaêng hoa. Ffdc : free freeze-dried cells, laø teá baøo töï do saáy thaêng hoa. NS : non-Saccharomyces, laø nhöõng loaøi naám men khoâng thuoäc gioáng Saccharomyces. TD : Naám men töï do WGB : wet gluten supported biocatalyst, laø teá baøo coá ñònh chöa qua saáy m : Toác ñoä sinh tröôûng rieâng töùc thôøi cuûa teá baøo, laø toác ñoä sinh tröôûng tính treân moät ñôn vò teá baøo taïi moät thôøi ñieåm nhaát ñònh. Ñôn vò: h-1 mmax : Toác ñoä sinh tröôûng rieâng cöïc ñaïi cuûa teá baøo, laø toác ñoä sinh tröôûng rieâng lôùn nhaát trong toaøn boä quaù trình leân men. Ñôn vò: h-1 gS : Toác ñoä söû duïng ñöôøng töùc thôøi cuûa naám men, laø haøm löôïng ñöôøng maø naám men söû duïng trong moät ñôn vò thôøi gian. Ñôn vò: g/L/h gSmax : Toác ñoä söû duïng ñöôøng cöïc ñaïi cuûa naám men, laø toác ñoä söû duïng ñöôøng lôùn nhaát trong toaøn boä quaù trình leân men. Ñôn vò: g/L/h gS : Toác ñoä söû duïng ñöôøng rieâng töùc thôøi cuûa naám men, laø toác ñoä söû duïng ñöôøng tính treân moät ñôn vò teá baøo taïi moät thôøi ñieåm nhaát ñònh. Ñôn vò: g/h/1012 teá baøo gSmax : Toác ñoä söû duïng ñöôøng rieâng cöïc ñaïi cuûa naám men, laø toác ñoä söû duïng ñöôøng rieâng lôùn nhaát trong toaøn boä quaù trình leân men. Ñôn vò: g/h/1012 teá baøo t : Toång thôøi gian leân men, ñöôïc xaùc ñònh töø ñoä leân men. Ñôn vò: h KS : Toác ñoä söû duïng ñöôøng trung bình, laø haøm löôïng ñöôøng trung bình ñöôïc naám men söû duïng trong moät ñôn vò thôøi gian leân men. Ñôn vò: g/L/h gP : Toác ñoä sinh toång hôïp coàn töùc thôøi cuûa naám men, laø haøm löôïng coàn maø naám men sinh toång hôïp ñöôïc trong moät ñôn vò thôøi gian. Ñôn vò: g/L/h gpmax : Toác ñoä sinh toång hôïp coàn cöïc ñaïi cuûa naám men, laø toác ñoä sinh toång hôïp coàn lôùn nhaát trong toaøn boä quaù trình leân men. Ñôn vò: g/L/h gP : Toác ñoä sinh toång hôïp coàn rieâng töùc thôøi cuûa naám men, laø toác ñoä sinh toång hôïp coàn tính treân moät ñôn vò teá baøo taïi moät thôøi ñieåm nhaát ñònh. Ñôn vò: g/h/1012 teá baøo gPmax : Toác ñoä sinh toång hôïp coàn rieâng cöïc ñaïi cuûa naám men, laø toác ñoä sinh toång hôïp coàn rieâng lôùn nhaát trong toaøn boä quaù trình leân men. Ñôn vò: g/h/1012 teá baøo KP : Toác ñoä sinh toång hôïp coàn trung bình, laø haøm löôïng coàn trung bình ñöôïc naám men sinh toång hôïp trong moät ñôn vò thôøi gian leân men. Ñôn vò: g/L/h h : Hieäu suaát sinh toång hôïp coàn, laø soá mol ethanol ñöôïc taïo thaønh töø moät mol glucose ñöôïc naám men söû duïng. Ñôn vò: mol ethanol/ mol glucose. GIÔÙI THIEÄU Nhö chuùng ta ñaõ bieát, röôïu vang laø moät trong nhöõng saûn phaåm leân men coù lòch söû laâu ñôøi nhaát. Theo caùc taøi lieäu coå, röôïu vang coù xuaát xöù töø caùc nöôùc AÛ Raäp vaøo khoaûng theá kyû 18 hay 19 tröôùc Coâng nguyeân vaø cho ñeán nay, röôïu vang ñaõ trôû neân phoå bieán khaép nôi treân theá giôùi. Röôïu vang ñöôïc öa thích tröôùc heát laø do höông vò heát söùc ñaëc tröng maø khoâng loaïi saûn phaåm naøo coù theå thay theá, sau ñoù laø do noù ñem laïi caûm giaùc saûng khoaùi vaø söùc khoûe cho ngöôøi uoáng. Ñaàu tieân, röôïu vang ñöôïc taïo ra baèng quaù trình leân men töï phaùt. Sau ñoù, ngöôøi ta ñaõ tieán haønh phaân laäp caùc chuûng naám men vaø caáy vaøo dòch leân men loaøi Saccharomyces cerevisiae thuaàn thieát ñeå thuùc ñaåy quaù trình leân men vaø taêng chaát löôïng cuûa röôïu vang. Tuy nhieân, vieäc söû duïng naám men töï do ñeå leân men coù khaù nhieàu nhöôïc ñieåm: Thôøi gian leân men daøi, naêng suaát leân men thaáp. Tieâu toán nhieàu naêng löôïng ñeå taùch naám men ra khoûi röôïu vang sau quaù trình leân men. Khaû naêng taùi söû duïng naám men raát thaáp. Khoù töï ñoäng hoùa quaù trình leân men. Ñeå khaéc phuïc caùc nhöôïc ñieåm naøy, nhieàu nghieân cöùu veà vieäc söû duïng naám men coá ñònh trong saûn xuaát röôïu vang ñaõ ñöôïc thöïc hieän. Caùc nghieân cöùu naøy ñeàu cho thaáy naám men coá ñònh coù nhieàu öu ñieåm hôn haún so vôùi naám men töï do: Taêng toác ñoä söû duïng cô chaát, ruùt ngaén thôøi gian leân men. OÅn ñònh hoaït tính cuûa naám men. Caùc chaát mang coá ñònh coù taùc duïng nhö laø moät taùc nhaân baûo veä teá baøo choáng laïi nhöõng aûnh höôûng baát lôïi cuûa pH, nhieät ñoä, dung moâi vaø ngay caû caùc kim loaïi naëng. Deã daøng taùch naám men ra khoûi saûn phaåm sau quaù trình leân men, do ñoù laøm giaûm chi phí veà thieát bò vaø naêng löôïng. Coù theå taùi söû duïng naám men nhieàu laàn. Taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho vieäc toái öu hoùa vaø töï ñoäng hoùa quaù trình leân men. Caùc nghieân cöùu tröôùc ñaây veà öùng duïng naám men coá ñònh trong saûn xuaát röôïu vang chuû yeáu khaûo saùt quaù trình söû duïng ñöôøng, quaù trình sinh toång hôïp coàn vaø söï hình thaønh caùc hôïp chaát höông maø ít ñeà caäp ñeán ñoäng hoïc quaù trình sinh tröôûng cuûa naám men, quaù trình söû duïng caùc hôïp chaát nitô cuõng nhö söï chuyeån hoùa cuûa caùc acid höõu cô trong suoát quaù trình leân men chính. Chuùng toâi cuõng tìm thaáy raát ít caùc nghieân cöùu veà aûnh höôûng cuûa moät soá yeáu toá coâng ngheä trong quaù trình saûn xuaát ñeán ñoäng hoïc quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men coá ñònh nhö aûnh höôûng cuûa haøm löôïng tannin, haøm löôïng SO2 trong dòch nho ban ñaàu. Tuy nhieân, caùc nghieân cöùu naøy cuõng chæ khaûo saùt quaù trình sinh toång hôïp coàn maø chöa khaûo saùt moät caùch toaøn dieän aûnh höôûng cuûa caùc yeáu toá naøy ñeán taát caû caùc maët trong quaù trình leân men chính. Treân cô sôû ñoù, chuùng toâi ñeà xuaát ñeà taøi nghieân cöùu “Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa caùc yeáu toá coâng ngheä ñeán ñoäng hoïc quaù trình leân men röôïu vang nho söû duïng naám men coá ñònh”. Chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt aûnh höôûng cuûa 4 yeáu toá coâng ngheä, bao goàm: pH, haøm löôïng ñöôøng, haøm löôïng SO2 vaø haøm löôïng tannin ban ñaàu. Tuy nhieân, trong phaïm vi baøi luaän vaên naøy, toâi chæ xin trình baøy sö aûnh höôûng cuûa 2 yeáu toá laø haøm löôïng ñöôøng vaø haøm löôïng tannin ban ñaàu. Keát quaû veà söï aûnh höôûng cuûa pH vaø haøm löôïng SO2 trong dòch nho ñeán quaù trình leân men seõ do moät baïn khaùc trình baøy. Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi söû duïng chaát mang laø alginate - moät polysaccharide thu ñöôïc töø rong mô phaân boá doïc theo bôø bieån mieàn Trung cuûa Vieät Nam. Chuùng toâi laàn löôït khaûo saùt aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng vaø haøm löôïng tannin ban ñaàu ñeán caùc vaán ñeà sau: Ñoäng hoïc quaù trình sinh tröôûng cuûa naám men. Ñoäng hoïc quaù trình söû duïng cô chaát: ñöôøng khöû, nitô amin vaø nitô voâ vô. Ñoäng hoïc quaù trình hình thaønh saûn phaåm: do thôøi gian haïn heïp vaø chöa coù ñieàu kieän veà kinh phí neân trong phaïm vi baøi luaän vaên naøy, chuùng toâi chæ trình baøy saûn phaåm quan troïng nhaát cuûa quaù trình leân men laø coàn maø chöa trình baøy caùc hôïp chaát höông. Vaø chuùng toâi cuõng khaûo saùt theâm söï chuyeån hoùa cuûa caùc acid höõu cô trong suoát quaù trình leân men chính. TOÅNG QUAN TOÅNG QUAN VEÀ RÖÔÏU VANG, NHO VAØ NAÁM MEN DUØNG TRONG SAÛN XUAÁT RÖÔÏU VANG Röôïu vang Röôïu vang nho laø saûn phaåm thu ñöôïc baèng con ñöôøng leân men coàn töø dòch nho. Röôïu vang nho coù theå ñöôïc saûn xuaát töø moät gioáng nho rieâng bieät, hoaëc töø hoãn hôïp hai hay ba gioáng nho khaùc nhau. Vì vaäy saûn phaåm vang nho coù soá löôïng vaø chuûng loaïi raát phong phuù, ña daïng. Veà maët coâng ngheä, saûn phaåm vang nho ñöôïc chia ra thaønh hai nhoùm lôùn [1]: Nhoùm röôïu vang khoâng coù gas Nhoùm röôïu vang coù gas Do quaù trình leân men, thaønh phaàn cuûa röôïu vang khaùc vôùi thaønh phaàn cuûa dòch nho ban ñaàu (baûng 2.1) [199]. Baûng 2.1: Thaønh phaàn cuûa dòch nho vaø röôïu vang thoâng thöôøng [199] Hôïp chaát % trong dòch nho % trong röôïu vang Nöôùc 75,0 86,0 Ñöôøng (fructose, glucose vaø moät ít saccharose) 22,0 0,3 Alcohols (ethanol vaø haøm löôïng veát cuûa terpenes, glycerols vaø röôïu baäc cao) 0,1 11,2 Acid höõu cô (tartaric, malic vaø moät ít lactic, succinic, oxalic,…) 0,9 0,6 Khoaùng (potassium, calcium vaø moät ít sodium, magnesium, iron,…) 0,5 0,5 Phenols (caùc flavonoid nhö laø caùc chaát maøu cuøng vôùi caùc nonflavonoid nhö laø cinnamic acid vaø vanillin) 0,3 0,3 Caùc hôïp chaát chöùa nitô (protein, amino acid, humin, amide, ammonia,…) 0,2 0,1 Caùc hôïp chaát höông (caùc ester nhö laø ethyl caproate, ethyl butyrate,…) Veát Veát TOÅNG 100,0 100,0 Nho Phaân loaïi Phaân loaïi khoa hoïc cuûa nho [217]: Giôùi (regnum) : Plantae Ngaønh (divisio) : Magnoliophyta Lôùp (class) : Magnoliopsida Boä (ordo) : Vitales Hoï (familia) : Vitaceae Chi (genus) : Vitis Trong ñoù, loaøi Vitis vinifera laø thích hôïp nhaát ñeå saûn xuaát röôïu vang vì loaøi naøy chöùa [216]: Haøm löôïng caùc chaát dinh döôõng cao, caàn thieát cho söï phaùt trieån cuûa naám men vang. Haøm löôïng acid khaù cao, ñuû ñeå öùc cheá söï phaùt trieån cuûa caùc vi sinh vaät khoâng mong muoán trong vaø sau quaù trình leân men. Haøm löôïng ñöôøng ñuû ñeå taïo ra haøm löôïng coàn cao, nhôø ñoù öùc cheá ñöôïc caùc vi sinh vaät gaây hö hoûng trong röôïu vang. Caùc hôïp chaát höông vôùi thaønh phaàn vaø löôïng thích hôïp, vì theá röôïu vang taïo thaønh coù tính chaát caûm quan toát. Döïa vaøo nguoàn goác gioáng nho, coù theå chia thaønh 2 nhoùm cô baûn laø [1] : Nho traéng: traùi nho khi chín voû khoâng coù maøu hoaëc maøu vaøng luïc nhaït. Nho ñoû: traùi nho khi chín voû coù maøu ñoû – tím ôû nhöõng möùc ñoä khaùc nhau (Hình 2.1). a) b) c) Hình 2.1: Nho xanh (a) vaø nho ñoû (b, c) Thaønh phaàn hoùa hoïc Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa nho thay ñoåi theo gioáng, ñoä chín, thôøi vuï thu hoaïch, ñieàu kieän ñaát ñai, khí haäu, kyõ thuaät canh taùc …. Thaønh phaàn cô baûn cuûa nho ñöôïc neâu ra nhö trong baûng 2.1. Moät soá caùc hôïp chaát quan troïng trong nho vaø röôïu vang: Ñöôøng Thoâng thöôøng dòch nho ñeå saûn xuaát röôïu vang chöùa 16 – 26% (w/v) ñöôøng. Trong nho khoâ vaø trong nho thu hoaïch treã, haøm löôïng ñöôøng coù theå leân tôùi treân 30% (w/v). Dòch nho coâ ñaëc vôùi haøm löôïng ñöôøng 35oBx ñöôïc söû duïng ñeå saûn xuaát röôïu vang coù haøm löôïng coàn cao (Buescher vaø coäng söï, 2001). Khi ñoù ñoä leân men ñaït khoaûng 86 – 87%. Haøm löôïng ñöôøng cao coù theå aûnh höôûng ñeán khaû naêng leân men cuûa naám men [129]. Dòch nho tröôùc khi leân men thöôøng chöùa tyû leä caân baèng cuûa glucose vaø fructose. Trong suoát quaù trình leân men, taát caû caùc chuûng Saccharomyces cerevisiae ñeàu öu tieân söû duïng glucose hôn laø fructose. Haøm löôïng ethanol cao coù taùc ñoäng öùc cheá maïnh söï söû duïng fructose hôn laø glucose. Trong khi ñoù, boå sung nitô vaøo dòch nho seõ kích thích söï söû duïng fructose hôn laø glucose [26, 49]. Nitô Caùc hôïp chaát nitô raát caàn cho söï phaùt trieån vaø trao ñoåi chaát cuûa naám men. Trong soá caùc chaát dinh döôõng maø naám men coù theå söû duïng ñöôïc trong suoát quaù trình leân men dòch nho, veà soá löôïng, nitô laø thaønh phaàn quan troïng thöù hai sau caùc hôïp chaát carbon. Coù nhieàu hôïp chaát chöùa nitô coù maët trong dòch nho, vôùi haøm löôïng thay ñoåi töø 60 – 2400mg/L [85]. Saccharomyces cerevisiae coù khaû naêng söû duïng caùc nguoàn nitô khaùc nhau ñeå phaùt trieån, nhöng khoâng phaûi taát caû caùc nguoàn nitô ñeàu hoã trôï phaùt trieån toát nhö nhau. Caùc nguoàn nitô toát laø ammonium, glutamine vaø asparagine, trong khi ñoù proline vaø urea ñöôïc xem nhö laø nhöõng nguoàn nitô keùm chaát löôïng [24, 85]. Taát caû caùc hôïp chaát chöùa nitô tích luõy trong dòch nho bò bieán ñoåi thaønh moät trong hai saûn phaåm cuoái laø ammonium hoaëc glutamate (Hình 2.2). Glutamate cuøng vôùi glutamine ñoùng moät vai troø quan troïng trong quaù trình trao ñoåi nitô cuûa naám men. Töø 2 amino acid naøy taát caû caùc hôïp chaát chöùa nitô trong teá baøo ñöôïc taïo ra [85]. Acid höõu cô Trong nho vaø röôïu vang, 6 acid chieám thaønh phaàn chính laø acid tartaric, acid malic, acid citric, acid lactic, acid succinic vaø acid acetic (Hình 2.3, baûng 2.2). Trong ñoù, acid acetic laø hôïp chaát deã bay hôi coøn caùc acid khaùc laø acid khoâng bay hôi. Ñoä phaân ly cuûa caùc acid naøy giaûm theo thöù töï sau: acid citric, acid tartaric, acid malic, acid succinic, acid lactic, vaø acid acetic. Hình 2.2: Cô cheá cuûa quaù trình bieán ñoåi caùc hôïp chaát nitô bôûi naám men [85] a) b) c) d) e) Hình 2.3: Caùc acid khoâng bay hôi trong röôïu vang: a) acid citric, b) acid tartaric, c) acid malic, d) acid succinic, e) acid lactic Baûng 2.2: Thaønh phaàn caùc moät soá acid höõu cô chính trong dòch nho ñoû vaø röôïu vang ñoû [167] Acid höõu cô Dòch nho ñoû Röôïu vang ñoû Acid citric Acid tartaric Acid malic Acid succinic Acid lactic Acid acetic 0,25 – 0,35g/L 4,07 – 7,65g/L 1,99 – 2,91g/L Raát ít Raát ít Raát ít 0,17 – 0,40g/L 2,60 – 5,7g/L 0,06 – 3,13g/L 0,48 – 1,22g/L 0,07 – 4,89g/L 0,30 – 1,44g/L SO2 Sulfur dioxide ñöôïc söû duïng roäng raõi trong röôïu vang nhö laø moät chaát choáng oxy hoùa, taùc nhaân khaùng khuaån vaø ñoàng thôøi cuõng laø taùc nhaân cho vieäc choïn loïc caùc loaøi hoaëc chuûng coù theå phaùt trieån vaø ñoùng goùp vaøo quaù trình leân men. Trong röôïu vang, SO2 toàn taïi ôû 2 daïng: töï do vaø lieân keát. Nhöng chæ SO2 töï do môùi coù tính khöû vaø dieät khuaån. Maëc duø vaäy, moät vaøi daïng SO2 lieân keát coù theå chuyeån hoùa thaønh SO2 töï do vaø coù theå buø laïi cho löôïng SO2 bò giaûm trong quaù trình leân men. Vì theá, SO2 laø moät thoâng soá quan troïng aûnh höôûng ñeán ñoäng hoïc quaù trình leân men vaø chaát löôïng röôïu vang [22, 30, 48, 58, 63, 79, 90, 143]. Beân caïnh ñoù, SO2 coøn coù aûnh höôûng xaáu ñeán quaù trình leân men röôïu vang: daãn tôùi keùo daøi thôøi gian leân men hoaëc quaù trình leân men keát thuùc khi haøm löôïng ñöôøng soùt coøn cao, vaø aûnh höôûng ñeán tính chaát caûm quan cuûa röôïu vang [48, 81]. Tannin Trong caùc thaäp kyû qua, thaønh phaàn polyphenolic ñöôïc quan taâm do noù aûnh höôûng ñeán giaù trò caûm quan cuûa röôïu vang (maøu saéc vaø muøi vò) vaø caùc giaù trò dinh döôõng khaùc (theo quan ñieåm veà y hoïc, tannin ñöôïc xem laø chaát choáng oxi hoùa, choáng khoái u vaø beänh maïch vaønh) [64, 31, 51, 165, 80, 174, 29, 99, 157]. Tannin xuaát phaùt töø chöõ “tanning” coù nghóa laø thuoäc da vì tannin coù khaû naêng phaûn öùng vaø keát tuûa vôùi caùc protein coù trong da ñoäng vaät [87]. Tannin coù ôû 2 daïng laø tannin ngöng tuï vaø tannin thuûy phaân [216]: Tannin thuûy phaân: coù nguoàn goác töø caùc acid phenolic nhö laø acid gallic vaø acid ellagic. Tannin ngöng tuï: laø polymer cuûa flavan-3-ol (epicatechin, catechin vaø gallocatechin) vaø flavan-3,4-diol. Tannin coù ôû trong nho vaø röôïu vang chuû yeáu laø caùc tannin ngöng tuï [216]. Tannin coù theå ñöôïc theâm vaøo röôïu vang döôùi daïng acid tannic (Hình 2.4) ñeå phaûn öùng vaø keát tuûa vôùi protein vaø ñeå caûi thieän ñoä trong cuûa röôïu vang. Trong suoát quaù trình uû, söï thay ñoåi haøm löôïng tannin ngöng tuï seõ aûnh höôûng ñeán maøu saéc vaø tính chaát caûm quan cuûa röôïu vang, vaø khi ñoù, khoái löôïng phaân töû cuûa tannin coù theå taêng leân [216]. Tình hình troàng nho treân theá giôùi vaø ôû Vieät Nam Theo soá lieäu cuûa FAO, 75.866km² ñaát treân theá giôùi ñöôïc duøng ñeå troàng nho. Khoaûng 71% saûn löôïng nho ñöôïc duøng saûn xuaát röôïu vang, 27% ñöôïc duøng ñeå aên döôùi daïng quaû töôi vaø 2% ñöôïc söû duïng laøm nho khoâ [217]. Khaùc vôùi caùc loaïi traùi caây khaùc cuûa Vieät Nam, nho laø loaïi traùi caây ñöôïc du nhaäp töø caùc nöôùc treân theá giôùi vaøo Vieät Nam töø nhöõng naêm 1960. Nho troàng taäp trung chuû yeáu ôû Ninh Thuaän vaø Baéc Bình Thuaän vôùi dieän tích khoaûng 2.500 – 7.000 ha. Ñaëc bieät taïi vuøng Ninh Thuaän, caây nho raát coù tieàm naêng, naêng suaát khaù cao, treân moät hecta coù theå thu ñöôïc 30 - 40 taán moãi naêm. Gioáng nho ñaàu tieân ñöôïc troàng laø gioáng nho ñoû aên töôi Red Cardinal. Cho tôùi baây giôø, ñaây vaãn laø gioáng nho chuû löïc do saûn löôïng töông ñoái cao. Gioáng naøy toàn taïi treân 30 naêm. Tröôùc naêm 2000, gioáng naøy chieám 100% dieän tích troàng nho taïi Vieät Nam, nhöng hieän nay chæ chieám khoaûng 80%. Gioáng nho xanh NH01 – 48 ñöôïc nhaäp töø Thaùi Lan töø naêm 1997 chieám gaàn 20% dieän tích troàng nho hieän nay. Ngoaøi ra, chuùng ta cuõng coù moät soá gioáng môùi nhaäp khaùc nhöng chæ chieám moät dieän tích troàng raát nhoû [215]. Hình 2.4: Caáu truùc phaân töû cuûa acid tannic Naám men Naám men laø vi sinh vaät quan troïng, kieåm soaùt quaù trình leân men coàn trong saûn xuaát röôïu vang. Naám men trong quaù trình leân men röôïu vang coù theå coù töø 3 nguoàn goác khaùc nhau: beà maët traùi nho, beà maët thieát bò vaø töø canh tröôøng ñöôïc caáy vaøo. Thaønh phaàn vaø chaát löôïng cuûa röôïu vang coù lieân quan chaët cheõ ñeán naám men. Trong quaù trình leân men, beân caïnh caùc saûn phaåm chính laø ethanol vaø CO2, naám men taïo thaønh nhieàu saûn phaåm phuï, ví duï nhö glycerol, acid acetic, acid succinic vaø ñaëc bieät laø caùc hôïp chaát höông, goùp phaàn ñaùng keå vaøo chaát löôïng cuûa röôïu vang [9, 89, 92, 151, 163]. Phaân loaïi Naám men coù theå ñöôïc phaân thaønh 2 nhoùm: Thöù nhaát goïi laø non-Saccharomyces (NS – laø nhöõng loaøi naám men khoâng thuoäc gioáng Saccharomyces), thöôøng xuaát hieän treân beà maët cuûa traùi nho cuøng vôùi nhieàu loaïi vi sinh vaät khaùc. Haàu heát caùc loaøi NS khoâng coù khaû naêng toàn taïi khi noàng ñoä coàn cao hôn 6%v/v (ngoaïi tröø Brettanomyces bruxellensis coù theå phaùt trieån trong moâi tröôøng coù noàng ñoä coàn leân ñeán 12%). Tröôùc ñaây, naám men NS ñöôïc xem laø caùc vi sinh vaät gaây hö hoûng. Tuy nhieân, nhöõng nghieân cöùu gaàn ñaây cho thaáy raèng, moät soá loaøi naám men NS coù lôïi cho chaát löôïng röôïu vang, giuùp taêng cöôøng höông vò cuûa röôïu vang [23, 41, 42, 45, 149, 166, 207]. Nhoùm khaùc goùp phaàn vaøo höông vò röôïu vang, cuõng laø nhaân toá chính cuûa quaù trình leân men coàn laø caùc loaøi thuoäc gioáng Saccharomyces. Saccharomyces coù khaû naêng chòu ñöïng söï thay ñoåi cuûa ñieàu kieän moâi tröôøng vôùi noàng ñoä ethanol vaø acid höõu cô taêng vaø söï caïn kieät chaát dinh döôõng (Pretorius, 2000). Nhö vaäy, maëc duø coù nhieàu gioáng vaø loaøi naám men trong dòch nho, nhöng gioáng Saccharomyces, maø chuû yeáu laø loaøi Saccharomyces cerevisiae môùi laø loaøi ñaûm nhieäm vieäc thöïc hieän caùc quaù trình chuyeån hoùa sinh hoïc quan troïng trong leân men vang. Chính vì theá, Saccharomyces cerevisiae coøn ñöôïc goïi laø “naám men vang” [58, 85, 92, 149, 166, 199]. Trình töï leân men cuûa caùc gioáng naám men trong quaù trình leân men vang Quaù trình leân men röôïu vang coù theå ñöôïc tieán haønh moät caùch töï nhieân maø khoâng caàn caáy gioáng hoaëc baèng caùch caáy vaøo dòch nho caùc naám men vang choïn loïc. Vieäc leân men dòch nho ñöôïc thöïc hieän bôûi moät heä vi sinh vaät phöùc taïp, trong ñoù caùc chuûng naám men phaùt trieån vaø cheát tuøy theo söï thích nghi cuûa chuùng ñoái vôùi moâi tröôøng. Töông taùc naám men-naám men xaûy ra trong suoát quaù trình saûn xuaát röôïu vang ngay töø khi baét ñaàu quaù trình leân men coàn. Trong quaù trình leân men töï nhieân, caùc naám men coù maët trong nho nguyeân lieäu nhö laø Kloeckera apiculata, Hansenula, Hanseniaspora uvarum, Pichia vaø Candida spp. khôûi ñaàu quaù trình leân men coàn töø dòch nho. Caùc naám men naøy cheát daàn khi haøm löôïng coàn taêng, chæ coøn laïi Saccharomyces cerevisiae coù khaû naêng chòu ñöôïc haøm löôïng coàn cao tieáp tuïc quaù trình leân men cho ñeán khi keát thuùc. Söï chuyeån bieán naøy raát quan troïng vì caùc chuûng non-Saccharomyces thöôøng taïo ra caùc hôïp chaát khoâng mong muoán nhö röôïu baäc cao, acid acetic vaø acetaldehyde. Söï bieán maát hoaëc giaûm maät ñoä cuûa gioáng non-Saccharomyces coù theå laø do khaû naêng chòu ñöïng coàn thaáp, hoaëc bò öùc cheá bôûi caùc chaát dieät men (acid beùo maïch ngaén vaø trung bình, glycoprotein,…) hoaëc do haøm löôïng oxy vaø nitrogen coøn laïi thaáp. Caùc quaù trình leân men coù kieåm soaùt thöôøng ñöôïc thöïc hieän baèng caùch caáy canh tröôøng Saccharomyces cerevisiae thuaàn khieát, nhôø ñoù quaù trình leân men dieãn ra nhanh hôn vaø coù theå taïo ra röôïu vang vôùi höông vò ñaëc tröng [25, 42, 44, 46, 48, 61, 84, 85, 89, 90, 92, 122, 139, 149, 151, 161, 163, 166]. Tuy nhieân, theo nhieàu taùc giaû thì khi coù caùc loaøi naám men non-Saccharomyces phaùt trieån trong röôïu vang vôùi moät möùc ñoä vöøa phaûi, höông vò cuûa röôïu vang seõ phong phuù hôn vaø ñöôïc öa thích nhieàu hôn so vôùi röôïu vang chæ ñöôïc leân men töø gioáng Saccharomyces [90]. Chæ tieâu choïn löïa naám men vang Ngoaøi vai troø quan troïng cuûa naám men vang laø xuùc taùc vieäc chuyeån hoùa hoaøn toaøn vaø coù hieäu quaû ñöôøng thaønh coàn maø khoâng taïo ra caùc höông vò khoâng mong muoán thì ngaøy nay, do yeâu caàu ngaøy caøng cao, canh tröôøng Saccharomyces cerevisiae caàn phaûi coù nhieàu ñaëc tính khaùc, nhö lieät keâ trong baûng 2.3 [85]. Tuy nhieân, ñeå coù theå kieåm tra heát taát caû caùc chæ tieâu naøy thì toán raát nhieàu thôøi gian. Regodon vaø coäng söï (1997) ñaõ ñöa ra moät phöông phaùp ñôn giaûn vaø hieäu quaû ñeå choïn löïa naám men vang duøng trong saûn xuaát coâng nghieäp döïa treân caùc tính chaát coâng ngheä cuûa naám men vang. Phöông phaùp naøy chæ bao goàm 2 böôùc [164]: Böôùc thöù nhaát laø böôùc choïn loïc sô boä döïa treân khaû naêng chòu ñöïng ñoái vôùi SO2, caùc loaøi coù haïi, khaû naêng phaùt trieån taïi nhieät ñoä cao vaø söï taïo boït thaáp. Böôùc thöù hai laø böôùc choïn loïc chính thöùc döïa treân haøm löôïng acid deã bay hôi vaø ethanol taïo thaønh cuõng nhö haøm löôïng ñöôøng soùt coøn laïi trong röôïu vang. Baûng 2.3: Caùc ñaëc tính mong muoán cuûa naám men vang [85] Ñaëc tính leân men Thích nghi vôùi quaù trình leân men nhanh Toác ñoä söû duïng cô chaát vaø toác ñoä hình thaønh saûn phaåm cao Khaû naêng chòu coàn cao Khaû naêng chòu aùp suaát thaåm thaáu cao Sinh khoái taïo thaønh vöøa phaûi Caùc tính chaát veà höông vò Taïo thaønh ít sulphite/DMS/thiol Taïo thaønh ít acid deã bay hôi Taïo thaønh ít röôïu baäc cao Giaûi phoùng ra caùc tieàn chaát höông glycosylate Hoaït tính esterase thaáp Ñaëc tính coâng ngheä Tính oån ñònh cao veà maët di truyeàn Khaû naêng chòu sulphite cao Ít lieân keát vôùi sulphite Ít taïo boït Coù khaû naêng keát boâng Keát laéng caën nhanh Nhu caàu nitô thaáp Caùc ñaëc tính trao ñoåi chaát coù lieân quan ñeán söùc khoûe con ngöôøi Taïo thaønh ít sulphite Taïo thaønh ít biogenic amine Taïo thaønh ít ethyl carbamate (urea) Keát hôïp caùc gioáng naám men vaø söû duïng kyõ thuaät di truyeàn trong saûn xuaát röôïu vang Theo nghieân cöùu cuûa Renouf vaø coäng söï (2006), vieäc söû duïng keát hôïp Saccharomyces cerevisiae vaø Brettanomyces bruxellensis seõ ruùt ngaén thôøi gian leân men do Brettanomyces bruxellensis coù khaû naêng chuyeån hoùa glucose vaø fructose thaønh ethanol vaø chòu ñöôïc haøm löôïng coàn cao. Coøn keát hôïp giöõa Saccharomyces cerevisiae vaø Candida stellata seõ laøm taêng haøm löôïng glycerol, taêng toác ñoä leân men vaø chaát löôïng röôïu vang [41, 42, 44, 166, 194]. Trong nhöõng naêm gaàn ñaây, kyõ thuaät di truyeàn ñaõ ñöôïc öùng duïng ñeå caûi thieän caùc ñaëc tính cuûa naám men vang: Shinohara vaø coäng söï (1994) ñaõ nghieân cöùu vieäc choïn loïc vaø lai gioáng caùc chuûng naám men vang ñeå caûi thieän toác ñoä leân men, taêng khaû naêng chòu ñöïng ñoái vôùi SO2 vaø laøm taêng chaát löôïng röôïu vang [178]. Serra vaø coäng söï (2005) ñaõ nghieân cöùu vieäc lai taïo giöõa Saccharomyces cerevisiae vaø Saccharomyces bayanus var. uvarum ñeå keát hôïp öu ñieåm cuûa 2 loaøi naøy, laøm taêng chaát löôïng saûn phaåm trong saûn xuaát röôïu vang coù haøm löôïng acid thaáp (pH cao) [175]. COÁ ÑÒNH NAÁM MEN Sô löôïc moät soá vaán ñeà veà kyõ thuaät coá ñònh teá baøo Khaùi nieäm Kyõ thuaät coá ñònh teá baøo ñöôïc ñònh nghóa laø: “Kyõ thuaät bao boïc hoaëc ñònh vò caùc teá baøo coøn nguyeân veïn leân moät “vuøng khoâng gian nhaát ñònh” nhaèm baûo veä caùc hoaït tính xuùc taùc mong muoán” (Karel vaø coäng söï, 1985) [113]. Coá ñònh thöôøng laø söï baét chöôùc caùc hieän töôïng xaûy ra trong töï nhieân do caùc teá baøo coù theå phaùt trieån treân beà maët hoaëc beân trong caùc caáu truùc cuûa nguyeân lieäu coù trong töï nhieân [113]. Caùc kyõ thuaät coá ñònh teá baøo Caùc kyõ thuaät coá ñònh teá baøo coù theå ñöôïc chia laøm 4 nhoùm chính nhö trong baûng 2.4 vaø Hình 2.5. Hình 2.5: Caùc kyõ thuaät cô baûn ñeå coá ñònh teá baøo [113] Baûng 2.4: So saùnh caùc kyõ thuaät coá ñònh teá baøo (coøn nöõa) Coá ñònh treân beà maët chaát mang raén Nhoát trong khung maïng xoáp Keo tuï teá baøo (taïo haït) Nhoát baèng phöông phaùp cô hoïc beân trong moät maøng chaén Nguyeân taéc Döïa vaøo löïc haáp phuï vaät lyù, lieân keát tónh ñieän hoaëc lieân keát coäng hoùa trò [113, 185]. Ñöa teá baøo vaøo beân trong moät maïng cöùng ñeå ngaên caûn teá baøo khueách taùn vaøo moâi tröôøng xung quanh, trong khi vaãn cho pheùp söï vaän chuyeån caùc chaát dinh döôõng vaø söï trao ñoåi chaát dieãn ra [113]. Laøm gia taêng kích thöôùc cuûa khoái teá baøo ñeå deã daøng söû duïng trong caùc bình phaûn öùng. Coù theå laø keo tuï töï nhieân hoaëc laø keo tuï nhaân taïo baèng caùch taïo thaønh caùc lieân keát ngang [113]. Phöông phaùp naøy coù theå ñöôïc thöïc hieän theo 2 caùch [113]: Söû duïng maøng membrane vi xoáp Söû duïng maøng vi bao Öu ñieåm Ñôn giaûn, deã thöïc hieän [113, 185, 189]. Khoâng aûnh höôûng ñeán quaù trình truyeàn khoái [185, 138]. Dieän tích tieáp xuùc giöõa teá baøo coá ñònh vaø chaát mang lôùn hôn so vôùi caùc kyõ thuaät khaùc [138]. Coù theå ñaït ñöôïc maät ñoä teá baøo trong moät ñôn vò theå tích chaát mang cao hôn so vôùi canh tröôøng vi sinh vaät töï do [138]. Chaát mang coù taùc duïng baûo veä teá baøo choáng laïi thöïc khuaån hoaëc teá baøo ngoaïi laïi cuõng nhö nhöõng ñieàu kieän gaây stress [138]. Ñôn giaûn, deã thöïc hieän. Khoâng aûnh höôûng ñeán quaù trình truyeàn khoái. Canh tröôøng leân men khoâng bò laãn teá baøo, do ñoù saûn phaåm taïo thaønh coù theå khoâng caàn loïc [113, 138]. Nhöôïc ñieåm Do khoâng coù maøng chaén giöõa caùc teá baøo vaø dung dòch cho neân caùc teá baøo deã bò taùch ra, laøm taêng haøm löôïng teá baøo töï do trong dung dòch [113, 40]. Khi teá baøo taêng quaù nhieàu sinh khoái seõ laøm giaûm ñoä beàn cuûa maïng gel [39]. Teá baøo treân beà maët deã thoaùt ra khoûi maïng gel vaø phaùt trieån trong moâi tröôøng nhö laø caùc teá baøo töï do [113, 39]. Do khoâng coù maøng chaén giöõa caùc teá baøo vaø dung dòch cho neân caùc teá baøo deã bò taùch ra, laøm taêng haøm löôïng teá baøo töï do trong dung dòch. Khaû naêng truyeàn khoái keùm [113]. Maøng membrane coù theå bò baùm baån do söï haáp phuï cô chaát leân beà maët maøng [113]. Baûng 2.4: So saùnh caùc kyõ thuaät coá ñònh teá baøo (tieáp theo) Coá ñònh treân beà maët chaát mang raén Nhoát trong khung maïng xoáp Keo tuï teá baøo (taïo haït) Nhoát baèng phöông phaùp cô hoïc beân trong moät maøng chaén Chaát mang Caùc vaät lieäu cellulose: DEAE-cellulose, goã, muøn cöa, muøn cöa ñaõ taùch lignine, … [113, 138] Caùc vaät lieäu voâ cô: polygorskite, montmorilonite, hydromica, söù xoáp, thuûy tinh xoáp, voøng Raschig, silicate, hôïp chaát titanium, … [113, 138] Polymer töï nhieân [113]: Polysaccharide: alginates, k-carrageenan, agar, chitosan vaø polygalacturonic acid. Polymer khaùc: gelatin, collagen vaø polyvinyl alcohol. Polymer toång hôïp: polyacrylamide, polyurethane vaø polyvinyl chloride [138]. Membrane laøm baèng vaät lieäu cellulose acetate, polyamide [138]. Caùc chaát mang coá ñònh naám men trong saûn xuaát röôïu vang Kyõ thuaät coá ñònh naám men trong saûn xuaát röôïu vang ñaõ ñöôïc nghieân cöùu raát roäng raõi, tuy nhieân vieäc öùng duïng kyõ thuaät naøy trong coâng nghieäp vaãn coøn haïn cheá. Muïc ñích cuûa vieäc söû duïng naám men coá ñònh laø ñeå caûi thieän naêng suaát sinh ethanol cuõng nhö höông vò vaø chaát löôïng saûn phaåm. Ñeå coù theå öùng duïng thaønh coâng trong coâng nghieäp, chaát mang ñöôïc söû duïng ñeå coá ñònh phaûi ñaït ñöôïc ñoä an toaøn thöïc phaåm, coù nhieàu trong töï nhieân, giaù thaønh thaáp vaø khoâng laøm aûnh höôûng ñeán tính chaát caûm quan cuûa röôïu vang [111, 113, 130, 155, 197]. Nhieàu loaïi chaát mang söû duïng ñeå coá ñònh naám men trong leân men röôïu vang ñaõ ñöôïc nghieân cöùu vaø trình baøy trong baûng 2.5. Baûng 2.5: Moät soá chaát mang söû duïng ñeå coá ñònh naám men trong saûn xuaát röôïu vang (coøn nöõa) Phaân loaïi chaát mang Moät soá chaát mang chính Vi sinh vaät Taùc giaû Taøi lieäu tham khaûo CHAÁT MANG KHOÂNG COÙ NGUOÀN GOÁC THÖÏC PHAÅM Chaát mang voâ cô g-alumina Saccharomyces cerevisiae Bakoyianis vaø coäng söï, 1997 Kourkoutas vaø coäng söï, 2003 Kourkoutas vaø coäng söï, 2006 Loukatos vaø coäng söï, 2000 14 108 105 125 Hydromica Saccharomyces cerevisiae Ageeva vaø coäng söï, 1985 5 Kissiris Saccharomyces cerevisiae Argiriou vaø coäng söï, 1996 Bakoyianis vaø coäng söï, 1992 Bakoyianis vaø coäng söï, 1997 Kourkoutas vaø coäng söï, 2003 Kourkoutas vaø coäng söï, 2006 Loukatos vaø coäng söï, 2003 11 13 14 108 105 124 Montmorilonite Saccharomyces cerevisiae Ageeva vaø coäng söï, 1985 5 Polygorskite Saccharomyces cerevisiae Ageeva vaø coäng söï, 1985 5 Thuûy tinh Saccharomyces cerevisiae Hamdy, 1990 88 Chaát mang höõu cô k-carrageenan Saccharomyces cerevisiae Goødia vaø coäng söï, 1991 Nakanishi vaø Yokotsuka, 1987 Tataridis vaø coäng söï, 2005 83 147 193 Acid pectic Saccharomyces cerevisiae Nakanishi vaø Yokotsuka, 1987 147 Baûng 2.5: Moät soá chaát mang söû duïng ñeå coá ñònh naám men trong saûn xuaát röôïu vang (tieáp theo vaø coøn nöõa) Phaân loaïi chaát mang Moät soá chaát mang chính Vi sinh vaät Taùc giaû Taøi lieäu tham khaûo Chaát mang höõu cô Agar Saccharomyces cerevisiae Nakanishi vaø Yokotsuka, 1987 147 Alginate Candida stellata Ciani vaø Ferraro, 1996 Ferraro vaø coäng söï, 2000 43 66 Alginate Saccharomyces bayanus Busova vaø coäng söï, 1994 33 Alginate Saccharomyces cerevisiae Bakoyianis vaø coäng söï, 1997 Colagrande vaø coäng söï, 1994 Ferraro vaø coäng söï, 2000 Fumi vaø coäng söï, 1987 Fumi vaø coäng söï, 1988 Fumi vaø coäng söï, 1989 Goødia vaø coäng söï, 1991 Mori, 1987 Suzzi vaø coäng söï, 1996 Silva vaø coäng söï, 2002 Shimobayashi vaø Tominaga, 1986 Tataridis vaø coäng söï, 2005 Yokotsuka vaø coäng söï, 1993 Yokotsuka vaø coäng söï, 1997 Yokotsuka vaø coäng söï, 2003 14 47 65 70 71 72 83 145 188 179 177 193 212 214 213 Alginate Schizosaccharomyces pombe Magyar vaø coäng söï, 1989 Rosini vaø Ciani, 1993 Silva vaø coäng söï, 2003 Yokotsuka vaø coäng söï, 1993 126 168 180 212 Baûng 2.5: Moät soá chaát mang söû duïng ñeå coá ñònh naám men trong saûn xuaát röôïu vang (tieáp theo vaø coøn nöõa) Phaân loaïi chaát mang Moät soá chaát mang chính Vi sinh vaät Taùc giaû Taøi lieäu tham khaûo Chaát mang höõu cô Cellulose ñöôïc bao phuû bôûi alginate Saccharomyces cerevisiae Otsuka, 1980 153 DCM (Delignified Cellulosic Material) Saccharomyces cerevisiae Bardi vaø Koutinas, 1994 Bardi vaø coäng söï, 1997 Balli vaø coäng söï, 2003 Loukatos vaø coäng söï, 2003 Mallouchos vaø coäng söï, 2003 17 20 15 124 135 DEAE-cellulose ñöôïc bao phuû bôûi lôùp nhöïa trao ñoåi ion Saccharomyces cerevisiae Lommi vaø Advenainen, 1990 121 Gelatin Saccharomyces cerevisiae Parascandola vaø coäng söï, 1992 154 Gluten Saccharomyces cerevisiae Balli vaø coäng söï, 2003 Bardi vaø coäng söï, 1996, 1997 Iconomopoulou vaø coäng söï, 2000 Loukatos vaø coäng söï, 2003 Mallouchos vaø coäng söï, 2003 15 18, 20 93 124 135 Ñóa thuûy tinh ñöôïc bao phuû bôûi lôùp maøng alginate Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Ogbonna vaø coäng söï, 1989 152 Polyvinyl alcohol Saccharomyces cerevisiae Martynenko vaø coäng söï, 2003 137 Chaát mang daïng maøng Maøng membrane Saccharomyces cerevisiae Takaya vaø coäng söï, 2002 190 Maøng vi bao sinh hoïc (biocapsule) Saccharomyces cerevisiae Peinado vaø coäng söï, 2005 Peinado vaø coäng söï, 2006 155 156 Baûng 2.5: Moät soá chaát mang söû duïng ñeå coá ñònh naám men trong saûn xuaát röôïu vang (tieáp theo) Phaân loaïi chaát mang Moät soá chaát mang chính Vi sinh vaät Taùc giaû Taøi lieäu tham khaûo CHAÁT MANG COÙ NGUOÀN GOÁC THÖÏC PHAÅM Mieáng leâ Saccharomyces cerevisiae Kourkoutas vaø coäng söï, 2005 Mallios vaø coäng söï, 2004 107 130 Mieáng moäc qua Saccharomyces cerevisiae Kourkoutas vaø coäng söï, 2002 Kourkoutas vaø coäng söï, 2003 Kourkoutas vaø coäng söï, 2005 106 111 107 Mieáng taùo Saccharomyces cerevisiae Kourkoutas vaø coäng söï, 2001 Kourkoutas vaø coäng söï, 2002 Kourkoutas vaø coäng söï, 2003 Kourkoutas vaø coäng söï, 2005 Kourkoutas vaø coäng söï, 2006 Kourkoutas vaø coäng söï, 2006 110 112 108 107 105 109 Nho khoâ Saccharomyces cerevisiae Tsakiris vaø coäng söï, 2004 Tsakiris vaø coäng söï, 2004 197 196 Voû nho Saccharomyces cerevisiae Mallouchos vaø coäng söï, 2002 Mallouchos vaø coäng söï, 2003 Mallouchos vaø coäng söï, 2003 132 131 134 Coá ñònh naám men trong gel alginate Alginate Alginate coù khaù nhieàu trong töï nhieân vaø coù theå xuaát phaùt töø 2 nguoàn goác khaùc nhau [186]: Laø thaønh phaàn caáu truùc cuûa taûo naâu bieån (Phaeophyceae), chieám ñeán 40% khoái löôïng chaát khoâ. Laø polysaccharide maøng bao trong caùc loaïi vi khuaån ñaát. Tuy nhieân taát caû caùc alginate thöông maïi hieän nay ñeàu coù nguoàn goác töø taûo. Alginate laø moät copolymer khoâng phaân nhaùnh, bao goàm caùc monomer b-D-mannuronic acid (goïi taét laø M) vaø a-L-guluronic acid (G) lieân keát vôùi nhau thoâng qua lieân keát 1,4 – glucoside. Caùc monomer naøy phaân boá trong maïch alginate theo caùc block (Hình 2.6) [116, 181, 186]: Block M: goàm caùc goác mannuronic acid noái tieáp nhau Block G: goàm caùc goác guluronic acid noái tieáp nhau Block MG: goàm caùc goác mannuronic acid vaø guluronic acid luaân phieân noái vôùi nhau. Hình 2.6: Caáu truùc cuûa alginate: (a) caùc monomer cuûa alginate, (b) chuoãi alginate, (c) söï phaân boá caùc block [186] Cô cheá taïo gel Alginate coù khaû naêng taïo gel khi keát hôïp vôùi caùc cation kim loaïi hoùa trò cao hoaëc khi phaân töû alginate bò acid hoùa. Tuy nhieân, phöông phaùp taïo gel baèng caùch acid hoùa phaân töû alginate ít ñöôïc duøng vì quy trình thöïc hieän raát phöùc taïp [186]. Alginate coù khaû naêng keát hôïp nhanh vôùi caùc cation kim loaïi hoùa trò cao ñeå taïo thaønh gel ñoàng theå. Aùi löïc cuûa alginate ñoái vôùi caùc ion hoùa trò 2 khaùc nhau giaûm theo trình töï: Pb2+ > Cu2+ > Cd2+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Co2+, Ni2+ > Zn2+ > Mn2+. Tuøy thuoäc vaøo loaïi ion lieân keát vaø loaïi alginate maø gel taïo thaønh coù tính chaát khaùc nhau. Thoâng thöôøng, ngöôøi ta thöôøng söû duïng calcium ñeå laøm ion taïo gel [144, 181]. Quaù trình taïo gel cuûa alginate theo phöông phaùp keát hôïp vôùi cation kim loaïi hoùa trò cao coù theå tieán haønh theo 2 phöông phaùp laø phöông phaùp taïo gel töø beân ngoaøi vaø phöông phaùp taïo gel töø beân trong [186]. Cô cheá taïo gel theo phöông phaùp taïo gel töø beân ngoaøi Ñaây laø phöông phaùp taïo gel phoå bieán nhaát cuûa alginate. Phöông phaùp naøy coù öu ñieåm laø taïo gel nhanh vaø thao taùc raát ñôn giaûn (Hình 2.7). Khi nhoû dung dòch alginate vaøo dung dòch coù chöùa cation coù khaû naêng taïo gel (thöôøng gaëp nhaát laø Ca2+), beà maët ngoaøi cuûa haït alginate seõ laäp töùc bò gel hoùa. Tieáp theo ñoù, caùc cation taïo gel ôû beân ngoaøi haït alginate tieáp tuïc khueách taùn vaøo beân trong haït laøm cho caùc phaân töû alginate beân trong tieáp tuïc bò gel hoùa. Quaù trình naøy xaûy ra treân beà maët haït vaø phaùt trieån vaøo beân trong. Phöông phaùp naøy taïo gel nhanh, tuy nhieân tính ñoàng theå cuûa haït gel laïi khoâng cao [100, 186, 193]. Hình 2.7: Cô cheá taïo gel cuûa alginate theo phöông phaùp taïo gel töø beân ngoaøi [186] Cô cheá taïo gel theo phöông phaùp taïo gel töø beân trong Cho caùc muoái coù chöùa caùc cation taïo gel ôû daïng voâ hoaït (Ví duï: CaCO3, CaSO4, EDTA-Ca, calcium citrate…) vaøo dung dòch alginate. Thay ñoåi pH cuûa dung dòch veà pH acid baèng caùc taùc nhaân acid hoùa (Ví duï: D-glucono-d-lactone (GDL)). Khi ñoù, do pH giaûm, maø ñoä hoøa tan cuûa caùc muoái chöùa caùc cation taïo gel nhö ôû treân laïi phuï thuoäc vaøo pH neân caùc ion Ca2+ seõ ñöôïc giaûi phoùng daàn vaø tham gia vaøo quaù trình taïo gel vôùi alginate (Hình 2.8). Phöông phaùp naøy cho haït gel coù tính ñoàng theå cao hôn haún phöông phaùp khueách taùn do caùc ion Ca2+ phaân boá ñoàng ñeàu hôn. Hôn theá nöõa, phöông phaùp naøy coøn coù theå taïo gel vôùi caùc hình daïng khaùc nhau nhö mong muoán baèng caùch cho dung dòch alginate vaøo khuoân thích hôïp tröôùc khi quaù trình taïo gel dieãn ra. Trong khi ñoù, phöông phaùp taïo gel töø beân ngoaøi thöôøng chæ taïo thaønh caùc haït coù hình caàu [67, 100, 101, 186]. Hình 2.8: Cô cheá taïo gel cuûa alginate theo phöông phaùp taïo gel töø beân trong [186] Theo Anders Johansen vaø James M. Flink (1986), khi naám men ñöôïc coá ñònh theo phöông phaùp gel töø beân trong, toác ñoä leân men cao hôn vaø ñoä beàn gel khoâng giaûm trong suoát quaù trình leân men khi so saùnh vôùi naám men ñöôïc coá ñònh theo phöông phaùp taïo gel töø beân ngoaøi [100, 101]. Öu nhöôïc ñieåm cuûa vieäc coá ñònh naám men trong gel alginate Öu ñieåm Quaù trình coá ñònh deã thöïc hieän [10, 35, 102, 103, 115, 176, 192, 194, 209]. Ñieàu kieän coá ñònh oân hoøa, khoâng phaûi xöû lyù nhieät hay xöû lyù hoùa chaát. Do ñoù, caùc teá baøo coá ñònh khoâng bò maát hoaït tính [10, 35, 102, 103, 115, 176, 209, 211]. Alginate laø chaát mang trô veà maët hoùa hoïc [176]. Alginate khoâng coù ñoäc tính, thích hôïp cho caùc saûn phaåm thöïc phaåm [10, 103, 169, 176, 192]. Ñoä xoáp cuûa maïng gel thuaän lôïi cho vieäc khueách taùn cô chaát vaø saûn phaåm [8, 27]. Gel alginate vaãn giöõ ñöôïc ñoä beàn khi nhieät ñoä leân men cao [205]. Nhöôïc ñieåm vaø caùch khaéc phuïc Ñoä beàn gel giaûm theo thôøi gian leân men do [113, 114, 115, 176, 194, 209, 211]: Caùc teá baøo naám men treân vaø gaàn beà maët coù khaû naêng sinh soâi naûy nôû chieám öu theá so vôùi caùc teá baøo naèm sau beân trong haït, do ñoù coù theå laøm phaù vôõ beà maët haït gel vaø deã daøng thoaùt ra khoûi haït gel, phaùt trieån nhanh choùng trong moâi tröôøng döôùi daïng caùc naám men töï do. Ñieàu naøy laøm caûn trôû vieäc ñaùnh giaù ñoäng hoïc phaûn öùng cuûa naám men coá ñònh, ñoàng thôøi gaây khoù khaên cho vieäc taùch naám men ra khoûi moâi tröôøng leân men. Ñeå khaéc phuïc vaán ñeà naøy coù nhieàu caùch khaùc nhau. Caùch thöù nhaát laø söû duïng kyõ thuaät taïo maøng bao. Trong phöông phaùp naøy, caùc teá baøo seõ ñöôïc nhoát beân trong moät nhaân loûng ñöôïc bao boïc bôûi moät lôùp moûng gel alginate. Do ñoù, caùc teá baøo seõ coù khoaûng khoâng nhieàu hôn ñeå phaùt trieån beân trong nhaân loûng. Vì theá, maät ñoä teá baøo ñaït ñöôïc cao hôn maø khoâng bò thoaùt baøo ra ngoaøi. Hôn theá nöõa, baèng caùch naøy coù theå söû duïng löôïng alginate ít hôn. Caùch thöù hai laø aùo naám men coá ñònh vôùi maïng polymer, coù theå thöïc hieän moät böôùc (baèng caùch söû duïng voøi ñoâi), hoaëc hai böôùc (baèng caùch taïo lôùp aùo polymer sau khi ñaõ taïo haït naám men coá ñònh). Ñaây laø phöông aùn raát khaû thi vì noù khoâng laøm aûnh höôûng ñeán toác ñoä sinh toång hôïp coàn cuõng nhö toác ñoä söû duïng cô chaát. Söï giaûi phoùng CO2 beân trong gel laøm phaù vôõ caáu truùc cuûa gel. Ñeå khaéc phuïc, coù theå laøm taêng ñoä xoáp cuûa gel alginate baèng caùch giaûm noàng ñoä alginate söû duïng, tuy nhieân ñieàu naøy laïi ñoàng nghóa vôùi vieäc laøm yeáu maïng gel. Vì theá, phaûi taêng ñoä beàn gel baèng caùch aùo caùc haït alginate xoáp naøy vôùi maøng polymer (ví duï, chitosan), khi ñoù ñoä beàn cuûa gel naøy seõ töông töï vôùi gel söû duïng noàng ñoä alginate cao. Gel Ca-alginate raát nhaïy vôùi caùc chaát taïo chelate (hôïp chaát höõu cô trong ñoù nguyeân töû taïo thaønh nhieàu hôn moät lieân keát phoái trí vôùi caùc kim loaïi trong dung dòch) nhö phosphate, citrate vaø lactate vaø caùc chaát khoâng taïo gel (non-gelling) nhö laø caùc ion sodium vaø magnesium. Söï coù maët cuûa caùc ion naøy trong dung dòch seõ laøm cho caùc haït bò phoàng ra, daãn ñeán taêng kích thöôùc caùc loã xoáp, laøm giaûm tính oån ñònh vaø phaù vôõ caáu truùc haït gel. Thoâng thöôøng ngöôøi ta thöôøng theâm vaøo moâi tröôøng leân men caùc chaát oån ñònh gel nhö laø CaCl2, celite vaø pectine vôùi moät haøm löôïng thích hôïp ñeå oån ñònh ñoä beàn gel. Hoaëc cuõng coù theå laøm cöùng gel baèng caùch söû duïng propylene glycol ester, polyethelenine (PEI) vaø caùc loaïi vaät lieäu composite (colloidal silica) [10, 102, 103, 144, 193, 194]. Khoâng beàn hoùa hoïc trong dung dòch ñieän phaân vaø dung dòch coù pH cao. Ñeå khaéc phuïc ñieàu naøy, nhieàu nghieân cöùu ñaõ ñöôïc thöïc hieän vaø coù nhieàu phöông phaùp ñöôïc ñöa ra: taïo lieân keát cuûa haït gel vôùi glutaraldehyde (Takata vaø coäng söï, 1977), vôùi polycations (Birnbaum vaø coäng söï, 1981) vaø saáy khoâ haït gel (Klein vaø Wagner, 1978; Burns vaø coäng söï, 1985). Nhöõng phöông phaùp naøy ñeàu coù theå caûi thieän ñoä beàn trong dung dòch ñieän phaân, nhöng roõ raøng laø chuùng raát phöùc taïp vaø toán nhieàu thôøi gian. Moät soá taùc giaû ñaõ ñöa ra phöông phaùp khaùc laø duøng caùc ion Ba2+ vaø Sr2+ thay cho ion Ca2+ truyeàn thoáng. Caùc ion naøy coù aùi löïc maïnh hôn ñoái vôùi alginate, vì theá haït gel barium vaø strontium alginate beàn hôn trong dung dòch ñieän phaân so vôùi haït gel calcium alginate. Tuy nhieân, caùc ion naøy vaãn khoâng ñöôïc öùng duïng roäng raõi vì ñoäc tính cuûa noù ñoái vôùi naám men vaø vôùi moâi tröôøng [144, 183, 192, 193, 194]. AÛnh höôûng cuûa thaønh phaàn alginate vaø caùc ñieàu kieän taïo gel ñeán ñoä beàn gel vaø quaù trình leân men Aûnh höôûng cuûa khoái löôïng phaân töû Anders Johansen vaø James M. Flink (1986) ñaõ nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa khoái löôïng phaân töû alginate thoâng qua caùc thí nghieäm vôùi caùc loaïi alginate coù ñoä nhôùt khaùc nhau. Keát quaû cho thaáy raèng khoái löôïng phaân töû ít coù aûnh höôûng ñeán toác ñoä leân men vaø söï taïo thaønh ethanol, maëc duø toác ñoä leân men nhìn chung giaûm khi taêng khoái löôïng phaân töû. Trong khi ñoù, ñoä beàn gel (ñöôïc ño baèng khaû naêng choáng chòu ñoái vôùi löïc neùn eùp) taêng ñaùng keå khi taêng ñoä nhôùt töø 5 ñeán 70cP (ñoä nhôùt laø ñaïi löôïng ñaëc tröng cho khoái löôïng phaân töû cuûa alginate), nhöng khi ñoä nhôùt taêng cao hôn nöõa (250 ñeán 600cP) thì ñoä beàn gel taêng raát ít [101]. Kazuaki vaø coäng söï (1995) cuõng ñaõ nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa ñoä nhôùt ñeán khaû naêng khueách taùn cuûa glucose vaø keát quaû cho thaáy raèng khaû naêng khueách taùn cuûa glucose khoâng phuï thuoäc vaøo ñoä nhôùt. Trong quaù trình xöû lyù nhieät, ñoä nhôùt cuûa alginate giaûm do giaûm möùc ñoä polymer hoùa cuûa caùc phaân töû alginate. Nhö vaäy, vieäc tieät truøng alginate khoâng aûnh höôûng baát lôïi ñeán khaû naêng khueách taùn cuûa glucose [210]. Aûnh höôûng cuûa tyû leä G/M Tyû leä G/M laø phaàn mol cuûa L-guluronic acid treân D-mannuronic acid, bieåu thò thaønh phaàn cuûa alginate. Khi tyû leä G/M giaûm thì: Toác ñoä leân men coù xu höôùng taêng, nhöng khoâng ñaùng keå [101]. Ñoä beàn gel giaûm, vì caùc ion hoùa trò 2 nhö laø calcium, barium, strontium ñöôïc öu tieân lieân keát vaøo block G hôn laø block M vaø block MG. Do ñoù alginate coù haøm löôïng G lôùn seõ taïo thaønh gel xoáp, chaéc hôn vaø vaãn giöõ ñöôïc ñoä cöùng vöõng trong moät thôøi gian daøi. Trong suoát quaù trình taïo lieân keát vôùi Ca2+, caùc loaïi alginate naøy seõ khoâng bò phoàng nôû hay co ruùt, vì theá vaãn giöõ ñöôïc hình daïng toát hôn. Theâm vaøo ñoù, alginate coù haøm löôïng G cao seõ caûn trôû söï sinh tröôûng cuûa teá baøo naám men sau khi coá ñònh. Traùi laïi, alginate coù haøm löôïng M cao taïo thaønh gel meàm vaø ít xoáp hôn vaø deã bò raõ ra hôn so vôùi caùc gel giaøu G [101, 116, 144, 173, 181, 192, 193]. Kazuaki vaø coäng söï (1995) cuõng ñaõ nghieân cöùu vaø keát luaän raèng gel alginate giaøu G thích hôïp ñeå coá ñònh naám men hôn vì gel naøy ít gaây caûn trôû ñeán khaû naêng khueách taùn cuûa glucose vaø coù ñoä beàn cô hoïc cao hôn [210]. Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä alginate Taêng noàng ñoä alginate trong khoaûng 1 – 10% laøm giaûm ñaùng keå toác ñoä leân men vaø toác ñoä sinh toång hôïp coàn do laøm giaûm söï khueách taùn nhöng laïi laøm taêng ñoä beàn gel [101, 146, 205, 210]. Theo nhieàu nhaø nghieân cöùu, noàng ñoä alginate thích hôïp ñeå coá ñònh naám men laø 2% [101, 146, 210]. Aûnh höôûng cuûa pH taïo gel Theo Kazuaki vaø coäng söï (1995), pH cuûa dung dòch alginate thích hôïp cho quaù trình taïo gel laø töø 6,0 ñeán 8,0. Naèm ngoaøi khoaûng naøy, khaû naêng khueách taùn cuûa glucose vaø ñoä beàn gel ñeàu giaûm. Ñoù laø do pH ñaõ laøm thay ñoåi hình daïng cuûa caùc phaân töû alginate [210]. Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä taïo gel Theo Kazuaki vaø coäng söï (1995), khi nhieät ñoä taïo gel döôùi 298K, khaû naêng khueách taùn cuûa glucose gaàn nhö khoâng ñoåi, nhöng khi taêng nhieät ñoä treân 300K thì khaû naêng khueách taùn cuûa glucose giaûm nhanh. Ñoä beàn gel cuõng gaàn nhö khoâng ñoåi khi nhieät ñoä taïo gel döôùi 298K, nhöng giaûm nhanh khi taêng nhieät ñoä treân 300K. Nhieät ñoä taïo gel aûnh höôûng ñeán khaû naêng khueách taùn cuûa glucose vaø ñoä beàn gel laø do nhieät ñoä ñaõ laøm thay ñoåi hình daïng cuûa phaân töû alginate. Nhö vaäy, nhieät ñoä thích hôïp cho quaù trình taïo gel laø nhieät ñoä döôùi 298K [210]. Aûnh höôûng cuûa maät ñoä teá baøo trong haït Ñeå ñaùnh giaù aûnh höôûng cuûa maät ñoä teá baøo, Anders Johansen vaø James M. Flink (1986) ñaõ tieán haønh thí nghieäm vôùi 2 maät ñoä teá baøo laø 0,5% vaø 10% (töông öùng vôùi 2.108 vaø 4.109 teá baøo/ g gel). Keát quaû cho thaáy raèng khi maät ñoä teá baøo ban ñaàu cao, toác ñoä leân men/ g haït thì cao hôn nhöng naêng suaát/ teá baøo thì thaáp hôn so vôùi maät ñoä teá baøo ban ñaàu thaáp. Ñoù laø do söï coù maët cuûa lôùp beà maët teá baøo hoaït hoùa ngay saùt beà maët haït gel, töông töï nhö vôùi nghieân cöùu cuûa Wada vaø coäng söï (1979) ñoái vôùi caùc haït k- carrageenan. Lôùp teá baøo naøy laøm ngaên caûn söï khueách taùn cuûa cô chaát vaø/ hoaëc saûn phaåm xuyeân qua maïng gel, vaø do ñoù caùc teá baøo beân trong gaàn nhö bò baát hoaït. Trong tröôøng hôïp naøy, naêng suaát/ teá baøo thaáp khi maät ñoä teá baøo cao ñoù laø do caùc teá baøo naèm ôû beân döôùi lôùp beà maët cuõng ñöôïc tính vaøo maät ñoä teá baøo nhöng khoâng tham gia vaøo quaù trình taïo thaønh saûn phaåm [101]. Aûnh höôûng cuûa tyû leä S/V Dieän tích beà maët rieâng (dieän tích beà maët/ theå tích) laø moät yeáu toá quan troïng ñoái vôùi naêng suaát leân men/g haït, khi tyû leä S/V caøng cao thì naêng suaát caøng cao. Ñoái vôùi moät tyû leä S/V nhaát ñònh, hình daïng gel khoâng aûnh höôûng ñeán toác ñoä leân men [101]. Moät soá tính chaát cuûa naám men coá ñònh Nhöõng söï thay ñoåi veà sinh tröôûng, hình thaùi cuûa teá baøo naám men khi coá ñònh treân chaát mang Nhö chuùng ta ñaõ bieát, quaù trình sinh tröôûng cuûa vi sinh vaät noùi chung vaø naám men noùi rieâng phuï thuoäc raát nhieàu vaøo ñieàu kieän moâi tröôøng quanh noù. Khi coá ñònh teá baøo, do söï töông taùc giöõa teá baøo – chaát mang vaø giöõa caùc teá baøo vôùi nhau maø khaû naêng sinh tröôûng vaø hình thaùi cuûa teá baøo cuõng coù moät vaøi bieán ñoåi [73]. Theo moät soá taùc giaû, khaû naêng sinh tröôûng cuûa naám men coá ñònh keùm hôn so vôùi naám men töï do: Banyopadhyay vaø coäng söï (1982) ñaõ tieán haønh nghieân cöùu khaûo saùt quaù trình sinh tröôûng cuûa naám men coá ñònh treân thuûy tinh xoáp (Controled pore glass) baèng phöông phaùp haáp phuï. Khaû naêng sinh tröôûng cuûa naám men töï do vaø coá ñònh ñöôïc ñaùnh giaù giaùn tieáp thoâng qua toác ñoä haáp thu O2 vaø toác ñoä sinh CO2. Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy naám men coá ñònh coù hieän töôïng giaûm khaû naêng haáp thu O2 vaø sinh CO2 so vôùi naám men töï do [16]. Doran vaø coäng söï (1985) cuõng tieán haønh khaûo saùt quaù trình sinh tröôûng cuûa naám men Saccharomyces cerevisiae coá ñònh treân gelatin. Keát quaû thöïc nghieäm thu ñöôïc töông töï nhö keát quaû cuûa Bandyopadhyay vaø coäng söï (1982). Ngoaøi ra taùc giaû coøn nhaän thaáy raèng toác ñoä sinh tröôûng vaø tyû leä naûy choài cuûa naám men coá ñònh treân gelatin ñeàu thaáp hôn so vôùi naám men töï do [56]. Nguyeân nhaân cuûa hieän töôïng naøy laø do: Heä leân men söû duïng naám men coá ñònh laø moät heä phaûn öùng dò theå, trong ñoù, caùc chaát dinh döôõng coù xu höôùng taäp trung treân beà maët chaát mang, vì vaäy naám men haáp phuï treân beà maët chaát mang coù ñieàu kieän tieáp xuùc vôùi noàng ñoä chaát dinh döôõng cao hôn so vôùi trong moâi tröôøng ñoàng theå. Chính söï thay ñoåi aùp löïc thaåm thaáu moät caùch ñoät ngoät gaây maát caân baèng trao ñoåi chaát qua maøng teá baøo, laøm aûnh höôûng ñeán quaù trình hoâ haáp cuûa teá baøo [16]. Choài coù theå ñöôïc hình thaønh ôû baát kyø vò trí naøo treân beà maët teá baøo naám men Saccharomyces cerevisiae, tuy nhieân phoå bieán nhaát laø choài seõ moïc ôû caùc cöïc ellipsoide cuûa teá baøo naám men löôõng boäi. Vì vaäy khi 1 cöïc cuûa teá baøo naám men gaén vaøo chaát mang seõ voâ tình laøm maát ñi söï hình thaønh cuûa moät choài môùi [56]. Nhieàu nghieân cöùu cuõng cho thaáy raèng naám men coá ñònh luoân sinh tröôûng ñaït ñeán moät soá löôïng teá baøo khoâng ñoåi vaø giöõ nguyeân nhö vaäy cho ñeán khi keát thuùc quaù trình leân men: Wada vaø coäng söï (1980) nhaän thaáy raèng naám men coá ñònh sinh tröôûng vaø giöõ oån ñònh ôû khoaûng 5,4.109 teá baøo/mL gel [201]. Melzoch vaø coäng söï (1994) ñaõ nghieân cöùu söï phaùt trieån vaø hình thaùi cuûa naám men coá ñònh trong gel Ca-alginate. Caùc teá baøo naám men coá ñònh sau khi ñöôïc hoaït hoùa, neáu ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng giaøu chaát dinh döôõng, soá löôïng teá baøo seõ taêng leân raát nhanh (khoaûng 1010 teá baøo/mL gel) vaø sau ñoù haàu nhö giöõ nguyeân khoâng ñoåi [142]. Beân caïnh ñoù, Melzoch vaø coäng söï cuõng thaáy raèng 80% teá baøo coá ñònh trong gel alginate ñeàu duy trì hoaït tính trao ñoåi chaát vaø khaû naêng phaùt trieån khi nuoâi caáy trong thôøi gian daøi. Saccharomyces cerevisiae coá ñònh trong gel alginate coù theå duy trì khaû naêng söû duïng ñöôøng cuûa chuùng ôû möùc ñoä töông ñoái cao vaø oån ñònh, chæ giaûm khoaûng 20% sau 1122 giôø nuoâi caáy [142]. Hình thaùi cuûa naám men coá ñònh cuõng thay ñoåi nhieàu so vôùi naám men töï do: Banyopadhyay vaø coäng söï (1982) giaû thuyeát raèng chính söï maát caân baèng veà trao ñoåi chaát laøm cho caùc choài cuûa naám men sau khi moïc thaønh nhanh choùng bò taùch ra khoûi teá baøo meï, laøm cho hình thaùi teá baøo naám men bò thay ñoåi [16]. Melzoch vaø coäng söï (1994) khaûo saùt söï thay ñoåi hình thaùi cuûa teá baøo naám men coá ñònh trong gel ñöôïc tieán haønh baèng caùch quan saùt döôùi kính hieån vi ñieän töû. Keát quaû khaûo saùt cho thaáy teá baøo naám men coá ñònh coù hình daïng vaø kích thöôùc khoâng ñoàng ñeàu. Ñieàu ñoù cho thaáy söï phaùt trieån cuûa caùc teá baøo bò nhoát trong haït gel phuï thuoäc vaøo ñoä xoáp vaø caáu truùc cuûa maïng gel cuõng nhö khaû naêng chieám choã troáng trong haït gel cuûa teá baøo naám men. Trong chaát mang, caùc teá baøo naám men coù xu höôùng keát tuï laïi vôùi nhau [142]. Nhöõng thay ñoåi veà hoaït ñoäng trao ñoåi chaát cuûa teá baøo naám men khi coá ñònh treân chaát mang Nhieàu nghieân cöùu cuûa caùc taùc giaû cho thaáy raèng naám men coá ñònh coù toác ñoä söû duïng glucose, toác ñoä sinh toång hôïp ethanol vaø glycerol cao hôn nhieàu so vôùi naám men töï do maëc duø dieän tích beà maët teá baøo cuûa naám men coá ñònh duøng ñeå vaän chuyeån chaát dinh döôõng nhoû hôn so vôùi cuûa naám men töï do (baûng 2.6) [15, 43, 52, 56, 73, 74, 75, 131, 138, 154, 193]. Glazzo vaø Bailey (1990) giaûi thích laø do quaù trình coá ñònh laøm thay ñoåi söï vaän chuyeån proton qua maøng teá baøo naám men (Theå hieän qua giaù trò pH noäi baøo cuûa naám men coá ñònh hôi thaáp hôn moät chuùt so vôùi giaù trò pH noäi baøo cuûa naám men töï do: giaù trò pH noäi baøo cuûa naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong gel alginate laàn löôït laø 6,9 vaø 6,8). Ñeå duy trì oån ñònh pH noäi baøo, naám men phaûi taêng toác ñoä söû duïng ATP. Nhö chuùng ta ñaõ bieát, quaù trình sinh toång hôïp ethanol bò haïn cheá khi coù söï coù maët cuûa ATP. Chính vì vaäy, ôû naám men coá ñònh, quaù trình söû duïng ATP taêng laøm giaûm söï coù maët cuûa ATP trong teá baøo, keát quaû daãn ñeán toác ñoä sinh toång hôïp ethanol ôû teá baøo naám men coá ñònh taêng voït [74]. Theâm vaøo ñoù, Galazzo vaø coäng söï (1987) cho raèng pH noäi baøo cuûa teá baøo coá ñònh thaáp hôn so vôùi teá baøo töï do, do ñoù laøm taêng toác ñoä cuûa caùc phaûn öùng xuùc taùc bôûi phosphofructokinase vaø hexokinase. Vì theá laøm taêng toác ñoä leân men [75]. Ngoaøi ra, nguyeân nhaân coøn coù theå laø do naám men coá ñònh ñaõ coù nhöõng thay ñoåi trong thaønh phaàn teá baøo: Thay ñoåi thaønh phaàn lipid cuûa maøng membrane [96, 138]. Thay ñoåi haøm löôïng caùc chaát trao ñoåi trung gian nhö laø fructose-1,6-diphosphate, glucsoe-6-phosphate vaø 3-phosphoglycerate [73]. Haøm löôïng polysaccharide taïo caáu truùc (glycogen, mannan, glucan, trehalose), chaát döï tröõ glycogen, DNA, vaø RNA cao hôn so vôùi teá baøo töï do [38, 71, 73, 96, 113, 138, 150, 193]. Baûng 2.6: Toác ñoä söû duïng cô chaát vaø hình thaønh saûn phaåm cuûa naám men coá ñònh trong gel alginate vaø naám men töï do [74] Naám men töï do (mmol/ L/ ph) Naám men coá ñònh (mmol/ L/ ph) Toác ñoä söû duïng glucose Toác ñoä sinh toång hôïp ethanol Toác ñoä sinh toång hôïp glycerol 21,1 37,1 3,5 42,7 70,0 6,9 Cuõng gioáng nhö khi nuoâi caáy treân moâi tröôøng toång hôïp, naám men coá ñònh khi nuoâi caáy trong moâi tröôøng dòch nho eùp trong leân men röôïu vang cuõng cho keát quaû töông töï. Keát quaû nghieân cöùu cuûa Bakoyianis vaø coäng söï (1997) veà quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men coá ñònh treân g-alumina, kissiris vaø alginate cho thaáy naám men coá ñònh coù toác ñoä söû duïng ñöôøng cuõng nhö toác ñoä sinh toång hôïp ethanol cao hôn haún naám men töï do. Keát quaû nghieân cöùu cuõng cho thaáy khi nhieät ñoä giaûm, hoaït ñoäng trao ñoåi chaát cuûa naám men cuõng giaûm. Tuy nhieân, ôû baát kyø tröôøng hôïp naøo, hoaït ñoäng trao ñoåi chaát cuûa naám men coá ñònh cuõng cao hôn naám men töï do [14]. Nhöõng thay ñoåi veà khaû naêng choáng laïi caùc yeáu toá baát lôïi trong moâi tröôøng cuûa teá baøo naám men coá ñònh Löôïng cô chaát caøng cao hoaëc löôïng saûn phaåm caøng cao thì caøng öùc cheá hoaït ñoäng soáng cuûa teá baøo naám men. Tuy nhieân, so vôùi naám men töï do thì naám men coá ñònh coù khaû naêng chòu ñöôïc söï öùc cheá cô chaát vaø saûn phaåm cao hôn: Desimone vaø coäng söï (2002) ñaõ cho naám men tieáp xuùc vôùi ethanol noàng ñoä 80% (v/v) trong nhieàu khoaûng thôøi gian khaùc nhau. Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy khaû naêng soáng soùt cuûa naám men coá ñònh cao hôn raát nhieàu so vôùi naám men töï do. Sau 5 phuùt tieáp xuùc vôùi ethanol, naám men töï do bò tieâu dieät hoaøn toaøn, trong khi soá löôïng naám men coá ñònh vaãn töông ñöông vôùi thôøi ñieåm ban ñaàu [53]. Nghieân cöùu cuûa Krisch vaø Szajaùni (1997) cho thaáy raèng haøm löôïng glucose treân 16% (v/v) thì coù aûnh höôûng ñoäc ñoái vôùi caùc teá baøo naám men töï do. Khi noàng ñoä coàn ñaït 20% thì naám men töï do khoâng coøn toàn taïi. Caùc teá baøo naám men ñöôïc nhoát trong gel alginate vaø haáp phuï treân cellulose thì coù khaû naêng soáng soùt cao hôn nhieàu so vôùi naám men töï do, laàn löôït laø 72 vaø 62% [117]. Holcberg vaø Margalith (1981) cho raèng haøm löôïng glucose 40 vaø 50%w/w seõ öùc cheá teá baøo töï do, laøm cho quaù trình leân men haàu nhö khoâng xaûy ra, trong khi ñoù teá baøo coá ñònh vaãn coù theå leân men maëc duø toác ñoä chaäm [91]. Hieän töôïng naøy coù theå ñöôïc giaûi thích nhö sau: Söï coù maët cuûa chaát mang ñaõ baûo veä teá baøo khoûi aûnh höôûng cuûa haøm löôïng coàn cao vaø aûnh höôûng cuûa aùp suaát thaåm thaáu cao do ñöôøng gaây ra [12, 113, 117, 133, 150, 206]. Naám men coá ñònh taïo thaønh glycerol nhieàu hôn. Glycerol coù taùc duïng laøm caân baèng theá oxy hoùa khöû noäi baøo cuûa naám men hoaëc söï caân baèng NAD+/NADH vaø hoaït ñoäng nhö laø moät chaát ñieàu chænh aùp suaát thaåm thaáu ñoái vôùi aùp löïc thaåm thaáu cao cuûa ñöôøng trong suoát quaù trình leân men. Nhieàu taùc giaû cuõng cho raèng khi haøm löôïng ñöôøng caøng taêng thì löôïng glycerol taïo thaønh cuõng taêng [15, 43, 52, 60]. Naám men coá ñònh chöùa löôïng acid beùo no cao hôn so vôùi naám men töï do, neân laøm taêng khaû naêng chòu noàng ñoä coàn cao. Möùc ñoä no cuûa acid beùo caøng taêng seõ laøm taêng khaû naêng chòu ñöïng ñoái vôùi ethanol. Agudo (1992) cuõng nhaän thaáy raèng caùc gioáng Saccharomyces chòu coàn coù chæ soá khoâng no thaáp hôn so vôùi caùc chuûng ít chòu coàn [53, 117, 150]. Naám men coá ñònh coù söï thay ñoåi veà khaû naêng vaän chuyeån caùc chaát qua maøng, do ñoù laøm taêng khaû naêng giaûi phoùng ethanol noäi baøo ra ngoaøi moâi tröôøng. Nagodawithana vaø Steinkraus (1976) cho raèng khaû naêng chòu coàn tuøy thuoäc vaøo khaû naêng teá baøo giaûi phoùng ethanol noäi baøo ra ngoaøi moâi tröôøng [150, 163, 206]. Coù hoaït tính enzyme ADH (laø enzyme xuùc taùc phaûn öùng chuyeån hoùa acetaldehyde thaønh ethanol) cao hôn [59]. Ngoaøi ra, theo Ladato vaø coäng söï (1999), naám men coá ñònh trong caùc vaät lieäu khaùc nhau ñeàu taêng khaû naêng soáng soùt vaø khaû naêng chòu nhieät trong ñieàu kieän baûo quaûn ñoâng vaø ñoâng khoâ so vôùi naám men töï do [113]. Khaû naêng sinh toång hôïp saûn phaåm phuï taïo höông vò cho röôïu vang cuûa naám men coá ñònh Trong quaù trình leân men röôïu vang, khaû naêng sinh toång hôïp saûn phaåm phuï taïo höông vò cho röôïu vang cuûa naám men ñöôïc coi laø moät trong nhöõng tính chaát quan troïng nhaát. Caùc chaát taïo höông vò cho saûn phaåm röôïu vang laø moät toå hôïp bao goàm raát nhieàu chaát thuoäc hoï ester, aldehyde, ketone, röôïu cao phaân töû, acid beùo vaø caùc hôïp chaát coù chöùa löu huyønh …. Caùc chaát naøy ñöôïc hình thaønh trong quaù trình trao ñoåi chaát cuûa naám men (Hình 2.9), ñaëc bieät laø töø caùc quaù trình trao ñoåi acid amine, vaø noù ñaëc tröng cho töøng loaïi röôïu vang khaùc nhau. Trong ñoù, röôïu cao phaân töû vaø ester laø thaønh phaàn chieám phaàn lôùn khoái löôïng cuûa caùc saûn phaåm phuï [28, 113, 131, 135]. Ethyl ester cuûa caùc acid beùo cuõng nhö ethyl ester cuûa röôïu ñoùng vai troø quan troïng trong vieäc taïo ra höông thôm ñaëc tröng saûn phaåm röôïu vang. Ngöôïc laïi, röôïu cao phaân töû vaø acetaldehyde laïi ñöôïc coi laø caùc yeáu toá gaây aûnh höôûng khoâng toát ñeán muøi vò cuûa saûn phaåm [28, 113, 131, 135, 139]. Hình 2.9: Con ñöôøng hình thaønh caùc chaát taïo höông vò cho röôïu vang [85] Quaù trình sinh toång hôïp caùc chaát deã bay hôi taïo höông vò cho röôïu vang bò aûnh höôûng bôûi raát nhieàu yeáu toá nhö chuûng naám men, loaïi nho nguyeân lieäu, ñieàu kieän leân men…. Quaù trình leân men seõ laøm taêng theâm höông vò cho röôïu vang baèng caùch thuùc ñaåy quaù trình trích ly caùc hôïp chaát töø caùc chaát raén coù trong dòch nho, bieán ñoåi moät vaøi hôïp chaát coù trong nho vaø taïo ra moät löôïng ñaùng keå caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát cuûa naám men. Raát nhieàu nghieân cöùu cho thaáy vieäc söû duïng naám men coá ñònh trong leân men röôïu vang khoâng nhöõng giuùp laøm taêng naêng suaát leân men maø noù coøn giuùp laøm taêng chaát löôïng cuûa röôïu vang thaønh phaåm. Chính söï coù maët cuûa chaát mang ñaõ laøm thay ñoåi moät soá ñaëc ñieåm veà sinh lyù vaø sinh hoùa cuûa naám men theo höôùng tích cöïc trong suoát quaù trình leân men vaø gaây aûnh höôûng tröïc tieáp ñeán quaù trình sinh toång hôïp saûn phaåm phuï [28, 131, 132, 133, 134, 135, 193]. Nhìn chung, so vôùi naám men töï do thì naám men coá ñònh: Taïo thaønh nhieàu ester hôn. Do vieäc coá ñònh caùc teá baøo naám men coù theå laøm thay ñoåi hoaït ñoäng cuûa caùc enzyme acetyl-transferase theo höôùng tích cöïc hôn, do ñoù laøm taêng quaù trình toång hôïp ester [20, 56, 113, 131, 133, 135, 193, 208]. Taïo thaønh ít diacetyl hôn [113]. Taïo thaønh ít acetaldehyde hôn [193, 196, 208]. Taïo thaønh ít methanol hôn [196, 208]. Taïo thaønh ít acid deã bay hôi hôn [18, 196]. Taïo thaønh röôïu baäc cao ít hôn khi leân men ôû nhieät ñoä thaáp [20, 193]. Beân caïnh ñoù, nhieàu nghieân cöùu laïi cho thaáy loaïi chaát mang duøng ñeå coá ñònh naám men cuõng coù aûnh höôûng ñeán khaû naêng sinh toång hôïp caùc hôïp chaát deã bay hôi (Mallouchos vaø coäng söï, 2003; Kourkoutas vaø coäng söï, 2005; Bardi vaø coäng söï, 1997…). Nguyeân nhaân coù söï khaùc bieät laø do caáu truùc cuûa chaát mang seõ gaây aûnh höôûng khaùc nhau ñeán quaù trình trao ñoåi chaát cuûa naám men. Nghieân cöùu cuûa Mallouchos vaø coäng söï (2003) veà quaù trình leân men röôïu vang söû duïng naám men coá ñònh treân DCM vaø gluten cho thaáy loaïi chaát mang coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán quaù trình sinh toång hôïp caùc saûn phaåm phuï trong quaù trình leân men röôïu vang. Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy naám men coá ñònh treân DCM coù khaû naêng sinh toång hôïp caùc hôïp chaát ester cao hôn haún naám men coá ñònh treân gluten. Beân caïnh ñoù, naám men coá ñònh treân DCM laïi cho khaû naêng sinh toång hôïp röôïu cao phaân töû nhoû hôn vaø khaû naêng sinh acid lôùn hôn naám men coá ñònh treân gluten [135]. Keát quaû nghieân cöùu cuûa caùc taùc giaû khaùc cuõng cho thaáy loaïi chaát mang cuõng coù aûnh höôûng ñeán khaû naêng sinh saûn phaåm phuï cuûa naám men [107, 113]. Keát quaû nghieân cöùu ñöôïc trình baøy trong baûng 2.7. Baûng 2.7: Caùc hôïp chaát höông chính cuûa röôïu vang taïo bôûi naám men coá ñònh vaø naám men töï do trong khoaûng nhieät ñoä 15 – 20oC [113] Chaát mang coá ñònh Ethyl acetate (mg/L) Amyl alcohols (mg/L) Acetaldehyde (mg/L) Propanol – 1 (mg/L) Isobutyl alcohol (mg/L) Methanol (mg/L) Teá baøo töï do DCM Gluten Mieáng taùo Mieáng moäc qua Kissiris g-alumina Alginate 50 – 80 100 – 115 60 – 170 50 – 120 40 – 100 80 – 140 70 – 110 90 - 130 130 – 160 120 – 150 210 – 360 180 – 300 150 – 290 120 – 150 90 – 130 120 - 140 20 – 25 25 – 30 35 – 80 5 – 40 10 – 30 15 – 30 15 – 50 5 – 20 35 – 50 30 – 40 25 – 60 5 – 20 10 – 25 35 – 50 25 – 40 30 - 40 20 – 35 20 – 30 30 – 50 15 – 30 10 – 25 20 – 30 15 – 25 20 - 50 75 – 90 75 – 95 30 – 90 10 – 90 10 – 40 75 – 110 60 – 105 65 - 100 Khi nghieân cöùu veà quaù trình leân men röôïu vang traéng söû duïng naám men coá ñònh, Yajima vaø coäng söï (2001) thaáy raèng khoâng phaûi chæ coù loaïi chaát mang môùi aûnh höôûng ñeán khaû naêng sinh toång hôïp caùc hôïp chaát deã bay hôi cuûa naám men maø ngay caû khi coá ñònh treân cuøng moät loaïi chaát mang, phöông phaùp coá ñònh khaùc nhau cuõng aûnh höôûng raát nhieàu ñeán quaù trình sinh toång hôïp caùc saûn phaåm phuï. Trong nghieân cöùu naøy, taùc giaû khaûo saùt quaù trình leân men röôïu vang töø 4 loaïi naám men coá ñònh khaùc nhau (naám men coá ñònh trong haït gel alginate 2 lôùp, haït gel alginate 1 lôùp, sôïi alginate 2 lôùp vaø sôïi alginate 1 lôùp) vaø naám men töï do. Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy haøm löôïng caùc chaát taïo höông vò khoâng mong muoán cho saûn phaåm nhö methanol, acetaldehyde vaø caùc röôïu cao phaân töû (n-propyl alcohol, isobutyl alcohol vaø isoamyl alcohol) raát khaùc nhau trong saûn phaåm leân men töø caùc loaïi naám men coá ñònh khaùc nhau vaø naám men töï do. Taùc giaû giaû thuyeát raèng chính möùc ñoä chaët cheõ trong caáu truùc cuûa naám men coá ñònh gaây aûnh höôûng ñeán khaû naêng sinh toång hôïp caùc hôïp chaát taïo höông vò cuûa naám men. Cuøng coá ñònh treân gel alginate nhöng möùc ñoä chaët cheõ cuûa haït naám men coá ñònh caøng lôùn, quaù trình sinh toång hôïp saûn phaåm phuï cuûa naám men caøng ñi theo chieàu höôùng tích cöïc hôn (möùc ñoä chaët cheõ veà caáu truùc trong tröôøng hôïp naøy ñöôïc xeáp theo thöù töï sau: haït gel alginate 2 lôùp/ sôïi alginate 2 lôùp > haït alginate 1 lôùp/ sôïi alginate 1 lôùp > naám men töï do). Keát quaû thí nghieäm ñöôïc trình baøy trong baûng 2.8 [208]. Baûng 2.8: Thaønh phaàn cuûa röôïu vang traéng leân men baèng 4 loaïi naám men coá ñònh trong gel alginate vaø naám men töï do [208] Naám men coá ñònh trong Töï do Haït 2 lôùp Haït 1 lôùp Sôïi 2 lôùp Sôïi 1 lôùp Ethanol (%v/v) Ñöôøng khöû (% theo glucose) pH Acid toång (% theo acid tartaric) Ethyl acetate (mg/L) Methyl alcohol (mg/L) Acetaldehyde (mg/L) Röôïu cao phaân töø (mg/L) n-Propyl alcohol Isobutyl alcohol Isoamyl alcohol 12,8 0,11 3,05 0,74 52,8 15,2 25,6 16,5 29,4 185,4 12,6 0,10 3,02 0,73 53,5 17,6 24,2 17,0 29,9 180,7 12,8 0,12 3,05 0,76 51,4 20,3 30,4 18,9 34,7 212,0 12,9 0,11 3,06 0,72 48,7 18,4 29,0 15,0 32,0 197,8 12,7 0,19 3,01 0,77 44,3 25,6 42,5 14,3 26,4 223,1 AÛNH HÖÔÛNG CUÛA CAÙC YEÁU TOÁ COÂNG NGHEÄ ÑEÁN ÑOÄNG HOÏC QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN RÖÔÏU VANG AÛnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng Dòch nho ñeå leân men röôïu vang thöôøng chöùa 16 – 26% (w/v) ñöôøng. Quaù trình leân men dòch nho coù haøm löôïng ñöôøng cao ñöôïc öùng duïng trong coâng nghieäp khi söû duïng nho khoâ, nho thu hoaïch treã, hoaëc trong coâng nghieäp cheá bieán söû duïng dòch nho coâ ñaëc. Söû duïng dòch nho coù haøm löôïng ñöôøng cao raát deã xaûy ra hieän töôïng keùo daøi thôøi gian leân men hoaëc quùa trình leân men keát thuùc khi haøm löôïng ñöôøng soùt coøn raát cao do aùp suaát thaåm thaáu cao vaø ñoäc tính cuûa ethanol ñoái vôùi naám men. Hôn theá nöõa, khi dòch nho bò ñình chæ leân men sôùm thì röôïu vang seõ coù chaát löôïng thaáp do taïo ra nhieàu acid deã bay hôi vaø caùc vi sinh vaät gaây haïi raát deã phaùt trieån [129]. Tuy nhieân, söû duïng naám men coá ñònh coù theå khaéc phuïc ñöôïc nhöõng nhöôïc ñieåm naøy. Ñeå khaûo saùt ñoäng hoïc cuûa quaù trình taïo thaønh ethanol bôûi teá baøo Zymomonas mobilis coá ñònh treân gel calcium alginate, Bajpai vaø Margaritis (1984) ñaõ thay ñoåi haøm löôïng D-glucose ban ñaàu trong moâi tröôøng trong khoaûng 5 – 30%. Keát quaû cho thaáy raèng haøm löôïng ethanol taêng lieân tuïc theo thôøi gian leân men vaø ñaït ñeán giaù trò cöïc ñaïi sau 8, 10, 12, 48, 64 vaø 68h leân men töông öùng vôùi haøm löôïng D-glucose trong moâi tröôøng laàn löôït laø 51, 21, 136, 204, 251 vaø 297g/L (Hình 2.10). Haøm löôïng ethanol cöïc ñaïi cuõng taêng lieân tuïc töø 24,3 ñeán 126,3g/L khi taêng noàng ñoä cô chaát töø 51 ñeán 297g/L. Khi noàng ñoä cô chaát ban ñaàu taêng töø 51 ñeán 136g/L thì toác ñoä taïo thaønh ethanol cuõng taêng (Hình 2.11). Tuy nhieân, khi noàng ñoä cô chaát ban ñaàu taêng cao hôn nöõa thì toác ñoä taïo thaønh ethanol baét ñaàu giaûm vaø ñaït ñeán giaù trò thaáp nhaát khi moâi tröôøng chöùa 297g/L D-glucose. Khi moâi tröôøng chöùa haøm löôïng D-glucose nhoû hôn 251g/L thì haàu nhö taát caû löôïng D-glucose ñeàu ñöôïc söû duïng heát. Nhöng khi haøm löôïng D-glucose trong moâi tröôøng taêng leân ñeán 297g/L thì haøm löôïng D-glucose coøn soùt laïi trong moâi tröôøng vaãn coøn nhieàu, ngay caû sau 100h leân men (Hình 2.12) [12]. Hình 2.10: Haøm löôïng ethanol (P) thay ñoåi theo thôøi gian öùng vôùi caùc noàng ñoä cô chaát khaùc nhau. Haøm löôïng glucose ban ñaàu (g/L): o, 51; š, 103; D, 136; ·, 204; n, 251; p, 297 [12] Hình 2.11: Toác ñoä söû duïng glucose cöïc ñaïi (dS/st) (š) vaø toác ñoä taïo thaønh ethanol cöïc ñaïi (dP/dt) (o) khi haøm löôïng ñöôøng thay ñoåi [12] Khi phaân tích haøm löôïng teá baøo thoaùt ra, Bajpai vaø Margaritis cuõng nhaän thaáy raèng haøm löôïng teá baøo töï do trong moâi tröôøng taêng lieân tuïc trong suoát thôøi gian leân men vaø haøm löôïng cöïc ñaïi cuõng taêng töø 0,2 ñeán 0,33g chaát khoâ/L khi haøm löôïng D-glucose ban ñaàu trong moâi tröôøng taêng töø 51 ñeán 297g/L [12]. Ñeå nghieân cöùu khaû naêng leân men coàn cuûa naám men coá ñònh ôû nhöõng haøm löôïng ñöôøng khaùc nhau, Holcberg vaø Margalith (1981) ñaõ coá ñònh naám men Saccharomyces cerevisiae trong gel agar roài tieán haønh leân men vôùi haøm löôïng glucose thay ñoåi töø 10 ñeán 50%w/w (Hình 2.13 vaø Hình 2.14). Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy raèng haøm löôïng glucose 40 vaø 50% seõ öùc cheá naám men töï do, laøm cho quaù trình leân men xaûy ra raát chaäm hoaëc khoâng coù söï leân men; trong khi ñoù naám men coá ñònh vaãn coù theå leân men maëc duø toác ñoä chaäm. ÔÛ haøm löôïng glucose 30% söï öùc cheá leân men ít hôn, trong khi ôû 20 vaø 10%, leân men coàn ñaït ñeán toác ñoä cao nhaát. Tuy nhieân, naám men töï do vaãn leân men ôû toác ñoä nhoû hôn ñaùng keå so vôùi naám men coá ñònh, ngoaïi tröø ôû haøm löôïng ñöôøng thaáp 10% [91]. Hình 2.12: Söï thay ñoåi haøm löôïng ñöôøng theo thôøi gian. Haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu (g/L): o, 51; š, 103; D, 136; ·, 204; n, 251; p, 297 [12] Hình 2.13: Söï söû duïng glucose trong suoát quaù trình leân men. -o o- naám men töï do; -·-·- naám men coá ñònh trong gel agar [91] Hình 2.14: Khaû naêng taïo coàn cuûa naám men trong suoát quaù trình leân men. -o o- naám men töï do; -·-·- naám men coá ñònh trong gel agar [91] Khi nghieân cöùu khaû naêng öùng duïng trong coâng nghieäp cuûa naám men coá ñònh trong saûn xuaát röôïu vang, Iconomopoulou vaø coäng söï (2002) ñaõ ñeà xuaát söû duïng teá baøo coá ñònh saáy thaêng hoa (freeze-dried gluten supported biocatalyst – FGB) thay theá cho teá baøo töï do saáy thaêng hoa (free freeze-dried cells – ffdc) vaø caùc phöông phaùp leân men truyeàn thoáng. Caùc teá baøo coá ñònh saáy thaêng hoa seõ giuùp caûi thieän toác ñoä leân men vaø chaát löôïng röôïu vang. Iconomopoulou vaø coäng söï ñaõ khaûo saùt aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng (136, 170, 204, 238, 272 vaø 306g/L) ñeán quaù trình leân men röôïu vang khi söû duïng teá baøo coá ñònh saáy thaêng hoa, teá baøo töï do saáy thaêng hoa vaø teá baøo coá ñònh chöa qua saáy (wet gluten supported biocatalyst – WGB). Keát quaû khaûo saùt cho thaáy raèng thôøi gian ñeå leân men dòch nho baèng FGB thì ngaén hôn vaø naêng suaát taïo coàn cuõng cao hôn so vôùi ffdc (baûng 2.9). Maëc duø thôøi gian leân men cuûa WGB laø ngaén nhaát vaø naêng suaát taïo coàn laø cao nhaát nhöng khaû naêng öùng duïng trong coâng nghieäp thì raát haïn cheá [93]. Baûng 2.9: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu ñeán ñoäng hoïc quaù trình leân men trong quaù trình leân men tónh röôïu vang ôû 30oC bôûi teá baøo coá ñònh saáy thaêng hoa (freeze-dried gluten supported biocatalyst – FGB), teá baøo töï do saáy thaêng hoa (freef reeze-dried cells – ffdc) vaø teá baøo coá ñònh chöa qua saáy (wet gluten supported biocatalyst – WGB) [93] Xuùc taùc sinh hoïc Haøm löôïng ñöôøng ban ñaàu (g/L) Thôøi gian leân men (h) Haøm löôïng ethanol (g/L) Naêng suaát sinh coàn (g/L/h) Haøm löôïng ñöôøng soùt (g/L) Ñoä chuyeån hoùa (%) F1GB 136 170 204 238 272 306 57 73 100 15 170 194 63,1 76,4 94,1 102,9 107,6 85,8 1,10 1,04 0,94 0,89 0,63 0,44 5,0 8,9 2,8 12,4 51,6 121,4 96,3 94,7 98,6 94,7 81,0 60,3 ffdc 136 170 204 238 272 306 84 95 110 140 240 240 63,1 85,0 93,6 100,6 102,1 93,6 0,75 0,89 0,85 0,71 0,42 0,39 3,9 5,6 7,6 22,1 65,0 105,6 97,1 96,7 96,2 90,7 76,1 65,4 WGB 136 170 204 238 272 306 36 48 54 60 69 141 62,4 73,3 93,6 108,4 120,1 125,5 1,73 1,52 1,73 1,80 1,74 0,89 0,5 3,3 3,8 8,5 13,6 42,16 99,6 98,0 98,1 96,4 95,0 86,2 AÛnh höôûng cuûa pH Kieåm soaùt pH vaø acid trong röôïu vang laø ñieàu raát quan troïng ñeå duy trì chaát löôïng röôïu vang trong suoát quaù trình baûo quaûn. pH thaáp seõ laøm taêng maøu ñoû, ñoä saùng, ñoä töôi vaø taêng höông vò traùi caây. pH cao laøm aûnh höôûng ñeán maøu ñoû cuûa röôïu vang, ñeán höông vò vaø laøm giaûm ñoä beàn sinh hoïc vaø hoùa hoïc trong suoát quaù trình baûo quaûn. Ngoaøi ra pH coøn aûnh höôûng ñeán hoaït ñoäng cuûa naám men [202]. Khi pH caøng thaáp, haøm löôïng ion H+ trong dòch leân men caøng cao. Do ñoù seõ taïo ra söï cheânh leäch quaù lôùn giöõa ion H+ trong vaø ngoaøi teá baøo, laøm cho naám men maát khaû naêng phaùt trieån. Szajaùni vaø coäng söï (1996) ñaõ khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH ñeán quaù trình leân men söû duïng naám men Saccharomyces cerevisiae coá ñònh trong haït cellulose trong quaù trình saûn xuaát coàn. Keát quaû cho thaáy raèng khaû naêng leân men cuûa teá baøo naám men coá ñònh khoâng phuï thuoäc vaøo pH khi pH naèm trong khoaûng 3,1 vaø 6,25. Trong khi ñoù, nhö ñaõ bieát, khaû naêng leân men cuûa naám men töï do phuï thuoäc vaøo pH, vaø giaù trò pH toái thích khoaûng 4. Keát quaû naøy töông töï nhö khi coá ñònh naám men trong gel calcium alginate (Hình 2.15) (William vaø Munnecke, 1981; Buzías vaø coäng söï, 1989) vaø trong maïng prepolymer hoøa tan (Jirku, 1998). Ñoù laø do chaát mang coá ñònh ñaõ baûo veä teá baøo khoûi nhöõng thay ñoåi cuûa haøm löôïng ion H+ trong moâi tröôøng [34, 98, 189, 205]. Hình 2.15: Aûnh höôûng cuûa pH ñeán toác ñoä leân men cuûa naám men coá ñònh (l) vaø naám men töï do (o). Toác ñoä leân men töông ñoái ñöôïc tính baèng phaàn traêm so vôùi toác ñoä leân men cöïc ñaïi [98] Buzías vaø coäng söï (1989) cuõng nhaän thaáy raèng khaû naêng soáng soùt cuûa naám men haàu nhö khoâng phuï thuoäc vaøo pH, trong khi ñoù khaû naêng soáng soùt cuûa naám men töï do bò aûnh höôûng raát lôùn bôûi pH (Hình 2.16) [34]. Hình 2.16: Aûnh höôûng cuûa pH ñeán khaû naêng soáng soùt cuûa naám men coá ñònh (l) vaø naám men töï do (´) [34] Ñeå khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH ñeán khaû naêng leân men cuûa naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong röôïu vang traéng, Yajima vaø Yokotsuka (2001) ñaõ ñieàu chænh pH cuûa dòch nho ñeán caùc giaù trò 2,80; 3,00; 3,25; 3,50 vaø 3,70 baèng dung dòch potassium bitartrate hoaëc NaOH. Keát quaû khaûo saùt cho thaáy raèng ngoaïi tröø dòch nho coù pH ban ñaàu laø 2,8, trong taát caû caùc tröôøng hôïp coøn laïi quaù trình leân men ñaït ñeán toác ñoä nhö nhau duø cho söû duïng naám men töï do hay coá ñònh (Hình 2.17). Ñieàu ñoù chöùng toû raèng pH ban ñaàu cuûa dòch nho (nho töôi bình thöôøng) aûnh höôûng khoâng ñaùng keå ñeán toác ñoä leân men [208]. Hình 2.17: Aûnh höôûng cuûa pH ñeán haøm löôïng coàn taïo thaønh trong suoát quaù trình leân men: £¢, pH 2,80; ¯¿ pH 3,0; ™˜ pH 3,25; rp pH 3,50; sq pH 3,70. Caùc kyù hieäu roãng vaø ñaëc laàn löôït öùng vôùi naám men coá ñònh vaø naám men töï do [208]. AÛnh höôûng cuûa haøm löôïng SO2 Sulfur dioxide laø moät hôïp chaát ñöôïc söû duïng roäng raõi trong saûn xuaát röôïu vang. Dung dòch SO2 thöôøng ñöôïc theâm vaøo trong luùc chaø, trong suoát quaù trình leân men hoaëc sau khi leân men chính vaø leân men phuï. Löôïng SO2 cao seõ öùc cheá quaù trình leân men coàn vì SO2 coù theå öùc cheá aldehyde dehydrogenase (ADH) ñeå acetaldehyde khoâng theå chuyeån hoùa thaønh ethanol hoaëc keát hôïp tröïc tieáp vôùi acetaldehyde vaø do ñoù laøm giaûm löôïng acetaldehyde coù theå chuyeån hoùa thaønh ethanol [69]. Vieäc söû duïng SO2 trong röôïu vang coù moät soá taùc duïng sau: Choáng hoùa naâu: khi dòch nho tieáp xuùc vôùi O2 trong khoâng khí trong suoát quaù trình chaø vaø eùp, dòch nho seõ phaûn öùng vôùi O2 trong khoâng khí vaø bò oxy hoùa. Quaù trình oxy hoùa laøm cho dòch nho bò saäm maøu, vaø dòch nho seõ daàn chuyeån sang maøu naâu. Quaù trình hoùa naâu coù theå ñöôïc taêng toác do söï coù maët cuûa enzyme polyphenoloxidase trong dòch nho. Loaïi enzyme naøy raát nhaïy vôùi SO2 töï do vaø enzyme naøy seõ bò baát hoaït khi theâm SO2 vaøo dòch nho vì SO2 laøm maát oån ñònh cuûa caùc caàu disulfide trong enzyme. Ngoaøi ra, SO2 coøn coù khaû naêng lieân keát vôùi acetaldehyde, chaát laøm caàu lieân keát cho caùc hôïp chaát phenolic, nhôø ñoù cuõng laøm kìm haõm quaù trình hoaù naâu [59, 30]. ÖÙc cheá vi khuaån vaø naám men daïi: naám men vang coù khaû naêng chòu ñöïng toát ñoái vôùi SO2 nhöng hoaït ñoäng cuûa naám men daïi vaø vi khuaån seõ bò giaûm ñi ñaùng keå khi theâm vaøo moät löôïng nhoû SO2. Ñoä nhaïy ñoái vôùi sulfite thì khaùc nhau ñoái vôùi caùc gioáng naám men khaùc nhau. Kloeckera apiculata nhaïy vôùi haøm löôïng SO2 töï do nhoû hôn 5mg/L. Nhöng Candida guilliermondii vaø Zygosacccharomyces spp. thì nhaïy vôùi haøm löôïng SO2 gaáp ít nhaát khoaûng 10 laàn [59, 90, 171]. Trong nghieân cöùu cuûa Magda Constanti vaø coäng söï (1998), keát quaû cho thaáy raèng SO2 roõ raøng ñaõ ngaên chaën söï phaùt trieån cuûa caùc loaøi khoâng phaûi Saccharomyces vaø laøm taêng toác ñoä phaùt trieån cuûa caùc chuûng Saccharomyces cerevisiae. Caùc taùc giaû naøy cho raèng theâm canh tröôøng Saccharomyces cerevisiae coù theå laøm giaûm löôïng SO2 söû duïng trong quaù trình leân men [48]. SO2 öùc cheá vi sinh vaät theo cô cheá sau: SO2 ôû daïng töï do deã daøng khueách taùn qua maøng teá baøo baèng cô cheá khueách taùn ñôn giaûn. Khi vaøo beân trong teá baøo, SO2 deã daøng taùc duïng vôùi nhieàu hôïp chaát quan troïng beân trong teá baøo nhö enzyme, protein, cofactor, DNA,… do ñoù laøm giaûm khaû naêng soáng soùt cuûa vi sinh vaät. Keát quaû nghieân cöùu cuûa Frivik vaø Ebeler (2003) cho thaáy raèng khi boå sung vaøo dòch nho 0 – 100mg/L SO2 thì quaù trình leân men hoaøn thaønh trong 180h (7,5 ngaøy) (Hình 2.18). Coøn khi boå sung 150mg/L thì keùo daøi laâu hôn moät chuùt (196h, hoaëc 8,2 ngaøy), ñaëc bieät khi boå sung 200mg/L thì coù moät söï thay ñoåi ñaùng keå: treã raát laâu (khoaûng 100h) vaø haøm löôïng chaát khoâ giaûm raát chaäm trong suoát quaù trình leân men. Toång thôøi gian leân men xaáp xæ 429h (hoaëc 17,9 ngaøy) [69]. Hình 2.18: Aûnh höôûng cuûa haøm löôïng SO2 ñeán quaù trình leân men röôïu vang traéng (ñöôïc ñaëc tröng bôûi ñoä leân men, tính theo % so vôùi haøm löôïng chaát khoâ ban ñaàu) [69] Ñeå khaûo saùt aûnh höôûng cuûa SO2 ñeán khaû naêng leân men cuûa naám men töï do vaø naám men coá ñònh trong röôïu vang traéng, Yajima vaø Yokotsuka (2001) ñaõ boå sung potassium metabisulfite ñeå ñieàu chænh haøm löôïng SO2 töï do trong dòch nho ñeán caùc giaù trò 12, 64, 101, 192 vaø 325mg/L. Keát quaû cho thaáy raèng, khi haøm löôïng SO2 töï do raát cao (325mg/L) thì quaù trình leân men bôûi naám men töï do vaø naám men coá ñònh ñeàu khoâng dieãn ra (Hình 2.19). Haøm löôïng ethanol taïo ra bôûi naám men coá ñònh thì cao hôn so vôùi naám men töï do. Khi thay ñoåi haøm löôïng SO2, toác ñoä leân men cuûa naám men töï do thay ñoåi ñaùng keå, ngoaïi tröø tröôøng hôïp haøm löôïng SO2 laø 64 vaø 101mg/L thì toác ñoä leân men laø töông töï nhau. Khi söû duïng naám men coá ñònh, giöõa caùc loaïi röôïu vang coù haøm löôïng SO2 laø 0, 64 vaø 101mg/L vaø giöõa caùc loaïi röôïu vang coù haøm löôïng SO2 laø 192 vaø 325mg/L thì toác ñoä leân men laø töông töï nhö nhau. Nhöõng keát quaû treân ñaõ cho thaáy raèng naám men coá ñònh ít nhaïy caûm hôn vôùi tính khaùng khuaån cuûa SO2 so vôùi naám men töï do [208]. Hình 2.19: Aûnh höôûng cuûa SO2 ñeán haøm löôïng coàn taïo thaønh trong suoát quaù trình leân men: £¢, khoâng boå sung; ¯¿ 64mg/L; ™˜ 101mg/L; rp 192mg/L; sq 325mg/L. Caùc kyù hieäu roãng vaø ñaëc laàn löôït öùng vôùi naám men coá ñònh vaø naám men töï do [208]. AÛnh höôûng cuûa tannin Tannin laø loaïi polyphenol phoå bieán trong dòch nho ñoû. Mazauric vaø Salmon (2005, 2006) cho raèng trong suoát quaù trình uû röôïu vang, polyphenol töông taùc vôùi caën naám men, giuùp duy trì traïng thaùi hình caàu cuûa teá baøo naám men, baûo veä thaønh teá baøo naám men khoûi hoaït ñoäng thuûy phaân cuûa caùc enzym ngoaïi baøo [95, 140, 172]. Cho ñeán nay, caùc nghieân cöùu veà aûnh höôûng cuûa tannin ñeán ñoäng hoïc quaù trình leân men röôïu vang nho vaãn coøn raát haïn cheá. Yajima vaø Yokotsuka (2001) ñaõ khaûo saùt aûnh höôûng cuûa haøm löôïng tannin ban ñaàu ñeán quaù trình sinh toång hôïp coàn cuûa röôïu vang traéng. Caùc taùc giaû ñaõ söû duïng dòch nho coù haøm löôïng tannin ban ñaàu laø 477, 667, 920, 1246 vaø 2178mg GAE/L sau khi ñaõ boå sung theâm tannin ñöôïc trích ra töø dòch nho vaøo haït nho. Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy raèng maëc duø quaù trình leân men coàn bôûi naám men coá ñònh khoâng bò aûnh höôûng bôûi haøm löôïng tannin nhöng ñoái vôùi naám men töï do, khi haøm löôïng tannin ban ñaàu quaù cao (2178mg/L) thì toác ñoä taïo coàn seõ bò giaûm xuoáng, bôûi vì söï haáp phuï tannin leân beà maët cuûa naám men töï do ñaõ öùc cheá söï phaùt trieån cuûa naám men (Hình 2.20) [208]. Hình 2.20: Aûnh höôûng cuûa tannin ñeán haøm löôïng coàn taïo thaønh trong suoát quaù trình leân men: £¢ 477mg GAE/L; ¯¿ 667 mg GAE/L; ™˜ 920 mg GAE/L; rp 1246 mg GAE/L; sq 2178 mg GAE/L. Caùc kyù hieäu roãng vaø ñaëc laàn löôït öùng vôùi naám men coá ñònh vaø naám men töï do [208]. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä Nhieät ñoä laø moät yeáu toá raát quan troïng trong quaù trình leân men vì nhieät ñoä aûnh höôûng raát maïnh meõ ñeán söï sinh tröôûng vaø hoaït ñoäng trao ñoåi chaát cuûa