Đề tài Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria

Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 1 MỤC LỤC Lời nói đầu 1. Giới thiệu 1 1.1 Probiotic 1 1.1.1 Lịch sử, khái niệm và các loài Bifidobacteria 1 1.1.2 Nguyên tắc phân loại 2 1.2 Bifidobacteria 2 1.2.1 Khái niệm và các chủng của loài Bifidobacteria 2 1.2.2 Các chủng có giá trị thương mại 8 1.2.3 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi khuẩn 10 2. Quá trình công nghệ thu nhận probiotic bifidobacteria 12 2.1 Môi trường nuôi cấy và các điều kiện 12 2.1.1 Môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn 12 2.1.2 Môi trường nuôi cấy thay thế 13 2.2 Lên men 16 2.2.1 Các hình thức lên men 16 2.2.2 Canh trường tế bào lên men tự do truyền thống 20 2.2.3 Ảnh hưởng các tính chất công nghệ đến đặc tính của tế bào 22 2.3 Vi lọc 24 2.3.1 Mô hình sợi 24 2.3.2 Hệ thống thiết bị phản ứng sinh học membrane 25 2.4 Rửa và bổ sung phụ gia 25 2.5 Hình thành sản phẩm 26 2.5.1 Môi trường dạng lỏng 26 2.5.2 Môi trường dạng lạnh đông 26 2.5.3 Môi trường dạng sấy khô 27 3. Tiêu chuẩn chất lượng 29 4. Thành tựu công nghệ 30 4.1 Đánh giá chủng Bifidobacteria spp trong việc sản xuất các probiotic tiềm năng trên môi trường đồ uống malt – base 30 4.2 Đánh giá tính an toàn của probiotic bifidobacteria bằng cách phân tích hoạt tính thủy phân mucin và khả năng chuyển vị 32 5. Phụ lục 37 5.1 Tác dụng của probiotic đối với sức khỏe con người 37 5.2 Bảo quản sản phấm 40 5.3 Những sản phẩm công nghệ bổ sung probiotic bifidobacteria 42 6. Tài liệu tham khảo 47 Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 2 DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Những tế bào Bifidobacterium trên biểu mô ruột 3 Hình 2. Mối quan hệ giữa các chủng của loài bifidobacteria 6 Hình 3. Bifidobacterium adolescentis 7 Hình 4. Bifidobacterium bifidum 8 Hình 5. Bifidobacterium breve 9 Hình 6. Bifidobacterium longum 10 Hình 7. Quá trình lên men liên tục hai giai đoạn để sản xuất probiotic thích ứng với stress. 19 Hình 8. Cấu tạo mô hình sợi 1 24 Hình 9. Cấu tạo mô hình sợi 2 24 Hình 10. Thiết bị phản ứng sinh học membrane 25 Hình 11. Sản phẩm Activia dạng chai và Activia yogurt 42 Hình 12. Sản phẩm Align 43 Hình 13. Sản phẩm Bifidus yogurt 43 Hình 14. Sản phẩm Good start natural cultures 44 Hình 15. Sản phẩm Nutrish 44 Hình 16. Pobiotic ice-cream, Nước giải khát probiotic whey, Bio-kefir 45 Hình 17. Sản phẩm Teddy 45 Hình 18. Sản phẩm Yo-plus yogurt 46 Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 3 DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic ở người 2 Bảng 2. Các chủng của loài bifidobacteria 4 Bảng 3. Các nhà cung cấp vi sinh vật sản xuất probiotic 7 Bảng 4. Môi trường nuôi cấy chuẩn 12 Bảng 5. Ảnh hưởng các yếu tố sinh trưởng lên sự phát triển của Bifidobacterium trong môi trường whey bơ 15 Bảng 6. Dữ liệu sản xuất Bifidobacteria trong những hệ thống lên men và điều kiện môi trường khác nhau 20 Bảng 7. Một số phụ gia chống đông có thể sử dụng được 26 Bảng 8. Những tiêu chuẩn mong muốn và then chốt trong việc lựa chọn những probiotic trong ứng dụng thương mại 29 Bảng 9. Các thông số động lực cho sự phát triển của Bifidobacterium spp 31 Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 4 1. Giới thiệu 1.1 Probiotic 1.1.1 Lịch sử, khái niệm và các tính chất 1.1.1.1 Lịch sử • Probiotic được dùng để chỉ những vi sinh vật có lợi cho người và động vật do Dr.Eli Metchinikoff, một nhà khoa học người Nga đạt giải Nobel năm 1908, đưa ra khi ông nghiên cứu về vai trò của những vi khuẩn có lợi trong đường ruột. • Cũng vào thời điểm đó, Henry Tissier, một bác sĩ khoa nhi người Pháp, đã quan sát trong phân những đứa trẻ bị tiêu chảy có một số lượng ít vi khuẩn lạ, hình Y, là những vi khuẩn “bifid” ngược lại chiếm số lượng lớn trong những đứa trẻ khỏe mạnh. Và ông cho rằng những con vi khuẩn này có khả năng chống lại bệnh tiêu chảy giúp khôi phục hệ thống vi sinh vật đường ruột khỏe mạnh. 1.1.1.2 Khái niệm • Có thể định nghĩa probiotic như sau: “Probiotic là một hay hỗn hợp nhiều vi khuẩn mà khi cung cấp cho người hay động vật thì mang lại những hiệu quả có lợi cho vật chủ bằng cách tăng cường các đặc tính của vi sinh vật trong hệ tiêu hóa”. • Đặc điểm cơ bản probiotic o Probiotic là những vi sinh vật sống. o Khi các probiotic được cung cấp với liều lượng thích hợp thì mang lại những hiệu quả mong muốn. 1.1.1.3 Vai trò
Thủy phân lactose, tăng sự hấp thu lactose.
Tăng “thành bảo vệ” miễn dịch, một số có khả năng kích thích cả miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu, cùng với việc sinh ra S-IgA ở màng nhầy.
Kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn, virus, nấm có hại.
Có khả năng chịu được acid dạ dày, muối mật, có khả năng xâm chiếm đường ruột, bám vào màng nhầy ruột do đó hạn chế sự có mặt của vi sinh vật có hại.
Sinh ra các chất chống lại vi sinh vật gây bệnh (như Samonella, E.coli, Clostridium…)
Phòng và chữa một số bệnh đường tiêu hóa: tiêu chảy, táo bón, ung loét dạ dày…
Giảm triệu chứng dị ứng, triệu chứng không dung nạp được lactose.
Tổng hợp một số vitamin, giảm cholesterol Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 5
Ngăn chặn ung thư đường ruột, ung thư ruột kết. 1.1.2 Nguyên tắc phân loại Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ yếu thuộc Lactobacillus và Bifidobacterum, ngoài ra Enterococcus và Streptococus cũng được sử dụng ít hơn. Những vi khuẩn này thường cư trú trong ruột. Một số chủng tiêu biểu bao gồm Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum. Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces boulardii cũng được xem là probiotic. Bảng 1: Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic ở người Chủng Lactobacillus Chủng Bifidobacterium Các chủng vi khuẩn lactic khác Các loài vi sinh vật khác L. acidophilus L. amylovocus L. casei L. crispatus L. gallinarum L. gasseri L. johnsonii L. paracaseii L. plantarum L. reuteri L. rhamnosus L. salivarius B. adolescentis B. alimalis B. bifidum B. breve B. infantis B. lactis B. longum Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Lactococus lactis Leuconostoc mesenteroides Pediococus acidilactici Sporolactobacillus inulinus Streptococus thermophilus Bacillus cereus Escherichia coli Propionibacterium freudenreichii Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces boulardii (Taylor & Francis, 2004) 1.2 Bifidobacteria 1.2.1 Khái niệm và các loài bifidobacteria 1.2.1.1 Khái niệm Chủng bifidobacterium theo truyền thống được xếp chung với LAB, là hệ thống phát sinh liên quan đến LAB thật. Nó thuộc ngành Atinobacteria, lớp Actinobacteria, bô bifidobacteriales, họ bifidobacteriaceae. Họ hàng của nó là Aeriscardovia, Gardnerella, Parascardovia, và Scardovia. Những loài của chủng đó sử dụng con đường trao đổi chất để phân hủy hexoses nên được gọi là “bifid shunt”, đó là sự khác biệt với Lactobacillus và các chủng liên quan. Enzym được xem như là đặc tính phân loại của nhóm là fructose-6-phosphoketolase(EC 4.1.2.2). Chủng hiện tại bao gồm khoảng 30 loài. Thành phần GC trong hệ gen khác nhau từ 42-67%mol, thuộc nhóm vi khuẩn gram dương cao GC. Nhóm vi khuẩn có những đặc tính probiotic thuộc các loại Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 6 Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve và Bifidobacterium longum. Hình 1: Những tế bào bifidobacterium trên biểu mô ruột (Trích từ Centre of Excellence for Knowledge Transfer, Research and Education in Food and Health for Central and Eastern Europe) • Bifidobacteria có chủ yếu ở trong ruột kết của người và động vật, nhất là ở trẻ mới sinh được nuôi bằng sữa mẹ. Số lượng của chúng trong ruột kết khá ổn dịnh cho đến khi về già thì số lượng giảm đi. • Một số tính chất chung của các loài thuộc Bifidobacteria: o Gram dương, kị khí, không chuyển động, không sinh bào tử, catalase âm o Có nhiều hình dạng: que cong ngắn, hình gậy, hình chữ Y. o Sinh acid lactic, không tạo CO2 trừ quá trình phân giải gluconate. • Nhiệt độ và pH tối ưu o Nhiệt độ tối ưu cho Bifidobacteria phá triển: Topt: 37 – 41oC và không thể phát triển dưới 20oC và trên 46oC. Sự phát triển tại nhiệt độ là Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 7 45oC dường như có thể phân biệt rõ ràng giữa chủng Bifidobacteria từ người và từ vật. Chỉ trừ trường hợp của B. thermacidophilum có thể phát triển tại điều kiện nhiệt độ 49.5oC (ưa ấm). o Bifidobacteria là vi khuẩn đường ruột chịu được acid. pHopt vào khảng 6.5 -7.0, không phát triển tại khoảng pH được ghi nhận là dưới 4.5 (trừ B. thermacidophilum có thể sống ở pH xuống khoảng 4) và trên 8.5. Bifidobacteria là vi sinh vật kỵ khí tuy nhiên độ nhạy với oxy có thể khác nhau tùy loài. • Cho đến nay đã có 30 loài thuộc Bifidobacteria được phân lập. Bifidobacteria được sử dụng như các probiotic gồm Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium thermophilus, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum… 1.2.1.2 Các chủng của loài bifidobacteria Bảng 2: Các chủng của loài bifidobacteria Loài Bifidobacteria Nguồn B. adolescentis Phân của trẻ em và người lớn, ruột thừa B. angulatum Phân người lớn B. animalis Phân của thỏ, chuột, gà, bê B. asteroids Mật ong B. bifidum Phân của trẻ em và người lớn B. boum Chất cặn trong dạ cỏ của động vật nhai lại B. breve Phân trẻ em B. catenulatum Phân trẻ em và người lớn B. choerinum B. coryneforme Mật ong B. cuniculi Phân thỏ B. denticolens Răng sâu của con người B. dentium Răng sâu của người, phân người lớn B. gallicum Phân người trưởng thành B. gallinarium Phân gà B. infantis Phân trẻ em B. inopinatum Răng sâu của người B. lactis Sữa đã lên men B. longum Phân người lớn và trẻ em B. magnum Phân thỏ B. merycicum Dạ cỏ động vật nhai lại B. minimum Nước cống B. pseudocatenulatum Phân trẻ em B. pseudolongum ssp. Phân của chuột, gà, bê, dạ cỏ của động vật nhai lại Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 8 B. psychraerophilum Manh tràng của heo B. pullorum Phân gà B. ruminantium Dạ cỏ của động vật nhai lại B. saeculare Phân thỏ B. scardovii Phân người trưởng thành B. subtile Nước cống B. suis B. thermacidophilum Kỵ khí trong hệ tiêu hóa B. thermophilum Phân gà, bê, dạ cỏ của động vật nhai lại B. thermacidophilum ssp. porcinum Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 9 Hình 2: Mối quan hệ giữa các chủng của loài Bifidobacteria Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 10 1.2.1.3 Các nhà cung cấp vi sinh vật sản xuất probiotic Bảng 3: Các nhà cung cấp vi sinh vật sản xuất probiotic Nhà sản xuất Chủng probiotic Cargill (Minneapolis, Mỹ) Bifidobacterium animalis subsp. Lactis Bf-6 Bifidobacterium bifidum BF2 Bifidobacterium breve BR2 Bifidobacterium infantis BT Bifidobacterium lactis BL2 Cell Biotech Europe (Copenhagen, Đan Mạch) Bifidobacterium longum BG3 Chr Hansen (Hφrsholm, Đan Mạch) Bifidobacterium lactis BB12 Bifidobacterium animalis subsp. Lactis B-420 Danisco (Copenhagen, Đan Mạch) Bifidobacterium lactis HN019 DSM (Heerlen, Hà Lan) Bifidobacterium LAFTI B94 Bifidobacterium breve M16V Bifidobacterium infantis M-63 Bifidobacterium longum BB536 Morinaga (Tokyo, Nhật Bản) Bifidobacterium pseudolongum M-602 1.2.2 Các loài có giá trị thương mại 1.2.2.1 Bifidobacterium adolescentis Thuộc nhóm được tách ra từ phân của người lớn, trẻ em và ruột thừa. Hệ thống phân nhóm liên quan đến Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium merycicum, Bifidobacterium pseudocatenulatum and Bifidobacterium ruminantium và rất khó khăn để phân biệt kiểu hình của nó với Bifidobacterium dentium. Nó được đặc trưng bởi thành phần gen GC khoảng 58% trong khi amino acid thành tế bào chứa amino acid Lys (Orn) – D-Asp. Chủng được tách từ ruột người là ATCC 15703T (= DSM 20083T = LMG 10502T). Hình 3: Bifidobacterium adolescentis Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 11 1.2.2.2 Bifidobacterium animalis Mô tả chủng này dựa vào sự phân lập từ phân của các loài động vật khác nhau. Ở một số tài liệu thì nó được mô tả như Bifidobacterium lactis, được tách ra từ các sản phẩm bơ sữa. Quá trình tách subsp. Lactis thì chịu áp lực oxy nhiều hơn subsp. Animalis và điều đó có lợi trong ứng dụng của probiotic, nó cho phép chúng có thể tồn tại trong điều kiện không kị khí của sản phẩm thương mại, và điều khác biệt nữa giữa 2 chủng là sự sinh trưởng của chúng trong sữa. Bifidobacterium animalis thuộc nhóm Bifidobacterium pseudolongum, bao gồm Bifidobacterium choerinum, Bifidobacterium cuniculi, Bifidobacterium gallicum và Bifidobacterium pseudolongum. Thành phần DNA G+C của loài này chiếm 61%. Một loại Bifidobacterium animalis subsp. animalis là ATCC 25527T (= LMG 10508T = DSM 20104T), tách từ phân chuột, một loại B. Animalis subsp. lactis là LMG 18314T (=DSM 10140T), được tách từ sữa đã lên men. 1.2.2.3 Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium Bifidum cực kì kị khí. Nó là một trong số những loài được nhận biết dựa vào dấu hiệu quá trình lên men và nó khác hoàn toàn so với những loài khác trong nhóm bifidobacteria. Trong điều kiện đặc biệt những tế bào có hình dáng riêng giống “amphora” và cũng thường xuất hiện như một nhánh que. Loài này được phân lập từ phân của cả người lớn và trẻ em, phân động vật, nhưng nó được sử dụng trong những sản phẩm của quá trình lên men bơ sữa cho mục đích probiotic. Một loại của chủng này là ATCC 29521T (= DSM20239T = LMG 10645T), tách ra từ phân của em bé nuôi bằng sữa mẹ. • B. bifidum là vi khuẩn chiếm đa số ở ruột già người. • Bảo vệ cơ thể chống sự phá hoại của rotavirus gây tiêu chảy, và điều chỉnh lại hệ vi sinh vật đường ruột • Tăng miễn dịch cơ thể, đặc biệt liên quan đến sức khoẻ đường ruột, ngăn chặn ung thư, không gây hiệu ứng phụ. • Chống các viêm loét, bảo vệ cơ thể chống lại các vi sinh vật gây bệnh như Samonella, hạn chế hoạt động của E.coli • Giảm đáng kể lượng nội độc tố trong ruột tạo thành từ các thành Hình 4: Bifidobacterium bifidum Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 12 1.2.2.4 Bifidobacterium breve Loài này được đặc trưng bởi kích thước ngắn, có hay không có sự rẽ nhánh, với lysine và glycine như là amino acid trong peptidoglycan và có thành phần gen GC chiếm 58%. Loài này được tách ra từ ruột người, nước cống và trong hệ thống loài thì liên quan đến Bifidobacterium longum. Loại chủng này là ATCC 15700T (=DSM20213T = LMG 11042T). Hình 5: Bifidobacterium breve 1.2.2.5 Bifidobacterium longum Khác với Bifidobacterium breve, tế bào của loài này có hình dạng dài và mỏng, ít phân nhánh. Nó kị khí và được xem là một trong những loài phổ biến của bifidobacteria, được tách ra từ phân của người lớn và cả phân của động vật. Loài gần nó nhất trong hệ thống phân loài là Bifidobacterium breve. Thành phần gen GC của nó chiếm 60% và sự hiện diện của nhiều plasmid, tính chất duy nhất trong số những bifidobacteria tách ra từ phân. Một loại của subsp. longum là ATCC 15707T (=DSM 20219T = LMG 13197T), tách ra từ phân của người lớn. • Giảm lượng nitrate sinh ra trong quá trình tiêu hóa thức ăn. • Ngăn chăn hoạt động của các vero cytotoxin sinh ra bởi một số chủng thuộc E.coli, gây bệnh viêm, xuất huyết đường ruột do có khả năng sinh ra các hợp chất kết hợp với các vero cytotoxin. • Ngoài ra, Bifidobacterium longum còn hiệu quả trong việc bảo vệ cơ thể chống lại sự nhiễm Samonella typhimurium. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 13 Hình 6: Bifidobacterium longum 1.2.3 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi khuẩn 1.2.3.1 Về mặt sản xuất − Có thể phát triển nhanh chóng với số lượng lớn trong điều kiện lên men đơn giản và rẻ. − Có thể tồn tại và phát triển trong điều kiện kị khí hoặc vi hiếu khí. − Có thể sống sót qua quá trình ly tâm, lọc, đông lạnh hoặc sấy lạnh mà không mất số lượng đáng kể. − Có khả năng hoạt hóa nhanh sau khi được sử dụng. − Có thể sống sót dưới những điều kiện biến đổi khác nhau trong chế biến thực phẩm bao gồm cả các quá trình nhiệt độ cao trên 450C cũng như chịu đựng được nồng độ ethanol và sodium cloride cao. 1.2.3.2 Khả năng sống sót trong ruột − Khả năng chịu được các dịch tiêu hoá: acid trong dạ dày và muối mật. − Khả năng cư trú trong ruột: khả năng bám chặt và làm giảm số lượng mầm. bệnh bám trên bề mặt thành ruột. 1.2.3.3 Đặc tính riêng − Có khả năng sử dụng prebiotic (oligosaccharides, inulin, tinh bột) để phát triển. − Khả năng tổng hợp hay sử dụng vitamine (Nhóm B, folate, vitamin K). − Có khả năng ngăn chặn các mầm bệnh: Samonella typhimurium, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Escherichia coli, Candida albicans… − Có hoạt tính β– galactosidase. − Có khả năng tổng hợp acid, hydrogen peroxide, các bacteriocin. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 14 − Khả năng sinh D-lactic acid. − Có thể sử dụng kết hợp với các vi sinh vật khác. 1.2.3.4 Tính an toàn − Không gây độc, không ảnh hưởng xấu đến sức khỏe. - Kiểm tra bằng liều gây chết trên động vật. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 15 2. Qui trình công nghệ thu nhận probiotic bifidobacteria 2.1 Môi trường nuôi cấy và các điều kiện 2.1.1 Môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn Bảng 4: Môi trường nuôi cấy chuẩn Môi trường Tên Chất thêm vào MRS De Man Rogosa Sharpe TPY Tryptone Phytone Yeast BL Glucose Blood-Liver CLB Columbia LCL Liver Cysteine Lactose (Blaurock) RCM Reinforced Clostridia Medium mMRS Modified MRS L-cysteine HCL, 0.05% mMRS + máu Modified MRS L-cysteine HCL, 0.05% máu cừu 10 ml X-a-Gal MRS X-a-Gal mBL Modified BL without blood L-cysteine HCL, 0.05% mRCM Modified RCM Lactose 1.0% máu người 50ml RCPB RCM Prussian Blue 0.03% 2.1.1.1 Môi trường MRS (g/l) + Peptone 10.0g + Baptist Meat extract 8.0g + Baptist yeast powder 4.0g + Glucose 20.0g + K2HPO4 2.0g + Diammonium hydrogen citrate 2.0g + Sodium 5.0g + MgSO4 0.2g + Manganese sulfate 0.04g + Agar 14.0g + PH 5.7 +/- 0.2 2.1.1.2 Môi trường TPY (g/l) + Hydrolyzed casein 10.0g + Soya Peptone 5.0g + Baptist yeast powder 2.0g + Glucose 5.0g Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 16 + L-cysteine 0.5g + K2HPO4 2.0g + Magnesium chloride 0.5g + Zinc sulfate 0.25g + Calcium chloride 0.15g + Ferric chloride 1.0ug + Agar 20.0g + Soil temperature 80 1.0g + PH 6.5 +/- 0.1 2.1.1.3 Môi trường BL (g/l) + Baptist liver powder 4.0g + Peptone 5.0g + Baptist Meat extract 3.0g + Baptist yeast powder 2.0g + Enzymatic digest of casein 5.0g + Soluble starch 0.5g + L-cysteine 0.5g + Glucose 10.0g + KH2PO4 1.0g + K2HPO4 1.0g + Soya Peptone 3.0g + MgSO4 0.2g + Ferrous sulfate 0.01g + NaCl 0.01g + Agar 20.0g + Manganese sulfate 0.0067g + Tween 80 1.0g + PH 7.2 +/- 0.1 2.1.2 Môi trường nuôi cấy thay thế Môi trường tổng hợp và bán tổng hợp có chứa lactose( 3-7%), proteins, amino acid, vitamin B, casein trong hệ tiêu hóa bò đang được phát triển để nuôi cấy bifidobacteria. Ngoài ra còn có thể nuôi cấy bifidobacteria trên môi trường sữa có bổ sung chất dinh dưỡng. Môi trường nuôi cấy thương mại như MRS, TPY thì rất mắc tiền vì vậy môi trường nuôi cấy dựa trên thành phần chủ yếu nước whey được đề ra. Vi sinh vật: Bifidobacteria bifidum Chuẩn bị chủng : B.bifidum được phát triển trong môi trường nước thịt MMRS có bổ sung casein-HCl 0.05% ở 370C trong 24h. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 17 Whey từ phô mai Chứa 4.65% lactose và 0.8% proteins tổng. Chuẩn bị phô mai Từ sữa bò, 1% môi trường nuôi cấy được thêm vào và được ủ ở 370C trong 24h. Men dịch vị lấy từ dạ dày bò sẽ được thêm vào để acid hóa khối đông và được ủ ở 370C trong 45 phút. Khối đông mềm dẻo sẽ được cắt ra và thu nhận nước whey. Tiệt trùng nước whey Nước whey được tiệt trùng autoclave ở 1210C trong 15 phút. Những yếu tố sinh trưởng sẽ được bổ sung trong quá trình tiệt trùng autoclave : chất chiết nấm men, casein từ bò, casein từ hệ tiêu hóa của bò, tryptone, peptone, N-acetyl-D- glucosamine. Những yếu tố sinh trưởng sẽ được thêm vào với nồng độ 10mg/ml ngoại trừ glucosamine với nồng độ 1mg/ml. Ảnh hưởng của điều kiện kị khí Điều kiện kị khí được thực hiện bằng cách thêm vào 0.05% cystrine-HCl, 0.2% ascorbic acid và 0.1% sodium thioglycolate. Dung dịch sẽ được tiệt trùng autoclave ở 1210C trong 15 phút. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ Whey phô mai sẽ được điều chỉnh đến pH 6.6 , 6.8,7.0, 7.2 và 7.4. 50ml nước whey được cấy B. bifidum sẽ được ủ ở nhiệt độ 35, 37, 40 hay 430C Sự phát triển của vi khuẩn Ống nghiệm chứa vi sinh vật sẽ được đặt trong tủ ấm N2-CO2 ở 370C trong 18h. pH tại thời điểm đó không quá thấp và tỉ lệ phát triển của vi sinh vật được giới hạn bởi hàm lượng các yếu tố sinh trưởng trong môi trường. pH cuối không được thấp hơn 4.8. Vi sinh vật sẽ được đếm trong môi trường MMRS agar ở 370C sau 72h. Kết quả a. Ảnh hưởng của các yếu tố sinh trưởng Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 18 Bảng 5: Ảnh hưởng của các yếu tố sinh trưởng lên sự phát triển của B. bifidum trong môi trường whey bơ b. Ảnh hưởng của môi trường kị khí Không có sự khác nhau trong hoạt động của 3 tác nhân. Số lượng vi sinh vật trong 1 ml khoảng 2,4.10-7. Nước whey bổ sung sodium thioglycolate là môi trường tốt hơn so với hai tác nhân còn lại. Bifidobacteria là vi khuẩn kị khí bắt buộc. Sụ phát triển của sinh vật trong môi trường đặc cần một lượng nhỏ khí CO2 và chịu đựng 3% oxy khí quyển nhưng khi phát triển trong môi trường lỏng chỉ chịu đựng oxy khí quyển mà không cần CO2. c. Ảnh hưởng của pH Không có sự khác biệt trong sự phát triển của vi sinh vật khi thay đổi pH. Số lượng vi sinh vật dao động trong khoảng 2.3 đến 2,4.10-7cfu/ml. Khi pH đến 7.6 thì số lượng vi sinh vật giảm. d. Ảnh hưởng của nhiệt độ B. bifidum phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ 35-370C. Nhiệt độ trên 370C sẽ làm giảm số lượng vi sinh vật. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 19 Lược đồ quy trình sản xuất probiotic 2.2 Lên men 2.2.1 Các hình thức lên men Lên men theo mẻ hoặc lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất là những quá trình sản xuất được ưa thích hơn cả trong công nghiệp sữa, bởi vì lên men liên tục đòi hỏi những bước cô đặc có chi phí cao; tuy nhiên, có những phát triển mới trong những lĩnh vực này. Với phương pháp lên men theo mẻ, tất cả cơ chất và giống vi sinh vật được trộn trong thiết bị lên men. Thiết bị lên men có nhiệt độ và pH được điều khiển cho phù hợp với những điều kiện phát triển tối ưu. Khi nồng độ probiotic đạt đến mức mong muốn, quá trình sẽ dừng lại, tất cả các tế bào Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 20 được thu gom và quá trình lại được lặp lại. Tùy thuộc vào khối lượng được yêu cầu mà các thiết bị lên men có thể lớn đến 10000 L. Lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất cho phép thêm vào một lượng giới hạn cơ chất trong suốt quá trình lên men, và kỹ thuật này thường được sử dụng để gia tăng nồng độ vi khuẩn. Việc sản xuất môi trường probiotic trong phương pháp lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất có điểm thuận lợi là các exopolysaccharide ít được tạo thành và do đó sản phẩm ít bị nhớt (Champagne và cộng sự, 2007). Lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất cũng có thể được ứng dụng để gây stress vi khuẩn vào cuối quá trình lên men nhằm đem lại phản hồi stress (chẳng hạn sự phản hồi stress thẩm thấu hoặc hòa tan) để bảo vệ chúng khỏi những bước sản xuất tiếp theo) Do những khó khăn trong việc nhân giống dòng tế bào trên quy mô công nghiệp, những giống từ sản xuất chuyển thành dạng giống DVS (direct vat set) được ưa thích hơn trong ngành công nghiệp sữa. Giống DVS là những giống được làm lạnh khô có nồng độ cao (khoảng 1011 cfu/g) hoặc đông lạnh (khoảng 1010 cfu/g) mà có thể được sử dụng để cho trực tiếp vào thiết bị lên men (Honer, 1995; Oberman và Libudzisz, 1998) pH thấp là một trong những nguyên nhân chính ức chế sự phát triển, và do đó, bằng việc kiểm soát pH, có thể đạt được hiệu suất sinh khối cao. Trong những quá trình theo mẻ, kiểm soát pH đạt được kết quả bằng việc canh chỉnh pH vối một base (chẳng hạn: ammonium hoặc sodium hydroxide), hoặc sử dụng một chất đệm phù hợp [như là: N-Tris(hydroxymethyl) methyl-3- aminopropanesulfonic acid (TAPS) hoặc đệm phosphate]. Khi các vi khuẩn phát triển, urease thủy phân urea thành acid amonia trung tính. Những kỹ thuật khác bao gồm việc sử dụng dung dịch muối bão hòa (như là CaCO3) hòa tan và trung hòa dần dần khi đó pH sẽ giảm, kỹ thuật này cũng phù hợp cho việc kiểm soát pH trong các đĩa agar. Việc tăng sinh khối gấp 10 lần có thể đạt được khi việc kiểm soát pH được sử dụng trong lên men. Khi các vi khuẩn phát triển với pH được kiểm soát, tỉ lệ acid hóa đặc hiệu sẽ thấp hơn khi không có sự kiểm soát pH, điều này có nghĩa phải cần một thể tích giống cao hơn và thời gian lên men lâu hơn (Salvoie và cộng sự, 2007) Ngoài lên men theo mẻ (có bổ sung cơ chất), còn có những phương pháp khác để sản xuất môi trường vi khuẩn nồng độ cao. Chẳng hạn, Doleyres và cộng sự (2004a) xem xét phương pháp lên men liên tục và mô tả những lợi ích tiềm năng. Công nghệ này có thể cho hiệu suất tế bào cao, và giảm quá trình cô đặc sau này được thực hiện trên B. longum ATCC15707 (Doleyres và cộng sự, 2002b). Tuy nhiên, nguy cơ nhiễm cũng gia tăng khi áp dụng công nghệ này vào quy mô công nghiệp (Lacroix và Yildirim, 2007). Taniguchi và cộng sự (1987) đã báo cáo về nồng độ của B. longum cao hơn gấp 7 lần khi sử dụng bình lên men sinh học trong suốt quá trình lên men. Thiết bị lên men này cung cấp thức ăn là môi trường mới liên tục, trong khi đó các vi khuẩn được giữ trong thiết bị phản ứng bằng màng siêu lọc hoặc vi lọc. Vì thế, những chất trao đổi ngăn cản sự phát triển được chuyển dời ra khỏi hệ thống mà cho phép nhiều hơn sự phát triển của vi khuẩn. Corre và cộng sự (1992) cũng đã báo cáo về hiệu suất tế bào cao hơn khi sử dụng Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 21 thiết bị phản ứng có membrane tương phản với lên men B. bifidum tế bào cố định. Schiraldi và cộng sự (2003) báo cáo về nồng độ tế bào được gia tăng và sản xuất có sự trao đổi chất trong một thiết bị phản ứng có màng membrane tương tự. Những hướng nghiên cứu khác đang gia tăng trong việc thực hiện quá trình lên men là cố định các vi khuẩn trong thiết bị lên men. Các vi khuẩn được cố định trên trái cây (táo và quả mộc qua) được sử dụng để sản xuất số lượng lớn các acid lactic dùng trong thực phẩm (Kourkoutas và cộng sự, 2005). Những tế bào cố định được sử dụng trong những lần lên men mẻ sau mà không có sự thất thoát đáng kể nào về hoạt tính sản sinh acid. Dạng cố định khác có thể đạt được kết quả bằng cách gắn vi khuẩn vào các hạt gel. Điều này đạt được kết quả bằng cách bẫy vi khuẩn trong các hạt polymer hình cầu với đường kính khoảng từ 0,3 đến 3 mm (Champagne và cộng sự, 1994; Lacroix, 2005). Sinh khối hoạt tính được cố định bằng sự hóa keo bởi nhiệt (κ-carrageenan, gellan, agarose, gelatine) hoặc sự hóa keo bởi ionic (alginate, chitosan). Sự phát triển được quan sát theo hướng hướng vào tâm các hạt gel. Sự phát triển giống như màng sinh học này có kết quả trong việc giải phóng nhiều tế bào vào môi trường, nguyên nhân là do những tác động va chạm song song trong thiết bị phản ứng (Doleyres and Locroix, 2005). Dựa trên những kỹ thuật này, nhiều nghiên cứu đã cho thấy hiệu suất sinh khối probiotic cao. Quellette và cộng sự (1994) đã sản xuất sữa gầy lên men liên tục sử dụng B. infantis cố định trên κ-carrageenan / những hạt locust bean gum. Số tế bào đếm được lên tới 2,2.109 cfu/ml và năng suất thể tích tối đa khoảng 109 cfu/ml.h. Trong một nghiên cứu khác, B. longum được cố định trên những hạt gellan gum (7.109 cfu/g) trong môi trường MRS có bổ sung whey permeate, mà hướng đến việc sản xuất tế bào nồng độ cao, khoảng 3,5 đến 4,9.109 cfu/ ml với D (tỉ lệ pha loãng) tuần tự 2 – 0,5 h – 1 (Doleyres và cộng sự, 2002b). Nghiên cứu này cũng trình bày năng suất theo thể tích cao nhất đối với B. longum là 6,9.109 cfu/ml/h. Tuy nhiên, nồng độ cao này đạt được bằng cách sử dụng tỉ lệ pha loãng khoảng 2 h–1 mà điều này làm cho tế bào không được thành. Trong quá trình lên men hai giai đoạn, dòng lưu chất từ thiết bị lên men thứ nhất chảy vào thiết bị lên men thứ hai. Lên men hai giai đoạn có thể gia tăng số lượng tế bào và khả năng sống trong suốt quá trình sản xuất lần sau. Doleyres và cộng sự (2004a) sử dụng lên men liên tục hai giai đoạn để sản xuất canh trường bị pha lẫn vào nhau có nồng độ cao (B. longum). Trong thiết bị lên men thứ nhất, các chủng được cố định tách biệt nhau trên κ-carrageenan / những hạt locust bean gum; thiết bị lên men thứ hai nhận các tế bào tự do từ thiết bị lên men thứ nhất. Bố trí như vậy cho phép sản xuất liên tục những tế bào có nồng độ cao, trong khi tỉ lệ vi khuẩn có thể được kiểm soát bằng nhiệt độ (Doleyres và cộng sự, 2002a, 2004a). Phương pháp sản xuất này cũng cải thiện khả năng chịu đựng những tác động trong các quá trình tiếp sau này (Doleyres và cộng sự, 2004b). Một vấn đề trong việc nuôi cấy canh trường có probiotic trong công nghiệp là tạp chất sinh ra bởi vật ăn vi khuẩn (bacterophages), đặc biệt khi lên men với các sản phẩm sữa nguyên liệu, mà được sử dụng trong ngành công nghiệp bơ. Cho đến năm 1995, bifidobacteria được cho rằng không tác động đối với các phage, Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 22 nhưng Ventura và các đồng sự nhận thấy phage giống những thành phần trong các chủng bifidobacterium (Tamine và cộng sự, 1995; Ventura và cộng sự, 2005). Để ngăn cản tạp chất phage, hai biện pháp được áp dụng: (1) thực hiện luân phiên chủng vi khuẩn, điều bất lợi của biện pháp này là những chủng mới không có cùng những đặc điểm sinh học và những lợi ích về sức khỏe; (2) thêm vào các probiotic chỉ ở bước sản xuất cuối cùng, điều bất lợi của phương pháp này là tỉ lệ nhiễm cao hơn , vì không có sự phát triển của probiotic, và điều này sẽ dẫn đến chi phí sản xuất cao hơn. Do đó, sự kháng lại các phage có thể là một tiêu chuẩn lựa chọn probiotic phù hợp hơn nữa (Mattila – Sandholm và cộng sự, 2002) Hình 7: Quá trình lên men liên tục hai giai đoạn để sản xuất các probiotic thích ứng với stress, với thiết bị phản ứng đầu tiên (R1) thực hiện với tế bào tự do hoặc cố định và thiết bị phản ứng thứ hai (R2) được tiêm những tế bào tự do được sản xuất ở R1. (a) Thiết bị phản ứng R1 thực hiện với tế bào tự do (ở mức độ pha loãng thấp để sản xuất các tế bào ở cuối của pha phát triển theo hệ số mũ); trong hình bên trái chỉ ra ảnh chụp hiển vi của Bifidobacterium longum được sản xuất trong hệ thống này. (b) Thiết bị phản ứng thứ nhất R1 thực hiện với các tế bào cố định ở tỷ lệ pha loãng và mật độ tế bào cao, hình bên trái chỉ ra hình ảnh vi quang của chủng được chọn Lactococcus lactis được cố định trên hạt (1,4.1011 đơn vị /hạt). Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 23 2.2.2 Canh trường tế bào tự do truyền thống Hầu hết các chủng bifidobacteria không thể phát triển trong môi trường tổng hợp hoàn toàn và đòi hỏi những cơ chất giàu nguồn nitrogen như các chất thủy phân casein bò, sữa whey hoặc dịch chiết nấm men (Poch & Bezkorovainy, 1998; Petschow & Talbott, 1990). Sự phát triển của bifidobacteria trong sữa nguyên kem nhìn chung là chậm và khác biệt rất lớn giữa các chủng. Chẳng hạn, B. longum và B. bifidum được sử dụng trong canh trường thuần khiết để sản xuất sữa lên men thì không phát triển trong sữa, trong khi nồng độ tế bào B. aldolescentis tăng lên chỉ 5 lần trong suốt 48h ủ (Samona và cộng sự, 1996). Mặc dù sữa chứa những dưỡng chất thiết yếu cho bifidobacteria, sự phát triển của chúng tương đối chậm vì bị giới hạn nồng độ của các acid amin và các peptide mạch ngắn. Bổ sung dịch chiết nấm men vào sữa, mà chứa các vitamin hòa tan, khoáng, acid amin và peptide cũng như nước cốt MRS (de Man, Rogosa & Sharpe, 1960) cải thiện sự phát triển (Roy, Dussault & Ward, 1990). Thêm vào đó, môi trường dựa trên sữa phải được bổ sung với những cơ chất có khả năng oxy hóa khử thấp như là cysteine hoặc acid ascorbic để giảm khả năng oxy hóa cao của sữa và để đạt được yêu cầu kỵ khí của bifidobacteria (Roy và cộng sự, 1990). Bởi vì những yêu cầu dinh dưỡng và tính cạnh tranh thấp của chúng khi trộn với LAB khác, bifidobacteria thường được nhân giống trong canh trường thuần khiết và cuối cùng mới trộn với những canh trường (Tamine, Marshall & Robinson, 1995). Bảng 6: Dữ liệu sản xuất bifidobacteria trong những hệ thống lên men và điều kiện môi trường khác nhau Trong phương pháp lên men tế bào tự do theo mẻ cổ điển của sữa với canh trường thuần khiết của bifidobacteria có hoặc không có kiểm soát pH, những yếu tố chính giới hạn sự phát triển là sự tích lũy những sản phẩm cuối của quá trình Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 24 trao đổi chất như lactic, acid acetic, và việc tháo xả nước cốt môi trường (Desjardins, Roy, Toupin & Goulet, 1990). Những nghiên cứu về bifidobacteria phát triển trong sữa gầy đã được lọc siêu không có kiểm soát pH cho kết quả sản lượng tế bào tối đa của những chủng khác nhau phổ rộng từ 6,2.108 đến 1,7.109 cfu/ml đối với sữa gầy và từ 2,9.109 đến 3,6.109 cfu/ml đối với sữa gầy cô đặc 5 lần bằng siêu lọc (Ventling & Mistry, 1993). Số lượng tế bào lớn đạt được với lọc siêu được kết hợp với thể tích đệm làm gia tăng thêm do nồng độ cao của protein và các muối không hòa tan, mà vẫn duy trì pH của sữa ở giá trị hỗ trợ sự phát triển bifidobacteria trong thời gian dài. Môi trường dựa trên whey cũng được phát triển để sản xuất bifidobacteria (Core, Madec & Boyaval, 1992). Trong nghiên cứu này, whey được bổ sung thêm acid casamino hoặc dịch chiết nấm men và một chất khử, như acid ascorbic hay cysteine, là môi trường thích hợp cho B. bifidum phát triển trong suốt quá trình lên men theo mẻ không có sự điều chỉnh pH. Tuy nhiên, lượng tế bào tối đa (9.108 cfu/ml) thấp hơn môi trường MRS-cysteine giá trị cao (1,4.109 cfu/ml), trong đó việc nhân giống bifidobacteria được thực hiện trong phòng thí nghệm. Lượng bifidobacteria cao trong môi trường MRS cho kết quả với bốn chủng của B. longum, với nồng độ tế bào tối đa là 3,3; 8,9; 3,7; và 1,3.109 cfu/ml tại pH theo thứ tự là 5.5, 6.0, 6.5 và 7.0 (Reilly và Gilliland, 1999) Việc bổ sung vào môi trường MRS với whey permeate cho thấy sự gia tăng tốc độ phát triển bifidobacteria trong quá trình lên men theo mẻ có kiểm soát pH (Doleyres và cộng sự, 2002b). Whey permeate là phụ phẩm giá trị thấp của ngành công nghiệp bơ, chủ yếu chứa lactose (80 – 85%), khoáng (2.5%) và các hợp chấtchứa nitrogen (2%) trên cơ sở ẩm tự do. Sản lượng rất cao B. bifidum đạt được trong 12h lên men trong môi trường MRS-whey permeate-cysteine, đạt đến 9,0; 17,3; 15,0; và 6,3.109 cfu/ml tại pH tuần tự là 5.0; 5.5; 6.0 và 6.5, so với 8,7.109 cfu/ml trong môi trường cysteine sau 12h lên men ở pH 5.5 (Doleyres và cộng sự, 2002b) Để sản xuất thực phẩm bổ sung probiotic cho người ăn kiêng trong môi trường chi phí thấp, dịch chiết thịt chứa nước cốt thịt MRS thay thế thành công cho môi trường dựa trên peptone đậu nành, glucose và dịch chiết nấm men cho quá trình nhân giống bifidobacteria, mà không ảnh hưởng đến tổng số tế bào tối đa và thời gian ủ (Heenan, Adams, Hosken & Fleet, 2002). Một môi trường rau có chứa 6% nước ép cà rốt, 12% nước ép cải bắp và 3% nước ép hành tây thích hợp cho việc nhân giống B. breve và B. bifidum (Savard, Gardner và Champagne, 2003). Tuy nhiên, việc thất thoát lượng lớn tế bào xảy ra trong suốt quá trình dự trữ của nước ép rau củ đã lên men ở 4oC trong 30 – 60 ngày, do thể tích dịch đệm của môi trường thấp gây hại cho việc acid hóa về sau. Nghiên cứu về số lượng chỉ ra rằng sữa đậu nành hỗ trợ sự phát triển của bifidobacteria nhưng ở mức độ thấp hơn nhiều so với sữa bò hay MRS (Kamaly, 1997; Chou & Hou, 2000; Wang và công sự, 2002). Chẳng hạn, tổng số tế bào B. longum và B. bifidum sau 24h lên men trong sữa đậu nành không kiểm soát pH đạt được tuần tự 5,0.107 và 1,3.108 cfu/ml, trong khi nồng độ cao hơn 3 – 10 lần trong Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 25 sữa hoàn nguyên và MRS (Kamaly, 1997). Tương tự nồng độ tối đa đạt được trong sữa đậu nành sau 48h phát triển của những chủng khác B. infantis và B. longum đạt đến 3,2.108 và 1,3.107 cfu/ml theo thứ tự (Chou & Hou, 2000). Tuy nhiên, Garro, de Valdez và de Giori (2004) cho kết quả rằng nồng độ cao 1,5.109 cfu/ml của B. longum đạt được trong sữa đậu nành sau 8h ủ ở 37oC, chỉ ra những ảnh hưởng chính của việc lựa chọn chủng và thành phần sữa đậu nành. Trong một nghiên cứu để so sánh việc sử dụng đường trong các canh trường B. longum, lên men tế bào tự do theo mẻ và liên tục được thực hiện trong môi trường MRS chứa lactose hoặc glucose như là nguồn carbon (Kim, Song, Kang và Oh, 2003). Nồng độ tế bào cuối sau 22h lên men theo mẻ trên lactose và glucose lần lượt là 4,37 và 3,42 g tế bào khô/l, trong khi nồng độ tế bào B. longum thấp hơn trong quá trình lên men liên tục, trung bình khoảng 2.5 – 3.0 g/l cho tỉ lệ pha loãng (D) phổ rộng từ 0,07 đến 0,33 h–1. Tuy nhiên, tính theo hiệu suất, lên men liên tục cho phép sản lượng là 0,75 – 0,90 gl–1h–1 với D = 0,33 h–1, so với chỉ 0,15 – 0,20 gl–1h–1 trong suốt 22h lên men theo mẻ. Việc gia tăng D lên đến 0,4 h–1, gần với tỉ lệ phát triển đặc hiệu cao nhất của B. longum, kết quả là làm giảm khối lượng tế bào khô xuống khoảng 1,8 g/l, mà vẫn tương đương hiệu suất 0,7 gl–1h–1 (Kim và cộng sự, 2003) 2.2.3 Ảnh hưởng của những tính chất công nghệ đến đặc tính của tế bào Khả năng của vi sinh vật đường ruột phát triển và tồn tại phụ thuộc nhiều vào khả năng thích ứng với sự thay đổi môi trường của nó. Sự thích nghi với môi trường không có lợi thường xuyên kết hợp với sự cảm ứng của số lượng chủng, sự tổng hợp của protein cảm ứng với stress (stress – response) và sự phát triển của hiện tượng đề kháng chéo (cross – resistance) to various stress. Hiện nay các kỹ thuật chủ yếu dựa trên sự nuôi cấy của tế bào tự do trong tình trạng bỏ đói hoặc các điều kiện gây stress khác, ví dụ như nhiệt, nồng độ cao của muối, muối mật, H2O2 hoặc pH thấp. Nó cũng được biết đến như tế bào trong pha tĩnh có khả năng chịu đựng hơn trong môi trường so với tế bào phát triển theo hàm mũ. Tuy nhiên, một nghiên cứu nhỏ đã được biết đến trên khả năng thích nghi stress của bifidobacteria. Sự phản ứng của những chủng bifidobacteria khác nhau với việc tăng nhiệt độ gây chết, muối hoặc xứ lý muối mật bằng cách tổng hợp các protein có tính bảo vệ đặc hiệu chống stress kết quả là khả năng chịu đựng được cải thiện. Ví dụ, gia nhiệt tế bào B. adolescentis tới 47oC trong khoảng thời gian 15 phút trước khi sốc nhiệt lần lượt trong khoảng 10s và 20s. Hơn thế nữa, sự bảo vệ chéo (cross- protection) được chứng minh trong nghiên cứu này sau khi xử lý muối (salt treatment) là kết quả của sự tăng khả năng chịu đựng sau giai đoạn rã đông (frezze – thawing cycles) (14-fold khả năng tồn tại cao hơn với các tế bào khi xứ lý thô với 2% NaCl trong 1h – 14 – fold khả năng sống sót của tế bào cao hơn trước xử lý là 2%...) hoặc stress bằng nhiệt độ gây chết (lethal heat stress) (15-fold khả năng tồn tại cao hơn tại 55oC đã đạt được bằng xứ lý thô với 1.5% NaCl trong 1h). Một số nhà nghiên cứu đã quan sát khả năng thích nghi acid tại pH 5.2 trong 2h Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 26 đã bảo vệ tế bào B. breve chống lại pH gây chết xảy ra sau đó (subsequent lethal pH) (2-5), bile (0.2-1%), H2O2 (100-1000ppm) stress và trong suốt thời gian bảo quản tại những nhiệt độ khác nhau. Pha tĩnh – các chủng bifodobacteria đã được xử lý nhiệt và acid cũng đưa ra các phản hồi về sự thích nghi khác nhau và khả năng bảo vệ chéo trong các thí nghiệm quy mô phòng thí nghiệm (laboratory scale). Sự phản hồi của bảo vệ chéo (nhiệt bảo vệ chống lại pH thấp và pH thấp bảo vệ chống lại bile) được quan sát trong 2 chủng bifidobacteria đã được kiểm tra (B. breve và B. animalis), nhưng ngược lại sự phản hồi khả năng thích nghi (xử lý sơ bộ tại pH 3 -4 bảo vệ chống lại pH 2.5 hoặc xử lý thô tại 47oC bảo vệ chống lại nhiệt độ 55oC) được quan sát chỉ với B. longum. Hơn thế nữa, kết quả tại quy mô phòng thí nghiệm với B. animalis không thể được lặp lại tại thùng lên men (fermented scale), điều này có thể được giải thích vì sự khó khăn trong tìm kiếm điều kiện thích hợp cho các quá trình xử lý thành công của các chủng tại thùng lên men (fermenter scale). Trong một nghiên cứu khác, ứng dụng của các điều kiện stress trong suốt quá trình sản xuất B. longum và B. lactis đem lại kết quả khác trên khả năng chịu lạnh và acid. B. longum thể hiện khả năng chịu lạnh cao, trong khi B. lactis chỉ cho thấy cải thiện về khả năng chịu đựng acid, cho thấy sự phản hồi stress phụ thuộc vào loài và chủng probiotic bifidobacteria phải được lựa chọn cẩn thận cho việc sử dụng trong thực phẩm và bổ sung trong các phần ăn (dietary supplements). Tuy nhiên các điều kiện cho trước hoặc các biện pháp gây stress cũng phải có kết quả trong việc giảm sản lượng tế bào, hoạt động của tế bào và/ hoặc hiệu suất về thể tích của quá trình phụ thuộc vào chủng hoặc loài, pha phát triển và cơ chế bảo vệ gây stress. 2.3 Vi lọc Phương pháp vi lọc để tách các tế bào vi sinh vật. Cấu hình thiết bị membrane dạng sợi rỗng (hollow fiber) được sử dụng phổ biến. Kích thước mao quản membrane thường là 0,1µm hoặc 0,2 µm. Năng suất hoạt động của thiết bị có thể đạt 20000 m3/ngày. 2.3.1 Mô hình sợi (hollow fiber module) Thiết bị membrane được chế tạo bằng thép không rỉ có dạng hình trụ với đường kính thường dao động trong khoảng 2,5÷12,7cm; chiều dài: 18÷120cm. Bên trong thiết bị có chứa sợi membrane. Mỗi module chứa từ 50÷3000 sợi. Đường kính sợi thay đổi từ 0,2÷3mm. Trong quá trình thẩm thấu ngược, đường kính sợi sử dụng có thể giảm xuống 0,04mm. Thông thường chiều dày membrane từ 100÷400µm. Khi hoạt động, canh trường vi sinh vật được bơm vào bên trong thiết bị và chui vào trong các sợi membrane. Dòng ra retentate sẽ đi hết theo chiều dài sợi và tập trung thoát ra ở đầu còn lại của thiết bị. Dòng ra permeate sẽ chui qua các lỗ mao dẫn membrane, thoát ra ngoài sợi rồi được tập trung vể cửa ra nằm trên thân Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 27 thiết bị. Riêng hãng Dupont thiết kế một số thiết bị sử dụng trong kỹ thuật thẩm thấu ngược đã cho dòng nguyên liệu đi vào khoảng không gian trống giữa các sợi membrane. Khi đó, một số cấu tử sẽ chui qua mao dẫn membrane để vào bên trong sợi và tạo nên dòng permeate. Ưu điểm của mô hình sợi là thiết bị ít chiếm diện tích nhà xưởng dù diện tích membrane sử dụng rất lớn, ít tốn năng lượng cho quá trình. Tuy nhiên, trong quá trình vận hành, một số sợi membrane dễ bị tổn thương và việc thay thế chúng sẽ tốn kém và phức tạp. Để hạn chế hiện tượng tắc nghẽn mao quản membrane trong quá trình sử dụng, người ta dùng khí nén để thổi ngược định kỳ, kết hợp với quá trình rửa ngược (backwash) nhằm tách bỏ các cấu tử bám trên bề mặt của membrane. Ngoài ra, sau mỗi 4÷6 tuần sử dụng, người ta dùng hóa chất để vệ sinh membrane. Hình 8: Cấu tạo mô hình sợi Hình 9: Cấu tạo mô hình sợi (A bề mặt, B thành phần theo chiều ngang, C thành phần theo chiều dọc, D nguyên lý lọc) Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 28 2.3.2 Hệ thống thiết bị phản ứng sinh học membrane Trong một hệ thống membrane với việc cung cấp liên tục môi trường sạch, các tế bào được giữ lại trong thiết bị phản ứng sinh học bằng một màng vi lọc hoặc siêu lọc, trong khi các phân tử nhỏ khuếch tán thông qua các lỗ trên membrane theo kích thước của nó. Do đó, trong một thiết bị phản ứng có membrane, những sản phẩm chuyển hóa có tính kiềm hãm quá trình lên men bị loại ra trong dòng permeate, trong khi đó các tế bào được cô lại trong dòng retentate. Phân đoạn tế bào cô đặc có thể được thu gom tốt nhất là theo mẻ hoặc liên tục cùng với việc không hoặc có xử lý lại tối thiểu đối với nồng độ tế bào trước khi làm đông hoặc đông khô. Lượng tế bào B. bifidum (5.109 cfu/ml) và năng suất (2.1011 cfu/lh) cao được thực hiện trên môi trường dựa vào whey là chính và một thiết bị phản ứng có membrane (Corre và cộng sự, 1992). Taniguchi và cộng sự (1987) cũng đã đưa ra kết quả về nồng độ cuối B. longum cao hơn 7 lần khi thực hiện trong thiết bị phản ứng có membrane so với kết quả đạt được khi lên men tế bào tự do theo mẻ. Tuy nhiên, một giới hạn quan trọng của thiết bị membrane và việc tái sử dụng tế bào có thể xảy ra là những tế bào không ở trong tình trạng độ nhớt cao làm giảm hoạt tính chuyển hóa, điều này được cho là gây stress đột ngột bởi những tế bào trong suốt quá trình bơm qua màng membrane (Bibal, Vayssier, Goma và Parceilleux, 1991). Thêm vào đó, việc ứng dụng thiết bị phản ứng có membrane bị hạn chế vì chi phí đầu tư cao, bảo dưỡng thiết bị và tắc nghẽn màng (Tejayadi và Cheryan, 1995; Musale và Kulkarni, 1998) Hình 10: Thiết bị phản ứng sinh học có màng membrane 2.4 Rửa và bổ sung phụ gia Canh trường sau khi qua hệ thống vi lọc thì đem rửa với nước nguyên liệu đồng thời bổ sung phụ gia chủ yếu là phụ gia chống đông. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 29 Bảng 7: Một số phụ gia chống đông có thể được sử dụng Adonitol Bột sữa gầy α-tocopherol Maltodextrin β-glycerophosphate Dịch chiết malt Bovinine albumin Mannitol Calcium alginate Chất béo sữa Calcium carbonate m-Inositol Casein hydrosylate Na-alginate Carnithine Na-glutamate Dextran Pectin Dimethylsulphoxide Polyethylenglycol Gelatine Sucrose Glucose Sorbitol Glycerol Trehalose Glycogen Tween Lactose Xathangum L – acid ascorbic Dịch chiết nấm men L – asparigine Bột whey L – cysteine 2.5 Hình thành sản phẩm 2.5.1 Môi trường dạng lỏng Chỉ sử dụng trực tiếp và dự trữ trong thời gian ngắn. Sau khi rửa và bổ sung phụ gia (hoặc không cần bổ sung) đem vào sản xuất ngay, thường bổ sung ở quá trình phối trộn trong các quy trình sản xuất sản phấm có chứa probiotic. 2.5.2 Môi trường dạng lạnh đông • Freeze – drying đã được sử dụng để sản xuất probitic dạng bột qua nhiều thập niên, dựa trên cơ sở của sự thăng hoa, xảy ra ba giai đoạn: freezing, primary và secondary drying. Tế bào được làm lạnh ở –1960C, sau đó sấy thăng hoa dưới áp suất chân không (Santivarangkna, Kulozik, & Foerst, 2007). Do điều kiện nhẹ nhàng hơn spray – drying nên tỷ lệ sống sót của probiotic cao hơn trong freeze-dried powders • Trong quá trình làm lạnh tế bào sẽ bị vô hoạt (Tsvetkov & Brankova, 1983). To và Etzel (1997) đã chứng minh rằng 60 – 70% tế bào sống sót qua bước làm lạnh sẽ vượt qua được giai đoạn dehydrate hóa. Trong suốt quá trình làm lạnh, sự hình thành lớp băng ngoài tế bào làm tăng hơn áp suất thẩm thấu và tế bào bắt đầu mất nước. Nồng độ dung dịch nội bào và ngoại bào sẽ tăng lên khi nhiệt độ giảm dưới điểm eutectic. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 30 • Có hai cách thức làm lạnh là làm lạnh chậm và làm lạnh nhanh. o Làm lạnh chậm, quá trình khử nước tế bào diễn ra từ từ khi sự đóng băng xảy ra chậm ngoài tế bào ảnh hưởng lớn đến tế bào. o Làm lạnh nhanh có thể tránh ảnh hưởng đến chất tan và sự co tế bào quá mức (Fowler & Toner, 2005). • Các báo cáo cũng chỉ ra rằng diện tích màng tế bào càng lớn thì càng nguy hiểm hơn khi hình thành tinh thể băng bên ngoài tế bào trong quá trình làm lạnh (Fonseca, Beal, & Corrieu, 2000). Do đó, kích thước tế bào có ảnh hưởng lớn đến sự tồn tại probiotic trong freeze – drying, với tế bào hình cầu có kích thước nhỏ chống chịu freezing và freeze-drying tốt hơn tế bào hình que có kích thước lớn hơn (Fonseca và cộng sự., 2000). • Nước mất đi từ tế bào vi khuẩn trong quá trình sấy sẽ gây hư hại bề mặt protein, thành tế bào, màng tế bào. Nước tại bề mặt có vai trò quan trọng trong việc tạo ổn định cấu trúc và nguyên vẹn các chức năng của đại phân tử vi sinh. Do đó, nước mất đi trong sấy khô có thể làm mất sự ổn định cấu trúc, tính toàn vẹn các thành phần tế bào làm giảm hoặc mất đi các chức năng (Brennan, Wanismail, Johnson, & Ray, 1986). Người ta dự đoán rằng trong quá trình sấy vị trí các phân tử lipid trên màng tế bào là nơi chịu ảnh hưởng lớn nhất do các phân tử lipid rất dễ bị oxy hóa. Thêm vào đó, cấu trúc của RNA và DNA mất ổn định, dẫn tới giảm hiệu quả sự sao chép của DNA, phiên mã, giải mã. Vì thế, để đạt được kết quả tốt nhất trong việc làm khô probiotic, phải tập trung chú ý đến phương pháp để giảm đến mức tối thiểu hư hại thành phần tế bào. • Sản phẩm thương mại từ canh trường freeze-dried là kết quả của quá trình tốn kém nhiều chi phí nhưng thu lợi thấp. 2.5.3 Môi trường sấy khô • Quá trình sấy phun đòi hỏi sự phun với tốc độ cao tại nhiệt độ trên 2000C, mà sau đó luồng hơi xuyên qua bộ phận tạo thành dạng bột. Do đó kết quả của quá trình này dễ nhận thấy rằng: trong môi trường sấy ở nhiệt độ cao với thời gian ngắn, nó có thể bất lợi tế bào vi khuẩn sống. • Trong quá trình sấy phun, tế bào vi khuẩn chịu tác dụng của nhiệt, sự mất nước, áp suất thẩm thấu,... (Brennan et al., 1986; Teixeira, Castro, Mohacsi- Farkas, & Kirby, 1997). Sấy phun có thể làm màng tế bào bị biến đổi, và có thể làm lọt vài thành phần nội bào từ tế bào ra môi trường xung quanh (Teixeira, Castro, & Kirby, 1995a). Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 31 • Màng tế bào chất là phần nhạy cảm nhất trong tế bào vi khuẩn khi sấy phun, trong khi đó thành tế bào, DNA và ARN cũng dễ bị ảnh hưởng, giảm hoạt động trao đổi chất. Việc mất đi các liên kết hydro với nước, làm gia tăng liên kết nội phân tử các nhóm phospholipid và xúc tiến các liên kết đóng vòng. Thành phần lipid có thể bị chuyển từ trạng thái lamellar (màng mỏng) sang trạng thái gel phase (khối bán rắn), có thể xem như là sự dehydrate lamellar phase trong đó các chuỗi trở nên cứng và mở rộng hoàn toàn. Hơn nữa, các phân tử phospholipid sẽ có sự biến đổi lớn từ dạng lamellar sang dạng hexagonal phase ngay khi nước mất đi (Crowe et al., 1988; Leslie, Israeli, Lighthart, Crowe, & Crowe, 1995). Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 32 3. Tiêu chuẩn chất lượng Bảng 8: Những tiêu chuẩn mong muốn và then chốt trong việc lựa chọn những probiotic trong ứng dụng thương mại (Trích từ Shah, 2006 ; Morelli, 2007) Tổng quát Tính chất Nguồn gốc Không sở hữu mầm bệnh và sự lây nhiễm Tiêu chuẩn an toàn Không có các thành phần độc hại – chất độc, hoạt tính trao đổi, đặc tính bên trong, nghĩa là kháng antibiotic Những chủng bền vững về hệ gen Khả năng sống sót mong muốn trong suốt quá trình chế biến và dự trữ. Những đặc tính cảm quan tốt. Kháng lại các phage. Tiêu chuẩn kỹ thuật Ứng dụng sản xuất trên quy mô lớn. Chịu đựng được acid trong dạ dày và dịch vị. Chịu đựng được mật. Khả năng bám chặt vào bề mặt niêm mạc, màng nhầy. Tiêu chuẩn chức năng Ảnh hưởng tốt đến sức khỏe. Khả năng miễn dịch Hoạt tính đối kháng với những chất độc trong ruột như là Helicobacter pylori, Candida albicans. Chuyển hóa cholesterol. Chuyển hóa lactose. Tiêu chuẩn sinh lý học mong muốn Những đặc tính chống đột biến và chống ung thư. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 33 4. Thành tựu công nghệ 4.1 Đánh giá chủng Bifidobacterium spp trong việc sản xuất các probiotic tiềm năng trên môi trường đồ uống malt-base 4.1.1 Giới thiệu Chất thủy phân malt, mà bắt chước thành phần của cái được sản xuất trong nhà máy bia bắng phương pháp pha trộn, được đánh giá là cơ chất tiềm năng cho việc lên men bifidobacteria nhằm mục đích sản xuất một thức uống có bổ sung probiotic đầy tiềm năng. Những thử nghiệm ban đầu chỉ ra nhu cầu bổ sung các chất hỗ trợ sự phát triển đối với các chất thủy phân malt, và dịch chiết nấm men có nồng độ 10 gl–1 được chọn. Sự phát triển của bốn chủng Bifidobacterium spp trong chất thủy phân malt với 10 gl–1 dịch chiết nấm men được theo dõi trong 24h ở nhiệt độ 37oC. Kết quả thu được chỉ ra rằng có sự gia tăng số lượng vi khuẩn giữa 1.5 và 2.0 log10 với tỷ lệ phát triển tối đa khoảng 0.2 h–1. Lượng lớn đường và các amino nitrogen tự do vẫn còn hiện diện ở đầu pha tĩnh của quá trình phát triển. Kết thúc pha mũ được cho là giai đoạn tích tụ các chất trao đổi gây độc kết hợp với pH giảm xuống. Nấu malt là quá trình bảy mầm có kiểm soát của lúa, thóc. Nó co thể áp dụng cho bất kỳ ngũ cốc nào, nhưng barley là ngũ cốc được sử dụng nhiều nhất cho việc nấu malt. Trong suốt quá trình malt hóa, hạt bị thủy phân và giải phóng các hormone mà kích thích việc tiết các enzyme thủy phân bao gồm, amylase, pentosanase, glucanase, và proteinase. Những enzyme này chịu trách nhiệm cho việc phá việc phá vỡ những phân tử lớn trong hạt, điển hình là tinh bột, β-glucan, arabinoxylan và các protein. Sau khi hạt đã đạt được sự thay đổi tối ưu về mặt hóa sinh thì sau đó được sấy khô để ngừng quá trình nảy mầm và đem lại những đặc tính về màu và mùi. Mặc dù malt được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, nấu bia và chưng cất là những hướng sử dụng chính của malt. Sản xuất thức uống dựa trên malt là ý tưởng mới lạ có thể mở ra cơ hội mới cho ngành công nghiệp malt và bia. Nhiều nỗ lực đã được thực hiện để sản xuất thức uống từ malt sử dụng công nghệ nấu malt hiện nay, nhưng trong những trường hợp này, việc lên men được thực hiện với vi khuẩn acid lactic hơn là với bifidobacteria. Mục tiêu của nghiên cứu này là nhằm đạt được môi trường từ malt nhằm hỗ trợ sự phát triển của các chủng bifidobacterium và đạt được các thông số động lực đặc trưng cho sự phát triển này. Những đặc tính lên men khác như sự tiêu thụ các chất dinh dưỡng và việc sản suất các acid hữu cơ được được đánh giá. 4.1.2 Hệ vi sinh vật Bốn chủng được sử dụng trong nghiên cứu này đều có nguồn gốc từ con người: Bifidobacterium adolescentis NCIMB 702204 (ruột người lớn), B. infantis NCIMN 702205 (ruột trẻ vị thành niên), B. breve NCIMB 702257 (ruột trẻ vị thành niên) và B. longum NCIMB 702259 (ruột người lớn). Tất cả chúng đều được lấy từ The National Collection of Industrial and Marine Bacteria (Aberdeen, Scotland). Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 34 4.1.3 Chuẩn bị giống Ống đông lạnh đem làm tan chảy thành 20ml Reinforced Clostridial Medium (Oxoid) và được ủ ở 37oC trong 24 – 36h. Giống vi sinh vât được nuôi cấy nhân giống trong Reinforced Clostridial Medium (RCM) hoặc chất thủy phân dịch chiết nấm men và dịch chiết malt trong 16 – 24h. 4.1.4 Lên men 134 g/l malt sấy khô (Muntons plc.) được hòa tan trong nước cất cùng với các chất hỗ trợ sự phát triển thiết yếu (dịch chiết nấm men hay peptone) tiệt trùng ở 121oC, áp suất 1 bar trong 20 phút. pH canh chỉnh khoảng 6.7 sau khi ly tâm. Môi trường được ủ với 1% v/v chủng và lên men thực hiện trong 24h ở 37oC. 4.1.5 Các phương pháp phân tích • Đếm số tế bào: sự phát triển của vi khuẩn được theo dõi thông qua mật độ quang tại 600 nm hoặc đếm tế bào nhìn thấy được. • Phân tích hóa học: nồng độ của đường (fructose, glucose, maltose và maltotriose) và những acid hữu cơ (lactic, acetic, acid formic) trong mẫu được phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Amino nitrogen tự do được phân tích bằng phương pháp cột ninhydrin và pH được đo bằng máy đo pH hiệu Jenway đã được hiệu chỉnh bằng dung dịch chuẩn (Fisher) ở pH 4.0 và 7.0. • Phân tích thống kê: sử dụng hàm Microsoft Excel. 4.1.6 Kết quả • Sự phát triển của môi trường thích hợp cho lên men o Ảnh hưởng của sự canh chỉnh pH lên sự phát triển của các chủng Bifidobacterium trong chất thủy phân malt. o Ảnh hưởng của việc bổ sung các chất hỗ trợ phát triển. • Những đặc điểm phát triển và lên men. o Thông số động lực lên men. Bảng 9: Các thông số động lực cho sự phát triển của Bifidobacteria spp o Sản sinh đường và amino nitrogen tự do. o pH và sự sản sinh acid hữu cơ Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 35 4.2 Đánh giá tính an toàn của probiotic bifidobacteria bằng cách phân tích hoạt tính thủy phân mucin và khả năng chuyển vị. 4.2.1 Giới thiệu Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra những ảnh hưởng tích cực của bifidobacteria đến sức khỏe con người. Bây giờ bifidobacteria được biết đến như là một trong những vi khuẩn có lợi nhất và được sử dụng trên toàn cầu như là các probiotic trong nhiều sản phầm thực phẩm bao gồm yogurt, sữa, sữa bột trẻ em, bơ và thực phẩm ăn kiêng. Cùng với đó, một số chủng bifidobacteria bao gồm bifidobacterium longum BB536 được sử dụng ở Nhật Bản như thành phần chức năng trong sản phẩm được nghiên cứu như là Food for Specified Health Uses (FOSHU) Mặt khác, vấn đề tính an toàn của các probiotic đã được nghiên cứu. Snydman liệt kê ba khái niệm lý thuyết để đánh giá tính an toàn của probiotic: sự xuất hiện bệnh tật, độc tố hoặc hiệu quả chuyển hóa trong đường ruột, và chuyển đổi tính kháng antibiotic trong hệ thực vật đường ruột. Những báo cáo ở trên thúc đẩy nhu cầu nghiên cứu không chỉ ảnh hưởng có lợi mà còn tính an toàn của probiotic đối với sức khỏe con người. Cụ thể, những tiềm tàng gây ra bệnh tật như tình trạng nhiễm trùng huyết, viêm màng trong tim và sự nhiễm trùng được cho là những nguy hiểm tiềm tàng của probiotic, bởi vì, một số các nhà điều tra báo cáo về chũng Lactobacillus, được phân lập từ những mẫu máu, không thể phân biệt được từ chủng probiotic, được hấp thụ bởi bệnh nhân, chỉ ra khả năng chuyển vị vi khuẩn của những chủng probiotic. Nhiều nghiên cứu lâm sàng đã nghiên cứu những ảnh hưởng khác nhau của những chủng B. longum BB536 và B. breve M-16V trên sức khỏe con người và không có trường hợp nguy hại nào. Puccio và cộng sự, và Chouraqui và cộng sự tiến hành bổ sung vào sữa bột trẻ em với B. longum BB536 và đánh giá tính an toàn và khả năng chịu đựng, cả hai nghiên cứu đều xác nhận rằng công thức bột chỉ ra không có ảnh hưởng có hại. Li và cộng sự; Fujii và cộng sự thực hiện nghiên cứu B. breve M-16V đối với những đứa trẻ sinh non nhẹ cân. Họ xác nhận rằng hiệu quả của chủng này trong việc hình thành hệ vi sinh vật đường ruột có lợi và quan sát thấy được không có những thành phần bất lợi. Hơn nữa, B. longum BB536 đã được sử dụng như là thành phần probiotic đối với sản phẩm sữa và yogurt probiotic từ ăm 1977 ở Nhật Bản, mà không có bất kỳ báo cáo nào về hệ quả bất lợi trong suốt hơn 30 năm qua về việc sử dụng như là sản phẩm thương mại. Từ những thông tin trên, người ta cho rằng cả hai chủng B. longum BB536 và B. breve M-16V đều an toàn không chỉ đối với người lớn mà còn cả trẻ vị thành niên. Tuy nhiên, mặc dù đã có nhiều nghiên cứu lâm sàng và lịch sử sử dụng lâu dài, những nghiên cứu căn bản đối với việc đánh giá là quan trọng để đảm bảo rằng những chủng probiotic không có nguy hiểm tiềm tàng nào. Mục đích ban đầu của nghiên cứu nàu là để đánh giá tính an toàn của B. longum BB536 và B. breve M-16V, mà đã được nghiên cứu những ảnh hưởng lâm sàng của chúng, bằng việc điều khiển những thí nghiệm thủy phân mucin trong Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 36 ống nghiệm (in vitro) và thí nghiệm chuyển vị trong cơ thể (in vivo) những động vật truyền thống. Cũng vậy, xem xét tính an toàn của chủng B. infantis M-63 được sử dụng như là chủng thí nghiệm phụ trong những thí nghiệm kiểm định tính an toàn. 4.2.2 Những chủng bifidobacteria Ba chủng bifidobacteria bao gồm B. longum subsp. longum BB536 (B. longum BB536), Bifidobacterium breve M-16V và B. longum subsp. infantis M-63 (B. infantis M-63) được sử dụng. 4.2.3 Những thí nghiệm thủy phân mucin Hoạt tính mucinolytic được kiểm tra bằng cách sử dụng ba thí nghiệm: phát triển trong môi trường lỏng, phân tích SDS-PAGE các gốc mucin bị thủy phân, và phân tích thủy phân trong đĩa Petri, theo những báo cáo trước đây với những điều chỉnh nhẹ. Trong tất cả các thí nghiệm thủy phân mucin, mucin dạ dày lợn (HGM) được tinh sạch từng phần từ một nguồn thương mại (loại III, Sigma-Aldrich, Inc., MO, Mỹ) được sử dụng sau khi tinh sạch. Mẫu phân thu được từ người lớn khỏe mạnh và mẫu phân được tiệt trùng (121oC, 20 phút) được sử dụng như kiểm soát dương tính và âm tính, theo tuần tự. SDS, amido black, acid acetic, và những thuốc thử khác được mua từ Wako Pure Chemical Industry Ltd, Osaka, Nhật Bản. Một cách ngắn gọn, 100µl canh trường MRS được ủ trong 10ml môi trường cơ sở chứa 0.3% HGM có hoặc không có 1% glucose, và được cấy ở 37oC trong 48h trong điều kiện kỵ khí (Anaero Pack). Thành phần môi trường cơ sở là 1g BactoTM peptone (Becton Dickinson, NJ, Mỹ), 1g TrypticaseTM Peptone (Becton Dickinson, NJ, Mỹ), 2g dịch chiết nấm men (Becton Dickinson, NJ, Mỹ), 0.1g L-cysteine-HCl, 4ml dung dịch khoáng-1 (0.78% dung dịch K2HPO4), 4ml dung dịch khoáng-2 (0.47% KH2PO4, 1.18% NaCl, 1.2% (NH4)2SO4, 0.12% CaCl2, 0.25% MgSO4.H2O), 3ml dung dịch Fildes (dung dịch máu bộ máy tiêu hóa) và 189ml nước cất. Dung dịch Fildes thường được sử dụng như là một thành phần cho canh trường vi khuẩn kỵ khí liên quan đến hệ vi sinh vật đường ruột. Sau khi ủ, sự phát triển của vi khuẩn được định mức bằng cách đo sự hấp thụ tại 600nm (Hitachi Spectrophotometer; Hitachi High-Technologies Co., Tokyo, Nhật Bản) và pH của canh trường vi sinh vật. Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần. Canh trường môi trường cơ sở của mỗi chủng được sử dungtrong SDS- PAGE. Cuối quá trình ủ,10 ml canh trường được ly tâm (10000 g, 4oC, 30 phút) để đạt được chất lỏng tế bào tự do nổi trên bề mặt. Chất lỏng được trộn với 15 ml ethanol tinh luyện 99% và ly tâm lại (10000 g, 4oC, 30 phút). Pellet được thu gom và hòa trong 6ml 0.1M NaCl. Kết tủa ethanol và ly tâm lại được lặp lại hai lần để tinh sạch mucin. Cuối cùng pellet được đình chỉ lại với 0.5ml dung dịch đệm Tris- HCl 10mM và được sử dụng như mẫu SDS-PAGE. Để biểu thị bất kỳ sự thay đổi nào trong thành phần của mucin sau khi ủ trong môi trường lỏng, phần điện Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 37 chuyển của những mẫu mucin bị kết tủa bởi ethanol được phân tích bằng SDS- PAGE sử dụng 12.5% polyacrylamide như gel phân chia. Những gel bị bẩn với Coomassie blue (Bio-SafeTM Coomassie, Bio-Rad Laboratories, Inc., Mỹ), cho phần protein, và với cả Coomassie blue và PAS stain (GelCode® Glycoprotein Staining Kit, Thermo Scientific, IL, Mỹ) cho phần glycoprotein. Thí nghiệm thủy phân mucin trong một đĩa Petri được thực hiện theo báo cáo trước đây. Một cách ngắn gọn, môi trường đĩa thạch được chuẩn bị từ môi trường cơ sở bổ sung thêm 1.5% agar (Becton Dickinson, NJ, Mỹ), 0.3% HGM, có hoặc không có 1% glucose được sử dụng trong thí nghiệm. 10µl môi trường MRS được ủ trên bề mặt của miếng thạch trên đĩa Petri. Những đĩa này được ủ ở 37oC kỵ khí trong 72h và sau đó nhuộm với 0.1% amido black trong 3.5M acid acetic torng 30 phút và sau đó rửa với 1.2M acid acetic. Vùng tiêu hóa mucin (vùng không màu) xung quanh ruột được quan sát. 4.2.4 Thí nghiệm chuyển vị Khả năng chuyển vị vi khuẩn của B. longum BB536 được quyết định khi sử dụng những con chuột 4 tuần tuổi (BALB/cAnNCrlCrlj, SPF). 5 con chuột đực và 5 con chuột cái mội loại được chia thành nhóm thí nghiệm và nhóm kiểm chứng. Mỗi nhóm có 5 con chuột được nhốt trong một chuồng bằng thép không rỉ trong môi trường kiểm soát (nhiệt độ 20 – 24oC, độ ẩm 45 – 75%) với chu trình 12h sáng tối, và được tiếp cận tự do với thức ăn viên đã được tiệt trùng (Funabashi Farm Co., Ltd., Chiba, Nhật Bản) và nước trong suốt thời gian thí nghiệm. Sau 7 ngày thay đổi điều kiện thích nghi, bột bifidobacteria hòa vào dung dịch muối được cung cấp cho chuột. Những con vật thí nghiệm được cung cấp B. longum BB536 9,3.1011 cfu/kg/ngày bằng miệng thông qua ống thực quản một lần một ngày trong 7 ngày. Những con chuột trong nhóm kiểm chứng được cung cấp dung dịch tinh bột khoai tây thay vì bột bifidobacteria. Quan sát những dấu hiệu chungh và đo khối lượng cơ thể được điều khiển trong suốt quá trình thí nghiệm. Vào ngày thứ tám, một ngày sau ngày cung cấp thức ăn cuối cùng, tất cả chuột đều chết sau khi máu được rút từ tim bằng cách gây mê. Sau khi quan sát chung về tất cả sự khác thường trong những cơ quan và các mô, gan, lá lách, thận, ruột hồi, ruột và mấu bạch huyết ở màng treo ruột được thu gom trong điều kiện sinh vật học sạch đối với phép phân tích chuyển vị vi khuẩn và kiểm tra mô bệnh học. Đối với phân tích chuyển vị vi khuẩn, mỗi cơ quan được băm nhỏ bằng dao mổ tiệt trùng và các mô được băm nhỏ thì được trải trên những đĩa agar BL (Nissui Co., Ltd, Tokyo, Nhật Bản) được sử dụng cho việc phân tích hệ vi sinh vật đường ruột. Đối với máu, 0.2 ml máu được rải trên đĩa agar BL. Những đĩa agar được ủ ở 37oC trong 72h trong điều kiện kỵ khí sử dụng Anaero Pack. Đối với việc xác định mô huyết học, những phần paraffin của ruột hồi và ruột được chuẩn bị được nhuộm để quan sát trên kính hiển vi. Đối với ruột kết, chiều cao lông nhung (từ đỉnh xuống đáy), chiều sâu đáy (từ vùng mở đến đáy) và chiều dày niêm mạc ( đỉnh của lông nhung đến cơ niêm mạc) được đo bằng kính hiển vi. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 38 Đối với ruột, chiều dày niêm mạc (bề mặt niêm mạc đến cơ niêm mạc) và hiều cao tế bào biểu mô (từ dỉnh đến màng cơ sở)được quan sát. 4.2.5 Phân tích thống kê Đối với các dữ liệu số (bao gồm chiều cao cơ thề, chiều cao lông nhung, chiều sâu hầm, chiều dày niêm mạc) trong những thí nghiệm trên động vật, kiểm nghiệm Student’s t được sử dụng để so sánh những khác biệt trong mức ý nghĩa giữa nhóm thí nghiệm và nhóm kiểm chứng. 4.2.6 Kết quả 4.2.6.1 Thí nghiệm thủy phân mucin Vi khuẩn phát triển sau khi nuôi cấy trong bốn loại môi trường, các môi trường cơ sở (không có nguồn carbon), các môi trường cơ sở với chất nhầy như là nguồn carbon duy nhất, các môi trường cơ sở với glucose và các môi trường cơ sở với glucose và chất nhầy như là nguồn carbon được kiểm tra bằng đo phát xạ tại 600nm (OD600nm) và giá trị pH. Ở đây không có sự khác biệt lớn trong OD600nm và giá trị pH giữa chủng mẫu và chủng thí nghiệm của mỗi loài Bifidobacteria trong mỗi môi trường nuôi cấy, mặc dù có vài sự khác nhau giữa các loài. Tất cả các chủng Bifidobacteria cho thấy OD600nm cao hơn trong các môi trường có bổ sung glucose hoặc glucose và mucin so với trong các môi trường chỉ có mucin hoặc môi trường cơ sở, trong khi đó fecal culture cho thấy giá trị OD600nm cao trong toàn bộ môi trường. Cũng như vậy, OD600nm của các môi trường cơ sở với mucin trong hầu hết canh trường Bifidobacteria không cao hơn so OD600nm trong môi trường cơ sở. Mặc dù chỉ giống B.infantis M-63 trong môi trường cơ sở với mucin cho thấy OD600nm khá cao hơn, giá trị đó vẫn thấp hơn so với canh trường bổ sung glucose hoặc vi sinh vật của mẫu phân. Giá trị pH của mỗi canh trường ảnh hưởng đến kết quả của OD600nm. Với tất cả các chủng thí nghiệm, không có sự khác nhau trong giá trị pH giữa các môi trường cơ sở (6.17 +- 0.10) và các môi trường có glucose (6.16+-0.16) và giá trị pH của những canh trường này cao hơn so với giá trị pH của các môi trường với glucose (3.89+-0.10) và các môi trường có glucose và mucin (3.9+-0.11) sau 48 giờ nuôi cấy. Tất cả những kết quả trên với các chủng thí nghiệm hầu như là tương tự với các giá trị của những chủng mẫu trong thí nghiệm này. Các gốc mucin trong các canh trường nuôi cấy Bifidobacteria trong các môi trường cơ sở với chất nhầy được phân tích SDS-PAGE được nhuộm với Coomassie cho các bã protein và tiếp theo đó bằng thuốc nhuộm PAS cho các bã glycoprotein. Mặc dù SDS-PAGE của fecal culture mang lại phần mucin bị thủy phân, được quan sát như phần còn lại của các kích thước đa dạng, bằng cả 2 phương pháp nhuộm màu, môi trường phân được tiệt trùng và tất cả các canh trường bifidobacteria (các chủng mẫu và chủng thí nghiệm) cho thấy không có thành phần thủy phân trong cả 2 keo nhuộm. Những sự quan sát cho thấy rằng Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 39 tất cả các chủng Bifidobacteria được kiểm tra không có hoạt động làm giảm chất nhầy, ngược lại đối với vi sinh vật trong phân. Hơn thế nữa, nghiên cứu sự thủy phân mucin đã được thực hiện trong đĩa Petri. Sử dụng các môi trường đặc (agar medium) với chỉ chất nhầy như nguồn carbon, chí fecal sample thành cụm (formed colony) với vùng tiêu hóa (lysis zone) xung quanh cụm, trong khi mẫu tiệt trùng và tất cả các chủng Bifidobacteria (cả chủng mẫu và chủng thí nghiệm) không thành cụm (formed no colony) và không có vùng tiêu hóa quanh các điểm nuôi cấy. Sử dụng các môi trường đặc có chứa cả glucose và chất nhầy, tất cả các chủng Bifidobacteria cho thấy colonie, nhưng không tạo ra được vùng tiêu hóa xung quanh các cụm. Cũng như vậy. không vùng tiêu hóa xung quanh cụm được quan sát trong fecal culture trên môi trường với mucin và glucose. 4.2.6.2 Thí nghiệm translocation. Một con thú chết trong nhóm được kiểm tra trên ngày thứ 5 của thí nghiệm translocation bacterial. Nguyên nhân của cái chết được cho là do quản lý không đúng cách (incorrect administration) bởi vì chỗ hõm ở thực quản, reddened lung và bã thực phẩm trong ngực (thorax) được quan sát trong suốt quá trình kiểm tra tử thi. Không có cái chết và không có các dấu hiệu khác thường được quan sát trong tất cả các con chuột còn lại trong suốt thời gian thí nghiệm. Trong sự quan sát khối lượng cơ thể, ở đây không có sự khác nhau một cách đáng kể giữa nhóm B.longum BB536 (22.1+-0.7g cho con đực và 19.0+-1.1g cho con cái) và nhóm được kiểm soát (control group – nhóm mẫu) (23.1+-1.3g cho con đực và 18.9+-1.1g cho con cái) tại thời điểm kết thúc thí nghiệm. Trong quá trình phân tích translocation của vi khuẩn sau khi administration của B.longum BB536 trong 7 ngày, không có vi khuẩn và không bifidobacteria được quan sát trong tất cả các cơ quan và bao gồm cả máu, gan, cật, lá lách, mấu bạch huyết ở mang treo ruột trong cả nhóm B.longum BB536 và nhóm mẫu (control group). Phổ hình thái của cấu trúc niêm mạc trong ruột hồi, manh tràng và ruột kết cũng được biểu diễn. Trong ruột hồi, không có sự khác nhau một cách đáng kể trong chiều cao các lông tơ (188.4+-31.1 Mm với 183.7+- 25.2Mm), độ sâu các khe (108.4 +- 15.4Mm với 97.1+-14.6Mm), bề dày lớp niêm mạc (305.0+-31.7Mm với 289.2+-34.2Mm) và chiều cao mô tế bào (19.6+-2.0Mn với 20.9+-2.0Mn) giữa nhóm B.longum và nhóm mẫu. Trong manh tràng và ruột kết không có sự khác nhau đáng kể trong bề dày lớp niêm mạc và chiều cao mô tế bào được quan sát giữa các nhóm. Những sự quan sát cho thấy rằng chủng B.longum BB536 được quản lý (administered) đã không gây ra các nguy hiểm trong vùng ruột non. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 40 5. Phụ lục 5.1 Tác dụng của probiotic đối với sức khỏe con người 5.1.1 Thuỷ phân lactose, tăng sự hấp thu lactose − Suốt quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh enzyme lactase thủy phân lactose thành glucose và galactose. − Các vi khuẩn đường ruột giúp chuyển hoá hầu hết lượng lactose không được hấp thu ở ruột non. 5.1.2 Làm giảm một số bệnh đường tiêu hoá − Bệnh ung loét: + Bệnh loét trong hệ thống tiêu hoá (do vi khuẩn Helicobacter Pylori gây ra) có liên quan đến chế độ ăn uống hàng ngày do ít sử dụng các sản phẩm sữa lên men và rau quả, sử dụng quá nhiều sữa, thịt, tinh bột. + Vi khuẩn lactic có thể ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh và làm giảm hoạt tính của enzyme urease – enzyme cần thiết cho các vi sinh vật gây bệnh lưu trú trong môi trường acid của dạ dày. − Bệnh tiêu chảy do vi sinh vật + Kích thích hệ thống miễn dịch tăng lên hơn nữa đáp ứng miễn dịch IgA đặc hiệu chống lại sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh. + Ngăn chặn sự bám chặt và phát triển của các vi sinh vật gây bệnh đường ruột như Samonella, E.coli, Shingela. 5.1.3 Tác dụng ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh − Sinh các acid acetic, acid lactic, và các acid hữu cơ khác, làm giảm pH môi trường ảnh hưởng bất lợi đối với một số vi sinh vật nhạy cảm với tính acid. − Sinh các chất kháng sinh tự nhiên (Bacteriocin) + Bacteriocin là các peptide, polypeptide, protein hoặc là những chất ít mang cấu trúc gen của protein và được cấu tạo từ các amino acid, cũng có thể bao gồm các amino acid hiếm như lanthionine hay beta-methyllanthionine. + Bacteriocin của các vi khuẩn lactic được chia làm 4 nhóm sau: ▫ Nhóm 1 chứa lanthibiotic: đây là những peptic nhỏ và có khả năng chịu nhiệt, chứa amino acid như lanthionine. ▫ Nhóm 2 chia thành 3 nhóm nhỏ trong đó nhóm 2a thường gặp nhất bao gồm các bacteriocin như pediocin có khả năng chống Listeria. ▫ Nhóm 3 là những nhóm protein không bền nhiệt. ▫ Nhóm 4 là phức hợp của protein, lipid và glucid. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 41 − Tranh giành nơi cư trú, tranh giành chất dinh dưỡng, ngăn chặn sự bám chặt và phát triển của các vi sinh vật gây bênh. − Tạo ra những cản trở không gian ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh. 5.1.4 Chống dị ứng thức ăn. 5.1.4.1 Một phương pháp phòng chống dị ứng thức ăn là điều chỉnh hệ vi sinh vật đặc biệt là hệ vi sinh vật đường ruột, vì đây là nguồn vi sinh vật chính kích thích hệ thống miễn dịch. 5.1.4.2 Qua các nghiên cứu, người ta thấy rằng ở những người ít bị dị ứng số lượng vi khuẩn Lactobacilli nhiều hơn và Clostridia ít hơn so với ở những người thường bị dị ứng. 5.1.5 Tổng hợp một số vitamin: 5.1.5.1 Các vi khuẩn đường ruột có khả năng sinh nhiều vitamin khác nhau. Việc hấp thu các vitamin trong đường ruột khá kém, do đó việc các vi khuẩn có khả năng sinh vitamin rất quan trọng. Các vi khuẩn này sinh tất cả các loại vitamin B (folic acid, niacin, riboflavin, B12, B6, acid pantothenic) và vitamin K. 5.1.5.2 Theo các nghiên cứu, L.Brevis có khả năng tổng hợp vitamin D và vitamin K; B.longum tổng hợp vitamin B; B.bifidum và L.acidophillus tổng hợp được các vitamin B như niacin, folic acid, biotin, B6 và vitamin K. 5.1.6 Giảm cholesterol 5.1.6.1 Vi khuẩn đường ruột chuyển cholesterol sang dạng khó hấp thu hơn (coprostanol) do đó làm cản trở việc hấp thu cholesterol vào hệ thống ruột. 5.1.6.2 Theo các nhà nghiên cứu, các vi khuẩn probiotic khống chế làm cho cholesterol khó hấp thu được vào máu thông qua các cơ chế chủ yếu sau: + Hấp thụ một lượng cholesterol có mặt trong hệ thống ruột + Tăng chuyển hóa cholesterol thành chất khác và giảm sự hấp thu của chất này vào cơ thể. + Giảm sự hấp thu cholesterol của ruột và tăng sự bài tiết của phân. + Giới hạn sự biến đổi cholesterol thành acid mật cho gan dự trữ. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 42 5.1.6.3 Nếu hàm lượng chất béo cao trong các bữa ăn, gây ra sự tăng cholesterol, việc sử dụng bổ sung các vi khuẩn có lợi này là một phương pháp giúp cân bằng mức lipid và chất béo, giữ hệ thống tim mạch mạnh khỏe. 5.1.7 Tăng cường hệ thống miễn dịch 5.1.7.1 Miễn dịch là trạng thái bảo vệ đặc biệt của cơ thể sống chống lại các yếu tố gây bệnh (các vi sinh vật, các độc tố của vi sinh vật, các phân tử lạ…) khi chúng xâm nhập vào cơ thể. 5.1.7.2 Kháng thể là các globulin trong máu của động vật, có khả năng liên kết đặt hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó, hay còn gọi là kháng thể miễn dịch hoặc kháng thể đặc hiệu. Kháng thể chủ yếu được tìm thấy trong huyết thanh. 5.1.7.3 IgA được tổng hợp chủ yếu nhờ tế bào B trong niêm mạc ruột, đường hô hấp và thực hiên chức năng chống vi khuẩn trên bề mặt niêm mạc ruột. 5.1.7.4 Các vi khuẩn có làm tăng hệ miễn dịch bằng cách: + Tăng cường chức năng chống virus của hệ miễn dịch. + Tăng hoạt động của tế bào NK ( natural killer) nhằm diệt trực tiếp tế bào bị nhiễm khuẩn bằng cách tiết những chất độc để phân giải chúng hoặc bằng cách tiết IFN – gamma ( một loại ctokine). + Tăng S-IgA, sinh cytokine, điều khiển đáp ứng miễn dịch tế bào + Sinh nitric oxide NO, có vai trò quan trọng trong việc dẫn truyền thông tin ở hệ thần kinh và đặc biệt có tác dụng làm thư giãn. + Tăng khả năng đề kháng chống lại một số quá trình tự miễn. + Giảm đáp ứng trung gian IgE (IgE-mediated responses) + Gián tiếp chống lại hiện tượng radiation-included depression in white blood cells: đây là hiện tượng các tế bào bạch cầu bị ức chế và tiêu diệt khi chiếu xạ. Hiện tượng này thường xảy ra trong khi điều trị bệnh ung thư bằng chiếu xạ. 5.1.8 Ngăn chặn ung thư 5.1.8.1 Cơ chế chung: + Kết hợp, ngăn chặn hoặc làm mất hoạt tính của các yếu tố gây ung thư. + Giảm hoạt tính của các enzyme ở phân, là nơi khơi nguồn của các mầm móng gây ung thư. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 43 + Kích thích hệ thống miễn dịch, ngăn chặn sự tạo thành khối u. 5.1.8.1 Đa số ung thư ở người liên quan đến thói quen ăn uống. Một số chủng của vi khuẩn lactic (L.bulgaricus, S.thermophilus hay L.acidophilus và Bifidobacteria) sử dụng trong các sản phẩm sữa lên men có thể xem như là một chất chống ung thư và chống gây đột biến. + Các vi khuẩn có lợi có thể giảm các enzyme liên quan đến các tác nhân gây ung thư (ß-gulucoronidase, azoreductase, nitroreductase và ß- glucosidase) và do đó làm giảm nguy cơ gây ung thư ruột kết. + Bifidobacteria ngăn chặn các yếu tố tiền ung thư như nitrate và nitrosamines thông qua cơ chế nội bào và non – enzymatic. Chúng cũng có thể kết hợp với các heterocyclic amines (các chất gây ung thư trong quá trình nấu thịt) sau đó được bài tiết theo phân. 5.1.9 Chống viêm nhiễm hệ thống niệu sinh dục – chống nấm Candida 5.1.9.1 Bình thường việc viêm nhiễm đường sinh dục là do sự mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, do sử dụng thuốc kháng sinh, các chất khử trùng, hormones, và các yếu tố khác. 5.1.9.2 Các vi khuẩn probiotic hiệu quả trong quá trình giành chỗ cư trú và ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh. 5.1.9.3 Một số chủng thuộc Lactobacillus có khả năng ngăn chặn sự phát triển và bám chặt của nấm Candida albicans và các chủng Candida khác. Việc sử dụng Lactobacillus giảm nguy cơ nhiễm nấm trở lại, giảm nhiễm nấm âm đạo. Ngoài ra một số chủng Lactobacillus GR-1 và RC-14 ngăn chặn sự nhiễm đường tiết niệu do Escheriachia coli gây ra. 5.2 Bảo quản sản phẩm − Điều kiện bảo quản như là nhiệt độ, chiếu sáng, độ ẩm, lượng oxy bảo quản, độ ẩm thành phần của bột có ảnh hưởng đáng kể đến sự tồn tại của probiotic trong bột đã sấy, và điều kiện bảo quản chính xác là yếu tố cần thiết duy trì sự sống sót vi khuẩn đã qua freeze-drying hoặc spray-draying. − Sự sống sót vi khuẩn probiotic trong bảo quản bột quan hệ nghịch đảo với nhiệt độ bảo quản, (Gardiner et al., 2000; Mary, Moschetto, & Tailliez, 1993; Silva, Carvalho,n Teixeira, & Gibbs, 2002; Teixeira et al., 1995b). Bruno and Shah (2003) đã giải thích nhiệt duy trì ở 180C là điều kiện tốt nhất bảo quản dài lâu của freeze-dried probiotic, tăng tối đa khả năng sống sót của bifidobacteria, nhưng Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 44 ngược lại nhiệt độ bảo quản hơn 200C không phù hợp, kết quả giảm đáng kể số lượng vi khuẩn sống sót. Nhưng Simpson et al. (2005) cho rằng có sự giảm đáng kể khả năng tồn tại số lượng loài bifidobacteria đã được sấy khô với chất mang là sữa gầy và bảo quản từ 15-250C. − Hơi ẩm trên probiotic powder (moisture content of probiotic powders) là nhân tố quan trọng kéo dài thời gian sử dụng vi khuẩn sống này. Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đã cho thấy khả năng sống sót freeze-dried probiotic có mối quan hệ nghịch đảo với áp lực hơi nước (relative vapour pressure hay RVP), với 11.4% RVP khả năng sống sót của probiotic cao nhất trong quá trình bảo quản ở nhiêt độ phòng. Zayed and Roos (2004) cũng chứng minh rằng lượng nước còn lại sau khi sấy ảnh hưởng không chỉ khả năng tồn tại probiotic đã được xác định rõ ngay sau quá trình sấy, mà còn ảnh hưởng tốc độ tổn thất trong quá trình bảo quản. Điều kiện độ ẩm tốt nhất bảo quản L. salivarius subsp. Salivarius đã qua freeze-dried từ 2.8 – 5.6% (Zayed & Roos, 2004). − Chất mang sử dụng trong quá trình sấy phun và sấy thăng hoa (freeze- drying) probiotic có ảnh hưởng độ ổn định bảo quản. Ananta et al. (2005) đánh giá ảnh hưởng chất mang trong sấy phun từ việc bảo vệ L. rhamnosus GG điều kiện bảo quản 25-370C, và đã phát hiện khả năng bảo vệ giảm theo thứ tự RSM > RSM/Polydextrose > RSM/Raftilose_P95. Vả lại độ bền của L. rhamnosus GG khi bảo quản lâu dài bị suy giảm do biến đổi thành phần sữa gầy hoặc thành phần prebiotic. Những dự kiện trên chứng minh sự thích hợp của sữa gầy như là môi trường sản xuất quy mô lớn của vi khuẩn probiotic cố định đã sấy phun. Vài nghiên cứu cho thấy sự hiện diện của disaccharides có thể ổn định màng tế bào trong cả hai quá trình freeze và bảo quản (Carvalho et al., 2002; Conrad et al., 2000; Crowe et al., 1988). Như sorbitol ngăn cản sự hư hại màng tế bào bằng cách tác động qua lại với màng (sorbitol prevents membrane damage by interaction with the membrane) (Linders, de Jong, Meerdink, & Vantriet, 1997b), ổn định cấu trúc và chứng năng protein (Yoo & Lee, 1993). − Kiểm soát giai đoạn chuyển đổi nhiệt độ trong màng của tế bào khô là một nhân tố quan trọng xác định sức chịu đựng sự sấy khô, thêm với hạn chế gốc tự do hoạt động (control of free radical activity) (Linders et al., 1997a). Nó làm suy giảm khả năng sống sót probiotic trong quá trình bảo quản ở nhiệt độ cao tương ứng với độ ẩm sản phẩm có chứa đường có liên quan đến glass transition temperature (Vega & Roos, 2006). Lý giải cho điều này là đường giống như form highly viscous glasses tại nhiệt độ phòng khi chúng được khử nước, và cải thiện bảo quản của anhydrobiotes và liposomes có kết hợp với sự hiện diện ở trạng thái như thủy tinh. Những dữ kiện trên chứng minh rằng khả năng sống sót cao của Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 45 đã freeze-dryed bột L. rhamnosus GG trong trehalose, lactose/trehalose và lactose/maltose có liên quan đến khả năng tạo lớp thủy tinh. Nhưng Carvalho et al. (2002) and Linders et al. (1997a) đã chứng minh rằng sorbitol là một chất bảo vệ có hiệu quả cho L. plantarum và L. rhamnosus trong quá trình bảo quản, trong khi đó, the superior glass former, trehalose không phải là chất bảo vệ tốt. 5.3 Những sản phẩm công nghiệp bổ sung probiotic bifidobacteria 5.3.1 Sản phẩm Activia và Activia yogurt Nhà sản xuất: Danone Chủng sử dụng: • Activia: Bifidobacterium lactis • Activia yogurt: Bifidobacterium animalis DN173 010 Hình 11: Sản phẩm Activia dạng chai và Activia yogurt 5.3.2 Sản phẩm Align Nhà sản xuất: Proter and Gamble Chủng sử dụng: Bifidobacterium infantis 35264 Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 46 Hình 12: Sản phẩm Align 5.3.3 Sản phẩm Bidifus yogurt Nhà sản xuất: Morinaga Chủng sử dụng: Bifidobacterium longum BB536 Hình 13: Sản phẩm Bifidus yogurt Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 47 5.3.4 Sản phẩm Good Start Natural Cultures Nhà sản xuất: Nestlé Chủng sử dụng: Bifidobacterium lacti Hình 14: Sản phẩm Good Start Natural Cultures 5.3.5 Sản phẩm Nu Trish Nhà sản xuất: Chr. Hansens Chủng sử dụng: Bifidobacterium lactis Bb-12 Hình 15: Sản phẩm Nu Trish Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 48 Ngoài ra công ty còn có các sản phẩm khác như: Hình 16: Probiotic ice cream; Nước giải khát probiotic whey; Bio – Kefir Chủng sử dụng cho những sản phẩm ở trên là: Bifidobacterium BB 12, đã được sử dụng từ năm 1984 và ngày càng được chứng minh tính có ích thông qua những nghiên cứu của: Schiffrin và cộng sự (1997), Isolauri và cộng sự (2000), Sheu và cộng sự (2002) 5.3.6 Sản phẩm Teddy Nhà sản xuất: Fattoria Scaldosole Chủng sử dụng: Bifidobacterium lactis Hình 17: Sản phẩm Teddy Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 49 5.3.7 Sản phẩm Yo-plus yogurt Nhà sản xuất: General Mills Inc Chủng sử dụng: Bifidobacterium lactis Bb-12 Hình 18: Sản phẩm Yo-plus yogurt Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Lê Văn Việt Mẫn Công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TpHCM, 2004, 296 trang [2] Dimitris Charalampopoulos, Robert A. Rastall Prebiotics and Probiotics Science and Technology Springer, 2009, 1247 pages [3] T. Vasilijevic, N. P. Shah Probiotics – From Metchnikoff to bioactives International Dairy Journal, 714 – 728 Elsevier, 2008 [4] Y. Doleyres, C. Lacroix Technologies with free and immobilised cells for probiotic bifidobacteria production and protection International Dairy Journal, Vol 5, 973 – 988 Elsevier, 2005 [5] Helmut Viernstein, Josef Raffalt, Diether Polheim Stabilisation of probiotic microorganisms – An overview of the techniques and some commercially available products Applications of Cell Immobilisation Biotechnology, 439 – 453 Springer, 2005 [6] Raquel Rozada-Sa1nchez, Avinash P. Sattur, Keith Thomas, Severino S. Pandiella Evaluation of Bifidobacterium spp. for the production of potentially probiotic malt-based beverage Process Biotechnology, Vol 43, 848 – 854 Elsevier, 2008 [7] R Mahalakshmi, VVPS Murthy Growth of Bifidobacterium bifidum in whey-based media Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, Vol 25, 177 – 179 Society for Industrial Microbiology, 2000 Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 51 [8] S.C. Leahy, D.G. Higgins, G.F. Fitzgerald, D. van Sinderen Getting better with bifidobacteria Journal of Applied Microbiology, Vol 98, 1303 – 1315 The Society for Applied Microbiology, 2005 [9] Christophe Lacroix, Selcuk Yildrim Fermentation technologies for the production of probiotics with high viability and functionality Current Opinion in Biotechnology, Vol 18, 176 – 183 Elsevier, 2007 [10] Fumiaki Abe, Masamichi Muto, Tomoko Yaeshima, Keiji Iwatsuki Safety evaluation of probiotic bifidobacteria by analysis of mucin degradation activity and translocation ability Anaerobe, Vol XXX, 1 – 6 Elsevier, 2009 [11] Y. Doleyres, C. Paquin, M. Leroy, C. Lacroix Bifidobacterium longum ATCC 15707 cell production during free- and immobilized-cell cultures in MRS-whey permeate medium Applied Microbiol Biotechnology, Vol 60, 168 – 173 Springer – Verlag, 2002 [12] K. M. Kamaly Bifidobacteria fermentation of soybean milk Food Research International, Vol 30, 675 – 682 Elsevier, 1998 [13] G. I. Novik, A. A. Samatsev, N. I. Astapovich Biological activity of probiotic microorganisms Applied Biochemistry and Microbiology, Vol 42, No 2, 166 – 172 Springer, 2006 [14] E. R. Farnworth, I. Mainville, M. PDesjardins Growth of probiotic bacteria and bifidobacteria in a soy yogurt formulation International Journal of Food Microbiology, Vol 116, 174 – 181 Elsevier, 2007 Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 52 [15] Maria Saarela, Gunnar Mogensen, Rangne Fondén Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties Journal of Biotechnology, Vol 84, 197 – 215 Elsevier, 2000 [16] Michael de Vrese, J. Schrezenmeir Probiotics, Prebiotics and Synbiotics Adv Biochem Engin/Biotechnol, Vol 111, 1 – 66 Springer – Verlag Berlin Heidelgerg, 2008 [17] Kantha D. Arunachalam Role of Bifidobacteria in nutrition, medicine and technology Nutrition Research, Vol 19, No 10, 1559 – 1597 Elsevier, 1999 [18] Fumiaki Abe, Hirofumi Miyauchi, Ayako Uchijima Stability of bifidobacteria in powdered formula International Journal of Food Science and Technology, Vol 44, 718 – 724 Springer, 2009 [19] Flávera C. Prado, Jose L. Parada Trends in non-dairy probiotic beverages Food Research International, Vol 41, 111 – 123 Elsevier, 2008