Đề tài Phương pháp phân tích Aflatoxin

Phương pháp phân tích Aflatoxin - 1 - LỜI NÓI ĐẦU Gần đây tình trạng mất an toàn thực phẩm được đề cập đến như một mối nguy hiểm đe dọa trực tiếp đến sức khỏe của cộng đồng. Các thông tin về nạn ngộ độc hàng loạt xảy ra ở nhiều nơi. Một trong những nguyên nhân gây ngộ độc đó là do Aflatocxin. Bên cạnh Ochratoxin thì Aflatoxin cũng là một mycotoxin được tiết ra từ nấm Aspergillus và A.parasiyicus. Trong thực tế, ở điều kiện thời tiết nóng và ẩm của Việt Nam thì các chủng nấm này sẽ phát triển mạnh ở các loại thực phẩm nông sản như ngô, lạc, đậu…, thức ăn gia súc, gia cầm ! Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 2 - MỤC LỤC 1.Tổng quan 1.1.Công thức ........................................................................................... 3 1.2.Nguồn gốc .......................................................................................... 4 1.3.Đặc điểm ............................................................................................ 5 1.4.Tác hại trong thực phẩm ..................................................................... 6 1.5.Tác hại đối với cơ thể ......................................................................... 7 1.6.Liều lượng cho phép ........................................................................... 8 2.Phân tích 2.1.Loại trừ aflatoxin bằng biện pháp phòng chống sinh học .................... 9 2.2.Nguyên lý phương pháp ...................................................................... 9 2.3.Dụng cụ .............................................................................................. 10 2.4.Hóa chất, thuốc thử ............................................................................. 10 2.5.Chuẩn bị ............................................................................................. 11 2.6.Định lượng.......................................................................................... 12 2.6.1.Chuẩn bị mẫu ............................................................................ 12 2.6.2.Chiết suất .................................................................................. 12 2.6.3.Làm sạch mẫu bằng cột sắc kí ................................................... 12 2.6.4.Lớp sắc kí mỏng một chiều ....................................................... 13 2.6.5.Thử nghiệm sự khẳng định sự có mặt của aflatoxin ................... 14 2.6.6.Đánh giá kết quả ....................................................................... 14 2.7.Định lượng.......................................................................................... 15 2.7.1.Bằng mắt ................................................................................... 15 2.7.2.Bằng máy đo mật độ huỳnh quang ............................................ 15 2.8.Độ nhạy của phương pháp .................................................................. 16 3.Đề xuất giải pháp 3.1.Biện pháp phòng chống ...................................................................... 16 3.2.Hạn chế sự nhiễm aflatoxin ................................................................. 16 3.3.Kiểm tra .............................................................................................. 17 Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 3 - 1.TỔNG QUAN : 1.1.Công thức: B1 (C17H12O6 ), B2 (C17H14O6 );G1 (C17H12O7 ); G2 (C17H14O7)….. Công thức cấu tạo Aflatoxin (B1,B2,G1,G2…) Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 4 - 1.2.Nguồn gốc : Trong số 200.000 loại nấm mốc khác nhau, khoảng 50 loài là có hại cho người và động vật. Các loại này có thể chia thành hai nhóm: Nhóm gây bệnh dịch và nhóm gây ngộ độc. Ðã từ lâu độc tố nấm ít được các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu, kể cả các nước tiên tiến có đời sống cao. Tuy nhiên trong những năm 1920-1930 ở Anh và Liên Xô đã thấy xuất hiện nhiều trường hợp ngộ độc Alcaloit ở người, và gà mà chất này có trong lúa mạch, lúa mì. Năm 1924 Shofield và cộng tác đã phát hiện một loại độc tố được sản sinh từ nấm mốc gây dịch bệnh cho gia súc. Cũng trong thời gian này, Liên Xô tìm ra bệnh bạch cầu không tăng bạch cầu (Aleusemic) ở một số người ăn phải ngũ cốc bị mốc. Ðến năm 1960 nhân một vụ dịch làm chết hàng ngàn con gà tây tại một quần đảo nước Anh do ăn phải lạc thối mốc, các nhà khoa học phương Tây tiến hành nghiên cứu và phát hiện ra độc tố Anatoxin, một độc tố được tiết ra từ nấm Aspergillus flavus, parasiticus và fumigatus. Năm 1961, ở Anh, người ta đã tiến hành thực nghiệm trên chuột cống, cho ăn thức ăn đã nhiễm mốc trong đó 20% là bột lạc thối, sau 6 tháng thấy xuất hiện ung thư gan. Ở Thái Lan, năm 1967 nhóm nghiên cứu của Shank cho thấy các mẫu lương thực thực phẩm bị mốc thì 50-60% số mẫu đó có Aflatoxin. Ðồng thời nhóm tác giả này tiến hành trên thức ăn gia đình (lấy mẫu lương thực thực phẩm tại các gia đình) cũng thấy có 30-50% số mẫu có độc tố Aflatoxin. Ở Việt Nam cho đến nay còn ít có những công thành công bố về vấn đề này. Theo kết quả của Viện VSDT đã nghiên cứu trên 29.381 mẫu lương thực thực phẩm thấy có 30 loại men mốc khác nhau, trong đó mốc Aspergillus chiếm tỉ lệ cao nhất (5,2 - 80,39%) bao gồm 12 chủng loại Aspergillus khác nhau. Trong số đó có 11 chủng có khả năng sinh độc tố. Năm 1984, theo tài liệu của Viện dinh dưỡng quốc gia đã nghiên cứu trên 200 mẫu gạo bán ở Hà Nội thấy ở 2 mẫu có nhiều nấm Aspergillus Flavus, một loại nấm có khả năng tạo ra Aflatoxin. Bảng : Các sản phẩm có thể nhiễm Aflatoxin. Các hạt ngũ cốc Ngô, thóc gạo, lúa mì, bo bo…. Hạt có dầu Lạc, bong, dừa, đậu tương, hướng dương…. Củ Sắn, khoai tây…. Sữa Sữa tươi, pho mat…. Thủy sản Cá, tôm …. Sản phẩm lên men Bia, nước giải khát, rượu vang… Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 5 - 1.3.Đặc điểm : Điều đầu tiên chúng ta cần biết aflatoxin là tinh thể trắng, bền với nhiệt, không bị phân hủy khi đun nấu ở nhiệt độ thông thường (ở 1200C, phải đun 30 phút mới mất tác dụng độc) do vậy nó có thể tồn tại trong thực phẩm không cần sự có mặt của nấm mốc tương ứng; đồng thời nó rất bền với các men tiêu hóa. Tuy nhiên nó lại không bền dưới ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại, nên việc khử độc thực phẩm sẽ có nhiều biện pháp hơn. Có 17 loại aflatoxin khác nhau, nhưng thường gặp bao gồm 6 loại (B1, B2, G1, G2, M1 và M3). Aflatoxin B1 là loại cực độc. Một lượng 0,03 ppm aflatoxin B1 từ khô lạc gây ra u gan. Aflatoxin là một mycotoxin được tiết ra từ nấm Aspergillus và A.parasiyicus, các chủng nấm này phát triển mạnh ở các loại thực phẩm nông sản, thức ăn gia súc, gia cầm như ngô, lạc, đậu... trong các điều kiện thuận lợi nóng và ẩm, nhất là điều kiện thời tiết ở Việt Nam. Tác hại của độc tố vi nấm này đối với động vật đã được biết đến từ lâu, và đã được chứng minh có thể gây ung thư gan trên thực nghiệm. Hình : Nấm Aspergillus Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn ngang hoàn chỉnh, nhiều khuẩn ty phát triển trên bề mặt cơ chất để hấp thu chất dinh dưỡng, đặc biệt có vách ngăn ngang có một lổ nhỏ để cho tế bào chất thông thương qua lại giữa hai tế bào; Khuẩn ty đứt thành khúc và mỗi khúc hay đoạn có thể phát triển cho ra một khuẩn ty mới. Có 2 hình thức sinh sản:  Sinh sản vô tính: Khuẩn ty hình thành một cọng mang bào tử (conidiophore) và bào tử đính (conidia) với cọng mang túi bào tử không vách ngăn và không xuất phát từ tế bào chân (foot cell). Túi hay bọng (vesicle) là tế bào đa nhân và phát triển bề mặt gắn liền với thể bình (phialide hay sterigmata). Thể bình với bậc 1 hay bậc 2, mỗi thể bình là cấu trúc đa nhân và trên đầu thể bình tạo thành một Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 6 - chuổi bào tử đính, những bào tử non ở trong và càng xa càng già; bào tử trưởng thành sẽ phóng thích vào không khí và nẩy mầm.  Sinh sản hữu tính: Sinh sản hữu tính chỉ được phát hiện ở một vài loài, chúng thành lập những bộ phận sinh dục là túi đực (hùng khí antheridia) và túi noãn (ascogonia).  Noãn phòng: Phát triển từ khuẩn ty ở thể có vách ngăn đồng thời tách ra một bộ phận gọi là cuống túi noãn (archicarp), ống noãn bào (trichogyne) kéo dài và tạo thành noãn phòng để kết hợp với giao tử, tất cả tế bào của cuống túi noãn là đa nhân và cuống lại giống như đồng tiền hay vòng xoắn.  Hùng cơ: Hùng cơ phát triển trong nhánh chung với túi noãn, sau đó nhánh này phát triển thành giao tử (pollinodium), nhành này tiến tới ống noãn bào và cắt phần ra gọi là hùng cơ, phần còn lại gọi là cuống hay thân (stalk), hùng cơ cũng là những tế bào đa nhân.  Phối hợp tế bào chất (plasmogamy): Đầu của hùng cơ tiếp xúc với ống noãn bào và vách tế bào của hai đầu này tan ra để hai tế bào chất này trộn với nhau.  Phát triển bao nang : Khi bắt đầu hợp nhân, nhân đơn bào trong túi noãn sẽ nhân đôi, mỗi tế bào nhị bội tạo ra sợi noãn (ascogenous hyphae), hai nhân của mỗi sợi noãn tiếp tục phân chia và tạo thành sợi noãn đa nhân, có vách ngăn ngang, cuối cùng tế bào cuống lại thành tế bào đơn nhân, như vậy trong mỗi tế bào có vách ngăn của sợi noãn có hai nhân và sẽ phát triển thành tế bào nang sau. Hai nhân trong nang sẽ tạo thành nhân tiếp hợp nhị và một gồm một bội; Nhân nhị bội trong nang giảm phân thành 4 nhân đơn bội và mỗi nhân đơn bội sẽ đẳng phân để cho 8 nhân đơn bội, mỗi nhân sẽ hình thành màng bao và phát triển thành một nang bào tử.Như vậy nang và bào tử nang phát triển từ sợi noãn và nhiều sợi noãn phát triển tạo ra một bao nang vách dầy chứa nhiều nang bên trong và nhiều bao nang nằm trong một túi lớn có vách gồm nhiều lớp tế bào gọi là túi bào tử (peridium), thể quả của bao nang gọi là Tử nang thể (Cleistothecium). Nang chứa 8 bào tử nang và khi bào tử nang trưởng thành thì vỏ nang vở ra và bào tử nang nằm trong Tử nang thể và khi nào Tử nang thể vở ra thì bào tử phóng thích ra bên ngoài.  Bào tử nang : vỏ bào tử Mỗi bào tử có đường kính khoảng 5 một đai mỏng bên ngoài và mỗi bào tử nang nẩy mầm cho một khuẩn ty mới. 1.4.Tác hại trong thực phẩm : Đối với thức ăn chăn nuôi nếu điều kiện chế biến bảo quản không tốt gây ra những thiệt hại cho ngành chăn nuôi, theo FAO có khoảng 25% lượng ngũ cốc cung Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 7 - cấp thế giới có chứa độc tố từ nấm, ở châu Á, tỷ lệ này còn cao hơn do các yếu tố về khí hậu và phương thức thu hoạch, chế biến, bảo quản kém. Thông thường trong những điều kiện phù hợp Aspergillus sẽ sinh ra Aflatoxin song không đủ lượng để gây ngộ độc nặng, nó làm giảm khả năng hấp thụ dinh dưỡng , vật nuôi tăng trưởng chậm, còi cọc, làm tăng tiêu tốn thức ăn, khả năng miễn dịch giảm, vật nuôi dể mắc bệnh. Độc tố gây hư hại tế bào gan, thận, gây ung thư làm tăng tỷ lệ chết ở thú non, suy giảm năng suất, sản lượng trứng. Và nếu con người ăn thịt có chứa Aflatoxin thì có thể bị ung thư gan Độc tính trên động vật thí nghiệm : Nhiễm độc các aflatoxin gây một loạt các triệu chứng cấp tính và mạn tính. Nhiễm độc cấp thường biểu hiện bằng cái chết của các động vật thí nghiệm với các triệu chứng thường gặp là hoại tử nhu mô gan, chảy máu ở gan và viêm cầu thận cấp. Nhiễm độc mạn tính thường biểu hiện bằng ăn kém ngon, chậm lớn, gan tụ máu, chảy máu và hoại tử nhu mô. Loại mạn tính tác động tới yếu tố di truyền tương ứng với 3 kiểu gây ung thư, gây quái thai và gây đột biến. 1.5.Tác hại đối với cơ thể : Bệnh gây ra do độc tố nấm trên người hay gặp ở các đối tượng có đời sống thấp, thức ăn cơ bản là ngũ cốc và các thức ăn thực vật giàu chất béo không được xử lý bảo quản tốt. Mặt khác điều kiện khí hậu nóng ẩm, tình trạng vệ sinh kém cũng là yếu tố thuận lợi cho nấm mốc phát triển sinh độc tố và gây bệnh. Aflatoxin được xem như là một trong các tác nhân gây ung thư gan ở người (cũng như các động vật nhạy cảm) và gây ra dị tật thai ở phụ nữ mang thai. Điều cần ghi nhận là tác động bệnh lý của Aflatoxin có tính cộng hưởng với những tác nhân khác như : HBV, hoặc những độc tố di truyền. Những phá hủy có tính chất cấp tính ở gan - thể hiện một nhiễm độc cấp tính. Thường là do Aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong đó độc tố có độc tính mạnh nhất là B1, sau đó đến G1, rồi đến B2, và sau cùng là G2. Bên cạnh gan, các cơ quan khác như: phổi, thận, mạc treo, túi mật... cũng bị tổn thương ít nhiều. Cho đến nay, người ta tạm thời công nhận khả năng tác động lên tế bào gan của aflatoxin qua 5 giai đoạn.  Tác động qua lại với ADN và ức chế các polymeraza chịu trách nhiệm tổng hợp AND và ARN.  Ngừng tổng hợp ADN.  Giảm tổng hợp ADN và ức chế tổng hợp ARN truyền tin.  Biến đổi hình thái nhân tế bào.  Giảm tổng hợp protein. Hậu quả của quá trình tác động sinh hóa lên tế bào gan này là gây ung thư biểu mô tế bào gan. Như vậy, aflatoxin có khả năng gây độc tính cấp và mạn ở các loài động vật và con người. Độc tính nguy hiểm nhất là khả năng gây xơ gan và ung thư gan nguyên Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 8 - phát. Các nhà khoa học đã gây được ung thư gan nguyên phát trên thực nghiệm bằng cách cho các con vật ăn thức ăn có aflatoxin. Một loạt các nghiên cứu cũng cho thấy sự phơi nhiễm aflatoxin tăng liên quan đến sự gia tăng mắc bệnh ung thư gan nguyên phát trên người. Do vậy vấn đề bảo quản lương thực thực phẩm, an toàn lương thực thực phẩm, không sử dụng các thực phẩm đã bị hỏng, bị nấm mốc là một vấn đề hết sức quan trọng có ý nghĩa trong việc hạn chế tần suất xuất hiện bệnh ung thư gan nguyên phát. Năm 1986, Payet và cộng sự đã quan sát trên 2 trẻ em bị suy dinh dưỡng Kwashiorkor, được nuôi bằng thức ăn bổ sung đạm dưới dạng bột lạc, không may bột lạc này đã bị nhiễm độc tố Aflatoxin. Trẻ đã ăn mỗi ngày 70-100g bột lạc bị nhiễm Aflatoxin với hàm lượng 0,5-1ppm ăn kéo dài trong 10 tháng, đến khi trẻ 4 tuổi thì thấy xuất hiện các triệu chứng rối loạn chức năng gan. Sinh thiết gan thấy có hiện tượng loét mô gan ở cả 2 trẻ. Bệnh bạch cầu không tăng bạch cầu là bệnh không do độc tố nấm Anatoxin gây ra, lần đầu tiên xuất hiện ở Xiberi (Liên Xô cũ) và một số vùng khác thuộc Liên Xô. Ở những vùng này thức ăn cơ bản là kê, lúa mì, lúa mạch. Sau này, các công trình nghiên cứu đã xác định tác nhân gây bệnh là nấm fusarium. Về lâm sàng bệnh thường tiến triển theo 3 giai đoạn: - Giai đoạn 1: Kéo dài 3-6 ngày, biểu hiện đầu tiên là viêm niêm mạc miệng, họng... sau đó lan xuống dạ dày, ruột. Sang ngày thứ 3 có đi ngoài nhiều lần, đau bụng, nôn mửa. - Giai đoạn 2: còn gọi là giai đoạn bất sản của hệ bạch huyết và cơ quan tạo máu, kéo dài 15-30 ngày. Xét nghiệm máu: Bạch cầu giảm, tiểu cầu giảm và thiếu máu rõ rệt. - Giai đoạn 3: Bạch cầu giảm nhiều, bệnh nhân có sốt nhẹ, xuất huyết dưới da, niêm mạc. Sau đó là viêm loét da cùng với những tai biến nhiễm khuẩn khác. Tỉ lệ tử vong cao tới 60-80% . 1.6.Chỉ tiêu cho phép : Ở Pháp quy định mức nhiễm Aflatoxin B1 trong sữa nước dùng cho trẻ em dưới 3 tuổi là ( 0.03ng/kg (ppb)); sữa nước thông dụng  0.05ng/kg. Vào năm 1997, Uỷ ban các chuyên gia về phụ gia thực phẩm của FAO/WHO (JECFA) đã đánh giá là việc giảm mức Aflatoxin trong tiêu chuẩn từ 20 ppb (phần tỷ) xuống 10 ppb sẽ giảm được 2 người chết do ung thư trong một năm trên một tỷ người. Năm 1997, EC đề nghị hài hoà mức Aflatoxin tối đa có thể chấp nhận được trong thực phẩm. Tiêu chuẩn mới này thay đổi trong khoảng từ 4 ppb cho ngũ cốc, các hạt và quả khô ăn ngay, đến 10 ppb cho các hạt cần chế biến tiếp. Đề nghị của EC làm các nhà xuất khẩu lo ngại về việc tiêu chuẩn mới có thể gây hạn chế thương mại. Một số nước xuất khẩu thực sự lo sợ bị tổn thất trong xuất khẩu của họ do tiêu chuẩn mới quá khắt khe. Các nước như Bôlivia, Peru, Ấn Độ, Acgentina, Canada, Urugoay, Úc và Pakistan đã yêu cầu EC đưa ra các đánh giá mối nguy hại cụ thể đối với tiêu chuẩn mới này. Kết quả của việc tham vấn với các đối tác thương mại về các quan ngại này Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 9 - là EC đã nới lỏng tiêu chuẩn dự kiến về Aflatoxin trong ngũ cốc, quả sấy khô và hạt các loại. Tiêu chuẩn về Aflatoxin trong lạc để chế biến tiếp được quy định ở mức 15 ppb (8 ppb cho B1), trong các loại hạt khác và quả khô để chế biến tiếp là 10 ppb (5 ppb cho B1). Đối với ngũ cốc, quả khô và các loại hạt dùng để ăn ngay cho người, tiêu chuẩn nghiêm ngặt hơn và quy định ở mức 4 ppb (2 ppb cho B1). Trong khi đó, các tiêu chuẩn về Aflatoxin của Codex được cho là thấp hơn nhiều so với các tiêu chuẩn của EC. Khi Codex đưa ra tiêu chuẩn riêng cho nhóm B1 của Aflatoxin thì người ta cho rằng Aflatoxin B1 chiếm đến 50-70% hoặc vào khoảng 7,5-10,5 ppb của tổng mức Aflatoxin 15 ppb. Tiêu chuẩn chung của Codex, do vậy, là vào khoảng 9 ppb. Cục quản lý Thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ qui định hàm lượng tối đa aflatoxin trong thức ăn gia súc như sau:  Bò giống, heo giống, gà trưởng thành không quá 100ppb (phần tỷ)  Heo thịt giai đoạn vổ béo: 200ppb  Bò thịt: 300ppb  Bò sữa và gia súc non: 20ppb 2.PHÂN TÍCH : Điều kiện tiến hành phân tích : ở phòng mát, tránh ánh nắng. Có nhiều phương pháp phát hiện aflatoxin, các phương pháp lý hoá học chủ yếu dựa trên tính chất phát huỳnh quang của bước sóng tử ngoại của aflatoxin. Aflatoxin có thể được phát hiện và định lượng bằng phương pháp sắc kí trên giấy với các hệ dung môi butanol-nước-acetic (20:1:19) hay chloroform – methanol (95:5) và sắc ký bản mỏng trên alumin, bột kieselguhl, bột cellulose với hệ dung môi chloroform – methanol (99:1 hay 93:7) hoặc chloroform –aceton (90;10 hay 85:15)… cũng có thể định lương alatoxin bằng sắc ký trên cột nhôm oxyd, cột silicagel với các dung dịch rửa là clorofom và hỗn hợp 5% methanol-cloroform. Hiện nay, phương pháp phổ biến nhất cho phát hiện và định lượng aflatoxin với độ nhay cao là sử dụng HPLC với dung môi tách là acetonitril. Bên cạnh đó, các phương pháp sinh học cũng có khả năng phát hiện aflatoxin. 2.1. Loại trừ Aflatoxin bằng biện pháp phòng chống sinh học (ở đậu phộng). Sử dụng dòng Aspetggillus flavus không gây độc để làm mất tác dụng các dòng sản ra độc tố trong môi trường bằng cách “loại trừ mang tính cạnh tranh”. Cho đến nay các công trình nghiên cứu đã xác định được các đặc trưng của những dòng không gây độc và đã đạt được những thành công nhất định ở Mỹ và Australia. Tuy nhiên còn phải tiếp tục thử nghiệm và đánh giá hiện trường ở Australia, khảo sát việc áp dụng qui mô thương mại, thảo qui trình phổ biến và qui mô ứng dụng. Phải tiến hành chứng minh qui mô độ tin cậy, tính hiệu quả trước và sau thu Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 10 - hoạch, tính an toàn của phương pháp này và tiếp tục nghiên cứu về sự sống sót của dòng đối thủ cạnh tranh trong đất và tính ổn định quá trình không sản sinh ra độc tố. Ưu điểm của biện pháp phòng chống sinh học là làm giảm thiểu nhiểu loạn hệ sinh thái, sự ủng hộ của người tiêu dùng, không dùng công nghệ gen hoặc vi phạm an toàn thực phẩm và có khả năng sẳn sàng chuyển giao công nghệ cho các nước khác. Nhược điểm của phương pháp này là cần những hệ thống thí nghiệm aflatoxin rộng rãi và quản lý sản xuất nông nghiệp và chỉ có thể giảm thiểu aflatoxin chứ không loại trừ hoàn toàn. Các vấn đề nguy cơ thất bại và tính hiệu quả đối với nhiễm sau thu hoạch cũng được đặt ra. 2.2.Nguyên lý phương pháp sử dụng dụng cụ: Aflatoxin được chiết tách từ mẫu thử bằng clorofoc. Dịch chiết được lọc và một phần dịch lọc được làm sạch qua cột silicagen. Làm bay hơi dung dịch rửa giải và hoà cặn với clorofoc hoặc hỗn hợp benzen – axetonitril. Sau đó chấm một phần xác định mẫu thử lên bản mỏng,chạy sắc ký và so sánh Rf, màu sắc vết sắc ký của mẫu phân tích với vết aflatoxin chuẩn dưới đèn tử ngoại có bước sóng 365nm. Lượng aflatoxin có thể xác định bằng mắt hay bằng máy đo mật độ huỳnh quang. Đối tượng áp dụng là aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong các sản phẩm ngũ cốc, đậu đỗ, hạt có dầu. 2.3.Dụng cụ :  Máy xay nghiền mẫu.  Máy lắc hoặc máy khuấy từ .  Cân phân tích.  Máy cất quay chân không.  Bếp cách thuỷ.  Đèn tử ngoại có bước sóng 365nm.  Quang phổ kế UV-VIS.  Máy đo mật độ huỳnh quang.  Các trang bị của sắc ký lớp mỏng.  Cột sắc ký thuỷ tinh, đường kính trong 22mm, dài 300mm, có khoá nút mài thuỷ tinh hoặc teflon và bình đựng dung môi phía trên, dung lượng 250ml.  Bình nón nút mài 250ml, 500ml.  Ống đong 50ml, 100ml.  Phễu lọc, đường kính 8 – 10 cm.  Micropipet Hamilton:20 ml, 50 ml  Bản mỏng kích thước 20 x 20 cm tráng sẵn lớp mỏng Silicagel 60-G 2.4.Hóa chất, thuốc thử : Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 11 - Tất cả các hoá chất đều phải là loại tinh khiết phân tích (TKPT) nếu không có các chỉ dẫn riêng nào khác.  Acetone .  Clorofoc .  n – Hexan .  Ete etylic (dạng khan).  Metanol .  Axetonitril  Toluen .  Natri sunfat (dạng khan).  Celite 545, đất diatomit.  Acid sunfuric 50% (v/v) .  Acid trifluoraxectic .  Khí nitơ .  Bông hút nước (được loại béo bằng clorofoc) hoặc bông thuỷ tinh.  Các hệ dung môi khai triển sắc ký : - Clorofoc : axeton = 9:1 (v/v). - Ete êtylic : metanol = nước: 94:4, 5:1,5:1 (v/v/v/v) . - Clorofoc : axeton : isopropanol : nước = 88:12:1, 5:1 (v/v/v/v) . - Toluen : etyl axetat : axit focmic = 6:3:1 (v/v/v) . 2.5.Chuẩn bị : Silicagel G – 60 dùng cho sắc ký cột, cỡ hạt 0,063 ¸0,2 mm. Hoạt hoá bằng cách sấy khô ở 105oC trong một giờ, sau đó trút vào bình tam giác nút nhám, thêm nước với tỷ lệ 1ml nước cho 100g silicagel, đậy nút, lắc đến khi trộn hoàn toàn đều, bảo quản 15 giờ trong bình kín. Chuẩn bị dung dịch aflatoxin chuẩn (điều kiện tiến hành: trong phòng mát, tránh ánh sáng) Dung dịch aflatoxin chuẩn gốc (dung dịch A): Dùng ống chuẩn 1 mg, mỗi loại aflatoxin chuẩn B1, B2, G1, G2 lần lượt cho vào 4 bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng hỗn hợp toluen – axetonitril 98: 2 (v/v) (nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn là 10 mg/ml). Dung dịch aflatoxin chuẩn làm việc (dung dịch B): Cho vào một bình định mức 10ml lần lượt 0,5 ml aflatoxin B1; 0,5 ml aflatoxin G1; 0,1 ml aflatoxin B2, 0,1 ml aflatoxin G2 (từ dung dịch A ở trên), định mức đến 10ml bằng hỗn hợp toluen – axetonitril 98: 2 (v/v), nồng độ dung dịch là 0,5 mg/ml đối với B1, G1, và 0,1 mg/ml đối với B2, G2. Cần kiểm tra lại nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn (dung dịch A mg/ml) bằng quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS, bước sóng 350nm, tính kết quả theo công thức: Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 12 - C = m – Khối lượng phân tử Aflatoxin. A – Mật độ quang ở bước sóng hấp thụ. e – Độ hấp thụ phân tử của Aflatoxin. Aflatoxin m Dung môi benzen – axetonitril (v/v) l max (nm) e B1 312 98: 2 350 9800 B2 314 98: 2 350 20900 G1 28 98: 2 350 7100 G2 30 98: 2 350 8200 2.6.Định tính : 2.6.1.Chuẩn bị mẫu : Nghiền mẫu sao cho có thể qua được rây có lỗ cỡ 1mm. Với các mẫu thử có hàm lượng chất béo lớn hơn 5%, cần loại chất béo bằng cách chiết với dung môi ete dầu hoả (độ sôi 40 – 60oC) sau khi đã hoàn thành công đoạn nghiền mẫu. 2.6.2. Chiết suất: Cân 50g mẫu đã nghiễn nhỏ cho vào bình nút mài 500ml. Cho tiếp 25ml nước, 25g celite 545, 250ml clorofoc, đậy nút chặt. Lắc trong 30 phút bằng máy lắc quay tròn hay máy khuấy từ (hoặc lắc kỹ bằng tay) rồi lọc qua giấy lọc gấp cạnh, bỏ 10ml dịch lọc đầu, sau đó lấy 50ml dịch lọc tiếp theo (tương đương 10g mẫu thử). Nếu tốc độ dịch lọc xuống chậm, chuyển sang phễu Bucher có chứa 1 lớp celite 545 dày 5mm trên giấy lọc và lọc hút chân không. 2.6.3. Làm sạch mẫu bằng cột sắc ký: Chuẩn bị cột sắc ký: Cho một ít bông vào đáy cột sắc ký, thêm 5g natri sunfat khan. Đổ clorofoc đến 2/3 cột, sau đó cho 10g silicagel dùng cho sắc ký cột (3 - 15), vừa cho vừa gõ nhẹ thành cột cho silicagel lắng đều, dùng đũa thuỷ tinh khuấy nhẹ để tránh bọt khí. Mở Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 13 - khoá cho clorofoc chảy xuống từ từ. Khi tốc độ lắng của silicagel chậm lại, rút hết clorofoc chỉ để lại một lớp 5cm phía trên lớp silicagel. Thêm từ từ 15g natri sunfat khan, sau đó rút bớt clorofoc đến gần sát lớp natri sunfat khan trên. Cột silicagel thu được phải mịn, không có bọt khí và chú ý không để cột bị khô kể từ lớp natri sunfat khan trên. Trộn 50ml dịch lọc trên (5 - 2) với 150ml n – hexan, đổ cẩn thận vào cột sắc ký đã chuẩn bị như trên. Loại bỏ dung dịch chảy ra. Cho tiếp 150ml ete êtylic khan, loại bỏ dung dịch chảy ra. Chú ý không để cột bị khô, lưu lượng dòng chảy khoảng 8 – 12ml /phút. Dung dịch rưả giải aflatoxin trên bằng 150ml hỗn hợp metanol – clorofoc (3 : 97). Lấy toàn bộ dịch chảy ra từ khi bắt đầu cho dung dịch rửa giải cho đến hết. Lưu lượng dòng chảy như trên. Làm bay hơi dung dịch rửa bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ thấp hơn 50oC cho đến khi còn khoảng 2 – 3 ml. Chuyển sang ống nghiệm 10ml, tráng rửa bình cầu bằng clorofoc và làm bay hơi đến khô trên nồi cách thuỷ ở nhiệt độ thấp hơn 50oC, tốt nhất dưới luồng khí nitơ nhẹ cặn còn lại trong ống nghiệm là mẫu phân tích. Đậy kín ống nghiệm có cặn để chạy sắc ký lớp mỏng. 2.6.4. Sắc ký lớp mỏng một chiều: Chuẩn bị: - Hoà cặn thu được ở trên bằng 0,5ml hỗn hợp benzen – axetonitril (98: 2) và lấy dịch này để chấm lên bản sắc ký. - Với bản mỏng tráng sẵn trước khi chấm sắc ký phải cạo sạch lớp silicagel ở hai cạnh bên tấm sắc ký với chiều rộng 0,5cm. Sau đó cách cạnh đáy 2 cm, dùng mao quản hay micropipet chấm các vết dung dịch chuẩn aflatoxin và dung dịch mẫu thử như sau:  Lấy 2; 5;10; 20 ml dung dịch chuẩn B ( chuẩn bị ở mục 2.4).  Lấy 10 ml dịch chiết với 10 ml dung dịch chuẩn B (chuẩn bị ở mục 2.4).  Lấy 10, 20 ml dịch chiết. - Với từng thể tích như trên, 4 dung dịch aflatoxin B1, B2, G1, G2 chuẩn có thể được chấm chồng lên nhau. Khai triển bản sắc ký ở chỗ tối với hệ dung môi clorofoc – axeton (9: 1). Sau khi tiếp tuyến dung môi chạy lên khoảng 10cm (khoảng 30 phút), lấy bản sắc ký ra để bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Sau đó soi dưới đèn tử ngoại với bước sóng 365 nm. Các vết aflatoxin B1, B2 có huỳnh quang màu xanh da trời; G1, G2 có huỳnh quang màu xanh lá cây. Nếu mẫu thử có aflatoxin sẽ xuất hiện các vết cùng giá trị Rf với các vết aflatoxin chuẩn. Rf của các vết aflatoxin trong hệ dung môi clorofóc - acetone (9-1) có trị số trung bình như sau: - Aflatoxin B1 : 0,72 Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 14 - - Aflatoxin B2 : 0,67 - Aflatoxin G1 : 0,59 - Aflatoxin G2 : 0,54 2.6.5. Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của aflatoxin: Phun dung dịch axit sunfuric 50% (v/v) lên bản sắc ký, huỳnh quang của các vết aflatoxin sẽ chuyển sang màu vàng dưới tia tử ngoại có bước sóng 365nm. Rót dung dịch Iod 5 – 10% trong ete lên một tấm thuỷ tinh 20 × 20cm, dàn đều ở khu vực giữa, để cho ete bay hơi hết còn lại một lớp iốt mỏng. Đặt úp tấm thuỷ tinh này lên bản sắc ký đã triển khai, cách khoảng 1 cm trong thời gian 20 – 30 giây. Lấy bản sắc ký ra quan sát dưới đèn tử ngoại, nếu huỳnh quang của chất chuẩn và dung dịch thử không mất đi, chứng tỏ sự có mặt của aflatoxin. Chia bản mỏng silicagel 20 × 20 cm làm hai phần bằng nhau (cách 10cm ở giữa), chấm các vết dịch chiết mẫu thử và dung dịch aflatoxin chuẩn như sau: Phần 1: Bên trái, chấm 4 vết như sau :  10 ml dung dịch aflatoxin chuẩn (chuẩn bị ở mục 2.4)  10 ml dịch chiết  10 ml dịch chiết với10 ml dung dịch aflatoxin chuẩn (chuẩn bị ở mục 2.4)  10 ml dung dịch aflatoxin chuẩn (chuẩn bị ở mục 2.4) Phần 2: Bên phải,chấm 4 vết như sau.  10 ml dung dịch aflatoxin chuẩn (chuẩn bị ở mục 2.4)  10 ml dịch chiết  10 ml dịch chiết với 10 ml dung dịch aflatoxin chuẩn (chuẩn bị ở mục 2.4)  10 ml dung dịch aflatoxin chuẩn (chuẩn bị ở mục 2.4) Chấm xong dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay hết. Nhỏ lên 4 vết chấm ở phần 1 bên trái, mỗi vết một giọt axít trifluoraxetic. Che phần 1 (bên trái) bằng một tấm thuỷ tinh khác, phun lên phần 2 (bên phải) dung dịch axitsunfuric 50% (v/v). Dùng máy sấy nhẹ làm khô các vết chấm rồi mới cho vào bình khai triển. Dung môi khai triển : Nước : metanol : ete etylic = 1 : 3 : 96 (v/v). Khi dung môi lên khoảng 13 cm, lấy bản sắc ký ra để khô ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng, soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365 nm, cách đèn 10 cm. 2.6.6. Đánh giá kết quả: Nửa bên trái: Các vết huỳnh quang aflatoxin của dung dịch aflatoxin chuẩn và của vết dịch chiết (nếu có) sẽ cùng có trị số Rf ngắn hơn bình thường, vẫn giữ nguyên màu huỳnh quang xanh . Nửa bên phải: Các vết huỳnh quang aflatoxin của dung dịch aflatoxin chuẩn và của vết dịch chiết (nếu có)sẽ cùng có trị số Rf bình thường, và màu huỳnh quang xanh chuyển sang màu vàng. Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 15 - 2.7.Định lượng : 2.7.1. Bằng mắt: Xác định hàm lượng aflatoxin trong dịch chiết bằng cách so sánh mật độ huỳnh quang của vết dịch chiết với mật độ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn. Vết huỳnh quang của vết chấm dung dịch aflatoxin chuẩn chồng lên vết dịch chiết phải mạnh hơn huỳnh quang của vết 10ml dịch chiết và phải trùng nhau. Nếu mật độ huỳnh quang của vết 10ml dịch chiết đậm hơn mật độ huỳnh quang của vết 20ml dung dịch chuẩn thì phải pha loãng dịch chiết và tiến hành làm sắc ký lớp mỏng lại. Hàm lượng aflatoxin (C) tính bằng microgam trong 1 kilogam mẫu được tính theo công thức: C = S – Nồng độ aflatoxin của dung dịch chuẩn (mg/ml) ( Dung dịch B ) V – Thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả những lần pha loãng nếu có (ml). W – Khối lượng của mẫu thử, (tương ứng với thể tích dịch chiết khi tiến hành làm sạch qua cột) (g). X – Thể tích dịch chiết có mật độ huỳnh quang giống thể tích Y của dung dịch chuẩn chấm trên bản mỏng (ml). Y – Thể tích dung dịch chuẩn có mật độ huỳnh quang giống thể tích X của dịch chiết chấm trên bản mỏng (ml). 2.7.2. Bằng máy đo mật độ huỳnh quang : Bước sóng kích thích là 365nm và bước sóng phát xạ là 443 nm. Định lượng aflatoxin trên các chấm của dịch chiết bằng cách so sánh mật độ huỳnh quang của vết dịch chiết với mật độ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn. Hàm lượng aflatoxin (C), tính bằng microgam trong 1 kilogam mẫu thử tính như sau: C = Am - mật độ huỳnh quang của vết mẫu. As - mật độ huỳnh quang của vết chuẩn. X – Thể tích của dịch chiết chấm lên bản mỏng (ml). Y – Thể tích của dịch chuẩn chấm lên bản mỏng (ml). S – Hàm lượng aflatoxin của dung dịch chuẩn,(ng). V– Thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả những lần pha loãng nếu có, (ml). W – Khối lượng của mẫu thử, tương ứng với thể tích dịch chiết khi tiến hành làm sạch qua cột,(g). Am × S × Y × V As × W × X S × Y × V W × X Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 16 - 2.8. Độ nhậy của phương pháp : 5 mg/kg (5 ppm) Hệ số thu hồi của phương pháp : 90 ± 5%. Sai số trung bình của phương pháp : ± 10%. 3.ĐỀ XUẤT GIẢI PHÁP : 3.1.Biện pháp phòng chống : Hiện nay thuốc chữa bệnh đặc hiệu không có, vì vậy biện pháp phòng bệnh là quan trọng. Aflatoxin là một độc tố khá bền vững với nhiệt. Vì vậy biện pháp đun sôi thông thường không có tác dụng đối với độc tố. Ðể đề phòng ngộ độc, biện pháp áp dụng là vấn đề bảo quản tốt các loại lương thực thực phẩm, trong đó chủ yếu là thực phẩm thực vật. - Với lương thực như gạo, ngô, mì: Yêu cầu bảo quản là giữ khô, thoáng mát để không bị nhiễm mốc. - Với những thực phẩm thực vật khô như lạc, vừng, cà phê... là những thực phẩm dễ hút ẩm và dễ mốc. Muốn bảo quản tốt cần được phơi khô, giữ nguyên vỏ, chứa trong các dụng cụ sạch, kín nếu để lâu, thỉnh thoảng phải đem phơi khô lại. Yêu cầu độ ẩm của hạt là dưới 15%. - Với nước chấm như xì dầu, tương: Những thông báo kết quả đầu tiên ở nước ta cho thấy độ nhiễm Aflatoxin trong nước chấm là đáng lo ngại. Vì vậy việc kiểm tra vệ sinh các xí nghiệp sản xuất nước chấm và các cửa hàng mua bán là cần thiết và phải được tiến hành thường xuyên. 3.2.Hạn chế sự nhiễm aflatoxin : Biện pháp hạn chế hoặc giảm hàm lượng aflatoxin cho nông sản bảo quản được áp dụng như xử lý nhiệt với muối amoni, monomethylamin, natri hydroxyt, natri hypoclorit, H2O2. Nghiên cứu chứng minh rằng sử dụng khí quyển biến đổi có khả năng kiểm soát được hàm lượng aflotoxin: CO2 tăng từ 0,5% (không khí) tới 100%, Oxy giảm từ 5% xuống 1% tạo thanh aflttoxin. Ở 15oC rõ hơn ở 30oC. Việc giảm aw từ 0,99 tới 0,858 cũng làm giảm sự tổng hợp aflatoxin. Các biện pháp kiểm soát sinh học aflatoxin cũng rất hứa hẹn, bao gồm từ việc tạo giống cây trồng, vật nuôi kháng nấm, sử dụng thuốc bảo vệ thực vật và kháng nấm trên đồng ruộng, và các biện pháp công nghệ gen nhằm vô hoạt gen sinh độc tố ở nấm mốc. Enzyme methyltransferase để phân giải tiền aflatoxin B1, tạo các giống nấm mốc cạnh tranh với nấm mốc sinh aflatixin B1 bằng cách loại bỏ gen sinh độc tố của các chủng gốc của chúng trở lại ổ sinh thái cạnh tranh với các chủng nấm hoang dại sinh độc tố, tạo vật nuôi, cây trồng với công nghệ tái tổ hợp ADNcó nấm gen kháng nấm… Aflatoxin B1 trong thực phẩm và một số thức ăn gia súc được quy định ở mức 20 ppb. Aflatoxin M1 trong sữa quy định dưới 0,5 ppb. Theo đánh giá mới đây, 77 nước trên thế giới có tiêu chuẩn về mycotoxin, trong đó, hầu hết các quy định này dành cho aflatoxin. Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 17 - 3.3.Kiểm tra :  Kiểm tra vệ sinh môi trường (chủ yếu là không khí).  Kiểm tra vệ sinh nước chấm.  Ngoài các chỉ tiêu vệ sinh đã được qui định cho một mẫu nước chấm và một mẫu không khí, còn phải chú ý phát hiện sự có mặt của các chủng nấm sinh độc tố như Aspergillus flavus, parasiticus và fumigatus.  Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, ẩm độ trong không khí thường cao, thời vụ canh tác, thu hoạch thường rơi vào mùa mưa trong khi các phương tiện thu hoạch, phơi sấy nông sản kém, kho chứa không đảm bảo khô ráo thoáng mát là điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiểm độc tố cho thức ăn chăn nuôi.  Chăn nuôi khi dự trử thức ăn cho chăn nuôi cần để nơi khô ráo, thoáng mát không để trực tiếp trên nền mà kê cao cách mặt nền 10 -20cm , giửa các khối thức ăn có khoảng cách tạo sự lưu thông khí hạn chế độ ẩm, tránh nấm mốc gây phát sinh độc tố trong thức ăn. Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn Phương pháp phân tích Aflatoxin - 18 - Tài liệu tham khảo  Vi sinh vật đại cương Nguyễn Lân Dũng  Giáo trình nấm học Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Bá, Nguyễn Văn Thành  Độc tố học và an toàn thực phẩm Lê Ngọc Tú  Tạp chí nông nghiệp Viễn Đông  www.aspergillus.ogr.uk/ntlam … Sưu tầm bởi: www.daihoc.com.vn