Đề tài Phế thải trong công nghiệp chế biến

MỞ ĐẦU Công nghiệp chế biến thủy sản đang ngày càng phát triển trên quy mô toàn cầu. rất nhiều nước ở Đông Nam Á và Nam Mĩ đang đẩy mạnh ngành công nghiệp này chủ yếu cho xuất khẩu như Ấn Độ, Indonexia, Thái Lan, Việt Nam…quá trình này bao gồm cả nuôi trồng và đánh bắt ở biển, với một sản lượng đông lạnh rất lớn. như vậy tất yếu một lượng phế thải không nhỏ bị vứt bỏ, để thối rữa và do đó gây ô nhiễm môi trường. Theo ước tính lượng phế thải tôm, cua…hàng năm là 1,44 triệu tấn (trọng lượng khô). Tuy vậy chính lượng phế thải vỏ tôm, cua, mực…này lại là một nguồn tiềm ẩn to lớn về protein, chất màu và chitin – polysaccarit. Chitin là một polyme thiên nhiên có cấu tạo mạch thẳng gồm các đơn vị N-axetyl-Dglucosamin nối với nhau bằng liên kết (1,4)- glucosit hiện đang được ứng dụng nhiều trong y học, dược phẩm, công nghiệp thực phẩm, xử lý nước. Sức ép về kinh tế và môi trường ngày càng tăng của ngành chế biến thủy sản buộc phải sớm lựa chọn những biện pháp xử lý thích hợp nhằm phối hợp giải quyết vấn đề môi trường và thu hồi chitin. Cho đến nay việc thu hồi chitin từ những phế thải thủy sản đã cho những kết quả có triển vọng về kinh tế cũng như bảo vệ môi trường. Hiện nay đang có hai phương pháp chủ yếu hay dùng để tách chitin: phương pháp truyền thống (phương pháp hóa học) và phương pháp sinh học (dung enzym hoặc vi khuẩn). Tuy nhiên, Việc sản xuất chitin và dẫn xuất của chúng là những quá trình hóa học đã và đang là mối quan tâm lớn hiện nay. Chitn thu được phụ thuộc nhiều vào quy trình xử lý với axit và kiềm nóng để khử khoáng và khử protein. Quá trình này tiêu tốn năng lượng, sản ra một thể tích lớn nước thải chứa nhiều NaOH, HCl, gây ăn mòn và ô nhiễm mạnh, đông thời rất khó tách các sản phẩm còn có giá trị như chất màu, protein. Nhưng điều quan trọng hơn cả là tính không ổn định của quá trình làm ảnh hưởng đến chất lượng của chitin. Những bất lợi của phương pháp hóa học này nếu xét theo các yếu tố về môi trường, kinh tế và chất lượng sản phẩm có thể thấy: Về môi trường: quá trình hóa học có thể là được xem như là không hợp lý vì: Cần sử dụng một dung lượng lớn axit, kiềm, nước rửa. Nước thải là một chất ăn mòn và chứa những chất gây ô nhiễm như: protein, khoáng đã hòa tan. Về kinh tế: quá trình hóa học trở nên kém hiệu quả hơn vì 4 lý do: Chi phí cho các yếu tố môi trường (như đã nêu trên) Chi phí năng lượng khi xử lý kiềm để loại protein, và tiếp tục chuyển chitin thành chitosan. Tiêu tốn một lượng lớn nước để rửa kiềm. Không thu hồi được các sản phẩm còn có giá trị khác Về chất lượng sản phẩm: chất lượng giảm vì 2 lý do: Việc sử dụng axit và kiềm nóng dẫn đến việc cắt mạch của chitin làm cho sản phẩm thay đổi trọng lượng phân tử và độ nhớt (tức là chitin không giữ được tính chất nguyên bản củ mình). Việc đề acetyl hóa một cách ngẫu nhiên bằng axit và đặc biệt là kiềm nóng đã tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau(có DA khác nhau) và còn tiếp tục gây biến tính những sản phẩm này thành chitosan và các dạng sản phẩm khác Những lý do dó đã làm cho chitin và những dẫn xuất của nó chưa được thương mại hóa trong các lĩnh vực và ứng dụng. Để khắc phục các vấn đề trên, em đã lựa chọn hướng tách chiết chitin theo phương pháp sinh học. Ưu điểm của phương pháp này được thể hiện ở 3 khía cạnh: Về môi trường: ít gây ô nhiễm môi trường, lượng nước rửa ít hơn. Về kinh tế: giảm thiểu chi phí cho năng lượng, đồng thời có thêm các sản phẩm kèm theo (chất màu và protein cho thức ăn gia súc) do đó giá thành rẻ hơn. Về chất lượng sản phẩm: chitin thu được có trọng lượng phân tử và độ nhớt không bị thay đổi nhiều do điều kiện xử lý êm dịu hơn. Đây là một giải pháp cập nhật, giải quyết được những nhược điểm của phương pháp truyền thống. hiện nay lĩnh vực nghiên cứu sinh thái chitin đã trở thành một ngành khoa học thực thụ, đã có nhiều hội nghị thế giới về “chitin enzymology” và những hoạt động này rất phù hợp với việc bảo vệ môi trường nhất là trong lĩnh vực hóa học xanh. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN I.1: Phế thải trong công nghiệp chế biến Tôm là nguồn thủy sản dồi dào và có giá trị kinh tế cao nhưng việc khai thác, đánh bắt phụ thuộc rất lớn vào điều kiện tự nhiên và mang tính mùa vụ vì vậy ngoài đánh bắt tự nhiên người ta còn đẩy mạnh theo hướng nuôi trồng đảm bảo cung cấp nguyên liệu một cách thường xuyên cho các nhà máy chế biến thủy sản xuất khẩu. Giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản dồi dào chiếm từ 30 – 35% tổng sản lượng nguyên liệu ở Việt Nam. Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm từ 70 – 80% công suất chế biến. Hàng năm các nhà máy chế biến đã thải ra một lượng phế liệu giáp xác khá lớn khoảng 70 000 tấn. Riêng ở tỉnh Khánh Hòa lượng phế liệu này vào khoảng 2257 tấn/năm. Theo thống kê của tổng cục hải quan, tính đến hết tháng 11/2009, xuất khẩu tôm của Việt Nam đạt 190 490 tấn, trị giá trên 1,518 tỉ USD, tăng 7,4% vê lượng và 0,73% về giá trị so với cùng kì năm 2008. Đây là mặt hàng thủy sản duy nhất tăng trưởng trong năm 2009. Hơn 300 doanh nghiệp tham gia xuất khẩu trong đó 60 doanh nghiệp dẫn đầu chiếm hơn 80% kim ngạch. 120 doanh nghiệp có giá trị xuất khẩu hơn 1 triệu USD. Theo dự báo của ông Trương Đình Hòe, Tổng thư ký Vasep, sang năm 2010, tôm sú vẫn là sản phẩm xuất khẩu chủ lực trong khi xuât khẩu tôm chân trắng sẽ tăng gấp đôi lên 500 triệu USD, sản lượng đạt khoảng 150000 tấn. Việt Nam có thể sẽ có lợi thế ở thị trường tôm chân trắng cỡ nhỏ do có nguồn lao động. Kim ngạch xuất khẩu tôm sú dự kiến sẽ đạt 1,4 tỷ USD. Theo ông Hòe, sang năm mới, giá thành tôm sú sẽ tác động trực tiếp lên xuất khẩu chứ không phải là thị trường. Năm 2010, tôm Việt Nam sẽ là lựa chọn của các nhà nhập khẩu Nhật Bản trong khi Hàn Quốc sau khủng hoảng sẽ là thị trường quan trọng đôi với Việt Nam (theo Vasep.com.vn). Việc tiêu thụ một số lượng lớn tôm nguyên liệu của các nhà máy chế biến thủy sản đã thải ra một lượng lớn phế liệu trong đó phế liệu vỏ, đầu tôm là chủ yếu. Các loại phế liệu này nếu thải trực tiếp ra môi trường sẽ gây ô nhiễm môi trường trầm trọng và nếu đem xử lý chất thải thì chi phí sẽ rất lớn. Ngày nay đã có rất nhiều hướng nghiên cứu sử dụng phế liệu tôm để sản xuất các chế phẩm có giá trị trong đó quan trọng nhất là việc sản xuất chitin – chitosan từ vỏ giáp xác. I.2: Thành phần phế phẩm tôm: Tôm là đối tượng quan trọng của ngành nuôi trồng và chế biến thủy sản Việt Nam. Hiện nay ở nước ta, kĩ thuật khai thác và nuôi tôm rất phát triển và ngày càng cung cấp nhiều nguyên liệu cho các nhà máy chế biến thủy sản trong nước và xuất khẩu nhiều mặt hang như: Tôm tươi còn vỏ, đầu (nguyên con) cấp đông IQF hoặc Block. Tôm vỏ bỏ đầu cấp đông IQF hoặc Block. Tôm bóc vỏ, bỏ chỉ lưng cấp đông IQF. Tôm bóc vỏ, còn đốt đuôi cấp đông IQF. Tôm dạng sản phẩm định hình, làm chín. Tôm bóc vỏ, đóng hộp. Điều này chứng tỏ tôm là một mặt hang đem lại nguồn lợi kinh tế lớn cho đất nước nhưng đồng thời cũng thải ra một lượng lớn đáng kể phế liệu, chủ yếu là vỏ và đầu tôm. Ngoài ra, có một lượng lớn đáng kể thịt vụn do bóc nõn không cẩn thận hoặc một số tôm bị thải loại do biến màu, chất lượng không đảm bảo. Tùy theo giống, loài và phương pháp gia công chế biến mà lượng phế liệu này có thể thay đổi từ 40% (đối với tôm sú) đến 60% (đối với tôm càng xanh) lượng nguyên liệu thu mua. Đối với sản phẩm tôm bóc nõn và rút ruột thì mất mát theo vỏ tôm và đuôi khoảng 25%. Nhìn chung, trong phế liệu tôm thì trọng lượng phần đầu thường gấp 3 – 4 lần so với phần vỏ và đuôi. Theo giáo trình “Sản xuất các chế phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu thuỷ sản”[11] của trường Đại học Nha Trang ta có các bảng sau: Bảng 1.1: Thành phần và trọng lượng của tôm (%) I.3 Cấu tạo và thành phần hóa học của phế liệu tôm I.3.1: cấu tạo vỏ tôm: Vỏ tôm chia làm 4 lớp chính: Lớp biểu bì (epicucle). Lớp màu. Lớp canxi hóa. Lớp không bị canxi hóa. Lớp biểu bì, lớp màu, lớp canxi hóa cứng do sự lắng đọng của canxi. Lớp màu, lớp canxi hóa, lớp không bị canxi hóa chứa nhiều chitin nhưng lớp biểu bì thì không. Ta gọi các lớp có chứa chitin là endocuicle. Lớp màu: tính chất của lớp này do sự có mặt của những thể hình hạt của vật chất mang màu giống dạng melanin. Chúng gồm những túi khứ hoặc những không bào. Một vài vùng xuất hiện những hệ thống rãnh thẳng đứng có phân nhánh, là con đường cho canxi thẩm thấu vào. Lớp biểu bì (epcuticle): những nghiên cứu cho thấy lớp màng nhanh chóng bị biến đỏ bởi Fucxin, có điểm pH = 5,1 không chứa chitin. Nó khác với các vỏ còn lại, bắt màu với anilin xanh. Lớp epicuticle có lipit vì thế nó cản trở tác động của axit ở nhiệt độ thường trong công đoạn khử khoáng bằng axit hơn là các lớp bên trong. Màu của lớp này thường vàng rất nhạt có chứa polyphenoloxidase và bị hóa cứng bởi puinone – tannin. Lớp epicuticle liên kết với một số màng mỏng bên ngoài cản trở hòa tan ngay cả trong môi trường axit đậm đặc do nó có chứa các mắt xích paratin mạch thẳng. Lớp canxi hóa: lớp này chiếm phần lớn vỏ, thường có màu xanh trải đều khắp, chitin ở trạng thái tạo phức với canxi. Lớp không bị canxi hóa: vùng trong cùng của lớp vỏ được tạo thành bởi một phần tương đối nhỏ so với tổng chiều dày bao gồm các phức chitin – protein bền vững không có canxi và quinine. I.3.2: Thành phần hóa học của vỏ tôm: Protein: thành phần protein trong phế liệu tôm thường tôn tại ở 2 dạng: dạng tự do và dạng liên kết Dạng tự do: dạng này là tồn tại ở phần thịt tôm từ một số tôm bị biến đổi và vứt đi lẫn vào phế liệu hoặc phần đầu và thịt còn sót lại trong đầu và nội tạng của tôm. Nếu công nhân vặt đầu không đúng kĩ thuật thì phần protein bị tổn thất vào phế liệu nhiều làm tăng tiêu hao nguyên vật liệu, mặt khác phế liệu này khó xử lý hơn. Dạng phức tạp: ở dạng này protein không hòa tan và thường liên kết với chitin, canxicacbonat, với lipit tạo thành lipoprotein, với sắc tố tạo proteincarotenoit…như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm. Chitin: tồn tại dưới dạng liên kết bởi những liên kết đồng hóa trị với các protein dưới dạng phức hợp chitin – protein, liên kết với các hợp chất khoáng và các hợp chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách và chiết chúng. Canxi: trong vỏ, đầu tôm, vỏ ghẹ…có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ yếu là muối CaCO3, hàm lượng Ca3(PO4)2 mặc dù không nhiều nhưng trong quá trình khử khoáng dễ hình thành hợp chất CaHPO4 không tan trong HCl gây khó khăn cho quá trình khử khoáng. Sắc tố: trong vỏ tôm thường có nhiêu loại sắc tố nhưng chủ yếu là astaxanthin. Enzym: theo tạp chí thủy sản (số 5/1993) hoạt độ enzym proteaza của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/gam tươi. Các enzym chủ yếu là enzym của nội tạng trong đầu tôm và của vi sinh vật thường trú trên tôm nguyên liệu. Ngoài thành phần chủ yếu kể trên, trong vỏ đầu tôm còn có các thành phần khác như: nước, lipit, photpho. Bảng 1.1: Thành phần hóa học của phế liệu tôm Phế liệu protein chitin lipit tro canxi photpho Đầu tôm 53,10 11,10 8,90 22,60 7,20 1,68 Vỏ tôm 22,80 27,20 0,40 31,70 11,10 3,16 Như vậy, trong phế liệu tôm hàm lượng chitin chiếm khá cao (từ 11,10 – 27,2%) và đây là nguồn nguyên liệu lý tưởng để sản xuất chitin. I.4: Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin – chitonsan trong tự nhiên Chitin – chitosan là một polysaccarit tôn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (đứng thứ 2 sau xenluloza). Trong tự nhiên chitin tồn tại trong cả động vật và thực vật. Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong động vật bậc cao monomer của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da, nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Trong thực vật chitin ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo[1]. Chitin - chitosan là polysacharit có đạm không độc, có khối lượng phân tử lớn. Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharit (N-acetyl-β-D-glucosamine) liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ chức. Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn liên kết cộng hóa trị với các protein, các chất khoáng và các hợp chất hữu khác. Hình 1: chitin và vỏ tôm Trong các loài thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ hàm lượng chitin – chitosan chiếm khá cao, dao động từ 14 – 35% so với trọng lượng khô [2]. Vì vậy, vỏ tôm, cua, ghẹ là nguôn nguyên liệu chính để sản xuất chitin – chitosan. Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821, trong cặn dịch chiết từ một loài nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguôn gốc của nó. Năm 1823 Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy Lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của Nito trong đó. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống xenlulose. Hình 2: 1) chitin; 2) chitosan; 3) xenlulose I.5: Cấu trúc hóa học, tính chất hóa lý của chitin I.5.1: Cấu trúc hóa học của chitin: Chitin I có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn. Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X, người ta đã chứng minh được chitin tồn tại ở 3 dạng cấu hình: α, β, γ – chitin [3]. Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích (N – acetyl – D – glucosmin) trong mạch. Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi tên chỉ nhóm – CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm – NHCOCH3, thì các cầu trúc α, β, γ – chitin được mô tả như sau: Hình 3: sắp xếp các mạch trong phân tử chitin α – chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững. Do các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuậ lợi về mặt không gian và năng lượng. Đây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên. β, γ – chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β – chitin) và hai song song một ngược chiều (γ – chitin), giữa các lớp không có loại liên kết hydro. Dạng β – chitin cũng có thể chuyển sang dạng α – chitin nhờ quá trình axetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn. Qua nhiều nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzym hay axit HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng chitin có cấu trúc là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N – acetyl – β – D – glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β – 1,4 – glucozit. Công thức cấu tạo của chitin: Tên gọi: poly(1,4) – 2 – acetamido – 2 – deoxy – β – D – glucose; poly(1,4) – 2 – acetamido – 2 – deoxy – β – D – glucopyranose. Công thức phân tử: [C8H13O5N]n. Phân tử lượng: Mchitin = (203,09)n. I.5.2: Tính chất hóa lý của chitin [4] Chitin có màu trắng hay màu trắng phớt hồng, dạng vảy hoặc dạng bột, không mùi, không vị, không tan trong nước, trong môi trường kiềm, axit loãng và các dung môi hữu cơ như ete, rượu… nhưng tan trong dung dịch đặc nóng của muối thioxianat canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo, tan được trong hệ dimetylacetamid – LiCl 8% [5], tan trong hexafluoro – isopropyl alcohol (CF3CHOHCF3) và hexafuoracetone sesquihydrate (CF3COCF3.H2O) [6]. Chitin có khả năng hấp thu tia hồng ngoại có bước sóng 884 – 890 cm-1. Chitin tồn tại với các chất oxy hóa mạnh như thuốc tím (KMnO4), oxy già (H2O2), nước javen (NaOCl – NaCl)…, lợi dụng tính chất này mà người ta sử dụng các chất oxy hóa trên để khử màu cho chitin. Khi đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40 – 50%), ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan: Lợi dụng tính chất này người ta điều chế ra chitosan – chất có nhiều ứng dụng như: ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm (màng bao gói, bảo quản thực phẩm), là chất trung gian điều chế ra glucosamine có nhiều tác dụng trong y học. Khi đun nóng trong axit HCl đậm đặc, ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị cắt mạch thu được glucosamine: Lợi dụng tính chất này người ta điều chế ra Glucosamine là một loại thuốc có tác dụng chống thoái hóa khớp. Phản ứng este hóa : - Chitin tác dụng với HNO3 đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat. - Chitin tác dụng với anhydrit sunfuric trong pyridin, dioxan và N,N-dimetylanilin cho sản phẩm chitin sunfonat. I.6: Phương pháp thu nhận chitin I.6.1: Phương pháp hóa học chitin Phế liệu tôm tươi Khử protein bằng NaOH 4%, T = 300 0C , = 24 giờ, w/v = 1/ 2,5 Rửa trung tính Kiểm tra hàm lượng protein Rửa trung tính Khử khoáng bằng HCl 4%, 24 giờ, 3000C Kiểm tra hàm lượng protein Cao hơn 5% Cao hơn 5% Chitin có thể được sản xuất theo phương pháp hóa học như sau: Hiệu quả của quá trình khử protein phụ thuộc vào nhiệt độ, nồng độ và tỉ lệ của dung dịch với khối lượng vỏ giáp xác. Nồng độ NaOH thường dùng được sử dụng trong khoảng 1 – 10 % và ở nhiệt độ 50 – 100 0C. Quá trình khử protein thích hợp cũng có thể đạt được bằng việc xử lý với dung dịch KOH. Quá trình khử khoáng cũng diễn ra với thời gian dài, nồng độ axit cao, nhiệt độ cao. Như vậy phương pháp hóa học có nhiều nhược điểm như gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến chất lượng chitin, không tận thu được các thành phần có giá trị khác (chất màu, protein làm thức ăn cho gia súc…) và như thế không giảm được giá thành sản phẩm, không nâng cao được hiệu quả cho việc sản xuất chitin. I.6.2: Phương pháp cơ học Nguyên lý: sử dụng các lực cơ học để tách một phần protein ra khỏi nguyên liệu vỏ tôm. Quá trình được tiến hành như sau: đầu tôm còn tươi đem rửa sạch, sau đó ép bằng trục lăn hoặc trục vít, thu protein đem sấy khô và bảo quản. hiệu quả thu hồi protein của phương pháp này không cao. Tuy nhiên, quá trình này đã loại bỏ được một phần protein tự do trong đầu tôm vì vậy giảm thiểu được hóa chất sử dụng cho các công đoạn tiếp theo. I.6.3: Phương pháp hóa lý Áp dụng phương pháp này nhằm thu hồi protein từ dịch thủy phân của công nghệ sản xuất chitin – chitosan theo phương pháp hóa học và phương pháp sinh học. Nguyên lý dựa trên việc kết tủa protein bằng cách dung axit để điều chỉnh pH dung dịch chứa protein về điểm đẳng điện của protein, sau đó dùng các phương pháp lắng, lọc để thu hồi protein. Dịch protein Kết tủa protein Lắng, gạn Kết tủa protein Lọc thu protein Lọc thu protein Phơi sấy Bột protein Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ làm, có thể thu hồi với hiệu suất cao. Cho phép thu được hầu hết các protein hòa tan do đó có thể ứng dụng để thu hồi protein trong nước thải của các nhà máy chế biến thực phẩm, chế biến thủy sản. I.6.4: Phương pháp sinh học Trong phương pháp sinh học chỉ khác ở công đoạn khử protein và deacetyl không sử dụng hóa chất mà có thể sử dụng hệ vi khuẩn, nấm men hoặc các enzym để loại bỏ protein một cách triệt để. Sản phẩm chitosan thu được có chất lượng cao do không bị ảnh hưởng nhiều bởi hóa chất. Việc sử dụng phương phap sinh học cũng gặp phải rất nhiều khó khăn như giá thành sản phẩm có thể cao, tùy thuộc vào loại enzym sử dụng. Việc loại bỏ hoàn toàn protein có thể đạt được bằng phương pháp hóa học nhưng rất khó đạt được bằng phương pháp sinh học. Vì vậy, người ta có thể kết hợp hai phương pháp này nhằm khắc phục những nhược điểm của từng phương pháp. Hiện nay, một trong những khó khăn trong phương pháp hóa học để sản xuất chitin là thể tích chất thải lớn và trong đó có chứa các chất ăn mòn, các chất lơ lửng khó xử lý với khối lượng lớn. Những chất này do công đoạn khử khoáng và khử protein sinh ra. Chính vì vậy, cần thiết phải có các biện pháp xử lý trước khi thải ra môi trường và điều này làm cho giá thành sản phẩm tăng lên. Quá trình sản xuất chitin bằng phương pháp hóa học có thể gây nên sự thủy phân polymer, biến đổi tính chất vật lý và gây ô nhiễm môi trường. Ngược lại, trong phương pháp sinh học khối lượng chất thải không lớn, protein sau thủy phân có thể thu hồi làm thức ăn gia súc và bên cạnh đó có thể thu hồi các chất màu. Hơn nữa sẽ hạn chế được việc xử lý môi trường. Vì vây, muốn sản phẩm chitin có được sự đồng nhất hơn về các đặc tính lý hóa thì chúng ta phải áp dụng những phương pháp xử lý êm dịu hơn như viêc sử dụng enzym. Legarraeta và cộng sự (1996) đã sử dụng enzym proteaza và vi khuẩn có khả năng tạo proteaza để tách protein nhằm thay thế cho phương pháp hóa học. Hall và De Silva (1994) đã đề xuất phương pháp khử khoáng đơn giản bằng việc sử dụng lên men lactic như một phương pháp bảo quản phế liệu. Phương pháp này là dạng ủ chua ban đầu được phát triển cho bảo quản phế liệu tôm pandan trước quá trình chế biến ở khí hậu nhiệt đới. Ủ chua là một quá trình đơn giản của việc bản quản nguyên liệu tránh vi sinh vật gây thối và đã được ứng dụng cho bản quản cá trong nhiều năm (Hall và De Silva, 1994). Quy trình sản xuất chitin theo phương pháp sinh học của Nguyễn Thị Vân An: Vỏ tôm Xay Khử Protein Khử khoáng Sấy khô Chitinn Nhận xét: chitin thu được có hàm lượng protein và khoáng rất thấp, sản phẩm chitin có màu sắc đẹp. Điều này có thể giải thích do trong quá trình khử protein bằng nước ép vỏ dứa thì đồng thời xảy ra quá trình khử khoáng nên liên kết giữa các muối Canxi và chitin bị cắt đứt càng tạo điều kiện cho quá trình khử khoáng và khử protein diễn ra một cách triệt để hơn. I.7: Tình hình nghiên cứu và sản xuất chitin trên thế giới và ở Việt Nam I.7.1: Tình hình nghiên cứu và sản xuất chitin trên thế giới Trước đây, người ta đã thử chiết tách chitin từ thực vật biển nhưng nguồn nguyên liệu không đủ để đáp ứng nhu cầu. Trữ lượng chitin phần lớn có nguồn gốc từ vỏ tôm, cua. Trong một thời gian, các chất phế thải này không được thu hồi mà lại thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường. Năm 1977 Viện kỹ thuật Masachusetts (Mỹ) khi tiến hành xác định giá trị của chitin và protein trong vỏ tôm, cua đã cho thấy việc thu hồi các chất này có lợi nếu sử dụng trong công nghiệp. Phần protein thu được sẽ dùng để chế biến thức ăn gia súc, còn phần chitin sẽ được dùng như một chất khởi đầu để điều chế các dẫn xuất có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp [7]. Gần đây xuất hiện nhiều nghiên cứu tập trung vào việc sản xuất bột đầu tôm bằng phương pháp sử dụng enzym proteaza (Synowwiecki và Al – Khateeb, 2003; Mizani, 2005; Helenice Duarteda Holanda and Netto F.M, 2006) [9]. Quá trình thủy phân protein đầu tôm bằng phương pháp enzym cho kết quả khả quan. Thủy phân đầu tôm bằng chế phẩm alcalaza thu được dịch thủy phân có nhiều các axit amin không thay thế rất thích hợp cho thức ăn gia súc (Mizani, 2005) [11] và tăng khả năng thu hồi protein trong dịch thủy phân và có thể dùng làm thức ăn cho cá [12], [13]. Mizani và Aminari đã chỉ ra rằng dùng enzym proteaza có thể tăng khả năng thu hồi protein từ 37% lên 45,7% [14]. Dịch thủy phân thu được bằng phương pháp sinh học có chứa các peptit có hoạt tính sinh học có thể dùng trong sinh học [12]. Thời gian thủy phân bằng enzym ngắn hơn phương pháp lên men. Enzym proteaza thường được dùng là papain, bromelain, pancreatin, chế phẩm alcalaza. Ưu điểm của phương pháp này là ngoài dịch thủy phân có thể thu hồi đồng thời chất sắc tố astaxanthin và chitin. Các nhận xét được trình bày dưới đây về các quy trình sản xuất chitin của tác giả Trần Thị Luyến. Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm hùm của Hackman Vỏ tôm hùm Ngâm HCl 2M, nhiệt độ phòng, = 5 giờ, w/v = 1/ 10 Rửa trung tính, sấy khô, nghiền mịn Ngâm HCl 2M, nhiệt độ phòng, = 48 giờ, w/v = 1/ 2,5 Ly tâm Rửa trung tính Ngâm NaOH 1M, T =100 0C, = 42 giờ, w/v = 1/ 2,5 Ly tâm Rửa trung tính Ngâm NaOH 1M, T =100 0C, = 12 giờ, w/v = 1/ 2,5 Ly tâm Rửa sạch bằng ly tâm Sấy khô Chitin dạng bột màu kem Nhận xét: Quy trình này gồm nhiều công đoạn, thời gian sản xuất kéo dài 65 giờ nên chỉ có ý nghĩa trong công tác nghiên cứu thí nghiệm vì khi đưa ra sản xuất đại trà thì thiết bị cồng kềnh, tốn kém, hóa chất đắt tiền, dễ hao hụt khi sản xuất I.7.2: Tình hình nghiên cứu và sản xuất chitin ở Việt Nam Việc nghiên cứu, sản xuất chitin- chitosan và các ứng dụng của chúng trong sản xuất phục vụ đời sống là một hướng nghiên cứu tương đối mới mẻ ở nước ta. Vào những năm 1978 đến 1980 Trường đại học Thủy sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitin – chitosan của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, nhưng chưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất. Gần đây, trước yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản đông lạnh đang ngày càng cấp bách, trước những thông tin kỹ thuật mới về chitin – chitosan cũng như tiềm năng thị trường của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học của chúng ta bắt tay vào việc nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin – chitosan ở bước cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực sản xuất công nghiệp. Hiện nay, Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan như: Trường đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm nghiên cứu polymer – Viện khoa học Việt Nam; Trung tâm công nghệ và sinh học thủy sản – viện nghiên cứu và nuôi trồng thủy sản 2. Vỏ tôm khô Ngâm HCl 6N, nhiệt độ phòng, = 48 giờ, w/v = 1/ 2,5 Rửa trung tính Ngâm NaOH 8%, T = 100 0C, = 48 giờ, w/v = 1/ 2,5 Rửa trung tính Tẩy màu chitin Quy trình của GVC Đỗ Minh Phụng-Đại học Nha Trang (1980) Nhận xét: Ưu điểm: Sản phẩm có chất lượng khá tốt, chitin có màu sắc đẹp. Nhược điểm: Sử dụng nhiều chất oxy hóa do đó dễ ảnh hưởng đến độ nhớt của sản phẩm, thời gian xử lý dài. b. Quy trình sử dụng enzym papain để sản xuất chitosan của PGS – TS Trần Thị Luyến ĐHTS Nha Trang. Vỏ tôm Ngâm HCl 10%, nhiệt độ phòng, 5 giờ, w/v = 1/10 Rửa trung tính Khử protein Rửa sạch Làm khô chitin Ngâm HCl 10%, nhiệt độ phòng, 5 giờ, w/v = 1/10 Vỏ tôm Nhận xét: Quy trình Papain cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các quy trình khác. Đặc biệt độ deacety, độ tan và hiệu suất quy trình có ưu thế hơn hẳn. Để nâng cao chất lượng chitosan có thể sử sụng enzyme papain thay thế cho NaOH để khử protein trong vỏ tôm. Đặc biệt dịch thủy phân thu được sử dụng cho các mục đích thu hồi protein và tận dụng. Điều đó chắc chắn mang lại hiệu quả cao. Tuy nhiên cần nghiên cứu quá trình xử lý tận dụng dịch thủy phân này. Cần tiếp tục sản xuất và chiết rút enzyme deacetylase để thay thế hoàn tất cho NaOH đặc trong công đoạn deacetyl. CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1: Nguyên liệu nghiên cứu II.1.1: Nguyên liệu chính II.1.1.1: Phế liệu tôm: Phế liệu tôm sử dụng trong nghiên cứu là phế liệu tôm Sú. Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius. Thành phần hóa học: Protein: 51,42 % so với chất khô tổng số. Chất khoáng tổng số: 23,26 % so với chất khô tổng số. Thu mua tại Công ty cổ phần chế biến và xuất khẩu thủy sản Phú Minh Hưng – Thị trấn Quảng Yên, huyện Quảng Yên, tỉnh Quảng Ninh. II.1.1.2: Enzym ancalaza: Sử dụng ancalaza của hãng Novo Đan Mạch. Hoạt lực enzym: 638 U/ml. II.1.1.3: Natrihydroxit: Sử dụng natrihydroxit dạng tinh thể. Công thức phân tử: NaOH M = 40.00 II.1.2: Hóa chất phụ: Các hóa chất phụ chủ yếu dùng cho quá trình phân tích gồm: Muối đồng sulfate (CuSO4. 5H2O) BSA ( Bovine Standard Albumin) Natri – Kali tartrat ( KNaC4H4O6. 4H2O) Tất cả các hóa chất trên được sử dụng ở dạng chế phẩm thương mại. II.2: Phương pháp nghiên cứu: II.2.1: Phương pháp nghiên cứu: Sản xuất chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp sinh học và sinh học kết hợp hóa học theo quy trình công nghệ như sau: Phế liệu tôm xay Khử protein lần 1 Khử khoáng.. Khử protein lần 2 bằng enzym alcalaza Sấy khô chitin Khử protein lần 2 bằng NaOH 1% Sấy khô chitin Quá trình khử protein: Tiến hành thí nghiệm để tìm ra những điều kiện tối ưu cho quá trình khử protein dưới ảnh hưởng của các yếu tố: Nhiệt độ: 50 0C – 65 0C. pH: 8 – 9. Lượng enzym: 1 – 2 ml. Thời gian thủy phân : 90 – 240 phút. Quá trình khử khoáng ( sử dụng axit lactic): Tiến hành khử khoáng với axit lactic nồng độ 75 g/l, ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 tiếng. II.3: Phương pháp phân tích: II.3.1: Xác định độ ẩm (hàm ẩm) Độ ẩm của nguyên liệu, chitin được xác định bằng phương pháp sấy mẫu ở nhiệt độ 1050C đến khối lượng không đổi. II.3.2: Xác hàm lượng tro: Cân 2g mẫu đã xác định độ ẩm vào chén sứ đã được sấy ở nhiệt độ 1050C đến khối lượng không đổi sau đó tiến hành nung ở nhiệt độ 6000C trong vòng 4h. Làm nguội trong bình hút ẩm. Hàm lượng tro được tính theo công thức: Trong đó: W1 : Khối lượng của cốc sau khi sấy ở 105oC trong 2 giờ W2 : Khối lượng của cốc và mẫu sau khi sấy ở 105oC trong 24 giờ W3 : Khối lượng của cốc và mẫu sau khi nung ở 600oC trong 4 giờ II.3.3: Xác định hàm lượng protein (phương pháp Biuret) - Chuẩn bị thuốc thử Hoà tan 1,5 g CuSO4 và 6 g Natri – Kali tartrat và khuấy thật kĩ (trong 500 ml nước cất) Thêm 300 ml NaOH 10% vào dung dịch, khuấy đều. Định mức thành 1 lít bằng nước cất để được dung dịch có nồng độ protein hoà tan là 10 mg/ml (0,1 g/ 10 ml nước cất) Xây dựng đường chuẩn bằng những dung dịch có nồng độ protein hoà tan từ 0 – 0,8 mg/ml Thêm 4 ml thuốc thử Buire vào mỗi ống nghiệm, lắc đều và để yên trong 30 phút. -Phương pháp tách chiết protein bằng NaOH Cân 1 g mẫu và cho vào ống ly tâm. Thêm 10 ml NaOH 3% vào ống và để qua đệm ở nhiệt độ phòng. Sau đó, đun nóng ống lên 90oC trong 1 giờ. Làm lạnh hỗn hợp xuống nhiệt độ phòng và lọc hỗn hợp. Nồng độ protein được phân tích ở phần vừa được lọc ra. Nước lọc được li tâm với tốc độ 6000 vòng/phúttrong 15 phút để chắc chắn rằng nước lọc đã được loại bỏ hoàn toàn các hạt nhỏ. Dịch protein thuỷ phân sau khi lọc (dịch trong) được pha loãng đến khoảng nồng độ của đường chuẩn đã được xây dựng. Sau khi pha loãng, 1 ml dịch thuỷ phân được trộn lẫn hoàn toàn và 4 ml thuốc thử Buiret và nồng độ của dung dịch được đo bằng độ hấp thụ ở 570 nm II.3.4: Phương pháp quy hoạch thực nghiệm Sử dụng quy hoạch bậc hai trực giao để lập ma trận thí nghiệm, tiến hành thí nghiệm theo ma trận đó và đưa ra kết quả ưu hóa theo mô hình tối ưu. II.3.5: Xử lý số liệu Kết quả được xử lý bằng phần mềm thống kê Design-Expert 7.1, để phân tích ác hệ số hồi quy, bề mặt đáp ứng và tối ưu hóa thuật toán hàm mong đợi. Các bước thực hiện bài toán quy hoạch: Chọn các yếu tố ảnh hưởng Chọn hàm mục tiêu Y Chọn miền khảo sát Tiến hành tối ưu hóa CHƯƠNG III: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN III.1: Kết quả nghiên cứu về nguyên liệu: Kết quả nghiên cứu thành phần chính của nguyên liệu được thể hiện ở bảng 3.1 như sau: Bảng 3.1: Kết quả thành phần hóa học của đầu tôm nguyên liệu STT Chỉ tiêu phân tích Kết quả 1 Độ ẩm (%) 77,80 2 Hàm lượng tro tổng số (%) 23,26 3 Hàm lượng protrin (%) 51,42 Bảng 3.2: Kết quả tham khảo thành phần hóa học của đầu tôm nguyên liệu STT Chỉ tiêu phân tích Kết quả 1 Độ ẩm (%) 77,5 ± 1,2 2 Hàm lượng tro tổng số (%) 24,6 ± 0,8 3 Hàm lượng protein (%) 47,4 ± 1,8 Như vậy: kết quả nghiên cứu tho thấy độ ẩm và thành phần khoáng tương đối gần nhau. Hàm lượng protein của tôm nguyên liệu cao hơn so với kết quả tham khảo (51,42 >47,4 ± 1,8). Điều này được giải thích như sau: Do kĩ thuật bóc vỏ nên trên đầu tôm còn sót lại thịt tôm Do trong phế liệu tôm còn có những con tôm bị ươn, hỏng không được sử dụng để chế biến thực phẩm Do tỷ lệ giữa các thành phần trong vỏ tôm không ổn định, chúng thay đổi theo mùa vụ, theo giống, theo giống, loài và đặc điểm sinh thái, sinh lý III.2: Kết quả nghiên cứu quá trình sản xuất chitin: III.2.1. Giai đoạn khử protein lần 1: Chitin là một polysaccarit cao phân tử, trong vỏ tôm nó liên kếtvới protein bằng liên kết cộng hóa trị mạnh (Brine, 1991; Roberts, 1992 ; Chang, 1997) . Quá trình khử protein trong vỏ tôm thực chất là quá trình thủy phân protein. Trong quy trình sản xuất chitin truyền thống, quá trình này diễn ra dưới tác dụng của NaOH. Nghiên cứu của Percot và cộng sự (2003) đã chỉ rõ khi khử protein chỉ bằng NaOH năng lượng hoạt hóa cho giai đoạn đầu khá lớn vì vậy cần sử dụng NaOH có nồng độ cao, trong thời gian dài, dẫn đến suy giảm chất lượng chitin đồng thời cũng làm giảm chất lượng của protein tách ra. Trong nghiên cứu này, em sử dụng Enzym alcalaza là một proteza kiềm. Alcalaza sẽ xúc xúc tác cho phản ứng phân cắt các liên kết peptit trong phân tử protein tạo thành các axit amin hòa tan trong nước và các axit amin này sẽ được tách ra khỏi vỏ tôm trong quá trình rửa trung tính sau thủy phân. Do đó mà làm giảm lượng protein trong vỏ tôm. Bên cạnh đó có thể tận dụng dịch thủy phân protein làm thức ăn cho gia súc. III.2.1.1: Lựa chọn các yếu tố và miền khảo sát: Căn cứ vào đặc tính của enzym alcalaza, lựa chọn miền khảo sát như sau: - Nhiệt độ thủy phân : từ 50 – 65 0C. - pH của dịch thủy phân: từ 8 – 9. - Thời gian thủy phân: từ 90 – 240 phút. - Lượng enzym thủy phân: từ 1 – 2 ml. Bảng 3.3: Giá trị mã hóa và thực nghiệm của các yếu tố khảo sát Yếu tố Ký hiệu Đơn vị Mức - a -1 0 +1 +a pH A 7,79289 8 8,5 9 9,20711 Nhiệt độ B 0C 46,8934 50 57,5 65 68,1066 Lượng enzym C ml 0,792893 1 1,5 2 2,20711 Thời gian D phút 58,934 90 165 240 271,066 III.2.1.2. Thiết lập mô hình Kết quả thực nghiệm khử protein theo quy hoạch trực giao bậc hai, bốn yếu tố được liệt kê trong bảng 3.3 Bảng 3.3: Kết quả ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng protein còn lại Std A: pH B: nhiệt độ (0C) C: lượng Enzym (ml) D: thời gian (phút) Hàm lượng Protein còn lại (% chất khô) 1 8.00 50.00 1.00 90.00 21.28 8 9.00 50.00 1.00 90.00 16.86 3 8.00 65.00 1.00 90.00 15.29 4 9.00 65.00 1.00 90.00 17.98 5 8.00 50.00 2.00 90.00 17.78 6 9.00 50.00 2.00 90.00 13.70 7 8.00 65.00 2.00 90.00 16.12 8 9.00 65.00 2.00 90.00 16.39 9 8.00 50.00 1.00 240.00 20.48 10 9.00 50.00 1.00 240.00 17.29 11 8.00 65.00 1.00 240.00 14.62 12 9.00 65.00 1.00 240.00 18.60 13 8.00 50.00 2.00 240.00 14.54 14 9.00 50.00 2.00 240.00 11.85 15 8.00 65.00 2.00 240.00 13.10 16 9.00 65.00 2.00 240.00 14.70 17 8.50 57.50 1.50 165.00 14.00 18 8.50 57.50 1.50 165.00 13.22 19 8.50 57.50 1.50 165.00 13.34 Khả năng khử protein được đánh giá bằng hàm lượng protein còn lại sau khi thủy phân và rửa trung tính. Hàm lượng protein còn lại càng thấp, khả năng khử càng cao. Lần lượt xét ảnh hưởng của từng yếu tố (khi giữ nguyên các yếu tố khác ở những giá trị xác định). III.2.1.2.a.Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân tới quá trình khử protein. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng khử protein được thể hiện ở hình 3.3: Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH thủy phân đến hiệu quả của quá trình khử protein Dựa vào bảng 3.3 và hình 3.3 cho thấy nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân là từ 50 – 60 0C. Nếu tăng nhiệt độ lên cao, ví dụ 65 0C sẽ làm giảm hoạt tính xúc tác của enzyme alcalaza vì độ bền và hoạt tính của enzyme phụ thuộc vào độ bền nhiệt của protein enzyme, enzyme sẽ giảm dần hoạt tính, và nếu tăng quá cao, enzym sẽ bị vô hoạt. Cụ thể khi so sánh thí nghiệm số 14 và 16 ta thấy: ở cùng điều kiện pH = 9, thời gian thủy phân là 240 phút , hàm lượng enzym cho vào là 2 ml thì hàm lượng protein còn lại sau khi thủy phân ở 65 0C là 14,7 %, trong khi ở nhiệt độ 50 0C là 11,85 %. III.2.1.2.b.Ảnh hưởng của pH dung dịch thủy phân tới quá trình khử protein. Ảnh hưởng của pH đến khả năng khử protein được thể hiện ở hình 3.4: Hình 3.4. Ảnh hưởng của pH dung dịch thủy phân và lượng enzym tới quá trình khử protein Hình 3.4 và bảng 3.3 cho thấy alcalaza là một proteaza kiềm. Và pH thích hợp cho quá trình thủy phân là từ 8,5 – 9. Ở cùng điều kiện nhiệt độ 50 0C, thời gian 240 phút, lượng enzym là 1 ml, khi pH tăng thì khả năng khử protein tăng thể hiện ở thí nghiệm số 9 và số 10, khi pH = 8 hàm lượng protein còn lại là 20,48% nhưng khi tăng pH lên 9 thì hàm lượng protein giảm còn 17,29%. III.2.1.2.c. Ảnh hưởng của lượng enzym tới quá trình khử protein: Ảnh hưởng của lượng enzym tới quá trình thủy phân protein được thể hiện trên hình 3.5: Hình 3.5: Ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ và lượng enzym đến hiệu quả của quá trình khử protein. Bảng 3.3 và hình 3.5 cho thấy khi nồng độ enzym càng tăng thì hiệu quả khử protein càng tăng. Qua nhiều dẫn liệu thực nghiệm cho thấy rằng quá trình tạo thành phức enzym – cơ chất (ES) và biến đổi phức này thành sản phẩm giải phóng ra enzym tự do thường trải qua 3 giai đoạn như ở sơ đồ dưới đây [10]: E + S ES P + E Giai đoạn thứ nhất: enzym kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức enzym – cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hởi năng lượng hoạt hóa thấp. Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng. Giai đoạn thứ ba: tạo ra sản phẩm còn enzym được giải phóng ra dưới dạng tự do. Như vậy, với ưu điểm tạo ra enzym ở dạng tự do ở giai đoạn thứ ba sẽ quay vòng trở lại tiếp tục tham gia phản ứng thủy phân. Hơn nữa, cùng với lượng cơ chất không đổi khi hàm lượng enzym tăng sẽ tăng cường xúc tác cho phản ưng thủy phân đạt hiệu quả cao hơn. Tuy nhiên, nếu lượng enzym cho vào quá cao sẽ gây lãng phí. Và cần lưu ý rằng, nếu phản ứng ở nhiệt độ cao và thời gian dài thì sẽ làm giảm hoạt lực của enzym, làm giảm khả năng xúc tác của enzym. Cụ thể khi so sánh kết quả thí nghiệm số 2 và số 6: ở cùng điều kiện nhiệt độ 50 0C, pH = 9.0 , thời gian thủy phân là 90 phút, khi lượng enzym là 1 ml thì hàm lượng protein còn lại là 16,86 % nhưng khi tăng hàm lượng enzym lên 2 ml thì hàm lượng protein còn lại giảm đáng kể chỉ còn 13,7 %. Như vậy hàm lượng protein còn lại giảm 18,74 %. III.2.1.2.d.Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới quá trình khử protein. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới quá trình khử protein được thể hiện trong hình 3.6. Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian và lượng enzym đến quá trình khử protein Bảng 3.3 và hình 3.6 cho thấy, thời gian thủy phân càng lâu thì hiệu quả thủy phân càng tốt, hàm lượng protein còn lại càng thấp. Điều này được giải thích như sau: ban đầu, enzyme tiếp xúc với protein ở lớp ngoài của vỏ tôm, sau khi thủy phân protein ở lớp ngoài, các liên kết peptit bị cắt đứt, tạo các axit amin hòa tan vào dung dịch phản ứng do đó tạo điều kiện cho enzyme tiếp xúc với các phân tử protein ở lớp trong của vỏ tôm. Cứ thế, quá trình phản ứng tiếp tục diễn ra. Vì vậy, thời gian thủy phân càng kéo dài thì khả năng thủy phân protein càng tăng. So sánh kết quả thí nghiệm số 8 và 14: ở cùng điều kiện thủy phân 50 0C, pH = 9, và lượng enzyme là 2 ml, khi thời gian thủy phân là 90 phút thì hàm lượng protein còn lại là 13,7 %. Khi tăng thời gian thủy phân lên 240 phút thì hàm lượng protein còn lại là 11,85 %. Như vậy, hàm lượng protein còn lại giảm 13,50 %. Mặt khác, trong quá trình thủy phân các liên kết giữa chitin-protein-xianin (astaxanthin liên kết với lipoprotein)-lipit cũng bị khử nên astaxanthin bị tách ra trong hỗn hợp phản ứng dưới dạng màu nâu đỏ, lipit tách ra khuyech tán vào dung dịch. Thời gian thủy phân càng dài, lượng protein bị thủy phân càng lớn, astaxanthin, lipit tách ra càng nhiều, hiệu quả khử màu, khử lipit càng cao. III.2.1.3. Tối ưu hóa quá trình khử protein: Quá trình khử protein được tiến hành sao cho hàm lượng protein còn lại trong vỏ tôm sau thủy phân là nhỏ nhất. Tiến hành giải bài toán tối ưu hóa theo phương pháp “hàm mong đợi”. Sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.6 để tiến hành tối ưu hóa nhằm xác định được giá trị của bộ 4 yếu tố ảnh hưởng mà tại đó ta thu được hàm lượng protein thấp nhất. Tiến hành xây dựng hàm hồi quy bậc 2 cho mục tiêu hàm lượng protein còn lại (nhỏ nhất). Hàm lượng protein còn lại: R1 = a0 + a1 A +a2B + a3C + a4D + a12AB + a13AC + a14AD + a23BC + a24BD + a34CD + a11A2 + a22B2 + a33C2 + a44D2 Kiểm tra sự có nghĩa của các hệ số và sự tương thích của mô hình được tiến hành bằng phân tích hồi quy theo phụ lục 4: - Chuẩn F của mô hình bằng: 32.90 cho thấy hai mô hình hoàn toàn có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99.99% (p<0.0001). - Hệ số tương quan bội của mô hình là R2 = 0.9705 và Adj R2 = 0,9410 cho thấy mô hình hoàn toàn tương thích với thực nghiệm. - Kết quả kiểm tra sự không có nghĩa của mô hình là “not significant” cũng cho thấy mô hình hoàn toàn có nghĩa. Theo phụ lục 5 ta có: Hàm mục tiêu hàm lượng protein còn lại dạng code là: Ham luong protein = +16.29 -0.37 * A -0.44 * B -1.51 * C -0.64 * D +1.43 * A * B -0.25 * A * C +0.74* B * C -0.59 * C * D -2.77 Hàm mục tiêu hàm lượng protein còn lại dạng thực là: R1 = +219.04183-21.21000 * pH-3.60167 * Nhiet do-3.39883 * Luong enzim+0.014933 * thoi gian +0.38200 * pH * Nhiet do-0.99000 * pH * Luong enzim+0.19767* Nhiet do * Luong enzim-0.015633 * Luong enzim * Thoi gian Tiến hành tối ưu hóa nhằm xác định được giá trị của bộ 4 yếu tố ảnh hưởng mà tại đó ta thu được hàm lượng protein thấp nhất với mục tiêu theo bảng sau: Bảng 3.5: Mục tiêu hàm lượng protein theo yêu cầu Yếu tố Mục tiêu Giới hạn dưới Giới hạn trên Tầm quan trọng pH Trong giải 8 9 3 Nhiệt độ (0C) Trong giải 50 65 5 Lượng enzym Trong giải 1 2 5 Thời gian 165 90 240 3 Hàm lượng protein Thấp nhất 5 Kết quả thu được ở phụ lục 1. Dựa vào phụ lục 1 cho kết quả tối ưu của quá trình khử protein lần 1 bằng enzym là: Bảng 3.6: Điều kiện tối ưu cho quá trình khử protein từ phế liệu tôm Yếu tố Tối ưu Nhiệt độ 50 0C pH 9 Thời gian 165 phút Lượng enzym 2 ml Khi đó các mức độ đáp ứng hàm mong đợi được thể hiện ở hình 3.7. Hình 3.7 thể hiện các yếu tố pH, nhiệt độ, lượng enzym, thời gian đạt được tối ưu thì khả năng đạt được hàm mong đợi (hàm lượng protein còn lại thấp nhất) là rất cao đạt tới 93,929 %. Tiến hành thực nghiệm theo điều kiện tối ưu. Kết quả thành phần hoá học của vỏ tôm được thể hiện ở bảng 3.7: Bảng 3.7: Thành phần hoá học của vỏ tôm Thành phần Hàm lượng(%) Mẫu nguyên liệu Mẫu sau khi khử protein Protein 51,42 12,42 Tro 23,26 Như vậy, so với các phương pháp hóa học (sử dụng kiềm để khử protein) thì quá trình khử protein bằng enzym mang lại nhiều ưu điểm: giảm được chi phí sản xuất do tận dụng được dịch thủy phân protein làm thức ăn cho chăn nuôi gia súc do vậy không tạo ra nguồn nước thải có hại cho môi trường. Quá trình thủy phân ở nhiệt độ 50 0C trong thời gian 165 phút sẽ giảm chi phí năng lượng hơn so với quy trình thủy nhiệt Yamasaky và Nacamichi Nhật Bản ở nhiệt độ 1500C [7] và quy trình của xí nghiệp thuỷ sản Hà nội [8] ở nhiệt độ 90-950C. (đều khử protein bằng phương pháp hóa học) So với kết quả nghiên cứu của Helenike Duarte Holanda and Flavia Maria Netto [9] (Hàm lượng protein còn lại sau khi khử protein bằng enzym alcalaza là 9,19 ±0,1 %). Sở dĩ có sự khác nhau đó là do trong nghiên cứu của Helenike Duarte Holanda and Flavia Maria Netto thủy phân trong điều kiện: hàm lượng enzym alcalaza là 3%, nhiệt độ 60 0C, thời gian 240 phút). Đánh giá cảm quan quá trình khử protein lần 1: Hình 3.8.a: vỏ tôm nguyên liệu Hình 3.8.b : vỏ tôm sau khi khử Protein Hình 3.8.a, b, c cho thấy: Màu sắc: vỏ tôm sau khi thủy phân đã mất một lượng nhỏ những vết màu đỏ như ở vỏ tôm nguyên liệu, chứng tỏ trong quá trình thủy phân protein, astaxanthin cũng bị khử nhưng không đáng kể. Mẫu khử bằng enzym cho màu sắc sẫm màu trong khi quá trình khử bằng NaOH cho chitin màu trắng. Như vậy, quá trình khử protein bằng enzym chúng ta có thể tận thu được chất màu astaxanthin có tính chất chống oxi hóa Bề mặt: Vỏ tôm sau khi thủy phân protein có bề mặt không bóng bằng vỏ tôm nguyên liệu do trong quá trình khử protein, lipid cũng bị khử theo, làm giảm hàm lượng lipid trong vỏ tôm, dẫn đến thay đổi sự khúc xạ ánh sáng trên bề mặt vỏ tôm. Độ cứng: Vỏ tôm sau thủy phân mềm hơn vỏ tôm nguyên liệu do một phần các muối khoáng trong thành phần của vỏ tôm cũng bị khử trong quá trình thủy phân protein. III.2.2. Giai đoạn khử protein lần 2: Để đáp ứng yêu cầu chỉ tiêu chất lượng của chitin (hàm lượng tro < 5%, hàm lượng protein < 5%) cần thiết phải tiến hành quá trình khử protein lần 2. Tiến hành khử protein lần 2 theo 2 hướng: Khử protein bằng enzym alcalaza. Khử protein bằng NaOH 1%. Bảng 3.8: Hàm lượng protein còn lại sau khử protein lần 2 bằng enzym Hàm lượng Pr ban đầu (%) Tỷ lệ enzym/mẫu (v/w Tỷ lệ vỏ tôm/nước Thời gian (phút) pH Nhiệt độ (0C) Hàm lượng Pr còn lại (%) 12,42 1 1/10 165 9 50 3,3 Bảng 3.9: Hàm lượng protein còn lại sau khử protein lần 2 bằng NaOH Hàm lượng protein ban đầu (%) Nồng độ NaOH (%) Tỷ lệ NaOH/mẫu (v/w) Thời gian (giờ) Nhiệt độ (0C) Hàm lượng Pr còn lại (%) 12,42 1 1/10 4 50 2,29 Như trên đã nói thì trong quy trình sản xuất chitin truyền thống, quá trình khử protein diễn ra dưới tác dụng của NaOH. Nghiên cứu của Percot và cộng sự (2003) đã chỉ rõ khi khử protein chỉ bằng NaOH năng lượng hoạt hóa cho giai đoạn đầu khá lớn vì vậy cần sử dụng NaOH có nồng độ cao, trong thời gian dài, dẫn đến suy giảm chất lượng chitin đồng thời cũng làm giảm chất lượng của protein tách ra. Như vậy việc kết hợp sử dụng Enzym chứ không chỉ dùng hóa chất trong quá trình sản xuất chitin-chitosan có ưu thế hơn so với phương pháp hóa học truyền thống là giảm thiểu lượng hóa chất sử dụng và thải ra môi trường. Mặt khác quy trình cải tiến với sự vượt trội về chất lượng chitin, chitosan thu được và thu hồi sản phẩm protein-astaxanthin có giá trị dinh dưỡng và sinh học có tác dụng làm hạn chế các chất hữu cơ có trong nước thải, giảm thiểu chi phí xử lý môi trường. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường trầm trọng do các cơ sở chế biến chitin-chitosan gây ra, góp phần phát triển bền vững ngành công nghiệp sản xuất chitin-chitosan từ phế liệu thủy sản. Đây là một hướng đi cho phương pháp sản xuất sạch hơn. Bên cạnh đó, việc kết hợp hóa học và sinh học còn đảm bảo vấn đề giá thành sản xuất hợp lý, cơ hội cho mở rộng sản xuất với quy mô lớn. So với kết quả nghiên cứu của Helenike Duarte Holanda and Flavia Maria Netto [9] (khi tiến hành khử protein lần 2 bằng KOH trong điều kiện thủy phân nồng độ KOH = 1%, thời gian là 2 giờ và nhiệt độ 90 0C) cho kết quả hàm lượng protein còn lại là 3,99% thì kết quả nghiên cứu khi khử protein lần 2 bằng NaOH 1% cho hàm lượng protein còn lại thấp hơn ( 2,29%<3,99%), tuy nhiên thời gian lại dài hơn. III.2.1. Giai đoạn khử khoáng: Trong vỏ các loài giáp xác chitin liên kết với Protein và khoáng theo từng lớp tạo nên độ chắc cho lớp vỏ. Quá trình loại bỏ khoáng, chủ yếu là các muối canxi được thực hiện trong môi trường axit. Trong quy trình sản xuất chitin truyền thống, quá trình tách khoáng chỉ tiến hành một giai đoạn, lượng khoáng trong vỏ được loại bỏ dưới tác dụng của axit clohydric ở nồng độ cao trong thời gian dài. Hiệu quả tách khoáng của quy trình khá cao tuy nhiên chất lượng của chitin bị ảnh hưởng đáng kể (Trần Thị Luyến, 2000, percot và cộng sự 2003). Mặt khác, khi sử dụng axit HCl còn tạo ra nguồn nước thải có hại, làm tăng giá thành của quá trình tinh chế chitin. Trong nghiên cứu này em sử dụng axit hữu cơ (axit lactic) để khử khoáng trong điều kiện như sau: Bảng 3.9: Điều kiện khử khoáng Yếu tố Lượng axit lactic 75 (g/l) Thời gian 5 (giờ) Tỷ lệ dung dịch axit/phế liệu tôm (w/v) 1/10 Kết quả thu được như sau: Bảng 3.10: Thành phần vỏ tôm sau khi khử khoáng Mẫu Hàm lượng tro/chất khô tổng số (%) Nguyên liệu 23,26 Sau khử khoáng 0,57 Như vậy, khi sử dụng axit hữu cơ (axit lactic) để khử khoáng không làm giảm phẩm chất của chitin, bên cạnh đó còn khắc phục được các hạn chế so với việc khử khoáng bằng axit vô cơ mạnh, tiết kiệm năng lượng vì chế độ khử khoáng ở nhiệt độ thấp (nhiệt độ thường). Trong khi một số quy trình sử dụng HCl khác cần nhiệt độ cao: cụ thể là “quy trình thủy nhiệt Yamasaky và Nacamichi Nhật Bản” ở nhiệt độ 1200C. So với phương pháp sử dụng axit vô cơ thì phương pháp này tương đối đơn giản, dễ thực hiện. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi thiết bị phản ứng phức tạp: do phản ứng khử khoáng sử dụng axit lactic sẽ tạo muối lactate kết tủa( lactate canxi, lactate magie) nên cần thiết phải tăng sự tiếp xúc giữa axit và vỏ tôm để đẩy mạnh vận tốc phản ứng, vì vậy, thiết bị phản ứng phải có cánh khuấy để khuấy trộn liên tục hỗn hợp phản ứng. Đánh giá cảm quan quá trình khử khoáng: Hình a: Mẫu sau khi khử khoáng Hình b: Mẫu sau khi khử protein lần 1 Từ hình a và b ta thấy: về màu sắc: sau khi khử khoáng thì màu đỏ của vỏ tôm đã giảm nhiều so với mẫu sau khi khử protein chứng tỏ trong quá trình khử khoáng đã xảy ra quá trình khử astaxanthin tương đối hiệu quả. về độ dày: vỏ tôm sau khử khoáng mỏng hơn vỏ tôm nguyên liệu rất nhiều do phần lớn các chất khoáng đã bị tách khỏi vỏ tôm. Vỏ tôm trở nên nhẹ, tơi và xốp hơn rất nhiều so với tôm nguyên liệu. Độ cứng: Vỏ tôm sau khử khoáng mềm hơn vỏ tôm nguyên liệu rất nhiều do các chất tạo nên độ cứng của vỏ tôm chủ yếu là các muối khoáng đã bị khử đi nhiều, chỉ còn lại một phần nhỏ ( 0.57% chất khô). CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN Tổng kết những kết quả nghiên cứu, em đã xây dựng được quy trình sản xuất chitin từ phế liệu tôm tươi bằng phương pháp sinh học và sinh học kết hợp hóa học như sau: Phế liệu tôm xay Khử protein lần 1 Rửa trung tính Khử khoáng.. Rửa trung tính Khử protein lần 2 bằng enzym alcalaza Rửa trung tính Sấy khô chitin Khử protein lần 2 bằng NaOH 1% Rửa trung tính Sấy khô chitin Nguyên liệu: Phế liệu tôm Sú tươi. Xay: Mục đích làm giảm kích thước, tăng bề mặt tiếp xúc giữa vỏ tôm và Enzym, kiềm và axit, tạo điều kiện cho quá trình khử protein và khử khoáng. Tiến hành xay để đạt kích thước vỏ tôm là = 3 mm. Khử protein lần 1: Mục đích: loại bỏ protein ra khỏi liên kết với chitin trong vỏ tôm. Tiến hành: khử protein bằng enzym alcaaza ở nhiệt độ 50 0, pH = 9, nồng độ enzym là 2 %, thời gian là 165 phút, tỷ lệ vỏ tôm / nước là 1/10. Rửa trung tính: Mục đích: rửa trôi toàn bộ phần protein và các sản phẩm thủy phân của protein đã tách ra trong quá trình khử protein. Tiến hành rửa đến khi pH của mẫu đạt 7.0 Khử khoáng: Mục đích: loại bỏ các chất khoáng và chất màu ra khỏi liên kết với chitin trong vỏ tôm. Tiến hành khử khoáng ở nồng độ axit lactic 75 g/l, tỷ lệ dung dịch axit / vỏ tôm là 1/10, thời gian phản ứng 5h. Rửa trung tính: Mục đích: loại bỏ các chất khoáng và chất màu ra khỏi liên kết với chitin trong vỏ tôm. Tiến hành: Tiến hành rửa đến khi pH của mẫu đạt 7.0 Khử protein lần 2: Mục đích: tiếp tục loại bỏ protein để thu được vỏ tôm có hàm lượng protein còn lại nhỏ hơn 5%. Tiến hành: Phương pháp sinh học: khử protein bằng enzym alcalaza ở nhiệt độ 50 0C, pH = 9, nồng độ enzym là 1 %. Phương pháp sinh học kết hợp hóa học: khử protein bằng NaOH 1 % trong điều kiện nhiệt độ 50 0C, thời gian 4 tiếng và tỷ lệ NaOH / mẫu là 1/10. Rửa trung tính: Mục đích: rửa trôi toàn bộ phần protein và các sản phẩm thủy phân của protein đã tách ra trong quá trình khử protein. Tiến hành: Tiến hành rửa đến khi pH của mẫu đạt 7.0 Hình 4.1: Chitin thu được theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học Hình 4.2: Chitin thu được theo phương pháp sinh học