Đề tài Phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon) bằng kỹ thuật Real - Time PCR

1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nuôi trồng thủy sản là ngành kinh tế quan trọng đóng góp một phần đáng kể trong thị phần xuất khẩu của một số quốc gia trên thế giới đặc biệt các nước Châu Á như Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan,Việt Nam, In-đô-nê-xi-a, Ấn Độ. Hiện nay để tăng sản lượng nuôi tôm, việc áp dụng kỹ thuật tiên tiến như nuôi thâm canh năng suất cao và tăng diện tích nuôi đã có nhiều tác động đến môi trường sinh thái các vùng nuôi. Vấn đề ô nhiễm môi trường, sự bùng phát dịch bệnh cũng thường xuyên diễn ra. Trong đó bệnh đốm trắng chiếm tỷ lệ rất cao. Bệnh này đã gây thiệt hại không nhỏ cho nghề nuôi tôm sú từ những năm 1993 - 1994 và đã tác động mạnh đến nghề nuôi tôm công nghiệp của thế giới. Bệnh đốm trắng gây tác hại rất nghiêm trọng trên tôm sú. Đặc trưng của bệnh là gây nên tỷ lệ chết khá cao và có thể gây chết hàng loạt cho tôm sú nuôi trong thời gian ngắn trên các ao nuôi bị nhiễm bệnh. Sự lan rộng của dịch bệnh đốm trắng đã làm sản lượng tôm nuôi ở Đài Loan từ 95.000 tấn vào năm 1987 giảm xuống chỉ còn 30.000 tấn vào năm 1988 (Liao và ctv., 1992; trích bởi Thuy Thi Ngoc Phan, 2001); ở Việt Nam sản lượng tôm nuôi từ 50.000 tấn vào năm 1995 giảm xuống còn 30.000 tấn năm 1997 (World Shrimp Farming, 1997; trích bởi Trần Thị Hoàng Dung, 2000). Hiện nay, việc nghiên cứu để tìm phương pháp điều trị bệnh này vẫn còn nhiều khó khăn và chưa có hiệu quả rõ ràng. Phương pháp để hạn chế thiệt hại do bệnh đốm trắng gây ra vẫn là các biện pháp phòng bệnh trong quá trình nuôi. Trong đó, việc chẩn đoán bệnh đốm trắng ở giai đoạn tôm giống trước khi thả nuôi và việc chẩn đoán bệnh kịp thời trong giai đoạn nuôi để có biện pháp xử lý thích hợp là một điều vô cùng cần thiết. Kỹ thuật PCR từ lâu đã được xem là cách tiếp cận hứa hẹn nhất đối với việc phát hiện mầm bệnh. Trong những năm qua, kỹ thuật PCR đã phát triển không ngừng thông qua những cải tiến mới về nguyên lý, thiết bị và hóa chất. Phương pháp Real - time PCR là một trong những cải tiến mới nhất của kỹ thuật PCR. Phương pháp Real - time PCR rút ngắn thời gian phân tích kết quả. Khả năng định lượng trong kỹ thuật Real - time PCR đảm bảo giảm thiểu xác suất dương tính giả đối với kết quả phân tích. Với ưu điểm như vậy, phương pháp Real - time PCR cho phép phát hiện và định lượng virus gây bệnh tôm trước khi xuất hiện các biểu hiện sinh lý 2 (Tạp chí Thủy sản, số 3 – 2004). Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng giúp cho các chủ trại tôm có đủ thời gian đưa ra những giải pháp hợp lý để phòng ngừa và ngăn chặn dịch bệnh trước khi bệnh bùng phát. Ở Việt Nam, kỹ thuật PCR đang được dùng phổ biến trong chẩn đoán virus gây bệnh đốm trắng trên tôm nuôi. Hiện nay, đối với Real – time PCR, nước ta chưa có công trình nghiên cứu nào công bố về việc sử dụng kỹ thuật này trong phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi. Do đó, được sự đồng ý bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm, dưới sự hướng dẫn của ThS. Phan Thị Ngọc Thủy và ThS. Nguyễn Thái Thủy, tôi thực hiện đề tài “Phát hiện và định lƣợng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon) bằng kỹ thuật Real - time PCR” nhằm phát hiện nhanh, chính xác và định lượng virus gây bệnh đốm trắng; góp phần phòng ngừa sự lây lan và bùng phát dịch bệnh này. 1.2. Mục đích yêu cầu 1.2.1. Mục đích - Thử nghiệm kỹ thuật Real - time PCR để phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú nuôi. - So sánh kỹ thuật mới: Real - time PCR và kỹ thuật đang được sử dụng: Nested PCR trong phát hiện WSSV trên tôm sú nuôi. - Ứng dụng kỹ thuật Real - time PCR để phát hiện và định lượng WSSV ở các giai đoạn tôm sú nuôi từ thực tiễn. 1.2.2. Yêu cầu - Nắm vững và hiểu rõ về kỹ thuật PCR và Real - time PCR. - Sử dụng thành thạo hệ thống PCR và Real - time PCR. - Bố trí thí nghiệm, xây dựng thành công quy trình phát hiện và định lượng WSSV trên tôm sú nuôi bằng kỹ thuật Real - time PCR. - Phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú ở các giai đoạn nuôi qua các mẫu thu từ thực tế. - Theo dõi, ghi nhận được tình trạng thu hoạch của các ao thả nuôi tôm đã thu mẫu để xét nghiệm WSSV. 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu khái quát về tôm sú (Penaeus monodon) Tôm sú là loài có kích thước lớn nhất của họ tôm he (Penaeidae). Kích thước lớn nhất có thể đạt đến 290 – 305 mm (200 – 250 gram), trung bình đạt từ 190 – 195 mm, nặng 150 gram. Chúng ưa sống ở những nơi có đáy bùn cát, độ trong, độ mặn cao và ổn định. Tuy nhiên, tôm sú có khả năng thích ứng với độ mặn rộng ngay trong thời kỳ trưởng thành, vì vậy rất thuận lợi cho nghề nuôi tôm trong các đầm mặn, lợ ven biển. Mùa vụ sinh sản từ tháng 11 - 4 năm sau (Bộ Thủy Sản, 1996). 2.1.1. Phân loại Theo Phạm Văn Tình (2001), tôm sú được định loại như sau: Ngành: Arthropoda - Ngành chân khớp Lớp: Crustacea - Lớp giáp xác Bộ: Decapoda - Bộ mười chân Họ chung: Penaeidae Họ: Penaeidae - Họ tôm he Giống: Penaeus Loài: Penaeus monodon Tên địa phương: tôm sú, tôm cỏ, tôm he, tôm giang (Trần Minh Anh, 1989). Tiếng Anh: Black tiger shrimp, Tiger prawn, Giant tiger prawn, Grass shrimp, Tumbo prawn (Nguyễn Văn Chung, 2000). 2.1.2. Vùng phân bố Phạm vi phân bố của tôm sú khá rộng, từ Ấn Độ Dương qua hướng Nhật Bản, Đài Loan, phía Đông Tahiti, phía Nam Châu Úc và phía Tây Châu Phi. Nhìn chung, tôm sú phân bố từ kinh độ 300E đến 1550E từ vĩ độ 350N tới 350S xung quanh các nước vùng xích đạo, đặc biệt là In-đô-nê-xi-a, Mã Lai, Phi-líp-pin và Việt Nam (Phạm Văn Tình, 2001). Tôm giống (PL) và tôm gần trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển và vùng rừng ngập mặn ven bờ. Khi tôm trưởng thành di chuyển xa bờ vì chúng thích sống vùng nước sâu hơn (Phạm Văn Tình, 2001). 4 2.1.3. Chu kỳ sống Trong thiên nhiên, ấu trùng tôm sú trải qua ba thời kỳ biến thái (Nauplius – Protozoea – Mysis). Ấu trùng sẽ theo sóng biển dạt vào cửa sông, đó là vùng nước lợ có độ mặn 15 - 30‰. Tại môi trường nước lợ, ấu trùng (larvae) phát triển sang thời kỳ hậu ấu trùng Postlarvae. Sau đó Postlarvae chuyển sang thời kỳ ấu niên Juvenile đồng thời bơi ra biển, tiếp tục tăng trưởng và phát triển (Vũ Thế Trụ, 1993). Tôm cái đẻ trứng vào ban đêm (thường từ 22 giờ đến 2 giờ), trứng sau khi đẻ được 14 – 15 giờ, ở nhiệt độ 27 – 280 sẽ nở thành ấu trùng (Nauplius). Ấu trùng phát triển qua các giai đoạn sau: - Nauplius 6 giai đoạn: 36 – 51 giờ - Protozoea 3 giai đoạn: 105 – 120 giờ - Mysis 3 giai đoạn: 72 giờ Sau đó chuyển thành Postlarvae, Juvenile, Adult (giai đoạn trưởng thành). Tôm sú đẻ quanh năm, nhưng tập trung vào hai thời kỳ chính: tháng 3 – 4 và tháng 7 – 10. Tuổi thọ tôm sú con đực khoảng 1,5 năm; con cái khoảng 2 năm (Phạm Văn Tình, 2001). Hình 2.1 Vòng đời tôm sú Penaeus monodon (Nguồn: FAO và Multimedia Asia Co., Ltd., 1999) 5 2.2. Tình hình dịch bệnh WSSV trên thế giới và Việt Nam 2.2.1. Trên thế giới Bệnh đốm trắng (WSSV – White Spot Syndrome Virus) là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi hiện nay. Bệnh xảy ra ở tất cả các nước nuôi tôm và ảnh hưởng phần lớn đến nghề nuôi tôm công nghiệp trên thế giới (Nguyễn Văn Hảo, 2000). Trong thời gian qua, bệnh đốm trắng đã bùng phát ở nhiều khu vực nuôi tôm trên thế giới, đặc biệt là các nước Châu Á. Bệnh đốm trắng đã gây tỷ lệ chết cao và gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm công nghiệp ở Trung Quốc, Nhật Bản, In-đô-nê-xi-a và Ấn Độ. Trong thời gian 1994 – 1995, virus gây bệnh đốm trắng đã gây chết hầu hết tôm nuôi (P. monodon; P. indicus) dọc theo bờ biển phía Đông Ấn Độ và phía Tây Ấn Độ (Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004). Theo Nguyễn Văn Hảo (2004), bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiên tại Bắc Á vào năm 1992 – 1993, đồng thời nhanh chóng lan rộng khắp khu vực Châu Á và thế giới nhất là các nước có hình thức nuôi tôm công nghiệp thâm canh. Dịch bệnh đốm trắng được phát hiện lần đầu tiên tại Đài Loan năm 1992, Trung Quốc – 1993, Nhật Bản – 1994, sau đó là các nước In-đô-nê-xi-a, Thái Lan, Mã Lai, Ấn Độ, Băng-la-desh, bang Texas (Hoa Kỳ) – 1995 gây tổn thất nghiêm trọng về sản lượng tôm nuôi. Ở Thái Lan, dịch bệnh đốm trắng bùng nổ đã làm giảm sản lượng tôm nuôi từ 225.000 tấn năm 1995 xuống 160.000 tấn năm 1996 làm thiệt hại trên dưới 500 triệu USD. Ở các nước Châu Á bệnh gây thiệt hại khoảng 3 tỷ USD mỗi năm (Nguyễn Văn Hảo, 2000). Thực tế hiện nay ở các nước trong khu vực Đông Nam Á, bệnh đốm trắng được xem là phổ biến và nguy hiểm nhất vì vậy hầu hết các nghiên cứu đều tập trung ngăn ngừa sự lan nhiễm và bùng nổ bệnh đốm trắng ở các ao nuôi (Nguyễn Văn Hảo, 2000). 2.2.2. Ở Việt Nam Theo Bùi Quang Tề (2003), từ năm 1993 – 1994 đến nay bệnh đốm trắng trên tôm thường xuất hiện ở các vùng nuôi tôm ven biển từ nuôi quảng canh đến nuôi thâm canh, bệnh đã gây thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi tôm. 6 Ở các tỉnh ven biển phía Nam từ năm 1993 – 1994, hiện tượng tôm chết hàng loạt trên tôm sú nuôi được xác định do ba loại bệnh: bệnh MBV, bệnh đốm trắng và bệnh đầu vàng (Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004). Từ năm 1996 đến nay, tôm nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa và các địa phương khác trong cả nước chịu tác hại rất lớn của bệnh đốm trắng. Bệnh này xảy ra hàng năm, trên diện rộng, có những vụ nuôi 80% diện tích nuôi tôm ở một địa phương bị thất thu hay thu hoạch sớm ngoài dự kiến (Bộ Thuỷ Sản, 2003). Năm 2001, Bùi Quang Tề và cộng sự đã điều tra 483 hộ nuôi tôm sú thuộc 23 huyện của 8 tỉnh ven biển phía Bắc (Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh) có 166 hộ (34,3%) có tôm nuôi và tôm cua tự nhiên đã mang mầm bệnh đốm trắng và có 169 hộ (34,99%) có tôm chết vì bệnh đốm trắng. Năm 2003, Bùi Quang Tề và cộng sự phân tích bệnh WSSV bằng kỹ thuật PCR của 145 mẫu tôm sú và tôm chân trắng nuôi ở các tỉnh ven biển miền Bắc (Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Thanh Hoá và Hà Tĩnh) và tôm Postlarve (PL) đưa từ Quảng Nam và Đà Nẵng chuyển ra Bắc. Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng của tôm (PL) đưa từ Đà Nẵng, Quảng Nam là 23,08%; tôm sú nuôi thương phẩm ở các tỉnh phía Bắc là 26,92%; tôm chân trắng là 13,33% (Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004). Theo báo cáo kết quả nuôi trồng thủy sản (NTTS) năm 2003, cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha. Các tỉnh, thành ven biển từ Đà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước. Bệnh xảy ra với tôm chủ yếu là bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh MBV (Monodon Baculovirus), bệnh do vi khuẩn Vibrio. Kết quả kiểm tra bệnh ở tôm giống nhập về Hải Phòng và Quảng Ninh trong năm 2003 do Trạm nghiên cứu NTTS nước lợ thực hiện cho thấy tỷ lệ nhiễm virus gây bệnh đốm trắng từ 25 - 46,6%, trung bình 38,9%. Theo số liệu từ Trung Tâm Môi Trường và Dịch Bệnh (Viện nghiên cứu NTTS I), Thanh Hóa có hơn 40% diện tích nuôi tôm bị bệnh, trong đó phần lớn thường là bệnh đốm trắng. Bệnh này tập trung ở vùng nuôi tôm công nghiệp như khu công nghiệp Hoằng Phụ, với 70/ 110 ha nuôi tôm bị nhiễm bệnh. Ở Hà Tĩnh, trong số 150 ha nuôi tôm bị bệnh, có 67 ha bị bệnh đốm trắng, trong đó 27 ha có tôm nuôi bị chết. Theo kết quả nghiên cứu của Viện Nghiên Cứu NTTS II, tại các tỉnh Nam Bộ, tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng trên mẫu tôm 7 có biểu hiện bệnh thu ở đầm nuôi quảng canh cải tiến là 56%. Những ngày đầu năm 2004, tại nhiều tỉnh ở Đồng Bằng Sông Cửu Long đã xảy ra tình trạng tôm nuôi bị chết do virus gây bệnh đốm trắng gây nên và bệnh này lây lan nhanh ngay từ đầu vụ. Hiện nay, bệnh đốm trắng vẫn đang diễn ra và đã gây nhiều tổn thất cho nhiều hộ dân tại các tỉnh này (Tạp chí Thủy sản, số 3 – 2004). Nhìn chung, tình hình dịch bệnh đốm trắng diễn ra ở Việt Nam rất nghiêm trọng và đã ảnh hưởng mạnh đến ngành Thủy sản trong cả nước. 2.3. Bệnh đốm trắng trên tôm 2.3.1. Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) 2.3.1.1. Định danh và phân loại Định danh - Giống: Non Occuluded Baculovirus - Họ: Baculoviridae - Họ phụ: NudiBaculoviridae Theo hội nghị virus học quốc tế lần thứ 12 (2002), các nhà khoa học đã phân loại virus gây bệnh đốm trắng là một giống mới Whisspovirus thuộc họ mới Nimaviridae (Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004). Tác nhân virus gây bệnh đốm trắng được gọi bởi nhiều tên do nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau (Wang Y. C et al., 1996): - WSSV: White Spot Syndrome Virus - WSBV: White Spot Baculovirus Virus - WSVD: White Spot Viral Disease - WSS: White Spot Syndrome - WSV: White Spot Virus - SEMBV: Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus Disease - HHNBV: Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Baculovirus Hiện nay, WSSV là tên thông dụng của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (Lightner D. V, 1996). Các chủng virus gây bệnh đốm trắng bao gồm: 8 2.3.1.2. Đặc điểm hình thái Virus dạng hình que, kích thước 120 x 275 mm, có một đuôi phụ ở một đầu, kích thước 70 x 300 mm. Virus có ít nhất 5 lớp protein, trọng lượng phân tử từ 15 – 28 kD. Vỏ bao có hai lớp protein VP28 và VP29; Nucleocapsid có ba lớp VP26, VP24, VP15. Nhân cấu trúc ADN mạch đôi (Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004). 2.3.1.3. Đặc tính sinh học Virus đốm trắng ký sinh ở các tổ chức ngoại bì, trung bì, mang, cơ quan lymphoid và biểu bì dưới vỏ kitin. Virus xâm nhập vào nhân tế bào gây hoại tử và sưng to. Virus sống và tồn tại trong nước có độ mặn từ 5 – 40‰, độ pH từ 4 – 10, có khả năng chịu đựng được nhiệt độ từ 0 – 800C (Trần Thị Việt Ngân, 2002). Hình 2.2 Virus đốm trắng (WSSV) hình que dƣới kính hiển vi điện tử Hình 2.3 Virus nhuộm âm ở trong huyết tƣơng của tôm sú nhiễm bệnh WSSV, một số thể virus có đuôi. (vạch kẻ a = 240 nm (theo Graindorge & Flegel, 1999)) (Nguồn: Bùi Quang Tề, 2003) Tên virus Kích thước virus Kích thước nhân Virus Trung Quốc (HHNBV) 120 x 360 nm Virus tôm Nhật 1 (RVPJ–1) 84 x 226 nm Virus tôm Nhật 2 (RV-PJ-2) 83 x 276 nm 89 x 201 nm Virus bệnh đốm trắng (WSBV) 70 – 150 x 350 – 380 nm 56 – 67 x 330 – 350 nm Bảng 2.1 Các chủng virus gây bệnh đốm trắng (Nguồn: Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004) 9 2.3.2. Vật chủ mang mầm bệnh WSSV Virus gây bệnh đốm trắng phân bố rất rộng ở nhiều vật chủ, virus không chỉ nhiễm ở một số loài tôm he (Penaeus) nuôi ở Tây bán cầu mà còn xuất hiện rất rộng ở bộ mười chân (Decapoda) gồm các loài cua và giáp xác khác. Ở Việt Nam, mầm bệnh WSSV nhiễm trên nhiều loài tôm he nuôi hoặc sống tự nhiên: tôm sú (P. mondon); tôm thẻ (P. indicus); tôm rảo (Metapenaeus ensis); tôm đất (M. lysianassa); tôm chân trắng (L. vannamei) nhập vào nuôi ở Việt Nam (Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004). 2.3.3. Các con đƣờng lây truyền WSSV Bệnh đốm trắng do virus WSSV lây lan rất nhanh qua hai đường chính: - Lây lan theo chiều dọc (Vertical transmission): từ bố mẹ nhiễm bệnh lây lan cho con. - Lây lan theo chiều ngang (Horizontal transmission): bị nhiễm virus từ nguồn nước nuôi, từ cua, còng mang virus từ ao này sang ao kia, từ dùng cụ sản xuất còn mang mầm bệnh, từ tôm chết, do người hoặc chim, cò vô tình đưa vào ao,…(Trần Thị Việt Ngân, 2002). Trong đó, lây lan theo chiều ngang là đường lan truyền chủ yếu. Bệnh đốm trắng dễ bị bùng phát khi tôm bị sốc do môi trường biến đổi xấu (Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004). 10 2.3.4. Cơ chế xâm nhập Virus gây hội chứng đốm trắng khi xâm nhập vào tôm sẽ cư trú ở nhiều bộ phận của tôm như mô nội bì, mô dạ dày, mang, buồng trứng, tinh hoàn, hệ thống thần kinh, mắt, chân bơi và các bộ phận khác. Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ, virus này tiến hành tự nhân bản dựa trên cơ sở vật chất và năng lượng của tế bào. Thông qua quá trình này, số lượng thể virus tăng lên rất nhanh, đồng thời làm thay đổi hoạt động bình thường của tế bào. Khi quan sát dưới kính hiển vi, các tế bào bị nhiễm virus thường có nhân phình to. Virus phát triển đến giai đoạn phá vỡ nhân và giết chết tế bào, virus lan truyền ra môi trường nước, đi tìm ký chủ khác và lại tiếp tục xâm nhập và tấn công (Trần Thị Việt Ngân, 2002). Ngoài ra, tôm ăn phải virus tự do tồn tại trong bùn ao và trong nước cũng dẫn đến nhiễm mầm bệnh WSSV (Chou H. Y và ctv., 1996; trích bởi Trần Thị Hoàng Dung, 2000). 2.3.5. Triệu chứng của bệnh Dấu hiệu bệnh lý đặc trưng: tôm bị bệnh giảm ăn rõ rệt, mệt mỏi, vỏ bì chùng lỏng với những đốm trắng từ 0,2 – 2 mm đường kính, biểu hiện ở bề mặt bên trong của vỏ. Trong nhiều trường hợp, tôm hấp hối do bệnh WSSV chuyển sang màu hồng đến màu (Nguồn: Trần Thị Việt Ngân, 2002) LÂY NHIỄM THEO CHIỀU DỌC LÂY NHIỄM THEO CHIỀU NGANG Hình 2.4 Hai vòng lây nhiễm của virus gây bệnh đốm trắng WSSV trong ao nuôi (theo Passano L. M., 1960) 11 nâu đỏ – gọi là bệnh đỏ thân. Bệnh này tỷ lệ chết rất cao, có thể tới 100% (Trần Thị Minh Tâm và Đái Duy Ban, 1999). Những dấu hiệu khác: tôm ở tầng mặt dạt vào bờ, hoạt động kém, các phần phụ bị tổn thương, nắp mang phồng lên và vỏ có nhiều sinh vật bám. Khi có dấu hiệu sức khỏe tôm yếu, đồng thời các đốm trắng xuất hiện, tỷ lệ tôm phát bệnh trong vòng từ 3 – 10 ngày lên đến 100% và tôm chết hầu hết trong ao nuôi (Bùi Quang Tề, 2003). Tuy nhiên cũng cần phân biệt những trường hợp bệnh lý giống như bệnh đốm trắng. Trong trường hợp này, những đốm trắng xuất hiện loang lỗ trên thân tôm và tôm chỉ chết rải rác hoặc kéo dài, khi lột xác xong, các đốm trắng bong ra khỏi vỏ và tôm hoạt động trở lại bình thường. Dấu hiệu này là do pH cao hoặc do tôm bị nhiễm vi khuẩn ( benhdomtrang.htm). 2.3.6. Phƣơng pháp chẩn đoán Kết hợp với dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng đã được mô tả ở Hình 2.5 và 2.6, mầm bệnh đốm trắng có thể phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau (Trần Thị Minh Tâm, 1999): - Phương pháp mô học: dấu hiệu định bệnh là sự xuất hiện của những thể vùi trong nhân tế bào của các mô có nguồn gốc trung bì. - Phương pháp PCR: dấu hiệu định bệnh là phát hiện sản phẩm khuếch đại của một đoạn gen đặc hiệu của tác nhân gây bệnh. - Phương pháp lai tại chỗ ADN (In situ DNA hybridization): dấu hiệu định bệnh là kết quả lai giữa đoạn gen dùng làm mẫu dò và đoạn gen của tác nhân gây bệnh trong điều kiện nghiêm ngặt. Hình 2.5 Tôm sú bị bệnh đốm trắng dạt vào bờ và chết Hình 2.6 Vỏ đầu ngực tôm bị bệnh đốm trắng (Nguồn: Bùi Quang Tề, 2003) 12 - Phương pháp Dot blot và Southern blot: được thực hiện với sản phẩm khuếch đại của một đoạn gen đặc trưng của tác nhân. - Phương pháp miễn dịch huỳnh quang: dấu hiệu định bệnh là kết quả kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Trong đó kỹ thuật PCR là kỹ thuật chẩn đoán nhanh, nhạy, và có tính đặc hiệu cao. Kỹ thuật này đã được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và phát triển, đồng thời đưa ra các cải tiến mới như: Nested PCR, Semi – Nested PCR, Real - time PCR,…Với độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao kết hợp với khả năng phát hiện và định lượng đồng thời, Real - time PCR được xem như một phương pháp rất có ý nghĩa trong việc xác định chính xác mức độ nhiễm mầm bệnh, đặc biệt là bệnh đốm trắng trên tôm. 2.4. Phƣơng pháp PCR và các cải tiến 2.4.1. Phƣơng pháp PCR Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được Kary Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985. PCR cho phép một lượng rất nhỏ ADN (một phân tử) được khuếch đại đến mức mà ở đó người ta dễ dàng phát hiện bằng những phương pháp thông thường như điện di gel (Trần Thị Minh Tâm và Đái Duy Ban, 1999). PCR là một phương pháp tạo dòng in vitro, nghĩa là cũng nhằm mục đích thu nhận một số lượng lớn bản sao của một trình tự xác định. PCR dùng để khuếch đại số lượng bản sao của một trình tự ADN đích thông qua các chu kỳ gồm ba bước: biến tính, bắt cặp với primer và tổng hợp mạch mới nhờ ADN polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002). 2.4.1.1. Nguyên tắc Trong phản ứng PCR, đoạn oligonucleotide ngắn đóng vai trò primer đặc hiệu gắn vào phân tử ADN đích. Dưới các điều kiện tối ưu, hai primer oligonucleotide bổ sung với hai mạch khuôn, sau đó bắt đầu tổng hợp ADN in vitro nhờ ADN polymerase chịu nhiệt. Sau giai đoạn primer bắt cặp, ADN polymerase kéo dài primer, tạo ra các bản sao mới của trình tự mạch khuôn nằm giữa hai primer. Sau khi kéo dài primer hoàn tất, mẫu (sample) được gia nhiệt để biến tính ADN mạch đôi, tạo ra hai mạch khuôn đơn để primer bắt cặp ở chu kỳ kế tiếp. Qua nhiều chu kỳ, kết quả tạo ra sự tích lũy các sản phẩm khuếch đại giữa hai primer theo cấp số nhân (Too H. P., 2001). 13 2.4.1.2. Các thành phần của phản ứng PCR Theo Too H. P. (2001) các thành phần cơ bản của một phản ứng PCR bao gồm: - Khuôn mẫu (template): ADN đích - Primer - Bốn dNTP (2’– deoxynucleoside – 5’ – triphosphate): dATP, dTTP, dGTP, dCTP - Taq polymerase - Dung dịch đệm - Mg 2+ - Chất phụ trợ (additive): được sử dụng để tăng hiệu quả khuếch đại 2.4.1.3. Các bƣớc phản ứng Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (2002), phản ứng PCR gồm các bước: Bước 1: trong dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 94 0 C - 95 0C trong vòng 30 giây – 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính (denaturation). Bước 2: nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 400C - 70 0C, tùy thuộc Tm của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây – 1 phút. Đây là giai đoạn lai (hybridization). Bước 3: nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp ADN polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài trình tự ADN cần khuếch đại và đặc tính của Taq polymerase, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation). Một chu kỳ bao gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân. 14 2.4.1.4. Ứng dụng PCR được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khoa học đời sống như: chẩn đoán phân tử và công nghệ di truyền. Trong chẩn đoán phân tử, ứng dụng chủ yếu là phát hiện tác nhân gây bệnh (Too H. P., 2001). Đối với ngành Thủy sản, PCR đóng vai trò rất quan trọng trong chẩn đoán sớm mầm bệnh trước và trong lúc nuôi, đặc biệt là bệnh đốm trắng. 2.4.1.5. Ƣu và nhƣợc điểm PCR dễ sử dụng và đưa ra kết quả có độ tin cậy cao. Kỹ thuật này chỉ cần một lượng mẫu rất nhỏ để xác định mầm bệnh, ngay cả có thể lấy mẫu từ một con tôm nhỏ để phân tích mà không cần làm chết con tôm. Mặc dù kỹ thuật PCR phát hiện nhanh với độ nhạy cao nhưng vẫn cần 18 – 36 giờ cho một xét nghiệm. Kỹ thuật này không có khả năng định lượng chính xác số bản sao của tác nhân cần kiểm tra trong mẫu bệnh phẩm. Trong những năm qua, kỹ thuật PCR đã phát triển không ngừng thông qua những cải tiến mới về nguyên lý, thiết bị và hóa chất. Nested và Real - time PCR là hai cải tiến mới của kỹ thuật PCR. Nested PCR là phương pháp cải thiện độ nhạy của kỹ thuật PCR. Trong khi đó Real - time PCR cải thiện kỹ thuật PCR cả về độ nhạy và khả năng định lượng chính xác số bản sao của tác nhân cần kiểm tra (Tạp chí Thủy sản, số 3 – 2004). 1 Biến tính (950C) 2 Bắt cặp (40 -700C) 3 Kéo dài (720C) DNA đích Sơ đồ 2.1 Sơ đồ các bƣớc phản ứng chuỗi polymerase (Nguồn: Nguyễn Thái Thủy, 2003) 15 2.4.2. Kỹ thuật Nested PCR Nested PCR là phương pháp phát hiện các sản phẩm PCR với tốc độ nhanh và độ chính xác cao. Trong phương pháp này, cặp primer được thiết kế nhằm khuếch đại đoạn ADN đích nằm bên trong sản phẩm PCR lần nhất. Sản phẩm PCR lần nhất làm khuôn ADN cho sản phẩm PCR lần hai được khuếch đại qua cặp primer bên trong. Do đó sản phẩm PCR lần hai sẽ ngắn hơn sản phẩm PCR lần nhất. Nested PCR có độ nhạy tăng gấp 104 lần khi phát hiện chính xác sản phẩm PCR mong đợi (McPherson M. J. và Moller S. G., 2001). 2.4.2.1. Nguyên tắc Phương pháp dựa trên nguyên tắc PCR Nested, trước tiên khuếch đại một đoạn ADN trên bộ gen của vi sinh vật đích, sau đó khuếch đại một đoạn ADN bên trong sản phẩm khuếch đại đầu tiên này để có sản phẩm khuếch đại cuối cùng phát hiện được nhỏ hơn sản phẩm khuếch đại ban đầu (Phạm Hùng Vân, 2002). Nested PCR được thực hiện qua hai bước hay một bước: - Hai bước: hai cặp primer ở bên ngoài và bên trong được cho vào hỗn hợp PCR ở từng bước riêng lẻ. Bước 1 nhằm khuếch đại đoạn ADN đích để cho sản phẩm PCR lần nhất. Bước 2 để khuếch đại đoạn ADN bên trong sản phẩm PCR lần nhất. - Một bước: hai cặp primer ở bên ngoài và bên trong được cho vào hỗn hợp PCR cùng lúc để khuếch đại đoạn ADN đích mong muốn. Trong đề tài này, kỹ thuật Nested PCR một bước được ứng dụng trong chẩn đoán mầm bệnh WSSV. PCR lần nhất PCR lần hai Hình 2.7 Nguyên tắc của Nested PCR (Nguồn: Too H. P., 2001) 16 2.4.2.2. Ƣu và nhƣợc điểm Theo Phạm Hùng Vân (2002), ưu điểm của phương pháp này là: - Nested PCR có độ nhạy phát hiện vi sinh vật đích rất cao. - Đối với Nested PCR một bước: sản phẩm PCR lần nhất đã được tính toán có một lượng vừa đủ để tham gia ngay trực tiếp vào PCR lần hai mà không cần phải mở ống eppendorf lấy sản phẩm PCR lần nhất cho vào hỗn hợp PCR mới để chạy PCR lần hai, chính nhờ vậy tránh được nguy cơ ngoại nhiễm. Tuy phương pháp này giúp gia tăng độ nhạy của PCR, nhưng Nested PCR vẫn đòi hỏi nhiều thời gian thực hiện, không có khả năng định lượng chính xác số bảo sao của sinh vật đích và không thể theo dõi tiến trình phản ứng đang diễn ra theo từng chu kỳ khuếch đại. 2.4.3. Kỹ thuật Real - time PCR Một cải tiến nổi bật hơn so với Nested PCR đó là khả năng định lượng chính xác số bản sao ban đầu: Real - time PCR. Phương pháp này cho phép rút ngắn thời gian phân tích. Khả năng định lượng được kết hợp trong kỹ thuật Real - time PCR đảm bảo giảm thiểu xác suất dương tính giả đối với kết quả phân tích. Real - time PCR cho phép phát hiện và định lượng mầm bệnh ở mức độ một phân tử (copy) trên một mẫu. Với độ nhạy cao như vậy phương pháp Real - time PCR cho phép phát hiện và định lượng virus gây bệnh tôm trước khi xuất hiện các biểu hiện sinh lý. 2.4.3.1. Lịch sử phát triển Vào năm 1992 – 1993, Higuchi và cộng sự đã tiên phong phân tích PCR kinetic (PCR động) bằng cách thiết lập hệ thống phát hiện các sản phẩm khuếch đại khi các sản phẩm này được tích lũy. Hệ thống Real - time bao gồm máy luân nhiệt có hệ thống chiếu mẫu bằng tia UV và tín hiệu huỳnh quang được thu nhận qua CCD (charge coupled device) camera. Ethidium bromide được thêm vào trong mỗi hỗn hợp phản ứng Real - time PCR. Khi có sự khuếch đại, số lượng ADN sợi đôi ngày càng tăng, ethidium bromide xen vào ADN mạch đôi, do đó tín hiệu huỳnh quang tăng lên (Weighardt F., 2004). Ngày nay, các nhà khoa học không ngừng cải tiến kỹ thuật Real - time PCR, đồng thời phát minh ra các chất chỉ thị huỳnh quang: SYBR Green I, FAM, HEX, Texas Red ® , Cy TM5,… 17 2.4.3.2. Khái niệm Real - time PCR là phương pháp khuếch đại và đồng thời phát hiện đoạn ADN chuyên biệt thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang. Trong phản ứng Real - time PCR, quá trình nhân bản ADN đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp (Newton C. R. and Graham A., 1997). Real - time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản ADN bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn ADN tạo thành. (Nguyễn Thái Thủy, 2003). 2.4.3.3. Nguyên tắc Phương pháp dựa trên sự khuếch đại một đoạn ADN đặc hiệu. Sản phẩm khuếch đại được đánh dấu bằng chất chỉ thị màu hay probe gắn huỳnh quang. Trong khi chạy Real - time PCR, đầu đọc Real - time sẽ phát hiện các sản phẩm khuếch đại đặc hiệu ở bước nhiệt độ trong các chu kỳ nhiệt tùy vào mỗi phương pháp phát hiện tín hiệu màu. Mẫu xét nghiệm chứa nhiều ADN đích ban đầu sẽ có chu kỳ ngưỡng phát hiện sớm hơn là mẫu xét nghiệm có ít ADN đích. Sau khi kết thúc chương trình, phân tích trên phần mềm và biết được nồng độ tác nhân gây bệnh ban đầu của mẫu xét nghiệm dựa vào các nồng độ ADN chuẩn. Nồng độ ADN trong các mẫu xét nghiệm sẽ được xác định dựa trên đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với log số bản sao ban đầu của các mẫu chuẩn. 2.4.3.4. Hệ thống Real - time PCR Hệ thống Real - time PCR gồm máy luân nhiệt được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính. Máy vi tính Quang phổ huỳnh quang Máy luân nhiệt Hình 2.8 Hệ thống Real - time PCR (Nguồn: Nguyễn Thái Thủy, 2003) 18 Hệ thống này hoạt động theo nguyên tắc sau: nguồn sáng chiếu sáng qua kính lọc kích thích và truyền đến mẫu đã được đặt trên máy luân nhiệt. Ánh sáng kích thích này giúp chất chỉ thị huỳnh quang tương ứng với số ADN đích trong ống phản ứng phát ra ánh sáng. Ánh sáng huỳnh quang này sẽ qua bộ kính lọc phát sáng. Kính lọc này sẽ chọn lọc các ánh sáng có bước sóng thích hợp. Sau đó, ánh sáng này sẽ qua bộ phận khuếch đại tín hiệu (intensifier), cuối cùng phát hiện nhờ đầu đọc CCD camera. 2.4.3.5. Phƣơng pháp phát hiện tín hiệu Real - time PCR Tính đặc hiệu của Real - time PCR tùy thuộc hóa chất dùng để theo dõi phản ứng khuếch đại và dụng cụ để kiểm tra tín hiệu. Các hóa chất khác nhau dùng trong mục đích này (Weighardt F., 2004): - Phẩm nhuộm chèn vào ADN sợi đôi sẽ phát huỳnh quang: ethidium bromide, SYBR Green I. - Probe đặc hiệu có gắn chất phát huỳnh quang: TaqMan probe, Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) probe, Molecular Beacons probe, Scorpions và TaqMan Minor Groove Binder (MGB) probe. Các hóa chất được dùng phổ biến hiện nay trong Real - time PCR như sau: Hình 2.9 Nguyên tắc hoạt động của hệ thống Real - time PCR KÍNH LOÏC KÍCH THÍCH KÍNH LOÏC PHAÙT SAÙNG TIA SAÙNG LEÄCH (Nguồn: Nguyễn Thái Thủy, 2003) 19 SYBR Green I SYBR Green I gắn vào ADN mạch đôi và phát tín hiệu huỳnh quang ở bước sóng 530 nm khi được kích thích bằng ánh sáng có bước sóng 490 nm. Mức độ huỳnh quang tương ứng với số ADN mạch đôi trong phản ứng (McPherson M. J. và Moller S. G., 2001). Đối với SYBR Green I dữ liệu huỳnh quang được thu nhận trong giai đoạn kéo dài. SYBR Green I gắn vào ADN mạch đôi và phát huỳnh quang sáng gấp 50 đến 100 lần so với khi không gắn kết vào ADN (Bio-Rad, 2004). Hạn chế của SYBR Green I trong phát hiện sản phẩm PCR khuếch đại là sự phát hiện ADN không đặc hiệu. Do mọi phân tử ADN đôi hiện diện trong phản ứng đều được định lượng, bao gồm các sản phẩm PCR không đặc hiệu và primer – dimer (Weighardt F., 2004). Molecular Beacons probe Molecular Beacons probe được đánh dấu fluorophore (chất chỉ thị huỳnh quang) ở cuối đầu 5’và một phân tử quencher (chất hấp thụ) ở cuối đầu 3’. Molecular Beacons probe gồm: trình tự probe bổ sung với ADN đích (loop) và hai trình tự bên thân probe (stem) với khoảng 5 nucleotide hay nhiều hơn. Trình tự hai bên thân probe (stem) không bổ sung với ADN đích mà bổ sung lẫn nhau. Khi trình tự hai bên thân probe bắt cặp với nhau, Molecular Beacons probe có dạng cấu trúc kẹp tóc. Ở dạng này, Molecular Beacons probe mang fluorophore và quencher ở khoảng cách gần, giúp quencher hấp thụ huỳnh quang từ fluorophore. Khi Molecular Beacons probe gắn vào ADN đích, đầu 5’ và 3’ tách riêng biệt, tín hiệu huỳnh quang được phát ra tương ứng với số ADN đích tạo thành (Bio-Rad, 2004). Ở bước biến tính (950C), Molecular Beacons probe tách nhau hoàn toàn, mở vòng kẹp tóc, tín hiệu huỳnh quang tăng cao. Khi nhiệt độ giảm xuống ở giai đoạn bắt cặp, Molecular Beacons probe gắn kết với trình tự ADN đích. Các Molecular Beacons probe không gắn bổ sung lên trình tự ADN đích sẽ tự bắt cặp lại trở về cấu trúc kẹp tóc Hình 2.10 SYBR Green I chèn vào ADN sợi đôi (Nguồn: Weighardt F., 2004) 20 ban đầu. Do vậy, tín hiệu huỳnh quang ghi nhận được ở giai đoạn này hoàn toàn tương ứng với lượng ADN đích. Đối với Molecular Beacons probe, dữ liệu huỳnh quang được thu nhận trong giai đoạn bắt cặp (Bio-Rad, 2004). Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) probe FRET dựa vào sự truyền năng lượng từ fluorophore cho sang fluorophore nhận. Các điều kiện đối với FRET (Weighardt F., 2004): - Các phân tử cho và nhận phải ở gần nhau (cụ thể 10 – 100 A0). - Phổ hấp thụ của vật nhận phải bao phủ phổ phát quang của vật cho. - Hướng chuyển đổi giữa vật cho và vật nhận phải đối diện nhau. Hệ thống FRET dựa vào hai chất chỉ thị huỳnh quang, hai chất này khi ở gần nhau sẽ tạo ra tín hiệu huỳnh quang chuyên biệt. Một chất đánh dấu huỳnh quang được kích thích bởi nguồn sáng và chuyển năng lượng cho chất đánh dấu huỳnh quang thứ hai. Chất đánh dấu huỳnh quang thứ hai này sẽ phát ra ánh sáng ở bước sóng khác để phát hiện. Probe lai được thiết kế ở dạng một cặp – một probe đánh dấu với màu cho (3’ – Fluorescine), probe còn lại được đánh dấu với màu nhận (5’ – Red 640 hay 5’ – Red 705). Khi hai probe bắt cặp với đoạn ADN đích thường chúng được tách riêng ra và bắt cặp vào ở vị trí cách nhau 1 - 5 nucleotide, kết quả sẽ có hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) giữa hai chất chỉ thị huỳnh quang. Hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang giữa đầu 3’ đánh dấu của probe thứ nhất và đầu 5’ của probe thứ hai nằm kế cận tạo ra tín hiệu huỳnh quang. Nhờ đó tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận tương ứng với số sản phẩm đích. Tín hiệu này được đo bởi thiết bị đo huỳnh quang (McPherson M. J. và Moller S. G., 2001). Hình 2. 11 Nguyên tắc của Molecular Beacons probe (Nguồn: Weighardt F., 2004) 21 TaqMan probe TaqMan probe được dùng phổ biến nhất trong các tài liệu về Real - time PCR. Probe oligonucleotide gắn vào đoạn bên trong ADN đích. Probe này được đánh dấu ở đầu 5’ bằng chất nhuộm chỉ thị huỳnh quang – fluorescent reporter dye (gọi là reporter) và chất hấp thụ – quencher ở đầu 3’. Reporter và quencher có phổ kích thích và phát quang trùng nhau. Nhờ đó tín hiệu huỳnh quang được hấp thu. Khi ADN đích tích lũy, probe gắn vào ADN đích nhưng chưa phát quang. Khi mạch bổ sung với mạch khuôn mà probe bắt cặp được kéo dài, Taq ADN polymerase tiến tới đầu 5’ của probe. Hoạt tính 5’3’ exonuclease của Taq ADN polymerase sẽ phân cắt đầu 5’ đã được đánh dấu huỳnh quang của probe. Do đó chất chỉ thị huỳnh quang - reporter được phóng thích ra khỏi sự bắt cặp của chất hấp thụ – quencher và tín hiệu huỳnh quang tăng lên. Mức độ huỳnh quang tương ứng với số ADN chuyên biệt mong đợi. Khác với SYBR Green I, primer dimer và các sản phẩm ADN khuếch đại không đặc hiệu sẽ không cho tín hiệu huỳnh quang (McPherson M. J. và Moller S. G., 2001). Như vậy, tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận trong giai đoạn kéo dài. Độ mạnh tín hiệu huỳnh quang tích lũy tăng dần. Tuy nhiên TaqMan probe cần phải đảm bảo (Nguyễn Thái Thủy, 2003): - Chất phát huỳnh quang được chọn làm reporter phải có phổ phát sáng tách biệt với quencher. - Reporter phát sáng trong khoảng kích thích của quencher. - Quencher phải nằm gần reporter để hấp thụ hiệu quả. Trong đề tài này, tôi dùng TaqMan probe để bắt cặp với đoạn đặc hiệu 100 bp cần khuếch đại nhằm phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú. TaqMan probe được đánh dấu ở đầu 5’ bằng chất chỉ thị huỳnh quang FAM (đóng vai trò reporter) và 3’ TAMRA (đóng vai trò quencher). Hình 2. 12 Nguyên tắc của FRET probe (Nguồn: Weighardt F., 2004) 22 TaqMan probe hoạt động theo nguyên tắc cụ thể ở Hình 2.13 như sau: 2.4.3.6. Nguyên lý định lƣợng của kỹ thuật Real - time PCR Để định lượng số bản sao ban đầu của mẫu cần xét nghiệm, khi thực hiện định lượng qua Real - time PCR cần chạy kèm với các chuẩn đã biết chính xác số bản sao Hình 2.13 Nguyên tắc của TaqMan probe (Nguồn: Nguyễn Thái Thủy, 2003) 23 ban đầu. Khi phản ứng Real - time PCR kết thúc, giá trị chu kỳ ngưỡng của mẫu xét nghiệm và của các chuẩn được xác định ở thời điểm có sự tương quan tuyến tính giữa số chu kỳ và nồng độ huỳnh quang đo được (pha log hay pha cấp số). Tại thời điểm này, đường baseline subtracted (đường đã trừ đi tín hiệu nền) phải cắt tất cả các đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang đo được và số chu kỳ. Tại vị trí cắt này, tín hiệu huỳnh quang vượt qua tín hiệu nền rõ rệt. Chu kỳ ngưỡng của mẫu và chuẩn được xác định tại vị trí đó. Đường chuẩn được hình thành dựa vào chu kỳ ngưỡng (đã được xác định ở trên) và nồng độ bản sao của các chuẩn đã biết. Chu kỳ ngưỡng của mẫu xét nghiệm được đối chiếu qua chu kỳ ngưỡng của các chuẩn nằm trên đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa log số bản sao ban đầu và chu kỳ ngưỡng. Kết quả đối chiếu này sẽ cho giá trị log số bản sao ban đầu của mẫu xét nghiệm qua phương trình Y = a.X + b (trục Y: chu kỳ ngưỡng, trục X: log số bản sao ban đầu). Từ giá trị log số bản sao ban đầu này ta sẽ quy đổi ra số bản sao ban đầu của mẫu xét nghiệm. 2.4.3.7. Ƣu và nhƣợc điểm Ưu điểm của kỹ thuật này là khả năng định lượng chính xác số ADN tham gia phản ứng, quan sát trực tiếp tiến trình khuếch đại đang diễn ra theo từng chu kỳ khi phản ứng Real - time PCR xảy ra (Bio – Rad, 2004). Ngoài ra, Real - time PCR còn thể hiện một số ưu điểm nổi bật (Nguyễn Thái Thủy, 2003): - Không cần điện di sau khi thực hiện phản ứng Real - time PCR. - Quy trình đơn giản, tiến trình thực hiện nhanh, rút ngắn thời gian cho kết quả. - Độ nhạy cao. - Độ đặc hiệu cao. - Ống phản ứng PCR luôn luôn đóng, tránh nguy cơ ngoại nhiễm. Tuy nhiên Real - time PCR đòi hỏi phòng thí nghiệm phải có trang thiết bị máy hiện đại, giá thành khá cao. 2.4.3.8. Ứng dụng Real - time PCR cũng được ứng dụng vào trong các lĩnh vực tương tự như PCR truyền thống. Nhờ khả năng thu nhận tín hiệu huỳnh quang tương ứng với số ADN đích ở pha cấp số, Real - time PCR được mở rộng thêm nhiều ứng dụng mới và hiệu quả hơn PCR truyền thống (Applied Biosystems, 2004): 24 - Định lượng hàm lượng virus. - Định lượng mức độ biểu hiện gen. - Phát hiện tác nhân gây bệnh. - Xác định kiểu gen (genotyping). - Ứng dụng hiệu quả trong trị liệu thuốc. Đối với tác nhân gây bệnh là virus, Real - time PCR đóng vai trò rất quan trọng trong phát hiện và định lượng tác nhân gây bệnh này. Virus gây bệnh đốm trắng trên tôm nuôi đang là mối quan tâm chung của ngành Thủy sản. Một trong những ứng dụng đáng được quan tâm hiện nay đó là sử dụng kỹ thuật Real - time PCR trong phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi. 25 Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3.1.1. Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ ngày 01/ 03/ 05 đến ngày 01/ 08/ 05. 3.1.2. Địa điểm thu mẫu Mẫu tôm giống, mẫu tôm nuôi thương phẩm, mẫu tôm bố mẹ được thu từ các hộ nuôi tôm, các trại tôm giống ở các tỉnh Bến Tre và Bạc Liêu, các chi cục Bảo Vệ Nguồn Lợi Thủy Sản Bến Tre và Bạc Liêu, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. 3.1.3. Địa điểm phân tích mẫu Đề tài được thực hiện tại Công Ty Nam Khoa và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2. Nội dung nghiên cứu - Thu nhận mẫu tôm đã qua xét nghiệm dương tính, âm tính với virus gây bệnh đốm trắng ở các chi cục Bảo Vệ Nguồn Lợi Thủy Sản Bến Tre và Bạc Liêu, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II và mẫu tôm thu từ thực tế ở các ao nuôi tôm ở các tỉnh Bến Tre và Bạc Liêu. - Thử nghiệm hai quy trình ly trích ADN sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt và ly trích ADN sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix. - Kiểm tra phát hiện virus gây bệnh đốm trắng trên 15 mẫu đã xác định dương tính, âm tính với WSSV thông qua thử nghiệm bằng phương pháp Real - time PCR. - Khảo sát tính định lượng của phương pháp Real - time PCR. - Khảo sát độ nhạy giữa phương pháp Real – time PCR và Non Stop Nested PCR. - Ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm bệnh WSSV trên 30 mẫu tôm thu từ thực tế. - Theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi tôm đã được thu mẫu kiểm tra. 3.3. Nguyên vật liệu 3.3.1. Mẫu xét nghiệm - Mẫu tôm giống - Mang, chân bò, chân bơi của tôm nuôi thương phẩm và tôm bố mẹ. 26 3.3.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hoá chất 3.3.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ -Hệ thống Real - time PCR của Bio - Rad (Hình 2.8) -Tủ cấy vô trùng -Tủ lạnh lưu mẫu -Máy khuấy từ -Máy nhiệt khô (hoặc bể điều nhiệt) -Máy ly tâm -Vortex mixer (máy trộn mẫu) -Các loại eppendorf 0,2; 0,5; 1,5 ml -Micropipette với các loại thể tích từ 0,5 µl đến 1000 µl -Cân phân tích -Bếp điện -Kéo, đèn cồn và panh -Bộ điện di nằm ngang và bộ nguồn -Máy đọc kết quả điện di GelDoc iQ của Bio - Rad -Máy iCycler của Bio - Rad Hình 3.3 Máy iCycler Hình 3.1 Máy ly tâm và vortex ixer Hình 3.2 Máy nhiệt khô (dry heat block) 27 3.3.2.2. Hoá chất Bộ kit “Real - time PCR phát hiện WSSV trên tôm” của công ty Nam Khoa do Bio - Rad tài trợ. Các thành phần của bộ kit gồm có: - Bộ thuốc thử ly trích thô ADN ở tôm gồm có các thành phần để pha dung dịch tách chiết: nước cất (50 ml), NaOH (350 µl), SDS (150 µl), ống eppendorf 1,5 ml: 50 ống, chày nhựa (dụng cụ nghiền mẫu dùng cho ống eppendorf): 10 cái/ gói x 5 gói - 50 ống eppendorf, mỗi ống có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR gồm các thành phần: primer, dNTP, Taq polymerase, TaqMan probe, Mg2+, dung dịch đệm PCR. - Đối chứng âm (control (-)): 100 µl dung dịch TE 1X - Đối chứng dương (control (+)): 100 µl ADN của WSSV - 5 chuẩn (standard (std)): 50 µl mỗi chuẩn có chứa ADN của WSSV với hàm lượng lần lượt là: 105 bản sao/ 2 µl, 104 bản sao/ 2 µl, 103 bản sao/ 2 µl, 102 bản sao/ 2 µl, 101 bản sao/ 2 µl. Bộ kit “Nested PCR phát hiện WSSV trên tôm” gồm có: - Bộ thuốc thử ly trích thô ADN ở tôm với các thành phần tương tự như bộ thuốc thử ly trích thô ADN ở tôm đi kèm trong bộ kit “Real - time PCR phát hiện WSSV trên tôm” - 50 ống eppendorf, mỗi ống có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Non Stop Nested PCR gồm các thành phần: dung dịch đệm PCR, Taq polymerase, dNTP, primer, Mg2+, UNG và dUTP. Hình 3.4 Bộ kit Real - time PCR phát hiện WSSV trên tôm 28 - Đối chứng âm (control (-)): 100 µl dung dịch TE 1X - Đối chứng dương (control (+)): 100 µl ADN của WSSV - Hóa chất dùng cho điện di: bộ thuốc thử điện di do công ty Nam Khoa sản xuất từ các hoá chất của Bio - Rad, Merck và Sigma gồm có dung dịch TBE 10X (Tris - Boric acid - EDTA), agarose, dung dịch nạp mẫu 5X (bromophenol blue và glycerol), dung dịch ethidium bromide (10 mg/ ml), thang ADN chuẩn 100 – 1000 bp có khoảng cách 100 bp của Bio - Rad. Bộ ly trích Instagene Matrix của công ty Bio – Rad: gồm có 20 ml dung dịch Instagene Matrix có các hạt nhỏ lơ lửng tích điện âm và các protein kinase. Các hạt nhỏ này sẽ gắn kết với ion hóa trị hai (các ion này hỗ trợ enzyme phân giải ADN mẫu) trong dịch tách chiết ADN, nhờ đó các ion hóa trị hai được loại bỏ. Các protein kinase có tác dụng biến tính các thành phần protein trong phần dịch nổi sau khi ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt. 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Thu mẫu và bảo quản mẫu Mẫu tôm giống: lấy mẫu nguyên 50 – 70 con. Tùy số lượng tôm trong đàn nhưng tổng trọng lượng mẫu không quá 1 gram. Mẫu tôm thu còn sống hay cố định trong cồn 95 0 . Mẫu tôm nuôi thương phẩm: lấy một phần nhỏ mang, chân bơi, chân bò của từ 10 – 15 con với tổng lượng mẫu không quá 1 gram. Mẫu tôm thu còn sống hay cố định trong cồn 950. Mẫu tôm bố mẹ: thu mẫu tôm bố mẹ phức tạp hơn vì phải đảm bảo tôm vẫn còn sống để tham gia sinh sản. Do vậy, ưu tiên thu mẫu chân bơi 2 hoặc một phần mang, thu mẫu còn sống hoặc cố định trong cồn 950. Lượng mẫu không quá 1 gram. Các mẫu tôm thu tại nơi lấy mẫu được cố định ngay bằng cồn 950 theo tỷ lệ t ôm :cồn = 1 : 3. Mẫu sau khi cố định trong cồn có thể được lưu giữ ở nhiệt độ thường. Khi cần bảo quản mẫu lâu hơn phải thay cồn mới và nếu cần có thể bảo quản mẫu trong tủ âm ở – 200C. 3.4.2. Ly trích mẫu 3.4.2.1. Pha dung dịch tách chiết Dùng micropipette hút 125 µl NaOH vào lọ có chứa nước cất (50 ml), lắc trộn đều. Sau đó hút 62,5 µl SDS cho tiếp vào lọ chứa nước cất này, lắc trộn đều. Dung 29 dịch tách chiết pha xong bảo quản trong bình tối, nắp vặn chặt, có thể lưu trữ trên 3 tháng. 3.4.2.2. Tiến hành ly trích Ly trích sử dụng SDS, NaOH và sốc nhiệt Nguyên tắc của việc ly trích này là dựa trên sự phối hợp cơ học (nghiền), hóa học (NaOH, SDS) và sốc nhiệt để tách chiết ADN virus ra dịch chiết. Quy trình tách chiết bao gồm các bước sau: - Cho mẫu tôm vào ống eppendorf 1,5 ml, thêm vào 100 µl dung dịch tách chiết, rồi dùng chày nhỏ nghiền nhuyễn. Sau đó tiếp tục thêm 500 – 700 µl dung dịch tách chiết, tiếp tục nghiền cho đến khi thấy mẫu được nghiền nhuyễn hoàn toàn (có thể gắn chày vào một đầu khoan điện để nghiền cho nhanh). Nếu thao tác nhiều mẫu thì nên giữ lạnh trên đá cho đến khi chuyển qua bước tiếp theo. - Chuyển các ống nghiệm này sang bếp cách thủy đang sôi, hay lên một bếp nhiệt khô ở 960C, giữ yên 5 – 10 phút. Sau đó lấy ra và làm lạnh nhanh các ống nghiệm trên đá trong vài phút. - Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 5 phút. Sử dụng phần dịch nổi cho phân tích Real - t ime PCR hoặc bảo quản lạnh ở – 200C trong vòng một tuần (khi mẫu chưa được phân tích ngay). Ly trích sử dụng SDS, NaOH và sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix Sau khi ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt. Tiến hành sử dụng bộ ly trích Instagene Matrix để tinh sạch và thu nhận nhiều ADN. Quy trình như sau: - Hút 20 µl phần dịch nổi sau khi ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt cho vào ống eppendorf 1,5 ml. Sau đó thêm 200 µl dung dịch Instagene Matrix (đã được khuấy từ trước đó 15 phút) vào trong ống. - Tiến hành ủ ở nhiệt độ 56oC trong vòng 15 - 30 phút, lấy ra vortex (đảo) mạnh 10 giây. - Tiếp tục ủ 100oC trong 8 - 10 phút, lấy ra vortex mạnh 10 giây. - Ly tâm 13000 vòng trong 3 phút. Sử dụng phần dịch nổi để phân tích Real - time PCR hay bảo quản lạnh - 20 oC trong vòng một tuần. 30 3.4.3. Tiến hành thực hiện Real - time PCR 3.4.3.1. Chuẩn bị hỗn hợp để thực hiện phản ứng Real - time PCR - Cho 2 µl dịch ly trích ADN cần phân tích vào các ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR để đạt thể tích phản ứng sau cùng là 50 l. - Đối chứng âm: cho 2 µl đối chứng âm vào ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. - Đối chứng dương: cho 2 µl đối chứng dương vào ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. - Đối với chuẩn: sử dụng 5 chuẩn có hàm lượng bản sao WSSV theo thứ tự lần lượt từ 105 bản sao/ 2 µl; 104 bản sao/ 2 µl; 103 bản sao/ 2 µl; 102 bản sao/ 2 µl; 101 bản sao/ 2 µl. Đối với mỗi chuẩn, dùng micropipette hút 2 µl từng chuẩn cho vào mỗi ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. 3.4.3.2. Thiết lập chƣơng trình thực hiện Real - time PCR trên phần mềm máy iCycler iQ Thiết lập chương trình luân nhiệt: chương trình luân nhiệt được thiết lập dựa trên các thanh công cụ trên phần mềm iQ version 3.1 như sau: Chu kỳ 1: lặp lại 1 lần Bước 1: 95oC 3 phút 30 giây Chu kỳ 2: lặp lại 45 lần Bước 1: 95oC 15 giây Bước 2: 60oC 1 phút Thiết lập vị trí đặt mẫu: chọn tên mẫu cần thiết lập: mẫu cần xét nghiệm (unknown), chuẩn (standard), đối chứng (-) và (+). Sau đó chọn vị trí đặt mẫu trên buồng đĩa 96 giếng qua màn hình vi tính. Định tên mẫu: mẫu được định tên tương ứng với số thứ tự mẫu hay nguồn gốc mẫu để thuận tiện cho phân tích kết quả. Chọn chất chỉ thị màu huỳnh quang: chọn FAM và màu hiển thị cho FAM. Định nồng độ các chuẩn: định tên và nồng độ 105 bản sao/ 2 µl đến 101 bản sao/ 2 µl tương ứng với vị trí 5 chuẩn đã được thiết lập trên buồng đĩa. 31 3.4.3.3. Chạy Real - time PCR Kiểm tra lại tất cả các thông số đã thiết lập trên máy iCyler iQ, sau đó thực hiện Real - time PCR . 3.4.3.4. Phân tích kết quả trên màn hình máy vi tính Phân tích kết quả dựa vào đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ, đồ thị biểu diễn đường chuẩn, bảng kết quả chạy mẫu (chi tiết ở mục 3.4.5.1). Quy trình thực hiện Real - time PCR được tóm tắt qua Sơ đồ 3.1. 32 Ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt Tinh sạch bằng Instagene Matrix Chuẩn bị hỗn hợp Real - time PCR Mẫu tôm Sơ đồ 3.1 Quy trình thực hiện Real - time PCR Chạy Real - time PCR iQ Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ Phân tích kết quả 33 3.4.4. Thực hiện Non Stop Nested PCR 3.4.4.1. Chuẩn bị hỗn hợp để thực hiện phản ứng Non Stop PCR - Sử dụng micropipette hút 2 µl dung dịch tách chiết ADN của mẫu cần phân tích cho vào ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Non Stop Nested PCR để đạt thể tích phản ứng sau cùng là 50 l. - Đối chứng âm: cho 2 µl đối chứng âm vào ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Non Stop Nested PCR. - Đối chứng dương: cho 2 µl đối chứng dương vào ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Non Stop Nested PCR. 3.4.4.2. Thiết lập chƣơng trình thực hiện Non Stop Nested PCR trên phần mềm của máy iCycler Chương trình luân nhiệt như sau: Chu kỳ 1: lặp lại 1 lần Bước 1: 40oC 10 phút Chu kỳ 2: lặp lại 1 lần Bước 1: 95oC 5 phút Chu kỳ 3: lặp lại 20 lần Bước 1: 94oC 30 giây Bước 2: 58oC 30 giây Bước 3: 72oC 1 phút Chu kỳ 4: lặp lại 40 lần Bước 1: 94oC 30 giây Bước 2: 51oC 30 giây Bước 3: 72oC 1 phút Chu kỳ 5: lặp lại 1 lần Bước 1: 72oC 7 phút Giữ ở 4oC cho đến khi phân tích 3.4.4.3. Chạy Non Stop Nested PCR Kiểm tra lại các thông số đã thiết lập trên máy iCycler, sau đó thực hiện Non Stop Nested PCR. 34 3.4.4.4. Điện di và phân tích kết quả Sản phẩm sau khi khuếch đại xong được điện di ngay trên thạch agarose 2% có chứa ethidium bromide. - Nguyên tắc của điện di: nguyên tắc này dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Các đại phân tử này tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Dựa vào kích thước các đoạn khuếch đại, các đoạn ADN khác nhau tách nhau ra sau khi điện di. Đoạn khuếch đại càng dài, băng thể hiện trên bản điện di càng gần vị trí giếng nạp mẫu. - Chuẩn bị gel agarose 2%: cho 4 gram agarose vào 200 ml dung dịch TBE 0,5X, đun chảy hoàn toàn, để nguội khoảng 600C rồi thêm 10 µl ethidium bromide (10 mg/ ml), trộn đều, đổ khuôn, để gel nguội trong khoảng 30 phút. Sau đó đưa vào khay điện di có chứa dung dịch TBE 0,5X để tiến hành điện di. - Nạp (load) mẫu: chuẩn bị mẫu thử bằng cách cho 12 µl dung dịch nạp mẫu (loading buffer) (có glycerol và bromophenol blue) vào trong mỗi mẫu thử. Dùng micropipette cho 15 µl mẫu và 15 µl thang ADN chuẩn vào giếng theo thứ tự. - Điện di trên gel agarose: điện di trong thời gian 30 phút ở 100 V và 50 mA. Sau khi điện di hoàn tất (khi thấy vệt màu xanh cách mép gel agarose khoảng 2 – 2,5 cm) lấy khuôn ra khỏi máng và đẩy nhẹ gel lên bàn đọc UV. Xem các băng ADN dưới tia sáng của đèn UV hay bằng máy phân tích điện di GelDoc iQ của Bio – Rad. Phân tích kết quả điện di dựa trên kích thước đoạn ADN đặc hiệu được xác định dựa trên thang ADN chuẩn (chi tiết ở mục 3.4.5.2). Quy trình thực hiện Non Stop Nested PCR được tóm tắt qua Sơ đồ 3.2. 35 Chạy Non Stop Nested PCR Sơ đồ 3.2 Quy trình thực hiện Non Stop Nested PCR Chuẩn bị hỗn hợp Non Stop Nested PCR Chạy điện di Mẫu tôm Ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt Tinh sạch bằng Instagene Matrix 633bp 221bp Phân tích kết quả 36 3.4.5. Cách đọc kết quả 3.4.5.1. Real - time PCR Kết quả sau khi thực hiện Real - time PCR được xử lý trên phần mềm iQ version 3.1 của máy iCycler iQ và phần mềm excel. Kết quả kiểm tra mẫu qua Real - time PCR được phân tích qua đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ, đồ thị biểu diễn đường chuẩn, bảng kết quả chạy mẫu. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ Trong suốt thời gian chạy chương trình Real - time PCR, ta có thể nhận biết sự biểu hiện nồng độ ADN của WSSV trong các mẫu thử bằng cách quan sát các đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang trên màn hình vi tính. Sau khi kết thúc chương trình, phân tích trên biểu đồ biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ để biết mẫu dương tính và mẫu âm tính. Có hai cách thể hiện đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ: dạng log (log view) – đơn vị huỳnh quang ở trục Y được tính ở dạng log và ▲: các chuẩn : mẫu dương tính : mẫu âm tính : đối chứng âm Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang Baseline subtracted (đường đã trừ đi tín hiệu nền) Chu kỳ ngưỡng (Ct) 37 dạng biểu diễn thường (normal view) – đơn vị huỳnh quang ở trục Y được tính ở dạng số thường, không quy đổi ra log. Trong đề tài này tôi chọn cách phân tích kết quả ở dạng log (Hình 3.5). Đồ thị thể hiện các mẫu dương tính là các mẫu có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang vượt qua đường baseline subtracted (đường đã trừ đi tín hiệu nền). Các mẫu âm tính là các mẫu có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang nằm dưới đường baseline subtracted. Đồ thị ở Hình 3.5 sẽ giúp người phân tích xác định được chu kỳ ngưỡng. Chu kỳ ngưỡng được xác định khi đường baseline subtracted cắt tất cả các đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang của mẫu kiểm tra trong giai đoạn tuyến tính giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ (pha log). Sau đó phân tích đường chuẩn và bảng kết quả để biết được hàm lượng WSSV có ban đầu trong 2 µl mẫu thử. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn Đường chuẩn được dựng nên từ 5 chuẩn ở Hình 3.6 với trục tung: chu kỳ ngưỡng - Ct (threshold cycle) và trục hoành: giá trị logarit của số lượng bản sao ban đầu (Log Starting Quantity) có đơn vị là số bản sao (copy number). Đường chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa log số bản sao ban đầu (X) và chu kỳ ngưỡng (Y). Thông qua chu kỳ ngưỡng được thể hiện qua Hình 3.5, giá trị log số bản sao ban đầu được xác định theo phương trình Y = a.X + b. Đồ thị này còn thể hiện các mẫu dương tính qua các unknown (mẫu cần kiểm tra) - các hiển thị tương ứng với chu kỳ ngưỡng và log số bản sao ban đầu trên đường chuẩn. Theo Too H. P. (2001), số bản sao trình tự đích ban đầu càng nhiều tương ứng với số chu kỳ ngưỡng càng thấp. Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn 38 Các thông số cần phân tích thể hiện trên đường chuẩn bao gồm: hệ số tương quan (r 2) (correlation coefficient), hiệu quả phản ứng (PCR efficiency) và độ nghiêng (slope).  Hệ số tương quan (correlation coefficient) Hệ số tương quan càng cao tương ứng với các thông số thí nghiệm càng chính xác và phù hợp với giá trị mong đợi. Hệ số tương quan có giá trị giữa 0 và 1. Nếu không có sự tương quan giữa giá trị dự đoán (predicted values) và giá trị thực sự, hệ số tương quan là 0 hay rất thấp. Sự tương quan giữa giá trị dự đoán và giá trị thực sự cao thì hệ số tương quan tiến gần đến 1. Sự phù hợp hoàn hảo tương ứng với hệ số tương quan bằng 1 (Bio – Rad, 2004).  Hiệu quả phản ứng và độ nghiêng Độ nghiêng của đường chuẩn tương quan chặt chẽ với hiệu quả phản ứng. Hiệu quả phản ứng sẽ cho biết các thông tin có giá trị về hóa chất phản ứng. Độ nghiêng của đường chuẩn tương quan với hiệu quả phản ứng qua phương trình sau: Hiệu quả (efficiency) = [10(-1/slope)] – 1 (slope: độ nghiêng) (3.1) Độ nghiêng – 3,322 cho hiệu quả 100%. Khi đó số lượng mạch khuôn mẫu (template) tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ khi sự khuếch đại tăng theo cấp số (exponential amplification). Độ nghiêng thấp hơn – 3,322 cho thấy hiệu quả phản ứng thấp hơn 100%. Hầu hết các phản ứng đều không đạt tới 100% do các giới hạn thí nghiệm. Độ nghiêng cao hơn – 3,322 cho hiệu quả phản ứng Real - time PCR cao hơn 100%. Điều này do các giá trị được đo ở giai đoạn không có sự tuyến tính giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ hay do sự hiện diện của các chất ức chế trong phản ứng (Qiagen, 2004). Bảng kết quả chạy mẫu Bảng kết quả xuất ra từ máy có dạng như sau: 39 Kết quả kiểm tra mẫu qua Real - time PCR sẽ được phân tích chủ yếu dựa trên: số bản sao ban đầu (SQ), giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct). Nếu có sự lặp lại các mẫu, kết quả còn được phân tích qua số bản sao trung bình (SQ Mean), giá trị chu kỳ ngưỡng trung bình (Ct Mean), độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu (SQ SD), độ lệch chuẩn của chu kỳ ngưỡng (Ct SD). Các cột còn lại ở Bảng 3.1 nhằm thể hiện vị trí đặt mẫu, loại mẫu,…giúp người phân tích biết rõ thông tin về mẫu cần kiểm tra. 3.4.5.2. Non Stop Nested PCR Kết quả sau khi thực hiện Non Stop Nested PCR được phân tích dựa trên kích thước đoạn khuếch đại đặc hiệu và thang ADN chuẩn qua quan sát các băng ADN dưới tia sáng của đèn UV hay bằng máy phân tích điện di GelDoc iQ của Bio – Rad. Sản phẩm khuếch đại đặc hiệu của WSSV khi chạy Non Stop Nested PCR là đoạn có kích thước 633 bp và 221 bp. Dựa vào thang ADN chuẩn, xác định sự hiện diện băng điện di của đoạn 633 và 221 bp ở đối chứng dương. Sau đó so sánh băng điện di của mẫu với hai băng đặc hiệu trên để xác định mẫu dương tính hay âm tính với WSSV. Well Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct SQ Mean SD Mean SD A01 A03 A05 A07 A09 Bảng 3.1 Bảng kết quả kiểm tra mẫu qua Real - time PCR Well: vị trí giếng Type: loại mẫu Identifier: định tên mẫu Rep: vị trí mẫu trên 96 giếng Ct: chu kỳ ngưỡng SQ: starting quantity: số bản sao ban dầu SD: standard deviation: độ lệch chuẩn Mean: trung bình 40 3.5. Bố trí thí nghiệm 3.5.1. Thí nghiệm 1: thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt và ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix Để ly trích ADN, có hai quy trình đã được thử nghiệm: - Quy trình 1: ly trích ADN sử dụng SDS, NaOH, và sốc nhiệt. - Quy trình 2: ly trích ADN sử dụng Instagene Matrix sau khi đã ly trích bằng SDS, NaOH, và sốc nhiệt. Mục đích Khảo sát hai quy trình ly trích nhằm tìm ra quy trình ly trích tối ưu. Tiến hành Sử dụng mẫu tôm nhiễm WSSV với mức độ nặng (đã qua xét nghiệm) được lưu trữ tại công ty Nam Khoa để tiến hành tách chiết ADN theo hai quy trình ly trích (chi tiết ở mục 3.4.2). Sau khi ly trích xong, dịch tách chiết ADN được pha loãng theo hệ số pha loãng bậc 10. Dùng micropipette hút 5 µl dịch tách chiết ADN cho vào 45 µl dung dịch TE 1X (Tris EDTA), tiến hành trộn mẫu trên máy vortex, sau đó hút 5 µl mẫu từ ống eppendorf vừa vortex ở trên chuyển sang ống eppendorf thứ hai có chứa sẵn 45 µl TE 1X, trộn đều. Quá trình cứ lặp lại, cuối cùng ta thu được một dãy các nồng độ ADN theo chiều giảm dần từ 100 đến 10-6 (Hình 3.8). Tiến hành thực hiện phản ứng Real - time PCR cho tất cả các nồng độ từ 10-1 đến 10-6 của cả hai quy trình ly trích. 633bp 221bp Hình 3.7 Kết quả điện di qua Non Stop Nested PCR MK: thang ADN chuẩn 41 Dựa vào kết quả so sánh chu kỳ ngưỡng của mẫu ở từng nồng độ pha loãng theo hai quy trình ly trích để xác định mẫu ly trích theo quy trình nào sẽ có ADN đích nhiều và tinh sạch hơn (mẫu có ADN đích nhiều và tinh sạch hơn sẽ có chu kỳ ngưỡng thấp hơn). 3.5.2. Thí nghiệm 2: sử dụng phƣơng pháp Real - time PCR kiểm tra phát hiện và định lƣợng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dƣơng tính, âm tính với WSSV Mục đích Thử nghiệm khả năng phát hiện và định lượng WSSV bằng phương pháp Real - time PCR. Tiến hành 15 mẫu tôm (8 mẫu dương tính và 7 mẫu âm tính với WSSV) đã qua kiểm tra PCR và Semi – Nested PCR được tiến hành ly trích theo quy trình xác định từ thí nghiệm 1. Các mẫu này được thử nghiệm lặp lại hai lần qua Real - time PCR và đồng thời một lần qua Non Stop Nested PCR. Các mẫu tôm sau khi ly trích này được chạy kèm với 5 chuẩn. Sau khi ly trích xong, dùng micropipette hút 2 µl dịch tách chiết chứa ADN của WSSV cho vào từng hỗn hợp 48 µl Real - time PCR và hỗn hợp 48 µl Non Stop Nested PCR. Đối với chuẩn, hút 2 µl mỗi chuẩn cho vào 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. Tiến hành thực hiện phản ứng Real - time PCR và Non Stop Nested PCR (chi tiết ở mục 3.4.3 và 3.4.4). Mẫu nào có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang vượt qua đường baseline subtracted được xác định là dương tính với WSSV. Mẫu nào có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang nằm dưới đường baseline subtracted được xác định là âm tính với 5 µl mẫu 45 µl TE 10 0 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -1 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl Hình 3.7 : Cách pha loãng mẫu theo hệ số pha loãng bậc 10 Hình 3.8 Cách pha loãng mẫu theo hệ số pha loãng bậc 10 10 0 10 -1 10 -4 10 -3 10 -2 10 -5 10 -6 42 WSSV. Kết quả chạy Real - time PCR được đối chiếu với kết quả chạy Non Stop Nested PCR và so sánh với kết quả đã xét nghiệm trước đó bằng phương pháp PCR và Semi – Nested PCR. Số bản sao ban đầu của WSSV được định lượng dựa trên đường chuẩn và cho kết quả ở bảng số liệu xuất kết quả sau khi chạy mẫu. 3.5.3. Thí nghiệm 3: khảo sát tính định lƣợng của phƣơng pháp Real - time PCR Mục đích Khảo sát tính tuyến tính và độ lặp lại về khả năng định lượng của phương pháp Real - time PCR. Tiến hành Chọn ngẫu nhiên hai mẫu nhiễm virus gây bệnh đốm trắng ở mức độ nặng từ thí nghiệm 2, tiến hành ly trích theo quy trình xác định từ thí nghiệm 1. Sau khi ly trích xong, pha loãng dịch tách chiết ADN của hai mẫu này theo hệ số pha loãng bậc 10 (giống như tiến hành pha loãng mẫu ở thí nghiệm 1) được một dãy các nồng độ ADN theo chiều giảm dần từ 100 đến 10-3. Thực hiện phản ứng Real - time PCR ở các nồng độ pha loãng của cả hai mẫu: ở nồng độ bắt đầu pha loãng (100) và ở mỗi nồng độ pha loãng (10-1, 10-2, 10-3) tiến hành lặp lại 3 lần. Khi thực hiện Real - time PCR, 5 chuẩn được chạy kèm để định lượng số bản sao của WSSV theo từng nồng độ pha loãng. Ở từng nồng độ pha loãng, 2 µl mẫu đã vortex được cho vào 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. Đối với chuẩn, 2 µl mỗi chuẩn được cho vào từng 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. Dựa vào các đường biễu diễn nồng độ huỳnh quang ở từng nồng độ trên đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ, độ sai khác của các giá trị chu kỳ ngưỡng ở các nồng độ, độ lệch chu kỳ ngưỡng trung bình và độ lệch giữa các số bản sao trung bình ở các nồng độ pha loãng qua 3 lần lặp lại để xác định tính tuyến tính về khả năng định lượng của Real - time PCR. Căn cứ vào đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang ở 3 lần lặp lại của từng nồng độ mẫu pha loãng, log số lượng bản sao ban đầu của mẫu ở từng nồng độ pha loãng trên đồ thị biểu diễn đường chuẩn, độ sai khác chu kỳ ngưỡng của 3 lần lặp lại ở cùng nồng độ pha loãng, độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu qua 3 lần lặp lại để xác định độ lặp lại về khả năng định lượng của Real - time PCR. 43 3.5.4. Thí nghiệm 4: khảo sát độ nhạy giữa phƣơng pháp Real - time PCR và Non Stop Nested PCR Mục đích So sánh độ nhạy giữa hai phương pháp để khẳng định tính vượt trội về độ nhạy của phương pháp Real - time PCR nhằm sử dụng để kiểm tra phát hiện WSSV trên các mẫu thu từ thực tế. Tiến hành Sử dụng mẫu tôm nhiễm WSSV nặng lưu trữ tại công ty Nam Khoa và tiến hành ly trích theo quy trình xác định từ thí nghiệm 1. Sau khi ly trích xong, dịch tách chiết ADN được tiến hành pha loãng theo hệ số pha loãng bậc 10, được một dãy các nồng độ ADN bản mẫu theo chiều giảm dần từ 100 đến 10-8. Sau đó thực hiện phản ứng Real - time PCR và Non Stop Nested PCR ở các nồng độ 10-1 đến 10-8. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần với cả hai phương pháp trên cùng một mẫu ở tất cả các nồng độ pha loãng. 2 µl dịch tách chiết ADN WSSV ở từng nồng độ pha loãng được cho vào đồng thời từng hỗn hợp 48 µl Real - time PCR và hỗn hợp 48 µl Non Stop Nested PCR. Sản phẩm khuếch đại của hai phương pháp được phân tích trên phần mềm iQ version 3.1 và trên gel agarose 2%. Dựa vào đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ xem khả năng phát hiện WSSV của phương pháp Real - time PCR đến nồng độ pha loãng nào. Căn cứ vào hình điện di sản phẩm qua Non Stop Nested PCR để xác định khả năng phát hiện WSSV của Non Stop Nested PCR đến nồng độ pha loãng nào. Qua đó so sánh khả năng phát hiện WSSV đến nồng độ mẫu pha loãng nào của hai phương pháp để xác định độ nhạy giữa Real - time PCR và Non Stop Nested PCR. Phương pháp nào có độ nhạy cao hơn sẽ có khả năng phát hiện WSSV đến nồng độ pha loãng thấp hơn. 3.5.5. Thí nghiệm 5: ứng dụng phƣơng pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm bệnh WSSV trên 30 mẫu tôm thu từ thực tế Mục đích Ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra sơ khởi tỷ lệ nhiễm WSSV trên tôm sú giống, và kiểm tra mức độ nhiễm WSSV trên tôm nuôi thương phẩm và tôm bố mẹ. 44 Tiến hành 30 mẫu tôm thu thực tế từ vùng nuôi tôm ở Bến Tre và Bạc Liêu được tách chiết ADN qua quy trình ly trích xác định từ thí nghiệm 1. Các mẫu này được chạy kèm với 5 chuẩn để định lượng số bản sao ban đầu của virus gây bệnh đốm trắng. Thí nghiệm này được lặp lại 2 lần qua Real - time PCR. Sau khi ly trích xong, 2 µl mẫu được cho vào 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. Đối với chuẩn, 2 µl mỗi chuẩn được cho vào từng hỗn hợp 48 µl Real - time PCR. Tiến hành thực hiện phản ứng Real - time PCR. Dựa vào đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang của các mẫu trên đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ và các hiển thị của mẫu trên đồ thị biểu diễn đường chuẩn để xác định là mẫu dương tính hay âm tính với WSSV và số lượng bản sao ban đầu của WSSV. 3.5.6. Thí nghiệm 6: theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi tôm đã đƣợc thu mẫu kiểm tra Mục đích Theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi có thu mẫu tôm kiểm tra để có những khuyến cáo phù hợp cho người nuôi tôm. Tiến hành Ghi nhận lại kết quả thu hoạch của các ao tôm thả nuôi tôm giống hoặc đang nuôi tôm thương phẩm, sản xuất giống bằng tôm bố mẹ được xét nghiệm bằng phương pháp Real - time PCR cho kết quả âm tính và dương tính với WSSV. Qua đó đánh giá khả năng thành công của các ao thả nuôi tôm bị nhiễm WSSV. 45 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt và ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix Đối với quy trình ly trích 2, tín hiệu huỳnh quang thu được ở chu kỳ ngưỡng lần lượt là: 16,9; 20,6; 23,7; 27,1; 30,6; 34,8 tương ứng với nồng độ mẫu pha loãng từ 10-1 đến 10-6. Quy trình ly trích 1 cho kết quả tín hiệu huỳnh quang thu được ở chu kỳ ngưỡng: 20,6; 23,8; 27,5; 31,6; 34,9; 37,8 tương ứng với nồng độ pha loãng từ 10-1 đến 10-6. Kết quả cho thấy, số chu kỳ ngưỡng tăng dần theo chiều giảm dần của nồng độ pha loãng. Ở nồng độ 10-1 đến 10-6 của mẫu qua quy trình ly trích 2 có chu kỳ ngưỡng thấp hơn so với chu kỳ ngưỡng của mẫu qua quy trình ly trích 1 ở các nồng độ Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của mẫu ly trích theo quy trình 1 và 2 : mẫu ly trích theo quy trình 1 : mẫu ly trích theo quy trình 2 : đối chứng âm , : 10-1 , : 10-2 , : 10-3 , : 10-4 , : 10-5 , : 10-6 46 từ 10-1 đến 10-6. Điều này cho thấy chu kỳ ngưỡng của mẫu ly trích qua quy trình 2 lên sớm hơn rất nhiều so với chu kỳ ngưỡng của mẫu ly trích qua quy trình 1. Với kết quả thu được cho thấy dịch tách chiết qua quy trình ly trích 2 có ADN của WSSV tinh sạch và nhiều hơn dịch tách chiết qua quy trình ly trích 1. Từ kết quả thu nhận được qua hai quy trình ly trích trên, tôi chọn quy trình ly trích 2 cho các bố trí thí nghiệm sau. 4.2. Kết quả sử dụng phƣơng pháp Real - time PCR kiểm tra phát hiện và định lƣợng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dƣơng tính, âm tính với WSSV Kết quả thử nghiệm Real - time PCR trên 12 mẫu dương tính và âm tính thể hiện qua các đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang trên đồ thị ở Hình 4.2. Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 12 mẫu tôm sú : 8 : 9 : 10 : 11 : 12 : đối chứng âm ▲: các chuẩn : 1 : 2 : 3 : 4 : 5 : 6 : 7 47 Hình 4.2 thể hiện rõ các đường cong biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 12 mẫu đều vượt qua đường baseline subtracted (đường đã trừ đi tín hiệu nền), điều này cho thấy các mẫu tôm đều bị nhiễm virus gây bệnh đốm trắng. Các mẫu: 1, 5, 6, 7, 8 nhiễm WSSV nặng thể hiện qua chu kỳ ngưỡng lên rất sớm từ chu kỳ 17 đến 21. Các mẫu còn lại nhiễm WSSV nhẹ đến trung bình thể hiện qua chu kỳ ngưỡng lên khá muộn từ chu kỳ 33 đến 39. Kết quả thử nghiệm Real – time PCR lần thứ 2 cho kết quả tương tự, cả 12 mẫu đều cho kết quả dương tính với WSSV. Kết quả này hoàn toàn tương thích với kết quả kiểm tra qua Non Stop Nested PCR. Kết quả kiểm tra được tóm tắt qua Bảng 4.1 như sau: Hình 4.3 Kết quả kiểm tra WSSV qua Non Stop Nested PCR của 12 mẫu tôm sú 633bp 221bp 48 Bảng 4.1 cho thấy kết quả kiểm tra mầm bệnh đốm trắng ở các mẫu 9, 10, 11, 12 bằng phương pháp Real - time PCR và Non Stop Nested PCR có sự khác biệt với kết quả kiểm tra bằng các phương pháp PCR và Semi – Nested PCR. Hai mẫu 9, 10 đã qua kiểm tra PCR và hai mẫu 11, 12 đã qua kiểm tra Semi – Nested PCR đều cho kết quả âm tính nhưng lại cho kết quả dương tính khi tôi tiến hành kiểm tra bằng Real - time PCR và Non Stop Nested PCR với mức độ nhiễm rất nhẹ (chỉ xuất hiện một băng 221 bp ở Non Stop Nested PCR và chỉ vài bản sao ở Real - time PCR). Sai lệch này có thể do độ nhạy của Real - time PCR và Non Stop Nested PCR cao hơn PCR thông thường và Semi – Nested PCR. Vì vậy tôi tiến hành kiểm tra tiếp 3 mẫu âm tính đã được xác định bằng PCR, kết quả thu được qua Hình 4.4. Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra WSSV trên 12 mẫu tôm sú Mẫu Kết quả đã qua kiểm tra PCR và Semi-Nested PCR Non Stop Nested PCR Real - time PCR 1 + (PCR) + + 2 + (PCR) + + 3 + (PCR) + + 4 + (PCR) + + 5 + (Semi-Nested PCR) + + 6 + (Semi-Nested PCR) + + 7 + (Semi-Nested PCR) + + 8 + (Semi-Nested PCR) + + 9 - (PCR) + + 10 - (PCR) + + 11 - (Semi-Nested PCR) + + 12 - (Semi-Nested PCR) + + 49 Hình 4.4 cho thấy đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của mẫu 13 nằm dưới đường baseline subtracted cho kết quả âm tính. Hai mẫu 14 và 15 có tín hiệu huỳnh quang vượt qua đường baseline subtracted ở chu kỳ ngưỡng rất muộn: 41,73 và 40,64, chứng tỏ các mẫu này nhiễm WSSV ở mức độ rất nhẹ. Kết quả kiểm tra 3 mẫu tôm sú qua Non Stop Nested PCR như sau: Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 3 mẫu tôm sú ▲: các chuẩn : đối chứng âm : mẫu 13 : mẫu 14 : mẫu 15 Hình 4.5 Kết quả Non Stop Nested PCR của 3 mẫu tôm sú MK (+) (-) 13 15 14 633 bp 221 bp 50 Kết quả kiểm tra 3 mẫu tôm sú được tóm tắt ở Bảng 4.2 như sau: Mẫu 13 được kiểm tra qua Real - time PCR cho kết quả tương thích với kết quả kiểm tra của phương pháp PCR và Non Stop Nested PCR. Hai mẫu 14 và 15 còn lại kiểm tra qua Real - time PCR cho kết quả khác biệt so với kết quả kiểm tra của phương pháp PCR và ngay cả Non Stop Nested PCR. Như vậy, trong 7 mẫu đã xác định âm tính qua PCR và Semi – Nested PCR, phương pháp Real – time PCR cho kết quả 6 mẫu dương tính và 1 mẫu âm tính; kết quả kiểm tra qua Non Stop Nested PCR cho thấy có 4 trong 7 mẫu trên là dương tính và 3 mẫu âm tính. Điều này chứng tỏ phương pháp Non Stop Nested PCR mà tôi sử dụng có khả năng phát hiện những mẫu nhiễm WSSV rất nhẹ mà không thể phát hiện bằng phương pháp PCR và Semi – Nested PCR mà các phòng xét nghiệm khác đang sử dụng, đồng thời phương pháp Real – time PCR có khả năng phát hiện các mẫu nhiễm WSSV mà các phương pháp khác không có khả năng phát hiện. Như vậy, phương pháp Real – time PCR có thể sử dụng để kiểm tra phát hiện WSSV trên tôm sú nuôi và thậm chí cho kết quả phát hiện mầm bệnh còn tốt hơn so với các phương pháp khác. Để định lượng số bản sao ban đầu của virus gây bệnh đốm trắng trên 12 mẫu tôm, tôi tiến hành định lượng dựa trên 5 chuẩn, kết quả thu được qua Hình 4.6. Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn của 12 mẫu tôm sú Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra 3 mẫu tôm sú Mẫu Kết quả đã xét nghiệm bằng PCR Non Stop Nested PCR Real - time PCR 13 - - - 14 - - + 15 - - + 51 Hiệu quả của phản ứng Real - time PCR trung bình qua 2 lần lặp lại đạt khá cao 97,95%, cho thấy phản ứng Real - time PCR này hoạt động tốt. Hệ số tương quan thu được rất cao (r2 = 1) chứng tỏ mối tương quan tuyến tính giữa log số bản sao ban đầu và số chu kỳ ngưỡng rất chặt. Số bản sao trung bình của WSSV trên 12 mẫu sau 2 lần lặp lại được tóm tắt ở Bảng 4.3. Bảng 4.3 cho thấy mẫu 1, 5, 6, 7, 8 nhiễm virus gây bệnh đốm trắng khá cao tương ứng với số bản sao ban đầu: 2,98.106; 2,57.105; 4,25.105; 6,95.105; 6,97.105 bản sao. Các mẫu 2, 3 nhiễm WSSV nhẹ tương ứng với số bản sao ban đầu: 2,47.101; 4,77.101 bản sao. Các mẫu 4, 9, 10, 11, 12 nhiễm virus gây bệnh đốm trắng rất nhẹ thể hiện qua số bản sao ban đầu thấp: 2; 5; 2; 6; 4 bản sao. Điều này cho thấy phương pháp Real – time PCR có thể phát hiện các mẫu nhiễm WSSV với số lượng bản sao ban đầu rất thấp (2 bản sao) cho nên có thể phát hiện được các mẫu nhiễm WSSV rất nhẹ mà phương pháp PCR và Semi – Nested PCR cho kết quả là âm tính. Kết quả kiểm tra bằng Non Stop Nested PCR cũng cho kết quả là cả 12 mẫu đều dương tính với WSSV với số bản sao ban đầu rất thấp (theo kết quả định lượng của Real – time PCR) chứng tỏ rằng phương pháp Non Stop Nested PCR mà tôi sử dụng Mẫu Chu kỳ ngưỡng trung bình Số bản sao ban đầu trung bình 1 16,67 2,98.10 6 2 33,82 2,47.10 1 3 32,84 4,77.10 1 4 37,69 1,74 5 20,28 2,57.10 5 6 19,53 4,25.10 5 7 18,83 6,95.10 5 8 18,81 6,97.10 5 9 36,68 4,64 10 38,20 1,23 11 35,99 5,69 12 37,79 3,45 Bảng 4.3 Số bản sao ban đầu trung bình của 12 mẫu tôm sú sau hai lần lặp lại 52 có độ nhạy rất cao (2 bản sao), có thể dùng để kiểm tra virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú. Số bản sao ban đầu của 3 mẫu tôm được định lượng qua Real – time PCR dựa trên đồ thị biểu diễn đường chuẩn (Hình 4.7). Hiệu quả của phản ứng Real - time PCR trung bình qua 2 lần lặp lại đạt khá cao 99,4%, chứng tỏ phản ứng Real - time PCR hoạt động tốt. Hệ số tương quan (r2 = 1) giữa log số bản sao ban đầu và số chu kỳ rất chặt. Kết quả sau 2 lần lặp lại được tóm tắt ở Bảng 4.4 Hai mẫu 14 và 15 nhiễm WSSV rất nhẹ, chỉ được phát hiện qua Real – time PCR với 1 bản sao ban đầu, trong khi đó PCR và ngay cả Non Stop Nested PCR cũng không thể phát hiện được. Mẫu 13 cho kết quả âm tính với tất cả các phương pháp xét nghiệm cho thấy là mẫu không bị nhiễm virus gây bệnh đốm trắng. Từ các kết quả thử nghiệm trên cho thấy phương pháp Real - time PCR có khả năng phát hiện được mầm bệnh WSSV mà các phương pháp khác có thể phát hiện. Ngoài ra Real - time PCR còn có khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV ngay cả ở mức độ nhiễm rất nhẹ (1 bản sao) mà các phương pháp khác không có khả năng phát hiện. Hình 4.7 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn của 3 mẫu tôm sú Mẫu Chu kỳ ngưỡng trung bình Số bản sao ban đầu trung bình 13 N/A N/A 14 41,73 1,54.10 -1 15 40,64 3,27.10 -1 Bảng 4.4 Số bản sao ban đầu trung bình của 3 mẫu tôm sú sau hai lần lặp lại 53 4.3. Kết quả khảo sát tính định lƣợng của phƣơng pháp Real - time PCR Kết quả thử nghiệm tính định lượng của phương pháp Real - time PCR ở các nồng độ pha loãng của mẫu 1 sau các lần lặp lại thể hiện qua Hình 4.8. Hình 4.8 thể hiện rõ các đường cong tuyến tính giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở các nồng độ pha loãng của mẫu 1. Khoảng cách độ lệch giữa các chu kỳ ngưỡng ở các nồng độ pha loãng rất đều thể hiện tính tuyến tính cao, tính tuyến tính càng cao thì khả năng định lượng số bản sao ban đầu càng chính xác. Ở nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, chu kỳ ngưỡng ở từng lần lặp lại sai lệch rất thấp. Điều này chứng tỏ độ lặp lại thể hiện khá cao. Ở nồng độ bắt đầu pha loãng 100, tín hiệu huỳnh quang thu được của mẫu có chu kỳ ngưỡng lên rất sớm: 16,34, chu kỳ ngưỡng của 3 lần lặp lại cũng khá đồng đều. Trong 3 lần lặp lại có một chu kỳ ngưỡng lên sớm hơn, tách biệt khỏi chu kỳ ngưỡng của hai lần lặp lại còn lại, tuy nhiên sự sai lệch này rất nhỏ: 0,39 chu kỳ, có thể chấp nhận được. Sự sai lệch này có thể do sai số pipet, thao tác người thực hiện,… Log số bản sao ban đầu của WSSV ở các nồng độ pha loãng sau 3 lần lặp lại thu được qua Hình 4.9. Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở từng nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần của mẫu 1 : 100 : 10-1 : 10-2 : 10-3 ▲: các chuẩn : các mẫu : đối chứng âm 54 Số bản sao ban đầu ở các nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần của mẫu 1 được định lượng dựa trên đường chuẩn ở Hình 4.9. Hình 4.9 thể hiện rõ mối quan hệ tuyến tính giữa log số bản sao ban đầu và số chu kỳ ngưỡng qua hệ số tương quan rất cao: r2 bằng 1. Hiệu quả phản ứng Real - time PCR này đạt cao (99,6%) chứng tỏ phản ứng này hoạt động tốt. Đường chuẩn thể hiện rõ các giá trị tương ứng với các chu kỳ ngưỡng và log số bản sao ban đầu ở từng nồng độ pha loãng của mẫu gần như trùng nhau. Từ Hình 4.9 ta có được độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình ở các nồng độ pha loãng của mẫu 1 sau 3 lần lặp lại thể hiện ở Bảng 4.5 như sau: Bảng 4.5 thể hiện rõ số chu kỳ ngưỡng trung bình tăng và số bản sao trung bình giảm theo từng nồng độ pha loãng. Chu kỳ ngưỡng trung bình càng cao tương ứng với số bản sao trung bình càng thấp. Sai lệch giữa các chu kỳ ngưỡng trung bình tương đối đều nhau và nằm trong khoảng từ 3,2 đến 3,71. Sai lệch đều thể hiện tính tuyến tính về Hình 4.9 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn ở từng nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần của mẫu 1 Bảng 4.5 Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình ở các nồng độ pha loãng của mẫu 1 sau 3 lần lặp lại Nồng độ mẫu 1 Chu kỳ ngưỡng trung bình Số bản sao ban đầu trung bình Độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu 10 0 16,77 4,89.10 6 1,38.10 6 10 -1 19,97 5,25.10 5 0,63.10 5 10 -2 23,37 5,02.10 4 0,84.10 4 10 -3 27,08 3,87.10 3 0,53.10 3 55 khả năng định lượng cao của Real - time PCR. Sau 3 lần lặp lại, độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu tương đối thấp, cho thấy độ lặp lại về khả năng định lượng cao. Qua kết quả khảo sát tính tuyến tính và độ lặp lại về khả năng định lượng của Rea l - t ime PCR trên các nồng độ pha loãng của mẫu 1 sau 3 lần lặp lại cho thấy phương pháp Real - time cho kết quả định lượng chính xác số bản sao ban đầu của virus gây bệnh đốm trắng với độ lặp lại cao. Tính định lượng của phương pháp Real - time PCR còn được khảo sát qua mẫu 7, kết quả thu được qua Hình 4.10 và Hình 4.11. Ở các nồng độ pha loãng, đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ thể hiện tuyến tính (Hình 4.10). Khoảng cách độ lệch giữa các chu kỳ ngưỡng ở các nồng độ pha loãng của mẫu 7 đều nhau thể hiện tính tuyến tính cao. Ở nồng độ 100 từng đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở các lần lặp lại hơi tách biệt nhau với độ lệch 0,43 chu kỳ. Ở nồng độ 10-1, đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở một lần lặp lại tách biệt so với hai lần lặp lại còn lại với sai lệch 0,2 chu kỳ. Sai lệch nhỏ này có thể do sai Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở từng nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần của mẫu 7 : 100 : 10-1 : 10-2 : 10-3 ▲: các chuẩn : các mẫu : đối chứng âm 56 số pipet và các tác động khác như thao tác người thực hiện,… Ở nồng độ 10-2, 10-3, đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở cả 3 lần lặp lại gần như trùng nhau. Điều này chứng tỏ độ lặp lại về khả năng định lượng của hệ thống cao. Log số bản sao ban đầu của WSSV ở các nồng độ pha loãng sau 3 lần lặp lại thu được qua Hình 4.11. Số bản sao ban đầu ở từng nồng độ pha loãng sau khi lặp lại 3 lần của mẫu 7 được định lượng dựa trên đường chuẩn ở Hình 4.11. Hình 4.11 cho thấy hiệu quả của phản ứng Real - time PCR đạt rất cao: 99,6%. Log số bản sao ban đầu và số chu kỳ ngưỡng có quan hệ rất tuyến tính qua hệ số tương quan r2 bằng 1. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn thể hiện rõ các giá trị tương ứng với các chu kỳ ngưỡng và log số bản sao ban đầu ở từng nồng độ pha loãng của mẫu qua 3 lần lặp lại trùng nhau hoàn toàn và gần trùng nhau, cho thấy hệ thống có khả năng cho kết quả định lượng chính xác với độ lặp lại cao. Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình ở các nồng độ pha loãng mẫu 7 sau 3 lần lặp lại thể hiện ở Bảng 4.6 như sau: Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn ở từng nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần của mẫu 7 57 Bảng 4.6 cho thấy số chu kỳ ngưỡng trung bình tăng dần và số bản sao trung bình giảm dần theo từng nồng độ pha loãng. Khoảng cách giữa các giá trị của các chu kỳ ngưỡng trung bình ở các nồng độ tương đối đều nhau và nằm trong khoảng từ 3,13 đến 3,75. Sau 3 lần lặp lại, độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu rất thấp thể hiện độ sai lệch nhỏ và độ lặp lại thí nghiệm cao. Như vậy, kết quả thử nghiệm tính định lượng của Real - time PCR trên hai mẫu 1 và 7 thể hiện rõ tính tuyến tính và độ lặp lại cao về khả năng định lượng của hệ thống, có thể sử dụng để kiểm tra định lượng WSSV trên tôm sú. 4.4. Kết quả khảo sát độ nhạy giữa phƣơng pháp Real - time PCR và Non Stop Nested PCR Kết quả Real – time PCR của các nồng độ pha loãng từ 10-1 đến 10-8 thể hiện qua Hình 4.12. Bảng 4.6 Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình ở các nồng độ pha loãng của mẫu 7 sau 3 lần lặp lại Nồng độ mẫu 7 Chu kỳ ngưỡng trung bình Số bản sao ban đầu trung bình Độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu 10 0 18,78 1,23.10 6 0,36.10 6 10 -1 21,91 1,38.10 5 0,18.10 5 10 -2 25,66 1,02.10 4 0,061.10 4 10 -3 29,27 8,46.10 2 0,92.10 2 58 Sau hai lần chạy Real – time PCR ở các nồng độ pha loãng 10-1 đến 10-8 của mẫu, kết quả cho thấy ở các nồng độ pha loãng từ 10-1 đến 10-7 đều có đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ nằm trên đường baseline subtracted, cho kết quả dương tính với WSSV, riêng nồng độ pha loãng 10-8 có đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ nằm dưới đường baseline subtracted, cho kết quả âm tính. Điều này chứng tỏ phương pháp Real - time PCR có khả năng phát hiện tới nồng độ pha loãng 10-7. Các nồng độ pha loãng của mẫu trên có kết quả kiểm tra qua Non Stop Nested PCR như sau: Hình 4.12 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của mẫu nhiễm WSSV pha loãng từ 10-1 đến 10-8 : 10-5 : 10-6 : 10-7 : 10-8 : đối chứng âm : 10-1 : 10-2 : 10-3 : 10-4 59 Ở các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 đều xuất hiện hai băng đặc hiệu 633 bp và 221 bp, cho kết quả nhiễm WSSV nặng (số lượng bản sao ban đầu lớn). Ở các nồng độ càng loãng: 10-4, 10-5, 10-6 số lượng ADN đích càng giảm nên chỉ hiện diện băng 221 bp (dương tính nhẹ với WSSV). Theo chiều giảm dần nồng độ mẫu pha loãng, các băng xuất hiện càng mờ dần. Ở hai nồng độ 10-7, 10-8 không thấy xuất hiện băng đặc hiệu (âm tính với WSSV). Kết quả kiểm tra lần 2 bằng Non Stop Nested PCR trên các mẫu pha loãng này cũng cho kết quả tương tự. Từ các kết quả trên cho thấy Non Stop Nested PCR có khả năng phát hiện mẫu tôm nhiễm WSSV có nồng độ pha loãng từ 10 -1 đến 10-6, và không có khả năng phát hiện mẫu tôm nhiễm WSSV có nồng độ pha loãng 10-7 và 10-8. Kết quả so sánh độ nhạy giữa hai phương pháp được tóm tắt qua Bảng 4.7. Hình 4.13 Kết quả kiểm tra Non Stop Nested PCR ở các nồng độ pha loãng của mẫu nhiễm WSSV (+) (-) MK 10-8 10-1 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 633bp 221bp 60 Với kết quả thu nhận từ khảo sát trên (thể hiện ở Bảng 4.7), tôi nhận thấy phương pháp Real - time PCR nhạy hơn phương pháp Non Stop Nested PCR 10 lần. Nếu có điều kiện nên tiến hành pha loãng mẫu từ nồng độ pha loãng 10-6 (nồng độ pha loãng cuối cùng mà hai phương pháp có thể phát hiện mẫu dương tính với WSSV) để so sánh độ nhạy của hai phương pháp một cách chính xác hơn. 4.5. Kết quả ứng dụng phƣơng pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm bệnh WSSV trên 30 mẫu tôm thu từ thực tế Qua các kết quả thu nhận từ các thí nghiệm trên, tôi nhận thấy phương pháp Real - time PCR là phương pháp đáng tin cậy trong phát hiện và định lượng WSSV, tiến hành kiểm tra 30 mẫu tôm thu từ thực tế bằng phương pháp Real - time PCR, kết quả thu được như sau: Bảng 4.7 Kết quả chạy Real - time PCR và Non Stop Nested PCR trên mẫu tôm nhiễm WSSV ở các nồng độ pha loãng từ 10-1 đến 10-8 Nồng độ Real - time PCR Non Stop Nested PCR 10 -1 + + 10 -2 + + 10 -3 + + 10 -4 + + 10 -5 + + 10 -6 + + 10 -7 + - 10 -8 - - 61 Hình 4.14 cho thấy đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của các mẫu 1, 18, 22, 23, 26 vượt qua đường baseline subtracted , cho kết quả dương tính với virus gây bệnh đốm trắng. Trong 5 mẫu dương tính với WSSV này, có mẫu 22 nhiễm WSSV rất nặng thể hiện qua chu kỳ ngưỡng lên rất sớm: 19,66. Các mẫu 6, 10, 13, 14, 25 âm tính về bệnh đốm trắng thể hiện qua các đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang nằm dưới đường baseline subtracted. Kết quả chạy Real – time PCR lần 2 của các mẫu này cũng cho kết quả tương tự. Số bản sao ban đầu của các mẫu tôm được định lượng dựa trên đồ thị biểu diễn đường chuẩn. Hình 4.14 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 10 mẫu tôm thu thực tế : 22 : 23 : 25 : 26 ▲: các chuẩn : đối chứng âm : 1 : 6 : 10 : 13 : 14 : 18 62 Hiệu quả của phản ứng Real - time PCR trung bình qua 2 lần lặp lại đạt khá cao 92,95%. Hệ số tương quan r2 bằng 1 thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa log số bản sao ban đầu và chu kỳ ngưỡng rất chặt. Sau hai lần lặp lại, độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình của 10 mẫu tôm thu thực tế được tóm tắt qua Bảng 4.8. Bảng 4.8 thể hiện mẫu 22 nhiễm WSSV rất nặng với số bản sao trung bình cao: 3,66.10 5 bản sao. Các mẫu 1, 18, 23 nhiễm WSSV nhẹ và trung bình với số bản sao tương ứng là 24, 83 và 603. Mẫu 26 nhiễm WSSV rất nhẹ tương ứng số bản sao rất Hình 4.15 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn của 10 mẫu tôm thu thực tế Bảng 4.8 Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình của 10 mẫu tôm thu thực tế Mẫu thực tế Chu kỳ ngưỡng trung bình Số bản sao trung bình Độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu 1 33,81 2,33.10 1 1,7.10 1 18 31,65 8,3.10 1 1,8.10 1 22 18,87 3,66.10 5 0,75.10 5 23 28,64 6,03.10 2 1,65.10 2 26 38,25 1,13 0,47 6 N/A N/A N/A 10 N/A N/A N/A 13 N/A N/A N/A 14 N/A N/A N/A 25 N/A N/A N/A 63 thấp (2 bản sao). Độ lệch chuẩn số bản sao ban đầu của các mẫu thấp cho thấy khả năng định lượng chính xác với độ lặp lại thí nghiệm cao. Kết quả kiểm tra 10 mẫu tôm thu từ thực tế khác qua Real - time PCR như sau: Hình 4.16 thể hiện các đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của 10 mẫu tôm thu thực tế vượt qua đường baseline subtracted, cho thấy 10 mẫu này đều dương tính với WSSV. Tất cả 10 mẫu này đều nhiễm WSSV nhẹ, thể hiện qua số chu kỳ ngưỡng lên khá muộn từ chu kỳ 34 đến 42. Số lượng bản sao ban đầu của WSSV được định lượng dựa trên đường chuẩn ở Hình 4.17. Hình 4.16 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 10 mẫu tôm thu thực tế tiếp theo : 9 : 11 : 12 : 15 ▲: các chuẩn : đối chứng âm : 2 : 3 : 4 : 5 : 7 : 8 64 Phản ứng Real - time PCR này hoạt động tốt thể hiện qua hiệu quả phản ứng Real - time PCR đạt khá cao: 90,5%. Log số bản sao ban đầu và chu kỳ ngưỡng tuyến tính với nhau qua hệ số tương quan r2 bằng 1. Số bản sao ban đầu của 10 mẫu tôm sú được thể hiện ở Bảng 4.9 sau: Bảng 4.9 cho thấy các mẫu tôm này đều nhiễm WSSV ở mức độ rất nhẹ từ 1 đến 13 bản sao. Chu kỳ ngưỡng của mẫu 3 lên sớm nhất: 34,82 tương ứng với số bản sao cao nhất gần 13 bản sao. Các mẫu 5, 12 nhiễm WSSV rất nhẹ có chu kỳ ngưỡng lên khá muộn (41, 42 chu kỳ) với số bản sao ban đầu chỉ 1 bản sao. Kết quả kiểm tra 10 mẫu tôm thu từ thực tế còn lại theo Hình 4.18. Hình 4.17 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn của 10 mẫu tôm thu thực tế tiếp theo Bảng 4.9 Số bản sao ban đầu của 10 mẫu tôm thu thực tế tiếp theo Mẫu thực tế Chu kỳ ngưỡng Số bản sao ban đầu 2 38,46 1,19 3 34,82 1,25.10 1 4 37,11 2,84 5 40,90 2,48.10 -1 7 38,38 1,25 8 35,69 7,10 9 36,21 5,08 11 36,94 3,18 12 41,47 1,71.10 -1 15 36,79 3,49 65 Hình 4.18 thể hiện các đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của mẫu 16, 17, 24 nằm dưới baseline subtracted cho thấy 3 mẫu âm tính với virus gây bệnh đốm trắng, các đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của các mẫu 19, 20, 21, 27, 28, 29, 30 vượt qua đường baseline subtracted cho thấy 7 mẫu tôm này đều nhiễm WSSV. Các mẫu dương tính này có chu kỳ ngưỡng lên khá muộn từ chu kỳ 35 đến 41. Số bản sao ban đầu của các mẫu tôm được định lượng qua đồ thị biểu diễn đường chuẩn ở Hình 4.19. Bảng 4.9. Số bản sao ban đầu của 10 mẫu tôm thu thực tế Mẫu thực tế Chu kỳ ngưỡng Số bản sao ban đầu 2 38,46 1,19 3 34,82 1,25.10 1 4 37,11 2,84 5 40,90 2,48.10 -1 7 38,38 1,25 8 35,69 7,10 9 36,21 5,08 11 36,94 3,18 12 41,47 1,71.10 -1 15 36,79 3,49 Hình 4.18 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 10 mẫu tôm thu thực tế còn lại : 27 : 28 : 29 : 30 ▲: các chuẩn : đối chứng âm : 16 : 17 : 19 : 20 : 21 : 24 66 Hiệu quả của phản ứng Real - time PCR đạt 90,5% thể hiện ở Hình 4.19. Hệ số tương quan r2 bằng 1 chứng tỏ mối quan hệ giữa log số bản sao ban đầu và số chu kỳ ngưỡng rất tuyến tính với nhau theo phương trình Y = - 3,573 X + 38,745. Số chu kỳ ngưỡng và số bản sao ban đầu thể hiện ở Bảng 4.10. Bảng 4.10 thể hiện 7 mẫu 19, 20, 21, 27, 28, 29, 30 nhiễm WSSV từ rất nhẹ đến nhẹ, với số bản sao tương ứng là 3, 8, 2, 1, 1, 1, 12. Các mẫu còn lại 16, 17, 24 cho kết quả âm tính với WSSV. Từ kết quả kiểm tra qua Real - time PCR của 30 mẫu thực tế cho thấy có 22 trong số 30 mẫu tôm thu từ thực tế bị nhiễm WSSV, chiếm tỷ lệ 73,33%, từ kết quả này có thể cho thấy tỷ lệ nhiễm WSSV trên tôm nuôi thực tế là khá cao. Trong số 18 mẫu tôm giống thu từ hai tỉnh Bạc Liêu và Bến Tre, có 14/ 18 mẫu bị nhiễm WSSV, chiếm tỷ lệ 77,77%. Theo Nguyễn Văn Hảo (2004), kết quả phân tích tỷ lệ tôm giống nhiễm WSSV bằng Nested PCR ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long trong giai đoạn từ 30 Hình 4.19 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn của 10 mẫu tôm thu thực tế còn lại Bảng 4.10 Số chu kỳ ngƣỡng và số bản sao ban đầu của 10 mẫu tôm thu thực tế còn lại Mẫu thực tế Chu kỳ ngưỡng Số bản sao 19 37,37 2,43 20 35,65 7,36 21 37,89 1,74 27 40,51 3,2.10 -1 28 40,97 2,38.10 -1 29 39,82 5,01.10 -1 30 35,02 1,11.10 1 16 N/A N/A 17 N/A N/A 24 N/A N/A 67 đến 60 ngày tuổi là 37,77%, so với kết quả kiểm tra qua Real - time PCR, thì tỷ lệ này thấp hơn một nửa. Điều này có thể là do phương pháp Real - time PCR nhạy hơn phương pháp Nested PCR đã sử dụng hoặc có thể là do số lượng mẫu thu còn quá ít, chưa đủ để đại diện cho tỷ lệ nhiễm WSSV của tôm sú giống trong khu vực thu mẫu. Đối với mẫu tôm nuôi thương phẩm, có 6/ 9 mẫu (chiếm 66,66%) dương tính với WSSV qua Real - time PCR, và mẫu tôm bố mẹ, có 2/ 3 mẫu thu bị nhiễm WSSV. So với kết quả thu được của Nguyễn Văn Hảo (2004), tỷ lệ nhiễm WSSV qua kiểm tra Nested PCR ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long trên tôm nuôi lớn hơn 60 ngày tuổi và tôm bố mẹ là: 18,24% và 11,11%. Kết quả này có thể do khả năng phát hiện WSSV của Real – time PCR cao hơn các phương pháp khác và do số lượng mẫu thu quá ít. Cho nên cần tiến hành kiểm tra với số lượng mẫu lớn hơn để có được tỷ lệ nhiễm WSSV chính xác của các giai đoạn tôm sú nuôi. Tuy nhiên, tỷ lệ tôm bố mẹ, tôm giống và tôm thương phẩm bị nhiễm WSSV khá cao, cho nên cần có biện pháp kiểm tra chẩn đoán nhanh, chính xác trong quá trình sản xuất giống, kiểm tra giống trước khi thả nuôi và trong quá trình nuôi để giảm thiểu rủi ro cho người nuôi tôm và đạt được kết quả tốt nhất mà theo các kết quả thí nghiệm trên thì phương pháp Real – time PCR cho kết quả tốt và thích hợp nhất. 4.6. Kết quả theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi tôm đã đƣợc thu mẫu kiểm tra Trong số 30 mẫu tôm thu từ thực tế, tình trạng thu hoạch các ao nuôi tôm của 23 mẫu được ghi nhận qua Bảng 4.11. 68 Bảng 4.11 cho thấy tất cả các mẫu tôm giống qua kiểm tra Real - time PCR về WSSV với kết quả dương tính đều phải tháo bỏ ao nuôi. Các mẫu tôm giống cho kết quả âm tính với Real – time PCR cho kết quả thu hoạch tốt. Do vậy, tôm giống thả nuôi sạch bệnh là một trong những yêu cầu cấp thiết để quyết định yếu tố thành công Mẫu Giai đoạn tôm nuôi Kết quả xét nghiệm qua Real – time PCR Tình trạng thu hoạch 1 Tôm giống 34 ngày + Tháo bỏ ao tôm 2 Tôm giống 31 ngày + Tháo bỏ ao tôm 3 Tôm giống 31 ngày + Tháo bỏ ao tôm 4 Tôm giống 31 ngày + Tháo bỏ ao tôm 5 Tôm giống 31 ngày + Tháo bỏ ao tôm 6 Tôm giống 31 ngày - Thu hoạch tốt 7 Tôm giống 31 ngày + Tháo bỏ ao tôm 8 Tôm nuôi thương phẩm (73 ngày) + Tháo bỏ ao tôm 9 Tôm nuôi thương phẩm (43 ngày) + Tháo bỏ ao tôm 10 Tôm giống 36 ngày - Thu hoạch tốt 11 Tôm giống 34 ngày + Tháo bỏ ao tôm 12 Tôm giống 31 ngày + Tháo bỏ ao tôm 13 Tôm giống 31 ngày - Thu hoạch tốt 14 Tôm giống 31 ngày - Thu hoạch tốt 15 Tôm nuôi thương phẩm (62 ngày) + Tháo bỏ ao tôm 16 Tôm nuôi thương phẩm (98 ngày) - Thu hoạch tốt 17 Tôm nuôi thương phẩm (132 ngày) - Thu hoạch sớm 18 Tôm giống 33 ngày ++ Tháo bỏ ao tôm 22 Tôm nuôi thương phẩm (135 ngày) ++++ Thu hoạch sớm 24 Tôm bố mẹ - Duy trì nuôi 26 Tôm bố mẹ + Loại bỏ 27 Tôm bố mẹ + Loại bỏ 30 Tôm nuôi thương phẩm (120 ngày) + Thu hoạch sớm Bảng 4.11 Bảng kết quả theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi tôm đã đƣợc thu mẫu kiểm tra +: nhiễm WSSV rất nhẹ ++: nhiễm WSSV nhẹ ++++: nhiễm WSSV nặng -: không nhiễm WSSV 69 của các hộ nuôi tôm. Kết quả thu hoạch của các ao nuôi thương phẩm có thu mẫu để kiểm tra WSSV bằng Real – time PCR cũng cho kết quả tương tự, tất cả các ao nuôi bị nhiễm WSSV đều bị tháo bỏ hoặc thu hoạch sớm và các ao nuôi không bị nhiễm WSSV cho kết quả thu hoạch tốt hoặc bị thu hoạch sớm. Điều này có thể là do quá trình quản lý ao nuôi kém dẫn đến hiện tượng lây nhiễm WSSV từ bên ngoài vào trong ao và cũng có thể do các yếu tố khác. Do vậy, quy trình quản lý ao nuôi tốt cũng góp phần đáng kể vào sự thành công của vụ nuôi. Tôm bố mẹ bị nhiễm WSSV cũng không cho kết quả sản xuất giống tốt (bị loại bỏ), mặt khác, có thể lây nhiễm WSSV sang tôm giống. Vì vậy, tôm bố mẹ sạch bệnh là yếu tố cần thiết để tạo ra tôm giống sạch bệnh và quyết định yếu tố thành công trong sản xuất giống. Từ các kết quả trên cho thấy các ao thả nuôi tôm giống cho kết quả dương tính qua kiểm tra bằng Real – time đều bị tháo bỏ, các ao nuôi tôm thương phẩm bị nhiễm WSSV đều bị thu hoạch sớm, các ao nuôi tôm thương phẩm không bị nhiễm WSSV có thể cho kết quả thu hoạch tốt hoặc có thể bị thu hoạch sớm tùy thuộc vào quá trình quản lý ao nuôi, và tôm bố mẹ bị nhiễm WSSV thì cho kết quả sản xuất giống kém. 70 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Sau khi thực hiện đề tài, qua 6 thí nghiệm đã tiến hành, tôi nhận thấy: Ly trích bằng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix sẽ thu được ADN của WSSV tinh sạch thích hợp cho tiến hành Real – time PCR và Non Stop Nested PCR. Real - time PCR có thể ứng dụng để kiểm tra mầm bệnh WSSV trên tôm sú với khả năng phát hiện (1 bản sao) cao hơn các phương pháp khác. Hơn nữa, Real - time PCR còn cho phép định lượng số bản sao của virus gây bệnh đốm trắng mà các phương pháp khác không có khả năng thực hiện. Phương pháp Real - time PCR có khả năng định lượng chính xác số lượng bản sao của WSSV với độ lặp lại cao. Độ nhạy của phương pháp Real - time PCR cao hơn 10 lần so với Non Stop Nested PCR. Tỷ lệ nhiễm WSSV trên tôm sú ở các giai đoạn nuôi qua kiểm tra bằng Real – time PCR có thể cao hơn rất nhiều so với tỷ lệ nhiễm được công bố qua xác định bằng các phương pháp khác. Các ao thả nuôi tôm giống cho kết quả dương tính qua kiểm tra bằng Real – time đều bị tháo bỏ, các ao nuôi tôm thương phẩm bị nhiễm WSSV đều bị thu hoạch sớm, các ao nuôi tôm thương phẩm không bị nhiễm WSSV có thể cho kết quả thu hoạch tốt hoặc có thể bị thu hoạch sớm tùy thuộc vào quá trình quản lý ao nuôi, và tôm bố mẹ bị nhiễm WSSV thì cho kết quả sản xuất giống kém. 5.2. Đề nghị Nên sử dụng phương pháp Real – time PCR để kiểm tra phát hiện virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú thay cho các phương pháp khác. Không thả nuôi tôm giống bị nhiễm WSSV. Không sử dụng tôm bố mẹ bị nhiễm WSSV để sản xuất tôm giống. Kiểm tra tôm nuôi thương phẩm định kỳ trong quá trình nuôi để có biện pháp xử lý thích hợp. 71 Do thời gian thực hiện đề tài hạn hẹp, nếu có điều kiện, tôi đề nghị thực hiện tiếp một số nghiên cứu như sau: Kiểm tra đánh giá tỷ lệ nhiễm WSSV bằng phương pháp Real – time PCR ở các giai đoạn tôm nuôi. Phát triển kỹ thuật Real - time PCR để phát hiện và định lượng các loại virus khác gây bệnh trên tôm sú. Tiến hành nghiên cứu nhằm sản xuất ra tôm giống sạch bệnh để giảm rủi ro cho người nuôi tôm. 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Trần Minh Anh, 1989. Đặc điểm sinh học và kỹ thuật nuôi tôm he. Nhà xuất bản Thành Phố Hồ Chí Minh. 394 trang. 2. Trần Thị Minh Tâm và Đái Duy Ban, 1999. Bệnh thường gặp ở tôm – Phương pháp chẩn đoán và phòng trị. Nhà Xuất Bản Nông nghiệp Hà Nội. 144 trang. 3. Nguyễn Văn Chung, 2000. Cơ sở sinh học và kỹ thuật sản xuất giống nhân tạo tôm sú. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 71 trang. 4. Trần Thị Hoàng Dung, 2000. Ứng dụng phương pháp Nested PCR điều tra bệnh WSSV trên tôm sú ở một số tỉnh phía Nam. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Thủy sản, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 56 trang. 5. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo dục. 301 trang. 6. Nguyễn Văn Hảo, 2000. Một số vấn đề về kỹ thuật nuôi tôm sú công nghiệp. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 210 trang. 7. Nguyễn Văn Hảo, 2004. Một số bệnh thường gặp trên tôm sú (Penaeus monodon) – Các phương pháp chẩn đoán và biện pháp phòng trị. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 223 trang. 8. Trần Thị Việt Ngân, 2002. Hỏi và đáp về kỹ thuật nuôi tôm sú. Nhà xuất bản Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh. 192 trang. 9. Báo cáo tại hội thảo bệnh tôm sú tại Hải Phòng, ngày 28 – 29/2/2004. Tổng quan bệnh virus đốm trắng ở tôm he (Penaeus). Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004. 42 trang. 10. Hội thảo về bệnh tôm nuôi ở các tỉnh phía Nam, 2004. Bệnh đốm trắng của tôm sú và biện pháp phòng trị. Tạp chí Thủy sản, số 3 – 2004. 44 trang. 11. Bộ Thủy Sản, 1996. Nguồn lợi thủy sản Việt Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. 616 trang. 12. Bộ Thủy Sản, 2003. Tuyển tập báo cáo khoa học về nuôi trồng thủy sản tại hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 2 (24 – 25/11/2003). Nhà xuất bản Nông ng