Đề tài Phát hiện một số gen độc lực của E. coliphân lập được từ phân và thịt bò, heo bằng kỹ thuật multiplex - PCR

Download» Agriviet.com 1 Chöông 1 ÑAËT VAÁN ÑEÀ Escherichia coli (E. coli) laø vi khuaån soáng coäng sinh chieám öu theá nhaát trong heä vi sinh vaät ñöôøng ruoät cuûa ngöôøi vaø ñoäng vaät. Tuy nhieân, khi coù ñieàu kieän thích hôïp, moät soá nhoùm E. coli gaây ñoäc taêng sinh maïnh, trôû thaønh nguyeân nhaân quan troïng gaây tieâu chaûy treân ngöôøi vaø gia suùc, ñaëc bieät laø gia suùc non (tieâu chaûy treân beâ ngheù, tieâu chaûy phaân traéng ôû heo con theo meï, tieâu chaûy phuø thuûng treân heo cai söõa). E. coli ñöôïc thaûi qua phaân ra moâi tröôøng beân ngoaøi. Neáu qui trình veä sinh keùm thì E. coli deã vaáy nhieãm vaøo thòt töôi, ñaëc bieät laø trong quaù trình gieát moå. Töø ñoù neáu vieäc baûo quaûn vaø cheá bieán thöïc phaåm khoâng thích hôïp thì ngoä ñoäc thöïc phaåm do E. coli hoaøn toaøn coù theå xaûy ra. Trong soá caùc taùc nhaân gaây tieâu chaûy ôû ngöôøi thì E. coli luoân laø taùc nhaân phoå bieán nhaát ôû nhöõng nöôùc coâng nghieäp phaùt triển lẫn nhöõng nöôùc ñang phaùt trieån. Do ñoù E. coli ñöôïc xem laø vi khuaån chæ danh oâ nhieãm thöïc phaåm vaø nöôùc ñöôïc ñaùnh giaù döïa treân soá löôïng cuûa chuùng. Döïa treân ñaëc ñieåm gaây beänh, E. coli ñöôïc chia thaønh nhieàu nhoùm. Moãi nhoùm ñeàu coù nhöõng yeáu toá ñoäc löïc khaùc nhau ñöôïc qui ñònh bôûi nhöõng gen ñoäc löïc. Moät soá gen ñoäc löïc quan troïng cuûa E. coli goàm: gen stx1, stx2, stx2e, hly cuûa nhoùm STEC (Shiga toxin-producing E. coli); gen eae cuûa nhoùm STEC vaø EPEC (Enteropathogenic E. coli); gen sta, stb, lt-I cuûa nhoùm ETEC (Enterotoxigenic E. coli )… E. coli laø vi khuaån bình thöôøng ôû ñöôøng ruoät vaø cuõng thöôøng coù maët trong thöïc phaåm neân vieäc phaân laäp ñöôïc vi khuaån E. coli trong phaân ñeå tìm nguyeân nhaân gaây beänh hay xaùc ñònh ñöôïc soá löôïng vi khuaån trong thöïc phaåm hoaøn toaøn khoâng phaûn aùnh ñöôïc khaû naêng gaây ñoäc cuûa chuùng. Do vaäy vieäc xaùc ñònh caùc gen Download» Agriviet.com 2 ñoäc löïc cuûa E. coli laø moät böôùc raát caàn thieát phuïc vuï cho vieäc ñaùnh giaù nguy cô gaây beänh treân vaät nuoâi vaø con ngöôøi. Caùc kyõ thuaät sinh hoïc phaân töû, ñaëc bieät laø kyõ thuaät PCR thöôøng ñöôïc aùp duïng ñeå phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc naøy. Cho ñeán nay, ôû Vieät Nam vieäc xaùc ñònh E. coli laø nguyeân nhaân gaây beänh thöôøng chæ thöïc hieän baèng kyõ thuaät phaân laäp vaø xaùc ñònh caùc ñaëc tính sinh hoùa, vaø theo Tieâu chuaån Vieät Nam, ñaùnh giaù tình traïng veä sinh thöïc phaåm hieän chæ döøng laïi ôû möùc ñoä xaùc ñònh soá löôïng vi khuaån, vieäc phaùt hieän nhöõng gen ñoäc löïc cuûa vi khuaån chöa ñöôïc quan taâm. Hôn nöõa vieäc öùng duïng kyõ thuaät multiplex - PCR ñeå phaùt hieän ñoàng thôøi caùc yeáu toá ñoäc löïc cuûa E. coli chöa ñöôïc thöïc hieän ôû Vieät Nam. Vôùi muïc tieâu phaùt hieän moät soá gen ñoäc löïc maõ hoùa caùc protein gaây ñoäc cuûa E. coli phaân laäp ñöôïc töø phaân vaø thòt boø, heo baèng kyõ thuaät multiplex – PCR, ñöôïc söï höôùng daãn cuûa Thaày Nguyeãn Ngoïc Tuaân, chuùng toâi tieán haønh thöïc hieän ñeà taøi: “Phaùt hieän moät soá gen ñoäc löïc cuûa E. coli phaân laäp ñöôïc töø phaân vaø thòt boø, heo baèng kyõ thuaät multiplex - PCR”. Böôùc ñaàu aùp duïng kyõ thuaät naøy, chuùng toâi laàn löôït thöïc hieän khaûo saùt treân caùc nhoùm ñoái töôïng maãu phaân tieâu chaûy, phaân bình thöôøng, vaø thòt töôi. Ñeà taøi hy voïng trôû thaønh cô sôû ñeå aùp duïng kyõ thuaät multiplex – PCR trong vieäc phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa vi khuaån E. coli trong chaån ñoaùn beänh vaø ñaùnh giaù tình traïng veä sinh thöïc phaåm. Yeâu caàu: - E. coli ñöôïc phaân laäp ñònh löôïng theo qui trình cuûa FAO (1992) vaø phaân laäp ñònh tính baèng moâi tröôøng choïn loïc MacConkey ñoái vôùi maãu phaân hoaëc baèng moâi tröôøng taêng sinh choïn loïc CT-SMAC (Sorbitol MacConkey vôùi khaùng sinh cefixime vaø tellurite potassium) ñoái vôùi maãu thòt. - Ly trích DNA töø vi khuaån E. coli phaân laäp ñöôïc; - Phaùt hieän moät soá gen ñoäc löïc (eae, hly, stx1, stx2, stx2e, sta, stb, lt-I) cuûa E. coli phaân laäp ñöôïc baèng kyõ thuaät mutiplex - PCR. Download» Agriviet.com 3 Chöông 2 TOÅNG QUAN 2.1 Vi khuaån E. coli 2.1.1 Ñònh nghóa Vi khuaån Escherichia coli ñöôïc phaân laäp vaø moâ taû ñaàu tieân vaøo naêm 1885 bôûi nhaø nghieân cöùu ngöôøi Ñöùc Theodor Escherich. Theo heä thoáng phaân loaïi cuûa Bergey, vi khuaån E. coli thuoäc hoï Enterobacteriaceae, gioáng Escherichia. E. coli laø tröïc khuaån Gram aâm, di ñoäng, kích thöôùc khoaûng 2 – 3 x 0,5 μm, khoâng hình thaønh baøo töû vaø coù giaùp moâ. E. coli coù maët thöôøng xuyeân vaø chieám öu theá trong ruoät cuûa ngöôøi vaø ñoäng vaät maùu noùng, ôû phaàn cuoái cuûa ruoät non vaø ôû ruoät giaø. 2.1.2 Nuoâi caáy vaø ñaëc ñieåm sinh hoùa E. coli laø vi khuaån hieáu khí hoaëc yeám khí tuøy nghi. Nhieät ñoä thích hôïp laø 35 - 370C, pH thích hôïp 6,4 – 7,5 (toái öu nhaát laø 7,2 – 7,4). Trong moâi tröôøng loûng, sau 4 – 5 giôø E. coli laøm ñuïc nheï moâi tröôøng, caøng ñeå laâu caøng ñuïc, coù muøi hoâi thoái; sau vaøi ngaøy coù theå coù vaùng moûng treân maët moâi tröôøng. E. coli moïc toát treân moâi tröôøng thaïch dinh döôõng, sau 24 giôø hình thaønh nhöõng khuaån laïc daïng S maøu xaùm traéng, troøn, öôùt, beà maët boùng, kích thöôùc khoaûng 2 – 3 mm. Treân moâi tröôøng thaïch EMB: E. coli cho khuaån laïc tím aùnh kim. Treân moâi tröôøng thaïch MacConkey: E. coli cho khuaån laïc ñoû hoàng. Treân moâi tröôøng thaïch nghieâng TSI: E. coli taïo acid / acid (vaøng / vaøng). Download» Agriviet.com 4 Ñeå phaân bieät E. coli vaø caùc vi khuaån ñöôøng ruoät khaùc, ngöôøi ta duøng thöû nghieäm IMVC. E. coli cho keát quaû IMVC laø + + − − (biotype 1) hoaëc − + − − (biotype 2). 2.1.3 Yeáu toá khaùng nguyeân E. coli coù caáu truùc khaùng nguyeân raát phöùc taïp. Tröôùc kia, kyõ thuaät xaùc ñònh khaùng nguyeân beà maët laø phöông tieän chính ñeå phaân bieät caùc doøng E. coli gaây beänh. Naêm 1947, Kauffmann ñöa ra heä thoáng phaân nhoùm serotype maø vaãn coøn ñöôïc söû duïng ñeán ngaøy nay. Heä thoáng phaân nhoùm naøy döïa vaøo vieäc xaùc ñònh khaùng nguyeân beà maët O, H, K. * Khaùng nguyeân thaân O (somatic antigen): coù baûn chaát laø lipopolysaccharide cuûa maøng ngoaøi teá baøo, beàn vôùi nhieät vaø coàn. Khi ñun noùng ôû 1000C trong 2 giôø vaãn giöõ ñöôïc tính khaùng nguyeân. Khaùng nguyeân O coù theå ñöôïc phaùt hieän baèng phaûn öùng ngöng keát. Khaùng nguyeân O giöõ vai troø nhaát ñònh ñoái vôùi khaû naêng gaây beänh cuûa doøng vi khuaån vaø coù tính chaát chuyeân bieät cho töøng loaøi vaät chuû. Khaùng nguyeân O taïo neàn taûng cho vieäc phaân loaïi serogroup cuûa E. coli. Coù hôn 170 serogroup khaùng nguyeân O. Trong moãi serogroup coù 1 hay nhieàu serotype ñöôïc phaân loaïi döïa vaøo khaùng nguyeân loâng H. * Khaùng nguyeân loâng H (flagellar antigen): coù baûn chaát laø protein, taïo neân khaû naêng di ñoäng cuûa E. coli, keùm chòu nhieät. Coù khoaûng 56 type khaùng nguyeân H. * Khaùng nguyeân giaùp moâ K (capsular antigen): Khaùng nguyeân K luùc ñaàu ñöôïc xaùc ñònh baèng phaûn öùng ngöng keát. Ngöôøi ta xaùc ñònh coù söï hieän dieän cuûa khaùng nguyeân K ôû vi khuaån neáu vi khuaån chæ ngöng keát vôùi khaùng huyeát thanh O khi bò ñun noùng. Döïa vaøo khaû naêng chòu nhieät ngöôøi ta chia khaùng nguyeân K thaønh 3 type laø A, L vaø B. Veà sau ngöôøi ta phaân loaïi khaùng nguyeân K döïa vaøo thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa chuùng vaø ñaõ coù hôn 80 type khaùng nguyeân K ñaõ ñöôïc xaùc ñònh. Moät vaøi E. coli, ñaëc bieät laø E. coli tieát ñoäc toá ruoät coù nhöõng loâng baùm khaùng mannose (mannose resistant - MR) cuõng ñöôïc duøng ñeå phaân loaïi veà maët Download» Agriviet.com 5 huyeát thanh hoïc. Moät vaøi loâng baùm khaùng mannose naøy (ví duï nhö K88 vaø K89) ñaõ töøng ñöôïc coi laø khaùng nguyeân K. Veà sau, khi xaùc ñònh ñöôïc thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa nhöõng loâng baùm naøy coù baûn chaát laø protein neân vieäc xeáp chuùng vaøo khaùng nguyeân K khoâng coøn phuø hôïp, chuùng ñöôïc xeáp vaøo nhoùm khaùng nguyeân tieâm mao F. * Khaùng nguyeân tieâm mao F (fimbrial antigen): Tieâm mao (fimbriae) daøi khoaûng 4μm, ñöôøng kính 2,1 – 7,0 nm, daïng thaúng hay xoaén. Tieâm mao khoâng tham gia vaøo söï di chuyeån, ngaén hôn vaø nhieàu hôn flagella. Tieâm mao giuùp vi khuaån keát dính vaøo teá baøo nieâm mao ruoät neân raát quan troïng trong khaû naêng gaây beänh cuûa vi khuaån. Hieän nay coù hôn 700 type khaùng nguyeân hay serotype cuûa E. coli töø söï toå hôïp cuûa caùc nhoùm khaùng nguyeân O, H, K, F. Tuy nhieân noùi chung, chæ nhöõng E. coli ngoaøi ñöôøng ruoät môùi khoâng coù capsul (Jann vaø Jann, 1992), do ñoù ñoái vôùi nhöõng E. coli gaây tieâu chaûy, thöôøng thì vieäc xaùc ñònh serotype chæ laø söï keát hôïp ñaëc hieäu giöõa khaùng nguyeân O vaø khaùng nguyeân H. 2.1.4 Phaân loaïi E. coli Maëc duø E. coli laø vi khuaån coäng sinh voâ haïi trong ñöôøng ruoät. Tuy nhieân trong moät ñieàu kieän thuaän lôïi, gioáng nhö haàu heát caùc taùc nhaân gaây beänh treân maøng nhaày, E. coli coù caùc yeáu toá caàn thieát ñeå gaây beänh goàm (1) cö truù treân maøng nhaày, (2) khaùng ñöôïc söï phoøng veä cuûa vaät chuû, (3) nhaân leân, vaø (4) gaây toån haïi vaät chuû. Ñaëc tính quan troïng nhaát cuûa doøng E. coli gaây tieâu chaûy laø khaû naêng cö truù treân maøng nhaày ruoät baát chaáp nhu ñoäng ruoät vaø söï caïnh tranh dinh döôõng cuûa heä vi sinh vaät bình thöôøng ôû ruoät (goàm caû nhöõng doøng E. coli khaùc). Söï hieän dieän cuûa nhöõng loâng baùm laø moät ñaëc ñieåm cuûa haàu heát caùc doøng E. coli, caû ôû nhöõng doøng E. coli khoâng gaây beänh (Nataro vaø Kaper, 1998). Tuy nhieân nhöõng doøng E. coli gaây tieâu chaûy coù nhöõng khaùng nguyeân loâng ñaëc hieäu giuùp E. coli coù theå baùm dính vaøo maøng nhaày ruoät non maëc duø ñaây khoâng phaûi laø vò trí cö truù bình thöôøng Download» Agriviet.com 6 cuûa E. coli (Levine vaø ctv, 1984). Moät khi söï cö truù ñaõ ñöôïc thieát laäp, vieäc gaây beänh cuûa caùc doøng E. coli gaây tieâu chaûy raát ña daïng. Döïa treân ñaëc ñieåm gaây beänh (goàm caùc ñaëc tính ñoäc löïc, söï taùc ñoäng khaùc nhau leân maøng nhaày ruoät, hoäi chöùng laâm saøng cuûa beänh vaø söï khaùc nhau veà maët dòch teã cuûa beänh), E. coli ñöôïc chia thaønh 5 nhoùm chính: - STEC (Shiga toxin-producing E. coli) hoaëc VTEC (Verotoxigenic E. coli) vaø EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli) - EPEC (Enteropathogenic E. coli) - ETEC (Enterotoxigenic E. coli) - EAggEC hay EAEC (Enteroaggregative E. coli) - EIEC (Enteroinvasive E. coli) Coù ba cô cheá chung veà khaû naêng gaây tieâu chaûy cuûa E. coli: (1) Saûn xuaát ñoäc toá (ETEC, EAEC, STEC) (2) Taán coâng / xaâm laán (EIEC) (3) Baùm dính, truyeàn tín hieäu qua maøng (EPEC vaø EHEC) Tuy nhieân, taùc ñoäng qua laïi giöõa cô theå vaät chuû vaø maøng nhaày ruoät thì ñaëc hieäu cho moãi loaïi (Nataro vaø Kaper, 1998). 2.1.5 Shiga toxigenic E. coli (STEC) 2.1.5.1 Thuaät ngöõ: Nhöõng höôùng khaùc nhau trong nghieân cöùu ñaõ ñöa ra nhöõng thuaät ngöõ khaùc nhau ñeå goïi teân cho nhoùm E. coli naøy. Teân goïi Verotoxigenic E. coli (VTEC) ñöôïc Konowalchuk vaø ctv (1977) ñaët cho nhoùm naøy khi phaùt hieän vieäc saûn xuaát ñoäc toá gaây ñoäc cho doøng teá baøo Vero. Teân goïi Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) laø do doøng naøy gaây vieâm keát traøng xuaát huyeát (HC) vaø hoäi chöùng huyeát nieäu (HUS) (Nataro vaø Kaper, 1989). Vaø thuaät ngöõ Shiga toxin-producing E. coli (STEC) (tröôùc ñaây goïi laø Shiga-like toxin- produccing E. coli - SLTEC) chæ roõ khaû naêng saûn sinh ñoäc toá gaây ñoäc teá baøo gioáng nhö ñoäc toá Shiga (Calderwood vaø ctv, 1996). Download» Agriviet.com 7 STEC vaø VTEC laø hai thuaät ngöõ töông ñöông nhau, vaø caû hai ñeàu chæ ra raèng nhoùm E. coli saûn sinh ra moät hay nhieàu loaïi ñoäc toá gaây ñoäc teá baøo. Maëc duø vaäy khoâng phaûi chæ caàn coù gen saûn sinh ñoäc toá laø coù theå gaây beänh neáu khoâng coù caùc yeáu toá ñoäc löïc khaùc. Nhöõng doøng E. coli mang gen sinh ñoäc toá cuõng hieän dieän trong ruoät gia suùc khoûe maïnh vôùi moät soá löôïng raát ít, nhöng nhöõng doøng naøy thieáu moät vaøi hay taát caû nhöõng yeáu toá ñoäc löïc khaùc cuûa STEC (Beutin vaø ctv, 1994). Do ñoù khoâng phaûi taát caû STEC ñeàu coù khaû naêng gaây beänh (Nataro vaø Kaper, 1998). 2.1.5.2 Shiga toxin vaø nhöõng yeáu toá ñoäc löïc lieân quan ñeán ñaëc tính gaây beänh cuûa STEC: STEC saûn xuaát ñoäc toá Shiga-like toxin (Slt), coøn goïi laø Shiga toxin (Stx) hay Verotoxin (VT). Hoï ñoäc toá Stx goàm hai nhoùm chính khoâng phaûn öùng cheùo vôùi nhau laø Stx1 vaø Stx2. Trong khi Stx1 coù tính baûo toàn cao thì Stx2 raát thay ñoåi veà trình töï, taïo ra nhieàu subtype nhö Stx2c, Stx2hb, Stx2e (Calderwood vaø ctv, 1996), Stx2g (Leung vaø ctv, 2003). Moät doøng STEC coù theå saûn sinh Stx1, Stx2 hoaëc caû Stx1 vaø Stx2, vaø thaäm chí nhieàu daïng cuûa Stx2. Caû hai ñoäc toá Stx1 vaø Stx2 ñeàu ñöôïc caáu taïo töø 5 tieåu ñôn vò B 7,7 kDa vaø 1 tieåu ñôn vò A 32 kDa. Tieåu ñôn vò A goàm peptide A1 28 kDa vaø peptide A2 4 kDa noái vôùi nhau baèng caàu noái disulfur. Peptide A1 coù hoaït tính enzyme vaø peptide A2 coù nhieäm vuï gaén keát tieåu ñôn vò A vaøo nhöõng tieåu ñôn vò B. Nhöõng tieåu ñôn vò B giuùp ñoäc toá keát hôïp vôùi receptor ñaëc hieäu Gb3 (globotriaosylceramide) hieän dieän treân beà maët cuûa nhöõng teá baøo eukaryote (Stx2e coù receptor laø Gb4). Sau khi ñöôïc chuyeån vaøo beân trong teá baøo, tieåu ñôn vò A ñeán teá baøo chaát vaø taùc ñoäng leân tieåu phaàn 60S cuûa ribosome. Peptide A1 coù hoaït tính enzyme hoaït ñoäng nhö moät N-glycosidase caét moät goác adenin khoûi rRNA 28S cuûa ribosome, do ñoù gaây trôû ngaïi cho söï toång hôïp protein. Do khoâng toång hôïp ñöôïc protein, nhöõng teá baøo bò Stx taùc ñoäng (teá baøo noäi moâ cuûa thaän, teá baøo bieåu moâ ruoät, teá baøo Vero, teá baøo Hela hay baát cöù teá baøo naøo coù receptor laø Gb3, receptor Gb4 ñoái vôùi Stx2e) seõ cheát. Haäu quaû gaây ñoäc cho teá baøo ruoät do Stx vaø caùc yeáu toá Download» Agriviet.com 8 ñoäc löïc khaùc cuûa STEC laø gaây söï hö haïi nhöõng teá baøo nhung mao ruoät, gaây tieâu chaûy vaø vieâm keát traøng xuaát huyeát (Haemorrhagic colitis – HC). Söï hö haïi nhöõng teá baøo thaønh maïch maùu do Stx2e seõ gaây neân hieän töôïng phuø thuûng ôû heo. Nhöõng toån thöông ôû teá baøo noäi moâ thaän gaây neân hoäi chöùng huyeát nieäu (Haemolytic uraemic syndrome - HUS) ôû ngöôøi. Yeáu toá baùm dính cuûa STEC/EHEC ñaõ ñöôïc chöùng minh laø ñoùng vai troø quan troïng trong söï ñònh vò vi khuaån ôû ruoät. Ñoù chính laø intimin, moät protein maøng ngoaøi coù troïng löôïng phaân töû 94 – 97 kDa. Intimin ñöôïc maõ hoùa bôûi gen eae (E. coli attaching and effacing). Intimin gaây toån thöông daïng baùm dính vaø phaù huûy (attaching-and-effacing, A/E) ôû ruoät giaø do vi khuaån baùm chaët vaøo teá baøo bieåu moâ (Donnerberg vaø ctv, 1993). Gen eae naøy cuõng ñöôïc tìm thaáy ôû nhoùm EPEC. Gen eae gaây kieåu toån thöông A/E laø moät trong soá caùc gen naèm treân vuøng gaây beänh 35,5 kb (goïi laø vuøng gaây hö haïi teá baøo ruoät – locus of enterocyte effacement, LEE). Vuøng LEE cuûa STEC/EHEC chöùa nhöõng gen maõ hoùa cho intimin, maõ hoùa receptor cuûa intimin Tir (translocated intimin receptor) vaø moät soá gen khaùc. Vuøng LEE khoâng chæ laø ñieàu kieän caàn maø coøn laø ñieàu kieän ñuû cho vieäc hình thaønh toån thöông A/E. Tuy nhieân khoâng phaûi taát caû STEC ñeàu coù gen eae, nhöng taát caû EHEC ñeàu coù gen eae (Nataro vaø Kaper, 1998). Beänh tích A/E phuï thuoäc vaøo töông taùc giöõa protein maøng ngoaøi cuûa vi khuaån (intimin) vaø protein Tir. Protein Tir ñöôïc tieát ra khoûi vi khuaån, chuyeån vò vaøo maøng cuûa teá baøo vaät chuû (Paton vaø ctv, 1996). Yeáu toá khaùc coù lieân quan ñeán ñoäc löïc cuûa STEC laø vieäc taïo ra enterohaemolysin (EHEC-Hly) vaø coù theå caû ñoäc toá ruoät chòu nhieät EAST1. EHEC-Hly ñöôïc maõ hoùa bôûi gen treân plasmid 60 MDa (pO157) maø plasmid naøy ñöôïc tìm thaáy ôû gaàn nhö taát caû caùc doøng O157:H7 vaø cuõng khaù phoå bieán caû nhöõng doøng STEC non-O157 nöõa (Nataro vaø Kaper, 1998). Treân plasmid Download» Agriviet.com 9 naøy coù söï hieän dieän cuûa moät operon goàm 4 khung ñoïc môû (open reading frame - ORF) laø hlyCABD. Trong ñoù hlyA laø gen caáu truùc khôûi ñaàu cho haemolysin. Ñoäc toá ruoät chòu nhieät EAST1 (ñaàu tieân ñöôïc moâ taû ôû nhoùm EAEC laø EAEC heat-stable enterotoxin 1), cuõng ñöôïc tìm thaáy ôû nhieàu doøng STEC. Taàm quan troïng cuûa EAST1 ñoái vôùi khaû naêng gaây beänh cuûa STEC vaãn chöa ñöôïc bieát, nhöng noù coù ôû moät vaøi tröôøng hôïp tieâu chaûy khoâng coù maùu maø thöôøng thaáy ôû nhöõng ngöôøi nhieãm STEC (Nataro vaø Kaper, 1998). Haàu heát caùc oå dòch cuûa STEC/EHEC laø do O157:H7, neân ngöôøi ta cho raèng coù theå serotype naøy ñoäc hôn vaø deã laây truyeàn hôn nhöõng serotype khaùc (Nataro vaø Kaper, 1998). Tuy nhieân cuõng coù nhieàu serotype khaùc ngoaøi O157:H7 coù lieân quan ñeán HC vaø HUS treân ngöôøi. Nhöõng serotype non-O157 phoå bieán nhaát lieân quan ñeán beänh treân ngöôøi thuoäc O26, O91, O103, O111 (Paton, 1989). Haàu heát tính chaát sinh hoùa cuûa E. coli O157:H7 ñeàu töông töï nhö nhöõng E. coli khaùc. Ñieåm khaùc bieät veà sinh hoùa cuûa doøng O157:H7 laø khoâng leân men ñöôøng sorbitol vaø β-glucuronidase döông tính. 93% chuûng E. coli thì leân men sorbitol trong 24 giôø, trong khi E. coli O157:H7 laïi khoâng. 93% chuûng E. coli cho β-glucuronidase döông tính trong khi E. coli O157:H7 thì khoâng. Ngoaøi ra trong moâi tröôøng TSB, O157:H7 phaùt trieån nhanh ôû 30 – 42oC, taêng tröôûng khoù khaên ôû 43 – 44oC vaø ngöøng taêng tröôûng ôû 45oC (daãn lieäu bôûi Traàn Thanh Phong, 1998). Lieàu gaây nhieãm cuûa E. coli O157:H7 laø raát nhoû, töø 10 – 100 vi khuaån (Griffin, 1994; Paton, 1996), nhöng cuõng may maén laø E. coli O157 hieän dieän trong phaân, thöïc phaåm vôùi taàn soá thaáp hôn nhieàu so vôùi nhoùm non-O157 (Paton, 1998). Ñaây cuõng laø trôû ngaïi cho vieäc phaùt hieän E. coli O157:H7. Döïa vaøo nhöõng tính chaát rieâng bieät cuûa doøng E. coli naøy, nhieàu moâi tröôøng taêng sinh vaø choïn loïc ñaõ ñöôïc taïo ra ñeå phaùt hieän O157:H7 trong thöïc phaåm. Ngöôøi ta duøng moâi tröôøng taêng sinh coù boå sung theâm khaùng sinh cefixime, cefsulodin, vancomycin ñeå haïn cheá söï taêng tröôûng cuûa nhöõng vi truøng Gram aâm khaùc. Sau ñoù söû duïng moâi tröôøng Download» Agriviet.com 10 tuyeån löïa ñeå phaùt hieän nhoùm E. coli O157. Thöôøng nhaát laø moâi tröôøng SMAC hoaëc SMAC coù boå sung cefixime vaø tellurite (CT-SMAC) (FDA, 2002). 2.1.5.3 Nguoàn laây nhieãm: STEC coù theå ñöôïc tìm thaáy trong phaân cuûa nhieàu loaøi ñoäng vaät nhö traâu boø, cöøu, deâ, heo, choù vaø meøo (Beutin, 1993; Beutin, 1995; Chapman, 1997) vaø ngöïa (Chalmer, 1997). Loaøi ñoäng vaät quan troïng nhaát trong vieäc gaây nhieãm cho ngöôøi laø traâu boø. Ñöôøng gaây nhieãm chuû yeáu cuûa STEC vaøo thöïc phaåm laø vieäc vaáy nhieãm chöùa vaät ñöôøng tieâu hoùa vaø phaân vaøo thòt trong quaù trình gieát moå (Paton, 1998). STEC laây truyeàn qua ngöôøi chuû yeáu baèng con ñöôøng thöïc phaåm, nöôùc vaø töø ngöôøi qua ngöôøi. Haàu heát caùc tröôøng hôïp laø do aên thöïc phaåm ñaõ bò nhieãm, ñaëc bieät laø thöïc phaåm coù nguoàn goác ñoäng vaät, maø thòt boø laø nguyeân nhaân chuû yeáu (Keskimaki, 2001). 2.1.6 Enteropathogenic E. coli (EPEC) EPEC laø nhoùm E. coli gaây tieâu chaûy quan troïng coù lieân quan ñeán tieâu chaûy ôû treû sô sinh taïi nhöõng nöôùc ñang phaùt trieån. Daáu hieäu cuûa söï nhieãm beänh do EPEC laø hình thaønh beänh tích kieåu A/E (attaching-and-effacing, A/E), coù theå quan saùt ñöôïc treân maãu sinh thieát ruoät töø nhöõng beänh nhaân hay thuù bò nhieãm beänh vaø trong nuoâi caáy teá baøo (daãn lieäu Nataro vaø Kaper, 1998). Kieåu hình rieâng bieät naøy ñöôïc ñaëc tröng bôûi söï hö haïi cuûa caùc vi nhung mao vaø söï keát dính chaët giöõa vi khuaån vaø maøng teá baøo bieåu moâ. Daïng toån thöông naøy khaùc vôùi daïng toån thöông do doøng ETEC vaø Vibrio cholerae (ETEC vaø V. cholerae baùm theo kieåu khoâng chaët, khoâng gaây baøo moøn vi nhung). Maëc duø nhöõng nghieân cöùu tröôùc ñaây ñaõ baùo caùo veà nhöõng toån thöông moâ beänh hoïc daïng naøy, nhöng cho ñeán khi Moon vaø ctv (1983) baùo caùo raèng kieåu toån thöông naøy coù lieân quan roäng raõi ñeán EPEC thì thuaät ngöõ “gaén keát vaø gaây hö haïi” (“attaching and effacing” – A/E) môùi ñöôïc ñöa ra. Gen caàn thieát cho vieäc taïo ra toån thöông A/E laø gen eae maõ hoùa protein intimin. Protein naøy laø yeáu toá ñoäc löïc caàn thieát cuûa EPEC (Donnerberg, 1993). Theo Nataro vaø Kaper (1998), gen eae Download» Agriviet.com 11 hieän dieän ôû taát caû caùc chuûng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium vaø Hafnia alvei; nhöng khoâng hieän dieän ôû nhöõng doøng E. coli thuoäc heä vi khuaån ñöôøng ruoät thoâng thöôøng. Ñaùp öùng vieâm taïi choã vaø söï taêng tính thaám cuûa ruoät trong ñaùp öùng vôùi EPEC goùp phaàn vaøo tieâu chaûy (Nataro vaø Kaper, 1998). Ñieåm ñaùng löu yù nhaát veà maët dòch teã hoïc cuûa beänh do EPEC veà söï phaân boá veà löùa tuoåi cuûa ngöôøi beänh. Beänh chuû yeáu xaûy ra treân treû em döôùi 2 tuoåi. Beänh thöôøng bieåu hieän caáp tính vôùi tieâu chaûy nghieâm troïng. Lyù do lieân quan ñeán khaû naêng ñeà khaùng ñöôïc ôû ngöôøi tröôûng thaønh vaø treû em lôùn coøn chöa ñöôïc bieát roõ, nhöng coù leõ laø do söï maát caùc receptor ñaëc hieäu. Tuy nhieân EPEC cuõng coù theå gaây tieâu chaûy ôû ngöôøi lôùn neáu soá löôïng vi khuaån ñuû lôùn (Nataro vaø Kaper, 1998). 2.1.7 Enterotoxigenic E. coli (ETEC) 2.1.7.1 Caùc yeáu toá ñoäc löïc: Nhoùm ETEC coù hai nhoùm quyeát ñònh ñoäc löïc chính laø ñoäc toá ruoät (enterotoxin) vaø yeáu toá ñònh vò (colonization factor – CF). ™ Ñoäc toá ruoät enterotoxin Nhoùm ETEC goàm nhöõng E. coli taïo ra ít nhaát moät trong hai loaïi ñoäc toá ñöôøng ruoät laø ST vaø LT. ETEC thöôøng ñöôïc xem laø ñaïi dieän cuûa cô cheá gaây beänh baèng caùch vi khuaån baùm vaøo beà maët maøng nhaày ruoät non vaø tieát ra ñoäc toá ruoät, laøm gia taêng tình traïng tieát dòch. Nhoùm ETEC gaây tieâu chaûy thoâng qua söï tieát ñoäc toá ñöôøng ruoät LT vaø ST. E. coli nhoùm naøy coù theå chæ tieát ñoäc toá LT, hoaëc chæ tieát ST, hoaëc coù theå tieát caû LT vaø ST. (1) Ñoäc toá khoâng chòu nhieät (Heat-labile toxin - LT): Ñoäc toá LT cuûa E. coli laø oligopeptide coù lieân heä gaàn guõi veà maët caáu truùc vaø chöùc naêng vôùi ñoäc toá taû (cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tieát ra. LT vaø CT gioáng nhau nhieàu ñaëc tính nhö caáu truùc, trình töï acid amin (gioáng nhau khoaûng 80%), töông ñoàng veà receptor, hoaït tính enzym, vaø taùc ñoäng cuûa noù treân thuù hay nuoâi caáy teá baøo. LT coù Download» Agriviet.com 12 2 serogroup chính laø LT-I vaø LT-II. LT-I vaø LT-II khoâng coù phaûn öùng cheùo veà maët mieãn dòch. LT-I ñöôïc tieát bôûi nhöõng doøng E. coli gaây beänh treân ngöôøi vaø thuù. Coøn LT- II ñöôïc tìm thaáy chuû yeáu ôû E. coli treân thuù vaø hieám khi ôû ngöôøi. Veà maët khaùi nieäm, tröø khi ñi keøm vôùi chöõ soá la maõ thì teân goïi LT duøng ñeå chæ LT-I (Nataro vaø Kaper, 1998). - LT-I: LT-I laø moät oligopeptide khoaûng 86 kDa, ñöôïc caáu taïo bôûi 1 tieåu ñôn vò A 28 kDa vaø 5 tieåu ñôn vò B 11,5 kDa. Tieåu ñôn vò A chòu traùch nhieäm trong hoaït tính enzym cuûa ñoäc toá goàm peptide A1 vaø peptide A2 lieân keát nhau bôûi caàu noái disulfur. Nhöõng tieåu ñôn vò B saép xeáp thaønh voøng nhaãn, lieân keát chaéc chaén vôùi ganglioside GM1 vaø lieân keát loûng leûo vôùi GD1b vaø vaøi glycoprotein ruoät – chuùng laø caùc receptor cuûa LT. Hai loaïi LT-I coù lieân heä gaàn nhau vaø coù theå phaûn öùng cheùo moät phaàn vôùi nhau laø LTp (LTp-I) ñaàu tieân ñöôïc phaân laäp töø heo vaø LTh (LTh-I) ñöôïc phaân laäp töø ngöôøi. Gen maõ hoùa cho LT laø elt hay lt-I naèm treân plasmid maø plasmid naøy coù theå chöùa caû gen maõ hoùa ST vaø/hoaëc gen maõ hoùa nhöõng khaùng nguyeân cuûa yeáu toá ñònh vò (colonization factor antigen - CFA). Sau khi ñoäc toá ñi vaøo noäi baøo, chuùng di chuyeån trong teá baøo nhôø heä thoáng vaän chuyeån cuûa Golgi (Golgi vaän chuyeån). Ñích cuûa LT trong teá baøo laø enzym adenylate cyclase naèm ôû lôùp maøng ngoaøi cuûa teá baøo bieåu moâ ruoät. Peptide A1 coù hoaït tính ADP-ribosyltransferase chuyeån phaàn ADP-ribosyl töø NAD ñeán cuûa protein lieân keát GTP (GTP-binding protein) laø GS, gaây hoaït hoùa enzyme adenylate cyclase, laøm gia taêng AMP voøng (cAMP) trong teá baøo. Vì vaäy enzyme cAMP-dependent protein kinase (A kinase) ñöôïc hoïat hoùa daãn ñeán söï phosphoryl hoùa keânh chloride (Cl-) ôû maøng teá baøo bieåu moâ vöôït quaù möùc bình thöôøng. Keát quaû daây chuyeàn laø kích thích teá baøo beân döôùi tieát Cl- vaø ngaên caûn söï haáp thuï NaCl bôûi nhöõng teá baøo coù loâng nhung. Haøm löôïng ion trong loøng ruoät gia taêng Download» Agriviet.com 13 keùo theo söï di chuyeån thuï ñoäng cuûa nöôùc töø teá baøo vaøo loøng ruoät, gaây tieâu chaûy (Nataro vaø Kaper, 1998). Maëc duø söï kích thích cuûa Cl- do söï gia taêng löôïng cAMP trong teá baøo laø caùch giaûi thích coå ñieån veà cô cheá gaây tieâu chaûy cuûa LT vaø CT, ngaøy caøng coù nhieàu baèng chöùng cho thaáy raèng ñaùp öùng taêng tieát ñoái vôùi nhöõng ñoäc toá naøy coù cô cheá phöùc taïp hôn. Moät cô cheá taùc ñoäng khaùc cuûa ñoäc toá coù lieân quan ñeán nhöõng prostaglandin E (PGE1 vaø PGE2) vaø yeáu toá hoaït hoùa tieåu caàu. Söï toång hôïp vaø phoùng thích nhöõng chaát chuyeån hoùa cuûa acid arachidonic nhö prostaglandin vaø leukotriene coù theå kích thích söï vaän chuyeån caùc chaát ñieän giaûi vaø kích thích nhu ñoäng ruoät. Cô cheá taùc ñoäng khaùc thöù hai coù lieân quan ñeán heä thaàn kinh ruoät (enteric nervous system – ENS) ñieàu hoøa nhu ñoäng vaø söï tieát ion ôû ruoät. Cô cheá thöù ba laø CT vaø LT gaây ñaùp öùng vieâm ruoät daïng nheï. - LT-II: Nhoùm LT-II gioáng vôùi LT-I vaø CT khoaûng 55 - 57% ôû tieåu ñôn vò A, nhöng khoâng gioáng vôùi LT-I vaø CT ôû tieåu ñôn vò B. LT-II laøm gia taêng cAMP trong teá baøo qua cô cheá töông töï nhö LT-I, nhöng LT-II söû duïng GD1 laøm receptor thay vì GM1. Nhö ñaõ noùi ôû treân, LT-II khoâng coù lieân quan ñeán beänh treân ngöôøi vaø thuù. (2) Ñoäc toá chòu nhieät (Heat-stable toxin - ST): Ngöôïc vôùi LT, ST coù troïng löôïng phaân töû nhoû vaø nhöõng caàu noái disulfur cuûa noù giaûi thích cho khaû naêng chòu nhieät cuûa ñoäc toá naøy. ST ñöôïc chia thaønh 2 nhoùm laø STa vaø STb, khaùc nhau veà caáu truùc vaø cô cheá hoaït ñoäng. Gen maõ hoùa cho caû 2 nhoùm ñöôïc tìm thaáy chuû yeáu treân plasmid vaø vaøi gen maõ hoùa ST cuõng ñöôïc tìm thaáy treân transposon. STa (hay coøn goïi laø ST-I) ñöôïc taïo bôûi ETEC vaø moät vaøi vi khuaån Gram aâm khaùc goàm Yersinia enterocolitica vaø V. cholerae khoâng phaûi O1. ST gioáng 50% trình töï acid amin vôùi ñoäc toá chòu nhieät EAST1 cuûa EAEC. Gaàn ñaây, coøn coù baùo caùo cho raèng moät vaøi doøng cuûa ETEC cuõng coù theå saûn sinh ñoäc toá EAST1 ngoaøi ñoäc toá STa. Coøn STb chæ ñöôïc tìm thaáy ôû ETEC. Download» Agriviet.com 14 - STa: STa laø moät peptide goàm 18 -19 amino acid vôùi troïng löôïng phaân töû khoaûng 2 kDa. STa ñöôïc chia thaønh 2 loaïi laø STp (ST porcine hay STIa) phaân laäp ñöôïc ñaàu tieân treân heo vaø STh (ST human hay STIb) phaân laäp treân ngöôøi. Caû 2 loaïi ñoäc toá coù theå ñöôïc tìm thaáy ôû doøng ETEC ngöôøi. Receptor chính cuûa STa laø enzyme xuyeân maøng guanylate cyclase C (GC- C) thuoäc hoï nhöõng enzyme receptor cyclase. Söï keát hôïp cuûa STa vaøo GC-C kích thích hoaït tính GC, daãn ñeán vieäc gia taêng löôïng cGMP noäi baøo. Hoaït ñoäng naøy cuoái cuøng daãn ñeán söï kích thích tieát Cl- vaø/hoaëc ngaên caûn söï haáp thuï NaCl, gaây ra söï tieát chaát loûng trong ruoät. - STb: STb chuû yeáu coù lieân quan ñeán doøng ETEC phaân laäp töø heo maëc duø cuõng coù baùo caùo veà vaøi chuûng ETEC ngöôøi cuõng saûn sinh STb. Khoâng nhö STa, STb gaây ra nhöõng toån thöông veà maët moâ hoïc treân lôùp bieåu moâ ruoät nhö maát teá baøo nhung mao cuûa bieåu moâ ruoät vaø teo nhung mao moät phaàn. Receptor cuûa STb chöa ñöôïc bieát roõ maëc duø gaàn ñaây ngöôøi ta cho raèng ñoäc toá coù theå keát hôïp khoâng ñaëc hieäu vôùi maøng teá baøo chaát tröôùc khi vaøo trong teá baøo. Khoâng taïo ra söï tieát Cl- nhö STa, STb kích thích teá baøo ruoät tieát bicarbonat (HCO3-). STb khoâng laøm taêng cAMP hay cGMP noäi baøo maëc duø noù kích thích taêng löôïng calci noäi baøo töø ngoaïi baøo. STb cuõng kích thích phoùng thích PGE2 vaø serotonin, töø ñoù ngöôøi ta cho raèng ENS coù theå cuõng coù lieân quan ñeán ñaùp öùng tieát gaây ra bôûi ñoäc toá naøy (Hitotsubashi, 1992). ™ Yeáu toá ñònh vò (colonization factor – CF): Cô cheá maø ETEC keát dính vaø cö truù treân lôùp maøng nhaày ruoät ñaõ ñöôïc nghieân cöùu kyõ. Ñeå gaây tieâu chaûy, ETEC ñaàu tieân phaûi keát dính vaøo teá baøo ruoät non nhôø vaøo loâng treân beà maët cuûa vi khuaån, goïi laø yeáu toá ñònh vò (CF). CFA coù theå ñöôïc phaân loaïi döïa treân ñaëc tính hình thaùi. Coù 3 loaïi chính goàm loaïi loâng hình que cöùng, loâng hình que meàm coù daïng boù, loâng coù caáu truùc maûnh meàm. Gen cuûa CFA thöôøng ñöôïc maõ hoùa treân plasmid, cuõng laø nôi maõ hoùa Download» Agriviet.com 15 cho ñoäc toá ST vaø/hoaëc LT. Tieåu ñôn vò caáu truùc loâng thöôøng taïo mieãn dòch vöôït troäi vaø do ñoù tieåu ñôn vò coù tính khaùng nguyeân maïnh nhaát. 2.1.7.2 Dòch teã Doøng ETEC lieân quan ñeán 2 hoäi chöùng laâm saøng chính: tieâu chaûy treân treû em thoâi buù ôû nhöõng nöôùc ñang phaùt trieån vaø tieâu chaûy ôû du khaùch. Dòch teã cuûa beänh do ETEC ñöôïc quyeát ñònh bôûi nhieàu yeáu toá: (1) mieãn dòch taïi maøng nhaày ñoái vôùi söï nhieãm ETEC khaùc nhau ôû töøng caù theå, (2) nhöõng ngöôøi nhieãm khoâng coù bieåu hieän trieäu chöùng vaãn baøi thaûi moät löôïng lôùn vi khuaån qua phaân, vaø (3) vieäc nhieãm chæ ñaït ñöôïc khi lieàu gaây nhieãm khaù cao. Ba ñaëc tính naøy taïo neân tình traïng oâ nhieãm ETEC trong moâi tröôøng ôû nhöõng vuøng coù dòch vaø haàu heát treû em trong vuøng naøy seõ ñöông ñaàu vôùi ETEC ôû thôøi kyø thoâi buù. Treû em ñaõ ôû tuoåi ñeán tröôøng vaø ngöôøi lôùn coù nguy cô tieâu chaûy do ETEC raát thaáp. Doøng ETEC saûn sinh ST laø nguyeân nhaân cuûa haàu heát caùc tröôøng hôïp dòch beänh. Caùc nghieân cöùu dòch teã hoïc cho thaáy raèng thöùc aên vaø nöôùc bò oâ nhieãm laø nhöõng phöông tieän chuû yeáu gaây nhieãm ETEC (Black, 1981). Söï nhieãm ETEC ôû nhöõng vuøng dòch thöôøng taäp trung chuû yeáu vaøo nhöõng thaùng aám vaø aåm, khi ñoù thì söï nhaân leân cuûa ETEC trong thöïc phaåm vaø nöôùc laø lyù töôûng nhaát. Maëc duø söï nhieãm ETEC xaûy ra chuû yeáu treân treû em, nhöng nhöõng ngöôøi tröôûng thaønh chöa coù mieãn dòch cuõng coù theå nhieãm. Thöïc vaäy ETEC laø nguyeân nhaân chính gaây tieâu chaûy treân du khaùch tröôûng thaønh töø nhöõng nöôùc ñaõ phaùt trieån ñeán thaêm nhöõng vuøng nhieãm dòch ETEC. Nhieàu nghieân cöùu cho raèng 20 - 60% soá du khaùch naøy coù trieäu chöùng tieâu chaûy vaø 20 - 40% caùc tröôøng hôïp laø do ETEC. Vieäc tieâu chaûy treân du khaùch thöôøng xaûy ra ôû nhöõng du khaùch laàn ñaàu tieân ñeán thaêm nhöõng nöôùc ñang phaùt trieån. Tieâu chaûy treân du khaùch thöôøng laø do thöùc aên vaø nöôùc uoáng bò oâ nhieãm. Download» Agriviet.com 16 2.1.7.3 Khía caïnh laâm saøng Trieäu chöùng beänh thöôøng xaûy ra ñoät ngoät vôùi thôøi gian nung beänh ngaén (14 – 50 giôø). Beänh nhaân tieâu chaûy nhö nöôùc, thöôøng khoâng coù maùu; moät vaøi beänh nhaân coù hieän töôïng soát vaø oùi möõa. Tieâu chaûy do ETEC coù theå nheï, ngaén vaø töï bôùt daàn nhöng cuõng coù theå gaây ra tieâu chaûy xoå nghieâm troïng gioáng nhö nhieãm Vibrio cholerae. Haàu heát caùc tröôøng hôïp nhieãm ETEC nguy hieåm ñeán tính maïng xaûy ra treân treû em thoâi buù ôû nhöõng nöôùc ñang phaùt trieån. Maëc duø vieäc söû duïng khaùng sinh nhaïy caûm cuõng laøm giaûm thôøi gian vaø möùc ñoä tieâu chaûy, nhöng nhöõng thuoác trò coù hieäu quaû thì khoâng saün coù ôû nhöõng vuøng nguy cô cao; ngoaøi ra söï ñeà khaùng khaùng sinh cuûa doøng ETEC cuõng laø vaán ñeà ñaùng quan taâm. Do ñoù caàn phaûi löu yù raèng cô sôû cuûa vieäc chaêm soùc beänh nhaân nhieãm ETEC laø duy trì ñuû löôïng nöôùc trong cô theå neáu coù trieäu chöùng tieâu chaûy. 2.1.8 Enteroaggregative E. coli (EAEC hay EAggEC) EAEC hay EaggEC laø nhoùm E. coli khoâng sinh enterotoxin vaø baùm dính vaøo teá baøo Hep-2 theo kieåu baùm dính keát taäp (aggregative adhesion – A/A). Nhoùm EAEC goàm caû doøng E. coli gaây beänh vaø khoâng gaây beänh. Taát caû caùc EAEC ñeàu coù plasmid 60 MDa chöùa gen taïo toån thöông daïng A/A vaø gen maõ hoùa cho ñoäc toá ruoät chòu nhieät EAST1 (EAEC heat-stable enterotoxin 1). Vai troø cuûa EAST1 trong tieâu chaûy chöa roõ raøng, nhöng gen maõ hoùa A/A treân plasmid laø caàn thieát cho quaù trình gaây beänh (Baudry 1990). Ngoaøi ra EAEC coøn coù nhöõng yeáu toá ñoäc löïc khaùc nhö haemolysin, caùc ñoäc toá vaø caùc yeáu toá coù lieân quan ñeán quaù trình baùm dính nhö loâng vaø nhöõng protein maøng ngoaøi. EAEC gaây tieâu chaûy keùo daøi (treân 14 ngaøy). Trong haàu heát caùc baùo caùo ñeàu moâ taû EAEC ôû caùc ca tieâu chaûy leû teû, nhöng EAEC cuõng coù theå laø taùc nhaân gaây thaønh oå dòch (daãn lieäu Keskimaki, 2001). Download» Agriviet.com 17 2.1.9 Enteroinvasive E. coli (EIEC) Nhöõng E. coli doøng EIEC thöôøng khoâng ñieån hình veà caùc ñaëc tính sinh hoùa vaø khoù xaùc ñònh. EIEC raát gioáng vôùi Shigella veà maët khaùng nguyeân, sinh hoùa vaø ñaëc tính gaây beänh. Trieäu chöùng laâm saøng cuûa beänh bao goàm soát, ñau buïng quaën, khoù chòu, nhieãm truøng maùu vaø tieâu chaûy nhö nöôùc hay beänh lî ñieån hình vôùi maùu, dòch nhaày vaø nhieàu baïch caàu trong phaân. Caû Shigella spp vaø EIEC ñeàu coù khaû naêng xaâm nhaäp vaøo teá baøo bieåu moâ keát traøng vaø chuùng ñeàu tieát moät hay nhieàu ñoäc toá ruoät lieân quan ñeán tieâu chaûy (Nataro vaø Kaper, 1998). EIEC cuõng coù theå gaây tieâu chaûy ôû khaùch du lòch vaø lieân quan ñeán nhöõng vuï ngoä ñoäc thöïc phaåm do aên phaûi thöùc aên bò oâ nhieãm. Toùm laïi, moät soá gen ñoäc löïc quan troïng cuûa nhöõng nhoùm E. coli goàm: STT Gen ñoäc löïc Nhoùm E. coli 1 eae EPEC, STEC 2 hly STEC 3 stx1 STEC 4 stx2 STEC 5 stx2e STEC 6 sta ETEC 7 stb ETEC 8 lt-I ETEC Vieäc phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli thöôøng ñöôïc thöïc hieän döïa treân nhöõng kyõ thuaät sinh hoïc phaân töû, ñaëc bieät laø kyõ thuaät PCR. 2.2 Kyõ thuaät PCR 2.2.1 Nguyeân taéc PCR (polymerase chain reaction – phaûn öùng toång hôïp daây chuyeàn nhôø polymerase) do Karl Mullis vaø coäng söï phaùt minh naêm 1985. Ñaây laø kyõ thuaät in vitro cho pheùp nhaân nhanh moät gen mong muoán leân haøng trieäu laàn trong thôøi gian ngaén (taïo doøng in vitro, khoâng caàn hieän dieän cuûa teá baøo). Download» Agriviet.com 18 Taát caû caùc DNA polymerase khi hoaït ñoäng toång hôïp moät maïch DNA môùi töø maïch khuoân ñeàu caàn söï hieän dieän cuûa nhöõng moài chuyeân bieät. Moài laø nhöõng ñoaïn DNA ngaén, coù khaû naêng baét caëp boå sung vôùi moät ñaàu cuûa maïch khuoân, vaø DNA polymerase seõ noái daøi moài ñeå hình thaønh maïch môùi. Caùc moài naøy goàm coù moài “xuoâi” (forward primer: moài taùc ñoäng leân sôïi 3’→ 5’) vaø moài “ngöôïc” (reverse primer: moài taùc ñoäng leân sôïi 5’→ 3’). 2.2.2 Caùc giai ñoaïn cuûa phaûn öùng PCR Phaûn öùng PCR laø moät chuoãi nhieàu chu kyø noái tieáp nhau. Moãi chu kyø goàm 3 böôùc: Böôùc 1 (giai ñoaïn bieán tính - denaturation): hai maïch cuûa phaân töû DNA taùch rôøi nhau thaønh hai maïch ñôn. Phaân töû DNA ñöôïc bieán tính ôû nhieät ñoä cao hôn nhieät ñoä noùng chaûy (Tm) cuûa phaân töû, thöôøng laø ôû 94 – 950 C trong voøng 30 giaây ñeán 1 phuùt. Böôùc 2 (giai ñoaïn uû baét caëp – anealing): Nhieät ñoä ñöôïc haï thaáp (thaáp hôn Tm cuûa caùc moài) cho pheùp caùc moài baét caëp vôùi khuoân, trong thöïc nghieäm nhieät ñoä naøy dao ñoäng trong khoaûng 40 – 600C tuyø thuoäc Tm cuûa caùc moài söû duïng vaø keùo daøi töø 30 giaây ñeán 1 phuùt. Böôùc 3 (giai ñoaïn keùo daøi – elongation hay extension): nhieät ñoä ôû giai ñoaïn naøy ñöôïc taêng leân 720C giuùp DNA polymerase hoaït ñoäng toång hôïp DNA toát nhaát vôùi söï hieän dieän cuûa 4 deoxyribonucleotide triphosphate. Ñoaïn DNA naèm giöõa hai moài ñöôïc toång hôïp taïo thaønh chuoãi DNA. Moãi chu kyø goàm 3 böôùc treân seõ ñöôïc laëp ñi laëp laïi nhieàu laàn vaø moãi laàn laïi laøm taêng gaáp ñoâi löôïng DNA maãu cuûa laàn tröôùc. Toång DNA khueách ñaïi ñöôïc tính theo coâng thöùc: Toång DNA khuyeách ñaïi = m * 2n Vôùi n laø soá chu kyø, m laø soá baûn sao cuûa chuoãi maõ hoùa. Download» Agriviet.com 19 * Soá chu kyø cuûa phaûn öùng PCR Trong thöïc teá, khoâng vöôït quaù 40 chu kyø trong moät phaûn öùng, vì phaûn öùng PCR dieãn ra qua hai giai ñoaïn: Giai ñoaïn ñaàu, soá löôïng baûn sao taêng theo caáp soá nhaân, tyû leä vôùi löôïng maãu ban ñaàu. Giai ñoaïn sau ñoù, hieäu quaû khueách ñaïi giaûm haún do: + Phaân huûy vaø caïn kieät caùc thaønh phaàn cuûa phaûn öùng. + Xuaát hieän caùc saûn phaåm phuï öùc cheá laïi phaûn öùng. + Caùc baûn sao vöøa toång hôïp khoâng keát hôïp vôùi moài maø laïi baét caëp vôùi nhau. Soá chu kyø cuûa phaûn öùng tuøy thuoäc soá löôïng maãu ban ñaàu. Soá baûn maãu 105 thì caàn khoaûng 25 – 30 chu kyø, soá baûn maãu 102 – 103 thì soá chu kyø phaûi laø 35 – 40. 2.2.3 Caùc thaønh phaàn cuûa moät phaûn öùng PCR - DNA maãu: laø thaønh phaàn caàn khueách ñaïi. - Moài (primer): Moài laø nhöõng ñoaïn oligonucleotide maïch ñôn, coù trình töï boå sung vôùi trình töï base cuûa hai ñaàu maïch khuoân ñeå khôûi ñaàu quaù trình toång hôïp DNA. Vieäc choïn moài laø giai ñoaïn quyeát ñònh cuûa phaûn öùng PCR. Caùc moài ñöôïc choïn phaûi ñaëc tröng cho trình töï DNA caàn khueách ñaïi, khoâng truøng vôùi caùc trình töï laëp laïi treân gen, khoâng coù söï baét caëp boå sung giöõa moài xuoâi vaø moài ngöôïc vaø cuõng khoâng coù nhöõng caáu truùc keïp toùc do söï baét caëp boå sung trong cuøng moät moài. Chieàu daøi caùc moài toái thieåu cho haàu heát caùc öùng duïng PCR laø 18 nucleotide (thöôøng laø 18 – 24 nucleotide). Trình töï naèm giöõa hai moài “xuoâi” vaø “ngöôïc” khoâng quaù lôùn, phaûn öùng PCR seõ toái öu treân nhöõng trình töï nhoû hôn 1Kb. - Taq polymerase: Taq polymerase laø moät DNA polymerase chòu nhieät, ñöôïc chieát taùch töø vi khuaån Thermus aquaticus ôû suoái nöôùc noùng. Taq DNA polymerase khoâng bò phaù huûy ôû nhieät ñoä cao vaø xuùc taùc söï toång hôïp töø ñaàu ñeán Download» Agriviet.com 20 cuoái quaù trình phaûn öùng döôùi söï hieän dieän cuûa Mg2+. Taq DNA polymerase toång hôïp DNA theo höôùng 5’ → 3’ vaø hoaït ñoäng toát nhaát ôû 70 - 720 C. - Caùc nucleotide (dNTP- deoxyribonucleotide triphosphate): Laø hoãn hôïp 4 loaïi: dATP, dTTP, dCTP, dGTP laøm nguyeân lieäu cho phaûn öùng toång hôïp DNA. - Dung dòch ñeäm: Thaønh phaàn dung dòch ñeäm coù theå thay ñoåi tuyø loaïi enzyme ñöôïc söû duïng, quan troïng nhaát laø ion Mg2+. Noù hình thaønh moät phöùp hôïp hoaø tan vôùi dNTP, raát caàn cho quaù trình lieân keát caùc dNTP, xuùc taùc cho emzyme polymerase, laøm taêng nhieät ñoä noùng chaûy (Tm) cuûa DNA maïch ñoâi. Noàng ñoä Mg2+ (thöôøng ñöôïc söû duïng ôû daïng MgCl2) laø moät yeáu toá aûnh höôûng maïnh ñeán hieäu quaû vaø tính ñaëc hieäu cuûa phaûn öùng PCR. Ngoaøi ra noàng ñoä MgCl2 coù theå aûnh höôûng ñeán quaù trình baét caëp cuûa moài, nhieät ñoä ñeå bieán tính DNA thaønh daây ñôn, hoaït ñoäng cuûa enzyme vaø söï trung thöïc cuûa keát quaû. Noàng ñoä Mg2+ phaûi ñöôïc xaùc ñònh cho töøng phaûn öùng qua nhieàu thöû nghieäm. Noàng ñoä MgCl2 trong hoån hôïp phaûn öùng cuoái cuøng thöôøng bieán thieân töø 0,5 – 5mM (Hoà Huyønh Thuøy Döông, 1998). Download» Agriviet.com 21 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ A B C AND KHUOÂN MAÃU Laëp laïi n voøng Hình 2.1 Nguyeân lyù cuûa phaûn öùng PCR A : Bieán tính – taùch rôøi 2 maïch cuûa phaân töû DNA B : UÛ baét caëp – caëp moài chuyeân bieät baét caëp vôùi khuoân C : Keùo daøi – DNA polymerase toång hôïp maïch môùi keå töø moài ñaõ baét caëp döôùi söï hieän dieän cuûa 4 loaïi dNTP vaø chaát ñeäm thích hôïp Thôøi gian (phuùt) Nhieät ñoä (0C) 40 50 60 70 90 100 80 1 2 3 4 5 6 Laëp laïi n laàn 1 chu kyø A B C 94 – 95 0C 40 – 60 0C 72 0C Hình 2.2 Chu kyø nhieät ñoä cuûa phaûn öùng PCR Download» Agriviet.com 22 2.2.4 Phaân tích keát quaû PCR Saûn phaåm cuûa phaûn öùng PCR (ñoaïn DNA ñöôïc khueách ñaïi) seõ ñöôïc phaùt hieän baèng phöông phaùp ñieän di. Nguyeân taéc cuûa phöông phaùp ñieän di laø döïa vaøo ñaëc tính caáu truùc cuûa caùc DNA. DNA laø caùc ñaïi phaân töû tích ñieän aâm ñoàng ñeàu treân khaép beà maët neân khi chòu taùc ñoäng cuûa moät ñieän tröôøng, chuùng seõ di chuyeån veà cöïc döông cuûa ñieän tröôøng. Söï di chuyeån cuûa phaân töû trong baûn gel döôùi taùc ñoäng cuûa moät ñieän tröôøng phuï thuoäc vaøo khoái löôïng phaân töû (töùc laø soá nucleotide) vaø noàng ñoä caùc chaát caáu thaønh gel, ñieän theá. Ñieän di ñöôïc thöïc hieän theo phöông naèm ngang hoaëc ñöùng. Caùc DNA trong gel agarose ñöôïc hieän hình döôùi tia töû ngoaïi (UV) nhôø ethidium bromide, chaát naøy coù khaû naêng gaén xen giöõa caùc base cuûa acid nucleic vaø phaùt huyønh quang döôùi taùc duïng cuûa tia UV (böôùc soùng λ = 300 nm) thaønh vaïch maøu ñoû da cam. Ñeå öôùc löôïng kích thöôùc DNA baèng gel agarose, ngöôøi ta söû duïng moät “yeáu toá ñaùnh daáu troïng löôïng phaân töû” (molecular weight marker – MWM) laø moät taäp hôïp nhieàu trình töï DNA coù kích thöôùc ñaõ bieát (DNA ladder). 2.3 Multiplex – PCR Multiplex - PCR laø moät caûi tieán cuûa kyõ thuaät PCR maø trong ñoù coù theå nhaân leân ñoàng thôøi nhieàu ñoaïn DNA mong muoán baèng caùch söû duøng ñoàng thôøi nhieàu caëp moài trong moät phaûn öùng. Multiplex - PCR ñaàu tieân ñöôïc moâ taû bôûi Chamberlain naêm 1988 vaø keå töø ñoù multiplex - PCR ñöôïc öùng duïng raát nhieàu trong caùc lónh vöïc kieåm tra DNA (Protocol online). Download» Agriviet.com 23 Chöông 3 NOÄI DUNG VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 3.1 Thôøi gian vaø ñòa ñieåm thöïc hieän ™ Thôøi gian Ñeà taøi ñöôïc thöïc hieän töø ngaøy 01/03/2004 ñeán ngaøy 30/11/2004. ™ Ñòa ñieåm - Maãu khaûo saùt ñöôïc laáy töø caùc chôï leû, loø moå, hoä - traïi chaên nuoâi ôû TP. Hoà Chí Minh vaø Long An. - Vieäc nuoâi caáy, phaân laäp vi khuaån ñöôïc thöïc hieän taïi Phoøng thöïc haønh Kieåm nghieäm thuù saûn vaø moâi tröôøng, Khoa Chaên nuoâi - Thuù y, Tröôøng Ñaïi hoïc Noâng Laâm Thaønh phoá Hoà Chí Minh. - Vieäc xaùc ñònh caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli ñöôïc thöïc hieän taïi Trung taâm Phaân tích thí nghieäm Hoùa sinh, Tröôøng Ñaïi hoïc Noâng Laâm Thaønh phoá Hoà Chí Minh. 3.2 Noäi dung - Phaân laäp vi khuaån E. coli trong phaân vaø thòt boø, heo baèng phöông phaùp ñònh löôïng. Töø ñoù ñaùnh giaù möùc ñoä veä sinh thöïc phaåm baèng caùch so saùnh vôùi tieâu chuaån Vieät Nam veà soá löôïng E. coli treân thòt töôi (TCVN 7046 - 2002). Söû duïng kyõ thuaät multiplex - PCR ñeå phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa vi khuaån E. coli phaân laäp ñöôïc baèng qui trình ñònh löôïng. - Phaân laäp ñònh tính vi khuaån E. coli trong phaân beâ tieâu chaûy, phaân heo con tieâu chaûy, thòt boø vaø thòt heo. Phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli ñaõ phaân laäp ñònh tính baèng kyõ thuaät multiplex - PCR. Download» Agriviet.com 24 3.3 Phöông phaùp nghieân cöùu 3.3.1 Phaân laäp vi khuaån E. coli ™ Ñoái töôïng laáy maãu - Thòt boø, heo ñöôïc laáy töø caùc chôï leû (duøng cho qui trình ñònh löôïng). - Beà maët quaøy thòt boø, thòt heo ñöôïc laáy trong loø moå (duøng cho qui trình phaân laäp ñònh tính). - Phaân beâ vaø phaân heo con tieâu chaûy ñöôïc laáy töø moät soá traïi vaø hoä chaên nuoâi. - Phaân boø vaø phaân heo bình thöôøng ñöôïc laáy töø moät soá traïi vaø hoä chaên nuoâi. ™ Caùch laáy vaø baûo quaûn maãu - Maãu thòt: Choïn ngaãu nhieân mieáng thòt ñeå laáy maãu. Khoái löôïng maãu laø 50 g thòt. - Maãu beà maët quaøy thòt: Choïn ngaãu nhieân quaøy thòt ôû giöõa ca gieát moå. Duøng gaïc voâ truøng lau beà maët quaøy thòt vôùi toång dieän tích khoaûng 200 cm2. - Maãu phaân bình thöôøng: Duøng muoãng muùc khoaûng 25 g ôû phaàn giöõa cuïc phaân gia suùc môùi thaûi. - Maãu phaân tieâu chaûy: Phaân ñöôïc laáy töø tröïc traøng baèng taêm boâng (± 0,1 g) roài cho vaøo moâi tröôøng vaän chuyeån Carry Blair. Taát caû caùc loaïi maãu sau khi laáy ñeàu ñöôïc ñöïng trong duïng cuï voâ truøng vaø giöõ laïnh ôû 4 – 80C cho ñeán khi tieán haønh xeùt nghieäm (maãu ñöôïc giöõ toái ña 24 giôø). ™ Soá löôïng maãu Soá löôïng maãu khaûo saùt ñöôïc tính laø soá maãu ñaõ phaân laäp ñöôïc vi khuaån E. coli töø caùc maãu ñaõ laáy. Download» Agriviet.com 25 Soá löôïng maãu khaûo saùt STT Ñoái töôïng maãu Phaân laäp ñònh tính Phaân laäp qua ñònh löôïng 1 Thòt heo 49 23 2 Thòt boø 34 8 Bình thöôøng 25 10 3 Phaân heo Tieâu chaûy 22 - Bình thöôøng 21 10 4 Phaân boø Tieâu chaûy 10 - Toång coäng 161 51 ™ Qui trình phaân laäp vi khuaån E. coli - Töø maãu thòt vaø maãu phaân bình thöôøng, vi khuaån E. coli ñöôïc phaân laäp, ñònh löôïng theo qui trình FAO (1992). - Maãu phaân beâ vaø heo con tieâu chaûy ñöôïc caáy ria tröïc tieáp treân moâi tröôøng EMB hoaëc MAC, uû ôû 37oC trong 24 giôø. Khuaån laïc E. coli ñieån hình treân moâi tröôøng EMB seõ deïp, coù maøu tím aùnh kim vôùi taâm saäm maøu, vaø treân moâi tröôøng MAC coù maøu hoàng, troøn, loài. - Maãu beà maët quaøy thòt (200 cm2) ñöôïc laøm ñoàng ñeàu trong 180 ml pepton ñeäm phosphate vaø daäp maãu trong 60 giaây. Boå sung khaùng sinh cefixime vôùi noàng ñoä 0,0125 mg/l (FDA, 2002). UÛ ôû 37oC trong 24 giôø. Pha loaõng canh taêng sinh 10 laàn vôùi nöôùc sinh lyù voâ truøng. Huùt 100 μl canh taêng sinh ôû noàng ñoä 10-1 daøn ñeàu leân beà maët ñóa thaïch CT-SMAC. UÛ ôû 37oC trong 24 giôø. Vi khuaån E. coli O157:H7 ñieån hình thöôøng phaùt trieån treân moâi tröôøng CT-SMAC taïo khuaån laïc khoâng maøu hoaëc maøu xaùm vôùi taâm ñuïc. Download» Agriviet.com 26 Maãu (thòt, phaân bình thöôøng) Laøm ñoàng ñeàu maãu Pha loaõng LTB (350C / 24h) EC (44,50C / 24 - 48h) EMB (350C / 24h) Thöû IMVC (350C / 24h) Keát quaû toång soá E. coli MAC (370C / 24h) Choïn khuaån laïc Caáy NA (350C / 24h) LY TRÍCH DNA QUI TRÌNH ÑÒNH LÖÔÏNG QUI TRÌNH ÑÒNH TÍNH Maãu phaân Maãu thòt Peptone + Cefixime (370C / 24h) CT - SMAC (370C / 24h) Choïn khuaån laïc ñieån hình Choïn khuaån laïc ñieån hình Laøm ñoàng ñeàu maãu MULTIPLEX - PCR Sô ñoà 3.1 Qui trình phaân laäp vi khuaån E. coli Download» Agriviet.com 27 Ghi nhaän keát quaû toång soá vi khuaån E. coli coù trong 1 g phaân vaø 1 g thòt töôi. Ñoái vôùi maãu thòt, so saùnh keát quaû toång soá vi khuaån E. coli vôùi chæ tieâu cuûa tieâu chuaån thòt töôi (TCVN 7046 - 2002) do Boä Khoa hoïc vaø Coâng ngheä ban haønh theo quyeát ñònh soá 22/2002/QÑ-BKHCN. TCVN qui ñònh saûn phaåm thòt töôi ñaït TCVN coù soá löôïng E. coli khoâng quaù 100 vi khuaån / gam. 3.3.2 Ly trích DNA töø vi khuaån E. coli phaân laäp ñöôïc Theo Cebula vaø ctv (1995), keát hôïp vôùi phöông phaùp ly trích DNA töø E. coli cuûa Cerna (2003) vaø Botteldoorn (2003), chuùng toâi tieán haønh ly trích DNA töø vi khuaån E. coli phaân laäp ñöôïc baèng phöông phaùp nhieät nhö sau: - Choïn khoaûng 20 khuaån laïc E. coli treân moâi tröôøng thaïch cho vaøo eppendorf ñöïng saün 1 ml nöôùc caát 2 laàn voâ truøng. - Ñun soâi trong 10 phuùt. - Chuyeån ngay vaøo tuû –70 oC, giöõ trong 10 phuùt. - Raõ ñoâng hoaøn toaøn. - Ly taâm vôùi toác ñoä 10.000 rpm trong 3 phuùt. - Thu phaàn noåi laøm DNA khuoân maãu. 3.3.3 Xaùc ñònh gen ñoäc löïc eae, hly, stx1, stx2, stx2e, sta, stb, lt-I cuûa E. coli phaân laäp ñöôïc töø thòt vaø phaân Vieäc phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli ñöôïc thöïc hieän baèng 2 phaûn öùng multiplex – PCR vôùi maùy luaân nhieät (thermal cycler): - Multiplex – PCR1: phaùt hieän caùc gen eaeA, hlyA, stx1, stx2. - Multiplex – PCR2: phaùt hieän caùc gen stx2e, sta, stb, lt-I Trong quaù trình thöïc hieän phaûn öùng multiplex – PCR, maãu ñoái chöùng döông (EDL933 hoaëc H44) ñöôïc thöïc hieän ñoàng thôøi vôùi nhöõng maãu khaûo saùt. + EDL933 laø ñoái chöùng döông vôùi caùc gen eaeA, hlyA, stx1, stx2. + H44 laø ñoái chöùng döông vôùi caùc gen stx2e, stb, lt-I. Download» Agriviet.com 28 Hai maãu ñoái chöùng döông naøy ñöôïc cung caáp töø Phoøng thí nghieäm Tröôøng Ñaïi hoïc Thuù y Toulouse (Phaùp). ™ Soá maãu xeùt nghieäm caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli Maãu E. coli phaân laäp ñöôïc Soá maãu thöïc hieän PCR Phöông phaùp phaân laäp Ñoái töôïng maãu Multiplex – PCR1 Multiplex – PCR2 Phaân boø 10 10 Phaân bình thöôøng Phaân heo 10 10 Thòt boø 8 8 ÑÒNH LÖÔÏNG Thòt Thòt heo 23 23 Phaân beâ 10 10 Phaân tieâu chaûy Phaân heo con 22 22 Phaân boø 21 21 Phaân bình thöôøng Phaân heo 25 25 Thòt boø 34 34 ÑÒNH TÍNH Thòt Thòt heo 49 49 TOÅNG COÄNG 212 212 ™ Multiplex – PCR1 * Trình töï caùc primer ñöôïc söû duïng trong multiplex – PCR1: Gen ñoäc löïc Primer Trình töï primer (5’ → 3’) Kích côõ ñoaïn DNA khueách ñaïi (bp) stx1 Stx1-F Stx1-R ATAAATCGCCATTCGTTGACTAC AGAACGCCCACTGAGATCATC 180 stx2 Stx2-F Stx2-R GGCACTGTCTGAAACTGCTCC TCGCCAGTTATCTGACATTCTG 255 eaeA EaeA-F EaeA-R GACCCGGCACAAGCATAAGC CCACCTGCAGCAACAAGAGG 384 hlyA HlyA-F HlyA-R GCATCATCAAGCGTACGTTCC AATGAGCCAAGCTGGTTAAGCT 534 (Daãn lieäu cuûa Paton vaø Paton, 1998) Download» Agriviet.com 29 * Caùc thaønh phaàn cuûa phaûn öùng multiplex – PCR: STT Thaønh phaàn Noàng ñoä 1 PCR Buffer 1 X 2 MgCl2 2 mM 3 dNTPs 200 μM 4 Moài Stx1-F 250 nM Stx1-R 250 nM Stx2-F 250 nM Stx2-R 250 nM EaeA-F 250 nM EaeA-R 250 nM HlyA-F 250 nM HlyA-R 250 nM 5 Taq - polymerase 0,5 UI 6 DNA khuoân maãu 1 μl 7 Nöôùc caát 2 laàn Vöøa ñuû 50 μl * Chu trình nhieät trong phaûn öùng multiplex – PCR1 (Paton vaø Paton, 1998): Böôùc 1 Böôùc 3 95 oC / 1 phuùt 95 oC / 1 phuùt 65 oC / 2 phuùt 63 oC / 2 phuùt 72 oC / 1,5 phuùt 72 oC / 1,5 phuùt Böôùc 2 Böôùc 4 95 oC / 1 phuùt 95 oC / 1 phuùt 64 oC / 2 phuùt 62 oC / 2 phuùt 72 oC / 1,5 phuùt 72 oC / 1,5 phuùt 10 chu kyø 1 chu kyø 1 chu kyø 1 chu kyø Download» Agriviet.com 30 Böôùc 5 Böôùc 7 95 oC / 1 phuùt 95 oC / 1 phuùt 61 oC / 2 phuùt 60 oC / 2 phuùt 72 oC / 1,5 phuùt 72 oC / 2,5 phuùt Böôùc 6 95 oC / 1 phuùt 60 oC / 2 phuùt 72 oC / 1,5 phuùt ™ Multiplex – PCR2 * Trình töï caùc primer ñöôïc söû duïng trong multiplex – PCR2: Gen ñoäc löïc Primer Trình töï primer (5’ → 3’) Kích côõ ñoaïn DNA khueách ñaïi (bp) lt-I LT-F LT-R GGCGACAGATTATACCGTGC CCGAATTCTGTTATATATGTC 696 sta STa-F STa-R TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG CTTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC 147 stb STb-F STb-R ATCGCATTTCTTCTTGCATC GGGCGCCAAAGCATGCTCC 172 stx2e Stx2e-F Stx2e-R CCTTAACTAAAAGGAATATA CTGGTGGTGTATGATTAATA 230 (Daãn lieäu Blanco vaø ctv, 1997) 1 chu kyø 10 chu kyø 11 chu kyø Download» Agriviet.com 31 * Caùc thaønh phaàn cuûa phaûn öùng multiplex – PCR2: STT Thaønh phaàn Noàng ñoä 1 PCR Buffer 1 X 2 MgCl2 1,5 mM 3 dNTPs 200 μM 4 Moài Stx2e-F 225 ng Stx2e-R 225 ng STa-F 150 ng STa-R 150 ng STb-F 45 ng STb-R 45 ng LT-I-F 150 ng LT-I-R 150 ng 5 Taq - polymerase 0,5 UI 6 DNA khuoân maãu 3 μl 7 Nöôùc caát 2 laàn Vöøa ñuû 50 μl * Chu trình nhieät trong phaûn öùng multiplex – PCR2 (Nguyen Ngoc Hai, 2002): 94 oC / 5 phuùt 94 oC / 45 giaây 52 oC / 45 giaây 72 oC / 1 phuùt 72 oC / 10 phuùt 3.3.4 Ñieän di treân gel agarose vaø ñoïc keát quaû ñieän di Sau phaûn öùng multiplex - PCR, 10 μl saûn phaåm PCR + 2 μl loading dye ñöôïc ñieän di treân gel agarose 1,5% trong TBE. Thang ladder cuõng ñöôïc ñieän di ñoàng thôøi. Thôøi gian ñieän di laø 35 – 40 phuùt ôû 100 V vaø 250 mA. Gel ñieän di ñöôïc ngaâm trong 30 phuùt vôùi dung dòch ethidium bromide 1 mg/ml TBE. Sau ñoù röûa saïch baèng nöôùc vaø chuïp hình gel vôùi tia UV baèng 25 chu kyø Download» Agriviet.com 32 maùy chuïp gel (phaàn meàm Quality One 2000, Bio-Rad). Caùc baêng DNA ñöôïc xaùc ñònh baèng caùch so vôùi caùc baêng cuûa ñoái chöùng döông vaø thang ladder 100 bp (AB gene, UK). Hình 3.1 Keát quaû ñieän di saûn phaåm PCR1 EDL933: ñoái chöùng döông (stx1, stx2, eae, hly); 1, 2, 4, 5, 6 laø caùc maãu xeùt nghieäm. Hình 3.2 Keát quaû ñieän di saûn phaåm PCR2 H44: ñoái chöùng döông (lt-I, stb, stx2e); Lad:thang chuaån; 1, 4, 5, 6 laø caùc maãu xeùt nghieäm 1 2 EDL 4 5 6 993 534 bp (hly) 255 bp (stx2) 384 bp (eae) 180 bp (stx1) 1 H44 Lad 4 5 6 500 bp 230 bp (stx2e) 696 bp (lt-I) 172 bp (stb) Download» Agriviet.com 33 Chöông 4 KEÁT QUAÛ – THAÛO LUAÄN 4.1 Toång soá vi khuaån E. coli vaø keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli phaân laäp ñöôïc töø phaân vaø thòt boø, heo baèng qui trình ñònh löôïng Xaùc ñònh toång soá vi khuaån E. coli cuûa 10 maãu phaân boø bình thöôøng, 10 maãu phaân heo bình thöôøng, 8 maãu thòt boø vaø 23 maãu thòt heo theo qui trình ñònh löôïng, keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 4.1. Baûng 4.1 Toång soá vi khuaån E. coli trong phaân vaø thòt boø, heo Ñoái töôïng maãu Soá maãu Toång soá E. coli (X ± SE) (MPN/g) Keát quaû phaùt hieän gen ñoäc löïc Phaân boø 10 9,5*106 ± 7,4*106 Khoâng phaùt hieän PHAÂN Phaân heo 10 102*106 ± 46,3*106 Khoâng phaùt hieän Thòt boø 8 14,8*104 ± 4,2*104 Khoâng phaùt hieän THÒT Thòt heo 23 0,4*104 ± 1,1*104 Khoâng phaùt hieän E. coli laø vi khuaån thuoäc nhoùm coliforms soáng thöôøng tröïc vaø chieám öu theá trong ñöôøng ruoät cuûa ngöôøi vaø gia suùc, theo phaân phaùt taùn vaøo moâi tröôøng beân ngoaøi. Soá löôïng E. coli trong phaân bieán thieân giöõa caùc loaøi. Ngoaøi ra soá löôïng E. coli coøn phuï thuoäc vaøo löùa tuoåi, tình traïng tieâu chaûy, caùch chaêm soùc quaûn lyù, tình traïng sinh lyù cuûa caù theå… Keát quaû xaùc ñònh toång soá E. coli trong phaân boø vaø phaân heo trong 20 maãu phaân cuûa khaûo saùt naøy cho thaáy toång soá vi khuaån E. coli trong phaân boø töông ñoái thaáp hôn Download» Agriviet.com 34 trong phaân heo. Paton vaø Paton (1998) khaúng ñònh E. coli trong phaân chính laø nguoàn vaáy nhieãm quan troïng xaâm nhaäp vaøo saûn phaåm thòt trong quaù trình gieát moå, cheá bieán thòt; vaø theo Keel vaø Parmelee (1968), E. coli ñöôïc xem laø chæ tieâu chaéc chaén ñeå ñaùnh giaù möùc ñoä vaáy nhieãâm phaân vaøo thòt (daãn lieäu Doyle vaø Padhye, 1989). Thaät vaäy, trong quaù trình gieát moå, E. coli töø phaân deã daøng vaáy nhieãm neàn saøn, duïng cuï gieát moå, nöôùc söû duïng, phöông tieän vaän chuyeån… Do ñoù neáu qui trình gieát moå gia suùc, vaän chuyeån vaø phaân phoái thòt khoâng tuaân thuû nghieâm ngaët caùc ñieàu kieän veä sinh thì nguy cô vaáy nhieãm E. coli töø phaân vaøo thòt caøng taêng. Chuùng toâi ñaõ tieán haønh ñònh löôïng toång soá vi khuaån E. coli theo qui trình ñònh löôïng cuûa FAO (1992) cho 8 maãu thòt boø vaø 23 maãu thòt heo thu thaäp töø caùc chôï leû (baûng 4.1). Keát quaû ñònh löôïng cho thaáy toång soá vi khuaån E. coli trung bình treân thòt boø laø 14,8*104 ± 4,2*104 MPN/g bieán thieân töø 1,1*104 ñeán 35*104 MPN/g. So saùnh vôùi tieâu chuaån TCVN 7046 – 2002 qui ñònh soá vi khuaån E. coli treân 1 gam thòt töôi khoâng quaù 100 vi khuaån thì trong toång soá 8 maãu khaûo saùt, khoâng coù maãu thòt boø naøo ñaït TCVN. Toång soá E. coli trung bình treân thòt heo laø 0,4*104 ± 1,1*104 MPN/g, bieán thieân töø 0,4*102 ñeán 4,5*104 MPN/g. Trong toång soá 23 maãu thòt heo khaûo saùt thì coù 6/23 maãu ñaït tieâu chuaån veä sinh veà chæ tieâu E. coli (chieám tæ leä 26,1%). Toång soá E. coli trung bình treân 1 gam thòt heo töông ñoái thaáp hôn treân thòt boø maëc duø soá löôïng E. coli trung bình treân 1 gam phaân heo cao hôn treân phaân boø. Ñieàu naøy coù theå laø do söï khaùc nhau trong caùch gieát moå, vaän chuyeån vaø baøy baùn. Boø ñöôïc gieát moå khoâ, hoaøn toaøn khoâng ñöôïc röûa nöôùc trong suoát quaù trình gieát moå. Thòt boø ñöôïc coâng nhaân gieát moå pha loïc taïi loø moå vaø vaän chuyeån ñeán chôï leû baèng caùc phöông tieän thoâ sô. Trong khi ñoù, trong quaù trình gieát moå heo, quaøy thòt heo ñöôïc röûa thöôøng xuyeân vaø nöûa Download» Agriviet.com 35 thaân thòt ñöôïc vaän chuyeån ñeán chôï leû roài môùi pha loïc, ngoaøi ra ngöôøi baùn thòt cuõng thöôøng caïo saïch beà maët thòt tröôùc khi pha loïc, do ñoù thòt heo haïn cheá ñöôïc söï vaáy nhieãm taïi loø moå, daãn ñeán soá löôïng E. coli treân thòt heo ít hôn treân thòt boø. Maëc duø soá löôïng E. coli trong caùc maãu phaân boø, heo laø raát cao, keå caû E. coli treân thòt boø, heo. Tuy nhieân vôùi 51 maãu E. coli phaân laäp ñöôïc töø phaân vaø thòt theo qui trình ñònh löôïng nhöng chuùng toâi ñeàu khoâng phaùt hieän ñöôïc gen ñoäc löïc baèng kyõ thuaät multiplex - PCR. Löu yù raèng trong qui trình ñònh löôïng, E. coli ñöôïc taêng sinh choïn loïc trong moâi tröôøng EC ôû 44,5oC trong 24 giôø. Nhieàu nghieân cöùu cho thaáy raèng ôû nhieät ñoä cao (≥ 44oC) nhöõng chuûng E. coli gaây beänh phaùt trieån yeáu daàn, coøn nhöõng chuûng E. coli coäng sinh (flora) phaùt trieån nhanh hôn. Ngoaøi ra Hill vaø Carlisle coøn ghi nhaän raèng neáu taêng sinh trong moâi tröôøng ôû 44,5oC coù theå laøm maát plasmide maõ hoùa nhöõng yeáu toá ñoäc löïc vaø laøm giaûm soá löôïng nhöõng doøng E. coli gaây beänh coù trong thöïc phaåm (theo daãn lieäu cuûa Doyle vaø Padhye, 1989) Cuõng theo daãn lieäu cuûa Doyle vaø Padhye (1989), nhaèm ñaùnh giaù khaû naêng phaùt hieän caùc E. coli gaây beänh coù trong thöïc phaåm theo qui trình cuûa FDA, moät nghieân cöùu khaùc cuûa Hill vaø caùc coäng taùc vieân nhaän thaáy raèng moãi loaïi thöïc phaåm baùn leû coù khoaûng 4,7 doøng E. coli khaùc nhau, nhöng sau quaù trình taêng sinh trong EC ôû 44,50C thì 30% chuûng E. coli khoâng theå phaùt hieän ñöôïc (khoâng sinh gas sau 48 giôø), nhöõng E. coli toàn taïi ñöôïc trong quaù trình taêng sinh coù khoaûng 20 – 95% E. coli taïo ñoäc toá LT bò maát plasmide. Nhö vaäy quaù trình taêng sinh theo qui trình cuûa FDA thì khoâng thích hôïp cho vieäc phaùt hieän coù hieäu quaû vaø ñaùng tin caäy ñoái vôùi nhöõng doøng E. coli gaây beänh coù trong thöïc phaåm. Thí nghieäm giaûm nhieät ñoä taêng sinh (< 44oC) trong quaù trình phaân laäp E. coli theo qui trình cuûa FDA laïi cho thaáy vieäc giaûm tính Download» Agriviet.com 36 choïn loïc cuûa moâi tröôøng do coù quaù nhieàu vi khuaån khaùc trong canh taêng sinh phaùt trieån laán aùt vi khuaån E. coli gaây beänh. Töø nhöõng lyù do treân, chuùng toâi cho raèng öu ñieåm cuûa phöông phaùp phaân laäp E. coli theo qui trình ñònh löôïng coù theå xaùc ñònh ñöôïc toång soá vi khuaån E. coli trong maãu khaûo saùt, nhöng E. coli phaân laäp ñöôïc hoaøn toaøn khoâng bao goàm nhöõng chuûng E. coli gaây beänh (do khoâng theå vöôït qua giai ñoaïn taêng sinh ôû nhieät ñoä 44,5oC), ñaëc bieät laø nhoùm EHEC vôùi thaønh vieân ñaëc tröng laø O157:H7 – taùc nhaân gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm ñöôïc quan taâm haøng ñaàu. Ñaây coù leõ laø lyù do aûnh höôûng ñeán keát quaû khoâng phaùt hieän ñöôïc caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli thu thaäp töø qui trình ñònh löôïng. Do vaäy toång soá vi khuaån E. coli xaùc ñònh ñöôïc baèng qui trình ñònh löôïng chæ phaûn aùnh möùc ñoä vaáy nhieãm E. coli vaøo thöïc phaåm nhöng khoâng thích hôïp cho vieäc phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc. 4.2 Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli phaân laäp ñöôïc töø phaân beâ tieâu chaûy vaø phaân heo con tieâu chaûy Nhaèm böôùc ñaàu thöû nghieäm qui trình phaân laäp ñònh tính vaø qui trình phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli, chuùng toâi choïn 2 ñoái töôïng coù khaû naêng phaùt hieän caùc doøng E. coli gaây beänh cao nhaát laø phaân beâ tieâu chaûy vaø phaân heo con tieâu chaûy ñeå khaûo saùt. ™ ÔÛ phaân beâ tieâu chaûy Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli phaân laäp ñöôïc töø 10 maãu phaân beâ tieâu chaûy ñöôïc trình baøy ôû baûng 4.2. Download» Agriviet.com 37 Baûng 4.2 Keát quaû phaùt hieän gen ñoäc löïc cuûa E. coli trong phaân beâ tieâu chaûy Gen ñoäc löïc Maãu eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1 1 - - + - - - - - 2 + - + - - - - - 3 - - - - - - - - 4 - - - - - - - - 5 + + + + - - - - 6 - + + - - - - - 7 - - - - - - 8 + + - + - - - - 9 - - - - - - + - 10 - - - - - - + - Coäng 3 3 4 2 0 0 2 0 Tyû leä (%) 30,0 30,0 40,0 20,0 0 0 20,0 0 Trong toång soá 10 maãu E. coli phaân laäp töø phaân beâ tieâu chaûy, coù 7/10 maãu (70%) phaùt hieän coù gen ñoäc löïc, bao goàm: - 5/10 maãu (50%)phaùt hieän ñöôïc gen stx (stx1 hoaëc/vaø stx2) - 3/10 maãu (30%) phaùt hieän ñöôïc gen eae - 3/10 maãu (30%) phaùt hieän ñöôïc gen hly - 2/10 maãu (20%) phaùt hieän ñöôïc gen stb Nhö vaäy vôùi 10 maãu E. coli töø phaân beâ tieâu chaûy, coù 7/10 maãu (70%) phaùt hieän ñöôïc ít nhaát 1 gen ñoäc löïc, coù maãu phaùt hieän ñöôïc 3 – 4 gen ñoäc Download» Agriviet.com 38 löïc. Gen stx ñöôïc phaùt hieän vôùi tæ leä cao nhaát (5/10 maãu – 50%). Smith (1988) vaø Gyles (1992) cho raèng nhieàu loaøi gia suùc mang STEC khoâng coù bieåu hieän trieäu chöùng, moät vaøi doøng STEC coù khaû naêng gaây tieâu chaûy cho boø, ñaëc bieät laø beâ. Trong 5 maãu E. coli cuûa phaân beâ tieâu chaûy mang gen stx, coù 3 maãu ñoàng thôøi mang gen eae vaø 3 maãu ñoàng thôøi mang gen hly. Theo Barrett (1992), ñoäc toá Stx laø ñieàu kieän caàn chöù chöa phaûi laø ñieàu kieän ñuû ñeå gaây beänh tieâu chaûy. Do ñoù söï xuaát hieän ñoàng thôøi caùc gen eae, hly vôùi caùc gen stx coù theå goùp phaàn giaûi thích lyù do tieâu chaûy treân beâ. ™ ÔÛ phaân heo con tieâu chaûy Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli töø 16 maãu phaân heo cai söõa tieâu chaûy vaø 6 maãu phaân heo con theo meï tieâu chaûy ñöôïc trình baøy ôû baûng 4.3. Keát quaû ôû baûng 4.3 cho ta thaáy raèng ôû nhoùm heo cai söõa tieâu chaûy coù 14/16 maãu (87,5%) mang gen ñoäc löïc, trong khi ñoù ôû nhoùm heo con theo meï tieâu chaûy coù 3/6 maãu (33,3%) mang gen ñoäc löïc. - Ñoái vôùi E. coli töø phaân heo cai söõa tieâu chaûy, coù 1/16 maãu (6,3%) mang gen hly, 2/16 maãu (12,5%) mang gen eae, 5/16 maãu (31,3%) mang gen stx2e vaø 8/16 maãu (50%) mang gen stx2. - Ñoái vôùi E. coli töø phaân heo con theo meï tieâu chaûy, coù 2/16 maãu (33,3%) vöøa hieän dieän gen stx2 vaø stx2e. - Khoâng phaùt hieän ñöôïc gen lt-I trong 22 maãu E. coli phaân laäp töø phaân heo cai söõa tieâu chaûy vaø phaân heo con theo meï tieâu chaûy. Botteldoorn vaø ctv (2003) cuõng khoâng phaùt hieän gen lt-I trong 24 maãu phaân heo khaûo saùt. - Gen sta chæ hieän dieän trong E. coli phaân laäp töø phaân heo cai söõa tieâu chaûy vôùi tyû leä 25% (4/16 maãu). Download» Agriviet.com 39 Baûng 4.3 Keát quaû phaùt hieän gen ñoäc löïc cuûa E. coli trong phaân heo con tieâu chaûy Gen ñoäc löïc Maãu eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1 1 − − − + + − + − 2 − − − + + − + − 3 − − − − − − − − 4 + + − + + − + − 5 − − − − − − − − 6 − − − + − − + − 7 + − − + − − + − 8 − − − + − + − − 9 − − − − + − + − 10 − − − − − − + − 11 − − − − + − + − 12 − − − − − − + − 13 − − − − − − + − 14 − − − + − + + − 15 − − − + − + + − 16 − − − − − + + − Ph aân h eo c ai sö õa tie âu ch aûy Coäng (%) 2 (12,5) 1 (6,3) 0 (0) 8 (50,0) 5 (31,3) 4 (25,0) 13 (81,25) 0 (0) 1 − − − − − − − − 2 − − − + + − + − 3 − − − + + − + − 4 − − − − − − − − 5 − − − − − − − − 6 − − − − − − + − Ph aân h eo c on th eo m eï tie âu ch aûy Coäng (%) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 2 (33,3) 2 (33,3) 0 (0) 3 (50,0) 0 (0) Coäng chung 2 1 0 10 7 4 16 0 Tyû leä chung (%) 9,1 4,5 0 45,5 31,8 18,2 72,7 0 Download» Agriviet.com 40 - Gen stb hieän dieän trong E. coli vôùi tyû leä cao nhaát ôû caû 2 nhoùm phaân heo cai söõa tieâu chaûy (81,25%) vaø phaân heo con theo meï tieâu chaûy (50%). Blanco (1997) nhaän thaáy raèng gen stb xuaát hieän vôùi taàn soá cao nhaát 78,4% (58/74 maãu) so vôùi caùc gen ñoäc löïc khaùc cuûa E. coli phaân laäp töø phaân heo con tieâu chaûy hoaëc phuø thuûng. OÂng keát luaän raèng ñoäc toá STb goùp phaàn ñaùng keå vaøo trieäu chöùng tieâu chaûy treân heo. Ñieàu naøy cuõng phuø hôïp vôùi keát quaû nghieân cöùu cuûa Handl (1992), Harel (1991) vaø Moon (1986). Toùm laïi, trong 22 maãu E. coli ñöôïc phaân laäp töø 22 maãu phaân heo con tieâu chaûy coù 17/22 maãu (77,2%) phaùt hieän gen ñoäc löïc, trong ñoù: - 16 maãu (72,7%) phaùt hieän ñöôïc gen stb, chieám tæ leä phaùt hieän cao nhaát. - 10 maãu (45,5%) phaùt hieän ñöôïc gen stx2. - 7 maãu (31,8%) phaùt hieän ñöôïc gen stx2e. - 4 maãu (18,2%) phaùt hieän ñöôïc gen sta - 2 maãu (9,1%) phaùt hieän ñöôïc gen eae - 1/22 maãu (4,5%) phaùt hieän ñöôïc gen hly. Nhö vaäy, ñoäc toá Stb vaø Stx2/Stx2e coù theå laø nguyeân nhaân gaây tieâu chaûy treân heo con, ñaëc bieät laø treân nhoùm heo cai söõa (81,3% maãu phaùt hieän ñöôïc gen stb, 50% phaùt hieän coù gen stx2 vaø 31,3% phaùt hieän coù gen stx2e). Coù 7/22 maãu (31,8%) E. coli töø phaân heo con tieâu chaûy mang gen stx2e. Tuy ñoäc toá Stx2e khoâng lieân quan ñeán beänh treân ngöôøi, nhöng noù chính laø nguyeân nhaân gaây phuø thuûng treân heo con. Kyõ thuaät PCR trôû thaønh phöông phaùp xeùt nghieäm nhanh vaø chính xaùc ñeå phaùt hieän nguyeân nhaân E. coli gaây phuø thuûng. Beänh tieâu chaûy vaø phuø thuûng treân heo con coù theå xaûy ra trong giai ñoaïn heo con theo meï laãn heo sau cai söõa (Bertschinger vaø Fairbrother, 1999). Download» Agriviet.com 41 Toång keát vieäc phaùt hieän gen ñoäc löïc cuûa E. coli töø nhoùm phaân beâ vaø heo con tieâu chaûy, chuùng toâi nhaän thaáy raèng: - Khaû naêng phaùt hieän ñöôïc gen ñoäc löïc cuûa E. coli töø nhöõng maãu phaân tieâu chaûy laø khaù cao (70% treân phaân beâ tieâu chaûy vaø 72,7% treân phaân heo con tieâu chaûy). Ñieàu naøy chöùng toû raèng treân caû 2 nhoùm ñoái töôïng naøy, E. coli mang caùc gen ñoäc löïc laø moät nguyeân nhaân quan troïng gaây tieâu chaûy. - Ñoäc toá chính gaây tieâu chaûy treân beâ laø Stx (Stx1 vaø/hoaëc Stx2 – 50%), coøn treân heo con laø caû ñoäc toá chòu nhieät Stb (59,1%), ñoäc toá Stx2 (45,5%) vaø nguy hieåm nhaát laø ñoäc toá Stx2e gaây phuø thuûng (31,8%). 4.3 Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli trong phaân boø vaø phaân heo bình thöôøng Nguoàn vaáy nhieãm E. coli vaøo thòt chuû yeáu laø phaân (ña soá laø phaân bình thöôøng) cuûa boø, heo tröôûng thaønh. Nhaèm xaùc ñònh caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli gaây beänh cho ngöôøi qua thòt töôi, chuùng toâi phaân laäp E. coli töø 21 maãu phaân boø bình thöôøng vaø 25 maãu phaân heo bình thöôøng theo phöông phaùp ñònh tính roài thu thaäp caùc khuaån laïc ñieån hình ñeå ly trích DNA. ™ ÔÛ phaân boø bình thöôøng Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa 21 maãu E. coli phaân laäp töø phaân boø bình thöôøng ñöôïc ghi nhaän ôû baûng 4.4. Trong 21 maãu E. coli töø phaân boø bình thöôøng ñöôïc khaûo saùt, 13 maãu (61,9%) phaùt hieän coù gen ñoäc löïc. Ñieàu naøy cho thaáy raèng boø bình thöôøng (khoâng coù bieåu hieän tieâu chaûy) cuõng laø ñoái töôïng mang gen ñoäc löïc cuûa E. coli. Ñaây chính laø nguoàn vaáy nhieãm cho thòt boø trong quaù trình gieát moå, vaän chuyeån, baøy baùn neáu khoâng tuaân thuû caùc ñieàu kieän veà veä sinh. Download» Agriviet.com 42 Baûng 4.4 Keát quaû phaùt hieän gen ñoäc löïc cuûa E. coli trong phaân boø bình thöôøng Gen ñoäc löïc Maãu eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1 1 − − − + − − − − 2 − − + − − − − − 3 − − − − − − − − 4 − − − − − − − − 5 − − − − − − − − 6 − − − − − − − − 7 − − − − − − − − 8 − − + + − − + − 9 − − − − − − − − 10 − − + − − − − − 11 − − + + − − + − 12 − + + + − − + − 13 − − + + − − − − 14 − − − − − + − − 15 − − − + − − − − 16 − − + + − − − − 17 − + − + − − − − 18 − + + + − − − − 19 + + − − − − − − 20 − − − − − − − − 21 − − − − − − − − Coäng 1 4 8 9 0 1 3 0 Tyû leä (%) 4,8 19,0 38,1 42,9 0 4,8 14,3 0 Download» Agriviet.com 43 Gen stx1 vaø stx2 ñöôïc phaùt hieän vôùi tæ leä cao nhaát (42,9% vaø 38,1%). Nhö vaäy roõ raøng phaân boø laø nguoàn löu cöûu STEC trong töï nhieân, ñuùng nhö Beutin (1995) ñaõ nhaän ñònh raèng nhöõng doøng E. coli saûn sinh ñoäc toá Stx thöôøng hieän dieän trong phaân cuûa nhöõng thuù nuoâi khoûe maïnh, vaø ñaëc bieät laø trong phaân cuûa loaøi nhai laïi (Beutin, 1993). Theo Levin (1987), STEC laø taùc nhaân gaây beänh cho ngöôøi. Vaø theo Renwick (1993), con ngöôøi trôû neân caûm nhieãm do aên phaûi thöùc aên bò nhieãm hoaëc tieáp xuùc tröïc tieáp vôùi STEC töø phaân ñoäng vaät. Ngöôøi nhieãm STEC coù theå tieâu chaûy hoaëc traàm troïng hôn thì vieâm keát traøng xuaát huyeát (HC) hoaëc hoäi chöùng huyeát nieäu (HUS) (Karmali, 1989). Vôùi 21 maãu E. coli trong phaân boø bình thöôøng, gen hly vaø gen stb coù tæ leä phaùt hieän laàn löôït laø 19% vaø 14,3%, gen eae vaø gen stb phaùt hieän ñöôïc vôùi tæ leä khaù thaáp (4,8%). Khoâng phaùt hieän ñöôïc gen stx2e vaø gen lt-I. Nhö vaäy, gen stx2e khoâng phaùt hieän ñöôïc ôû caû 2 nhoùm phaân beâ tieâu chaûy vaø phaân boø bình thöôøng. Ñieàu naøy phuø hôïp vôùi keát luaän cuûa Beutin (1995), Stx2e chæ hieän dieän treân nhoùm STEC cuûa heo. Theo Blanco (1997), Stx2e laø moät bieán chuûng cuûa Stx2, bieán chuûng naøy chæ ñöôïc phaùt hieän ôû nhöõng E. coli coù nguoàn goác töø heo. ™ ÔÛ phaân heo bình thöôøng Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa 25 maãu E. coli phaân laäp töø phaân heo bình thöôøng ñöôïc ghi nhaän ôû baûng 4.5. Download» Agriviet.com 44 Baûng 4.5 Keát quaû phaùt hieän gen ñoäc löïc cuûa E. coli trong phaân heo bình thöôøng Gen ñoäc löïc Maãu eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1 1 − − − − − − + − 2 − − − − − − − − 3 − − − − − − + − 4 − − − − − − − − 5 − − − − − − − − 6 − − − − − − + − 7 − − − − − − + − 8 − − − − − − − − 9 − − − − − − + − 10 − − − − − − − − 11 − − − − − − − − 12 − − − − − − − − 13 − − − − − − − − 14 − − − − − − − − 15 − − − − − − − − 16 − − − − − − − − 17 − − − − + − + − 18 − − − − − − − − 19 − − − − − − − − 20 − − − − + − + − 21 − − − − + − − − 22 + + − + + − − − 23 − − − − − − − − 24 + + − − − − − − 25 − − − − − − − − Coäng 2 2 0 1 4 0 7 0 Tyû leä (%) 8,0 8,0 0 4,0 16,0 0 28,0 0 Download» Agriviet.com 45 Trong 25 maãu E. coli phaân laäp töø phaân heo bình thöôøng, 10/25 maãu (40%) phaùt hieän coù gen ñoäc löïc; vaø cuõng nhö treân nhoùm phaân heo con tieâu chaûy, gen stb ñöôïc phaùt hieän vôùi tæ leä cao nhaát (28%), tæ leä phaùt hieän gen stx2 töông ñoái khoâng cao (16%). Toùm laïi, E. coli trong phaân boø heo bình thöôøng ñeàu mang nhöõng gen ñoäc löïc. Ñaëc bieät E. coli trong phaân boø bình thöôøng mang gen saûn sinh ñoäc toá Stx1, Stx2 gaây tieâu chaûy cho ngöôøi, trong tröôøng hôïp beänh naëng coù theå gaây HC vaø HUS. Ngoaøi ra, E. coli trong phaân heo bình thöôøng vaãn mang gen stx2e saûn sinh ñoäc toá vero gaây phuø thuûng cho heo con. Do ñoù veä sinh toát taïi caùc traïi chaên nuoâi heo laø bieän phaùp phoøng ngöøa tieâu chaûy phuø thuûng cho heo con. Veä sinh saïch seõ cho thuù moå thòt, veä sinh trong haï thòt vaø phaân phoái laø bieän phaùp haøng ñaàu ngaên ngöøa vaáy nhieãm E. coli töø phaân ñeán thòt nhaèm ñaûm baûo veä sinh an toaøn thöïc phaåm cho ngöôøi tieâu duøng. 4.4 Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân beà maët quaøy thòt boø, heo Vieäc phaùt hieän ñöôïc gen ñoäc löïc cuûa E. coli phaân laäp töø phaân boø, heo bình thöôøng ñeå laøm neàn taûng cho chuùng toâi tieán haønh ñieàu tra caùc gen naøy cuûa E. coli phaân laäp ñöôïc töø quaøy thòt boø, heo bôûi vì phaân boø, heo chính laø nguoàn gaây vaáy nhieãm cho thòt trong quaù trình gieát moå. Soá löôïng vi khuaån E. coli treân beà maët thòt khoâng nhieàu nhö trong phaân, ñaëc bieät laø nhöõng doøng E. coli gaây beänh thöôøng hieän dieän vôùi soá löôïng raát ít treân thòt, cho neân neáu chæ söû duïng phöông phaùp caáy ria tröïc tieáp treân thaïch MAC thì khaû naêng phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân thòt coù theå gaëp khoù khaên. Ñeå taêng khaû naêng phaùt hieän caùc E. coli mang gen ñoäc löïc, chuùng toâi söû duïng moâi tröôøng choïn loïc chuyeân bieät cuûa O157:H7 laø CT-SMAC ñeå taêng sinh nhoùm STEC. Vaø ñeå traùnh boû soùt nhöõng doøng E. coli non-O157, chuùng toâi choïn khoaûng 20 khuaån laïc goàm caû nhöõng khuaån laïc ñieån hình vaø khoâng ñieån hình treân thaïch Download» Agriviet.com 46 CT-SMAC. Vieäc ly trích vaø thöïc hieän phaûn öùng multiplex - PCR ñöôïc tieán haønh töông töï nhö ôû caùc nhoùm maãu khaùc. ™ Treân thòt boø Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa 34 maãu E. coli phaân laäp töø thòt boø ñöôïc ghi nhaän ôû baûng 4.6. Trong toång soá 34 maãu E. coli phaân laäp töø thòt boø, coù 21/34 maãu (61,8%) phaùt hieän coù mang gen ñoäc löïc, bao goàm: - 17/34 maãu (50,0%) phaùt hieän ñöôïc gen stx2 - 11/34 maãu (32,4%) phaùt hieän ñöôïc gen stx1. - 8/34 maãu (23,5%) phaùt hieän ñöôïc gen eae. - 9/34 maãu (26,5%) phaùt hieän ñöôïc gen hly. - 1/34 maãu (2,9%) phaùt hieän ñöôïc gen stb. Tæ leä phaùt hieän ñöôïc E. coli mang gen ñoäc löïc treân thòt boø khaù cao (21/34 maãu chieám tæ leä 61,8%) vaø trong ñoù coù 2 maãu (5,9%) mang ñoàng thôøi caû 4 gen ñoäc löïc cuûa nhoùm EHEC (stx1, stx2, eae, hly) vaø 5 maãu khaùc (14,7%) mang 3 gen ñoäc löïc stx2, eae, hly. Söï xuaát hieän ñoàng thôøi nhieàu gen ñoäc löïc cuûa EHEC trong moät maãu chính laø nguy cô tieàm aån gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm hoaëc nghieâm troïng hôn laø gaây HC vaø HUS cho ngöôøi neáu quaù trình cheá bieán khoâng coù coâng ñoaïn tieâu dieät vi khuaån naøy. Keát quaû cuûa chuùng toâi phuø hôïp vôùi keát quaû cuûa Sadu vaø ctv (1999) khaûo saùt 25 maãu thòt boø ôû Malaysia, taùc giaû ñaõ phaùt hieän 9 maãu thòt boø nhieãm E. coli O157:H7 (chieám tæ leä 36,0%). Download» Agriviet.com 47 Baûng 4.6 Keát quaû phaùt hieän gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân thòt boø Gen ñoäc löïc Maãu eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1 1 − − − − + − − − 2 − − − − − − + − 3 − − − − + − − − 4 − + + + − − − − 5 + + + + − − − − 6 + + + + + − − − 7 + + − + − − − − 8 + + − + − − − − 9 + + − + − − − − 10 + + − + − − − − 11 + + − − − − − − 12 + + − + − − − − 13 − − + + − − − − 14 − − + + − − − − 15 − − + + − − − − 16 − − + + − − − − 17 − − + + − − − − 18 − − + + − − − − 19 − − + + − − − − 20 − − + + − − − − 21 − − − + − − − − 13 maãu coøn laïi − − − − − − − − Coäng 8 9 11 17 3 0 1 0 Tyû leä (%) 23,5 26,5 32,4 50,0 8,8 0 2,9 0 Download» Agriviet.com 48 Rieâng gen stx2e phaùt hieän ñöôïc trong 3 maãu thòt boø ñöôïc chuùng toâi khaúng ñònh laø do söï vaáy nhieãm phaân heo trong quaù trình gieát moå. Caû 3 maãu thòt boø naøy ñöôïc laáy töø cô sôû gieát moå chung heo vaø boø. Vieäc vaáy nhieãm qua laïi giöõa hai khu vöïc trong loø moå hoaøn toaøn coù theå xaûy ra do coâng nhaân gieát moå, duïng cuï, nöôùc röûa tay… ™ Treân thòt heo Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa 49 maãu E. coli phaân laäp töø thòt heo ñöôïc ghi nhaän ôû baûng 4.7. Baûng 4.7 Keát quaû phaùt hieän gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân thòt heo Gen ñoäc löïc Maãu eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1 1 − + − − − − 2 + + + − − − − 3 − − − + − − − − 4 − − − + − − − − 5 − − − + − − − − 6 − − − + − − − − 7 − − − + − − − − 8 − − − + − − − − 9 − − − + − − − − 10 − − − + − − − − 11 − − − + − − − − 12 + + − − − − − − 37 maãu coøn laïi − − − − − − − − Coäng 2 2 0 11 0 0 0 0 Tyû leä (%) 4,1 4,1 0 22,5 0 0 0 0 Download» Agriviet.com 49 Trong toång soá 49 maãu E. coli phaân laäp töø thòt heo, coù 12/49 maãu (24,5%) phaùt hieän coù mang gen ñoäc löïc, bao goàm: - 11/49 maãu (22,5%) phaùt hieän ñöôïc gen stx2. - 2/49 maãu (4,1%) phaùt hieän ñöôïc gen eae, hly. - Khoâng phaùt hieän ñöôïc caùc gen stx1, stx2e, sta, stb, lt-I trong nhöõng maãu khaûo saùt. - Chæ coù 1/49 maãu (2,0%) phaùt hieän ñoàng thôøi mang gen stx2, eae, hly. Nhö vaäy, E. coli mang gen ñoäc löïc phaân laäp ñöôïc treân thòt heo chieám tæ leä thaáp hôn treân thòt boø (24,5% so vôùi 61,8%)ø. Ngoaøi ra, treân thòt heo tæ leä E. coli mang ñoàng thôøi 3 gen ñoäc löïc stx2, eae, hly (2,0%) cuõng thaáp hôn tæ leä treân thòt boø (20,6%). Töø ñoù ta coù theå nhaän ñònh raèng tieâu chaûy vaø HC hoaëc HUS ôû ngöôøi do nguyeân nhaân thòt boø deã xaûy ra hôn so vôùi thòt heo. Ñieàu naøy phuø hôïp vôùi caùc nghieân cöùu dòch teã treân theá giôùi veà caùc oå dòch do STEC/EHEC phaàn lôùn gaây ra do tieâu thuï saûn phaåm thòt boø (daãn lieäu Paton vaø Paton, 1998). 4.5 Toång keát keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân maãu khaûo saùt coù nguoàn goác töø boø Toùm laïi, trong nghieân cöùu cuûa chuùng toâi, 2 ñoái töôïng gia suùc ñöôïc choïn khaûo saùt laø boø vaø heo. Trong moãi ñoái töôïng gia suùc naøy, chuùng toâi thöïc hieän khaûo saùt treân 3 nhoùm maãu goàm: phaân beâ/heo con tieâu chaûy, phaân boø bình thöôøng vaø thòt töôi. Treân töøng ñoái töôïng gia suùc, chuùng toâi toång keát keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân 3 nhoùm maãu khaûo saùt naøy nhaèm coù caùi nhìn toång quaùt hôn. Khaûo saùt vôùi 65 maãu coù nguoàn goác töø boø bao goàm: 10 maãu phaân beâ tieâu chaûy, 21 maãu phaân boø bình thöôøng, 34 maãu thòt boø, keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân maãu khaûo saùt coù nguoàn goác töø boø ñöôïc trình baøy ôû baûng 4.8. Download» Agriviet.com 50 Baûng 4.8 Toång keát keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân maãu khaûo saùt coù nguoàn goác töø boø Gen ñoäc löïc Nhoùm maãu N n eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1 7 3 3 4 2 0 0 2 0 Phaân beâ tieâu chaûy 10 70,0 30,0 30,0 40,0 20,0 0 0 20,0 0 13 1 4 8 9 0 1 3 0 Phaân boø bình thöôøng 21 61,9 4,8 19,0 38,1 42,9 0 4,8 14,3 0 21 8 9 11 17 3 0 1 0 Thòt boø 34 61,8 23,5 26,5 32,4 50,0 8,8 0 2,9 0 41 12 16 23 28 (3) 1 6 0 COÄNG 65 63,1 18,5 24,6 35,4 43,1 (4,6) 1,5 9,2 0 N: Soá löôïng maãu khaûo saùt n: Soá löôïng maãu phaùt hieän ñöôïc coù mang gen ñoäc löïc 0 10 20 30 40 50 60 eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1 Gen ñoäc löïc Tæ leä (%) Phaân beâ tieâu chaûy Phaân boø bình thöôøng Thòt boø Bieåu ñoà 4.1: Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân maãu khaûo saùt coù nguoàn goác töø boø Download» Agriviet.com 51 Nhö vaäy, trong soá 65 maãu E. coli phaân laäp töø phaân vaø thòt coù nguoàn goác töø boø, moãi ñoái töôïng maãu ñeàu coù tæ leä maãu mang gen ñoäc löïc khaù cao (70% töø maãu phaân beâ tieâu chaûy, 61,9% töø maãu phaân boø bình thöôøng, 61,8% töø maãu thòt boø). Tính chung cho nhoùm maãu coù nguoàn goác töø boø coù 41/65 maãu E. coli mang gen ñoäc löïc, chieám tæ leä 63,1%. Trong ñoù: - E. coli mang gen stx2 xuaát hieän vôùi tæ leä cao nhaát (43,1%). - Caùc gen stx1, hly, eae cuõng xuaát hieän vôùi tæ leä khaù cao (laàn löôït laø 35,4%, 24,6%, 18,5%). Nhö vaäy roõ raøng boø chính laø nguoàn löu cöûu STEC trong töï nhieân. - Gen sta, stb xuaát hieän vôùi taàn soá thaáp (1,5% vaø 9,2%) - Rieâng gen stx2e cuûa E. coli thì khoâng phaùt hieän ñöôïc trong 31 maãu phaân boø (10 maãu phaân beâ tieâu chaûy vaø 21 maãu phaân boø bình thöôøng). Keát quaû naøy phuø hôïp vôùi Beutin (1995) vaø Blanco (1997). Tuy nhieân E. coli töø 34 maãu thòt boø khaûo saùt coù 3 maãu mang gen stx2e laø do nhieãm phaân heo trong quaù trình gieát moå. 4.6 Toång keát keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân maãu khaûo saùt coù nguoàn goác töø heo Vôùi 96 maãu coù nguoàn goác töø heo bao goàm: 22 maãu phaân heo con tieâu chaûy, 25 maãu phaân heo bình thöôøng, 49 maãu thòt heo, toång keát keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân maãu khaûo saùt coù nguoàn goác töø heo ñöôïc trình baøy ôû baûng 4.9. Download» Agriviet.com 52 Baûng 4.9 Toång keát keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân maãu khaûo saùt coù nguoàn goác töø heo Gen ñoäc löïc Nhoùm maãu N n eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1 17 2 1 0 10 7 4 16 0 Phaân heo con tieâu chaûy 22 77,2 9,1 4,5 0 45,5 31,8 18,2 72,7 0 10 2 2 0 1 4 0 7 0 Phaân heo bình thöôøng 25 40,0 8,0 8,0 0 4,0 16,0 0 28,0 0 12 2 2 0 11 0 0 0 0 Thòt heo 49 24,5 4,1 4,1 0 22,5 0 0 0 0 39 6 5 0 22 11 4 23 0 COÄNG 96 40,6 6,3 5,2 0 22,9 11,5 4,2 24,0 0 N: Soá löôïng maãu khaûo saùt n: Soá löôïng maãu phaùt hieän ñöôïc coù mang gen ñoäc löïc 0 10 20 30 40 50 60 70 80 eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1 Gen ñoäc löïc Tæ leä (%) Phaân heo con tieâu chaûy Phaân heo bình thöôøng Thòt heo Bieåu ñoà 4.2: Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân maãu khaûo saùt coù nguoàn goác töø heo Download» Agriviet.com 53 Nhö vaäy, trong 96 maãu E. coli coù nguoàn goác töø heo, 39 maãu phaùt hieän mang gen ñoäc löïc, chieám tæ leä 40,6%. - Gen stb vaø gen stx2 phaùt hieän ñöôïc vôùi tæ leä cao (24,0% vaø 22,9%). - Gen eae, hly, sta phaùt hieän ñöôïc vôùi taàn soá thaáp (6,3%, 5,2%, 4,2%). - Khoâng phaùt hieän ñöôïc gen stx1 trong 96 maãu coù nguoàn goác töø heo. Ñieàu naøy phuø hôïp vôùi keát quaû nghieân cöùu cuûa Blanco vaø ctv (1997) keát luaän raèng gen stx1 thöôøng khoâng coù treân heo (chæ phaùt hieän ñöôïc 1/74 doøng E. coli cuûa heo con tieâu chaûy hoaëc phuø thuûng). Botteldoorn vaø ctv (2003) xeùt nghieäm 177 maãu phaân heo cuõng khoâng phaùt hieän maãu E. coli naøo mang gen stx1, trong khi ñoù coù 56/177 maãu (31,6%) mang gen stx2, 24/177 maãu (13,6%) mang gen eae, vaø 8/177 maãu (4,5%) mang gen hly. Download» Agriviet.com 54 Chöông 5 KEÁT LUAÄN – ÑEÀ NGHÒ 5.1 Keát luaän Qua keát quaû thu ñöôïc trong quaù trình phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli phaân laäp ñöôïc töø phaân vaø thòt boø, heo baèng kyõ thuaät multiplex - PCR, chuùng toâi ruùt ra moät soá keát luaän sau: (1) Qui trình ñònh löôïng E. coli coù giai ñoaïn nuoâi caáy ôû 44,5oC khoâng thích hôïp cho nhoùm E. coli gaây beänh phaùt trieån neân khoâng phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc ôû 20 maãu phaân vaø 31 maãu thòt boø, heo. (2) Phaân laäp tröïc tieáp E. coli töø phaân treân moâi tröôøng choïn loïc MAC ôû 370C, choïn 20 khuaån laïc ñieån hình cho E. coli ñeå phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc baèng kyõ thuaät multiplex – PCR cho thaáy: * Tæ leä phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli trong phaân tieâu chaûy laø khaù cao: 70% ôû phaân beâ tieâu chaûy vaø 77,2% ôû phaân heo con tieâu chaûy. * E. coli trong phaân boø, heo bình thöôøng cuõng mang caùc gen ñoäc löïc vôùi tæ leä phaùt hieän thaáp hôn trong phaân tieâu chaûy. * Phaân boø laø nguoàn löu cöûu STEC/EHEC trong töï nhieân. Gen stx1 chæ phaùt hieän töø E. coli phaân laäp ñöôïc töø phaân boø, khoâng phaùt hieän ñöôïc töø phaân heo. Gen stx2e saûn sinh ñoäc toá vero gaây tieâu chaûy phuø thuûng chæ hieän dieän ôû E. coli trong phaân heo, khoâng phaùt hieän ñöôïc trong phaân boø. (3) Moâi tröôøng taêng sinh choïn loïc CT-SMAC taïo ñieàu kieän cho nhoùm STEC/EHEC trong thòt phaùt trieån toát, trôï giuùp cho vieäc choïn khuaån laïc ñeå phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc. Tæ leä phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli töø thòt boø vaø thòt heo laàn löôït laø 61,8% vaø 24,5%. Download» Agriviet.com 55 (4) Chöa phaùt hieän ñöôïc gen lt-I cuûa E. coli trong 65 maãu phaân vaø thòt boø, 96 maãu phaân vaø thòt heo. 5.2 Ñeà nghò - ÖÙng duïng kyõ thuaät PCR trong chaån ñoaùn beänh vaø kieåm tra veä sinh an toaøn thöïc phaåm. - Veä sinh vaø quaûn lyù toát taïi caùc cô sôû chaên nuoâi nhaèm ngaên ngöøa beänh tieâu chaûy, phuø thuûng treân heo con. - Tuaân thuû nghieâm ngaët caùc qui ñònh veà veä sinh trong quaù trình gieát moå gia suùc. Download» Agriviet.com 56 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO PHAÀN TIEÁNG VIEÄT 1. Hoà Huyønh Thuøy Döông, 1998. Sinh hoïc phaân töû (Khaùi nieäm – Phöông phaùp – ÖÙng duïng). Nhaø xuaát baûn Giaùo duïc Thaønh phoá Hoà Chí Minh. 2. Traàn Thanh Phong, 1998. Escherichia coli O157:H7 vaø ngoä ñoäc thöùc aên. Taäp san Khoa hoïc Kyõ thuaät Noâng laâm nghieäp. Soá thaùng 6/1998. Tröôøng Ñaïi hoïc Noâng Laâm, TP. Hoà Chí Minh. Nhaø xuaát baûn Noâng nghieäp. Trang 8 – 14. PHAÀN TIEÁNG NÖÔÙC NGOAØI 3. Barrett T. J., Kaper L. B., Jerse A. E., and Wachsmuth I. K., 1992. Virulence factors in Shiga-like toxin producing Escherichia coli isolated from humans and cattle. J. Infect. Dis. 165:970-980. 4. Bertschinger H. U. and Fairbrother J. M., 1999. Escherichia coli infections. In Diseases of swine (Eds. B. E. Straw, S. D’Allaire, W. L. Mengeling, and D. J. Taylor). Iowa State University Press, Iowa, USA. 5. Beutin L., Aleksic S., Zimmermann S., and Gleier K., 1994. Virulence factors and phenotypic traits of verotoxigenic strains of Escherichia coli isolated from human patients in Germany. Med. Microbiol. Immunol. (Berlin) 183:13-21 6. Beutin L., Geier D., Steinrck H., Zimmermann S., and Scheutz F., 1993. Prevalence and some properties of verotoxin (Shiga-like toxin)- producing Escherichia coli in seven different species of healthy domestic animals. J. Clin. Microbiol. 31:2483-2488 7. Black R. E., Merson M. H., Rowe B., Taylor P. R., Abdul Alim A. R. M., Gross R. J., and Sack D. A., 1981. Enterotoxigenic Escherichia coli diarrhoea: acquired immunity and transmission in an endemic area. Bull. W. H. O. 59:263-268 8. Blanco M., Blanco J. E., Gonzalez E. A., Mora A., Jansen W., Gomes T. Download» Agriviet.com 57 A. T., Zerbini L. F., Yano T., de Castro A. F. P., and Blanco J., 1997. Note: Genes coding for enterotoxins and Verotoxins in Porcin Escherichia coli strains belonging to different O:K:H serotypes: relationship with phenotype. J. Clin. Microbiol. 35:2958-2963 9. Botteldoorn N., Heydrick M., Rijpens N., Herman L., 2003. Detection and characterization of verotoxigenic Escherichia coli by a VTEC/EHEC multiplex – PCR in porcine faeces in pig carcass swabs. Res. Microbiol. 154:97-104. 10. Calderwood S. B., Acheson D. W. K., Keusch G. T., Barrett T. J., Griffin P. M., Strockbine N. A. et al, 1996. Proposed new nomenclature for SLT (VT) family. ASM News 62:118-119. 11. Cebula T. A., Payne W. L., and Fegn P., 1995. Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by Mismatch amplification mutation assay multiplex – PCR. J. Clin. Microbiol. 33:248-250. 12. Cerna J. F., Nataro J. P., and Garcia T. E., 2003. Multiplex – PCR for detection of three plasmid borne genes of enteroaggregative Escherichia coli strains. J. Clin. Microbiol. 41:2138-2140. 13. Chalmer R. M., Salmon R. L., Willshaw G. A., Cheasty T., Looker N., Davies I., and Wray C., 1997. Verocytotoxin-producing Escherichia coli O157 in a farmer handing horses. Lancet 349:1816 14. Chapman P. A., Siddons C. A., Cerdan Malo A. T., and Harkin M. A., 1997. A 1-year study of Escherichia coli in cattle, pig and poultry. Epidemiol. Infect. 119:245-250 15. Donnenberg M. S., Tzipori S., McKee M. L., O'Brien A. D., Alroy J., and Kaper J. B., 1993. The role of the eae gene of enterohemorrhagic Escherichia coli in intimate attachment in vitro and in a porcine model. J. Clin. Invest. 92:1418-1424 16. Doyle M. P. and Padhye V. V., 1989. Escherichia coli. In: Foodborne bacterial pathogens (Ed. M. P. Doyle). Marcel Decker Inc. New York. p.235-281. Download» Agriviet.com 58 17. FAO, 1992. Microbiological analysis in the food control laboratory. 18. FDA, 2002. “Diarrheagenic Escherichia coli”, Bacteriological Analytical manual Online, CFSAN. September 2002. <URL: 19. Handl C. E., Olsson E., and Flock J. I., 1992. Evaluation of three different STb assays and comparision of enterotoxin pattern over a five-year period in Swedish porcine Escherichia coli. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 15:505-510. 20. Harel J., Lapointe H., Fallara A., Lorrtie A., Bigras-Poulin M., Lariviere S., and Fairbrother J. M., 1991. detection of genes for fimbrial antigens and enterotoxins associated with Escherichia coli serogroups isolated from pig with diarrhea. J. Clin. Microbiol. 29:745-752. 21. Hitotsubashi S., Fujii Y., Yamanaka H., and Okamoto K., 1992. Some properties of purified Escherichia coli heat-stable enterotoxin II. Infect. Immun. 60:4468-4474 22. Jann K. and Jann B., 1992. Capsules of Escherichia coli, expression and biological significance. Can. J. Microbiol. 38:705-710 23. Kaffmann F., 1947. The serology of coli group. J. Immunol. 57:71-100. 24. Karmali M. A., 1989 Infection by verocytotoxin-producing Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev. 2:15-38. 25. Keskimaki M., 2001, Shiga toxin-producing and other diarrhoeagenic Escherichia coli in Finland: pheno- and genotypic epidemiology. Academic dissertation. The Faculty of Agriculture and Forestry of the University of Helsinky, Finland. 26. Konowalchuk J., Speirs J. I., and Stavric S., 1977. Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli. Infect. Immun. 18:775-779 27. Leung P. H. M., Peiris J. S. M., Ng W. W. S., Robin-Browne R. M., Bettelheim K. A., and Yam W. C., 2003. A newly discovered Download» Agriviet.com 59 verotoxin variant, VT2g, produced by bovine verocytotoxigenic Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 69:4549-4553. 28. Levine M. M., Ristaino P., Marley G., Smyth C., Knutton S., Boedeker E., Black R., Young C., Clements M. L., Cheney C., and Patnaik R., 1984. Coli surface antigens 1 and 3 of colonization factor antigen II- positive enterotoxigenic Escherichia coli: morphology, purification, and immune responses in humans. Infect. Immun. 44:409-420. 29. Levine M. M., Ristaino P., Marley G., Smyth C., Knutton S., Boedeker E., Black R., Young C., Clements M. L., Cheney C., and Patnaik R., 1984. Coli surface antigens 1 and 3 of colonization factor antigen II- positive enterotoxigenic Escherichia coli: morphology, purification, and immune responses in humans. Infect. Immun. 44:409-420. 30. Levine M. M., Xu J., Kapper J. B., Lior H., Prado V., Tall B., Nataro J. P., Karch H., and Wachsmuth K., 1987. A DNA probe to identify enterohemorrhagic Escherichia coli of O157:H7 and other serotypes that cause hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome. J. Infect. Dis. 156:175-182. 31. Moon H. W., Schneider R. A., and Moseley S. L., 1986. Comparative prevalence of four enterotoxin genes among Escherichia coli isolated from swine. Am. J. Vet. Res. 47:210-212. 32. Moon H. W., Whipp S. C., Argenzio R. A., Levine M. M., and Giannella R. A., 1983. Attaching and effacing activities of rabbit and human enteropathogenic Escherichia coli in pig and rabbit intestines. Infect. Immun. 41:1340-1351. 33. Nataro J. P. and Kaper J. B., 1998.Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol. Rev. 11(1):142-201. 34. Nguyen Ngoc Hai, 2002. Maladie de l’edemedu porc au Vietnam: carateùrisation des sou ches Escherichia coli responsables, facteurs de pathogeùniciteù et vaccination. PhD. Theùsis. 35. Orskov F., Orskov I., 1984. Serotyping of Escherichia coli. In: Methods in Microbiology (Ed. T. Bergan), vol. 14. Academic Press Inc., Ltd. London, p. 43-112. Download» Agriviet.com 60 36. Paton A. W. and Paton J. C., 1998. Detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by using multiplex PCR assay for stx1, stx2, eaeA, enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfbO111, and rfbO157. J. Clinical Microbiol. 36(2):598-602 37. Paton J. C. and Paton A. W., 1998. Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections. Clin. Microbiol. Rev. 11:450-479. 38. Paton J. C., and Paton A. W., 1996. Survival rate of mice after transient colonization with Escherichia coli clones carrying variant Shiga-like toxin type II operons. Microb. Pathog. 20:377-383 39. Protocol online <URL: Multiplex_PCR/ 40. Renwick S. A., wilson J. B., Clarke R. C., Lior H., Borcyk A. A., Spika J., Rahn K., McFadden K., Brouwer A., Coopps A., Anderson N. G., Alves D., and Karmali M. A., 1993. evidence of direct transmission of Escherichia coli O157:H7 infection between calves and human. J. Infect. Dis. 168:792-793. 41. Sadu S., Mutalib S. A., Rusul G., Ahmad Z., Morigaki T., Asai N., Kim Y. B., Okuda J., and Nishibuchi M., 1998. Appl. Environ. Microbiol. 64:1153-1156. Download» Agriviet.com 61 PHUÏ LUÏC 1 HOÙA CHAÁT CHO ÑIEÄN DI ™ TBE (0,5 X) Tris HCl 3,94 mg Acid Boric 1,39 g Na2EDTA 93,06 mg Nöôùc caát vöøa ñuû 500 ml pH = 8,3 vôùi NaOH 0,1N ™ Agarose (2%) ™ Loading dye Bromophenol blue 0,25% Sucrose 40% TE 1X vöøa ñuû 100% HOÙA CHAÁT CHO NHUOÄM GEL TBE 1X Ethidium bromide 10 mg/ml MOÂI TRÖÔØNG VAØ THUOÁC THÖÛ ™ Moâi Tröôøng LTB Trypticase/ Tryptone 20g NaCl 5g Lactose 5g K2HPO4 2,75g KH2PO4 2,75g Sodium lauryl sulphate 0,1g Nöôùc caát vöøa ñuû 1.000 ml pH = 6,8 ± 0,1 EC Tryptone 20 g Lactose 5g Bile salt mixture 1,5g Download» Agriviet.com 62 Dipotassium phosphate 4 g Monopotassium phosphate 1,5g Sodium chloride 5g Nöôùc caát vöøa ñuû 1.000 ml PH = 6,9 ± 0,2 (25oC) EMB Peptone 10 g Lactose 5 g Sucrose 5g Dipotassium phosphate 2 g Agar 13,5g Eosin Y 0,4 g Methyl blue 0,065g Nöôùc caát vöøa ñuû 1.000 ml pH = 7,2± 0,2 (25oC) NA Peptone 5g Sodium chloride 5g Beef Extract 1,5g Yeast Extract 1,5g Agar 15g Nöôùc caát vöøa ñuû 1.000 ml pH = 7,4 ± 0,2 (25oC) Nöôùc peptone ñeäm Peptone 10 g Sodium chloride 5g Disodium hydrogen phosphate 9 g Potassium dihydrogen phosphate 1,5g Nöôùc caát vöøa ñuû 1.000 ml pH = 7 Download» Agriviet.com 63 SIMMON CITRAT Na citrate 2 g NaCl 5 g K2HPO4 1 g NH4H2PO4 1 g MgSO4 0,2 g Bromothymol blue 0,08 g Agar 15 g Nöôùc caát vöøa ñuû 1.000 ml MR – VP Peptone 7 g Glucose 5 g K2HPO4 5 g Nöôùc caát vöøa ñuû 800 ml Ph = 6,9 ± 0,2 ™ Thuoác Thöû VP (Voges Proskauer) Dung dòch A: Alpha naphthol 5g Ethanol tuyeät ñoái 100 ml Dung dòch B: Potassium hydroxyde 40 g Nöôùc caát 100 ml MR (Methyl red) Methyl red 0,1 g Alcohol 300 ml Nöôùc caát vöøa ñuû 500 ml Download» Agriviet.com 64 PHUÏ LUÏC 2 CAÙC VAÁN ÑEÀ THÖÔØNG GAËP TRONG MULTIPLEX – PCR VAØ HÖÔÙNG GIAÛI QUYEÁT Vaán ñeà Höôùng giaûi quyeát Saûn phaåm khoâng chuyeân bieät * Neáu daøi - Taêng noàng ñoä KCl (buffer) ñeán 1,2 - 2X nhöng giöõ nguyeân noàng ñoä MgCl2 ôû 1,5 – 2 mM. * Neáu ngaén - Giaûm noàng ñoä buffer coøn 0,7 - 0,9X nhöng giöõ noàng ñoä MgCl2 ôû 1,5 - 2 mM. - Taêng daàn nhieät ñoä uû baét caëp. - Giaûm löôïng ADN xeùt nghieäm . - Giaûm löôïng primer. - Giaûm löïông Taq - polymerase. - Taêng noàng ñoä MgCl2 3 - 4,5 mM nhöng giöõ nguyeân noàng ñoä dNTP. - Theâm chaát phuï gia, toát nhaát laø duøng BSA (0,1 - 0,8 μg/μl: noàng ñoä cuoái cuøng). Coù theå duøng thöû 5% glycerol (v/v noàng ñoä cuoái). * Neáu khoâng coù saûn phaåm. - Chaïy PCR cho moãi caëp moài ñöôïc söû duïng trong multiplex vôùi nhieät ñoä uû baét caëp thaáp hôn bình thöôøng. - So saùnh saûn phaåm khoâng chuyeân bieät cho moãi caëp moài kieåm tra vôùi saûn phaåm khoâng chuyeân bieät nhìn thaáy khi chaïy multiplex - PCR. Ñieàu naøy coù theå chæ ra moãi caëp moài mang laïi nhöõng saûn phaåm khoâng chuyeân bieät trong phaûn öùng multiplex. - Keát hôïp moät vaøi hoaëc taát caû nhöõng phöông phaùp treân. Saûn phaåm yeáu (môø) - Giaûm thôøi gian uû baét caëp. - Giaûm nhieät ñoä keùo daøi ñeán 62 - 680C. - Taêng thôøi gian keùo daøi. - Taêng noàng ñoä ADN xeùt nghieäm. - Taêng taát caû löôïng primer söû duïng. - Ñieàu chænh noàng ñoä Taq - polymerase. - Thay ñoåi noàng ñoä buffer nhöng giöõ noàng ñoä MgCl2 ôû 1,5 – 2 mM. - Taêng noàng ñoä MgCl2 ñeán 3 - 4,5 mM nhöng giöõ nguyeân noàng ñoä dNTPs. - Theâm chaát phuï gia, toát nhaát laø BSA (0,1 - 0,8 μg/μl), coù theå thöû 5% glycerol (v/v noàng ñoä cuoái cuøng). - Keát hôïp moät vaøi hoaëc taát caû phöông phaùp treân. Download» Agriviet.com 65 Vaán ñeà Höôùng giaûi quyeát Saûn phaåm daøi vaø yeáu (môø) - Giaûm noàng ñoä buffer coøn 0,7 - 0,8X nhöng giöõ noàng ñoä MgCl2 ôû 1,5 – 2 mM. - Taêng noàng ñoä MgCl2 leân 3 - 4,5 mM nhöng giöõ nguyeân noàng ñoä dNTPs. - Taêng thôøi gian bieán tính. - Taêng thôøi gian uû baét caëp. - Giaûm nhieät ñoä uû baét caëp. - Taêng thôøi gian vaø nhieät ñoä keùo daøi. - Taêng löôïng primer ñoái vôùi saûn phaåm PCR coù baêng môø ñoàng thôøi giaûm löôïng primer cho baêng ñaäm. - Theâm chaát phuï gia, toát nhaát laø duøng BSA ( 0,1 - 0,8μg/μl). Neân thöû 5% glycerol (v/v noàng ñoä cuoái cuøng). - Keát hôïp moät vaøi hoaëc taát caû caùc phöông phaùp treân. Saûn phaåm ngaén vaø yeáu (môø)ø - Taêng noàng ñoä buffer ñeán 1,2 - 2X nhöng giöõ noàng ñoä MgCl2 ôû 1,5 – 2 mM. - Giaûm thôøi gian bieán tính. - Giaûm thôøi gian uû baét caëp. - Giaûm nhieät ñoä uû baét caëp. - Giaûm thôøi gian vaø nhieät ñoä keùo daøi. - Taêng löôïng primer ñoái vôùi saûn phaåm PCR coù baêng môø vaø giaûm löôïng primer cho baêng ñaäm. - Theâm chaát phuï gia BSA (0,1 - 0,8 μg/μl), coù theå thöû 5% glycerol (v/v noàng ñoä cuoái cuøng). - Keát hôïp moät vaøi hoaëc taát caû caùc phöông phaùp treân. Download» Agriviet.com 66 GIÔÙI THIEÄU VEÀ TAØI LIEÄU A. Tài liệu bạn đang xem được download từ website WWW.AGRIVIET.COM WWW.MAUTHOIGIAN.ORG »Agriviet.com là website chuyên đề về nông nghiệp nơi liên kết mọi thành viên hoạt động trong lĩnh vực nông nghiệp, chúng tôi thường xuyên tổng hợp tài liệu về tất cả các lĩnh vực có liên quan đến nông nghiệp để chia sẽ cùng tất cả mọi người. Nếu tài liệu bạn cần không tìm thấy trong website xin vui lòng gửi yêu cầu về ban biên tập website để chúng tôi cố gắng bổ sung trong thời gian sớm nhất. »Chúng tôi xin chân thành cám ơn các bạn thành viên đã gửi tài liệu về cho chúng tôi. Thay lời cám ơn đến tác giả bằng cách chia sẽ lại những tài liệu mà bạn đang có cùng mọi người. Bạn có thể trực tiếp gửi tài liệu của bạn lên website hoặc gửi về cho chúng tôi theo địa chỉ email Webmaster@Agriviet.Com Lưu ý: Mọi tài liệu, hình ảnh bạn download từ web