Tài liệu Đề tài Phát hiện một số gen độc lực của E. coliphân lập được từ phân và thịt bò, heo bằng kỹ thuật multiplex - PCR: Download» Agriviet.com
1
Chương 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Escherichia coli (E. coli) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế nhất
trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật. Tuy nhiên, khi có điều
kiện thích hợp, một số nhóm E. coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên
nhân quan trọng gây tiêu chảy trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc non (tiêu
chảy trên bê nghé, tiêu chảy phân trắng ở heo con theo mẹ, tiêu chảy phù thủng
trên heo cai sữa).
E. coli được thải qua phân ra môi trường bên ngoài. Nếu qui trình vệ sinh
kém thì E. coli dễ vấy nhiễm vào thịt tươi, đặc biệt là trong quá trình giết mổ. Từ
đó nếu việc bảo quản và chế biến thực phẩm không thích hợp thì ngộ độc thực
phẩm do E. coli hoàn toàn có thể xảy ra. Trong số các tác nhân gây tiêu chảy ở
người thì E. coli luôn là tác nhân phổ biến nhất ở những nước công nghiệp phát...
66 trang |
Chia sẻ: hunglv | Lượt xem: 1063 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang mẫu tài liệu Đề tài Phát hiện một số gen độc lực của E. coliphân lập được từ phân và thịt bò, heo bằng kỹ thuật multiplex - PCR, để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Download» Agriviet.com
1
Chöông 1
ÑAËT VAÁN ÑEÀ
Escherichia coli (E. coli) laø vi khuaån soáng coäng sinh chieám öu theá nhaát
trong heä vi sinh vaät ñöôøng ruoät cuûa ngöôøi vaø ñoäng vaät. Tuy nhieân, khi coù ñieàu
kieän thích hôïp, moät soá nhoùm E. coli gaây ñoäc taêng sinh maïnh, trôû thaønh nguyeân
nhaân quan troïng gaây tieâu chaûy treân ngöôøi vaø gia suùc, ñaëc bieät laø gia suùc non (tieâu
chaûy treân beâ ngheù, tieâu chaûy phaân traéng ôû heo con theo meï, tieâu chaûy phuø thuûng
treân heo cai söõa).
E. coli ñöôïc thaûi qua phaân ra moâi tröôøng beân ngoaøi. Neáu qui trình veä sinh
keùm thì E. coli deã vaáy nhieãm vaøo thòt töôi, ñaëc bieät laø trong quaù trình gieát moå. Töø
ñoù neáu vieäc baûo quaûn vaø cheá bieán thöïc phaåm khoâng thích hôïp thì ngoä ñoäc thöïc
phaåm do E. coli hoaøn toaøn coù theå xaûy ra. Trong soá caùc taùc nhaân gaây tieâu chaûy ôû
ngöôøi thì E. coli luoân laø taùc nhaân phoå bieán nhaát ôû nhöõng nöôùc coâng nghieäp phaùt
triển lẫn nhöõng nöôùc ñang phaùt trieån. Do ñoù E. coli ñöôïc xem laø vi khuaån chæ danh
oâ nhieãm thöïc phaåm vaø nöôùc ñöôïc ñaùnh giaù döïa treân soá löôïng cuûa chuùng.
Döïa treân ñaëc ñieåm gaây beänh, E. coli ñöôïc chia thaønh nhieàu nhoùm. Moãi
nhoùm ñeàu coù nhöõng yeáu toá ñoäc löïc khaùc nhau ñöôïc qui ñònh bôûi nhöõng gen ñoäc
löïc. Moät soá gen ñoäc löïc quan troïng cuûa E. coli goàm: gen stx1, stx2, stx2e, hly cuûa
nhoùm STEC (Shiga toxin-producing E. coli); gen eae cuûa nhoùm STEC vaø EPEC
(Enteropathogenic E. coli); gen sta, stb, lt-I cuûa nhoùm ETEC (Enterotoxigenic E.
coli )…
E. coli laø vi khuaån bình thöôøng ôû ñöôøng ruoät vaø cuõng thöôøng coù maët trong
thöïc phaåm neân vieäc phaân laäp ñöôïc vi khuaån E. coli trong phaân ñeå tìm nguyeân
nhaân gaây beänh hay xaùc ñònh ñöôïc soá löôïng vi khuaån trong thöïc phaåm hoaøn toaøn
khoâng phaûn aùnh ñöôïc khaû naêng gaây ñoäc cuûa chuùng. Do vaäy vieäc xaùc ñònh caùc gen
Download» Agriviet.com
2
ñoäc löïc cuûa E. coli laø moät böôùc raát caàn thieát phuïc vuï cho vieäc ñaùnh giaù nguy cô
gaây beänh treân vaät nuoâi vaø con ngöôøi. Caùc kyõ thuaät sinh hoïc phaân töû, ñaëc bieät laø
kyõ thuaät PCR thöôøng ñöôïc aùp duïng ñeå phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc naøy.
Cho ñeán nay, ôû Vieät Nam vieäc xaùc ñònh E. coli laø nguyeân nhaân gaây beänh
thöôøng chæ thöïc hieän baèng kyõ thuaät phaân laäp vaø xaùc ñònh caùc ñaëc tính sinh hoùa, vaø
theo Tieâu chuaån Vieät Nam, ñaùnh giaù tình traïng veä sinh thöïc phaåm hieän chæ döøng
laïi ôû möùc ñoä xaùc ñònh soá löôïng vi khuaån, vieäc phaùt hieän nhöõng gen ñoäc löïc cuûa vi
khuaån chöa ñöôïc quan taâm. Hôn nöõa vieäc öùng duïng kyõ thuaät multiplex - PCR ñeå
phaùt hieän ñoàng thôøi caùc yeáu toá ñoäc löïc cuûa E. coli chöa ñöôïc thöïc hieän ôû Vieät
Nam. Vôùi muïc tieâu phaùt hieän moät soá gen ñoäc löïc maõ hoùa caùc protein gaây ñoäc cuûa
E. coli phaân laäp ñöôïc töø phaân vaø thòt boø, heo baèng kyõ thuaät multiplex – PCR, ñöôïc
söï höôùng daãn cuûa Thaày Nguyeãn Ngoïc Tuaân, chuùng toâi tieán haønh thöïc hieän ñeà taøi:
“Phaùt hieän moät soá gen ñoäc löïc cuûa E. coli phaân laäp ñöôïc töø phaân vaø thòt boø,
heo baèng kyõ thuaät multiplex - PCR”.
Böôùc ñaàu aùp duïng kyõ thuaät naøy, chuùng toâi laàn löôït thöïc hieän khaûo saùt treân
caùc nhoùm ñoái töôïng maãu phaân tieâu chaûy, phaân bình thöôøng, vaø thòt töôi. Ñeà taøi hy
voïng trôû thaønh cô sôû ñeå aùp duïng kyõ thuaät multiplex – PCR trong vieäc phaùt hieän
caùc gen ñoäc löïc cuûa vi khuaån E. coli trong chaån ñoaùn beänh vaø ñaùnh giaù tình traïng
veä sinh thöïc phaåm.
Yeâu caàu:
- E. coli ñöôïc phaân laäp ñònh löôïng theo qui trình cuûa FAO (1992) vaø phaân
laäp ñònh tính baèng moâi tröôøng choïn loïc MacConkey ñoái vôùi maãu phaân hoaëc baèng
moâi tröôøng taêng sinh choïn loïc CT-SMAC (Sorbitol MacConkey vôùi khaùng sinh
cefixime vaø tellurite potassium) ñoái vôùi maãu thòt.
- Ly trích DNA töø vi khuaån E. coli phaân laäp ñöôïc;
- Phaùt hieän moät soá gen ñoäc löïc (eae, hly, stx1, stx2, stx2e, sta, stb, lt-I) cuûa
E. coli phaân laäp ñöôïc baèng kyõ thuaät mutiplex - PCR.
Download» Agriviet.com
3
Chöông 2
TOÅNG QUAN
2.1 Vi khuaån E. coli
2.1.1 Ñònh nghóa
Vi khuaån Escherichia coli ñöôïc phaân laäp vaø moâ taû ñaàu tieân vaøo naêm 1885
bôûi nhaø nghieân cöùu ngöôøi Ñöùc Theodor Escherich.
Theo heä thoáng phaân loaïi cuûa Bergey, vi khuaån E. coli thuoäc hoï
Enterobacteriaceae, gioáng Escherichia.
E. coli laø tröïc khuaån Gram aâm, di ñoäng, kích thöôùc khoaûng 2 – 3 x 0,5 μm,
khoâng hình thaønh baøo töû vaø coù giaùp moâ. E. coli coù maët thöôøng xuyeân vaø chieám öu
theá trong ruoät cuûa ngöôøi vaø ñoäng vaät maùu noùng, ôû phaàn cuoái cuûa ruoät non vaø ôû
ruoät giaø.
2.1.2 Nuoâi caáy vaø ñaëc ñieåm sinh hoùa
E. coli laø vi khuaån hieáu khí hoaëc yeám khí tuøy nghi. Nhieät ñoä thích hôïp laø
35 - 370C, pH thích hôïp 6,4 – 7,5 (toái öu nhaát laø 7,2 – 7,4).
Trong moâi tröôøng loûng, sau 4 – 5 giôø E. coli laøm ñuïc nheï moâi tröôøng, caøng
ñeå laâu caøng ñuïc, coù muøi hoâi thoái; sau vaøi ngaøy coù theå coù vaùng moûng treân maët moâi
tröôøng.
E. coli moïc toát treân moâi tröôøng thaïch dinh döôõng, sau 24 giôø hình thaønh
nhöõng khuaån laïc daïng S maøu xaùm traéng, troøn, öôùt, beà maët boùng, kích thöôùc
khoaûng 2 – 3 mm.
Treân moâi tröôøng thaïch EMB: E. coli cho khuaån laïc tím aùnh kim.
Treân moâi tröôøng thaïch MacConkey: E. coli cho khuaån laïc ñoû hoàng.
Treân moâi tröôøng thaïch nghieâng TSI: E. coli taïo acid / acid (vaøng / vaøng).
Download» Agriviet.com
4
Ñeå phaân bieät E. coli vaø caùc vi khuaån ñöôøng ruoät khaùc, ngöôøi ta duøng thöû
nghieäm IMVC. E. coli cho keát quaû IMVC laø + + − − (biotype 1) hoaëc − + − −
(biotype 2).
2.1.3 Yeáu toá khaùng nguyeân
E. coli coù caáu truùc khaùng nguyeân raát phöùc taïp. Tröôùc kia, kyõ thuaät xaùc ñònh
khaùng nguyeân beà maët laø phöông tieän chính ñeå phaân bieät caùc doøng E. coli gaây
beänh. Naêm 1947, Kauffmann ñöa ra heä thoáng phaân nhoùm serotype maø vaãn coøn
ñöôïc söû duïng ñeán ngaøy nay. Heä thoáng phaân nhoùm naøy döïa vaøo vieäc xaùc ñònh
khaùng nguyeân beà maët O, H, K.
* Khaùng nguyeân thaân O (somatic antigen): coù baûn chaát laø
lipopolysaccharide cuûa maøng ngoaøi teá baøo, beàn vôùi nhieät vaø coàn. Khi ñun noùng ôû
1000C trong 2 giôø vaãn giöõ ñöôïc tính khaùng nguyeân. Khaùng nguyeân O coù theå ñöôïc
phaùt hieän baèng phaûn öùng ngöng keát. Khaùng nguyeân O giöõ vai troø nhaát ñònh ñoái
vôùi khaû naêng gaây beänh cuûa doøng vi khuaån vaø coù tính chaát chuyeân bieät cho töøng
loaøi vaät chuû. Khaùng nguyeân O taïo neàn taûng cho vieäc phaân loaïi serogroup cuûa E.
coli. Coù hôn 170 serogroup khaùng nguyeân O. Trong moãi serogroup coù 1 hay nhieàu
serotype ñöôïc phaân loaïi döïa vaøo khaùng nguyeân loâng H.
* Khaùng nguyeân loâng H (flagellar antigen): coù baûn chaát laø protein, taïo neân
khaû naêng di ñoäng cuûa E. coli, keùm chòu nhieät. Coù khoaûng 56 type khaùng nguyeân H.
* Khaùng nguyeân giaùp moâ K (capsular antigen): Khaùng nguyeân K luùc ñaàu
ñöôïc xaùc ñònh baèng phaûn öùng ngöng keát. Ngöôøi ta xaùc ñònh coù söï hieän dieän cuûa
khaùng nguyeân K ôû vi khuaån neáu vi khuaån chæ ngöng keát vôùi khaùng huyeát thanh O
khi bò ñun noùng. Döïa vaøo khaû naêng chòu nhieät ngöôøi ta chia khaùng nguyeân K thaønh
3 type laø A, L vaø B. Veà sau ngöôøi ta phaân loaïi khaùng nguyeân K döïa vaøo thaønh
phaàn hoùa hoïc cuûa chuùng vaø ñaõ coù hôn 80 type khaùng nguyeân K ñaõ ñöôïc xaùc ñònh.
Moät vaøi E. coli, ñaëc bieät laø E. coli tieát ñoäc toá ruoät coù nhöõng loâng baùm
khaùng mannose (mannose resistant - MR) cuõng ñöôïc duøng ñeå phaân loaïi veà maët
Download» Agriviet.com
5
huyeát thanh hoïc. Moät vaøi loâng baùm khaùng mannose naøy (ví duï nhö K88 vaø K89)
ñaõ töøng ñöôïc coi laø khaùng nguyeân K. Veà sau, khi xaùc ñònh ñöôïc thaønh phaàn hoùa
hoïc cuûa nhöõng loâng baùm naøy coù baûn chaát laø protein neân vieäc xeáp chuùng vaøo
khaùng nguyeân K khoâng coøn phuø hôïp, chuùng ñöôïc xeáp vaøo nhoùm khaùng nguyeân
tieâm mao F.
* Khaùng nguyeân tieâm mao F (fimbrial antigen): Tieâm mao (fimbriae) daøi
khoaûng 4μm, ñöôøng kính 2,1 – 7,0 nm, daïng thaúng hay xoaén. Tieâm mao khoâng
tham gia vaøo söï di chuyeån, ngaén hôn vaø nhieàu hôn flagella. Tieâm mao giuùp vi
khuaån keát dính vaøo teá baøo nieâm mao ruoät neân raát quan troïng trong khaû naêng gaây
beänh cuûa vi khuaån.
Hieän nay coù hôn 700 type khaùng nguyeân hay serotype cuûa E. coli töø söï toå
hôïp cuûa caùc nhoùm khaùng nguyeân O, H, K, F. Tuy nhieân noùi chung, chæ nhöõng E.
coli ngoaøi ñöôøng ruoät môùi khoâng coù capsul (Jann vaø Jann, 1992), do ñoù ñoái vôùi
nhöõng E. coli gaây tieâu chaûy, thöôøng thì vieäc xaùc ñònh serotype chæ laø söï keát hôïp
ñaëc hieäu giöõa khaùng nguyeân O vaø khaùng nguyeân H.
2.1.4 Phaân loaïi E. coli
Maëc duø E. coli laø vi khuaån coäng sinh voâ haïi trong ñöôøng ruoät. Tuy nhieân
trong moät ñieàu kieän thuaän lôïi, gioáng nhö haàu heát caùc taùc nhaân gaây beänh treân
maøng nhaày, E. coli coù caùc yeáu toá caàn thieát ñeå gaây beänh goàm (1) cö truù treân maøng
nhaày, (2) khaùng ñöôïc söï phoøng veä cuûa vaät chuû, (3) nhaân leân, vaø (4) gaây toån haïi
vaät chuû. Ñaëc tính quan troïng nhaát cuûa doøng E. coli gaây tieâu chaûy laø khaû naêng cö
truù treân maøng nhaày ruoät baát chaáp nhu ñoäng ruoät vaø söï caïnh tranh dinh döôõng cuûa
heä vi sinh vaät bình thöôøng ôû ruoät (goàm caû nhöõng doøng E. coli khaùc). Söï hieän dieän
cuûa nhöõng loâng baùm laø moät ñaëc ñieåm cuûa haàu heát caùc doøng E. coli, caû ôû nhöõng
doøng E. coli khoâng gaây beänh (Nataro vaø Kaper, 1998). Tuy nhieân nhöõng doøng E.
coli gaây tieâu chaûy coù nhöõng khaùng nguyeân loâng ñaëc hieäu giuùp E. coli coù theå baùm
dính vaøo maøng nhaày ruoät non maëc duø ñaây khoâng phaûi laø vò trí cö truù bình thöôøng
Download» Agriviet.com
6
cuûa E. coli (Levine vaø ctv, 1984). Moät khi söï cö truù ñaõ ñöôïc thieát laäp, vieäc gaây
beänh cuûa caùc doøng E. coli gaây tieâu chaûy raát ña daïng. Döïa treân ñaëc ñieåm gaây
beänh (goàm caùc ñaëc tính ñoäc löïc, söï taùc ñoäng khaùc nhau leân maøng nhaày ruoät, hoäi
chöùng laâm saøng cuûa beänh vaø söï khaùc nhau veà maët dòch teã cuûa beänh), E. coli ñöôïc
chia thaønh 5 nhoùm chính:
- STEC (Shiga toxin-producing E. coli) hoaëc VTEC (Verotoxigenic E. coli)
vaø EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli)
- EPEC (Enteropathogenic E. coli)
- ETEC (Enterotoxigenic E. coli)
- EAggEC hay EAEC (Enteroaggregative E. coli)
- EIEC (Enteroinvasive E. coli)
Coù ba cô cheá chung veà khaû naêng gaây tieâu chaûy cuûa E. coli:
(1) Saûn xuaát ñoäc toá (ETEC, EAEC, STEC)
(2) Taán coâng / xaâm laán (EIEC)
(3) Baùm dính, truyeàn tín hieäu qua maøng (EPEC vaø EHEC)
Tuy nhieân, taùc ñoäng qua laïi giöõa cô theå vaät chuû vaø maøng nhaày ruoät thì ñaëc
hieäu cho moãi loaïi (Nataro vaø Kaper, 1998).
2.1.5 Shiga toxigenic E. coli (STEC)
2.1.5.1 Thuaät ngöõ: Nhöõng höôùng khaùc nhau trong nghieân cöùu ñaõ ñöa ra
nhöõng thuaät ngöõ khaùc nhau ñeå goïi teân cho nhoùm E. coli naøy. Teân goïi
Verotoxigenic E. coli (VTEC) ñöôïc Konowalchuk vaø ctv (1977) ñaët cho nhoùm
naøy khi phaùt hieän vieäc saûn xuaát ñoäc toá gaây ñoäc cho doøng teá baøo Vero. Teân goïi
Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) laø do doøng naøy gaây vieâm keát traøng xuaát
huyeát (HC) vaø hoäi chöùng huyeát nieäu (HUS) (Nataro vaø Kaper, 1989). Vaø thuaät
ngöõ Shiga toxin-producing E. coli (STEC) (tröôùc ñaây goïi laø Shiga-like toxin-
produccing E. coli - SLTEC) chæ roõ khaû naêng saûn sinh ñoäc toá gaây ñoäc teá baøo gioáng
nhö ñoäc toá Shiga (Calderwood vaø ctv, 1996).
Download» Agriviet.com
7
STEC vaø VTEC laø hai thuaät ngöõ töông ñöông nhau, vaø caû hai ñeàu chæ ra
raèng nhoùm E. coli saûn sinh ra moät hay nhieàu loaïi ñoäc toá gaây ñoäc teá baøo. Maëc duø
vaäy khoâng phaûi chæ caàn coù gen saûn sinh ñoäc toá laø coù theå gaây beänh neáu khoâng coù
caùc yeáu toá ñoäc löïc khaùc. Nhöõng doøng E. coli mang gen sinh ñoäc toá cuõng hieän dieän
trong ruoät gia suùc khoûe maïnh vôùi moät soá löôïng raát ít, nhöng nhöõng doøng naøy thieáu
moät vaøi hay taát caû nhöõng yeáu toá ñoäc löïc khaùc cuûa STEC (Beutin vaø ctv, 1994). Do
ñoù khoâng phaûi taát caû STEC ñeàu coù khaû naêng gaây beänh (Nataro vaø Kaper, 1998).
2.1.5.2 Shiga toxin vaø nhöõng yeáu toá ñoäc löïc lieân quan ñeán ñaëc tính gaây
beänh cuûa STEC: STEC saûn xuaát ñoäc toá Shiga-like toxin (Slt), coøn goïi laø Shiga
toxin (Stx) hay Verotoxin (VT). Hoï ñoäc toá Stx goàm hai nhoùm chính khoâng phaûn
öùng cheùo vôùi nhau laø Stx1 vaø Stx2. Trong khi Stx1 coù tính baûo toàn cao thì Stx2 raát
thay ñoåi veà trình töï, taïo ra nhieàu subtype nhö Stx2c, Stx2hb, Stx2e (Calderwood
vaø ctv, 1996), Stx2g (Leung vaø ctv, 2003). Moät doøng STEC coù theå saûn sinh Stx1,
Stx2 hoaëc caû Stx1 vaø Stx2, vaø thaäm chí nhieàu daïng cuûa Stx2.
Caû hai ñoäc toá Stx1 vaø Stx2 ñeàu ñöôïc caáu taïo töø 5 tieåu ñôn vò B 7,7 kDa vaø
1 tieåu ñôn vò A 32 kDa. Tieåu ñôn vò A goàm peptide A1 28 kDa vaø peptide A2 4
kDa noái vôùi nhau baèng caàu noái disulfur. Peptide A1 coù hoaït tính enzyme vaø
peptide A2 coù nhieäm vuï gaén keát tieåu ñôn vò A vaøo nhöõng tieåu ñôn vò B. Nhöõng
tieåu ñôn vò B giuùp ñoäc toá keát hôïp vôùi receptor ñaëc hieäu Gb3
(globotriaosylceramide) hieän dieän treân beà maët cuûa nhöõng teá baøo eukaryote (Stx2e
coù receptor laø Gb4). Sau khi ñöôïc chuyeån vaøo beân trong teá baøo, tieåu ñôn vò A ñeán
teá baøo chaát vaø taùc ñoäng leân tieåu phaàn 60S cuûa ribosome. Peptide A1 coù hoaït tính
enzyme hoaït ñoäng nhö moät N-glycosidase caét moät goác adenin khoûi rRNA 28S cuûa
ribosome, do ñoù gaây trôû ngaïi cho söï toång hôïp protein. Do khoâng toång hôïp ñöôïc
protein, nhöõng teá baøo bò Stx taùc ñoäng (teá baøo noäi moâ cuûa thaän, teá baøo bieåu moâ
ruoät, teá baøo Vero, teá baøo Hela hay baát cöù teá baøo naøo coù receptor laø Gb3, receptor
Gb4 ñoái vôùi Stx2e) seõ cheát. Haäu quaû gaây ñoäc cho teá baøo ruoät do Stx vaø caùc yeáu toá
Download» Agriviet.com
8
ñoäc löïc khaùc cuûa STEC laø gaây söï hö haïi nhöõng teá baøo nhung mao ruoät, gaây tieâu
chaûy vaø vieâm keát traøng xuaát huyeát (Haemorrhagic colitis – HC). Söï hö haïi nhöõng
teá baøo thaønh maïch maùu do Stx2e seõ gaây neân hieän töôïng phuø thuûng ôû heo. Nhöõng
toån thöông ôû teá baøo noäi moâ thaän gaây neân hoäi chöùng huyeát nieäu (Haemolytic
uraemic syndrome - HUS) ôû ngöôøi.
Yeáu toá baùm dính cuûa STEC/EHEC ñaõ ñöôïc chöùng minh laø ñoùng vai troø
quan troïng trong söï ñònh vò vi khuaån ôû ruoät. Ñoù chính laø intimin, moät protein
maøng ngoaøi coù troïng löôïng phaân töû 94 – 97 kDa. Intimin ñöôïc maõ hoùa bôûi gen eae
(E. coli attaching and effacing). Intimin gaây toån thöông daïng baùm dính vaø phaù huûy
(attaching-and-effacing, A/E) ôû ruoät giaø do vi khuaån baùm chaët vaøo teá baøo bieåu
moâ (Donnerberg vaø ctv, 1993). Gen eae naøy cuõng ñöôïc tìm thaáy ôû nhoùm EPEC.
Gen eae gaây kieåu toån thöông A/E laø moät trong soá caùc gen naèm treân vuøng gaây
beänh 35,5 kb (goïi laø vuøng gaây hö haïi teá baøo ruoät – locus of enterocyte
effacement, LEE). Vuøng LEE cuûa STEC/EHEC chöùa nhöõng gen maõ hoùa cho
intimin, maõ hoùa receptor cuûa intimin Tir (translocated intimin receptor) vaø moät soá
gen khaùc. Vuøng LEE khoâng chæ laø ñieàu kieän caàn maø coøn laø ñieàu kieän ñuû cho vieäc
hình thaønh toån thöông A/E. Tuy nhieân khoâng phaûi taát caû STEC ñeàu coù gen eae,
nhöng taát caû EHEC ñeàu coù gen eae (Nataro vaø Kaper, 1998).
Beänh tích A/E phuï thuoäc vaøo töông taùc giöõa protein maøng ngoaøi cuûa vi
khuaån (intimin) vaø protein Tir. Protein Tir ñöôïc tieát ra khoûi vi khuaån, chuyeån vò
vaøo maøng cuûa teá baøo vaät chuû (Paton vaø ctv, 1996).
Yeáu toá khaùc coù lieân quan ñeán ñoäc löïc cuûa STEC laø vieäc taïo ra
enterohaemolysin (EHEC-Hly) vaø coù theå caû ñoäc toá ruoät chòu nhieät EAST1.
EHEC-Hly ñöôïc maõ hoùa bôûi gen treân plasmid 60 MDa (pO157) maø
plasmid naøy ñöôïc tìm thaáy ôû gaàn nhö taát caû caùc doøng O157:H7 vaø cuõng khaù phoå
bieán caû nhöõng doøng STEC non-O157 nöõa (Nataro vaø Kaper, 1998). Treân plasmid
Download» Agriviet.com
9
naøy coù söï hieän dieän cuûa moät operon goàm 4 khung ñoïc môû (open reading frame -
ORF) laø hlyCABD. Trong ñoù hlyA laø gen caáu truùc khôûi ñaàu cho haemolysin.
Ñoäc toá ruoät chòu nhieät EAST1 (ñaàu tieân ñöôïc moâ taû ôû nhoùm EAEC laø
EAEC heat-stable enterotoxin 1), cuõng ñöôïc tìm thaáy ôû nhieàu doøng STEC. Taàm
quan troïng cuûa EAST1 ñoái vôùi khaû naêng gaây beänh cuûa STEC vaãn chöa ñöôïc bieát,
nhöng noù coù ôû moät vaøi tröôøng hôïp tieâu chaûy khoâng coù maùu maø thöôøng thaáy ôû
nhöõng ngöôøi nhieãm STEC (Nataro vaø Kaper, 1998).
Haàu heát caùc oå dòch cuûa STEC/EHEC laø do O157:H7, neân ngöôøi ta cho raèng
coù theå serotype naøy ñoäc hôn vaø deã laây truyeàn hôn nhöõng serotype khaùc (Nataro
vaø Kaper, 1998). Tuy nhieân cuõng coù nhieàu serotype khaùc ngoaøi O157:H7 coù lieân
quan ñeán HC vaø HUS treân ngöôøi. Nhöõng serotype non-O157 phoå bieán nhaát lieân
quan ñeán beänh treân ngöôøi thuoäc O26, O91, O103, O111 (Paton, 1989). Haàu heát
tính chaát sinh hoùa cuûa E. coli O157:H7 ñeàu töông töï nhö nhöõng E. coli khaùc.
Ñieåm khaùc bieät veà sinh hoùa cuûa doøng O157:H7 laø khoâng leân men ñöôøng sorbitol
vaø β-glucuronidase döông tính. 93% chuûng E. coli thì leân men sorbitol trong 24
giôø, trong khi E. coli O157:H7 laïi khoâng. 93% chuûng E. coli cho β-glucuronidase
döông tính trong khi E. coli O157:H7 thì khoâng. Ngoaøi ra trong moâi tröôøng TSB,
O157:H7 phaùt trieån nhanh ôû 30 – 42oC, taêng tröôûng khoù khaên ôû 43 – 44oC vaø
ngöøng taêng tröôûng ôû 45oC (daãn lieäu bôûi Traàn Thanh Phong, 1998).
Lieàu gaây nhieãm cuûa E. coli O157:H7 laø raát nhoû, töø 10 – 100 vi khuaån
(Griffin, 1994; Paton, 1996), nhöng cuõng may maén laø E. coli O157 hieän dieän trong
phaân, thöïc phaåm vôùi taàn soá thaáp hôn nhieàu so vôùi nhoùm non-O157 (Paton, 1998).
Ñaây cuõng laø trôû ngaïi cho vieäc phaùt hieän E. coli O157:H7. Döïa vaøo nhöõng tính
chaát rieâng bieät cuûa doøng E. coli naøy, nhieàu moâi tröôøng taêng sinh vaø choïn loïc ñaõ
ñöôïc taïo ra ñeå phaùt hieän O157:H7 trong thöïc phaåm. Ngöôøi ta duøng moâi tröôøng
taêng sinh coù boå sung theâm khaùng sinh cefixime, cefsulodin, vancomycin ñeå haïn
cheá söï taêng tröôûng cuûa nhöõng vi truøng Gram aâm khaùc. Sau ñoù söû duïng moâi tröôøng
Download» Agriviet.com
10
tuyeån löïa ñeå phaùt hieän nhoùm E. coli O157. Thöôøng nhaát laø moâi tröôøng SMAC
hoaëc SMAC coù boå sung cefixime vaø tellurite (CT-SMAC) (FDA, 2002).
2.1.5.3 Nguoàn laây nhieãm: STEC coù theå ñöôïc tìm thaáy trong phaân cuûa
nhieàu loaøi ñoäng vaät nhö traâu boø, cöøu, deâ, heo, choù vaø meøo (Beutin, 1993; Beutin,
1995; Chapman, 1997) vaø ngöïa (Chalmer, 1997). Loaøi ñoäng vaät quan troïng nhaát
trong vieäc gaây nhieãm cho ngöôøi laø traâu boø. Ñöôøng gaây nhieãm chuû yeáu cuûa STEC
vaøo thöïc phaåm laø vieäc vaáy nhieãm chöùa vaät ñöôøng tieâu hoùa vaø phaân vaøo thòt trong
quaù trình gieát moå (Paton, 1998). STEC laây truyeàn qua ngöôøi chuû yeáu baèng con
ñöôøng thöïc phaåm, nöôùc vaø töø ngöôøi qua ngöôøi. Haàu heát caùc tröôøng hôïp laø do aên
thöïc phaåm ñaõ bò nhieãm, ñaëc bieät laø thöïc phaåm coù nguoàn goác ñoäng vaät, maø thòt boø
laø nguyeân nhaân chuû yeáu (Keskimaki, 2001).
2.1.6 Enteropathogenic E. coli (EPEC)
EPEC laø nhoùm E. coli gaây tieâu chaûy quan troïng coù lieân quan ñeán tieâu chaûy
ôû treû sô sinh taïi nhöõng nöôùc ñang phaùt trieån.
Daáu hieäu cuûa söï nhieãm beänh do EPEC laø hình thaønh beänh tích kieåu A/E
(attaching-and-effacing, A/E), coù theå quan saùt ñöôïc treân maãu sinh thieát ruoät töø
nhöõng beänh nhaân hay thuù bò nhieãm beänh vaø trong nuoâi caáy teá baøo (daãn lieäu
Nataro vaø Kaper, 1998). Kieåu hình rieâng bieät naøy ñöôïc ñaëc tröng bôûi söï hö haïi
cuûa caùc vi nhung mao vaø söï keát dính chaët giöõa vi khuaån vaø maøng teá baøo bieåu moâ.
Daïng toån thöông naøy khaùc vôùi daïng toån thöông do doøng ETEC vaø Vibrio cholerae
(ETEC vaø V. cholerae baùm theo kieåu khoâng chaët, khoâng gaây baøo moøn vi nhung).
Maëc duø nhöõng nghieân cöùu tröôùc ñaây ñaõ baùo caùo veà nhöõng toån thöông moâ beänh
hoïc daïng naøy, nhöng cho ñeán khi Moon vaø ctv (1983) baùo caùo raèng kieåu toån
thöông naøy coù lieân quan roäng raõi ñeán EPEC thì thuaät ngöõ “gaén keát vaø gaây hö haïi”
(“attaching and effacing” – A/E) môùi ñöôïc ñöa ra. Gen caàn thieát cho vieäc taïo ra
toån thöông A/E laø gen eae maõ hoùa protein intimin. Protein naøy laø yeáu toá ñoäc löïc
caàn thieát cuûa EPEC (Donnerberg, 1993). Theo Nataro vaø Kaper (1998), gen eae
Download» Agriviet.com
11
hieän dieän ôû taát caû caùc chuûng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium vaø Hafnia
alvei; nhöng khoâng hieän dieän ôû nhöõng doøng E. coli thuoäc heä vi khuaån ñöôøng ruoät
thoâng thöôøng.
Ñaùp öùng vieâm taïi choã vaø söï taêng tính thaám cuûa ruoät trong ñaùp öùng vôùi
EPEC goùp phaàn vaøo tieâu chaûy (Nataro vaø Kaper, 1998). Ñieåm ñaùng löu yù nhaát veà
maët dòch teã hoïc cuûa beänh do EPEC veà söï phaân boá veà löùa tuoåi cuûa ngöôøi beänh.
Beänh chuû yeáu xaûy ra treân treû em döôùi 2 tuoåi. Beänh thöôøng bieåu hieän caáp tính vôùi
tieâu chaûy nghieâm troïng. Lyù do lieân quan ñeán khaû naêng ñeà khaùng ñöôïc ôû ngöôøi
tröôûng thaønh vaø treû em lôùn coøn chöa ñöôïc bieát roõ, nhöng coù leõ laø do söï maát caùc
receptor ñaëc hieäu. Tuy nhieân EPEC cuõng coù theå gaây tieâu chaûy ôû ngöôøi lôùn neáu soá
löôïng vi khuaån ñuû lôùn (Nataro vaø Kaper, 1998).
2.1.7 Enterotoxigenic E. coli (ETEC)
2.1.7.1 Caùc yeáu toá ñoäc löïc: Nhoùm ETEC coù hai nhoùm quyeát ñònh ñoäc löïc
chính laø ñoäc toá ruoät (enterotoxin) vaø yeáu toá ñònh vò (colonization factor – CF).
Ñoäc toá ruoät enterotoxin
Nhoùm ETEC goàm nhöõng E. coli taïo ra ít nhaát moät trong hai loaïi ñoäc toá
ñöôøng ruoät laø ST vaø LT.
ETEC thöôøng ñöôïc xem laø ñaïi dieän cuûa cô cheá gaây beänh baèng caùch vi
khuaån baùm vaøo beà maët maøng nhaày ruoät non vaø tieát ra ñoäc toá ruoät, laøm gia taêng
tình traïng tieát dòch. Nhoùm ETEC gaây tieâu chaûy thoâng qua söï tieát ñoäc toá ñöôøng
ruoät LT vaø ST. E. coli nhoùm naøy coù theå chæ tieát ñoäc toá LT, hoaëc chæ tieát ST, hoaëc
coù theå tieát caû LT vaø ST.
(1) Ñoäc toá khoâng chòu nhieät (Heat-labile toxin - LT): Ñoäc toá LT cuûa E.
coli laø oligopeptide coù lieân heä gaàn guõi veà maët caáu truùc vaø chöùc naêng vôùi ñoäc toá taû
(cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tieát ra. LT vaø CT gioáng nhau nhieàu ñaëc
tính nhö caáu truùc, trình töï acid amin (gioáng nhau khoaûng 80%), töông ñoàng veà
receptor, hoaït tính enzym, vaø taùc ñoäng cuûa noù treân thuù hay nuoâi caáy teá baøo. LT coù
Download» Agriviet.com
12
2 serogroup chính laø LT-I vaø LT-II. LT-I vaø LT-II khoâng coù phaûn öùng cheùo veà
maët mieãn dòch.
LT-I ñöôïc tieát bôûi nhöõng doøng E. coli gaây beänh treân ngöôøi vaø thuù. Coøn LT-
II ñöôïc tìm thaáy chuû yeáu ôû E. coli treân thuù vaø hieám khi ôû ngöôøi. Veà maët khaùi
nieäm, tröø khi ñi keøm vôùi chöõ soá la maõ thì teân goïi LT duøng ñeå chæ LT-I (Nataro vaø
Kaper, 1998).
- LT-I: LT-I laø moät oligopeptide khoaûng 86 kDa, ñöôïc caáu taïo bôûi 1 tieåu
ñôn vò A 28 kDa vaø 5 tieåu ñôn vò B 11,5 kDa. Tieåu ñôn vò A chòu traùch nhieäm
trong hoaït tính enzym cuûa ñoäc toá goàm peptide A1 vaø peptide A2 lieân keát nhau bôûi
caàu noái disulfur. Nhöõng tieåu ñôn vò B saép xeáp thaønh voøng nhaãn, lieân keát chaéc
chaén vôùi ganglioside GM1 vaø lieân keát loûng leûo vôùi GD1b vaø vaøi glycoprotein ruoät
– chuùng laø caùc receptor cuûa LT. Hai loaïi LT-I coù lieân heä gaàn nhau vaø coù theå phaûn
öùng cheùo moät phaàn vôùi nhau laø LTp (LTp-I) ñaàu tieân ñöôïc phaân laäp töø heo vaø
LTh (LTh-I) ñöôïc phaân laäp töø ngöôøi. Gen maõ hoùa cho LT laø elt hay lt-I naèm treân
plasmid maø plasmid naøy coù theå chöùa caû gen maõ hoùa ST vaø/hoaëc gen maõ hoùa
nhöõng khaùng nguyeân cuûa yeáu toá ñònh vò (colonization factor antigen - CFA).
Sau khi ñoäc toá ñi vaøo noäi baøo, chuùng di chuyeån trong teá baøo nhôø heä thoáng
vaän chuyeån cuûa Golgi (Golgi vaän chuyeån). Ñích cuûa LT trong teá baøo laø enzym
adenylate cyclase naèm ôû lôùp maøng ngoaøi cuûa teá baøo bieåu moâ ruoät. Peptide A1 coù
hoaït tính ADP-ribosyltransferase chuyeån phaàn ADP-ribosyl töø NAD ñeán cuûa
protein lieân keát GTP (GTP-binding protein) laø GS, gaây hoaït hoùa enzyme
adenylate cyclase, laøm gia taêng AMP voøng (cAMP) trong teá baøo. Vì vaäy enzyme
cAMP-dependent protein kinase (A kinase) ñöôïc hoïat hoùa daãn ñeán söï phosphoryl
hoùa keânh chloride (Cl-) ôû maøng teá baøo bieåu moâ vöôït quaù möùc bình thöôøng. Keát
quaû daây chuyeàn laø kích thích teá baøo beân döôùi tieát Cl- vaø ngaên caûn söï haáp thuï
NaCl bôûi nhöõng teá baøo coù loâng nhung. Haøm löôïng ion trong loøng ruoät gia taêng
Download» Agriviet.com
13
keùo theo söï di chuyeån thuï ñoäng cuûa nöôùc töø teá baøo vaøo loøng ruoät, gaây tieâu chaûy
(Nataro vaø Kaper, 1998).
Maëc duø söï kích thích cuûa Cl- do söï gia taêng löôïng cAMP trong teá baøo laø
caùch giaûi thích coå ñieån veà cô cheá gaây tieâu chaûy cuûa LT vaø CT, ngaøy caøng coù
nhieàu baèng chöùng cho thaáy raèng ñaùp öùng taêng tieát ñoái vôùi nhöõng ñoäc toá naøy coù cô
cheá phöùc taïp hôn. Moät cô cheá taùc ñoäng khaùc cuûa ñoäc toá coù lieân quan ñeán nhöõng
prostaglandin E (PGE1 vaø PGE2) vaø yeáu toá hoaït hoùa tieåu caàu. Söï toång hôïp vaø
phoùng thích nhöõng chaát chuyeån hoùa cuûa acid arachidonic nhö prostaglandin vaø
leukotriene coù theå kích thích söï vaän chuyeån caùc chaát ñieän giaûi vaø kích thích nhu
ñoäng ruoät. Cô cheá taùc ñoäng khaùc thöù hai coù lieân quan ñeán heä thaàn kinh ruoät
(enteric nervous system – ENS) ñieàu hoøa nhu ñoäng vaø söï tieát ion ôû ruoät. Cô cheá
thöù ba laø CT vaø LT gaây ñaùp öùng vieâm ruoät daïng nheï.
- LT-II: Nhoùm LT-II gioáng vôùi LT-I vaø CT khoaûng 55 - 57% ôû tieåu ñôn vò
A, nhöng khoâng gioáng vôùi LT-I vaø CT ôû tieåu ñôn vò B. LT-II laøm gia taêng cAMP
trong teá baøo qua cô cheá töông töï nhö LT-I, nhöng LT-II söû duïng GD1 laøm
receptor thay vì GM1. Nhö ñaõ noùi ôû treân, LT-II khoâng coù lieân quan ñeán beänh treân
ngöôøi vaø thuù.
(2) Ñoäc toá chòu nhieät (Heat-stable toxin - ST): Ngöôïc vôùi LT, ST coù
troïng löôïng phaân töû nhoû vaø nhöõng caàu noái disulfur cuûa noù giaûi thích cho khaû naêng
chòu nhieät cuûa ñoäc toá naøy. ST ñöôïc chia thaønh 2 nhoùm laø STa vaø STb, khaùc nhau
veà caáu truùc vaø cô cheá hoaït ñoäng. Gen maõ hoùa cho caû 2 nhoùm ñöôïc tìm thaáy chuû
yeáu treân plasmid vaø vaøi gen maõ hoùa ST cuõng ñöôïc tìm thaáy treân transposon. STa
(hay coøn goïi laø ST-I) ñöôïc taïo bôûi ETEC vaø moät vaøi vi khuaån Gram aâm khaùc goàm
Yersinia enterocolitica vaø V. cholerae khoâng phaûi O1. ST gioáng 50% trình töï acid
amin vôùi ñoäc toá chòu nhieät EAST1 cuûa EAEC. Gaàn ñaây, coøn coù baùo caùo cho raèng
moät vaøi doøng cuûa ETEC cuõng coù theå saûn sinh ñoäc toá EAST1 ngoaøi ñoäc toá STa.
Coøn STb chæ ñöôïc tìm thaáy ôû ETEC.
Download» Agriviet.com
14
- STa: STa laø moät peptide goàm 18 -19 amino acid vôùi troïng löôïng phaân töû
khoaûng 2 kDa. STa ñöôïc chia thaønh 2 loaïi laø STp (ST porcine hay STIa) phaân laäp
ñöôïc ñaàu tieân treân heo vaø STh (ST human hay STIb) phaân laäp treân ngöôøi. Caû 2
loaïi ñoäc toá coù theå ñöôïc tìm thaáy ôû doøng ETEC ngöôøi.
Receptor chính cuûa STa laø enzyme xuyeân maøng guanylate cyclase C (GC-
C) thuoäc hoï nhöõng enzyme receptor cyclase. Söï keát hôïp cuûa STa vaøo GC-C kích
thích hoaït tính GC, daãn ñeán vieäc gia taêng löôïng cGMP noäi baøo. Hoaït ñoäng naøy
cuoái cuøng daãn ñeán söï kích thích tieát Cl- vaø/hoaëc ngaên caûn söï haáp thuï NaCl, gaây
ra söï tieát chaát loûng trong ruoät.
- STb: STb chuû yeáu coù lieân quan ñeán doøng ETEC phaân laäp töø heo maëc duø
cuõng coù baùo caùo veà vaøi chuûng ETEC ngöôøi cuõng saûn sinh STb. Khoâng nhö STa,
STb gaây ra nhöõng toån thöông veà maët moâ hoïc treân lôùp bieåu moâ ruoät nhö maát teá
baøo nhung mao cuûa bieåu moâ ruoät vaø teo nhung mao moät phaàn. Receptor cuûa STb
chöa ñöôïc bieát roõ maëc duø gaàn ñaây ngöôøi ta cho raèng ñoäc toá coù theå keát hôïp khoâng
ñaëc hieäu vôùi maøng teá baøo chaát tröôùc khi vaøo trong teá baøo. Khoâng taïo ra söï tieát Cl-
nhö STa, STb kích thích teá baøo ruoät tieát bicarbonat (HCO3-). STb khoâng laøm taêng
cAMP hay cGMP noäi baøo maëc duø noù kích thích taêng löôïng calci noäi baøo töø ngoaïi
baøo. STb cuõng kích thích phoùng thích PGE2 vaø serotonin, töø ñoù ngöôøi ta cho raèng
ENS coù theå cuõng coù lieân quan ñeán ñaùp öùng tieát gaây ra bôûi ñoäc toá naøy
(Hitotsubashi, 1992).
Yeáu toá ñònh vò (colonization factor – CF): Cô cheá maø ETEC keát dính vaø
cö truù treân lôùp maøng nhaày ruoät ñaõ ñöôïc nghieân cöùu kyõ. Ñeå gaây tieâu chaûy, ETEC
ñaàu tieân phaûi keát dính vaøo teá baøo ruoät non nhôø vaøo loâng treân beà maët cuûa vi
khuaån, goïi laø yeáu toá ñònh vò (CF).
CFA coù theå ñöôïc phaân loaïi döïa treân ñaëc tính hình thaùi. Coù 3 loaïi chính
goàm loaïi loâng hình que cöùng, loâng hình que meàm coù daïng boù, loâng coù caáu truùc
maûnh meàm. Gen cuûa CFA thöôøng ñöôïc maõ hoùa treân plasmid, cuõng laø nôi maõ hoùa
Download» Agriviet.com
15
cho ñoäc toá ST vaø/hoaëc LT. Tieåu ñôn vò caáu truùc loâng thöôøng taïo mieãn dòch vöôït
troäi vaø do ñoù tieåu ñôn vò coù tính khaùng nguyeân maïnh nhaát.
2.1.7.2 Dòch teã
Doøng ETEC lieân quan ñeán 2 hoäi chöùng laâm saøng chính: tieâu chaûy treân treû
em thoâi buù ôû nhöõng nöôùc ñang phaùt trieån vaø tieâu chaûy ôû du khaùch. Dòch teã cuûa
beänh do ETEC ñöôïc quyeát ñònh bôûi nhieàu yeáu toá: (1) mieãn dòch taïi maøng nhaày
ñoái vôùi söï nhieãm ETEC khaùc nhau ôû töøng caù theå, (2) nhöõng ngöôøi nhieãm khoâng
coù bieåu hieän trieäu chöùng vaãn baøi thaûi moät löôïng lôùn vi khuaån qua phaân, vaø (3)
vieäc nhieãm chæ ñaït ñöôïc khi lieàu gaây nhieãm khaù cao. Ba ñaëc tính naøy taïo neân tình
traïng oâ nhieãm ETEC trong moâi tröôøng ôû nhöõng vuøng coù dòch vaø haàu heát treû em
trong vuøng naøy seõ ñöông ñaàu vôùi ETEC ôû thôøi kyø thoâi buù. Treû em ñaõ ôû tuoåi ñeán
tröôøng vaø ngöôøi lôùn coù nguy cô tieâu chaûy do ETEC raát thaáp. Doøng ETEC saûn sinh
ST laø nguyeân nhaân cuûa haàu heát caùc tröôøng hôïp dòch beänh.
Caùc nghieân cöùu dòch teã hoïc cho thaáy raèng thöùc aên vaø nöôùc bò oâ nhieãm laø
nhöõng phöông tieän chuû yeáu gaây nhieãm ETEC (Black, 1981). Söï nhieãm ETEC ôû
nhöõng vuøng dòch thöôøng taäp trung chuû yeáu vaøo nhöõng thaùng aám vaø aåm, khi ñoù thì
söï nhaân leân cuûa ETEC trong thöïc phaåm vaø nöôùc laø lyù töôûng nhaát.
Maëc duø söï nhieãm ETEC xaûy ra chuû yeáu treân treû em, nhöng nhöõng ngöôøi
tröôûng thaønh chöa coù mieãn dòch cuõng coù theå nhieãm. Thöïc vaäy ETEC laø nguyeân
nhaân chính gaây tieâu chaûy treân du khaùch tröôûng thaønh töø nhöõng nöôùc ñaõ phaùt trieån
ñeán thaêm nhöõng vuøng nhieãm dòch ETEC. Nhieàu nghieân cöùu cho raèng 20 - 60% soá
du khaùch naøy coù trieäu chöùng tieâu chaûy vaø 20 - 40% caùc tröôøng hôïp laø do ETEC.
Vieäc tieâu chaûy treân du khaùch thöôøng xaûy ra ôû nhöõng du khaùch laàn ñaàu tieân ñeán
thaêm nhöõng nöôùc ñang phaùt trieån. Tieâu chaûy treân du khaùch thöôøng laø do thöùc aên
vaø nöôùc uoáng bò oâ nhieãm.
Download» Agriviet.com
16
2.1.7.3 Khía caïnh laâm saøng
Trieäu chöùng beänh thöôøng xaûy ra ñoät ngoät vôùi thôøi gian nung beänh ngaén (14
– 50 giôø). Beänh nhaân tieâu chaûy nhö nöôùc, thöôøng khoâng coù maùu; moät vaøi beänh
nhaân coù hieän töôïng soát vaø oùi möõa. Tieâu chaûy do ETEC coù theå nheï, ngaén vaø töï bôùt
daàn nhöng cuõng coù theå gaây ra tieâu chaûy xoå nghieâm troïng gioáng nhö nhieãm Vibrio
cholerae.
Haàu heát caùc tröôøng hôïp nhieãm ETEC nguy hieåm ñeán tính maïng xaûy ra treân
treû em thoâi buù ôû nhöõng nöôùc ñang phaùt trieån. Maëc duø vieäc söû duïng khaùng sinh
nhaïy caûm cuõng laøm giaûm thôøi gian vaø möùc ñoä tieâu chaûy, nhöng nhöõng thuoác trò coù
hieäu quaû thì khoâng saün coù ôû nhöõng vuøng nguy cô cao; ngoaøi ra söï ñeà khaùng khaùng
sinh cuûa doøng ETEC cuõng laø vaán ñeà ñaùng quan taâm. Do ñoù caàn phaûi löu yù raèng cô
sôû cuûa vieäc chaêm soùc beänh nhaân nhieãm ETEC laø duy trì ñuû löôïng nöôùc trong cô
theå neáu coù trieäu chöùng tieâu chaûy.
2.1.8 Enteroaggregative E. coli (EAEC hay EAggEC)
EAEC hay EaggEC laø nhoùm E. coli khoâng sinh enterotoxin vaø baùm dính
vaøo teá baøo Hep-2 theo kieåu baùm dính keát taäp (aggregative adhesion – A/A).
Nhoùm EAEC goàm caû doøng E. coli gaây beänh vaø khoâng gaây beänh. Taát caû caùc
EAEC ñeàu coù plasmid 60 MDa chöùa gen taïo toån thöông daïng A/A vaø gen maõ hoùa
cho ñoäc toá ruoät chòu nhieät EAST1 (EAEC heat-stable enterotoxin 1). Vai troø cuûa
EAST1 trong tieâu chaûy chöa roõ raøng, nhöng gen maõ hoùa A/A treân plasmid laø caàn
thieát cho quaù trình gaây beänh (Baudry 1990). Ngoaøi ra EAEC coøn coù nhöõng yeáu toá
ñoäc löïc khaùc nhö haemolysin, caùc ñoäc toá vaø caùc yeáu toá coù lieân quan ñeán quaù trình
baùm dính nhö loâng vaø nhöõng protein maøng ngoaøi.
EAEC gaây tieâu chaûy keùo daøi (treân 14 ngaøy). Trong haàu heát caùc baùo caùo
ñeàu moâ taû EAEC ôû caùc ca tieâu chaûy leû teû, nhöng EAEC cuõng coù theå laø taùc nhaân
gaây thaønh oå dòch (daãn lieäu Keskimaki, 2001).
Download» Agriviet.com
17
2.1.9 Enteroinvasive E. coli (EIEC)
Nhöõng E. coli doøng EIEC thöôøng khoâng ñieån hình veà caùc ñaëc tính sinh hoùa
vaø khoù xaùc ñònh. EIEC raát gioáng vôùi Shigella veà maët khaùng nguyeân, sinh hoùa vaø
ñaëc tính gaây beänh. Trieäu chöùng laâm saøng cuûa beänh bao goàm soát, ñau buïng quaën,
khoù chòu, nhieãm truøng maùu vaø tieâu chaûy nhö nöôùc hay beänh lî ñieån hình vôùi maùu,
dòch nhaày vaø nhieàu baïch caàu trong phaân. Caû Shigella spp vaø EIEC ñeàu coù khaû
naêng xaâm nhaäp vaøo teá baøo bieåu moâ keát traøng vaø chuùng ñeàu tieát moät hay nhieàu
ñoäc toá ruoät lieân quan ñeán tieâu chaûy (Nataro vaø Kaper, 1998). EIEC cuõng coù theå
gaây tieâu chaûy ôû khaùch du lòch vaø lieân quan ñeán nhöõng vuï ngoä ñoäc thöïc phaåm do
aên phaûi thöùc aên bò oâ nhieãm.
Toùm laïi, moät soá gen ñoäc löïc quan troïng cuûa nhöõng nhoùm E. coli goàm:
STT Gen ñoäc löïc Nhoùm E. coli
1 eae EPEC, STEC
2 hly STEC
3 stx1 STEC
4 stx2 STEC
5 stx2e STEC
6 sta ETEC
7 stb ETEC
8 lt-I ETEC
Vieäc phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli thöôøng ñöôïc thöïc hieän döïa treân
nhöõng kyõ thuaät sinh hoïc phaân töû, ñaëc bieät laø kyõ thuaät PCR.
2.2 Kyõ thuaät PCR
2.2.1 Nguyeân taéc
PCR (polymerase chain reaction – phaûn öùng toång hôïp daây chuyeàn nhôø
polymerase) do Karl Mullis vaø coäng söï phaùt minh naêm 1985. Ñaây laø kyõ thuaät in
vitro cho pheùp nhaân nhanh moät gen mong muoán leân haøng trieäu laàn trong thôøi gian
ngaén (taïo doøng in vitro, khoâng caàn hieän dieän cuûa teá baøo).
Download» Agriviet.com
18
Taát caû caùc DNA polymerase khi hoaït ñoäng toång hôïp moät maïch DNA môùi
töø maïch khuoân ñeàu caàn söï hieän dieän cuûa nhöõng moài chuyeân bieät. Moài laø nhöõng
ñoaïn DNA ngaén, coù khaû naêng baét caëp boå sung vôùi moät ñaàu cuûa maïch khuoân, vaø
DNA polymerase seõ noái daøi moài ñeå hình thaønh maïch môùi. Caùc moài naøy goàm coù
moài “xuoâi” (forward primer: moài taùc ñoäng leân sôïi 3’→ 5’) vaø moài “ngöôïc”
(reverse primer: moài taùc ñoäng leân sôïi 5’→ 3’).
2.2.2 Caùc giai ñoaïn cuûa phaûn öùng PCR
Phaûn öùng PCR laø moät chuoãi nhieàu chu kyø noái tieáp nhau. Moãi chu kyø goàm 3
böôùc:
Böôùc 1 (giai ñoaïn bieán tính - denaturation): hai maïch cuûa phaân töû DNA
taùch rôøi nhau thaønh hai maïch ñôn. Phaân töû DNA ñöôïc bieán tính ôû nhieät ñoä cao
hôn nhieät ñoä noùng chaûy (Tm) cuûa phaân töû, thöôøng laø ôû 94 – 950 C trong voøng 30
giaây ñeán 1 phuùt.
Böôùc 2 (giai ñoaïn uû baét caëp – anealing): Nhieät ñoä ñöôïc haï thaáp (thaáp hôn
Tm cuûa caùc moài) cho pheùp caùc moài baét caëp vôùi khuoân, trong thöïc nghieäm nhieät
ñoä naøy dao ñoäng trong khoaûng 40 – 600C tuyø thuoäc Tm cuûa caùc moài söû duïng vaø
keùo daøi töø 30 giaây ñeán 1 phuùt.
Böôùc 3 (giai ñoaïn keùo daøi – elongation hay extension): nhieät ñoä ôû giai
ñoaïn naøy ñöôïc taêng leân 720C giuùp DNA polymerase hoaït ñoäng toång hôïp DNA toát
nhaát vôùi söï hieän dieän cuûa 4 deoxyribonucleotide triphosphate. Ñoaïn DNA naèm
giöõa hai moài ñöôïc toång hôïp taïo thaønh chuoãi DNA.
Moãi chu kyø goàm 3 böôùc treân seõ ñöôïc laëp ñi laëp laïi nhieàu laàn vaø moãi laàn laïi
laøm taêng gaáp ñoâi löôïng DNA maãu cuûa laàn tröôùc. Toång DNA khueách ñaïi ñöôïc tính
theo coâng thöùc:
Toång DNA khuyeách ñaïi = m * 2n
Vôùi n laø soá chu kyø, m laø soá baûn sao cuûa chuoãi maõ hoùa.
Download» Agriviet.com
19
* Soá chu kyø cuûa phaûn öùng PCR
Trong thöïc teá, khoâng vöôït quaù 40 chu kyø trong moät phaûn öùng, vì phaûn öùng
PCR dieãn ra qua hai giai ñoaïn:
Giai ñoaïn ñaàu, soá löôïng baûn sao taêng theo caáp soá nhaân, tyû leä vôùi löôïng
maãu ban ñaàu.
Giai ñoaïn sau ñoù, hieäu quaû khueách ñaïi giaûm haún do:
+ Phaân huûy vaø caïn kieät caùc thaønh phaàn cuûa phaûn öùng.
+ Xuaát hieän caùc saûn phaåm phuï öùc cheá laïi phaûn öùng.
+ Caùc baûn sao vöøa toång hôïp khoâng keát hôïp vôùi moài maø laïi baét caëp vôùi
nhau.
Soá chu kyø cuûa phaûn öùng tuøy thuoäc soá löôïng maãu ban ñaàu. Soá baûn maãu 105
thì caàn khoaûng 25 – 30 chu kyø, soá baûn maãu 102 – 103 thì soá chu kyø phaûi laø 35 – 40.
2.2.3 Caùc thaønh phaàn cuûa moät phaûn öùng PCR
- DNA maãu: laø thaønh phaàn caàn khueách ñaïi.
- Moài (primer): Moài laø nhöõng ñoaïn oligonucleotide maïch ñôn, coù trình töï
boå sung vôùi trình töï base cuûa hai ñaàu maïch khuoân ñeå khôûi ñaàu quaù trình toång hôïp
DNA. Vieäc choïn moài laø giai ñoaïn quyeát ñònh cuûa phaûn öùng PCR. Caùc moài ñöôïc
choïn phaûi ñaëc tröng cho trình töï DNA caàn khueách ñaïi, khoâng truøng vôùi caùc trình
töï laëp laïi treân gen, khoâng coù söï baét caëp boå sung giöõa moài xuoâi vaø moài ngöôïc vaø
cuõng khoâng coù nhöõng caáu truùc keïp toùc do söï baét caëp boå sung trong cuøng moät moài.
Chieàu daøi caùc moài toái thieåu cho haàu heát caùc öùng duïng PCR laø 18 nucleotide
(thöôøng laø 18 – 24 nucleotide). Trình töï naèm giöõa hai moài “xuoâi” vaø “ngöôïc”
khoâng quaù lôùn, phaûn öùng PCR seõ toái öu treân nhöõng trình töï nhoû hôn 1Kb.
- Taq polymerase: Taq polymerase laø moät DNA polymerase chòu nhieät,
ñöôïc chieát taùch töø vi khuaån Thermus aquaticus ôû suoái nöôùc noùng. Taq DNA
polymerase khoâng bò phaù huûy ôû nhieät ñoä cao vaø xuùc taùc söï toång hôïp töø ñaàu ñeán
Download» Agriviet.com
20
cuoái quaù trình phaûn öùng döôùi söï hieän dieän cuûa Mg2+. Taq DNA polymerase toång
hôïp DNA theo höôùng 5’ → 3’ vaø hoaït ñoäng toát nhaát ôû 70 - 720 C.
- Caùc nucleotide (dNTP- deoxyribonucleotide triphosphate): Laø hoãn hôïp 4
loaïi: dATP, dTTP, dCTP, dGTP laøm nguyeân lieäu cho phaûn öùng toång hôïp DNA.
- Dung dòch ñeäm: Thaønh phaàn dung dòch ñeäm coù theå thay ñoåi tuyø loaïi
enzyme ñöôïc söû duïng, quan troïng nhaát laø ion Mg2+. Noù hình thaønh moät phöùp hôïp
hoaø tan vôùi dNTP, raát caàn cho quaù trình lieân keát caùc dNTP, xuùc taùc cho emzyme
polymerase, laøm taêng nhieät ñoä noùng chaûy (Tm) cuûa DNA maïch ñoâi. Noàng ñoä
Mg2+ (thöôøng ñöôïc söû duïng ôû daïng MgCl2) laø moät yeáu toá aûnh höôûng maïnh ñeán
hieäu quaû vaø tính ñaëc hieäu cuûa phaûn öùng PCR. Ngoaøi ra noàng ñoä MgCl2 coù theå aûnh
höôûng ñeán quaù trình baét caëp cuûa moài, nhieät ñoä ñeå bieán tính DNA thaønh daây ñôn,
hoaït ñoäng cuûa enzyme vaø söï trung thöïc cuûa keát quaû. Noàng ñoä Mg2+ phaûi ñöôïc xaùc
ñònh cho töøng phaûn öùng qua nhieàu thöû nghieäm. Noàng ñoä MgCl2 trong hoån hôïp
phaûn öùng cuoái cuøng thöôøng bieán thieân töø 0,5 – 5mM (Hoà Huyønh Thuøy Döông,
1998).
Download» Agriviet.com
21
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
A
B
C
AND KHUOÂN MAÃU
Laëp laïi
n voøng
Hình 2.1 Nguyeân lyù cuûa phaûn öùng PCR
A : Bieán tính – taùch rôøi 2 maïch cuûa phaân töû DNA
B : UÛ baét caëp – caëp moài chuyeân bieät baét caëp vôùi khuoân
C : Keùo daøi – DNA polymerase toång hôïp maïch môùi keå töø moài ñaõ baét caëp
döôùi söï hieän dieän cuûa 4 loaïi dNTP vaø chaát ñeäm thích hôïp
Thôøi gian
(phuùt)
Nhieät ñoä (0C)
40
50
60
70
90
100
80
1 2 3 4 5 6
Laëp laïi n laàn 1 chu kyø
A
B
C
94 – 95 0C
40 – 60 0C
72 0C
Hình 2.2 Chu kyø nhieät ñoä cuûa phaûn öùng PCR
Download» Agriviet.com
22
2.2.4 Phaân tích keát quaû PCR
Saûn phaåm cuûa phaûn öùng PCR (ñoaïn DNA ñöôïc khueách ñaïi) seõ ñöôïc phaùt
hieän baèng phöông phaùp ñieän di.
Nguyeân taéc cuûa phöông phaùp ñieän di laø döïa vaøo ñaëc tính caáu truùc cuûa caùc
DNA. DNA laø caùc ñaïi phaân töû tích ñieän aâm ñoàng ñeàu treân khaép beà maët neân khi
chòu taùc ñoäng cuûa moät ñieän tröôøng, chuùng seõ di chuyeån veà cöïc döông cuûa ñieän
tröôøng. Söï di chuyeån cuûa phaân töû trong baûn gel döôùi taùc ñoäng cuûa moät ñieän
tröôøng phuï thuoäc vaøo khoái löôïng phaân töû (töùc laø soá nucleotide) vaø noàng ñoä caùc
chaát caáu thaønh gel, ñieän theá.
Ñieän di ñöôïc thöïc hieän theo phöông naèm ngang hoaëc ñöùng. Caùc DNA trong
gel agarose ñöôïc hieän hình döôùi tia töû ngoaïi (UV) nhôø ethidium bromide, chaát
naøy coù khaû naêng gaén xen giöõa caùc base cuûa acid nucleic vaø phaùt huyønh quang
döôùi taùc duïng cuûa tia UV (böôùc soùng λ = 300 nm) thaønh vaïch maøu ñoû da cam.
Ñeå öôùc löôïng kích thöôùc DNA baèng gel agarose, ngöôøi ta söû duïng moät
“yeáu toá ñaùnh daáu troïng löôïng phaân töû” (molecular weight marker – MWM) laø
moät taäp hôïp nhieàu trình töï DNA coù kích thöôùc ñaõ bieát (DNA ladder).
2.3 Multiplex – PCR
Multiplex - PCR laø moät caûi tieán cuûa kyõ thuaät PCR maø trong ñoù coù theå nhaân
leân ñoàng thôøi nhieàu ñoaïn DNA mong muoán baèng caùch söû duøng ñoàng thôøi nhieàu
caëp moài trong moät phaûn öùng. Multiplex - PCR ñaàu tieân ñöôïc moâ taû bôûi
Chamberlain naêm 1988 vaø keå töø ñoù multiplex - PCR ñöôïc öùng duïng raát nhieàu
trong caùc lónh vöïc kieåm tra DNA (Protocol online).
Download» Agriviet.com
23
Chöông 3
NOÄI DUNG VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU
3.1 Thôøi gian vaø ñòa ñieåm thöïc hieän
Thôøi gian
Ñeà taøi ñöôïc thöïc hieän töø ngaøy 01/03/2004 ñeán ngaøy 30/11/2004.
Ñòa ñieåm
- Maãu khaûo saùt ñöôïc laáy töø caùc chôï leû, loø moå, hoä - traïi chaên nuoâi ôû TP. Hoà
Chí Minh vaø Long An.
- Vieäc nuoâi caáy, phaân laäp vi khuaån ñöôïc thöïc hieän taïi Phoøng thöïc haønh
Kieåm nghieäm thuù saûn vaø moâi tröôøng, Khoa Chaên nuoâi - Thuù y, Tröôøng Ñaïi hoïc
Noâng Laâm Thaønh phoá Hoà Chí Minh.
- Vieäc xaùc ñònh caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli ñöôïc thöïc hieän taïi Trung taâm
Phaân tích thí nghieäm Hoùa sinh, Tröôøng Ñaïi hoïc Noâng Laâm Thaønh phoá Hoà Chí
Minh.
3.2 Noäi dung
- Phaân laäp vi khuaån E. coli trong phaân vaø thòt boø, heo baèng phöông phaùp
ñònh löôïng. Töø ñoù ñaùnh giaù möùc ñoä veä sinh thöïc phaåm baèng caùch so saùnh vôùi tieâu
chuaån Vieät Nam veà soá löôïng E. coli treân thòt töôi (TCVN 7046 - 2002). Söû duïng
kyõ thuaät multiplex - PCR ñeå phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa vi khuaån E. coli phaân
laäp ñöôïc baèng qui trình ñònh löôïng.
- Phaân laäp ñònh tính vi khuaån E. coli trong phaân beâ tieâu chaûy, phaân heo
con tieâu chaûy, thòt boø vaø thòt heo. Phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli ñaõ phaân
laäp ñònh tính baèng kyõ thuaät multiplex - PCR.
Download» Agriviet.com
24
3.3 Phöông phaùp nghieân cöùu
3.3.1 Phaân laäp vi khuaån E. coli
Ñoái töôïng laáy maãu
- Thòt boø, heo ñöôïc laáy töø caùc chôï leû (duøng cho qui trình ñònh löôïng).
- Beà maët quaøy thòt boø, thòt heo ñöôïc laáy trong loø moå (duøng cho qui trình
phaân laäp ñònh tính).
- Phaân beâ vaø phaân heo con tieâu chaûy ñöôïc laáy töø moät soá traïi vaø hoä chaên
nuoâi.
- Phaân boø vaø phaân heo bình thöôøng ñöôïc laáy töø moät soá traïi vaø hoä chaên
nuoâi.
Caùch laáy vaø baûo quaûn maãu
- Maãu thòt: Choïn ngaãu nhieân mieáng thòt ñeå laáy maãu. Khoái löôïng maãu laø 50
g thòt.
- Maãu beà maët quaøy thòt: Choïn ngaãu nhieân quaøy thòt ôû giöõa ca gieát moå.
Duøng gaïc voâ truøng lau beà maët quaøy thòt vôùi toång dieän tích khoaûng 200 cm2.
- Maãu phaân bình thöôøng: Duøng muoãng muùc khoaûng 25 g ôû phaàn giöõa cuïc
phaân gia suùc môùi thaûi.
- Maãu phaân tieâu chaûy: Phaân ñöôïc laáy töø tröïc traøng baèng taêm boâng (± 0,1 g)
roài cho vaøo moâi tröôøng vaän chuyeån Carry Blair.
Taát caû caùc loaïi maãu sau khi laáy ñeàu ñöôïc ñöïng trong duïng cuï voâ truøng vaø
giöõ laïnh ôû 4 – 80C cho ñeán khi tieán haønh xeùt nghieäm (maãu ñöôïc giöõ toái ña 24 giôø).
Soá löôïng maãu
Soá löôïng maãu khaûo saùt ñöôïc tính laø soá maãu ñaõ phaân laäp ñöôïc vi khuaån E.
coli töø caùc maãu ñaõ laáy.
Download» Agriviet.com
25
Soá löôïng maãu khaûo saùt
STT Ñoái töôïng maãu Phaân laäp
ñònh tính
Phaân laäp qua
ñònh löôïng
1 Thòt heo 49 23
2 Thòt boø 34 8
Bình thöôøng 25 10
3 Phaân heo
Tieâu chaûy 22 -
Bình thöôøng 21 10
4 Phaân boø
Tieâu chaûy 10 -
Toång coäng 161 51
Qui trình phaân laäp vi khuaån E. coli
- Töø maãu thòt vaø maãu phaân bình thöôøng, vi khuaån E. coli ñöôïc phaân laäp,
ñònh löôïng theo qui trình FAO (1992).
- Maãu phaân beâ vaø heo con tieâu chaûy ñöôïc caáy ria tröïc tieáp treân moâi tröôøng
EMB hoaëc MAC, uû ôû 37oC trong 24 giôø. Khuaån laïc E. coli ñieån hình treân moâi
tröôøng EMB seõ deïp, coù maøu tím aùnh kim vôùi taâm saäm maøu, vaø treân moâi tröôøng
MAC coù maøu hoàng, troøn, loài.
- Maãu beà maët quaøy thòt (200 cm2) ñöôïc laøm ñoàng ñeàu trong 180 ml pepton
ñeäm phosphate vaø daäp maãu trong 60 giaây. Boå sung khaùng sinh cefixime vôùi noàng
ñoä 0,0125 mg/l (FDA, 2002). UÛ ôû 37oC trong 24 giôø. Pha loaõng canh taêng sinh 10
laàn vôùi nöôùc sinh lyù voâ truøng. Huùt 100 μl canh taêng sinh ôû noàng ñoä 10-1 daøn ñeàu
leân beà maët ñóa thaïch CT-SMAC. UÛ ôû 37oC trong 24 giôø. Vi khuaån E. coli
O157:H7 ñieån hình thöôøng phaùt trieån treân moâi tröôøng CT-SMAC taïo khuaån laïc
khoâng maøu hoaëc maøu xaùm vôùi taâm ñuïc.
Download» Agriviet.com
26
Maãu (thòt, phaân bình thöôøng)
Laøm ñoàng ñeàu maãu
Pha loaõng
LTB
(350C / 24h)
EC
(44,50C / 24 - 48h)
EMB
(350C / 24h)
Thöû IMVC
(350C / 24h)
Keát quaû
toång soá E. coli
MAC
(370C / 24h)
Choïn khuaån laïc
Caáy NA (350C / 24h)
LY TRÍCH DNA
QUI TRÌNH ÑÒNH LÖÔÏNG QUI TRÌNH ÑÒNH TÍNH
Maãu phaân Maãu thòt
Peptone + Cefixime
(370C / 24h)
CT - SMAC
(370C / 24h)
Choïn khuaån laïc
ñieån hình
Choïn khuaån laïc
ñieån hình
Laøm ñoàng ñeàu maãu
MULTIPLEX - PCR
Sô ñoà 3.1 Qui trình phaân laäp vi khuaån E. coli
Download» Agriviet.com
27
Ghi nhaän keát quaû toång soá vi khuaån E. coli coù trong 1 g phaân vaø 1 g thòt töôi.
Ñoái vôùi maãu thòt, so saùnh keát quaû toång soá vi khuaån E. coli vôùi chæ tieâu cuûa
tieâu chuaån thòt töôi (TCVN 7046 - 2002) do Boä Khoa hoïc vaø Coâng ngheä ban haønh
theo quyeát ñònh soá 22/2002/QÑ-BKHCN. TCVN qui ñònh saûn phaåm thòt töôi ñaït
TCVN coù soá löôïng E. coli khoâng quaù 100 vi khuaån / gam.
3.3.2 Ly trích DNA töø vi khuaån E. coli phaân laäp ñöôïc
Theo Cebula vaø ctv (1995), keát hôïp vôùi phöông phaùp ly trích DNA töø E.
coli cuûa Cerna (2003) vaø Botteldoorn (2003), chuùng toâi tieán haønh ly trích DNA töø
vi khuaån E. coli phaân laäp ñöôïc baèng phöông phaùp nhieät nhö sau:
- Choïn khoaûng 20 khuaån laïc E. coli treân moâi tröôøng thaïch cho vaøo
eppendorf ñöïng saün 1 ml nöôùc caát 2 laàn voâ truøng.
- Ñun soâi trong 10 phuùt.
- Chuyeån ngay vaøo tuû –70 oC, giöõ trong 10 phuùt.
- Raõ ñoâng hoaøn toaøn.
- Ly taâm vôùi toác ñoä 10.000 rpm trong 3 phuùt.
- Thu phaàn noåi laøm DNA khuoân maãu.
3.3.3 Xaùc ñònh gen ñoäc löïc eae, hly, stx1, stx2, stx2e, sta, stb, lt-I cuûa E.
coli phaân laäp ñöôïc töø thòt vaø phaân
Vieäc phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli ñöôïc thöïc hieän baèng 2 phaûn
öùng multiplex – PCR vôùi maùy luaân nhieät (thermal cycler):
- Multiplex – PCR1: phaùt hieän caùc gen eaeA, hlyA, stx1, stx2.
- Multiplex – PCR2: phaùt hieän caùc gen stx2e, sta, stb, lt-I
Trong quaù trình thöïc hieän phaûn öùng multiplex – PCR, maãu ñoái chöùng döông
(EDL933 hoaëc H44) ñöôïc thöïc hieän ñoàng thôøi vôùi nhöõng maãu khaûo saùt.
+ EDL933 laø ñoái chöùng döông vôùi caùc gen eaeA, hlyA, stx1, stx2.
+ H44 laø ñoái chöùng döông vôùi caùc gen stx2e, stb, lt-I.
Download» Agriviet.com
28
Hai maãu ñoái chöùng döông naøy ñöôïc cung caáp töø Phoøng thí nghieäm Tröôøng
Ñaïi hoïc Thuù y Toulouse (Phaùp).
Soá maãu xeùt nghieäm caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli
Maãu E. coli phaân laäp ñöôïc Soá maãu thöïc hieän PCR
Phöông phaùp
phaân laäp Ñoái töôïng maãu
Multiplex –
PCR1
Multiplex –
PCR2
Phaân boø 10 10 Phaân
bình thöôøng Phaân heo 10 10
Thòt boø 8 8
ÑÒNH
LÖÔÏNG
Thòt
Thòt heo 23 23
Phaân beâ 10 10 Phaân
tieâu chaûy Phaân heo con 22 22
Phaân boø 21 21 Phaân
bình thöôøng Phaân heo 25 25
Thòt boø 34 34
ÑÒNH
TÍNH
Thòt
Thòt heo 49 49
TOÅNG COÄNG 212 212
Multiplex – PCR1
* Trình töï caùc primer ñöôïc söû duïng trong multiplex – PCR1:
Gen
ñoäc
löïc
Primer Trình töï primer (5’ → 3’)
Kích côõ ñoaïn
DNA khueách ñaïi
(bp)
stx1 Stx1-F Stx1-R
ATAAATCGCCATTCGTTGACTAC
AGAACGCCCACTGAGATCATC 180
stx2 Stx2-F Stx2-R
GGCACTGTCTGAAACTGCTCC
TCGCCAGTTATCTGACATTCTG
255
eaeA EaeA-F EaeA-R
GACCCGGCACAAGCATAAGC
CCACCTGCAGCAACAAGAGG
384
hlyA HlyA-F HlyA-R
GCATCATCAAGCGTACGTTCC
AATGAGCCAAGCTGGTTAAGCT 534
(Daãn lieäu cuûa Paton vaø Paton, 1998)
Download» Agriviet.com
29
* Caùc thaønh phaàn cuûa phaûn öùng multiplex – PCR:
STT Thaønh phaàn Noàng ñoä
1 PCR Buffer 1 X
2 MgCl2 2 mM
3 dNTPs 200 μM
4 Moài
Stx1-F 250 nM
Stx1-R 250 nM
Stx2-F 250 nM
Stx2-R 250 nM
EaeA-F 250 nM
EaeA-R 250 nM
HlyA-F 250 nM
HlyA-R 250 nM
5 Taq - polymerase 0,5 UI
6 DNA khuoân maãu 1 μl
7 Nöôùc caát 2 laàn Vöøa ñuû 50 μl
* Chu trình nhieät trong phaûn öùng multiplex – PCR1 (Paton vaø Paton,
1998):
Böôùc 1 Böôùc 3
95 oC / 1 phuùt 95 oC / 1 phuùt
65 oC / 2 phuùt 63 oC / 2 phuùt
72 oC / 1,5 phuùt 72 oC / 1,5 phuùt
Böôùc 2 Böôùc 4
95 oC / 1 phuùt 95 oC / 1 phuùt
64 oC / 2 phuùt 62 oC / 2 phuùt
72 oC / 1,5 phuùt 72 oC / 1,5 phuùt
10 chu kyø
1 chu kyø
1 chu kyø
1 chu kyø
Download» Agriviet.com
30
Böôùc 5 Böôùc 7
95 oC / 1 phuùt 95 oC / 1 phuùt
61 oC / 2 phuùt 60 oC / 2 phuùt
72 oC / 1,5 phuùt 72 oC / 2,5 phuùt
Böôùc 6
95 oC / 1 phuùt
60 oC / 2 phuùt
72 oC / 1,5 phuùt
Multiplex – PCR2
* Trình töï caùc primer ñöôïc söû duïng trong multiplex – PCR2:
Gen
ñoäc
löïc
Primer Trình töï primer (5’ → 3’)
Kích côõ
ñoaïn DNA
khueách ñaïi
(bp)
lt-I
LT-F
LT-R
GGCGACAGATTATACCGTGC
CCGAATTCTGTTATATATGTC 696
sta STa-F STa-R
TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG
CTTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC
147
stb
STb-F
STb-R
ATCGCATTTCTTCTTGCATC
GGGCGCCAAAGCATGCTCC
172
stx2e
Stx2e-F
Stx2e-R
CCTTAACTAAAAGGAATATA
CTGGTGGTGTATGATTAATA
230
(Daãn lieäu Blanco vaø ctv, 1997)
1 chu kyø
10 chu kyø
11 chu kyø
Download» Agriviet.com
31
* Caùc thaønh phaàn cuûa phaûn öùng multiplex – PCR2:
STT Thaønh phaàn Noàng ñoä
1 PCR Buffer 1 X
2 MgCl2 1,5 mM
3 dNTPs 200 μM
4 Moài
Stx2e-F 225 ng
Stx2e-R 225 ng
STa-F 150 ng
STa-R 150 ng
STb-F 45 ng
STb-R 45 ng
LT-I-F 150 ng
LT-I-R 150 ng
5 Taq - polymerase 0,5 UI
6 DNA khuoân maãu 3 μl
7 Nöôùc caát 2 laàn Vöøa ñuû 50 μl
* Chu trình nhieät trong phaûn öùng multiplex – PCR2 (Nguyen Ngoc
Hai, 2002):
94 oC / 5 phuùt
94 oC / 45 giaây
52 oC / 45 giaây
72 oC / 1 phuùt
72 oC / 10 phuùt
3.3.4 Ñieän di treân gel agarose vaø ñoïc keát quaû ñieän di
Sau phaûn öùng multiplex - PCR, 10 μl saûn phaåm PCR + 2 μl loading
dye ñöôïc ñieän di treân gel agarose 1,5% trong TBE. Thang ladder cuõng ñöôïc
ñieän di ñoàng thôøi. Thôøi gian ñieän di laø 35 – 40 phuùt ôû 100 V vaø 250 mA.
Gel ñieän di ñöôïc ngaâm trong 30 phuùt vôùi dung dòch ethidium bromide
1 mg/ml TBE. Sau ñoù röûa saïch baèng nöôùc vaø chuïp hình gel vôùi tia UV baèng
25 chu kyø
Download» Agriviet.com
32
maùy chuïp gel (phaàn meàm Quality One 2000, Bio-Rad). Caùc baêng DNA ñöôïc
xaùc ñònh baèng caùch so vôùi caùc baêng cuûa ñoái chöùng döông vaø thang ladder
100 bp (AB gene, UK).
Hình 3.1 Keát quaû ñieän di saûn phaåm PCR1
EDL933: ñoái chöùng döông (stx1, stx2, eae, hly); 1, 2, 4, 5, 6 laø caùc maãu xeùt nghieäm.
Hình 3.2 Keát quaû ñieän di saûn phaåm PCR2
H44: ñoái chöùng döông (lt-I, stb, stx2e); Lad:thang chuaån;
1, 4, 5, 6 laø caùc maãu xeùt nghieäm
1 2 EDL 4 5 6
993
534 bp (hly)
255 bp (stx2)
384 bp (eae)
180 bp (stx1)
1 H44 Lad 4 5 6
500 bp
230 bp (stx2e)
696 bp (lt-I)
172 bp (stb)
Download» Agriviet.com
33
Chöông 4
KEÁT QUAÛ – THAÛO LUAÄN
4.1 Toång soá vi khuaån E. coli vaø keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc
cuûa E. coli phaân laäp ñöôïc töø phaân vaø thòt boø, heo baèng qui trình ñònh
löôïng
Xaùc ñònh toång soá vi khuaån E. coli cuûa 10 maãu phaân boø bình thöôøng,
10 maãu phaân heo bình thöôøng, 8 maãu thòt boø vaø 23 maãu thòt heo theo qui
trình ñònh löôïng, keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 4.1.
Baûng 4.1 Toång soá vi khuaån E. coli trong phaân vaø thòt boø, heo
Ñoái töôïng maãu Soá maãu
Toång soá E. coli (X ± SE)
(MPN/g)
Keát quaû phaùt
hieän gen ñoäc löïc
Phaân boø 10 9,5*106 ± 7,4*106 Khoâng phaùt hieän
PHAÂN
Phaân heo 10 102*106 ± 46,3*106 Khoâng phaùt hieän
Thòt boø 8 14,8*104 ± 4,2*104 Khoâng phaùt hieän
THÒT
Thòt heo 23 0,4*104 ± 1,1*104 Khoâng phaùt hieän
E. coli laø vi khuaån thuoäc nhoùm coliforms soáng thöôøng tröïc vaø chieám
öu theá trong ñöôøng ruoät cuûa ngöôøi vaø gia suùc, theo phaân phaùt taùn vaøo moâi
tröôøng beân ngoaøi. Soá löôïng E. coli trong phaân bieán thieân giöõa caùc loaøi.
Ngoaøi ra soá löôïng E. coli coøn phuï thuoäc vaøo löùa tuoåi, tình traïng tieâu chaûy,
caùch chaêm soùc quaûn lyù, tình traïng sinh lyù cuûa caù theå… Keát quaû xaùc ñònh
toång soá E. coli trong phaân boø vaø phaân heo trong 20 maãu phaân cuûa khaûo saùt
naøy cho thaáy toång soá vi khuaån E. coli trong phaân boø töông ñoái thaáp hôn
Download» Agriviet.com
34
trong phaân heo. Paton vaø Paton (1998) khaúng ñònh E. coli trong phaân chính
laø nguoàn vaáy nhieãm quan troïng xaâm nhaäp vaøo saûn phaåm thòt trong quaù trình
gieát moå, cheá bieán thòt; vaø theo Keel vaø Parmelee (1968), E. coli ñöôïc xem
laø chæ tieâu chaéc chaén ñeå ñaùnh giaù möùc ñoä vaáy nhieãâm phaân vaøo thòt (daãn lieäu
Doyle vaø Padhye, 1989).
Thaät vaäy, trong quaù trình gieát moå, E. coli töø phaân deã daøng vaáy nhieãm
neàn saøn, duïng cuï gieát moå, nöôùc söû duïng, phöông tieän vaän chuyeån… Do ñoù
neáu qui trình gieát moå gia suùc, vaän chuyeån vaø phaân phoái thòt khoâng tuaân thuû
nghieâm ngaët caùc ñieàu kieän veä sinh thì nguy cô vaáy nhieãm E. coli töø phaân
vaøo thòt caøng taêng.
Chuùng toâi ñaõ tieán haønh ñònh löôïng toång soá vi khuaån E. coli theo qui
trình ñònh löôïng cuûa FAO (1992) cho 8 maãu thòt boø vaø 23 maãu thòt heo thu
thaäp töø caùc chôï leû (baûng 4.1). Keát quaû ñònh löôïng cho thaáy toång soá vi khuaån
E. coli trung bình treân thòt boø laø 14,8*104 ± 4,2*104 MPN/g bieán thieân töø
1,1*104 ñeán 35*104 MPN/g. So saùnh vôùi tieâu chuaån TCVN 7046 – 2002 qui
ñònh soá vi khuaån E. coli treân 1 gam thòt töôi khoâng quaù 100 vi khuaån thì
trong toång soá 8 maãu khaûo saùt, khoâng coù maãu thòt boø naøo ñaït TCVN. Toång soá
E. coli trung bình treân thòt heo laø 0,4*104 ± 1,1*104 MPN/g, bieán thieân töø
0,4*102 ñeán 4,5*104 MPN/g. Trong toång soá 23 maãu thòt heo khaûo saùt thì coù
6/23 maãu ñaït tieâu chuaån veä sinh veà chæ tieâu E. coli (chieám tæ leä 26,1%).
Toång soá E. coli trung bình treân 1 gam thòt heo töông ñoái thaáp hôn treân
thòt boø maëc duø soá löôïng E. coli trung bình treân 1 gam phaân heo cao hôn treân
phaân boø. Ñieàu naøy coù theå laø do söï khaùc nhau trong caùch gieát moå, vaän
chuyeån vaø baøy baùn. Boø ñöôïc gieát moå khoâ, hoaøn toaøn khoâng ñöôïc röûa nöôùc
trong suoát quaù trình gieát moå. Thòt boø ñöôïc coâng nhaân gieát moå pha loïc taïi loø
moå vaø vaän chuyeån ñeán chôï leû baèng caùc phöông tieän thoâ sô. Trong khi ñoù,
trong quaù trình gieát moå heo, quaøy thòt heo ñöôïc röûa thöôøng xuyeân vaø nöûa
Download» Agriviet.com
35
thaân thòt ñöôïc vaän chuyeån ñeán chôï leû roài môùi pha loïc, ngoaøi ra ngöôøi baùn
thòt cuõng thöôøng caïo saïch beà maët thòt tröôùc khi pha loïc, do ñoù thòt heo haïn
cheá ñöôïc söï vaáy nhieãm taïi loø moå, daãn ñeán soá löôïng E. coli treân thòt heo ít
hôn treân thòt boø.
Maëc duø soá löôïng E. coli trong caùc maãu phaân boø, heo laø raát cao, keå caû
E. coli treân thòt boø, heo. Tuy nhieân vôùi 51 maãu E. coli phaân laäp ñöôïc töø phaân
vaø thòt theo qui trình ñònh löôïng nhöng chuùng toâi ñeàu khoâng phaùt hieän ñöôïc
gen ñoäc löïc baèng kyõ thuaät multiplex - PCR.
Löu yù raèng trong qui trình ñònh löôïng, E. coli ñöôïc taêng sinh choïn loïc
trong moâi tröôøng EC ôû 44,5oC trong 24 giôø. Nhieàu nghieân cöùu cho thaáy raèng
ôû nhieät ñoä cao (≥ 44oC) nhöõng chuûng E. coli gaây beänh phaùt trieån yeáu daàn,
coøn nhöõng chuûng E. coli coäng sinh (flora) phaùt trieån nhanh hôn. Ngoaøi ra Hill
vaø Carlisle coøn ghi nhaän raèng neáu taêng sinh trong moâi tröôøng ôû 44,5oC coù
theå laøm maát plasmide maõ hoùa nhöõng yeáu toá ñoäc löïc vaø laøm giaûm soá löôïng
nhöõng doøng E. coli gaây beänh coù trong thöïc phaåm (theo daãn lieäu cuûa Doyle
vaø Padhye, 1989)
Cuõng theo daãn lieäu cuûa Doyle vaø Padhye (1989), nhaèm ñaùnh giaù khaû
naêng phaùt hieän caùc E. coli gaây beänh coù trong thöïc phaåm theo qui trình cuûa
FDA, moät nghieân cöùu khaùc cuûa Hill vaø caùc coäng taùc vieân nhaän thaáy raèng
moãi loaïi thöïc phaåm baùn leû coù khoaûng 4,7 doøng E. coli khaùc nhau, nhöng sau
quaù trình taêng sinh trong EC ôû 44,50C thì 30% chuûng E. coli khoâng theå phaùt
hieän ñöôïc (khoâng sinh gas sau 48 giôø), nhöõng E. coli toàn taïi ñöôïc trong quaù
trình taêng sinh coù khoaûng 20 – 95% E. coli taïo ñoäc toá LT bò maát plasmide.
Nhö vaäy quaù trình taêng sinh theo qui trình cuûa FDA thì khoâng thích hôïp cho
vieäc phaùt hieän coù hieäu quaû vaø ñaùng tin caäy ñoái vôùi nhöõng doøng E. coli gaây
beänh coù trong thöïc phaåm. Thí nghieäm giaûm nhieät ñoä taêng sinh (< 44oC) trong
quaù trình phaân laäp E. coli theo qui trình cuûa FDA laïi cho thaáy vieäc giaûm tính
Download» Agriviet.com
36
choïn loïc cuûa moâi tröôøng do coù quaù nhieàu vi khuaån khaùc trong canh taêng sinh
phaùt trieån laán aùt vi khuaån E. coli gaây beänh.
Töø nhöõng lyù do treân, chuùng toâi cho raèng öu ñieåm cuûa phöông phaùp
phaân laäp E. coli theo qui trình ñònh löôïng coù theå xaùc ñònh ñöôïc toång soá vi
khuaån E. coli trong maãu khaûo saùt, nhöng E. coli phaân laäp ñöôïc hoaøn toaøn
khoâng bao goàm nhöõng chuûng E. coli gaây beänh (do khoâng theå vöôït qua giai
ñoaïn taêng sinh ôû nhieät ñoä 44,5oC), ñaëc bieät laø nhoùm EHEC vôùi thaønh vieân
ñaëc tröng laø O157:H7 – taùc nhaân gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm ñöôïc quan taâm
haøng ñaàu. Ñaây coù leõ laø lyù do aûnh höôûng ñeán keát quaû khoâng phaùt hieän ñöôïc
caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli thu thaäp töø qui trình ñònh löôïng. Do vaäy toång soá
vi khuaån E. coli xaùc ñònh ñöôïc baèng qui trình ñònh löôïng chæ phaûn aùnh möùc
ñoä vaáy nhieãm E. coli vaøo thöïc phaåm nhöng khoâng thích hôïp cho vieäc phaùt
hieän caùc gen ñoäc löïc.
4.2 Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli phaân laäp ñöôïc
töø phaân beâ tieâu chaûy vaø phaân heo con tieâu chaûy
Nhaèm böôùc ñaàu thöû nghieäm qui trình phaân laäp ñònh tính vaø qui trình
phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli, chuùng toâi choïn 2 ñoái töôïng coù khaû
naêng phaùt hieän caùc doøng E. coli gaây beänh cao nhaát laø phaân beâ tieâu chaûy vaø
phaân heo con tieâu chaûy ñeå khaûo saùt.
ÔÛ phaân beâ tieâu chaûy
Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli phaân laäp ñöôïc töø 10
maãu phaân beâ tieâu chaûy ñöôïc trình baøy ôû baûng 4.2.
Download» Agriviet.com
37
Baûng 4.2 Keát quaû phaùt hieän gen ñoäc löïc cuûa E. coli trong phaân beâ
tieâu chaûy
Gen ñoäc löïc
Maãu
eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1
1 - - + - - - - -
2 + - + - - - - -
3 - - - - - - - -
4 - - - - - - - -
5 + + + + - - - -
6 - + + - - - - -
7 - - - - - -
8 + + - + - - - -
9 - - - - - - + -
10 - - - - - - + -
Coäng 3 3 4 2 0 0 2 0
Tyû leä (%) 30,0 30,0 40,0 20,0 0 0 20,0 0
Trong toång soá 10 maãu E. coli phaân laäp töø phaân beâ tieâu chaûy, coù 7/10
maãu (70%) phaùt hieän coù gen ñoäc löïc, bao goàm:
- 5/10 maãu (50%)phaùt hieän ñöôïc gen stx (stx1 hoaëc/vaø stx2)
- 3/10 maãu (30%) phaùt hieän ñöôïc gen eae
- 3/10 maãu (30%) phaùt hieän ñöôïc gen hly
- 2/10 maãu (20%) phaùt hieän ñöôïc gen stb
Nhö vaäy vôùi 10 maãu E. coli töø phaân beâ tieâu chaûy, coù 7/10 maãu (70%)
phaùt hieän ñöôïc ít nhaát 1 gen ñoäc löïc, coù maãu phaùt hieän ñöôïc 3 – 4 gen ñoäc
Download» Agriviet.com
38
löïc. Gen stx ñöôïc phaùt hieän vôùi tæ leä cao nhaát (5/10 maãu – 50%). Smith
(1988) vaø Gyles (1992) cho raèng nhieàu loaøi gia suùc mang STEC khoâng coù
bieåu hieän trieäu chöùng, moät vaøi doøng STEC coù khaû naêng gaây tieâu chaûy cho
boø, ñaëc bieät laø beâ. Trong 5 maãu E. coli cuûa phaân beâ tieâu chaûy mang gen stx,
coù 3 maãu ñoàng thôøi mang gen eae vaø 3 maãu ñoàng thôøi mang gen hly. Theo
Barrett (1992), ñoäc toá Stx laø ñieàu kieän caàn chöù chöa phaûi laø ñieàu kieän ñuû ñeå
gaây beänh tieâu chaûy. Do ñoù söï xuaát hieän ñoàng thôøi caùc gen eae, hly vôùi caùc
gen stx coù theå goùp phaàn giaûi thích lyù do tieâu chaûy treân beâ.
ÔÛ phaân heo con tieâu chaûy
Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli töø 16 maãu phaân heo cai
söõa tieâu chaûy vaø 6 maãu phaân heo con theo meï tieâu chaûy ñöôïc trình baøy ôû
baûng 4.3.
Keát quaû ôû baûng 4.3 cho ta thaáy raèng ôû nhoùm heo cai söõa tieâu chaûy coù
14/16 maãu (87,5%) mang gen ñoäc löïc, trong khi ñoù ôû nhoùm heo con theo meï
tieâu chaûy coù 3/6 maãu (33,3%) mang gen ñoäc löïc.
- Ñoái vôùi E. coli töø phaân heo cai söõa tieâu chaûy, coù 1/16 maãu (6,3%)
mang gen hly, 2/16 maãu (12,5%) mang gen eae, 5/16 maãu (31,3%) mang gen
stx2e vaø 8/16 maãu (50%) mang gen stx2.
- Ñoái vôùi E. coli töø phaân heo con theo meï tieâu chaûy, coù 2/16 maãu
(33,3%) vöøa hieän dieän gen stx2 vaø stx2e.
- Khoâng phaùt hieän ñöôïc gen lt-I trong 22 maãu E. coli phaân laäp töø
phaân heo cai söõa tieâu chaûy vaø phaân heo con theo meï tieâu chaûy. Botteldoorn
vaø ctv (2003) cuõng khoâng phaùt hieän gen lt-I trong 24 maãu phaân heo khaûo saùt.
- Gen sta chæ hieän dieän trong E. coli phaân laäp töø phaân heo cai söõa tieâu
chaûy vôùi tyû leä 25% (4/16 maãu).
Download» Agriviet.com
39
Baûng 4.3 Keát quaû phaùt hieän gen ñoäc löïc cuûa E. coli trong phaân
heo con tieâu chaûy
Gen ñoäc löïc
Maãu
eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1
1 − − − + + − + −
2 − − − + + − + −
3 − − − − − − − −
4 + + − + + − + −
5 − − − − − − − −
6 − − − + − − + −
7 + − − + − − + −
8 − − − + − + − −
9 − − − − + − + −
10 − − − − − − + −
11 − − − − + − + −
12 − − − − − − + −
13 − − − − − − + −
14 − − − + − + + −
15 − − − + − + + −
16 − − − − − + + −
Ph
aân
h
eo
c
ai
sö
õa
tie
âu
ch
aûy
Coäng
(%)
2
(12,5)
1
(6,3)
0
(0)
8
(50,0)
5
(31,3)
4
(25,0)
13
(81,25)
0
(0)
1 − − − − − − − −
2 − − − + + − + −
3 − − − + + − + −
4 − − − − − − − −
5 − − − − − − − −
6 − − − − − − + −
Ph
aân
h
eo
c
on
th
eo
m
eï
tie
âu
ch
aûy
Coäng
(%)
0
(0)
0
(0)
0
(0)
2
(33,3)
2
(33,3)
0
(0)
3
(50,0)
0
(0)
Coäng chung 2 1 0 10 7 4 16 0
Tyû leä chung (%) 9,1 4,5 0 45,5 31,8 18,2 72,7 0
Download» Agriviet.com
40
- Gen stb hieän dieän trong E. coli vôùi tyû leä cao nhaát ôû caû 2 nhoùm phaân
heo cai söõa tieâu chaûy (81,25%) vaø phaân heo con theo meï tieâu chaûy (50%).
Blanco (1997) nhaän thaáy raèng gen stb xuaát hieän vôùi taàn soá cao nhaát
78,4% (58/74 maãu) so vôùi caùc gen ñoäc löïc khaùc cuûa E. coli phaân laäp töø phaân
heo con tieâu chaûy hoaëc phuø thuûng. OÂng keát luaän raèng ñoäc toá STb goùp phaàn
ñaùng keå vaøo trieäu chöùng tieâu chaûy treân heo. Ñieàu naøy cuõng phuø hôïp vôùi keát
quaû nghieân cöùu cuûa Handl (1992), Harel (1991) vaø Moon (1986).
Toùm laïi, trong 22 maãu E. coli ñöôïc phaân laäp töø 22 maãu phaân heo con
tieâu chaûy coù 17/22 maãu (77,2%) phaùt hieän gen ñoäc löïc, trong ñoù:
- 16 maãu (72,7%) phaùt hieän ñöôïc gen stb, chieám tæ leä phaùt hieän cao
nhaát.
- 10 maãu (45,5%) phaùt hieän ñöôïc gen stx2.
- 7 maãu (31,8%) phaùt hieän ñöôïc gen stx2e.
- 4 maãu (18,2%) phaùt hieän ñöôïc gen sta
- 2 maãu (9,1%) phaùt hieän ñöôïc gen eae
- 1/22 maãu (4,5%) phaùt hieän ñöôïc gen hly.
Nhö vaäy, ñoäc toá Stb vaø Stx2/Stx2e coù theå laø nguyeân nhaân gaây tieâu
chaûy treân heo con, ñaëc bieät laø treân nhoùm heo cai söõa (81,3% maãu phaùt hieän
ñöôïc gen stb, 50% phaùt hieän coù gen stx2 vaø 31,3% phaùt hieän coù gen stx2e).
Coù 7/22 maãu (31,8%) E. coli töø phaân heo con tieâu chaûy mang gen
stx2e. Tuy ñoäc toá Stx2e khoâng lieân quan ñeán beänh treân ngöôøi, nhöng noù
chính laø nguyeân nhaân gaây phuø thuûng treân heo con. Kyõ thuaät PCR trôû thaønh
phöông phaùp xeùt nghieäm nhanh vaø chính xaùc ñeå phaùt hieän nguyeân nhaân E.
coli gaây phuø thuûng. Beänh tieâu chaûy vaø phuø thuûng treân heo con coù theå xaûy ra
trong giai ñoaïn heo con theo meï laãn heo sau cai söõa (Bertschinger vaø
Fairbrother, 1999).
Download» Agriviet.com
41
Toång keát vieäc phaùt hieän gen ñoäc löïc cuûa E. coli töø nhoùm phaân beâ vaø
heo con tieâu chaûy, chuùng toâi nhaän thaáy raèng:
- Khaû naêng phaùt hieän ñöôïc gen ñoäc löïc cuûa E. coli töø nhöõng maãu
phaân tieâu chaûy laø khaù cao (70% treân phaân beâ tieâu chaûy vaø 72,7% treân phaân
heo con tieâu chaûy). Ñieàu naøy chöùng toû raèng treân caû 2 nhoùm ñoái töôïng naøy,
E. coli mang caùc gen ñoäc löïc laø moät nguyeân nhaân quan troïng gaây tieâu chaûy.
- Ñoäc toá chính gaây tieâu chaûy treân beâ laø Stx (Stx1 vaø/hoaëc Stx2 –
50%), coøn treân heo con laø caû ñoäc toá chòu nhieät Stb (59,1%), ñoäc toá Stx2
(45,5%) vaø nguy hieåm nhaát laø ñoäc toá Stx2e gaây phuø thuûng (31,8%).
4.3 Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli trong phaân boø
vaø phaân heo bình thöôøng
Nguoàn vaáy nhieãm E. coli vaøo thòt chuû yeáu laø phaân (ña soá laø phaân bình
thöôøng) cuûa boø, heo tröôûng thaønh. Nhaèm xaùc ñònh caùc gen ñoäc löïc cuûa E.
coli gaây beänh cho ngöôøi qua thòt töôi, chuùng toâi phaân laäp E. coli töø 21 maãu
phaân boø bình thöôøng vaø 25 maãu phaân heo bình thöôøng theo phöông phaùp
ñònh tính roài thu thaäp caùc khuaån laïc ñieån hình ñeå ly trích DNA.
ÔÛ phaân boø bình thöôøng
Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa 21 maãu E. coli phaân laäp töø
phaân boø bình thöôøng ñöôïc ghi nhaän ôû baûng 4.4.
Trong 21 maãu E. coli töø phaân boø bình thöôøng ñöôïc khaûo saùt, 13 maãu
(61,9%) phaùt hieän coù gen ñoäc löïc. Ñieàu naøy cho thaáy raèng boø bình thöôøng
(khoâng coù bieåu hieän tieâu chaûy) cuõng laø ñoái töôïng mang gen ñoäc löïc cuûa E.
coli. Ñaây chính laø nguoàn vaáy nhieãm cho thòt boø trong quaù trình gieát moå, vaän
chuyeån, baøy baùn neáu khoâng tuaân thuû caùc ñieàu kieän veà veä sinh.
Download» Agriviet.com
42
Baûng 4.4 Keát quaû phaùt hieän gen ñoäc löïc cuûa E. coli trong phaân boø
bình thöôøng
Gen ñoäc löïc
Maãu
eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1
1 − − − + − − − −
2 − − + − − − − −
3 − − − − − − − −
4 − − − − − − − −
5 − − − − − − − −
6 − − − − − − − −
7 − − − − − − − −
8 − − + + − − + −
9 − − − − − − − −
10 − − + − − − − −
11 − − + + − − + −
12 − + + + − − + −
13 − − + + − − − −
14 − − − − − + − −
15 − − − + − − − −
16 − − + + − − − −
17 − + − + − − − −
18 − + + + − − − −
19 + + − − − − − −
20 − − − − − − − −
21 − − − − − − − −
Coäng 1 4 8 9 0 1 3 0
Tyû leä (%) 4,8 19,0 38,1 42,9 0 4,8 14,3 0
Download» Agriviet.com
43
Gen stx1 vaø stx2 ñöôïc phaùt hieän vôùi tæ leä cao nhaát (42,9% vaø 38,1%).
Nhö vaäy roõ raøng phaân boø laø nguoàn löu cöûu STEC trong töï nhieân, ñuùng nhö
Beutin (1995) ñaõ nhaän ñònh raèng nhöõng doøng E. coli saûn sinh ñoäc toá Stx
thöôøng hieän dieän trong phaân cuûa nhöõng thuù nuoâi khoûe maïnh, vaø ñaëc bieät laø
trong phaân cuûa loaøi nhai laïi (Beutin, 1993). Theo Levin (1987), STEC laø taùc
nhaân gaây beänh cho ngöôøi. Vaø theo Renwick (1993), con ngöôøi trôû neân caûm
nhieãm do aên phaûi thöùc aên bò nhieãm hoaëc tieáp xuùc tröïc tieáp vôùi STEC töø phaân
ñoäng vaät. Ngöôøi nhieãm STEC coù theå tieâu chaûy hoaëc traàm troïng hôn thì vieâm
keát traøng xuaát huyeát (HC) hoaëc hoäi chöùng huyeát nieäu (HUS) (Karmali,
1989).
Vôùi 21 maãu E. coli trong phaân boø bình thöôøng, gen hly vaø gen stb coù
tæ leä phaùt hieän laàn löôït laø 19% vaø 14,3%, gen eae vaø gen stb phaùt hieän ñöôïc
vôùi tæ leä khaù thaáp (4,8%). Khoâng phaùt hieän ñöôïc gen stx2e vaø gen lt-I.
Nhö vaäy, gen stx2e khoâng phaùt hieän ñöôïc ôû caû 2 nhoùm phaân beâ tieâu
chaûy vaø phaân boø bình thöôøng. Ñieàu naøy phuø hôïp vôùi keát luaän cuûa Beutin
(1995), Stx2e chæ hieän dieän treân nhoùm STEC cuûa heo. Theo Blanco (1997),
Stx2e laø moät bieán chuûng cuûa Stx2, bieán chuûng naøy chæ ñöôïc phaùt hieän ôû
nhöõng E. coli coù nguoàn goác töø heo.
ÔÛ phaân heo bình thöôøng
Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa 25 maãu E. coli phaân laäp töø
phaân heo bình thöôøng ñöôïc ghi nhaän ôû baûng 4.5.
Download» Agriviet.com
44
Baûng 4.5 Keát quaû phaùt hieän gen ñoäc löïc cuûa E. coli trong phaân
heo bình thöôøng
Gen ñoäc löïc
Maãu
eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1
1 − − − − − − + −
2 − − − − − − − −
3 − − − − − − + −
4 − − − − − − − −
5 − − − − − − − −
6 − − − − − − + −
7 − − − − − − + −
8 − − − − − − − −
9 − − − − − − + −
10 − − − − − − − −
11 − − − − − − − −
12 − − − − − − − −
13 − − − − − − − −
14 − − − − − − − −
15 − − − − − − − −
16 − − − − − − − −
17 − − − − + − + −
18 − − − − − − − −
19 − − − − − − − −
20 − − − − + − + −
21 − − − − + − − −
22 + + − + + − − −
23 − − − − − − − −
24 + + − − − − − −
25 − − − − − − − −
Coäng 2 2 0 1 4 0 7 0
Tyû leä (%) 8,0 8,0 0 4,0 16,0 0 28,0 0
Download» Agriviet.com
45
Trong 25 maãu E. coli phaân laäp töø phaân heo bình thöôøng, 10/25 maãu
(40%) phaùt hieän coù gen ñoäc löïc; vaø cuõng nhö treân nhoùm phaân heo con tieâu
chaûy, gen stb ñöôïc phaùt hieän vôùi tæ leä cao nhaát (28%), tæ leä phaùt hieän gen
stx2 töông ñoái khoâng cao (16%).
Toùm laïi, E. coli trong phaân boø heo bình thöôøng ñeàu mang nhöõng gen
ñoäc löïc. Ñaëc bieät E. coli trong phaân boø bình thöôøng mang gen saûn sinh ñoäc
toá Stx1, Stx2 gaây tieâu chaûy cho ngöôøi, trong tröôøng hôïp beänh naëng coù theå
gaây HC vaø HUS. Ngoaøi ra, E. coli trong phaân heo bình thöôøng vaãn mang gen
stx2e saûn sinh ñoäc toá vero gaây phuø thuûng cho heo con. Do ñoù veä sinh toát taïi
caùc traïi chaên nuoâi heo laø bieän phaùp phoøng ngöøa tieâu chaûy phuø thuûng cho heo
con. Veä sinh saïch seõ cho thuù moå thòt, veä sinh trong haï thòt vaø phaân phoái laø
bieän phaùp haøng ñaàu ngaên ngöøa vaáy nhieãm E. coli töø phaân ñeán thòt nhaèm
ñaûm baûo veä sinh an toaøn thöïc phaåm cho ngöôøi tieâu duøng.
4.4 Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân beà maët
quaøy thòt boø, heo
Vieäc phaùt hieän ñöôïc gen ñoäc löïc cuûa E. coli phaân laäp töø phaân boø, heo
bình thöôøng ñeå laøm neàn taûng cho chuùng toâi tieán haønh ñieàu tra caùc gen naøy
cuûa E. coli phaân laäp ñöôïc töø quaøy thòt boø, heo bôûi vì phaân boø, heo chính laø
nguoàn gaây vaáy nhieãm cho thòt trong quaù trình gieát moå. Soá löôïng vi khuaån E.
coli treân beà maët thòt khoâng nhieàu nhö trong phaân, ñaëc bieät laø nhöõng doøng E.
coli gaây beänh thöôøng hieän dieän vôùi soá löôïng raát ít treân thòt, cho neân neáu chæ
söû duïng phöông phaùp caáy ria tröïc tieáp treân thaïch MAC thì khaû naêng phaùt
hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân thòt coù theå gaëp khoù khaên. Ñeå taêng khaû
naêng phaùt hieän caùc E. coli mang gen ñoäc löïc, chuùng toâi söû duïng moâi tröôøng
choïn loïc chuyeân bieät cuûa O157:H7 laø CT-SMAC ñeå taêng sinh nhoùm STEC.
Vaø ñeå traùnh boû soùt nhöõng doøng E. coli non-O157, chuùng toâi choïn khoaûng 20
khuaån laïc goàm caû nhöõng khuaån laïc ñieån hình vaø khoâng ñieån hình treân thaïch
Download» Agriviet.com
46
CT-SMAC. Vieäc ly trích vaø thöïc hieän phaûn öùng multiplex - PCR ñöôïc tieán
haønh töông töï nhö ôû caùc nhoùm maãu khaùc.
Treân thòt boø
Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa 34 maãu E. coli phaân laäp töø thòt
boø ñöôïc ghi nhaän ôû baûng 4.6.
Trong toång soá 34 maãu E. coli phaân laäp töø thòt boø, coù 21/34 maãu
(61,8%) phaùt hieän coù mang gen ñoäc löïc, bao goàm:
- 17/34 maãu (50,0%) phaùt hieän ñöôïc gen stx2
- 11/34 maãu (32,4%) phaùt hieän ñöôïc gen stx1.
- 8/34 maãu (23,5%) phaùt hieän ñöôïc gen eae.
- 9/34 maãu (26,5%) phaùt hieän ñöôïc gen hly.
- 1/34 maãu (2,9%) phaùt hieän ñöôïc gen stb.
Tæ leä phaùt hieän ñöôïc E. coli mang gen ñoäc löïc treân thòt boø khaù cao
(21/34 maãu chieám tæ leä 61,8%) vaø trong ñoù coù 2 maãu (5,9%) mang ñoàng thôøi
caû 4 gen ñoäc löïc cuûa nhoùm EHEC (stx1, stx2, eae, hly) vaø 5 maãu khaùc
(14,7%) mang 3 gen ñoäc löïc stx2, eae, hly. Söï xuaát hieän ñoàng thôøi nhieàu gen
ñoäc löïc cuûa EHEC trong moät maãu chính laø nguy cô tieàm aån gaây ngoä ñoäc
thöïc phaåm hoaëc nghieâm troïng hôn laø gaây HC vaø HUS cho ngöôøi neáu quaù
trình cheá bieán khoâng coù coâng ñoaïn tieâu dieät vi khuaån naøy.
Keát quaû cuûa chuùng toâi phuø hôïp vôùi keát quaû cuûa Sadu vaø ctv (1999)
khaûo saùt 25 maãu thòt boø ôû Malaysia, taùc giaû ñaõ phaùt hieän 9 maãu thòt boø
nhieãm E. coli O157:H7 (chieám tæ leä 36,0%).
Download» Agriviet.com
47
Baûng 4.6 Keát quaû phaùt hieän gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân thòt boø
Gen ñoäc löïc
Maãu
eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1
1 − − − − + − − −
2 − − − − − − + −
3 − − − − + − − −
4 − + + + − − − −
5 + + + + − − − −
6 + + + + + − − −
7 + + − + − − − −
8 + + − + − − − −
9 + + − + − − − −
10 + + − + − − − −
11 + + − − − − − −
12 + + − + − − − −
13 − − + + − − − −
14 − − + + − − − −
15 − − + + − − − −
16 − − + + − − − −
17 − − + + − − − −
18 − − + + − − − −
19 − − + + − − − −
20 − − + + − − − −
21 − − − + − − − −
13 maãu
coøn laïi
− − − − − − − −
Coäng 8 9 11 17 3 0 1 0
Tyû leä (%) 23,5 26,5 32,4 50,0 8,8 0 2,9 0
Download» Agriviet.com
48
Rieâng gen stx2e phaùt hieän ñöôïc trong 3 maãu thòt boø ñöôïc chuùng toâi
khaúng ñònh laø do söï vaáy nhieãm phaân heo trong quaù trình gieát moå. Caû 3 maãu
thòt boø naøy ñöôïc laáy töø cô sôû gieát moå chung heo vaø boø. Vieäc vaáy nhieãm qua
laïi giöõa hai khu vöïc trong loø moå hoaøn toaøn coù theå xaûy ra do coâng nhaân gieát
moå, duïng cuï, nöôùc röûa tay…
Treân thòt heo
Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa 49 maãu E. coli phaân laäp töø thòt
heo ñöôïc ghi nhaän ôû baûng 4.7.
Baûng 4.7 Keát quaû phaùt hieän gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân thòt heo
Gen ñoäc löïc
Maãu
eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1
1 − + − − − −
2 + + + − − − −
3 − − − + − − − −
4 − − − + − − − −
5 − − − + − − − −
6 − − − + − − − −
7 − − − + − − − −
8 − − − + − − − −
9 − − − + − − − −
10 − − − + − − − −
11 − − − + − − − −
12 + + − − − − − −
37 maãu
coøn laïi
− − − − − − − −
Coäng 2 2 0 11 0 0 0 0
Tyû leä (%) 4,1 4,1 0 22,5 0 0 0 0
Download» Agriviet.com
49
Trong toång soá 49 maãu E. coli phaân laäp töø thòt heo, coù 12/49 maãu
(24,5%) phaùt hieän coù mang gen ñoäc löïc, bao goàm:
- 11/49 maãu (22,5%) phaùt hieän ñöôïc gen stx2.
- 2/49 maãu (4,1%) phaùt hieän ñöôïc gen eae, hly.
- Khoâng phaùt hieän ñöôïc caùc gen stx1, stx2e, sta, stb, lt-I trong nhöõng
maãu khaûo saùt.
- Chæ coù 1/49 maãu (2,0%) phaùt hieän ñoàng thôøi mang gen stx2, eae, hly.
Nhö vaäy, E. coli mang gen ñoäc löïc phaân laäp ñöôïc treân thòt heo chieám
tæ leä thaáp hôn treân thòt boø (24,5% so vôùi 61,8%)ø. Ngoaøi ra, treân thòt heo tæ leä
E. coli mang ñoàng thôøi 3 gen ñoäc löïc stx2, eae, hly (2,0%) cuõng thaáp hôn tæ leä
treân thòt boø (20,6%). Töø ñoù ta coù theå nhaän ñònh raèng tieâu chaûy vaø HC hoaëc
HUS ôû ngöôøi do nguyeân nhaân thòt boø deã xaûy ra hôn so vôùi thòt heo. Ñieàu naøy
phuø hôïp vôùi caùc nghieân cöùu dòch teã treân theá giôùi veà caùc oå dòch do
STEC/EHEC phaàn lôùn gaây ra do tieâu thuï saûn phaåm thòt boø (daãn lieäu Paton
vaø Paton, 1998).
4.5 Toång keát keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân
maãu khaûo saùt coù nguoàn goác töø boø
Toùm laïi, trong nghieân cöùu cuûa chuùng toâi, 2 ñoái töôïng gia suùc ñöôïc
choïn khaûo saùt laø boø vaø heo. Trong moãi ñoái töôïng gia suùc naøy, chuùng toâi thöïc
hieän khaûo saùt treân 3 nhoùm maãu goàm: phaân beâ/heo con tieâu chaûy, phaân boø
bình thöôøng vaø thòt töôi. Treân töøng ñoái töôïng gia suùc, chuùng toâi toång keát keát
quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân 3 nhoùm maãu khaûo saùt naøy
nhaèm coù caùi nhìn toång quaùt hôn.
Khaûo saùt vôùi 65 maãu coù nguoàn goác töø boø bao goàm: 10 maãu phaân beâ
tieâu chaûy, 21 maãu phaân boø bình thöôøng, 34 maãu thòt boø, keát quaû phaùt hieän
caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân maãu khaûo saùt coù nguoàn goác töø boø ñöôïc trình
baøy ôû baûng 4.8.
Download» Agriviet.com
50
Baûng 4.8 Toång keát keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli
treân maãu khaûo saùt coù nguoàn goác töø boø
Gen ñoäc löïc
Nhoùm maãu N n
eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1
7 3 3 4 2 0 0 2 0 Phaân beâ
tieâu chaûy
10
70,0 30,0 30,0 40,0 20,0 0 0 20,0 0
13 1 4 8 9 0 1 3 0 Phaân boø
bình thöôøng
21
61,9 4,8 19,0 38,1 42,9 0 4,8 14,3 0
21 8 9 11 17 3 0 1 0
Thòt boø
34
61,8 23,5 26,5 32,4 50,0 8,8 0 2,9 0
41 12 16 23 28 (3) 1 6 0
COÄNG
65
63,1 18,5 24,6 35,4 43,1 (4,6) 1,5 9,2 0
N: Soá löôïng maãu khaûo saùt
n: Soá löôïng maãu phaùt hieän ñöôïc coù mang gen ñoäc löïc
0
10
20
30
40
50
60
eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1
Gen ñoäc löïc
Tæ leä (%)
Phaân beâ tieâu chaûy Phaân boø bình thöôøng Thòt boø
Bieåu ñoà 4.1: Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân maãu
khaûo saùt coù nguoàn goác töø boø
Download» Agriviet.com
51
Nhö vaäy, trong soá 65 maãu E. coli phaân laäp töø phaân vaø thòt coù nguoàn
goác töø boø, moãi ñoái töôïng maãu ñeàu coù tæ leä maãu mang gen ñoäc löïc khaù cao
(70% töø maãu phaân beâ tieâu chaûy, 61,9% töø maãu phaân boø bình thöôøng, 61,8%
töø maãu thòt boø). Tính chung cho nhoùm maãu coù nguoàn goác töø boø coù 41/65 maãu
E. coli mang gen ñoäc löïc, chieám tæ leä 63,1%.
Trong ñoù:
- E. coli mang gen stx2 xuaát hieän vôùi tæ leä cao nhaát (43,1%).
- Caùc gen stx1, hly, eae cuõng xuaát hieän vôùi tæ leä khaù cao (laàn löôït laø
35,4%, 24,6%, 18,5%). Nhö vaäy roõ raøng boø chính laø nguoàn löu cöûu STEC
trong töï nhieân.
- Gen sta, stb xuaát hieän vôùi taàn soá thaáp (1,5% vaø 9,2%)
- Rieâng gen stx2e cuûa E. coli thì khoâng phaùt hieän ñöôïc trong 31 maãu
phaân boø (10 maãu phaân beâ tieâu chaûy vaø 21 maãu phaân boø bình thöôøng). Keát
quaû naøy phuø hôïp vôùi Beutin (1995) vaø Blanco (1997). Tuy nhieân E. coli töø
34 maãu thòt boø khaûo saùt coù 3 maãu mang gen stx2e laø do nhieãm phaân heo
trong quaù trình gieát moå.
4.6 Toång keát keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân
maãu khaûo saùt coù nguoàn goác töø heo
Vôùi 96 maãu coù nguoàn goác töø heo bao goàm: 22 maãu phaân heo con tieâu
chaûy, 25 maãu phaân heo bình thöôøng, 49 maãu thòt heo, toång keát keát quaû phaùt
hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân maãu khaûo saùt coù nguoàn goác töø heo
ñöôïc trình baøy ôû baûng 4.9.
Download» Agriviet.com
52
Baûng 4.9 Toång keát keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli
treân maãu khaûo saùt coù nguoàn goác töø heo
Gen ñoäc löïc
Nhoùm maãu N n
eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1
17 2 1 0 10 7 4 16 0 Phaân heo con
tieâu chaûy
22
77,2 9,1 4,5 0 45,5 31,8 18,2 72,7 0
10 2 2 0 1 4 0 7 0 Phaân heo
bình thöôøng
25
40,0 8,0 8,0 0 4,0 16,0 0 28,0 0
12 2 2 0 11 0 0 0 0
Thòt heo
49
24,5 4,1 4,1 0 22,5 0 0 0 0
39 6 5 0 22 11 4 23 0
COÄNG
96
40,6 6,3 5,2 0 22,9 11,5 4,2 24,0 0
N: Soá löôïng maãu khaûo saùt
n: Soá löôïng maãu phaùt hieän ñöôïc coù mang gen ñoäc löïc
0
10
20
30
40
50
60
70
80
eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1
Gen ñoäc löïc
Tæ leä (%)
Phaân heo con tieâu chaûy Phaân heo bình thöôøng Thòt heo
Bieåu ñoà 4.2: Keát quaû phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli treân maãu
khaûo saùt coù nguoàn goác töø heo
Download» Agriviet.com
53
Nhö vaäy, trong 96 maãu E. coli coù nguoàn goác töø heo, 39 maãu phaùt hieän
mang gen ñoäc löïc, chieám tæ leä 40,6%.
- Gen stb vaø gen stx2 phaùt hieän ñöôïc vôùi tæ leä cao (24,0% vaø 22,9%).
- Gen eae, hly, sta phaùt hieän ñöôïc vôùi taàn soá thaáp (6,3%, 5,2%, 4,2%).
- Khoâng phaùt hieän ñöôïc gen stx1 trong 96 maãu coù nguoàn goác töø heo.
Ñieàu naøy phuø hôïp vôùi keát quaû nghieân cöùu cuûa Blanco vaø ctv (1997) keát luaän
raèng gen stx1 thöôøng khoâng coù treân heo (chæ phaùt hieän ñöôïc 1/74 doøng E.
coli cuûa heo con tieâu chaûy hoaëc phuø thuûng). Botteldoorn vaø ctv (2003) xeùt
nghieäm 177 maãu phaân heo cuõng khoâng phaùt hieän maãu E. coli naøo mang gen
stx1, trong khi ñoù coù 56/177 maãu (31,6%) mang gen stx2, 24/177 maãu
(13,6%) mang gen eae, vaø 8/177 maãu (4,5%) mang gen hly.
Download» Agriviet.com
54
Chöông 5
KEÁT LUAÄN – ÑEÀ NGHÒ
5.1 Keát luaän
Qua keát quaû thu ñöôïc trong quaù trình phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa
E. coli phaân laäp ñöôïc töø phaân vaø thòt boø, heo baèng kyõ thuaät multiplex - PCR,
chuùng toâi ruùt ra moät soá keát luaän sau:
(1) Qui trình ñònh löôïng E. coli coù giai ñoaïn nuoâi caáy ôû 44,5oC khoâng
thích hôïp cho nhoùm E. coli gaây beänh phaùt trieån neân khoâng phaùt hieän caùc gen
ñoäc löïc ôû 20 maãu phaân vaø 31 maãu thòt boø, heo.
(2) Phaân laäp tröïc tieáp E. coli töø phaân treân moâi tröôøng choïn loïc MAC ôû
370C, choïn 20 khuaån laïc ñieån hình cho E. coli ñeå phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc
baèng kyõ thuaät multiplex – PCR cho thaáy:
* Tæ leä phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli trong phaân tieâu chaûy laø
khaù cao: 70% ôû phaân beâ tieâu chaûy vaø 77,2% ôû phaân heo con tieâu chaûy.
* E. coli trong phaân boø, heo bình thöôøng cuõng mang caùc gen ñoäc löïc
vôùi tæ leä phaùt hieän thaáp hôn trong phaân tieâu chaûy.
* Phaân boø laø nguoàn löu cöûu STEC/EHEC trong töï nhieân. Gen stx1 chæ
phaùt hieän töø E. coli phaân laäp ñöôïc töø phaân boø, khoâng phaùt hieän ñöôïc töø phaân
heo. Gen stx2e saûn sinh ñoäc toá vero gaây tieâu chaûy phuø thuûng chæ hieän dieän ôû
E. coli trong phaân heo, khoâng phaùt hieän ñöôïc trong phaân boø.
(3) Moâi tröôøng taêng sinh choïn loïc CT-SMAC taïo ñieàu kieän cho nhoùm
STEC/EHEC trong thòt phaùt trieån toát, trôï giuùp cho vieäc choïn khuaån laïc ñeå
phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc. Tæ leä phaùt hieän caùc gen ñoäc löïc cuûa E. coli töø thòt
boø vaø thòt heo laàn löôït laø 61,8% vaø 24,5%.
Download» Agriviet.com
55
(4) Chöa phaùt hieän ñöôïc gen lt-I cuûa E. coli trong 65 maãu phaân vaø thòt
boø, 96 maãu phaân vaø thòt heo.
5.2 Ñeà nghò
- ÖÙng duïng kyõ thuaät PCR trong chaån ñoaùn beänh vaø kieåm tra veä sinh
an toaøn thöïc phaåm.
- Veä sinh vaø quaûn lyù toát taïi caùc cô sôû chaên nuoâi nhaèm ngaên ngöøa
beänh tieâu chaûy, phuø thuûng treân heo con.
- Tuaân thuû nghieâm ngaët caùc qui ñònh veà veä sinh trong quaù trình gieát
moå gia suùc.
Download» Agriviet.com
56
TAØI LIEÄU THAM KHAÛO
PHAÀN TIEÁNG VIEÄT
1. Hoà Huyønh Thuøy Döông, 1998. Sinh hoïc phaân töû (Khaùi nieäm – Phöông
phaùp – ÖÙng duïng). Nhaø xuaát baûn Giaùo duïc Thaønh phoá Hoà Chí Minh.
2. Traàn Thanh Phong, 1998. Escherichia coli O157:H7 vaø ngoä ñoäc thöùc aên.
Taäp san Khoa hoïc Kyõ thuaät Noâng laâm nghieäp. Soá thaùng 6/1998.
Tröôøng Ñaïi hoïc Noâng Laâm, TP. Hoà Chí Minh. Nhaø xuaát baûn Noâng
nghieäp. Trang 8 – 14.
PHAÀN TIEÁNG NÖÔÙC NGOAØI
3. Barrett T. J., Kaper L. B., Jerse A. E., and Wachsmuth I. K., 1992.
Virulence factors in Shiga-like toxin producing Escherichia coli
isolated from humans and cattle. J. Infect. Dis. 165:970-980.
4. Bertschinger H. U. and Fairbrother J. M., 1999. Escherichia coli
infections. In Diseases of swine (Eds. B. E. Straw, S. D’Allaire, W. L.
Mengeling, and D. J. Taylor). Iowa State University Press, Iowa, USA.
5. Beutin L., Aleksic S., Zimmermann S., and Gleier K., 1994. Virulence
factors and phenotypic traits of verotoxigenic strains of Escherichia
coli isolated from human patients in Germany. Med. Microbiol.
Immunol. (Berlin) 183:13-21
6. Beutin L., Geier D., Steinrck H., Zimmermann S., and Scheutz F., 1993.
Prevalence and some properties of verotoxin (Shiga-like toxin)-
producing Escherichia coli in seven different species of healthy
domestic animals. J. Clin. Microbiol. 31:2483-2488
7. Black R. E., Merson M. H., Rowe B., Taylor P. R., Abdul Alim A. R. M.,
Gross R. J., and Sack D. A., 1981. Enterotoxigenic Escherichia coli
diarrhoea: acquired immunity and transmission in an endemic area.
Bull. W. H. O. 59:263-268
8. Blanco M., Blanco J. E., Gonzalez E. A., Mora A., Jansen W., Gomes T.
Download» Agriviet.com
57
A. T., Zerbini L. F., Yano T., de Castro A. F. P., and Blanco J., 1997.
Note: Genes coding for enterotoxins and Verotoxins in Porcin
Escherichia coli strains belonging to different O:K:H serotypes:
relationship with phenotype. J. Clin. Microbiol. 35:2958-2963
9. Botteldoorn N., Heydrick M., Rijpens N., Herman L., 2003. Detection
and characterization of verotoxigenic Escherichia coli by a
VTEC/EHEC multiplex – PCR in porcine faeces in pig carcass
swabs. Res. Microbiol. 154:97-104.
10. Calderwood S. B., Acheson D. W. K., Keusch G. T., Barrett T. J., Griffin
P. M., Strockbine N. A. et al, 1996. Proposed new nomenclature for
SLT (VT) family. ASM News 62:118-119.
11. Cebula T. A., Payne W. L., and Fegn P., 1995. Simultaneous
identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and
their Shiga-like toxin type by Mismatch amplification mutation assay
multiplex – PCR. J. Clin. Microbiol. 33:248-250.
12. Cerna J. F., Nataro J. P., and Garcia T. E., 2003. Multiplex – PCR for
detection of three plasmid borne genes of enteroaggregative
Escherichia coli strains. J. Clin. Microbiol. 41:2138-2140.
13. Chalmer R. M., Salmon R. L., Willshaw G. A., Cheasty T., Looker N.,
Davies I., and Wray C., 1997. Verocytotoxin-producing Escherichia
coli O157 in a farmer handing horses. Lancet 349:1816
14. Chapman P. A., Siddons C. A., Cerdan Malo A. T., and Harkin M. A.,
1997. A 1-year study of Escherichia coli in cattle, pig and poultry.
Epidemiol. Infect. 119:245-250
15. Donnenberg M. S., Tzipori S., McKee M. L., O'Brien A. D., Alroy J., and
Kaper J. B., 1993. The role of the eae gene of enterohemorrhagic
Escherichia coli in intimate attachment in vitro and in a porcine
model. J. Clin. Invest. 92:1418-1424
16. Doyle M. P. and Padhye V. V., 1989. Escherichia coli. In: Foodborne
bacterial pathogens (Ed. M. P. Doyle). Marcel Decker Inc. New
York. p.235-281.
Download» Agriviet.com
58
17. FAO, 1992. Microbiological analysis in the food control laboratory.
18. FDA, 2002. “Diarrheagenic Escherichia coli”, Bacteriological Analytical
manual Online, CFSAN. September 2002.
<URL:
19. Handl C. E., Olsson E., and Flock J. I., 1992. Evaluation of three
different STb assays and comparision of enterotoxin pattern over a
five-year period in Swedish porcine Escherichia coli. Diagn.
Microbiol. Infect. Dis. 15:505-510.
20. Harel J., Lapointe H., Fallara A., Lorrtie A., Bigras-Poulin M., Lariviere
S., and Fairbrother J. M., 1991. detection of genes for fimbrial
antigens and enterotoxins associated with Escherichia coli
serogroups isolated from pig with diarrhea. J. Clin. Microbiol.
29:745-752.
21. Hitotsubashi S., Fujii Y., Yamanaka H., and Okamoto K., 1992. Some
properties of purified Escherichia coli heat-stable enterotoxin II.
Infect. Immun. 60:4468-4474
22. Jann K. and Jann B., 1992. Capsules of Escherichia coli, expression and
biological significance. Can. J. Microbiol. 38:705-710
23. Kaffmann F., 1947. The serology of coli group. J. Immunol. 57:71-100.
24. Karmali M. A., 1989 Infection by verocytotoxin-producing Escherichia
coli. Clin. Microbiol. Rev. 2:15-38.
25. Keskimaki M., 2001, Shiga toxin-producing and other diarrhoeagenic
Escherichia coli in Finland: pheno- and genotypic epidemiology.
Academic dissertation. The Faculty of Agriculture and Forestry of
the University of Helsinky, Finland.
26. Konowalchuk J., Speirs J. I., and Stavric S., 1977. Vero response to a
cytotoxin of Escherichia coli. Infect. Immun. 18:775-779
27. Leung P. H. M., Peiris J. S. M., Ng W. W. S., Robin-Browne R. M.,
Bettelheim K. A., and Yam W. C., 2003. A newly discovered
Download» Agriviet.com
59
verotoxin variant, VT2g, produced by bovine verocytotoxigenic
Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 69:4549-4553.
28. Levine M. M., Ristaino P., Marley G., Smyth C., Knutton S., Boedeker
E., Black R., Young C., Clements M. L., Cheney C., and Patnaik R.,
1984. Coli surface antigens 1 and 3 of colonization factor antigen II-
positive enterotoxigenic Escherichia coli: morphology, purification,
and immune responses in humans. Infect. Immun. 44:409-420.
29. Levine M. M., Ristaino P., Marley G., Smyth C., Knutton S., Boedeker
E., Black R., Young C., Clements M. L., Cheney C., and Patnaik R.,
1984. Coli surface antigens 1 and 3 of colonization factor antigen II-
positive enterotoxigenic Escherichia coli: morphology, purification,
and immune responses in humans. Infect. Immun. 44:409-420.
30. Levine M. M., Xu J., Kapper J. B., Lior H., Prado V., Tall B., Nataro J.
P., Karch H., and Wachsmuth K., 1987. A DNA probe to identify
enterohemorrhagic Escherichia coli of O157:H7 and other serotypes
that cause hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome. J.
Infect. Dis. 156:175-182.
31. Moon H. W., Schneider R. A., and Moseley S. L., 1986. Comparative
prevalence of four enterotoxin genes among Escherichia coli
isolated from swine. Am. J. Vet. Res. 47:210-212.
32. Moon H. W., Whipp S. C., Argenzio R. A., Levine M. M., and Giannella
R. A., 1983. Attaching and effacing activities of rabbit and human
enteropathogenic Escherichia coli in pig and rabbit intestines. Infect.
Immun. 41:1340-1351.
33. Nataro J. P. and Kaper J. B., 1998.Diarrheagenic Escherichia coli. Clin
Microbiol. Rev. 11(1):142-201.
34. Nguyen Ngoc Hai, 2002. Maladie de l’edemedu porc au Vietnam:
carateùrisation des sou ches Escherichia coli responsables, facteurs
de pathogeùniciteù et vaccination. PhD. Theùsis.
35. Orskov F., Orskov I., 1984. Serotyping of Escherichia coli. In: Methods
in Microbiology (Ed. T. Bergan), vol. 14. Academic Press Inc., Ltd.
London, p. 43-112.
Download» Agriviet.com
60
36. Paton A. W. and Paton J. C., 1998. Detection and characterization of
Shiga toxigenic Escherichia coli by using multiplex PCR assay for
stx1, stx2, eaeA, enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfbO111, and rfbO157.
J. Clinical Microbiol. 36(2):598-602
37. Paton J. C. and Paton A. W., 1998. Pathogenesis and diagnosis of Shiga
toxin-producing Escherichia coli infections. Clin. Microbiol. Rev.
11:450-479.
38. Paton J. C., and Paton A. W., 1996. Survival rate of mice after transient
colonization with Escherichia coli clones carrying variant Shiga-like
toxin type II operons. Microb. Pathog. 20:377-383
39. Protocol online
<URL:
Multiplex_PCR/
40. Renwick S. A., wilson J. B., Clarke R. C., Lior H., Borcyk A. A., Spika
J., Rahn K., McFadden K., Brouwer A., Coopps A., Anderson N. G.,
Alves D., and Karmali M. A., 1993. evidence of direct transmission
of Escherichia coli O157:H7 infection between calves and human. J.
Infect. Dis. 168:792-793.
41. Sadu S., Mutalib S. A., Rusul G., Ahmad Z., Morigaki T., Asai N., Kim
Y. B., Okuda J., and Nishibuchi M., 1998. Appl. Environ. Microbiol.
64:1153-1156.
Download» Agriviet.com
61
PHUÏ LUÏC 1
HOÙA CHAÁT CHO ÑIEÄN DI
TBE (0,5 X)
Tris HCl 3,94 mg
Acid Boric 1,39 g
Na2EDTA 93,06 mg
Nöôùc caát vöøa ñuû 500 ml
pH = 8,3 vôùi NaOH 0,1N
Agarose (2%)
Loading dye
Bromophenol blue 0,25%
Sucrose 40%
TE 1X vöøa ñuû 100%
HOÙA CHAÁT CHO NHUOÄM GEL
TBE 1X
Ethidium bromide 10 mg/ml
MOÂI TRÖÔØNG VAØ THUOÁC THÖÛ
Moâi Tröôøng
LTB
Trypticase/ Tryptone 20g
NaCl 5g
Lactose 5g
K2HPO4 2,75g
KH2PO4 2,75g
Sodium lauryl sulphate 0,1g
Nöôùc caát vöøa ñuû 1.000 ml
pH = 6,8 ± 0,1
EC
Tryptone 20 g
Lactose 5g
Bile salt mixture 1,5g
Download» Agriviet.com
62
Dipotassium phosphate 4 g
Monopotassium phosphate 1,5g
Sodium chloride 5g
Nöôùc caát vöøa ñuû 1.000 ml
PH = 6,9 ± 0,2 (25oC)
EMB
Peptone 10 g
Lactose 5 g
Sucrose 5g
Dipotassium phosphate 2 g
Agar 13,5g
Eosin Y 0,4 g
Methyl blue 0,065g
Nöôùc caát vöøa ñuû 1.000 ml
pH = 7,2± 0,2 (25oC)
NA
Peptone 5g
Sodium chloride 5g
Beef Extract 1,5g
Yeast Extract 1,5g
Agar 15g
Nöôùc caát vöøa ñuû 1.000 ml
pH = 7,4 ± 0,2 (25oC)
Nöôùc peptone ñeäm
Peptone 10 g
Sodium chloride 5g
Disodium hydrogen phosphate 9 g
Potassium dihydrogen phosphate 1,5g
Nöôùc caát vöøa ñuû 1.000 ml
pH = 7
Download» Agriviet.com
63
SIMMON CITRAT
Na citrate 2 g
NaCl 5 g
K2HPO4 1 g
NH4H2PO4 1 g
MgSO4 0,2 g
Bromothymol blue 0,08 g
Agar 15 g
Nöôùc caát vöøa ñuû 1.000 ml
MR – VP
Peptone 7 g
Glucose 5 g
K2HPO4 5 g
Nöôùc caát vöøa ñuû 800 ml
Ph = 6,9 ± 0,2
Thuoác Thöû
VP (Voges Proskauer)
Dung dòch A:
Alpha naphthol 5g
Ethanol tuyeät ñoái 100 ml
Dung dòch B:
Potassium hydroxyde 40 g
Nöôùc caát 100 ml
MR (Methyl red)
Methyl red 0,1 g
Alcohol 300 ml
Nöôùc caát vöøa ñuû 500 ml
Download» Agriviet.com
64
PHUÏ LUÏC 2
CAÙC VAÁN ÑEÀ THÖÔØNG GAËP TRONG MULTIPLEX – PCR
VAØ HÖÔÙNG GIAÛI QUYEÁT
Vaán ñeà Höôùng giaûi quyeát
Saûn phaåm
khoâng
chuyeân bieät
* Neáu daøi
- Taêng noàng ñoä KCl (buffer) ñeán 1,2 - 2X nhöng giöõ nguyeân noàng ñoä
MgCl2 ôû 1,5 – 2 mM.
* Neáu ngaén
- Giaûm noàng ñoä buffer coøn 0,7 - 0,9X nhöng giöõ noàng ñoä MgCl2 ôû 1,5 -
2 mM.
- Taêng daàn nhieät ñoä uû baét caëp.
- Giaûm löôïng ADN xeùt nghieäm .
- Giaûm löôïng primer.
- Giaûm löïông Taq - polymerase.
- Taêng noàng ñoä MgCl2 3 - 4,5 mM nhöng giöõ nguyeân noàng ñoä dNTP.
- Theâm chaát phuï gia, toát nhaát laø duøng BSA (0,1 - 0,8 μg/μl: noàng ñoä
cuoái cuøng). Coù theå duøng thöû 5% glycerol (v/v noàng ñoä cuoái).
* Neáu khoâng coù saûn phaåm.
- Chaïy PCR cho moãi caëp moài ñöôïc söû duïng trong multiplex vôùi nhieät
ñoä uû baét caëp thaáp hôn bình thöôøng.
- So saùnh saûn phaåm khoâng chuyeân bieät cho moãi caëp moài kieåm tra vôùi
saûn phaåm khoâng chuyeân bieät nhìn thaáy khi chaïy multiplex - PCR. Ñieàu
naøy coù theå chæ ra moãi caëp moài mang laïi nhöõng saûn phaåm khoâng chuyeân
bieät trong phaûn öùng multiplex.
- Keát hôïp moät vaøi hoaëc taát caû nhöõng phöông phaùp treân.
Saûn phaåm
yeáu (môø)
- Giaûm thôøi gian uû baét caëp.
- Giaûm nhieät ñoä keùo daøi ñeán 62 - 680C.
- Taêng thôøi gian keùo daøi.
- Taêng noàng ñoä ADN xeùt nghieäm.
- Taêng taát caû löôïng primer söû duïng.
- Ñieàu chænh noàng ñoä Taq - polymerase.
- Thay ñoåi noàng ñoä buffer nhöng giöõ noàng ñoä MgCl2 ôû 1,5 – 2 mM.
- Taêng noàng ñoä MgCl2 ñeán 3 - 4,5 mM nhöng giöõ nguyeân noàng ñoä
dNTPs.
- Theâm chaát phuï gia, toát nhaát laø BSA (0,1 - 0,8 μg/μl), coù theå thöû 5%
glycerol (v/v noàng ñoä cuoái cuøng).
- Keát hôïp moät vaøi hoaëc taát caû phöông phaùp treân.
Download» Agriviet.com
65
Vaán ñeà Höôùng giaûi quyeát
Saûn phaåm
daøi vaø yeáu
(môø)
- Giaûm noàng ñoä buffer coøn 0,7 - 0,8X nhöng giöõ noàng ñoä MgCl2 ôû 1,5 –
2 mM.
- Taêng noàng ñoä MgCl2 leân 3 - 4,5 mM nhöng giöõ nguyeân noàng ñoä
dNTPs.
- Taêng thôøi gian bieán tính.
- Taêng thôøi gian uû baét caëp.
- Giaûm nhieät ñoä uû baét caëp.
- Taêng thôøi gian vaø nhieät ñoä keùo daøi.
- Taêng löôïng primer ñoái vôùi saûn phaåm PCR coù baêng môø ñoàng thôøi
giaûm löôïng primer cho baêng ñaäm.
- Theâm chaát phuï gia, toát nhaát laø duøng BSA ( 0,1 - 0,8μg/μl). Neân thöû
5% glycerol (v/v noàng ñoä cuoái cuøng).
- Keát hôïp moät vaøi hoaëc taát caû caùc phöông phaùp treân.
Saûn phaåm
ngaén vaø
yeáu (môø)ø
- Taêng noàng ñoä buffer ñeán 1,2 - 2X nhöng giöõ noàng ñoä MgCl2 ôû 1,5 – 2
mM.
- Giaûm thôøi gian bieán tính.
- Giaûm thôøi gian uû baét caëp.
- Giaûm nhieät ñoä uû baét caëp.
- Giaûm thôøi gian vaø nhieät ñoä keùo daøi.
- Taêng löôïng primer ñoái vôùi saûn phaåm PCR coù baêng môø vaø giaûm löôïng
primer cho baêng ñaäm.
- Theâm chaát phuï gia BSA (0,1 - 0,8 μg/μl), coù theå thöû 5% glycerol (v/v
noàng ñoä cuoái cuøng).
- Keát hôïp moät vaøi hoaëc taát caû caùc phöông phaùp treân.
Download» Agriviet.com
66
GIÔÙI THIEÄU VEÀ TAØI LIEÄU
A. Tài liệu bạn đang xem được download từ website
WWW.AGRIVIET.COM
WWW.MAUTHOIGIAN.ORG
»Agriviet.com là website chuyên đề về nông nghiệp nơi liên kết mọi thành viên
hoạt động trong lĩnh vực nông nghiệp, chúng tôi thường xuyên tổng hợp tài liệu về tất cả
các lĩnh vực có liên quan đến nông nghiệp để chia sẽ cùng tất cả mọi người. Nếu tài liệu
bạn cần không tìm thấy trong website xin vui lòng gửi yêu cầu về ban biên tập website để
chúng tôi cố gắng bổ sung trong thời gian sớm nhất.
»Chúng tôi xin chân thành cám ơn các bạn thành viên đã gửi tài liệu về cho chúng tôi.
Thay lời cám ơn đến tác giả bằng cách chia sẽ lại những tài liệu mà bạn đang có cùng
mọi người. Bạn có thể trực tiếp gửi tài liệu của bạn lên website hoặc gửi về cho chúng tôi
theo địa chỉ email Webmaster@Agriviet.Com
Lưu ý: Mọi tài liệu, hình ảnh bạn download từ web
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- Unlock-a6.PDF