Đề tài Phản ứng của mẫu lá Kim Ngân trong điều kiện in vitro

Ñaët vaán ñeà Kim Ngaân hoa (Lonicera japonica Thunb) thuoäc Hoï Kim Ngaân (Caprifolianceae) laø caây döôïc lieäu chöùa tanin vaø moät saponin. Hoa chöùa moät flavonoid laø scolymosid lonicerin vaø moät soá carotenoid (e. caroten, cryptoxanthin, auroxanthin). Quaû moïng giaøu carotenoid maø phaàn lôùn laø cryptoxanthin. Laù chöùa moät glucosid goïi laø loganin vaø khoaûng 8% tanin. Theo Y hoïc coå truyeàn: Kim Ngaân Hoa coù taùc duïng thanh nhieät giaûi ñoäc. Theo keát quaû nghieân cöùu döôïc lyù hieän ñaïi chöùng minh caây thuoác Kim Ngaân Hoa coù taùc duïng: khaùng khuaån, choáng vieâm, laøm giaûm chaát xuaát tieát, giaûi nhieät vaø laøm taêng taùc duïng thöïc baøo cuûa baïch caàu, taùc duïng höng phaán trung khu thaàn kinh cöôøng ñoä baèng 1/6 cuûa caø pheâ, laøm haï cholesterol trong maùu, taêng baøi tieát dòch vò vaø maät. Khi nghieân cöùu taùc duïng khaùng khuaån in vitro baèng caùc phöông phaùp khuyeách taùn vaø heä noàng ñoä, ngöôøi ta thaáy nöôùc saéc coâ ñaëc 100% cuûa hoa Kim Ngaân coù taùc duïng khaùng khuaån maïnh ñoái vôùi caùc tröïc khuaån lî, dòch haïch, thöông haøn, caän thöông haøn, lieân caàu khuaån tan maùu, phaåy khuaån taû. Taùc duïng yeáu hôn ñoái vôùi caùc tröïc khuaån baïch haàu, E.Coli, pheá caàu, tuï caàu khuaån vaøng. Nöôùc saéc laù Kim Ngaân vôùi noàng ñoä 201,2% öùc cheá tröïc khuaån Shiga, vôùi noàng ñoä 2050% öùc cheá tröïc khuaån caän thöông haøn, noàng ñoä 100% coù taùc duïng ñoái vôùi tieâu caàu khuaån (Taøi Nguyeân Caây Thuoác Vieät Nam). Maëc khaùc, Kim Ngaân cuõng laø döôïc lieäu quyù ñöôïc duøng ñieàu trò ung thö trong Ñoâng vaø Taây y nhö ung thö tuyeán vuù, gan, voøm hoïng, coå töû cung, u böôùu giaùp traïng, tröïc traøng,.. Ngoaøi taùc duïng hoa laù laøm thuoác, ứng dụng trong mỹ phẩm, cho caûnh ñeïp, hoa thôm, maønh che naéng vaø maùi che naéng, Kim Ngaân coøn coù taùc duïng haáp thu nhieät cuûa aùnh naéng maët trôøi (cho caây quang hôïp vaø phaùt trieån) neân maùt hôn maønh tre, maønh nhöïa vaø maùi toân choáng noùng. Ngoaøi ra, noù coøn huùt thaùn khí (CO2), nhaû döôõng khí (O2) laøm saïch moâi tröôøng, taïo baàu khoâng khí trong laønh.  Vieät Nam ñöôïc xem laø moät nöôùc coù nguoàn döôïc lieäu phong phuù vaø ña daïng vôùi soá löôïng treân 3.800 loaøi caây laøm thuoác treân toång soá hôn 10.600 loaøi thöïc vaät vaø laø thò tröôøng ñaày höùa heïn khi nhu caàu söû duïng raát lôùn khoâng chæ laø thuoác maø xu theá myõ phaåm duøng nguyeân lieäu töø thieân nhieân thay theá nguyeân lieäu toång hôïp ñaõ chieám 90% toång soá myõ phaåm ñöôïc saûn xuaát. Tuy nhieân, trong vaán ñeà saûn xuaát, kinh doanh vaø löu thoâng, phaân phoái döôïc lieäu, nguoàn döôïc lieäu chöa töông xöùng vôùi tieàm naêng hieän coù vaø coøn raát nhieàu baát caäp. Hôn 90% nguyeân lieäu saûn xuaát thuoác trong nöôùc vaãn phaûi nhaäp khaåu, chuû yeáu saûn xuaát nhöõng loaïi thuoác thoâng thöôøng, ngay caû nhöõng maët haøng thuoäc veà theá maïnh cuûa Vieät Nam laø caùc loaïi thuoác y hoïc coå truyeàn (YHCT), döôïc lieäu löu haønh treân thò tröôøng cuõng chuû yeáu nhaäp töø Ñaøi Loan, Trung Quoác, Singapore. Taïi TP.HCM, nôi chieám ñeán 70% tyû troïng soá löôïng thaønh phaåm vaø nguyeân lieäu döôïc lieäu cuûa caû nöôùc, 90% maët haøng ñoâng döôïc löu haønh treân thò tröôøng laø haøng nhaäp laäu. Moät ñieàu ñaùng löu taâm nöõa laø chaát löôïng döôïc lieäu hieän nay vaãn chöa ñöôïc kieåm soaùt (treân 50% maãu kieåm tra khoâng ñaït tieâu chuaån chaát löôïng) vaø tyû leä naøy vôùi caùc loaïi thuoác töø döôïc lieäu laø 10%. Ngoaøi ra, vieäc troàng döôïc lieäu hieän nay vaãn thieáu söï quy hoaïch taäp trung, thieáu söï hoã trôï caên cô töø nhaø nöôùc khieán thò tröôøng döôïc lieäu khoâng oån ñònh, caây döôïc lieäu vì theá cuõng khoâng phaùt trieån. Vaãn chöa coù moät cô quan chuyeân moân naøo ñaûm traùch khaâu kyõ thuaät saûn xuaát daãn ñeán tình traïng caùc caây döôïc lieäu khoâng ñaûm baûo ñöôïc naêng suaát – chaát löôïng – giaù caû oån ñònh ñeå caïnh tranh ñöôïc vôùi döôïc lieäu nhaäp khaåu. Nhö vaäy vôùi giaù trò to lôùn cuûa caây Kim Ngaân, laø caây thuoác moïc töï nhieân ôû Vieät Nam trong tình hình döôïc lieäu cuûa nöôùc ta hieän nay noùi chung vaø Kim Ngaân noùi rieâng thì vieäc ñaåy maïnh nghieân cöùu nhaân gioáng baèng nuoâi caáy moâ theo quy moâ coâng nghieäp ñeå coù theå naâng cao naêng suaát vaø soá löôïng caây troàng trong thôøi gian ngaén nhaát ñaùp öùng ñöôïc nhu caàu tieâu thuï cho thò tröôøng Vieät Nam vaø treân theá giôùi laø ñieàu heát söùc caàn thieát. Muïc ñích vaø noäi dung nghieân cöùu Muïc ñích Böôùc ñaàu khaûo saùt phaûn öùng cuûa maãu laù Kim Ngaân trong ñieàu kieän in vitro. Ñoàng thôøi taïo tieàn ñeà cho nhöõng nghieân cöùu taùch chieát caùc hôïp chaát coù giaù trò döôïc lyù trong caây Kim Ngaân laøm nguyeân lieäu phuïc vuï cho ngaønh coâng nghieäp döôïc. Noäi dung nghieân cöùu Böôùc ñaàu khaûo saùt aûnh höôûng cuûa caùc chaát ñieàu hoøa taêng tröôûng ñeán maãu caáy laù cuûa caây Kim Ngaân. Khaùi quaùt veà nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät Khaùi nieäm Nhaân gioáng in vitro hay nuoâi caáy moâ ñeàu laø thuaät ngöõ moâ taû caùc phöông thöùc nuoâi caáy caùc boä phaän thöïc vaät trong oáng nghieäm coù chöùa moâi tröôøng xaùc ñònh ôû ñieàu kieän voâ truøng. Moâi tröôøng coù chöùa caùc chaát dinh döôõng thích hôïp nhö muoái khoaùng, vitamin, caùc hormone taêng tröôûng vaø ñöôøng (Döông Coâng Kieân, 2002). Taàm quan troïng cuûa phöông phaùp nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät Phöông phaùp nuoâi caáy moâ vaø teá baøo thöïc vaät coù yù nghóa voâ cuøng to lôùn ñoái vôùi nghieân cöùu lyù luaän sinh hoïc cô baûn, ñoàng thôøi noù coù giaù trò ñoùng goùp tröïc tieáp cho thöïc tieãn saûn xuaát vaø ñôøi soáng. Veà maët lyù luaän sinh hoïc cô baûn Nuoâi caáy moâ ñaõ môû ra khaû naêng to lôùn cho vieäc tìm hieåu saâu saéc veà baûn chaát cuûa söï soáng. Thoâng qua nuoâi caáy moâ vaø teá baøo, chuùng ta coù theå tieán haønh so saùnh ñaëc tính cuûa cô theå vôùi hôïp phaàn cuûa chuùng khi taùch rôøi khoûi cô theå, töø ñoù ruùt ra qui luaät veà moái töông quan giöõa caùc boä phaän trong caây. Thöïc teá ñaõ cho pheùp chuùng ta taùch vaø nuoâi caáy tröôùc heát laø moâ phaân sinh roài töø ñoù cho ra nhoùm teá baøo khoâng chuyeân hoùa goïi laø moâ seïo, vaø töø moâ seïo coù theå kích thích ñeå taùi sinh caây hoaøn chænh vaø coù theå gaây ra nhöõng thay ñoåi ñònh höôùng ôû möùc ñoä teá baøo (tröôùc khi cho ra caây hoaøn chænh). Trong moät cô theå, raát khoù phaân bieät ñöôïc töøng giai ñoaïn moät caùch cuï theå vaø chính xaùc theo chu kyø phaùt trieån cuûa caù theå. Baèng phöông phaùp nuoâi caáy moâ, chuùng ta coù theå khaéc phuïc ñöôïc khoù khaên treân vaø deã daøng taïo ra caùc böôùc phaùt sinh hình thaùi ñöôïc phaân bieät moät caùch roõ reät. Töø ñoù coù theå tìm ra caùc maáu choát thuùc ñaày söï phaùt trieån cuûa caây troàng theo chieàu höôùng mong muoán. Baèng phöông phaùp nuoâi caáy moâ vaø teá baøo, chuùng ta coù theå tìm hieåu vaø tieán haønh nghieân cöùu moái quan heä khôûi ñaàu giöõa kyù sinh vaø kyù chuû. Töø ñoù, ngöôøi ta tìm ra ñöôïc nhöõng cô cheá mieãn dòch thöïc vaät. Khi con ngöôøi hoaøn toaøn laøm chuû ñöôïc cô cheá naøy thì caùc bieän phaùp phoøng beänh ñöôïc hoaøn thieän vaø nhö vaäy vieäc choáng beänh seõ trôû neân ñôõ toán keùm hôn raát nhieàu. Veà maët thöïc tieãn saûn xuaát Ngoaøi taùc duïng nghieân cöùu lyù luaän sinh hoïc cô baûn, phöông phaùp nuoâi caáy moâ coøn coù nhöõng ñoùng goùp heát söùc cuï theå ñoái vôùi saûn xuaát vaø ñôøi soáng. YÙ nghóa thöïc tieãn quan troïng nhaát cuûa nuoâi caáy moâ teá baøo laø aùp duïng kyõ thuaät saûn xuaát ñaïi traø coù kieåm soaùt trong taïo gioáng vaø nhaân gioáng caây troàng. Nhöõng lôïi ích trong vieäc aùp duïng nuoâi caáy moâ trong saûn xuaát noâng nghieäp vaø laâm nghieäp ñöôïc toùm taét nhö sau: Kieåm soaùt ñöôïc dòch beänh caây troàng. Baèng phöông phaùp nuoâi caáy moâ hay nuoâi caáy teá baøo, ta hoaøn toaøn coù theå loaïi ñöôïc nhöõng caù theå nhieãm beänh hay mang maàm beänh. Kieåm soaùt ñöôïc chaát löôïng gioáng thoâng qua kieåm soaùt kieåu gen cuûa gioáng ñem vaøo saûn xuaát. Kieåm soaùt ñöôïc toaøn boä kyõ thuaät töø khaâu nhaân gioáng ñeán khaâu thu hoaïch. Taïo ra söï ñoàng loaït veà gioáng, töø ñoù taïo ra söï ñoàng loaït cuûa saûn phaåm cuoái. Söï ñoàng loaït naøy seõ giuùp cô giôùi hoùa ñöôïc khaâu troàng troït vaø khaâu thu hoaïch. Do ñoù, naêng suaát lao ñoäng seõ taêng leân. Chaát löôïng saûn phaåm ñoàng nhaát, taïo ñieàu kieän cho khaâu tieâu thuï vaø cheá bieán. Toùm laïi, nuoâi caáy moâ hay nuoâi caáy teá baøo thöïc vaät ñaõ ñem laïi hieäu quaû to lôùn trong saûn xuaát noâng nghieäp vaø laâm nghieäp. Ñaây thöïc söï ñaõ vaø ñang laø cuoäc caùch maïng xanh trong ngaønh troàng troït. Nhöõng thuaän lôïi vaø khoù khaên cuûa phöông phaùp nhaân gioáng in vitro Moät soá thuaän lôïi cuûa phöông phaùp nhaân gioáng in vitro (Pierik, 1975, Anonymous, 1980; van Assche, 1983; Gebhard vaø coäng söï, 1983; Kunneman-Kooij, 1984): Nhaân gioáng voâ tính in vitro nhanh hôn nhaân gioáng voâ tính in vivo. Coù theå taùi sinh ñöôïc moät soá loaøi thöïc vaät maø khoâng theå tieán haønh in vivo vaø söï taêng tröôûng cuûa nhöõng caây nhaân gioáng voâ tính in vitro thöôøng maïnh hôn do nhaân gioáng in vitro coù theå caûm öùng ñöôïc söï treû hoùa cuûa moâ vaø taïo ñöôïc caây saïch beänh vì coù söï choïn loïc caùc ñoái töôïng saïch beänh ñeå ñöa maãu vaøo nuoâi caáy, ñoàng thôøi cuõng coù theå xöû lyù maãu caáy cuûa caùc caây coù mang maàm beänh tröôùc khi ñöa vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy. Caùc caây saïch beänh naøy coù theå ñöôïc trao ñoåi deã daøng giöõa caùc nôi vôùi nhau do caây coù kích thöôùc nhoû vaø khoâng troàng trong ñaát. Trong nuoâi caáy in vitro chæ söû duïng nhöõng maãu caáy ban ñaàu raát nhoû cho neân coù theå choïn loïc kyõ löôõng vaø deã daøng. Do caây in vitro ñöôïc nuoâi caáy trong ñieàu kieän hoaøn toaøn thích hôïp (nguoàn dinh döôõng vaø ñieàu kieän moâi tröôøng) do ñoù coù theå saûn xuaát caây con quanh naêm. Coù theå söû duïng caây nhaân gioáng in vitro ñeå laøm caây meï cho caùc böôùc nhaân gioáng keá tieáp. Coù theå taïo ra caùc ñoät bieán ñieåm trong quaù trình nuoâi caáy. Phöông phaùp nhaân gioáng in vitro ñaëc bieät höõu duïng ñeå taïo ra caùc ngaân haøng gen. Caùc teá baøo traàn vaø huyeàn phuø teá baøo laø ñoái töôïng höõu duïng trong vieäc lai soma. Moät soá loaïi caây bò maát khaû naêng sinh saûn höõu tính nhö caùc caây ñôn boäi, caây baát thuï ñöïc, caây baát thuï do ñoät bieán… coù theå ñöôïc duy trì vaø nhaân gioáng baèng phöông phaùp nhaân gioáng in vitro. Tuy nhieân beân caïnh nhöõng thuaän lôïi treân, phöông phaùp nhaân gioáng in vitro coù nhöõng baát lôïi sau: Kieåu gen thöïc vaät khoâng ñöôïc oån ñònh trong moät soá heä thoáng nuoâi caáy. Ñaëc bieät ñoái vôùi moät soá loaøi caây thaân goã, vieäc caûm öùng reã raát khoù thöïc hieän. Vieäc chuyeån caây töø trong oáng nghieäm ra vöôøn öôm raát khoù ñoái vôùi moät soá caây. Caây khi ñöôïc chuyeån töø phoøng thí nghieäm ra vöôøn öôm raát deã bò taán coâng bôûi moät soá loaïi beänh haïi do noù ñaõ quen soáng trong ñieàu kieän voâ truøng. Vì vaäy, caàn phaûi xöû lyù moâi tröôøng vaø giaù theå soáng cuûa caây thaät caån thaän. Khaû naêng taùi sinh caây coù theå bò maát ñi do vieäc caáy chuyeån moâ seïo vaø huyeàn phuø teá baøo ñöôïc laëp laïi nhieàu laàn. Ñoái vôùi moät soá moâ, vieäc voâ truøng tröôùc khi ñöa vaøo caáy raát khoù thöïc hieän. Phöông phaùp nhaân gioáng in vitro toán nhieàu coâng lao ñoäng laøm cho giaù thaønh cuûa caây taêng leân. ÖÙng duïng cuûa kyõ thuaät nuoâi caáy moâ Phöông phaùp nuoâi caáy moâ vaø teá baøo thöïc vaät ñöôïc öùng duïng trong moät soá lónh vöïc nhö: Lai taïo giöõa nhöõng loaøi xa nhau veà di truyeàn baèng phöông phaùp dung hôïp (nuoâi caáy teá baøo traàn). Nuoâi caáy teá baøo thöïc vaät trong moâi tröôøng loûng (nuoâi caày huyeàn phuø teá baøo) treân quy moâ lôùn ñeå saûn xuaát caùc hôïp chaát thöù caáp nhö alkaloid, glycoside, caùc steroid (duøng trong y hoïc), chaát dính duøng trong coâng nghieäp thöïc phaåm, nhöõng chaát kìm haõm söï sinh tröôûng cuûa vi khuaån duøng trong noâng nghieäp. Choïn loïc teá baøo coù nhöõng ñaëc tính mong muoán, cho phaùt trieån thaønh caây con thay vì choïn loïc caây ngoaøi ñoàng ruoäng (nuoâi caáy teá baøo ñôn). Saûn xuaát doøng caây ñoàng hôïp töû (nuoâi caáy bao phaán vaø tuùi phaán). Vi nhaân gioáng nhöõng gioáng caây coù giaù trò khoa hoïc vaø thöông maïi. Baûo quaûn phoâi vaø cô quan trong ñieàu kieän nhieät ñoä thaáp. Nuoâi caáy phoâi sinh döôõng, phoâi hôïp töû. Nuoâi caáy quang töï döôõng. Caùc cô quan thöïc vaät ñöôïc duøng trong nuoâi caáy moâ Baûng 2.1. Caùc cô quan thöïc vaät ñöôïc duøng trong nuoâi caáy moâ Nguoàn goác maãu caáy Kích thöôùc Maãu ñöôïc taùch Ñænh sinh tröôûng 0,5 – 1 mm Teá baøo ñænh sinh tröôûng Choài ñænh 0,5 – 1 cm Choáp ñænh coù chöùa moät phaàn thaân Choài beân 0,5 – 1 cm Choài beân coù chöùa moät phaàn thaân, laù vaø choài naùch Maãu laù 0,2 – 0,3 cm Maãu laù ñöôïc caét nhoû, phaân nöûa ñöôïc caáy chìm vaøo moâi tröôøng Phieán laù 0,2 – 1 cm Phieán laù non ñöôïc ñaët treân moâi tröôøng, maët döôùi ñaët treân maët thaïch Reã 0,5 – 1 cm Maãu reã ñöôïc ñaët treân maët thaïch Daïng cuû haønh 1 – 2 cm Maãu ñöôïc ñaët treân maët hay ñöôïc caáy chìm phaân nöõa vaøo moâi tröôøng Haït naûy maàm 2 – 3 mm Choài non Haït phaán 0,1 – 0,5 mm Haït phaán trong tuùi phaán Caùc böôùc nhaân gioáng in vitro Quaù trình nhaân gioáng in vitro ñöôïc chia thaønh caùc giai ñoaïn sau: Choïn löïa vaø khöû truøng maãu caáy Khi choïn caây meï phaûi chuù yù xaùc ñònh ñuùng caây caàn nhaân gioáng. Caây meï phaûi saïch beänh vaø toát nhaát laø choïn caây troàng trong nhaø kính hoaëc trong phoøng taêng tröôûng. Keát quaû nhaân gioáng toát nhaát coù theå ñaït ñöôïc khi maãu caáy ñöôïc laáy vaøo thôøi ñieåm taêng tröôûng maïnh nhaát cuûa caây meï. Muïc tieâu cuûa vieäc khöû truøng maãu caáy laø thu ñöôïc moät löôïng lôùn caùc maãu caáy voâ truøng vaø vaãn coøn khaû naêng taêng tröôûng. Khöû truøng beà maët maãu caáy bao goàm röûa maãu vaø khöû truøng maãu caáy. + Maãu thu ñöôïc phaûi röûa döôùi voøi nöôùc chaûy töø 30 phuùt – 2 giôø, sau ñoù röûa maãu baèng xaø phoøng seõ laøm giaûm ñaùng keå nguoàn laây nhieãm treân maãu caáy. + Maãu sau khi röûa saïch seõ ñöôïc ngaâm chìm trong dung dòch khöû truøng ñeå khöû caùc nguoàn laây nhieãm treân beà maët maãu caáy. Dung dòch thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå khöû truøng maãu laø hypochlorite sodium 0,5 – 5,25%, coàn, hypochlorite calcium, oxy giaø, nitrate baïc, dung dòch bromine, chlorur thuûy ngaân. Khi theâm Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) vaøo dung dòch khöû truøng thì seõ laøm taêng hieäu quaû khöû truøng vì laøm giaûm söùc caêng beà maët giöõa nöôùc vaø moâ thöïc vaät nhö vaäy beà maët maãu tieáp xuùc vôùi chaát khöû truøng toát hôn. + Sau khi khöû truøng maãu caáy phaûi ñöôïc röûa laïi vaøi laàn baèng nöôùc caát voâ truøng trong tuû caáy ñeå röûa saïch caùc chaát khöû truøng coøn baùm treân beà maët maãu, nhöõng phaàn bò toån thöông phaûi ñöôïc caét boû, ñoàng thôøi maãu caáy phaûi ñöôïc caét theo kích thöôùc thích hôïp. + Maãu thöïc vaät thöôøng bò nhieãm beân trong vaø coù theå ñöôïc khöû truøng baèng caùch boå sung benomyl hoaëc benlate 10mg/l trong moâi tröôøng nuoâi caáy hoaëc xöû lyù maãu baèng caùc chaát naøy tröôùc khi khöû truøng. + Maãu caáy cuûa vaøi loaøi thöïc vaät coù theå hoùa naâu hoaëc ñen sau vaøi ngaøy keå töø khi baét ñaàu nuoâi caáy. Khi bò hoùa naâu thì söï taêng sinh cuûa maãu seõ bò öùc cheá vaø laâu ngaøy maãu seõ cheát. Hieän töôïng hoùa naâu naøy xaûy ra khi trong maãu caáy coù chöùa moät löôïng lôùn tannin hoaëc caùc hôïp chaát hydroxyphenol. Caùc moâ non thöôøng ít bò hoùa naâu hôn moâ tröôûng thaønh hay moâ giaø. Hieän töôïng hoaïi töû hoaëc hoùa naâu laø do hoaït ñoäng cuûa enzyme oxidase coù nhaân Cu (ví duï nhö polyphenoloxidase vaø tryosinase), noù ñöôïc toång hôïp vaø phoùng thích tuøy thuoäc vaøo veát thöông trong suoát quaù trình caét vaø khöû truøng maãu. Phöông phaùp thöôøng ñöôïc söû duïng nhieàu nhaát ñeå ngaên caûn hieän töôïng hoùa naâu laø duøng than hoaït tính ñeå haáp thuï bôùt caùc hôïp chaát phenol ñöôïc tieát ra. Löôïng thöôøng duøng 0,5 – 5 g/l. Ngoaøi ra coøn coù moät soá chaát khaùc nhö: polyvinyl pyrolidone (PVP), acid ascorbic, acid citric, L–cystein, hydrochlorite, 1,4 – ditheithreitol, glutathione vaø mercaptoethanol. Khi nghieân cöùu enzyme phenolase ngöôøi ta thaáy raèng enzyme naøy hoaït ñoäng maïnh ôû pH 6,5 vaø hoaït ñoäng yeáu ôû pH thaáp. Vì vaäy, neáu giaûm pH thì seõ giaûm ñöôïc hieän töôïng hoùa naâu. Toùm laïi, töø kinh nghieäm thöïc tieãn ngöôøi ta ruùt ra raèng ñeå laøm giaûm hieän töôïng hoùa naâu cuûa maãu caáy neân: Söû duïng maãu caáy nhoû ôû moâ non. Gaây veát thöông treân maãu vôùi kích thöôùc nhoû nhaát. Ngaâm maãu vaøo dung dòch acid ascorbic trong vaøi giôø tröôùc khi caáy vaøo moâi tröôøng. Nuoâi caáy maãu trong moâi tröôøng loûng coù löôïng O2 thaáp, khoâng coù aùnh saùng trong 1 – 2 tuaàn ñaàu. Chuyeån maãu töø moâi tröôøng coù chaát kích thích sinh tröôûng noàng ñoä thaáp sang moâi tröôøng coù chaát kích thích sinh tröôûng noàng ñoä cao. Chuyeån maãu lieân tuïc trong khoaûng thôøi gian 2 – 4 tuaàn keå töø khi baét ñaàu nuoâi caáy thì moät löôïng lôùn caùc hôïp chaát phenol seõ khoâng tích tuï. Taïo theå nhaân gioáng in vitro Maãu nuoâi caáy ñöôïc caáy treân moâi tröôøng choïn loïc ñaëc bieät nhaèm muïc ñích taïo theå nhaân gioáng in vitro. Coù hai theå nhaân gioáng in vitro: theå choài, theå caét ñoát. Taïo theå nhaân gioáng in vitro döïa vaøo ñaëc ñieåm nhaân gioáng ngoaøi töï nhieân cuûa caây troàng. Tuy nhieân, coù nhöõng loaøi caây troàng khoâng coù khaû naêng nhaân gioáng, ngöôøi ta thöôøng nhaân gioáng baèng caùch taïo cuïm choài töø moâ seïo. Ñeå nhaân gioáng, trong moâi tröôøng nuoâi caáy thöôøng boå sung cytokinin, GA3 vaø caùc chaát höõu cô khaùc. Nhaân gioáng in vitro Ñaây laø giai ñoaïn quan troïng trong vieäc nhaân gioáng caây troàng baèng phöông phaùp nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät nhaèm muïc ñích taêng sinh khoái theå nhaân gioáng. Vaät lieäu nuoâi caáy laø nhöõng theå choài, moâi tröôøng nuoâi caáy thoâng thöôøng gioáng vôùi moâi tröôøng taïo theå choài, ñoâi khi noàng ñoä chaát sinh tröôûng giaûm thaáp cho phuø hôïp vôùi quaù trình nhaân gioáng keùo daøi. Ñieàu kieän nuoâi caáy thích hôïp giuùp cho quaù trình taêng sinh ñöôïc nhanh. Caây nhaân gioáng in vitro coù traïng thaùi sinh lyù treû vaø ñöôïc duy trì trong thôøi gian voâ haïn. Taùi sinh caây hoaøn chænh in vitro Ñaây laø giai ñoaïn taïo caây con hoaøn chænh coù ñaày ñuû thaân, laù vaø reã chuaån bò chuyeån ra vöôøn öôm caây. Caây con phaûi khoûe maïnh nhaèm naâng cao söùc soáng khi ra moâi tröôøng bình thöôøng. Caùc chaát coù taùc duïng taïo choài ñöôïc loaïi boû, thay vaøo ñoù laø caùc chaát kích thích quaù trình taïo reã. Ñieàu kieän nuoâi caáy töông töï vôùi ñieàu kieän töï nhieân beân ngoaøi, moät böôùc thuaàn hoùa tröôùc khi ñöôïc taùch ra khoûi ñieàu kieän in vitro. Söï ra reã phuï thuoäc vaøo nhieàu yeáu toá: haøm löôïng auxin noäi sinh, tyû leä C/N, aùnh saùng, söï treû hoøa cuûa maãu, kieåu di truyeàn. Ngöôøi ta thöôøng boå sung auxin ñeå kích thích quaù trình ra reã in vitro. Chuyeån caây con in vitro ra vöôøn öôm Ñaây laø giai ñoaïn khoù khaên nhaát trong quaù trình nhaân gioáng voâ tính. Caây in vitro ñöôïc nuoâi caáy trong ñieàu kieän oån ñònh veà dinh döôõng, aùnh saùng, nhieät ñoä, ñoä aåm… Neân khi chuyeån ra ñaát, vôùi ñieàu kieän töï nhieân hoaøn toaøn khaùc haún nhö dinh döôõng thaáp, aùnh saùng coù cöôøng ñoä maïnh, nhieät ñoä cao, aåm ñoä thaáp, caây con deã daøng bò stress, deã maát nöôùc vaø mau heùo. Ñeå traùnh tình traïng naøy, vöôøn öôm caây caáy moâ phaûi maùt, cöôøng ñoä chieáu saùng thaáp, nhieät ñoä khoâng khí maùt, aåm ñoä cao,… caây con thöôøng ñöôïc caáy trong luoáng öôm caây coù cô chaát deã thoaùt nöôùc, tôi xoáp, giöõ ñöôïc aåm, trong nhöõng ngaøy ñaàu caàn phaûi ñöôïc phuû nylon ñeå giaûm quaù trình thoaùt nöôùc ôû laù (thöôøng 7-10 ngaøy keå töø ngaøy caáy). Reã ñöôïc taïo ra trong quaù trình caáy moâ seõ daàn daàn bò luïi ñi vaø reã môùi xuaát hieän, caây con thöôøng ñöôïc xöû lyù vôùi chaát kích thích ra reã baèng caùch ngaâm hay phun leân ñeå ruùt ngaén thôøi gian ra reã. Quaù trình taùi sinh cô quan trong nhaân gioáng in vitro Söï taùi sinh cô quan trong nuoâi caáy moâ khoâng xaûy ra ngay khi vöøa coâ laäp maãu caáy maø phaûi traûi qua moät quaù trình raát phöùc taïp vì: Quaù trình taùi sinh chæ xaûy ra khi moái töông quan cuõ ñöôïc phaù vôõ vaø nhöõng moái töông quan môùi ñöôïc hình thaønh. Quaù trình naøy bao goàm nhieàu giai ñoaïn khaùc nhau: Loaïi boû söï phaûn bieät hoùa cuûa caùc teá baøo phaûn bieät hoùa (daãn ñeán söï treû hoùa teá baøo). Söï phaân chia teá baøo (ñoâi khi daãn ñeán söï hình thaønh moâ seïo): söï hình thaønh cô quan baét ñaàu xaûy ra khi söï phaân chia teá baøo dieãn ra. Söï hình thaønh cô quan Söï phaùt trieån cô quan Söï taùi sinh bò giôùi haïn veà soá löôïng vaø chaát löôïng do nhieàu nhaân toá: Caùc yeáu toá noäi sinh trong maãu caáy Ñieàu kieän taêng tröôûng cuûa caây meï trong nhaø kính hoaëc ngoaøi thieân nhieân Vò trí cuûa maãu caáy treân caây Thôøi gian thu maãu trong naêm Haøm löôïng chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng thöïc vaät noäi sinh Kích thöôùc cuûa maãu caáy, phöông phaùp caáy, nuoâi, thaønh phaàn döôõng chaát trong moâi tröôøng nuoâi caáy, caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng, caùc yeáu toá vaät lyù trong quaù trình nuoâi caáy nhö nhieät ñoä, aùnh saùng,… söï boå sung moät soá cô chaát khaùc vaøo trong moâi tröôøng,… Nhöõng nguyeân nhaân treân cho thaáy quaù trình taùi sinh cô quan trong nuoâi caáy moâ raát phöùc taïp, chuùng ta khoâng theå ñeà caäp heát nhöõng khía caïnh lieân quan nhöng caàn löu yù ñeán moät soá vaán ñeà sau: Quaù trình taùi sinh phöùc taïp do chòu söï töông taùc cuûa nhieàu nhaân toá khaùc nhau (moâi tröôøng dinh döôõng, aùnh saùng, nhieät ñoä vaø caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng,…). Khoâng theå khaùi quaùt chung quaù trình taùi sinh cho taát caû caùc loaøi vì moãi loaøi khaùc nhau caàn ñieàu kieän taùi sinh khaùc nhau. Khoù coù theå ñieàu hoøa quaù trình taùi sinh vì khaû naêng taùi sinh cuûa moãi loaøi khaùc nhau: trong nhöõng tröôøng hôïp naøy caùc nhaân toá noäi sinh ñoùng vai troø quyeát ñònh do ñoù caùc yeáu toá ngoaïi sinh nhö chaát ñieàu hoøa aûnh höôûng khoâng nhieàu. Söï hình thaønh reã baát ñònh thöôøng ñoái laäp vôùi söï hình thaønh choài baát ñònh. Neáu caû hai quaù trình naøy ñöôïc thuùc ñaåy ñoàng thôøi, caây con taïo ra seõ mang nhieàu thieáu soùt. Ñeå thu nhaän moät caây hoaøn chænh toát nhaát chuùng ta neân taïo choài baát ñònh tröôùc sau ñoù caûm öùng taïo reã. Söï hình thaønh choài baát ñònh Ngöôøi ta söû duïng phöông phaùp taïo choài baát ñònh nhö moät phöông phaùp nhaân gioáng voâ tính nhaèm laøm taêng soá löôïng caây mong muoán. Caùc loaïi caây thöôøng ñöôïc aùp duïng phöông phaùp naøy ñeå nhaân gioáng ví duï nhö: Saintpaulia, Begonia, Achimenes, Streptocarpus, Lily, lan daï höông, Nerin… Coù nhieàu ñieåm gioáng nhau giöõa taïo choài baát ñònh vaø taïo reã baát ñònh: Söï hình thaønh choài baát ñònh ôû caây haït traàn chæ thaønh coâng khi söû duïng caùc boä phaän cuûa caây con (Anonymous, 1984). Ñöôøng luoân luoân ñoùng vai troø quan troïng trong söï taïo cô quan (choài vaø reã). Söï hình thaønh choài vaø reã ñeàu bò öùc cheá bôûi gibberellin vaø acid abscisic. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán söï taïo choài baát ñònh AÙnh saùng AÙnh saùng kích thích söï taïo choài nhöng cuõng coù moät soá tröôøng hôïp ngoaïi leä laø coù moät soá caây troàng laïi coù theå taïo choài deã daøng hôn khi ôû trong toái: choài hoa cuûa Freesia (Pierik vaø Steegmans, 1975), cuoáng hoa Eucharis grandiflora vaø Nerine bowdenii (Pierik, 1985; Pierik vaø Steegmans, 1986). Economou vaø Read (1986) cho bieát raèng caùc maãu caáy laù cuûa Petunia hyrbida taêng tröôûng treân moâi tröôøng khoâng coù cytokinin vaø ñöôïc xöû lyù vôùi aùnh saùng ñoû thì taïo ra nhieàu choài coù troïng löôïng töôi lôùn hôn laø ñöôïc nuoâi caáy döôùi aùnh saùng ñoû xa. Tuy nhieân, treân moâi tröôøng coù BA thì khi xöû lyù vôùi aùnh saùng ñoû vaø aùnh saùng ñoû xa thì seõ taïo ra soá löôïng choài vaø troïng löôïng töôi cuûa chuùng töông töï nhau vaø nhieàu hôn treân moâi tröôøng khoâng coù cytokinin. Nhieät ñoä Nhieät ñoä cao caàn thieát cho söï taïo choài nhöng cuõng coù moät soá tröôøng hôïp ngoaïi leä nhö Begonia (Heide, 1965) vaø Streptocarpus (Appelgren vaø Heide, 1972). Chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng thöïc vaät Nhu caàu veà auxin vaø cytokinin trong söï taïo choài baát ñònh coù phaàn phöùc taïp: Coù nhöõng loaøi thöïc vaät veà maët cô baûn khoâng caàn caû auxin laãn cytokinin ñeå taïo choài baát ñònh nhö: rau dieáp xoaên (Pierik, 1966), Streptocarpus (Appelgren vaø Heide, 1972; Rossini vaø Nitsch, 1966). Haàu heát caùc loaøi thöïc vaät ñeàu caàn ñeán cytokinin ñeå caûm öùng söï taïo choài, trong khi auxin laïi coù vai troø ngöôïc laïi (Miller vaø Skoog, 1953; Paulet, 1965; Nitsch, 1968). Coù moät soá thöïc vaät caàn ñeán auxin ngoaïi sinh ñeå taïo choài, ñoù laø tröôøng hôïp Lili (van Aartrijk, 1984), lan daï höông (Pierik vaø Steegmans, 1975). Moät noàng ñoä cytokinin cao phoái hôïp vôùi auxin noàng ñoä thaáp raát quan troïng trong vieäc taïo choài ôû nhieàu loaøi thöïc vaät khaùc nhau nhö Begonia (Ringe vaø Nitsch, 1968; Heide, 1965) vaø caây boâng caûi (Margara, 1969). Chuùng ta coù theå keát luaän raèng ôû nhöõng loaøi caàn cytokinin vaø auxin cho söï taùi sinh choài, noàng ñoä cytokinin bao giôø cuõng cao hôn noàng ñoä auxin. Tæ leä cuûa hai chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng naøy seõ quyeát ñònh söï hình thaønh cô quan (Skoog vaø Tsui, 1948; Miller vaø Skoog, 1953). Cytokinin BA raát hieäu quaû trong vieäc thuùc ñaåy taïo choài ôû nhieàu loaøi thöïc vaät nhöng neáu söû duïng BA ôû noàng ñoä cao seõ xuaát hieän nhieàu bieán dò (choài bieán daïng). Trong moät soá tröôøng hôïp, söï keát hôïp giöõa cytokinin vaø adenine (sulphate) seõ taêng hieäu quaû taïo choài (Skoog vaø Miller, 1957; Nitsh vaø coäng söï, 1969). Moät soá tröôøng hôïp, vieäc söû duïng moät mình adenine cuõng coù theå caûm öùng taïo choài: Begonia (Ringle vaø Nitsch, 1968), caây thuoác laù (Skoog vaø Tsui, 1948). Söï gia taêng noàng ñoä gibberellin öùc cheá quaù trình taïo choài: ôû loaøi Begonia rex (Schrandolf vaø Reinert, 1959), Plumbago indica (Nitsch, 1968)… Acid abscisic öùc cheá söï hình thaønh choài baát ñònh maëc duø vaãn coù tröôøng hôïp caûm öùng söï hình thaønh choài nhö ôû caây Ipomoea batatas. Söï hình thaønh reã baát ñònh Reã baát ñònh ñöôïc hình thaønh treân caùc cô quan khaùc nhau cuûa caây, nôi moâ cuûa chuùng coøn giöõ khaû naêng phaân sinh. Quaù trình hình thaønh reã raát quan troïng vì noù aûnh höôûng ñeán khaû naêng soáng soùt cuûa maãu caáy khi caây in vitro ñöôïc chuyeån ra vöôøn öôm. Coù nhieàu yeáu toá aûnh höôûng ñeán söï hình thaønh reã baát ñònh: ñaëc ñieåm di truyeàn cuûa loaøi, tuoåi cuûa maãu, vò trí cuûa maãu caáy treân thaân, kích thöôùc maãu caáy, veát thöông, soá laàn caáy chuyeån, nguoàn oxy, aùnh saùng, nhieät ñoä, chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng, than hoaït tính, ñöôøng, agar, pH,… Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình phaùt sinh hình thaùi trong nuoâi caáy in vitro AÛnh höôûng cuûa maãu caáy Vaät lieäu nuoâi caáy laø moät trong nhöõng yeáu toá quan troïng aûnh höôûng ñeán söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån in vitro: Kieåu di truyeàn Khaû naêng taùi sinh cuûa thöïc vaät raát ña daïng. Nhöõng caây hai laù maàm thoâng thöôøng coù khaû naêng taùi sinh maïnh hôn caây moät laù maàm vaø caây haït traàn raát khoù taùi sinh (tröø khi chuùng coøn non). Trong soá caùc caây hai laù maàm, Solanaceae, Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae, Cruciferae laø nhöõng hoï thöïc vaät deã taùi sinh nhaát. Neáu moät loaøi deã taùi sinh cô quan trong töï nhieân (caùc gioáng lai Saintpaulia ionantha, Begonia rex, Streptocarpus) thì chuùng haàu nhö deã taùi sinh in vitro. Cuõng coù nhöõng tröôøng hôïp ngoaïi leä nhö nhöõng ñoaïn caét töø laù cuûa Kalanchoe farinacea haàu nhö khoâng coù khaû naêng hình thaønh choài baát ñònh in vivo nhöng coù theå thöïc hieän trong ñieàu kieän in vitro, ñieàu naøy coù theå do söï haáp thu caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng coù trong moâi tröôøng nuoâi caáy. Tuoåi cuûa caây Caùc moâ phoâi thöôøng coù khaû naêng taùi sinh cao do ñoù ôû nguõ coác ngöôøi ta thöôøng duøng phoâi vaø haït laøm vaät lieäu nuoâi caáy moâ. Khi caây giaø ñi, khaû naêng taùi sinh cuûa chuùng cuõng giaûm theo vaø caùc boä phaän cuûa caây non deã taùi sinh hôn nhö trong tröôøng hôïp caây buïi. Khi moâ phaân sinh vaø choài ñænh ñöôïc taùch khoûi caây meï thì chuùng vaãn giöõ nhöõng ñaëc tính giaø hay non trong ñieàu kieän in vitro tuøy vaøo ñieàu kieän ban ñaàu. Ñoâi khi qua nhieàu laàn caáy chuyeån, moâ phaân sinh giaø töøng böôùc ñöôïc treû hoùa do taêng khaû naêng taùi sinh vaø phaân chia teá baøo. Ñieàu naøy ñöôïc chöùng minh treân nhöõng ñoái töôïng nhö Pinus vinifera, Malus sylvestris, Cryptomeria japonica. Tuoåi cuûa moâ vaø cô quan Nhöõng moâ coøn non vaø meàm thöôøng deã nuoâi caáy hôn nhöõng moâ cöùng nhöng cuõng coù nhieàu tröôøng hôïp ngoaïi leä. Caùc maãu caáy töø cuoáng laù coøn non taùi sinh toát hôn nhöõng maãu caáy töø cuoáng laù giaø do cô quan cuûa chuùng giaø hôn neân khaû naêng taùi sinh vaø phaân chia teá baøo giaûm. Khaû naêng taùi sinh cuûa nhöõng loaøi khaùc nhau taêng leân trong suoát giai ñoaïn ra hoa: caùc boä phaän cuûa phaùt hoa coøn non ñoâi khi taùi sinh raát maïnh, ví duï nhö Freesia (Bajaj vaø Pierik, 1974), Lunaria annua (Pierik vaø coäng söï, 1974), Primula obconica ( Coumans vaø coäng söï, 1979). Tình traïng sinh lyù Tình traïng sinh lyù aûnh höôûng maïnh ñeán khaû naêng taùi sinh vaø phaân chia teá baøo in vitro. Thoâng thöôøng caùc boä phaän cuûa caây trong giai ñoaïn sinh döôõng deã taùi sinh hôn trong giai ñoaïn sinh saûn. Caùc maãu caáy töø vaûy cuûa caây hueä taây ôû giai ñoaïn sinh döôõng taùi sinh toát hôn nhöõng maãu caáy ôû giai ñoaïn sinh saûn (Robb, 1957). Caùc choài cuûa caây trong giai ñoaïn nguû ñoâng (cuoái thu ñaàu ñoâng) khoù nuoâi caáy in vitro hôn choài cuûa nhöõng caây ñaõ vöôït qua ñöôïc giai ñoaïn naøy (vaøo muøa xuaân tröôùc khi chuùng baét ñaàu phaùt trieån). Vò trí cuûa maãu caáy treân caây Ever (1984) ñaõ khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa vò trí maãu caáy leân söï sinh tröôûng vaø phaùt trieàn in vitro sau khi taùch maãu ôû caây Pseudotsuga menziesii, oâng nhaän thaáy nhöõng choài ban ñaàu ñöôïc taùch töø nhöõng vò trí thaáp treân caây phaùt trieån trong moâi tröôøng in vitro toát hôn, vaø choài goác taêng tröôûng nhanh hôn choài naùch. Söï hình thaønh caùc giaû haønh baát ñònh cuûa maãu caáy lan daï höông ñöôïc taùch ra töø phaàn goác cuûa vaûy haønh toát hôn töø phaàn ñænh. Ñieàu naøy cuõng xaûy ra töông töï ñoái vôùi Lily (Robb, 1957). Ñieàu ñaùng löu yù laø nhöõng moâ seïo phaùt sinh töø nhöõng maãu caáy coù nguoàn goác töø caùc phaàn khaùc nhau cuûa caây nhö reã, choài, cuoáng laù ñeàu coù phaûn öùng in vitro gioáng nhau. Kích thöôùc maãu caáy Caùc caáu truùc nhoû nhö teá baøo, cuïm teá baøo vaø moâ phaân sinh khoù caûm öùng ñeå taêng tröôûng hôn nhöõng caáu truùc lôùn nhö thaân, laù, cuû. Caùc phaàn ñöôïc taùch rôøi khoûi caây töï noù cung caáp chaát dinh döôõng vaø hormone, do ñoù maãu caáy coù kích thöôùc caøng lôùn caøng deã taùi sinh vaø phaùt trieån. Caùc boä phaän cuûa caây coù chöùa nhieàu chaát dinh döôõng döï tröõ nhö cuû, thaân haønh thöôøng deã taùi sinh treân moâi tröôøng in vitro hôn nhöõng cô quan ít chaát döï tröõ. Ñoái vôùi nhöõng maãu bò caét, phaàn traêm beà maët bò toån thöông cuõng aûnh höôûng ñeán khaû naêng taùi sinh. AÛnh höôûng cuûa veát thöông leân söï taùi sinh cuûa caùc maãu caáy töø vaûy haønh Lily ñaõ ñöôïc Aartrijk (1984) chöùng minh. Veát thöông Söï toån thöông treân beà maët maãu caáy ñoùng vai troø quan troïng trong söï taùi sinh maãu caáy. Beà maët toån thöông taêng leân laøm gia taêng söï haáp thu chaát dinh döôõng vaø caùc chaát ñieàu hoøa ñoàng thôøi ethylene ñöôïc taïo ra nhieàu hôn. Ngoaøi ra, coù theå taêng cöôøng söï hình thaønh reã baát ñònh baèng veát thöông. Phöông phaùp caáy Caùc maãu caáy coù theå ñöôïc ñaët treân moâi tröôøng theo nhieàu caùch khaùc nhau: coù cöïc (thaúng ñöùng vôùi phaàn goác caém xuoáng moâi tröôøng) hoaëc khoâng cöïc (caém phaàn ngoïn xuoáng moâi tröôøng). Choài vaø reã thöôøng taùi sinh deã vaø nhanh khi maãu ñöôïc caáy khoâng cöïc (Pierik vaø Steegmans, 1975). Maãu taùi sinh toát khi ñöôïc cung caáp ñaày ñuû oxy nhöng nhöõng nhaân toá khaùc cuõng ñoùng vai troø quan troïng. Phaàn goác cuûa maãu caáy khoâng cöïc coù caùc chaát döï tröõ khoâng coù khaû naêng khueách taùn vaøo trong agar do noù khoâng tieáp xuùc vôùi moâi tröôøng. Nhö ôû tröôøng hôïp taát caû caùc caây thuoäc hoï Amaryllidaceae (Pierik vaø coäng söï, 1974), söï taùi sinh chæ xaûy ra ôû phaàn goác cuûa vaûy haønh, do ñoù phöông phaùp caáy khoâng cöïc daãn ñeán söï hình thaønh thaân haønh baát ñònh toát hôn phöông phaùp caáy coù cöïc. AÛnh höôûng cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy Moät trong nhöõng yeáu toá quan troïng nhaát ñoái vôùi söï taêng tröôûng vaø phaùt sinh hình thaùi cuûa teá baøo vaø moâ thöïc vaät trong nuoâi caáy laø thaønh phaàn moâi tröôøng. Thaønh phaàn naøy thay ñoåi tuøy theo loaøi vaø boä phaän nuoâi caáy. Ñoái vôùi cuøng moät maãu caáy nhöng tuøy theo muïc ñích thí nghieäm maø thaønh phaàn moâi tröôøng cuõng thay ñoåi. Moâi tröôøng coøn thay ñoåi tuøy theo giai ñoaïn phaân hoùa cuûa maãu caáy. Tuy nhieân, taát caû caùc moâi tröôøng ñeàu bao goàm naêm thaønh phaàn: khoaùng ña löôïng, khoaùng vi löôïng, vitamin, ñöôøng (nguoàn carbon) vaø caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng thöïc vaät Khoaùng ña löôïng: nhu caàu khoaùng cuûa moâ, teá baøo thöïc vaät taùch rôøi khoâng khaùc nhieàu so vôùi caây troàng trong ñieàu kieän töï nhieân. Caùc nguyeân toá ña löôïng caàn phaûi cung caáp laø N, P, K¸Ca, Mg vaø Fe. Khoaùng vi löôïng: nhu caàu khoaùng vi löôïng trong nuoâi caáy moâ thöïc vaät in vitro laø lónh vöïc coøn ít nghieân cöùu. Tröôùc ñaây, khi kyõ thuaät nuoâi caáy moâ môùi ra ñôøi, ngöôøi ta khoâng nghó ñeán vieäc boå sung khoaùng vi löôïng vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy. Caùc thí nghieäm luùc ñoù thaønh coâng laø do agar vaø hoùa chaát duøng ñeå pha moâi tröôøng khoâng tinh khieát maø coù laãn moät soá nguyeân toá vi löôïng cung caáp phaàn naøo cho moâi tröôøng nuoâi caáy. Caùc nguyeân toá vi löôïng caàn cung caáp cho teá baøo laø: Mn, Zn, Cu, B, Co, I, Mo... Carbon vaø nguoàn naêng löôïng: trong nuoâi caáy in vitro, nguoàn carbon giuùp moâ vaø teá baøo thöïc vaät toång hôïp neân caùc höõu cô ñeå teá baøo phaân chia, taêng sinh khoái khoâng phaûi töø quaù trình quang hôïp maø chính töø nguoàn carbon boå sung vaøo moâi tröôøng döôùi daïng ñöôøng. Hai daïng ñöôøng thöôøng gaëp nhaát laø glucose vaø sucrose. Caùc nguoàn carbonhydrate khaùc cuõng ñöôïc tieán haønh thöû nghieäm nhö lactose, galactose, rafinose, maltose vaø tinh boät nhöng caùc carbonhydrate naøy coù hieäu quaû keùm hôn so vôùi glucose vaø sucrose. Sucrose laø moät nguoàn carbon quan troïng ñoái vôùi moâ vaø teá baøo nuoâi caáy. Vitamin: thoâng thöôøng thöïc vaät toång hôïp caùc vitamin caàn thieát cho söï taêng tröôûng vaø phaùt trieån cuûa chuùng. Chuùng caàn vitamin ñeå xuùc taùc caùc quaù trình bieán döôõng khaùc nhau. Khi teá baøo vaø moâ ñöôïc nuoâi caáy in vitro thì moät vaøi vitamin trôû thaønh yeáu toá giôùi haïn cho söï phaùt trieån cuûa chuùng. Caùc vitamin thöôøng ñöôïc söû duïng nhieàu nhaát trong nuoâi caáy moâ laø: thiamine (B1), acid nicotinic, pyridoxine (B6) vaø myo-inositol. Caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng thöïc vaät Chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng hoaït ñoäng vôùi lieàu löôïng raát thaáp, ôû lieàu löôïng cao chuùng trôû neân ñoäc, ñieàu naøy cho pheùp moät vaøi chaát kích thích toá ñöôïc söû duïng nhö caùc chaát dieät coû daïi. Caùc chaát ñieàu hoøa noäi sinh coù theå ñöôïc kieåm soaùt do cô cheá chuyeån hoùa cuûa teá baøo neân chuùng ñöôïc kieåm soaùt hoaëc ñaøo thaûi khaù nhanh. Traùi laïi caùc chaát ñieàu hoøa toång hôïp toàn taïi laâu hôn nhieàu neân thöôøng ñöôïc söû duïng cho caùc öùng duïng trong thöïc teá. Coù 5 nhoùm chaát ñieàu hoøa quan troïng trong nuoâi caáy moâ thöïc vaät: auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid vaø etylen: Auxin Auxin laø hôïp chaát coù nhaân indole, coù coâng thöùc nguyeân laø C10H9O2N. Auxin goàm coù hai loaïi laø auxin coù nguoàn goác noäi sinh do thöïc vaät taïo ra (IAA), vaø auxin toång hôïp do con ngöôøi taïo ra (IBA, NAA, 2,4-D,...). Auxin can thieäp vaøo nhieàu hieän töôïng sinh lyù, hoaït ñoäng cuûa noù tuøy thuoäc vaøo noàng ñoä vaø taùc ñoäng boå trôï cuûa chuùng vôùi caùc chaát ñieàu hoøa taêng tröôûng khaùc. Auxin taùc ñoäng leân söï keùo daøi teá baøo. Hieäu quaû naøy laø söï noái tieáp cho söï gia taêng tính ñaøn hoài cuûa thaønh teá baøo vaø cho söï xaâm nhaäp cuûa nöôùc vaøo beân trong teá baøo, söùc caêng cuûa thaønh teá baøo giaûm ñi vaø teá baøo töï keùo daøi ra. Auxin thay ñoåi tính thaåm thaáu cuûa maøng teá baøo, söï thay ñoåi naøy theå hieän baèng moät söï phoùng thích ion H+. Ion naøy gaây ra moät hoaït tính acid chòu traùch nhieäm laøm giaûm tính ñeà khaùng cuûa thaønh teá baøo bôûi söï haáp thu ion K+. Auxin taùc ñoäng leân caùc quaù trình chuyeån hoùa, ñaëc bieät nhaát laø treân söï toång hôïp RNA ribosome. Auxin kích thích söï phaân chia teá baøo moät caùch ñaëc bieät trong quaù trình hình thaønh moâ seïo vaø söï hình thaønh reã baát ñònh. Auxin cuõng öùc cheá söï phaùt trieån cuûa choài naùch vaø söï hình thaønh phoâi sinh döôõng trong moâi tröôøng nuoâi caáy moâ seïo. Taát caû caây troàng ñeàu toång hôïp auxin tuøy theo giai ñoaïn phaùt trieån cuûa chuùng. Auxin ñöôïc toång hôïp ôû laù non, trong caùc choài ñang hoaït ñoäng, ôû phaùt hoa, ôû caùc quaû coøn non vaø löu thoâng töø ñænh xuoáng phía döôùi vôùi moät söï phaân cöïc roõ raøng ñöôïc nhìn thaáy roõ treân caùc cô quan thöïc vaät coøn non. Nhöng trong quaù trình vaän chuyeån naøy, chuùng bò oxy hoùa do hoaït ñoäng cuûa caùc enzyme auxin – oxidase, ñieàu naøy cho thaáy noàng ñoä auxin luoân cao hôn ôû nhöõng vuøng toång hôïp ra chuùng. Ñoái vôùi moät soá loaøi, auxin caàn cho söï hình thaønh reã cuûa caùc caønh giaâm (Voõ Thò Baïch Mai, 2004). Cytokinin Cytokinin (goàm kinetin, BA, zeatin vaø 2iP) ñöôïc phaùt hieän sau auxin vaø gibberellin. Ngöôøi ta bieát raèng trong moâi tröôøng nuoâi caáy, vieäc boå sung cytokinin seõ taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho söï phaân chia teá baøo vaø hình thaønh choài. Cytokinin laø caùc hôïp chaát adenin ñöôïc thay theá, coù 2 nhoùm cytokinin noäi sinh ñöôïc bieát ñeán laø zeatin vaø IPA, ngoaøi ra coøn coù 2 nhoùm cytokinin toång hôïp ñöôïc söû duïng nhieàu nhaát trong nuoâi caáy moâ thöïc vaät laø Kinetin vaø BAP. Cytokinin taùc ñoäng hieäu quaû leân söï phaân chia teá baøo khi coù söï hieän dieän cuûa auxin: auxin taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho söï nhaân ñoâi DNA vaø cytokinin cho pheùp taùch rôøi nhieãm saéc theå. Cytokinin coù vai troø trong söï taïo cô quan thöïc vaät, chuùng kích thích maïnh meõ söï thaønh laäp choài non, traùi laïi chuùng laø chaát ñoái khaùng vôùi söï taïo reã. Cytokinin kích thích quaù trình chuyeån hoùa, baûo veä caùc chaát chuyeån hoùa choáng laïi taùc ñoäng cuûa enzyme phaân giaûi, laøm chaäm quaù trình laõo hoùa. Caùc choài naùch ñöôïc xöû lyù baèng cytokinin seõ taêng tröôûng vaø caïnh tranh vôùi choài ngoïn. Toùm laïi, cytokinin giuùp duy trì söï soáng cuûa moâ, kích thích söï phaân chia teá baøo vaø ñònh höôùng teá baøo trong con ñöôøng phaân hoùa, taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho nuoâi caáy in vitro. Gibberellin Gibberellin cuõng nhö chaát auxin, ñaõ noåi baät raát laâu tröôùc khi ñöôïc nhaän daïng. Chaát gibberellin ñaàu tieân ñöôïc nhaän daïng laø GA3. Ñaây laø caùc chaát coù caáu truùc noäi sinh. Taát caû caùc gibberellin theå hieän moät nhaân gioáng nhau, chuùng coù söï khaùc nhau bôûi chaát löôïng vaø vò trí cuûa caùc chaát theá treân nhaân. Tính chaát chính cuûa gibberellin laø söï keùo daøi cuûa caùc ñoát caây. Taùc ñoäng naøy cuõng coù theå aùp duïng treân caùc cuoáng hoa vaø ñieàu naøy cho pheùp coù moät söï chín toát hôn hoaëc nhöõng phaùt hoa phaùt trieån hôn (treân caùc loaøi nho coù chuøm nhieàu traùi, chaát gibberellin cho pheùp laøm caùc chuøm nho thöa traùi, thoaùng hôn). GA3 ñöôïc söû duïng trong moâi tröôøng dinh döôõng kích thích vöôn thaân, ñaëc bieät trong tröôøng hôïp coù haøm löôïng cytokinin cao daãn ñeán vieäc hình thaønh caùc cuïm choài coù caáu truùc chaët (Economou, 1982). Trong nuoâi caáy in vitro, gibberellin coù taùc duïng ñoái vôùi nhieàu ñænh sinh tröôûng, neáu thieáu gibberellin ñænh sinh tröôûng theå hieän moät daïng hình caàu, taïo neân caùc maét caây. Caùc gibberellin cuõng coù taùc ñoäng treân söï ñaäu traùi cuûa caùc traùi khoâng haït, chaúng haïn traùi leâ, quyùt, maän vaø moät vaøi loaïi caây khaùc. Etylen Gia taêng quaù trình ruïng laù vaø traùi; vôùi muïc ñích naøy, noù ñöôïc söû duïng ñeå cho pheùp thu hoaïch cô giôùi traùi (thí duï traùi olive, cerise…). Tính caûm öùng hoa treân caây troàng thuoäc hoï döùa. Taùc ñoäng laøm thuaän lôïi cho söï taïo cuû. Taát caû caùc boä phaän cuûa caây ñeàu coù khaû naêng toång hôïp etylen, quan troïng nhaát laø traùi caây, keùm hôn laø hoa vaø ôû caùc cô quan thöïc vaät bò chaán thöông. Abscisic acid Acid abscisic (ABA), moät loaïi hormone thöïc vaät gaây neân söï ruïng laù vaø quaû cuõng nhö söï mieân traïng thöôøng ñöôïc söû duïng trong nuoâi caáy phoâi. Hoaït ñoäng treân söï thaåm thaáu cuûa teá baøo ñoái vôùi ion potassium (K+), do taùc ñoäng naøy noù ñaõ aûnh höôûng treân söï ñoùng môû khí khoång cuûa teá baøo. Khi aùp duïng treân caùc caây ngaén ngaøy ñöôïc nuoâi caáy baèng chu kyø saùng thích hôïp, noù coù theå bò öùc cheá hoaøn toaøn (nhö caây Volubilis) hoaëc töøng phaàn bò öùc cheá (nhö caây Chenopodium rubrum) thaäm chí kích thích söï ra hoa (nhö caây Plumbago). AÙp duïng treân caùc caây daøi ngaøy, noù coù theå öùc cheá söï ra hoa trong chu kyø saùng thuaän lôïi (nhö caây Epinard, Lolium temulentum). Trong nuoâi caáy moâ, acid abscisic ít ñöôïc söû duïng, moät phaàn tuøy theo loaïi caây vaø phaàn khaùc tuøy caùc ñieàu kieän nuoâi caáy, chaát naøy seõ gaây neân caùc phaûn öùng raát khaùc nhau vaø giaûi thích moät caùch khoù khaên. Toùm laïi, trong nuoâi caáy in vitro, söï cheá ngöï cuûa kyõ thuaät seõ vöôït qua caùc söï caân baèng giöõa chaát ñieàu hoøa vôùi nhau vaø trong soá ñoù coù hai chaát chính maø vai troø taïo cô quan laø cô baûn: auxin vaø cytokinin. Theo Skoog: Neáu tyû leä auxin/cytokinin cao, ngöôøi ta thu ñöôïc chöùc naêng sinh taïo reã. Neáu tyû leä auxin/cytokinin thaáp, moâ seõ phaùt trieån veà phía chöùc naêng sinh taïo thaân. Neáu tæ leä naøy gaàn moät ñôn vò ngöôøi ta seõ thu ñöôïc sinh taïo moâ seïo. Caùc chaát khöû truøng hoùa hoïc ñöôïc söû duïng trong nuoâi caáy moâ Khi tieán haønh nuoâi caáy moâ khoù khaên lôùn nhaát laø phaûi taïo ñöôïc theå nhaân gioáng in vitro voâ truøng. Coù raát nhieàu nguyeân nhaân gaây ra söï nhieãm truøng, trong quaù trình nuoâi caáy coù theå bò nhieãm vi sinh vaät töø: maãu caáy, ngöôøi caáy, heä thoáng loïc khí trong tuû caáy, coân truøng, duïng cuï hay baûn thaân moâi tröôøng nuoâi caáy. Maãu caáy thöôøng laø nguoàn nhieãm chính vì coù raát nhieàu vi sinh vaät baùm treân beà maët, trong caùc raõnh nhoû hoaëc giöõa caùc lôùp vaûy choài, maàm choài. Ñoái vôùi moät soá loaøi thöïc vaät ñöôïc bao phuû beân ngoaøi bôûi moät lôùp saùp daøy hoaëc coù loâng tô thì caøng khoù khöû truøng vì ñaây laø nôi cö nguï cuûa raát nhieàu vi sinh vaät. Ngoaøi ra, nhöõng caây ñaõ bò nhieãm ngay trong heä thoáng moâ maïch thì xem nhö khoâng theå duøng phöông phaùp khöû truøng thoâng thöôøng ñeå loaïi boû vi sinh vaät ñöôïc. Ñeå giaûi quyeát vaán ñeà naøy, ñaàu tieân ngöôøi ta söû duïng caùc chaát khöû truøng. Nhaèm taêng cöôøng hieäu quaû khöû truøng, ngöôøi ta thöôøng röûa sô moâ caáy vôùi xaø phoøng ñeå loaïi boû buïi ñaát vaø gia taêng söï tieáp xuùc vôùi caùc chaát khöû truøng hoaëc söû duïng dung dòch Tween-20 nhö laø chaát hoaït ñoäng beà maët. Sau khi khöû truøng phaûi röûa saïch maãu caáy baèng nöôùc caát voâ truøng 3 - 5 laàn. Moät soá chaát khöû truøng thöôøng söû duïng nhö: Chlorur thuûy ngaân (HgCl2): Laø chaát khöû truøng raát hieäu quaû, thöôøng duøng vôùi löôïng raát thaáp töø 0,01% - 0,05%, chaát naøy raát khoù ñaøo thaûi, vì vaäy caàn caån thaän khi tieáp xuùc. Sodium hypochlorite NaOCl: Coù trong caùc dung dòch taåy traéng 5 - 20% (v/v). Thôøi gian khöû truøng töø 5 – 30 phuùt, sau ñoù röûa saïch baèng nöôùc caát voâ truøng 3 – 5 laàn. Chaát naøy ngaám vaøo trong moâ thöïc vaät, laøm caûn trôû söï taêng tröôûng cuûa moâ veà sau. Calcium hypochlorite Ca(OCl)2: Noàng ñoä khoaûng 5 – 10% (v/v), xöû lyù moâ caáy töø 5 – 30 phuùt. Ethyl hay isopropyl alcohol 70% (v/v): Thöôøng söû duïng ñeå lau saïch caùc vaät lieäu nuoâi caáy tröôùc khi khöû truøng hoaëc duøng ñeå ngaâm nguyeân lieäu tröôùc hoaëc sau khi xöû lyù vôùi NaOCl hoaëc Ca(OCl)2 trong khoaûng 1 -5 phuùt. Nöôùc oxy giaø (H2O2): Laø moät chaát oxy hoùa cöïc maïnh, coù theå söû duïng ôû noàng ñoä 3 – 10% trong 1 – 30 phuùt tröôùc khi röûa baèng nöôùc caát voâ truøng khi söû duïng. Söï keát hôïp giöõa NaOCl vaø H2O2 laø raát ñoäc vôùi moâ thöïc vaät, do ñoù phaûi röûa thaät saïch. Khí Clo (Cl2): Thöôøng ñöôïc söû duïng nhieàu trong khöû truøng haït khoâ. Sodium dichloroisocyanurate (NADCC): Chaát naøy ít ñoäc ñoái vôùi moâ thöïc vaät, khoâng caàn röûa laïi maãu caáy baèng nöôùc caát voâ truøng sau khi xöû lyù baèng chaát naøy. Chaát khaùng sinh: Gentamicine vaø Ampicilline: Nhöõng khaùng sinh naøy coù taùc duïng hoã trôï theâm cho vieäc söû duïng ethanol vaø thuoác taåy. Dung dòch khaùng sinh 50 – 100 mg/l ñöôïc duøng ñeå ngaâm maãu trong 30 phuùt tröôùc khi nuoâi caáy. Nhö vaäy, vieäc tìm ra thôøi gian khöû truøng ngaén nhaát vaø noàng ñoä khöû truøng thaáp maø vaãn thu ñöôïc maãu caáy voâ truøng laø ñieàu raát quan troïng, vì caùc chaát khöû truøng coù theå phaù huûy moâ cuûa maãu caáy vaø laøm cheát maãu caáy (Döông Coâng Kieân, 2002). Giôùi thieäu chung veà Kim Ngaân Hoa Vò trí phaân loaïi Giôùi: Plantae Ngaønh: Tracheobionta Lôùp: Magnoliopsida Boä: Dipsacales Hoï: Caprifoliaceae Chi: Lonicera L Loaøi: Lonicera japonica Thunb Hình 2.1. Caây Kim Ngaân Hoa (Lonicera japonica Thunb) Teân nöôùc ngoaøi: Japanese honeysuckle (Anh), cheøvrefeuille du Japon (Phaùp). Teân khaùc: Nhaãn ñoâng hoa (Taân Tu Baûn Thaûo) Ngaân hoa (OÂn Beänh Ñieàu Bieän) Kim Ngaân Hoa, Kim Ngaân Hoa Loä, Maät Ngaân Hoa, Ngaân Hoa Thaùn, Teá Ngaân Hoa, Thoå Ngaân Hoa, Tænh Ngaân Hoa (Ñoâng Döôïc Hoïc Thieát Yeáu). Song Hoa (Trung Döôïc Taøi Thuû Saùch) Song Baøo Hoa (Trieát Giang Daân Gian Thaûo Döôïc) Nhò Hoa (Thieåm Taây Trung Döôïc Chí) Nhò Baûo Hoa (Giang Toâ Nghieäm Phöông Thaûo Döôïc Tuyeån Bieân) Kim Ñaèng Hoa (Haø Baéc Döôïc Taøi) Ñaëc ñieåm quan troïng cuûa caây Kim Ngaân Hoa Kim Ngaân Hoa coù teân khoa hoïc laø Lonicera japonica Thunb, laø loaïi döôïc lieäu quan troïng thuoäc hoï Kim Ngaân (Caprifoliaceae). Hoï naøy gồm khoảng 800 loài tập trung phoå bieán ôû khu vöïc oân ñôùi Baéc baùn caàu, vôùi trung taâm ña daïng naèm ôû mieàn ñoâng Baéc Myõ vaø mieàn ñoâng chaâu AÙ, trong khi khoâng coù maët taïi khu vöïc chaâu Phi nhieät ñôùi vaø mieàn nam cuûa chaâu luïc naøy. Trong phaân loaïi cuûa heä thoáng APG II naêm 2003 Caprifoliaceae Leycesteria: 6 loaøi Lonicera: 180 loaøi Symphoricarpos: 17 loaøi Triosteum: 6 loaøi Taïi Vieät Nam, chi Lonicera L. coù khoaûng 10 loaøi, taát caû ñeàu ñöôïc duøng laøm thuoác. Kim Ngaân Hoa laø caây buïi hay daây leo, ít thaáy caây thaân thaûo coù caùc ñaëc ñieåm hình thaùi sau: Thaân coù theå daøi ñeán 9-10m, roãng, coù nhieàu caønh, luùc non maøu xanh, khi giaø maøu ñoû naâu, treân thaân coù nhöõng vaïch chaïy doïc. Laù moïc ñoái nhau, hình tröùng daøi. Phieán laù roäng 1,5 - 5cm, daøi 38cm. Laù caây quanh naêm xanh töôi, muøa reùt khoâng ruïng. Hoa khi môùi nôû coù maøu traéng, nôû ra laâu chuyeån thaønh maøu vaøng. Hoa moïc ôû keõ laù, moãi keõ laù coù 2 hoa moïc treân 1 cuoáng chung. Laù baéc gioáng nhö laù caây nhöng nhoû hôn. Traøng hoa caùnh hôïp, daøi töø 2,5 – 3,5 cm, chia laøm 2 moâi khoâng ñeàu. Moâi roäng laïi chia thaønh 4 thuøy nhoû, 5 nhuïy ñính ôû hoïng traøng, moïc thoø daøi ra ngoaøi hoa. Quaû hình caàu, maøu ñen. Muøa quaû: thaùng 6 – 8. Nuï hoa hình gaäy, hôi cong queo, daøi 25cm, ñöôøng kính ñaït ñeán 5mm. Maët ngoaøi maøu vaøng ñeán vaøng naâu, phuû ñaày loâng ngaén. Muøi thôm nheï vò ñaéng. Muøa hoa: thaùng 3 – 5. Theo Taøi nguyeân Caây Thuoác Vieät Nam, ngoaøi Kim Ngaân noùi treân ngöôøi ta coøn duøng moät soá loaïi Kim Ngaân sau: Kim Ngaân Daïi (Lonicera dasystyla Rehd): Laù hình tröùng nhoïn daøi 28 cm, roäng 14 cm; Meùp laù treân nguyeân, laù goác chia thuøy; Phieán laù moûng, maët treân nhaün, maët döôùi phuû loâng mòn; Hoa oáng traøng, thaúng hoaëc hôi cong, daøi 1,8 – 2,2 cm; Baàu nhaün. Kim Ngaân Loâng (Lonicera cambodiana Pierre): Laù hình thuoân hôi daøi, daøi khoaûng 5 – 12 cm, roäng 36 cm; Meùp laù nguyeân cuoän xuoáng döôùi maët laù; Phieán laù khaù daøy, maët treân nhaün, tröø cuoái gaân giöõa, maët döôùi loâng xuø xì, nhaát laø ôû gaân laù; Hoa oáng traøng, thaúng hoaëc hôi cong, daøi 56 cm; Baàu coù nhieàu loâng. Lonicera confusa D C: Laù hình thuoân daøi, daøi 46 cm, roäng 1,5 – 3 cm; Meùp laù nguyeân; Phieán laù hôi daøy, maët treân nhaün, maët döôùi coù nhieàu loâng ngaén mòn; Hoa oáng traøng thaúng hoaëc hôi cong, daøi 3 cm; Baàu coù loâng. Trong caây Kim Ngaân Hoa coù chöùa caùc thaønh phaàn hoùa hoïc nhö sau Luteolin, Inositol, Tannin, saponin (Trung Döôïc Hoïc). Hoa chöùa Scolymozid (Lonicerin), 1 soá Carotenoid (e. caroten, cryptoxanthin, auroxantin). Laù chöùa Loganin (Taøi Nguyeân Caây Thuoác Vieät Nam). Chlorogenic acid, Isochlorogenic acid (Lyù Baù Ñình, 1986). Ginnol, b-Sitosterol, Stigmasterol, b-Sitosterol-D-Glucoside, Stimasteryl-D-Glucoside (Sim vaø coäng söï, 1981). Boä phaän duøng laøm thuoác thöôøng laø hoa môùi chôùm nôû, laù vaø thaân thì ít duøng hôn. Khi hoa saép chôùm nôû thì thu haùi; neân haùi vaøo khoaûng 9-10 giôø saùng (luùc naøy söông ñaõ raùo), nhaët boû taïp chaát, ñem taõi moûng phôi trong raâm maùt hoaëc saáy nheï ñeán khoâ. Daây laù coù theå thu haùi quanh naêm, thaùi nhoû, phôi khoâ, baûo quaûn nôi khoâ raùo, traùnh aåm. Coù taùc duïng döôïc lyù nhö sau: Taùc duïng khaùng khuaån: nöôùc saéc hoa Kim Ngaân coù taùc duïng öùc cheá maïnh ñoái vôùi tuï caàu khuaån, tröïc khuaån thöông haøn, tröïc khuaån lî Shiga. Nöôùc saéc coù taùc duïng maïnh hôn caùc daïng baøo cheá khaùc (Taøi Nguyeân Caây Thuoác Vieät Nam). Khi nghieân cöùu taùc duïng khaùng khuaån in vitro baèng caùc phöông phaùp  khuyeách taùn vaø heä noàng ñoä, ngöôøi ta thaáy nöôùc saéc coâ ñaëc 100% cuûa hoa Kim Ngaân coù taùc duïng khaùng khuaån maïnh ñoái vôùi caùc tröïc khuaån lî, dòch haïch, thöông haøn, caän thöông haøn, lieân caàu khuaån tan maùu, phaåy khuaån taû. Taùc duïng yeáu hôn ñoái vôùi caùc tröïc khuaån baïch haàu, E.Coli, pheá caàu, tuï caàu khuaån vaøng. Nöôùc saéc laù Kim Ngaân vôùi noàng ñoä 201,2% öùc cheá tröïc khuaån Shiga, vôùi noàng ñoä 2050% öùc cheá tröïc khuaån caän thöông haøn, noàng ñoä 100% coù taùc duïng ñoái vôùi tieâu caàu khuaån (Taøi Nguyeân Caây Thuoác Vieät Nam). Taùc duïng treân ñöôøng huyeát: Nöôùc saéc hoa Kim Ngaân cho uoáng coù taùc duïng ngaên chaën choaùng phaûn veä ôû chuoät lang. ÔÛ chuoät lang uoáng Kim Ngaân, soá löôïng vaø tính chaát caùc döôõng baøo ôû maïc treo ruoät ít thay ñoåi. Löôïng Histamin ôû phoåi chuoät lang bò choaùng phaûn veä cao gaáp röôõi so vôùi chuoät lang bình thöôøng vaø chuoät lang uoáng Kim Ngaân tröôùc khi gaây choaùng (Taøi Nguyeân Caây Thuoác Vieät Nam). Taùc duïng khaùng vieâm: Laøm giaûm chaát xuaát tieát, giaûi nhieät vaø laøm taêng taùc duïng thöïc baøo cuûa baïch caàu (Trung Döôïc Hoïc). Taùc duïng höng phaán trung khu thaàn kinh: Cöôøng ñoä baèng 1/6 cuûa caø pheâ (Trung Döôïc Hoïc). Taùc duïng choáng lao: Nöôùc  saéc Kim Ngaân Hoa in vitro coù taùc duïng choáng Mycobacterium tuberculosis. Cho chuoät uoáng nöôùc saéc Kim Ngaân hoa roài cho chích vi khuaån lao cho thaáy ít thay ñoåi ôû phoåi hôn loâ ñoái chöùng (Trung Döôïc Hoïc). Khaùng Virus: Nöôùc  saéc Kim Ngaân Hoa  coù theå laøm giaûm söùc hoaït ñoäng cuûa PR8 ôû virus cuùm nhöng khoâng coù taùc duïng ôû phoâi gaø con ñaõ tieâm chuûng (Trung Döôïc Hoïc). Taùc duïng chuyeån hoùa Lipid: Cho chuoät beùo phì duøng löôïng lôùn Cholesterol voã beùo cho chuoät ñoàng thôøi cho uoáng nöôùc  saéc Kim Ngaân Hoa, möùc Cholesterol trong maùu cuûa chuùng thaáp hôn so vôùi nhoùm ñoái chöùng (Trung Döôïc Hoïc). Trong nhaõn khoa: Nöôùc  saéc Kim Ngaân Hoa coù hieäu quaû trong ñieàu trò cho nhöõng tröôøng hôïp bò keát maïc vieâm maïn, giaùc maïc loeùt (Trung Döôïc Hoïc). Laøm haï Cholesterol trong maùu (Trung Döôïc Hoïc). Taêng baøi tieát dòch vò vaø maät (Trung Döôïc Hoïc). Taêng taùc duïng thu lieãm do coù chaát Tanin (Soå Tay Laâm Saøng Trung Döôïc). Coù taùc duïng lôïi tieåu (Soå Tay Laâm Saøng Trung Döôïc). Ñieàu kieän troàng troït Kim Ngaân coù nguoàn goác ôû vuøng Ñoâng AÙ, phaân boá ôû Trung Quoác, Nhaät Baûn vaø Trieàu Tieân. ÔÛ Vieät Nam, Kim Ngaân phaân boá chuû yeáu ôû caùc tænh vuøng nuùi vaø trung du phía baéc, nhö Quaûng Ninh, Cao Baèng, Laïng Sôn, Baéc Giang, Haø Taây,… Kim Ngaân thích nghi vôùi nhieàu loaïi ñaát vaø khí haäu khaùc nhau. Caây öa saùng, thöôøng moïc ôû röøng thöù sinh, ñoài caây buïi vaø röøng thöa nuùi ñaù voâi. Gioáng Caây Kim Ngaân coù 2 caùch nhaân gioáng: Nhaân gioáng höõu tính vaø nhaân gioáng voâ tính Nhaân gioáng höõu tính: Duøng haït ñeå gieo, ñaàu thaùng 11 thu hoaïch quaû chín, trong moãi quaû coù 4-7 haït. Ñem haït phôi khoâ, caát giöõ ñeán cuoái thaùng 3 naêm sau ñem gieo. Boû haït vaøo nöôùc aám 300C ngaâm 21 giôø, vôùt ra troän vôùi caùt aåm ñeå thuùc ñaåy söï naûy maàm, khi haït ñaõ nöùt voû treân 30% thì ñem gieo. Nhaân gioáng voâ tính truyeàn thoáng Cho tôùi nay caùc nôi troàng Kim Ngaân phaàn lôùn duøng caùch nhaân gioáng voâ tính truyeàn thoáng goàm hai caùch: troàng baèng caém hom vaø troàng baèng ñaùnh tæa choài. + Caùch nhaân gioáng baèng ñaùnh tæa choài: Ñaùnh tæa choài thöôøng phaûi choïn luùc treân choài coù nuï hoa ñang nôû. Vì theá neáu ñaùnh choài ñi troàng thì sang naêm caây meï seõ khoâng ra hoa vaø aûnh höôûng tôùi saûn löôïng. Do ñoù caùch naøy thöôøng ít khi ñöôïc söû duïng + Caùch troàng baèng hom: Caùch troàng baèng hom laø caét laáy ñoaïn thaân caây chöa ra hoa ñeå mang ñi troàng. Caùch laøm naøy ñôn giaûn, caây ra hoa sôùm neân baø con noâng daân thích duøng caùch nhaân gioáng naøy. Luùc caém hom toát nhaát laø choïn ngaøy raâm maùt sau khi möa, vì ñaát aåm, ñoä aåm khoâng khí cao, caém xong tyû leä caây soáng cao.  Hom caàn phaûi choïn ôû caây khoeû maïnh, caây ñaõ moät, hai tuoåi, tyû leä soáng cao nhaát, sinh tröôûng cuõng nhanh. Tröôùc khi caém phaûi cuoác hoác roài ñaët hom vaøo hoác; ôû doác nuùi vaø ñaát bôø ruoäng khoaûng caùch giöõa caùc caây 1,3 – 1.7m choã ñaát ñai khaùc noùi chung haøng caây caùch nhau laø 1,7m, hoác saâu. Chaêm soùc Vun xôùi ñaát: Vun xôùi ñaát coù theå laøm cho ñaát tôi xoáp giöõ cho goác caây ñöôïc vöõng chaéc, laøm cho reã moïc nhieàu, caây moïc nhieàu caønh. Haøng naêm vaøo tieát tröôùc kinh traäp (khoaûng ngaøy 5 thaùng 3 haøng naêm), tieán haønh vun xôùi ñaát moät laàn vaø vaøo tröôùc luùc böôùc vaøo muøa ñoâng laïnh giaù cuoái thu vun goác caây laàn thöù hai. Laøm coû: Moãi naêm coù theå laøm coû 3 - 5 laàn. Khi laøm coû neân chuù yù tröôùc heát baét ñaàu töø ngoaøi vaøo goác, veà sau laøm daàn vaøo, laàn tröôùc xôùi ñaát saâu, caùc laàn sau xôùi noâng daàn ñeå traùnh reã bò toån thöông. Boùn phaân: Moãi naêm boùn phaân thuùc moät laàn, boùn vaøo luùc tröôùc khi böôùc vaøo muøa ñoâng hoaëc tröôùc khi caây ñaâm choài naûy loäc ñaàu xuaân. Nhöõng laàn sau coù theå boùn vaøo sau luùc ñaâm choài moät laàn vaø sau khi haùi heát hoa boùn moät laàn. Töôùi nöôùc: Thöïc teá cho thaáy töôùi nöôùc coù taùc duïng nhaát ñònh ñoái vôùi vieäc laøm taêng saûn löôïng. Vì theá vaøo muøa xuaân khoâ haïn neân tieán haønh töôùi nöôùc cho caây Tæa bôùt caønh: Tæa ôû nhöõng caây caønh moïc quaù daøy. Khi tæa phaûi naém vöõng nguyeân taéc tæa töø trong ra ngoaøi, chia ra töøng lôùp. Vieäc tæa caønh naøy seõ goùp phaàn laøm cho caây ra hoa nhieàu hôn Phoøng tröø saâu beänh Kim Ngaân raát ít saâu beänh. Saâu haïi Kim Ngaân coù reäp laø nghieâm troïng nhaát, loaøi naøy thöôøng xuaát hieän tröôùc khi caây ra hoa. Ñeå phoøng reäp thì cuoái ñoâng ñaàu xuaân phaùt vaø cuoác heát coû daïi ôû xung quanh goác caây, ñaøo xôùi cho ñaát tôi xoáp ôû xung quanh goác caây laø ñaõ tieâu dieät ñöôïc moâi tröôøng laây lan cuûa reäp. Haïn cheá duøng hoaù chaát tröø saâu beänh vì noù seõ laøm cho hoa bò nhieãm ñoäc khoâng an toaøn cho döôïc lieäu sau naøy. Thu hoaïch vaø cheá bieán:  Thu hoaïch: Thôøi vuï thu hoaïch Kim Ngaân laø töø cuoái thaùng 5 ñeán ñaàu thaùng 6, töø luùc caây coù nuï hoa ñeán luùc hoa nôû trong khoaûng 15 ngaøy. Thôøi gian haùi hoa neân choïn luùc nuï hoa maøu xanh trôû thaønh maøu traéng, luùc hoa baét ñaàu nôû laø toát nhaát.Sau khi haùi hoa veà neân phôi vaø saáy khoâ ngay. Hoa sau khi ñaõ phôi saáy khoâ neân chuù yù baûo quaûn ôû nôi thoaùng gioù, traùnh nôi aåm öôùt. Nhöõng nghieân cöùu chính veà Kim Ngaân Hoa Trong nöôùc Leâ Thò Dieãm Hoàng vaø coäng söï (2007) ñaõ nghieân cöùu taùc duïng choáng vieâm maõn tính cuûa saponin vaø flavonoid caây Kim Ngaân keát hôïp vôùi α-chymotrypsin vaø α-amylase cho thaáy saponin vaø flavonoid Kim Ngaân coù taùc duïng choáng vieâm treân moâ hình gaây vieâm maïn tính. Khi keát hôïp saponin vaø flavonoid Kim Ngaân vôùi α-chymotrypsin vaø α-amylase, taùc duïng taêng leân so vôùi khi duøng ñôn ñoäc töøng hoaït chaát. Saponin vaø flavonoid Kim Ngaân keát hôïp vôùi α-chymotrypsin vaø α-amylase coù taùc duïng laøm giaûm soá löôïng baïch caàu, khoâng laøm thay ñoåi noàng ñoä protein huyeát thanh, laøm taêng tyû soá A/G, laøm giaûm noàng ñoä seromucoid huyeát thanh töông ñöông vôùi cuûa indomethacin ôû loâ ñoái chöùng. Ngoaøi nöôùc Nghieân cöùu ñaàu tieân cuûa söï phaùt sinh moâ seïo töø caây treân 6 thaùng tuoåi do D. Georges vaø coäng söï (1993) ñaõ nghieân cöùu thaønh coâng söï taùi sinh caây Lonicera japonica "Hall's Prolific" töø nuoâi caáy moâ laù tröôûng thaønh, thaân vaø ñoát reã treân moâi tröôøng chöùa 10,7 µM NAA vaø 2.7 µM BA, trong khi ñoù moâi tröôøng chöùa 2,4-D laïi laøm cheát nhanh choùng caùc maãu caáy. Keát quaû cho thaáy söï taùi sinh choài ñaït ñöôïc tyû leä cao nhaát treân moâi tröôøng chæ chöùa BA (4.4 töø 44.4 µM ). Söï phaùt sinh choài deã daøng vaø ñaõ beùn reã treân moâi tröôøng duøng ñeå nhaân. Caây con ñem ra troàng ngoaøi töï nhieân coù tyû leä soáng khaù cao. Naêm 2003, Suk Weon Kim vaø coäng söï ñaõ tieán haønh nghieân cöùu taùi sinh Lonicera japonica Thunb thoâng qua phaùt sinh phoâi soma töø nuoâi caáy phoâi vaø nuoâi caáy huyeàn phuø teá baøo. Töø phoâi hôïp töû tröôûng thaønh ñaõ taïo ñöôïc moâ seïo vôùi taàn suaát cao 46.7% treân moâi tröôøng MS cô baûn coù boå sung 4.52 µM 2,4-D. Nuoâi caáy huyeàn phuø teá baøo treân moâi tröôøng MS loûng coù boå sung 4,52 µM 2,4-D ñaõ phaùt sinh raát nhieàu phoâi soma roài phaùt trieån thaønh caây con vôùi taàn suaát 68%. Caây con ñem troàng ngoaøi töï nhieân coù tyû leä soáng raát cao. Thôøi gian vaø ñòa ñieåm thí nghieäm Thí nghieäm ñöôïc tieán haønh töø thaùng 4 ñeán thaùng 6 naêm 2009 taïi phoøng thí nghieäm thöïc vaät tröôøng Ñaïi hoïc Kyõ Thuaät Coâng Ngheä TP. HCM. Vaät lieäu Ñoái töôïng nghieân cöùu Ñoái töôïng ñöôïc söû duïng trong nghieân cöùu laø caây Kim Ngaân Hoa (Lonicera japonica Thunb) ñöôïc troàng taïi thaønh phoá Hoà Chí Minh. Nguoàn maãu ñöôïc söû duïng ñeå tieán haønh caùc thí nghieäm laø phaàn laù Kim Ngaân ñöôïc tuyeån choïn tröïc tieáp töø caùc vöôøn trong thaønh phoá Hoà Chí Minh. Caùc caây Kim Ngaân ñöôïc choïn phaûi khoûe, goác caây to, thaân leo toát, coù söùc soáng toát, phaàn laù non, xanh, phieán laù to, khoâng bò saâu boï phaù hoaïi. Maãu laù sau khi caét ra töø caây ñöôïc cho vaøo hoäp nhöïa vaø tieán haønh tuaàn töï theo caùc böôùc khöû truøng maãu nhö sau: Khöû truøng sô boä Maãu laù ñöôïc ñaët döôùi voøi nöôùc chaûy trong 30 phuùt ñeå loaïi boû bôùt söï nhieãm baån beà maët. Röûa kyõ töøng maãu laù trong nöôùc röûa cheùn ñöôïc pha loaõng. Röûa laïi baèng nöôùc maùy töø 4 – 5 laàn vaø ñöa vaøo tuû caáy. Khöû truøng maãu beân trong tuû caáy Chuyeån maãu sang moät erlen khaùc ñaõ ñöôïc haáp khöû truøng. Tieán haønh laéc khöû truøng maãu laù baèng dung dòch Javel (NaOCl) 7% coù boå sung theâm vaøi gioït Tween 20 trong caùc khoaûng thôøi gian khaùc nhau. Röûa laïi baèng nöôùc caát voâ truøng 3 – 4 laàn cho saïch heát chaát khöû truøng. Ngaâm maãu trong nöôùc caát voâ truøng ñeå chuaån bò tieán haønh caùc thí nghieäm. Trang thieát bò vaø duïng cuï Thieát bò: tuû voâ truøng, noài haáp, maùy ño pH, caân phaân tích, maùy laïnh, keä ñaët bình, ñeøn neon, … Duïng cuï: dao caáy, bình thuûy tinh 500 ml, ñóa, ñeøn coàn, … Caùc loaïi moâi tröôøng Moâi tröôøng söû duïng laø moâi tröôøng muoái khoaùng cô baûn cuûa Murashige vaø Skoog (1962) coù boå sung theâm ñöôøng sucrose (30 g/l), agar (9 g/l) vaø caùc chaát ñieàu hoøa taêng tröôûng thöïc vaät. Tuøy theo muïc ñích cuûa töøng thí nghieäm maø moâi tröôøng coù theå boå sung caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng ôû nhöõng noàng ñoä khaùc nhau. Baûng 3.1. Moâi tröôøng MS boå sung 2,4-D vaø BA aûnh höôûng leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa Kyù hieäu 2,4 – D (mg/l) BA (mg/l) A0 - - A1 0,1 0,5 A2 0,5 0,5 A3 1 0,5 A4 0,1 0,7 A5 0,5 0,7 A6 1 0,7 A7 0,1 1 A8 0,5 1 A9 1 1 A10 0,1 1,5 A11 0,5 1,5 A12 1 1,5 A13 0,1 2 A14 0,5 2 A15 1 2 Baûng 3.2. Moâi tröôøng MS boå sung NAA vaø BA aûnh höôûng leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa Kyù hieäu NAA (mg/l) BA (mg/l) B0 - - B1 0,1 0,5 B2 0,5 0,5 B3 1 0,5 B4 0,1 0,7 B5 0,5 0,7 B6 1 0,7 B7 0,1 1 B8 0,5 1 B9 1 1 B10 0,1 1,5 B11 0,5 1,5 B12 1 1,5 B13 0,1 2 B14 0,5 2 B15 1 2 Caùc loaïi moâi tröôøng treân sau khi boå sung caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng ñöôïc ñieàu chænh veà pH = 5,8 (baèng NaOH 1 N hay HCl 1 N) vaø haáp khöû truøng baèng autoclave trong 30 phuùt ôû nhieät ñoä 1210C vaø aùp suaát 1 atm. Ñieàu kieän nuoâi caáy trong phoøng nuoâi caáy in vitro Thôøi gian chieáu saùng : 10 giôø/ngaøy Cöôøng ñoä chieáu saùng : 2500lux Nhieät ñoä : 25 ± 20C Phöông phaùp boá trí thí nghieäm Thí nghieäm 1: Khaûo saùt thôøi gian khöû truøng maãu caáy baèng dung dòch Javel (NaOCl) 7% Muïc ñích thí nghieäm: Xaùc ñònh thôøi gian khöû truøng thích hôïp ñoái vôùi maãu caáy laù ñeå tìm ra thôøi gian khöû truøng cho tæ leä nhieãm thaáp nhaát vaø maãu caáy vaãn coøn coù khaû naêng taêng tröôûng ñeå aùp duïng cho caùc thí nghieäm tieáp theo. Tieán haønh thí nghieäm: Maãu sau khi thu nhaän ñöôïc khöû truøng sô boä vaø ñöa vaøo tuû caáy, tieán haønh khöû truøng baèng dung dòch Javel 7% vôùi caùc khoaûng thôøi gian laàn löôït nhö sau: 3, 4, 5, 6, 7 vaø 8 phuùt. Chæ tieâu theo doõi: Tæ leä nhieãm cuûa maãu caáy öùng vôùi caùc khoaûng thôøi gian khöû truøng khaùc nhau. Ghi nhaän keát quaû vaø choïn thôøi gian khöû truøng coù tæ leä maãy caáy nhieãm ít nhaát ñoàng thôøi tæ leä maãu soáng soùt phaûi cao ñeå aùp duïng cho caùc thí nghieäm tieáp theo. Thí nghieäm 2: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa caùch ñaët maãu laù leân moâi tröôøng nuoâi caáy ñeán khaû naêng phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu Muïc ñích thí nghieäm: Khaûo saùt caùch ñaët maãu laù cuûa Kim Ngaân Hoa ñeå tìm ra caùch ñaët maãu cho khaû naêng phaùt sinh hình thaùi nhanh vaø toát nhaát phuïc vuï cho caùc thí nghieäm tieáp theo. Tieán haønh thí nghieäm: Khi tieán haønh caáy maãu laù leân moâi tröôøng nuoâi caáy ta chia thaønh 2 caùch ñaët maãu: ñaët maët treân cuûa laù tieáp xuùc vôùi moâi tröôøng vaø ñaët maët döôùi cuûa laù tieáp xuùc vôùi moâi tröôøng nuoâi caáy ñeå ñaùnh giaù aûnh höôûng cuûa caùch ñaët maãu leân khaû naêng phaùt sinh hình thaùi. Chæ tieâu ñaùnh giaù: Quan saùt söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu caáy, so saùnh söï phaùt trieån cuûa maãu ñoái vôùi 2 caùch ñaët maãu khaùc nhau, tìm ra caùch ñaët maãu cho phaùt sinh hình thaùi toát nhaát. Thí nghieäm 3: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa chaát kích thích taêng tröôûng BA keát hôïp vôùi 2,4-D vaø NAA leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa Muïc ñích thí nghieäm: Ñaùnh giaù taùc ñoäng cuûa chaát kích thích taêng tröôûng (BA, 2,4-D, NAA) ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu caáy. Tieán haønh thí nghieäm: Maãu caáy laù Kim Ngaân Hoa sau khi khöû truøng ñöôïc caét boû rìa laù bò traéng hoaëc naâu do taùc ñoäng cuûa chaát khöû truøng vaø caét phieán laù daøi 1 – 2 cm seõ ñöôïc nuoâi caáy treân moâi tröôøng MS coù boå sung 30 g/l ñöôøng sucrose, 9g/l agar, vaø caùc chaát ñieàu hoøa taêng tröôûng thöïc vaät nhö trong baûng 3.1 vaø baûng 3.2. Sau 1 thaùng, ghi nhaän söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu caáy vaø thu soá lieäu. Ñaùnh giaù hình thaùi cuûa töøng maãu trong moãi noàng ñoä khaùc nhau. Chæ tieâu theo doõi: Khoái löôïng moâ seïo taêng sinh, maøu saéc, hình daïng moâ seïo phaùt sinh sau 1 thaùng theo doõi. Ñaùnh giaù khaû naêng phaùt sinh thaønh choài vaø reã cuûa moâ seïo. Phaân tích thoáng keâ Soá lieäu thu thaäp ñöôïc xöû lyù treân maùy vi tính baèng chöông trình thoáng keâ Statgraphic 7.0. Ñoïc keát quaû döïa vaøo baûng ANOVA, baûng trung bình vaø baûng so saùnh khaùc bieät giöõa caùc nghieäm thöùc (Baèng phöông phaùp LSD). Thí nghieäm 1: Khaûo saùt thôøi gian khöû truøng maãu caáy baèng dung dòch Javel (NaOCl) 7% Maãu laù Kim Ngaân sau khi ñöôïc khöû truøng sô boä beân ngoaøi tuû caáy döôùi voøi nöôùc chaûy vaø nöôùc röûa cheùn pha loaõng seõ laøm giaûm ñaùng keå nguoàn gaây nhieãm, giuùp cho söï khöû truøng ñöôïc deã daøng hôn, sau ñoù ñöôïc ñöa vaøo tuû caáy ñeå tieán haønh khöû truøng maãu caáy baèng dung dòch Javel 7% coù boå sung vaøi gioït Tween 20 vôùi caùc khoaûng thôøi gian khaùc nhau. Maãu laù sau khi khöû truøng seõ ñöôïc caét boû vieàn xung quanh laù bò traéng, naâu do taùc duïng cuûa chaát khöû truøng, caét ñoâi laù theo ñöôøng gaân chính thu ñöôïc maãu coù kích thöôùc 1 – 2 cm vaø caáy treân moâi tröôøng MS coù boå sung 1 mg/l BA vaø 1 mg/l NAA. Tæ leä maãu bò nhieãm ñöôïc ghi nhaän sau 1 tuaàn vaø tieáp tuïc ñaùnh giaù tæ leä maãu taùi sinh sau 4 tuaàn nuoâi caáy. Trong 1 tuaàn nuoâi caáy ñaàu tieân cho keát quaû khöû truøng nhö baûng 4 Bảng 4.1. Keát quaû khaûo saùt thôøi gian khöû truøng maãu caáy laù Kim Ngaân Hoa Nghieäm thöùc Thôøi gian (phuùt) Tæ leä maãu nhieãm(%) Tæ leä maãu cheát (%) Tæ leä maãu soáng (%) 1 3 20a (*) 0b 80b 2 4 8ab 0b 92ab 3 5 0b 0b 100a 4 6 0b 4ab 96a 5 7 0b 8ab 92ab 6 8 0b 12a 88ab (*) Trong cuøng moät coät, caùc giaù trò trung bình theo sau bôûi caùc chöõ caùi khoâng cuøng kí töï thì coù söï khaùc bieät raát coù yù nghóa veà maët thoáng keâ vôùi möùc xaùc suaát P = 0,05 Khi tieán haønh nuoâi caáy moâ thöïc vaät thì vaán ñeà lôùn nhaát laø phaûi taïo ñöôïc nguoàn maãu nuoâi caáy ñaûm baûo voâ truøng. Muïc ñích cuûa vieäc khöû truøng maãu caáy laø thu ñöôïc moät löôïng lôùn caùc maãu caáy laù Kim Ngaân Hoa voâ truøng vaø vaãn coøn khaû naêng taêng tröôûng ñeå taïo ra nguoàn nguyeân lieäu cho caùc caùc thí nghieäm sau. Moâi tröôøng nuoâi caáy moâ thöïc vaät coù chöùa ñöôøng, muoái khoaùng vaø vitamin thì raát thích hôïp cho caùc loaøi naám, vi khuaån phaùt trieån do toác ñoä phaân chia teá baøo cuûa naám vaø vi khuaån lôùn hôn raát nhieàu so vôùi teá baøo thöïc vaät. Neáu do naám, chuùng ta thaáy söï phaùt trieån cuûa khuaån ty coù caáu truùc sôïi, thöôøng maøu traéng hoaëc hôi xaùm. Neáu sôïi khuaån ty maøu xanh, chaéc chaén laø do naám penicillium. Neáu sôïi theå hieän caùc haït ñen nhoû (daïng quaû), coù theå laø do naám rhizopus nigricans, naám naøy seõ sinh soâi raát nhanh. Neáu do khuaån, thì chuùng ta seõ thaáy moät maøng coù daïng söõa, phaùt trieån beân trong moâi tröôøng vaø ôû beà maët. Maøng naøy ñoâi luùc coù maøu (nhö hoàng, vaøng,…). Vaøi loaøi vi khuaån thöôøng gaây nhieãm: Acinebacter, Aerococcus, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Curtobacterium, Erwinia, Pseudomonas…. Neáu vieäc nhieãm truøng phaùt ñi töø vuøng tieáp xuùc giöõa moâ vaø moâi tröôøng caáy thì ñaây laø nhieãm do moâ. Neáu söï nhieãm khôûi ñi töø moät ñieåm baát kyø naøo ñoù trong moâi tröôøng thì nguoàn nhieãm coù theå do khoâng khí hoaëc söï khöû truøng moâi tröôøng khoâng toát hoaëc do nhieãm töø khoâng khí xung quanh. (Döông Coâng Kieân, 2002) Do ñoù, caùc maãu caáy caàn phaûi ñöôïc khöû truøng baèng caùc taùc nhaân khöû truøng hoùa hoïc. Caùc chaát khöû truøng phaûi öùc cheá hoaëc phaù huûy söï taêng tröôûng cuûa vi sinh vaät. Hieäu löïc cuûa caùc chaát khöû truøng phuï thuoäc vaøo thôøi gian xöû lyù, noàng ñoä vaø khaû naêng xaâm nhaäp cuûa chuùng vaøo caùc keõ ngaùch loài loõm treân beà maët moâ caáy, khaû naêng ñaåy heát caùc boït khí baùm treân beà maët moâ caáy vaø coù ñoäc tính thaáp ñoái vôùi moâ caáy. Ñeå taêng tính linh ñoäng vaø khaû naêng xaâm nhaäp cuûa chaát dieät khuaån thì ta coù theå theâm Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) vaøo dung dòch khöû truøng seõ laøm taêng hieäu quaû khöû truøng vì laøm giaûm söùc caêng beà maët giöõa nöôùc vaø moâ thöïc vaät, nhö vaäy, beà maët maãu tieáp xuùc vôùi chaát khöû truøng toát hôn. (Nguyeãn Ñöùc Löôïng – Leâ Thò Thuûy Tieân, 2006) Töø baûng 4.1 cho thaáy, khi thôøi gian khöû truøng 3 – 4 phuùt thì chöa ñuû ñeå taïo ra ñöôïc maãu caáy voâ truøng, tæ leä maãu bò nhieãm naám vaø vi khuaån khaù cao. Trong khi ñoù, thôøi gian khaûo saùt 5 phuùt cho thaáy keát quaû khaû quan, ñuû ñeå tieâu dieät vi khuaån vaø caùc baøo töû naám maø khoâng laøm aûnh höôûng ñeán söï taêng tröôûng cuûa maãu caáy, taïo ñöôïc khoái löôïng lôùn caùc maãu laù voâ truøng. Cô cheá taùc ñoäng cuûa chaát khöû truøng laø: phaù huûy lôùp maøng phospholipid, phaân huûy lipid vaø acid beùo, hình thaønh chloramine – caûn trôû quaù trình bieán döôõng cuûa teá baøo vi sinh vaät; gaây oxy hoùa öùc cheá khoâng thuaän nghòch caùc loaïi enzyme cuûa vi sinh vaät caàn thieát cho quaù trình bieán döôõng, phaân chia teá baøo, hình thaønh vaùch teá baøo, sinh toång hôïp lipid, vaän chuyeån caùc electron trong quaù trình hoâ haáp cuûa teá baøo vi sinh vaät. Khi hypoclorit hoaø tan trong nöôùc, chuùng sinh ra acid hypoclorô (HOCl), chaát naøy seõ toàn taïi trong dung dòch ôû 2 daïng OCl- vaø H+. Hai daïng naøy seõ chuyeån hoaù qua laïi, tuøy theo ñoä pH cuûa dung dòch. Acid hypoclorô toàn taïi trong dung dòch, seõ taùc ñoäng ñeán caùc chaát höõu cô nhö laø moät chaát hoaø tan, hình thaønh clorua laø moät chaát oxy hoaù maïnh seõ thay theá nhoùm hydro (H) trong nhoùm amino (NH) cuûa protein hình thaønh chloramine daãn ñeán söï phaù huyû amino acid, laøm bieán tính protein. Tính nguyeân veïn cuûa maøng nguyeân sinh chaát bò thay ñoåi, phospholipid hoaëc caùc acid beùo khoâng no cuûa maøng teá baøo vi sinh vaät bò phaân huyû do quaù trình xaø phoøng hoaù (Estrela vaø coäng söï, 2002). Keát quaû cuõng cho thaáy, khi taêng thôøi gian khöû truøng maãu caáy 6 – 8 phuùt thì maãu khoâng bò nhieãm nhöng tæ leä maãu soáng thaáp. Maãu bò cheát do Javel ngaám saâu vaøo moâ teá baøo laøm cho moâ teá baøo bò phaù huûy. Nhö vaäy, thôøi gian khöû truøng thích hôïp nhaát ñoái vôùi maãu caáy laù Kim Ngaân Hoa laø 5 phuùt vôùi tæ leä maãu coù khaû naêng soáng soùt vaø taùi sinh laø 100%. (Baûng 4.1) Baûng 4.2. AÛnh höôûng cuûa caùch ñaët maãu caáy leân söï phaùt sinh hình thaùi sau 1 thaùng nuoâi caáy Caùch ñaët maãu laù treân moâi tröôøng Troïng löôïng töôi moâ seïo (g) UÙp 0.103017b Ngöûa 0.229317a Muïc ñích thí nghieäm ñaët ra laø nhaèm xaùc ñònh ñöôïc caùch ñaët maãu caáy leân beà maët moâi tröôøng ñeå thu ñöôïc keát quaû cho phaùt sinh moâ seïo toát nhaát trong thôøi gian ngaén nhaát. Sau 1 thaùng nuoâi caáy trong moâi tröôøng MS coù boå sung 1 BA – 1 NAA, keát quaû cho thaáy khi ñaët maët döôùi cuûa laù tieáp xuùc vôùi moâi tröôøng (ñaët ngöûa) thì maãu caáy phaùt sinh moâ seïo töø veát caét, gaân laù vaø treân beà maët cuûa laù. Caùc maãu caáy khaùc khi ñaët maët treân cuûa laù tieáp xuùc vôùi moâi tröôøng (ñaët uùp) thì trong 1 thaùng nuoâi caáy ñaàu tieân moâ seïo chæ phaùt sinh töø veát caét, maët treân cuûa laù laïi raát ít vaø chaäm hôn raát nhieàu, ñoâi khi khoâng coù söï phaùt sinh moâ seïo so vôùi khi ñaët maët döôùi cuûa laù leân moâi tröôøng. ÔÛ caây Cydonia oblong, Morini vaø coäng söï (2001) ñaõ nghieân cöùu söï phaùt sinh moâ seïo töø maãu caáy laù, keát quaû cho thaáy moâ seïo chæ hình thaønh treân beà maët cuûa laù Cydonia oblong. Töông töï nhö nghieân cöùu cuûa Rita and Floh (1995) vôùi maãu caáy laù Cuphea ericoides. Nhö vaäy, söï hình thaønh moâ seïo trong 1 vaøi tröôøng hôïp thì bò aûnh höôûng bôûi söï ñònh höôùng cuûa maãu caáy treân moâi tröôøng nuoâi caáy (Warren, 1991). Söï khaùc bieät giöõa 2 caùch ñaët maãu laù treân moâi tröôøng coù theå giaûi thích döïa vaøo caáu truùc cuûa laù. Maët döôùi laù thöôøng coù lôùp cutin moûng hôn vaø nhieàu khí khoång hôn (Buøi Trang Vieät, 2002; Nguyeãn Ñình Giaäu, 2000). Do ñoù, khi ñaët trong moâi tröôøng nuoâi caáy, maãu laù ñaët ngöûa seõ haáp thu nhieàu chaát dinh döôõng cuõng nhö caùc thaønh phaàn khaùc cuûa moâi tröôøng hôn. Taùc duïng cuûa ñieàu kieän nuoâi caáy deã daøng phaùt huy hôn. Treân laù, chuû yeáu phaàn gaân cuoái laù bò toån thöông do söï caét ra khoûi cuoáng. Khi ñaët maãu laù ngöûa, phaàn gaân naøy ñöôïc tieáp xuùc nhieàu vôùi moâi tröôøng vaø haáp thu caùc chaát nhanh hôn nhöõng vò trí khaùc cuûa laù. Vaø luùc naøy, chuùng trôû thaønh caùc "beå" thu huùt chaát dinh döôõng cuõng nhö nhöõng chaát khaùc töø caùc nôi ñoå veà. Ñoàng thôøi khi quan saùt laù trong thôøi gian ñaàu nuoâi caáy nhaän thaáy coù söï cong ñaëc tröng cuûa phieán laù. Laù coù xu höôùng cong leân khi ñaët ngöûa vaø cong xuoáng khi ñaët uùp. Töø ñoù coù theå keát luaän caùc teá baøo laù ôû maët treân nhaïy caûm vaø phaûn öùng toát hôn. Pierik vaø Zwart chöùng minh raèng söï taïo choài baát ñònh cuûa maãu caáy laù taêng nhieàu khi ñeå cho lôùp bieåu bì döôùi cuûa phieán laù Kalanchoe farinacea tieáp xuùc tröïc tieáp vôùi moâi tröôøng nuoâi caáy (ñaët ngöûa). Töø baûng 4.2 cuõng cho thaáy troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo ñaït ñöôïc trong 1 thaùng cuõng coù söï cheânh leänh ñaùng keå. Ñoái vôùi maãu caáy ñaët ngöûa thì troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo taêng leân laø 0.229317 g/maãu trong khi ñaët uùp thì chæ coù 0.103017 g/maãu. Ñieàu naøy chöùng toû raèng, söï ñònh höôùng cuûa maãu caáy aûnh höôûng raát lôùn ñoái vôùi söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa. Nhö vaäy, ñoái vôùi maãu laù Kim Ngaân Hoa thì khi ñaët ngöûa thì khaû naêng maãu phaùt sinh moâ seïo töø veát caét, gaân laù vaø treân caû beà maët cuûa laù toát hôn vaø khoái löôïng moâ seïo taêng sinh nhanh so vôùi khi ñaët uùp. Thí nghieäm 3: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa chaát kích thích taêng tröôûng BA keát hôïp vôùi 2,4-D vaø NAA leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa Thí nghieäm 3.1: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa chaát kích thích taêng tröôûng BA keát hôïp vôùi 2,4-D leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa Baûng 4.3. Aûnh höôûng cuûa chaát kích thích taêng tröôûng BA keát hôïp 2,4-D leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa ñöôïc ghi nhaän sau 1 thaùng nuoâi caáy Nghieäm thöùc Noàng ñoä (mg/l) Troïng löôïng töôi moâ seïo (g) 1 A1 0.5335 e 2 A2 0.78006 bc 3 A3 0.68716 cd 4 A4 0.53418 e 5 A5 1.28192 a 6 A6 0.77308 bc 7 A7 0.6321 e 8 A8 1.21554 a 9 A9 0.77334 bc 10 A10 0.53132 e 11 A11 0.49182 e 12 A12 0.7692 bc 13 A13 0.35552 e 14 A14 0.68274 cd 15 A15 0.85406 b Keát quaû ghi nhaän sau 1 thaùng nuoâi caáy cho thaáy caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng thöïc vaät coù aûnh höôûng chuyeân bieät leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa. Ña soá maãu caáy thöïc vaät thuoäc nhoùm song töû dieäp khoâng coù khaû naêng taïo moâ seïo trong moâi tröôøng chæ coù auxin maø caàn phaûi coù moät söï phoái hôïp giöõa cytokinin vaø auxin. Ñoái vôùi Kim Ngaân Hoa laø caây buïi hay daây leo, ít thaáy caây thaân thaûo thì quaù trình nuoâi caáy in vitro seõ khoù caûm öùng hôn caùc daïng caây thaân thaûo neân söï keát hôïp giöõa auxin vaø cytokinin laø ñieàu caàn thieát. Ñieàu naøy cuõng ñöôïc chöùng minh bôûi Shrikhande vaø coäng söï, 1993 khi nghieân cöùu treân töû dieäp caây maàm Azadirachta indica A. caàn IAA ôû noàng ñoä 0,5 mg/l vaø BA 1,0 mg/l ñeå coù theå taïo moâ seïo ; laù cuûa Solanum tuberosum L. caàn coù söï phoái hôïp giöõa 2,4-D 3,0 mg/l, NAA 1,0 mg/l vaø kinetin 0,2 mg/l cho söï taïo moâ seïo (Nguyeãn Ñöùc Thaønh, 1983). Coù moät soá coâng trình nghieân cöùu cuûa Libbenga vaø Torrey, 1973 ; Simpson vaø Torrey, 1977 treân moâ reã caây ñaäu naønh, ghi nhaän coù söï toång hôïp DNA tröôùc khi phaân baøo thì caàn auxin vaø cytokinin. Neáu moâi tröôøng chæ coù auxin, thì haøm löôïng DNA ñöôïc ghi nhaän laø khoâng thay ñoåi. 100% maãu laù phaùt sinh moâ seïo khi nuoâi caáy treân moâi tröôøng MS coù boå sung BA vaø 2,4-D. Moâ seïo laø moät ñaùm teá baøo khoâng phaân hoùa, coù ñaëc tính phaân chia maïnh, thöôøng ñöôïc taïo ra do nhöõng xaùo troän trong quaù trình taïo cô quan (Buøi Trang Vieät, 2000). Moâ seïo hình thaønh ôû haàu heát caùc boä phaän cuûa caây (thaân, laù, reã), khi nôi ñoù coù veát caét (Street, 1969). Tuy nhieân, khaû naêng taïo moâ seïo cuûa moâ vaø cô quan phuï thuoäc raát nhieàu vaøo traïng thaùi sinh lyù, sinh hoùa vaø kieåu gen (Torres, 1989). Chæ coù caây non hay nhöõng maûnh thaân non cuûa caây tröôûng thaønh laø deã cho moâ seïo döôùi taùc ñoäng cuûa auxin maïnh ñöôïc aùp duïng rieâng leõ hay keát hôïp vôùi cytokinin, coøn nhöõng maûnh cô quan tröôûng thaønh thöôøng khoâng coù khaû naêng naøy. Öùng vôùi moãi loaïi moâ hay cô quan, thöôøng phaûi söû duïng caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng thöïc vaät vôùi loaïi vaø noàng ñoä khaùc nhau tuøy theo möùc ñoä nhaïy caûm cuûa caùc teá baøo trong moâ hay cô quan ñoù (Ochatt vaø Caso, 1986) Ñoái vôùi Kim Ngaân Hoa thì laù laø cô quan cho phaùt sinh moâ seïo toát nhaát bôûi ñoä ñoàng ñeàu cuûa caùc teá baøo laù cao hôn do caùc teá baøo laù phaân chia ñeàu khaép beà maët (Buøi Trang Vieät, 2000), cuõng laø cô quan cho phaùt sinh choài nhieàu nhaát. Neáu tính theo soá löôïng teá baøo bieåu bì, döôùi bieåu bì (choài baát ñònh thöôøng phaùt sinh töø nhöõng teá baøo naøy, theo Joy IV vaø Thorpe, 1999; Buøi Trang Vieät, 2000) thì maãu laù coù soá löôïng lôùn hôn thaân vaø reã. Do ñoù, choài phaùt sinh cô baûn laø nhieàu hôn. Ñieàu naøy ñaõ ñöôïc chöùng minh bôûi nghieân cöùu cuûa D. Georges (1993) vaø coäng söï treân caây Kim Ngaân Hoa. Beà maët tieáp xuùc cuûa maãu laù vôùi moâi tröôøng lôùn hôn, beà daøy maãu caáy nhoû hôn neân cheânh leäch gradient cuûa caùc chaát caûm öùng cuõng ít hôn. Theo Joy IV vaø Thorpe (1999), söï töông taùc giöõa gradient caùc chaát caûm öùng laø moät yeáu toá quan troïng trong quaù trình phaùt sinh cô quan. Maãu caáy caøng ñoàng ñeàu veà gradient seõ cho phaûn öùng caøng thoáng nhaát vaø hieäu quaû. Ñieàu quan troïng ñöôïc nhaän thaáy ôû ñaëc tính cuûa moâ seïo laø moâ seïo phaùt trieån khoâng theo quy luaät nhöng coù khaû naêng bieät hoùa thaønh reã, choài vaø phoâi ñeå coù theå hình thaønh caây hoaøn chænh. Ñaëc ñieåm sinh tröôûng cuûa moâ seïo coù quan heä vôùi cô quan hình thaønh moâ seïo, thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy vaø ñieàu kieän nuoâi caáy. Söï hình thaønh moâ seïo chia ra 3 giai ñoaïn : phaùt sinh moâ seïo, phaân chia teá baøo vaø bieät hoùa. Trong phase phaùt sinh moâ seïo, söï trao ñoåi chaát kích thích teá baøo chuaån bò phaân chia, giai ñoaïn naøy daøi hay ngaén phuï thuoäc vaøo tình traïng sinh lyù cuûa moâ ñöôïc ñöa vaøo nuoâi caáy vaø ñieàu kieän nuoâi caáy. Teá baøo ñi vaøo giai ñoaïn phaân chia taêng sinh khoái. Teá baøo ñi vaøo quaù trình bieät hoùa, xuaát hieän söï bieät hoùa teá baøo vaø söï xuaát hieän caùc con ñöôøng trao ñoåi chaát daãn ñeán söï saûn xuaát caùc hôïp chaát thöù caáp coù hoaït tính sinh hoïc (Aitchison, 1997). Moâ seïo thöôøng coù maøu vaøng, traéng, xanh hay maøu saéc toá anthocyanin. Söï bieät hoùa cuûa teá baøo hình thaønh nhöõng chaát lieäu caáu taïo nhu moâ caùc loaïi, caùc teá baøo raây... hôn nöõa hình thaønh vuøng moâ phaân sinh, trung taâm cuûa söï taïo neân choài vaø reã. Khi ñaët maãu laù trong moâi tröôøng MS cô baûn, khoâng boå sung chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng thöïc vaät thì maãu laù phoàng leân, xanh nhöng sau 1 thôøi gian thì maãu laù baét ñaàu hoùa naâu vaø cheát, ñieàu naøy coù theå laø do löôïng hormon noäi sinh trong maãu caáy ít, khoâng ñuû ñeå caûm öùng quaù trình phaùt sinh hình thaùi. Ñieàu naøy cuõng ñöôïc ghi nhaän bôûi Klimaszewska vaø Keller (1985) khi nuoâi caáy caùc TLC cuûa caây Brassica napus treân moâi tröôøng khoâng chöùa chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng. Khi maãu laù ñöôïc nuoâi caáy treân moâi tröôøng coù boå sung caùc loaïi chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng khaùc nhau cho thaáy caùc keát quaû coù söï khaùc bieät roõ raøng. Auxin coù vai troø quan troïng trong söï taïo moâ seïo (Ahloowalia, 1991 ; Komamin vaø coäng söï, 1992 ; Liu vaø coäng söï, 1993 ; Zimmerman, 1993). 2,4-D ñaõ ñöôïc chöùng minh coù vai troø quyeát ñònh ñeán söï phaùt sinh moâ seïo coù khaû naêng phaùt sinh phoâi ôû caây caø roát (Borkid vaø coäng söï, 1986) vaø söï phaùt sinh phoâi sinh döôõng ôû haàu heát caùc loaøi thöïc vaät (Halperin vaø Whetherell, 1964 ; Ammirato, 1983). Keát quaû ghi nhaän cho thaáy 2,4-D vôùi noàng ñoä 0,1 mg/l keát hôïp vôùi BA cho khaû naêng phaùt sinh moâ seïo toát nhaát, moâ seïo hình thaønh xung quanh veát caét vaø treân khaép beà maët cuûa laù, taïo thaønh boâng traéng, vaø naâu, noát xanh treân beà maët laù, maãu laù seõ uoán cong thaønh daïng V vôùi gaân chính laø ñieåm maáu choát do söï taêng sinh teá baøo, maãu laù chaéc, maëc duø troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo ôû noàng ñoä naøy laø 0.6321 g/maãu thaáp hôn so vôùi caùc noàng ñoä coøn laïi. Khi noàng ñoä 2,4-D caøng cao (0,5 – 1 mg/l) thì moâ seïo trôû neân traéng ñuïc, nhaõo khoâng coù khaû naêng taùi sinh, nhöng troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo laïi taêng leân ñaùng keå, nhöõng loaïi moâ seïo daïng nhö vaäy taêng sinh raát nhanh vaø caàn phaûi ñöôïc loaïi boû. Toác ñoä taêng tröôûng cuûa moâ seïo phuï thuoäc vaøo thaønh phaàn cuõng nhö noàng ñoä cuûa auxin (Bonner vaø Galston, 1959 ; De Garcia vaø Martnez, 1995 ; Grant vaø Fuller, 1968). Noàng ñoä auxin taêng cao kích thích taïo söï taïo moâ seïo daïng bôû nhöng khi giaûm noàng ñoä auxin thì moâ seïo coù daïng noát vaø chaéc (Ceriani vaø coäng söï, 1992). Neáu giöõ nguyeân noàng ñoä vaø loaïi auxin trong moâi tröôøng nuoâi caáy, nhöng thay ñoåi thaønh phaàn vaø noàng ñoä cytokinin thì hình thaùi moâ seïo thay ñoåi (Mehra vaø Jaidka, 1985 ; Pal vaø coäng söï, 1985 ; Shrikhande vaø coäng söï, 1993). Keát quaû cho thaáy noàng ñoä BA 1 mg/l cho khaû naêng taùi sinh tốt hôn caùc noàng ñoä coøn laïi. Nhö vaäy, noàng ñoä 0,1 mg/l 2,4-D keát hôïp vôùi 1 mg/l BA laø noàng ñoä thích hôïp cho söï phaùt sinh moâ seïo ôû maãu laù Kim Ngaân Hoa. Ñaây laø tieàn ñeà cho caùc thí nghieäm nghieân cöùu nuoâi caáy teá baøo ñôn vaø nuoâi caáy phoâi soma, saûn xuaát caùc hôïp chaát sinh hoïc thöù caáp ôû caây Kim Ngaân Hoa. Thí nghieäm 3.2 : Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa chaát kích thích taêng tröôûng BA keát hôïp vôùi NAA leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa Baûng 4.4. Aûnh höôûng cuûa chaát kích thích taêng tröôûng BA keát hôïp NAA leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù Kim Ngaân Hoa ñöôïc ghi nhaän sau 1 thaùng nuoâi caáy Nghieäm thöùc Noàng ñoä (mg/l) Troïng löôïng töôi moâ seïo (g) 1 B1 0.192228 e 2 B2 0.94526 cd 3 B3 1.0575 b 4 B4 0.5967 e 5 B5 0.84984 e 6 B6 0.98806 bc 7 B7 0.817 e 8 B8 0.8757 e 9 B9 1.5339 a 10 B10 0.73264 e 11 B11 0.8935 e 12 B12 0.97728 bc 13 B13 0.62436 e 14 B14 0.754506 e 15 B15 0.89754 e Töø baûng 4.4 cho thaáy söï keát hôïp giöõa BA vaø NAA cho phaùt sinh moâ seïo toát hôn raát nhieàu so vôùi khi BA keát hôïp vôùi 2,4-D vaø troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo cuõng taêng leân ñaùng keå. 100% moâ seïo cuõng ñöôïc phaùt sinh töø söï keát hôïp naøy. Ñieàu naøy chöùng toû, ôû caây Kim Ngaân Hoa thì laù laø cô quan raát deã caûm öùng taïo moâ seïo. Moät tieán trình phaûn bieän hoùa phaùt sinh daãn ñeán keát quaû hình thaønh moâ seïo coù tính caïnh tranh doïc theo bìa veát caét. Taát caû moâ seïo thu ñöôïc ñeàu raén chaéc, moâ seïo naâu, traéng, vaøng, vaø coù nhieàu noát xanh treân beà maët cuûa laù. Khoâng coù söï taùi sinh choài trong suoát quaù trình khôûi ñaàu cuûa moâ seïo nhöng reã xuaát hieän thöôøng xuyeân treân moâi tröôøng cô baûn chöùa NAA. Ñieàu naøy coù theå ñöôïc giaûi thích vì haøm löôïng auxin noäi sinh cuûa caây khaù cao, ñoàng thôøi NAA laø moät auxin nhaân taïo, coù hoaït tính maïnh neân khi boå sung 1 haøm löôïng raát nhoû cuûa NAA cuõng ñaõ coù khaû naêng caûm öùng moâ seïo phaùt sinh reã. ÔÛ noàng ñoä 0,5 mg/l NAA thì cho söï phaùt sinh reã töø khoái moâ seïo naâu vaø söï phaùt sinh reã caøng nhieàu treân moâi tröôøng chöùa (0,5 mg/l BA + 1 mg/l NAA) coù troïng löôïng töôi laø 1.0575 g/maãu hoaëc (0.7 mg/l BA + 1 mg/l NAA) coù troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo laø 0.98806 g/maãu, tæ leä A/C cao thì kích thích taïo reã (Bùi Trang Việt, 2000). Ñieàu naøy cuõng ñöôïc baét gaëp khi nuoâi caáy maãu laù Crassula argentea ñaùp öùng vôùi veát thöông baèng caùch taïo moâ seïo, sau ñoù seõ taïo reã vaø tieáp theo laø taïo choài (Paterson vaø Rost, 1981) Söï hình thaønh reã baát ñònh chia laøm 3 giai ñoaïn: Giai ñoaïn ñaàu laø söï taùi phaân chia cuûa moâ phaân sinh beân töùc laø moät soá teá baøo xaûy ra söï phaûn phaân hoaù maïnh ôû vuøng xuaát hieän reã taïo neân moät ñaùm teá baøo loän xoän ñoù laø maàm moáng cuûa reã. Giai ñoaïn tieáp theo laø söï xuaát hieän maàm reã. Giai ñoaïn cuoái cuøng laø söï sinh tröôûng vaø keùo daøi cuûa reã, reã chui qua voû ngoaøi taïo neân reã baát ñònh. Caùc giai ñoaïn naøy khaùc nhau veà yeâu caàu ñoái vôùi auxin. Giai ñoaïn ñaàu ñoøi hoûi haøm löôïng auxin cao ñeå khôûi xöôùng söï phaûn phaân hoaù teá baøo maïnh meõ. Giai ñoaïn hai caàn haøm löôïng auxin thaáp hôn cho söï xuaát hieän reã. Giai ñoaïn ba söï sinh tröôûng cuûa maàm reã ñeå hình thaønh reã ñoøi hoûi haøm löôïng auxin raát thaáp, thaäm chí auxin coù theå gaây öùc cheá söï sinh tröôûng cuûa reã. Ñoái vôùi caây Kim Ngaân Hoa, söï phaùt sinh reã coøn chòu taùc ñoäng raát lôùn bôûi nhieät ñoä cao (> 300C) vaø trong ñieàu kieän toái thì reã seõ phaùt sinh nhieàu vaø toát hôn trong ñieàu kieän ngöôïc laïi (D. Georges vaø coäng söï, 1993). Ñieàu naøy ñöôïc giaûi thích laø do khi duy trì maãu caáy trong ñieàu kieän nhieät ñoä cao baát thöôøng thì laøm giaûm hieäu quaû cuûa cytokinin nhöng coù theå laøm taêng hieäu quaû cuûa auxin. Töông töï nhö tröôøng hôïp ñoái vôùi maãu caáy laù Begonia khi Heide (1965) quan saùt thaáy raèng möùc ñoä hoaït ñoäng cuûa cytokinin seõ giaûm xuoáng khi maãu caáy ñöôïc nuoâi trong ñieàu kieän 270C so vôùi khi ñöôïc nuoâi ôû nhieät ñoä 150C. Khi taêng noàng ñoä BA leân 1 mg/l keát hôïp vôùi 1 mg/l NAA thì maãu laù phaùt sinh moâ seïo toát nhaát vôùi troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo cao nhaát laø 1.5339 g/maãu so vôùi caùc noàng ñoä coøn laïi. Moâ seïo hình thaønh nhanh vaø nhieàu khaép beà maët vaø xung quanh veát caét cuûa laù, moâ seïo xanh, vaøng nhaït, naâu nhaït, khoái löôïng moâ seïo taêng sinh noåi baät, moâ seïo xoáp chaéc thaønh khoái, maãu laù cöùng vaø khoâng coù söï phaùt sinh reã töø noàng ñoä naøy. Theo Skoog, tæ leä A/C gaàn moät ñôn vò seõ thu ñöôïc sinh taïo moâ seïo. Khi noàng ñoä auxin taêng thì nhaän thaáy troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo cuõng taêng leân, do auxin kích thích raát maïnh söï phaân chia teá baøo töôïng taàng nhöng haàu nhö khoâng taùc ñoäng treân moâ phaân sinh sô caáp, neân auxin taùc ñoäng leân söï taêng tröôûng theo ñöôøng kính. Sau 1 thôøi gian nuoâi caáy thì noàng ñoä auxin noäi sinh seõ töø töø taêng leân (Phan Hoaøng Anh, 2000). Söï phaùt sinh choài ôû Torenia cuõng tuaân theo nguyeân taéc veà tæ leä A/C: A/C cao: kích thích taïo reã, A/C tieán gaàn veà 1: kích thích taïo moâ seïo, töø nhöõng moâ seïo naøy sau ñoù hình thaønh choài giaùn tieáp, A/C thaáp: kích thích taïo choài tröïc tieáp. Tæ leä giöõa A/C seõ xaùc ñònh söï taïo cô quan : tyû leä cao : taïo choài, tæ leä thaáp : taïo reã. (Skoog vaø Tsui, 1948 ; Miller vaø Skoog, 1953 ; Paulet, 1965 ; Gautheret, 1959). Trong nuoâi caáy moâ, cytokinin caàn thieát cho söï phaân chia cuûa teá baøo maãu caáy. Khi khoâng coù cytokinin trong moâi tröôøng nuoâi caáy thì metaphase cuûa chu trình teá baøo seõ bò keùo daøi vì vaäy cytokinin caàn thieát trong söï ñieàu hoøa sinh toång hôïp protein teá baøo trong söï taêng tröôûng vaø phaùt trieån cuûa teá baøo. Khi taêng noàng ñoä cuûa BA leân 1,5 mg/l keát hôïp vôùi 0,5 mg/l NAA thì khoâng thaáy söï phaùt sinh reã, vaø vôùi noàng ñoä 1 mg/l NAA thì söï phaùt sinh reã ít, moâ seïo naâu hình thaønh nhanh vaø nhieàu xung quanh veát caét, caùc noát xanh hình thaønh treân beà maët cuûa laù, khoái boâng traéng xuaát hieän töø veát caét, maãu laù cöùng, xanh, chaéc, phaùt sinh toát. Khi gia taêng haøm löôïng cytokinin trong moâ thì hieän töôïng öu tính ngoïn bò phaù vôõ söï baät choài ñöôïc kích thích bôûi cytokinin; traùi ngöôïc vôùi taùc ñoäng cuûa auxin (Buøi Trang Vieät, 2000). Trong nuoâi caáy moâ, neáu löôïng cytokinin khoâng ñuû thì söï phaân chia cuûa nhaân teá baøo seõ bò chaën laïi taïi moät giai ñoaïn trong chu trình teá baøo. BA laø loaïi cytokinin coù hieäu quaû cao trong söï caûm öùng taïo choài ôû nhieàu loaøi thöïc vaät, tuy nhieân khi sử dụng BA với nồng độ cao thì sẽ tạo ra những chồi không bình thường. Khi phoái hôïp cuøng vôùi auxin thì cytokinin seõ kích thích söï phaân chia teá baøo vaø ñieàu khieån söï phaùt sinh hình thaùi. Caùc thí nghieäm taïo choài baát ñònh thöôøng cho keát quaû cao khi söû duïng cytokinin ôû noàng ñoä cao vaø auxin töø noàng ñoä thaáp ñeán trung bình (Gaspar vaø coäng söï, 2003). Keát quaû naøy ñaõ ñöôïc ghi nhaän treân nhieàu ñoái töôïng nhö Diospyros kati Thunb. (Choi, 2001), caø chua Licopersicon esculentum L. (Chaudary, 2001), hoa loa keøn Zantedeschia albomaculata (Chang, 2003), Crataeva adansonii (dc.) prodr. (Sharma, 2003), khoai taây (Yasmin, 2003). Trong söï khôûi ñaàu vaø ñieàu hoaø söï taêng tröôûng cuûa cô quan chaát ñieàu hoøa taêng tröôûng thöïc vaät coù vai troø quan troïng. Khi nuoâi caáy treân moâi tröôøng coù cytokinin vaø auxin thì söï phaùt trieån choài ñöôïc kích thích. Caàn coù moät söï caân baèng veà noàng ñoä cuûa töøng loaïi hormone trong töøng loaïi moâ, ôû töøng vò trí chuyeân bieät. Nhieàu loaïi thöïc vaät nhö caây thuoác laù ñoøi hoûi auxin vaø cytokinin ngoaïi sinh vôùi tyû leä hôïp lyù ñeå taïo choài. Sau 1 thaùng nuoâi caáy, moâ seïo ñöôïc caáy chuyeån sang moâi tröôøng chöùa BA coù noàng ñoä cao hôn, cho thaáy moâ seïo caûm öùng toát, nhöng vaãn chöa thaáy söï phaùt sinh choài trong suoát thôøi gian nuoâi caáy, tuy nhieân ñaây laø tieàn ñeà cho vieäc nghieân cöùu söï taïo choài vaø taùi sinh caây hoaøn chænh cho caây Kim Ngaân Hoa sau naøy. Kim Ngaân Hoa laø daïng caây daây leo, thaân goã neân khaû naêng caûm öùng choài töø moâ seïo khoù hôn caùc loaøi caây thaân thaûo khaùc vaø phaûi caàn raát nhieàu thôøi gian. Theo nghieân cöùu bôûi D. Georges (1993) vaø coäng söï cho thaáy sau 6 thaùng treân moâi tröôøng nuoâi caáy moâ seïo thì moâ seïo töø laù môùi hình thaønh choài vaø cho tæ leä hình thaønh choài cao hôn so với moâ seïo töø reã, thaân vaø thôøi gian hình thaønh choài ít nhaát (75 ngaøy). Vôùi nhöõng böôùc tieán veà vi nhaân gioáng vaø kyõ thuaät di truyeàn, ñaõ coù haøng traêm loaøi thöïc vaät ñaõ ñöôïc nuoâi caáy thaønh coâng in vitro treân nhieàu loaïi moâ khaùc nhau vaø phaùt sinh cô quan coù caáu truùc (Bajaj, 1986). Tuy nhieân, coù nhieàu loaøi thöïc vaät khoù nuoâi caáy, khoâng hình thaønh reã, choài hay phoâi trong nhieàu ñieàu kieän nuoâi caáy khaùc nhau. Ñieàu quan troïng laø caàn nghieân cöùu khaû naêng taùi sinh thaønh caây hoaøn chænh neáu khaû naêng phaùt trieån kyõ thuaät di truyeàn mang tính khaû thi. Ñaõ coù nhieàu baùo caùo vôùi nhöõng phöông phaùp nghieân cöùu taùi sinh caùc loaøi thöïc vaät ñaëc bieät, nhöõng phöông phaùp naøy caàn nhieàu thôøi gian ñeå phaùt trieån vì chuùng ta khoâng coù moät neàn taûng kieán thöùc cô baûn ñeå coù theå hieåu roõ tieán trình taùi sinh phaùt sinh hình thaùi. Hôn nöõa, kieán thöùc chuùng ta thu nhaän ñöôïc qua vieäc vaän duïng thaønh coâng moät loaøi thöïc vaät hay moät gioáng caây troàng troït thì thöôøng khoâng theå naøo aùp duïng cho caùc loaøi thöïc vaät hay caùc gioáng caây troàng khaùc maëc duø thöïc vaät gaàn nhau veà maët di truyeàn. Vieäc phaùt trieån caùc moâ hình nuoâi caáy taùi sinh thaønh coâng in vitro ôû nhöõng loaøi thöïc vaät khoù taùi sinh seõ höõu ích trong vieäc naâng cao taàm hieåu bieát cuûa chuùng ta veà nhöõng cô cheá cô baûn ñieàu khieån phaùt sinh hình thaùi. Keát luaän Qua quaù trình tieán haønh thí nghieäm ñoái vôùi maãu laù Kim Ngaân Hoa, chuùng toâi ruùt ra ñöôïc moät soá keát luaän sau : Vaán ñeà khoù khaên nhaát khi baét ñaàu tieán haønh nuoâi caáy in vitro ñoái vôùi maãu laù Kim Ngaân Hoa laø phaûi taïo ñöôïc nguoàn maãu caáy voâ truøng vaø vaãn coøn khaû naêng taêng tröôûng. Thôøi gian 5 phuùt trong dung dòch khöû truøng Javel 7% cho thaáy keát quaû khaû quan, ñuû ñeå tieâu dieät vi khuaån vaø caùc baøo töû naám maø khoâng laøm aûnh höôûng ñeán söï taêng tröôûng cuûa maãu caáy, taïo ñöôïc khoái löôïng lôùn caùc maãu laù voâ truøng vôùi tæ leä maãu soáng soùt coù khaû naêng taùi sinh laø 100%. Ñoái vôùi maãu caáy töø laù, caùch ñaët maãu laù treân moâi tröôøng nuoâi caáy aûnh höôûng lôùn ñeán khaû naêng phaùt sinh hình thaùi cuûa caây. Quaù trình thí nghieäm cho thaáy khi ñaët ngöûa thì khaû naêng maãu phaùt sinh moâ seïo töø veát caét, gaân laù vaø treân caû beà maët cuûa laù toát hôn vaø troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo taêng sinh nhanh so vôùi khi ñaët uùp. Quaù trình phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu laù coøn chòu aûnh höôûng ñaùng keå cuûa chaát kích thích taêng tröôûng thöïc vaät khi boå sung vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy. 100% maãu laù phaùt sinh moâ seïo treân moâi tröôøng boå sung BA keát hôïp vôùi NAA vaø 2,4-D. Noàng ñoä 0,1 mg/l 2,4-D keát hôïp vôùi 1 mg/l BA laø noàng ñoä thích hôïp cho söï phaùt sinh moâ seïo ôû maãu laù Kim Ngaân Hoa. Ñaây laø tieàn ñeà cho caùc thí nghieäm nghieân cöùu nuoâi caáy teá baøo ñôn vaø nuoâi caáy phoâi soma, saûn xuaát caùc hôïp chaát sinh hoïc thöù caáp ôû caây Kim Ngaân Hoa. Söï keát hôïp giöõa BA vaø NAA cho phaùt sinh moâ seïo toát hôn so vôùi khi BA keát hôïp vôùi 2,4-D vaø troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo cuõng taêng leân ñaùng keå. Noàng ñoä 1mg/l BA - 1 NAA thì maãu laù phaùt sinh moâ seïo toát nhaát vôùi troïng löôïng töôi cuûa moâ seïo cao nhaát ; 0,5 mg/l BA – 1 mg/l NAA moâ seïo phaùt sinh reã ; moâ seïo trong noàng ñoä BA cao chöa khaúng ñònh ñöôïc khaû naêng phaùt sinh choài trong nghieân cöùu naøy. Ñeà nghò Do thôøi gian tieán haønh thí nghieäm chæ trong 3 thaùng vaø thieát bò söû duïng coù haïn neân caùc thí nghieäm ñaõ tieán haønh laø tieàn ñeà cho caùc nghieân cöùu sau naøy veà caây Kim Ngaân Hoa. Chuùng toâi xin ñöa ra moät soá ñeà nghò ñeå nghieân cöùu naøy ñöôïc hoaøn thieän hôn. Khaûo saùt theâm caùc yeáu toá lieân quan trong quaù trình khöû truøng maãu nhö : tuoåi moâ caáy, thôøi ñieåm thu maãu khöû truøng nhaèm naâng cao hieäu quaû khöû truøng. Nghieân cöùu theâm veà caùc loaïi hoùa chaát khöû truøng khaùc khi ñöa maãu töø beân ngoaøi vaøo. Khaûo saùt theâm aûnh höôûng cuûa moät soá chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng khaùc leân söï phaùt sinh hình thaùi cuûa maãu caáy laù vaø khaû naêng phaùt sinh choài cuûa maãu laù. Khaûo saùt khaû naêng phaùt sinh choài töø caùc boä phaän khaùc cuûa caây ñeå tìm ñöôïc nguoàn maãu caáy coù khaû naêng taùi sinh choài toát nhaát, trong thôøi gian nhanh nhaát. Kim Ngaân Hoa laø caây döôïc lieäu chöùa nhieàu hôïp chaát sinh hoïc nhö saponin vaø flavonoid, nghieân cöùu naøy laø tieàn ñeà cho caùc thí nghieäm nghieân cöùu nuoâi caáy teá baøo ñôn vaø nuoâi caáy phoâi soma, saûn xuaát caùc hôïp chaát sinh hoïc thöù caáp ôû caây Kim Ngaân Hoa. Xaây döïng hoaøn chænh qui trình nhaân gioáng in vitro vaø ñöa ra vöôøn öôm caây Kim Ngaân Hoa. Tieán haønh giaûi phaåu hình thaùi ñoái vôùi maãu caáy ñeå nghieân cöùu nhöõng thay ñoåi veà moâ hoïc beân trong maãu caáy theo thôøi gian, töø ñoù ta coù theå hieåu roõ hôn veà taùc ñoäng cuûa chaát kích thích taêng tröôûng thöïc vaät leân söï phaùt trieån cuûa moâ trong quaù trình nuoâi caáy.