Đề tài Phân tích protein huyết thanh bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều

LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp là kết quả của 4 năm miệt mài học tập trên ghế giảng đường Đại học, cũng là bước khởi đầu để làm quen với công việc nghiên cứu khoa học thực thụ. Vì vậy, nó vô cùng có ý nghĩa đối với mỗi sinh viên. Tuy nhiên, hoàn thành tốt Khóa luận là một công việc không hề đơn giản, không chỉ đòi hỏi sự nỗ lực, cố gắng của bản thân người thực hiện mà còn cần đến sự động viên, cổ vũ của gia đình, bạn bè đặc biệt là sự giúp đỡ nhiệt thành của các thầy cô và cán bộ hướng dẫn. Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn đến những cá nhân đã nhiệt tình ủng hộ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện Khóa luận. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Phan Văn Chi – Phó viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Trưởng phòng Hoá Sinh Protein đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, hướng dẫn và truyền thụ cho tôi kiến thức cũng như lòng say mê khoa học trong suốt quá trình thực hiện khoá luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Bùi Phương Thuận, Chủ nhiệm bộ môn Sinh lý thực vật và Hoá Sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội đã tận tình truyền thụ và trang bị cho tôi những nền tảng kiến thức vững chắc trong thời gian học tập tại trường để tôi có thể chủ động tiếp thu tốt hơn những kiến thức khoa học mới khi làm khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới NCS. Đỗ Quỳnh Hoa, người đã trực tiếp hướng dẫn và nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Bích Nhi, ThS. Trần Thế Thành vì những đóng góp quý báu trong quá trình hoàn thành khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Hoá sinh Protein, Viện Công nghệ Sinh học và các thầy cô Bộ môn Sinh lý thực vật và Hoá sinh đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ, góp ý và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân, những người đã luôn động viên, khích lệ và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2008 Sinh viên Vũ Khắc Ngọc MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ HỆ PROTEIN HUYẾT THANH NGƯỜI 2 1.1.1. Khái niệm về huyết thanh người 2 1.1.2. Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh người 2 1.1.3. Chức năng của các protein trong huyết thanh 3 1.1.4. Phân loại protein trong huyết thanh theo Putnam 4 1.1.5. Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh 4 1.1.6. Hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh 6 1.2. KỸ THUẬT ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2-DE) 7 1.2.1. Giới thiệu chung 7 1.2.2. Tiến trình hoạt động của 2-DE 7 1.2.3. Thế mạnh và những tồn tại của kỹ thuật 2-DE 9 1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của điện di 2-DE 9 1.2.5. Nhận diện protein bằng điện di hai chiều kết hợp khối phổ (2DE-MS) 10 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 15 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2. Hóa chất 15 2.1.3. Thiết bị 16 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.2.1. Thu nhận protein bền nhiệt từ hệ protein huyết thanh 16 2.2.2. Kết tủa protein bằng TCA ở các điều kiện khác nhau 16 2.2.3. Xác định hàm lượng protein trong dung dịch bằng phương pháp Bradford 17 2.2.4. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE) 18 2.2.5. Phân tách protein bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE) 19 2.2.6. Thủy phân protein trong gel bằng enzym trypsin 20 2.2.7. Phân tách các protein huyết thanh bền nhiệt bằng hệ sắc ký nanoLC-MS 20 2.2.8. Phân tích phổ khối nanoLC-ESI-MS/MS bằng phần mềm Mascot v1.8 21 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1. Thu nhận các protein bền nhiệt bằng phương pháp biến tính nhiệt 23 3.2. Điện di SDS–PAGE kiểm tra các protein bền nhiệt thu được 24 3.3. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp so màu Bradford 25 3.4. Điện di 2-DE protein bền nhiệt 27 3.5. Điện di 2-DE protein bền nhiệt trên dải pH hẹp 30 3.6. Loại bỏ Tris bằng phương pháp kết tủa protein 32 3.7. Kiểm tra hiệu quả loại Tris trên bản điện di 2-DE 34 3.8. Nhận dạng các protein bền nhiệt trên gel bằng hệ 1DnanoLC-ESI-MS/MS 36 3.9. Tìm hiểu chức năng một số protein bền nhiệt đã được nhận diện 37 3.9.1. Haptoglobin 37 3.9.2. Apolipoprotein A (Apo) 38 3.9.3. Transthyretin (TTR) 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Bảng Trang Bảng 1. Sự thay đổi nồng độ protein trong huyết thanh bệnh nhân bị ung thư 5 Bảng 2. Một số hóa chất chính đã sử dụng trong nghiên cứu 15 Bảng 3. Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE 18 Bảng 4. Các thông số của hệ thống sắc ký lỏng NanoLC 20 Bảng 5. Kết quả đo OD của các nồng độ BSA chuẩn 26 Bảng 6. Kết quả tính toán nồng độ protein trong mẫu theo phương pháp Bradford 27 Bảng 7. Sự biến đổi của hiệu điện thế theo thời gian 28 Bảng 8. Kết quả tính toán nồng độ protein trước và sau khi kết tủa bằng phương pháp Bradford 33 Bảng 9. Kết quả nhận dạng các protein chịu nhiệt bằng phương pháp 2DE-LC-MS/MS 36 DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Hình Trang Hình 1. Biểu đồ biểu diễn thành phần 22 protein (chiếm 99%) trong huyết thanh 3 Hình 2. Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2-DE sử dụng thanh IPG Strip 8 Hình 3. Ảnh hưởng của nồng độ Tris đến quá trình hội tụ đẳng điện của protein 10 Hình 4. Hiệu quả của việc lựa chọn dải pH hẹp gối lên nhau 11 Hình 5. Sơ đồ cấu tạo hệ máy khối phổ với các khả năng lắp đặt khác nhau 13 Hình 6. Sơ đồ kết hợp 2-DE và khối phổ MS/MS trong xác định protein 14 Hình 7. Hình minh họa các thông số của phần mềm Mascot v1.8 22 Hình 8. Kết quả thu nhận các protein bền nhiệt bằng phương pháp biến tính nhiệt 23 Hình 9. Ảnh điện di SDS – PAGE protein bền nhiệt 24 Hình 10. Đường chuẩn xác định nồng độ protein theo phương pháp Bradford 26 Hình 11. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ protein huyết thanh bền nhiệt trong mẫu nghiên cứu so với protein tổng số 27 Hình 12. Ảnh điện di 2-DE phân đoạn protein bền nhiệt 29 Hình 13. Sự hội tụ của Tris trên bản điện di 2-DE tại pH ứng với pKa của nó 30 Hình 14. Ảnh điện di phân đoạn protein bền nhiệt trên dải pH 4-7 31 Hình 15. Ảnh điện di SDS – PAGE khảo sát các điều kiện kết tủa với TCA 33 Hình 16. Ảnh điện di 2-DE so sánh hiệu quả của việc loại Tris bằng phương pháp kết tủa protein đối với quá trình điện di 2-DE trên dải pH 3-10 35 Hình 17. Kết quả nhận dạng haptoglobin với số đăng ký gi|4826762 37 Hình 18. Phổ MS/MS ion peptide (TSTQDWVQK) của Haptoglobin gi|4826762 38 Hình 19. Trình tự amino acid của protein haptoglobin gi|4826762 38 Hình 20. Kết quả nhận dạng ApoA-I với số đăng ký gi|37499465 39 Hình 21. Phổ MS/MS ion peptide (HLAPYSDELR) của apoA-I gi|37499465 40 Hình 22. Trình tự amino acid của protein apoA-I gi|37499465 40 Hình 23. Kết quả nhận dạng của transthyretin với số đăng ký gi|1181953 41 Hình 24. Phổ MS/MS ion peptide (GSPAINVAVHVFR) của transthyretin gi|1181953 41 Hình 25. Trình tự amino acid của transthyretin với số đăng ký gi|1181953 42 MỞ ĐẦU Huyết thanh là một hệ protein phức tạp, chứa nhiều protein có nguồn gốc và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong cơ thể. Những thay đổi về hàm lượng cũng như thành phần các protein trong huyết thanh thường có mối liên hệ chặt chẽ với các quá trình bệnh lý. Vì thế việc sử dụng huyết thanh cho mục đích nghiên cứu là một trong những cách tiếp cận đuợc quan tâm nhất trong nghiên cứu proteomics hiện nay. Tuy nhiên, thách thức lớn nhất trong nghiên cứu protein huyết thanh không chỉ ở số lượng rất lớn protein có mặt (khoảng 10000 loại), mà còn là tỷ lệ rất khác nhau của chúng. Trong khi một số protein có nồng độ cao như albumin (50%-70%), immunoglobulin (8%-10%)…, thì ngược lại, có rất nhiều protein, peptid có nồng độ rất thấp (ng/ml) như cytokin, hormon mà tổng nồng độ của chúng chỉ chiếm 1% hàm lượng protein tổng số. Những khác biệt rất lớn về nồng độ này cùng với sự hạn chế về mặt kỹ thuật của những phương pháp proteomics truyền thống (định lượng và định tính protein) đã làm cho việc nghiên cứu một số phân đoạn protein có hàm lượng thấp trong huyết thanh trở nên khó khăn và ít được chú ý trong một thời gian dài. Song gần đây, sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp nghiên cứu proteomics hiện đại với độ nhạy và độ chính xác cao đã cho phép các nhà nghiên cứu phân tách, nhận diện được nhiều protein tồn tại với hàm lượng tới fg/mL. Một số thành phần protein hàm lượng thấp trong huyết thanh đã bắt đầu được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn. Một trong những hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực này là nghiên cứu phân đoạn protein bền nhiệt trong huyết thanh. Mặc dù chưa có được nhiều thành tựu lớn, nhưng những kết quả mới công bố gần đây cũng đã gợi ý những phương pháp thu nhận, phân tích và nhận dạng có hiệu quả các protein huyết thanh bền nhiệt, đồng thời cũng chứng minh được có những mối liên hệ nhất định giữa sự biến đổi tính bền nhiệt của các protein này với các quá trình bệnh lý, đặc biệt là đái tháo đường và ung thư. Các nghiên cứu trên hệ protein bền nhiệt này hiện còn rất mới, rất tiềm năng và hứa hẹn sẽ thu được nhiều thành tựu quan trọng và có ý nghĩa trong nghiên cứu sinh - y học. Trong khóa luận tốt nghiệp này, chúng tôi sử dụng phương pháp điện di hai chiều 2-DE và khảo sát một số điều kiện thực nghiệm có liên quan để thực hiện đề tài “Phân tích protein huyết thanh bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều” với mục tiêu thu nhận, phân tách và bước đầu nhận dạng, tiến tới xây dựng cơ sở dữ liệu về hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh người Việt Nam, tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn trên hệ protein này, đặc biệt là trên các mẫu bệnh lý nhằm phân tích, so sánh và tìm kiếm các ứng viên chỉ thị bệnh đặc hiệu. Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ HỆ PROTEIN HUYẾT THANH NGƯỜI 1.1.1. Khái niệm về huyết thanh người Huyết tương - plasma là một dịch trong, màu vàng nhạt và vị hơi mặn, thu được khi máu chống đông đã được loại bỏ toàn bộ các thành phần tế bào. Huyết tương là thành phần quan trọng của máu, là môi trường sống của các tế bào máu và tất cả các tế bào trong cơ thể, chiếm 55-60% thể tích máu[44]. Huyết thanh - serum là phần dịch lỏng, trong suốt còn lại của máu sau khi đã loại bỏ các thành phần tế bào và các yếu tố đông máu hay là phần còn lại của huyết tương sau khi đã loại bỏ các yếu tố đông máu. Nó bao gồm nước, muối, lipid, đường, các enzyme, kháng thể và các protein hòa tan khác.... Như vậy, huyết thanh rất giống huyết tương và các protein của nó thực hiện các vai trò rất đa dạng như đông máu, đáp ứng miễn dịch, cung cấp chất dinh dưỡng và nhiều hoạt động sinh lý quan trọng khác trong cơ thể. Huyết thanh không chỉ là mẫu xét nghiệm lâm sàng mà còn thể hiện rất nhiều đặc tính hữu ích cho các nghiên cứu proteomics. Theo phương diện này, nó là mẫu phân tích tiềm năng cho việc phát hiện ra các chỉ thị sinh học [8]. 1.1.2. Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh người Một người trưởng thành chứa khoảng 3,5 - 5 lít huyết thanh với khoảng 200 - 250 gam protein. Người ta ước lượng có khoảng từ 10.000 đến 20.000 protein khác nhau xuất hiện trong huyết thanh tại một thời điểm nhất định, phần lớn trong số chúng có mặt ở nồng độ rất thấp, cỡ ng/ml. Đây là mẫu rất giàu protein với hàm lượng thay đổi từ 60 - 80 mg/ml [9]. Các protein có hàm lượng cao trong huyết thanh gồm 22 loại, chiếm đến 99% lượng protein tổng số (hình 1), trong đó có albumin, immunoglobin, transferrin, haptoglobin, lipoprotein, ... [30]. Ngoài ra còn có rất nhiều protein khác tồn tại với hàm lượng thấp hoặc rất thấp nhưng lại giữ những chức năng quan trọng như các protein làm nhiệm vụ truyền tín hiệu giữa các mô, cơ quan hay các protein giải phóng vào máu do kết quả của sự phá hủy mô, do nhiễm vi sinh vật, .... Như vậy, các protein xuất hiện trong huyết thanh do nhiều nguyên nhân khác nhau và nó cũng gợi ý cho việc áp dụng các phương pháp nghiên cứu khác nhau để phát hiện chúng. Hình 1. Biểu đồ biểu diễn thành phần 22 protein (chiếm 99%) trong huyết thanh [30] Protein trong huyết thanh được coi là một trong những hệ protein phức tạp nhất ở người. Một số protein có hàm lượng cao (mg/ml) như albumin thông thường thay đổi từ 35-50 mg/ml (chiếm từ 50- 70%), do sự tổng hợp hàng ngày ở gan (khoảng 12g) và có thời gian bán hủy là 21 ngày nên nó được coi là chỉ thị của bệnh xơ gan hay bệnh suy dinh dưỡng [9, 10]. IgG khoảng 5-7 mg/ml chiếm 10%. Các protein có hàm lượng thấp (ng/ml) chỉ chiếm khoảng 1% hàm lượng protein tổng số như interleukin 6, hormone, carbonhydrate antigen 125 (CA-125), b2-microglobulin ... thông thường thay đổi từ 0 - 5 pg/ml và được coi là những chất chỉ thị có độ nhạy cao trong chẩn đoán nhiều quá trình bệnh lý [43]. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng các protein huyết thanh có thể là các chỉ thị sinh học đủ tin cậy trong chẩn đoán một số bệnh như: ung thư buồng trứng (CA 15-3), ung thư tuyến tiền liệt (PSA), ung thư gan (a-fetoprotein) và các bệnh về tim mạch (C-reactive protein) [3]. Tuy nhiên, trải qua nhiều thập kỷ nghiên cứu mới chỉ có một lượng nhỏ các chỉ thị sinh học này được phát hiện và sử dụng cho mục đích chẩn đoán. 1.1.3. Chức năng của các protein trong huyết thanh Huyết thanh đóng vai trò rất quan trọng trong các hoạt động sống của cơ thể, là môi trường trao đổi chất của các mô và cơ quan, đồng thời cũng là môi trường phức tạp, chứa hàng nghìn loại protein với hàm lượng rất khác nhau. Dựa theo chức năng, có thể phân chia protein huyết thanh các nhóm sau [4]: Chức năng miễn dịch: Bao gồm các Ig (đó là IgA, IgG, IgM, IgD, IgE) và các bổ thể tham gia vào quá trình bảo vệ cơ thể như: tăng thực bào, phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên (peptide, vi khuẩn, virus,…). Chức năng đông máu: gồm các chất đông máu và các chất chống đông (AT III, protein C, protein S...) tham gia vào quá trình đông máu và bảo vệ cơ thể. Duy trì áp suất keo, độ nhớt của máu: trong huyết thanh, protein tạo thành dung dịch keo để duy trì áp suất thẩm thấu, sức căng bề mặt và tính đệm. Chức năng xúc tác: enzyme có chức năng xúc tác cho các phản ứng của các quá trình sinh học từ đơn giản đến phức tạp nhất. Vận chuyển các chất: vận chuyển chất dinh dưỡng, nước, muối đến các tổ chức và vận chuyển các chất thải, chất bã qua thận, phổi, mồ hôi, hệ tiêu hoá như: transferrin vận chuyển sắt; haptoglobin vận chuyển HST tự do; vận chuyển lipid, cholesterol. Vận chuyển các protein cần thiết để tổng hợp các tổ chức tế bào và mô. Chức năng điều hoà: những protein này tuy có hàm lượng rất nhỏ (ng/ml) nhưng có vai trò rất quan trọng trong mọi hoạt động của cơ thể. Chúng bao gồm các hormone, cytokine, các protein ức chế đặc hiệu enzyme. 1.1.4. Phân loại protein trong huyết thanh theo Putnam Dựa trên quan điểm về chức năng, Putnam (1975-1987) đã phân loại các protein trong huyết thanh thành các nhóm chính: Protein tiết từ các mô rắn, các immunoglobulin miễn dịch, các phối tử trung gian, các phối tử địa phương, các chất tạm thời, sản phẩm giải phóng từ các mô, các chất tiết bất thường và các protein ngoại lai. Hệ thống phân loại này được thừa nhận rộng rãi và trích dẫn lại trong các nghiên cứu của Anderson (2002) [9]. 1.1.5. Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh Huyết thanh là một hệ protein khá toàn diện, là phiên bản lớn nhất và cũng là một mẫu nghiên cứu hấp dẫn [1, 9]. Sự hấp dẫn của huyết tương đối với việc chuẩn đoán bệnh được quyết định bởi hai đặc trưng: (i) mẫu có thể lấy dễ dàng và an toàn, (ii) mẫu không chỉ phản ánh toàn diện kiểu hình người mà còn cho biết trạng thái của cơ thể ở một thời điểm đặc biệt nào đó. Trong khi đó, những mẫu khác như nước bọt, nước mắt, nước tiểu, da, tóc chỉ được coi là một tập con nhỏ của huyết tương hoặc mang tính địa phương và phản ánh hoạt động của tế bào [2]. Huyết thanh là một thành phần quan trọng trong máu, chứa nhiều protein có nguồn gốc và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong cơ thể. Chính vì thành phần protein phức tạp của huyết thanh bắt nguồn từ nhiều nguồn gốc mà việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh hứa hẹn sẽ mang lại nhiều thông tin bổ ích để phát triển các công tác nghiên cứu, chẩn đoán và chữa trị nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là các bệnh trao đổi chất như đái tháo đường và các bệnh ung thư. Những thay đổi bất thường về thành phần protein huyết thanh chắc chắn có liên quan đến các quá trình bệnh lý (bảng 1). Nói cách khác, huyết thanh là dạng mẫu đặc biệt, chứa đựng nhiều thông tin cần thiết cho việc nghiên cứu và chẩn đoán bệnh, vì thế việc sử dụng huyết thanh cho mục đích nghiên cứu là cách tiếp cận hợp lý, đã và đang được minh chứng qua những thành tựu thu được trong nhiều thập kỷ qua. Bảng 1. Sự thay đổi nồng độ protein trong huyết thanh bệnh nhân bị ung thư [11, 43] Tên bệnh Protein Nồng độ Bình thường Bị bệnh Ung thư trực tràng, ống tiêu hoá CEA (Carcinoembryonine antigen) 3-5 ng/ml 10-20 ng/ml Ung thư gan AFP (α-fetoprotein) 3-5 ng/ml 10-100mg/ml Ung thư tế bào nuôi HCG (Human Chrionic Gonandotrophin) 5 IU/ml 1 triệu IU/ml Ung thư vú CA15-3 --- Tăng cao Ung thư tuyến tiền liệt PAP (Prostatic acid phosphatase) 0-0.2 ng/ml Tăng cao Ung thư dòng lympho β2-M (beta2-Microglobulin) 3.4 ng/ml Tăng cao Thực tế là nhiều loại protein trong huyết thanh đã được nghiên cứu trước khi chúng ta biết đến sự tồn tại của gen [9]. Năm 2002 Adkins và cộng sự bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đã phát hiện được 490 loại protein khác nhau trong huyết thanh [6]. Năm 2004, Chan và cộng sự bằng phương pháp điện di đẳng điện, sắc ký lỏng đa chiều-khối phổ đã phát hiện được 1444 protein [13] và gần đây nhất năm 2005, theo kết quả xác định và so sánh của 35 phòng thí nghiệm trong dự án proteome huyết tương người của HUPO (Human Proteome Organization), con số này đã là 3020. Lượng thông tin phong phú do các nghiên cứu về proteome huyết thanh thu được hoàn toàn bổ trợ cho những thông tin di truyền từ các nghiên cứu genome. Với những cải tiến nhanh chóng, các kỹ thuật phân tích proteomics đang trở thành cơ sở cho sự phát triển của genomics chức năng. Sự phối hợp giữa proteomics và genomics sẽ đóng vai trò chủ đạo trong những nghiên cứu về sinh-y học, là nền tảng cho sự phát triển các sản phẩm chẩn đoán và chữa bệnh trong tương lai. 1.1.6. Hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh Hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh là một trong những đối tượng nghiên cứu mới rất hấp dẫn trong nghiên cứu về huyết thanh. Cho đến nay vẫn chưa có một định nghĩa chính xác và đầy đủ cho các protein loại này. Trong nghiên cứu này của chúng tôi, hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh được xem như là tập hợp các protein có khả năng chịu được nhiệt độ, vẫn giữ được hoạt tính sau khi đã được xử lý ở nhiệt độ 98oC trong 10 phút theo phương pháp của Goufman và có thể nhận ra được bằng một số phương pháp proteomics như điện di hai chiều và khối phổ [22]. Các protein bền nhiệt trong huyết thanh thường là những protein có nồng độ thấp và rất thấp (có thể < 1 pmol), vượt quá giới hạn độ nhạy của các phương pháp nghiên cứu protein truyền thống. Do đó, trong suốt một thời gian dài, các nghiên cứu về hệ protein bền nhiệt không được phổ biến và không theo kịp với sự tiến bộ nhanh chóng trong các nghiên cứu về hệ protein khác ở người. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, với sự phát triển nhanh chóng và vượt bậc về mặt kỹ thuật, các phương pháp nghiên cứu protein mới như hệ sắc ký Nano đa chiều, phương pháp nhận diện và định lượng protein bằng khối phổ đã cho phép nhà nghiên cứu thao tác trên các protein có hàm lượng nhỏ hơn 1pg nhiều lần. Các phương pháp này đã mở ra triển vọng mới cho việc nghiên cứu các hệ protein hàm lượng thấp, trong đó có hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh. Tính bền nhiệt của các protein có mối quan hệ chặt chẽ với các cấu trúc tương ứng của chúng. Ngoài ra, nó còn liên quan đến những cải biến và những biến đổi sinh hóa của protein như các quá trình glycosyl hóa [31], ..... Do đó, sự thay đổi tính bền nhiệt của protein chắc chắn có những mối liên hệ nhất định với các biểu hiện bệnh lý. Nghiên cứu các protein bền nhiệt có thể giúp tìm ra những ứng viên chỉ thị bệnh hiệu quả và có độ nhạy cao. 1.2. KỸ THUẬT ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2-DE) 1.2.1. Giới thiệu chung Kỹ thuật điện di hai chiều (Two Dimensional Electrophoresis, 2-DE) là một trong những công cụ phân tách protein truyền thống và được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu về hệ protein [20, 36, 25]. Đây là phương pháp có độ phân giải cao hơn hẳn các phương pháp phân tách protein khác hiện có như sắc ký, điện di một chiều, .... Hiện nay, sự phát triển của kỹ thuật 2-DE cho phép phân tách các protein khác nhau chỉ đến 0,1 đơn vị pI, 1kDa về khối lượng phân tử và có thể phát hiện vệt protein có hàm lượng < 1ng. Tùy thuộc vào kích thước lỗ gel và giải gradient pH sử dụng, điện di 2-DE có thể phân tách hàng ngàn protein có mặt trong mẫu cùng một lúc, đồng thời so sánh mức độ biểu hiện khác nhau của các mẫu phân tích [7]. Nhờ đó mà nó ngày càng trở thành một công cụ được ứng dụng rộng rãi nhằm phân tách các phức hợp protein trong tế bào, mô và các dịch cơ thể [23] và là kỹ thuật mạnh, không thể thay thế trong so sánh các mẫu có liên quan như mô bệnh so với mô thường [2]. Mặc dù kỹ thuật điện di hai chiều 2-DE đã ra đời và giới thiệu rộng rãi từ đầu những năm 1970 nhưng phải mất một thời gian dài sau đó kỹ thuật này mới trở nên phổ biến. Lý do là những khó khăn trong quá trình thực hiện IEF và đưa các protein đã được hội tụ lên gel SDS-PAGE. Khi mới ra đời, kỹ thuật IEF được tiến hành trên các ống gel, rất khó thiết lập gradient pH. Thêm vào đó, việc sử dụng ống gel cũng làm cho quá trình điện di chiều thứ hai trên gel SDS-PAGE khó thực hiện. Khó khăn này chỉ giải quyết được khi có sự ra đời của thanh gel IPG (immobilized pH gradient). Các thanh IPG này được làm từ dẫn xuất của acrylamide, chứa một nhóm acid carboxylic tự do hoặc một nhóm amin bậc ba và là sản phẩm đồng trùng hợp với acrylamide và bis-acrylamide [39]. Thanh gel IPG tạo ra một giải gradient pH cố định, liên tục và tăng dần với chiều dài khác nhau (7 cm, 11 cm, 18 cm, 24 cm) đã hạn chế sự di chuyển, trôi dạt của các hóa chất (vì chúng được gắn trên gel polyacrylamid) và sự biến thiên pH, làm cho quá trình phân tách ổn định hơn [32, 39]. Ngoài ra, các thành gel này cũng có độ cứng tương đối giúp cho việc đưa các protein từ thanh IPG vào trong gel SDS-PAGE trở nên dễ dàng hơn [32]. 1.2.2. Tiến trình hoạt động của 2-DE  Kỹ thuật điện di 2-DE thực ra là sự kết hợp của hai nguyên lý phân tách khác nhau. Theo chiều thứ nhất, các phân tử protein được phân tách dựa theo điểm đẳng điện pI bằng một trong các phương pháp sau: điện di gradien pH cố định (immobilized pH gradient electrophoresis, IPGE), điện di hội tụ theo điểm đẳng điện (isoelectric focusing, IEF) hoặc điện di gradien pH không cân bằng (non-equilibrium pH gradient electrophoresis, NEPHGE), trong đó phổ biến nhất là điện di IEF [2, 14]. Chiều thứ hai, các phân tử protein được phân tách bằng phương pháp điện di biến tính trên gel polyacrylamid (như điện di SDS-PAGE) (hình 2). Do đó, thực chất 2-DE là phương pháp phân tách protein theo 2 chiều, (i) chiều thứ nhất theo điện tích và (ii) chiều thứ hai theo trọng lượng phân tử. Hình 2. Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2-DE sử dụng thanh IPG Strip [2] Sự khác biệt về điểm đẳng điện pI (Isoelectric point) của các protein chính là cơ sở của IEF. pI là giá trị pH tại đó điện tích bề mặt tổng số của protein bằng 0 (protein không di chuyển trong điện trường). Mỗi protein có một giá trị pI xác định, do đó dưới tác dụng của điện trường trong quá trình điện di IEF, các protein sẽ di chuyển và dừng lại tại vị trí có pH tương ứng với pI của chúng. 1.2.3. Thế mạnh và những tồn tại của kỹ thuật 2-DE Điện di 2-DE là một trong những công cụ mạnh trong phân tích các hỗn hợp protein phức tạp và là phương pháp không thể thay thế trong so sánh các mẫu có liên quan như mô bệnh so với mô thường [2, 32]. Đây là phương pháp cổ điển nhưng vẫn được áp dụng rộng rãi và thường gắn liền với proteomics vì nó có khả năng phân tách cao, hiển thị hình ảnh so sánh tương quan, đem lại bức tranh toàn cảnh về mức độ biểu hiện khác nhau của các protein [20]. Khả năng tập hợp dữ liệu và số hóa dữ liệu cũng là một trong những yếu tố quan trọng cho phép 2-DE trở thành một phương pháp thực nghiệm có nhiều ý nghĩa trong việc xây dựng các tập hợp thông tin về một hệ proteome. Nó cho phép so sánh khách quan các kết quả nghiên cứu, điều chỉnh sự sai khác trong kết quả nghiên cứu giữa các nhóm nghiên cứu khác nhau và phân loại được một số lượng khổng lồ các dữ liệu protein đã được phân tích [14]. Một trong những ưu điểm nữa của phương pháp điện di 2-DE là khả năng kết nối với các hệ thống phân tích hình ảnh gel hoàn toàn tự động. Các phần mềm phân tích và xử lý hình ảnh gel như PDQuest, Proteom Weaver, Z3, Delta2D, Decyder 2D, ... cho phép phân tích, so sánh, định lượng , chú thích, chú giải và phân loại dữ liệu cho các protein phát hiện được. Ngoài ra, các phần mềm này còn có khả năng kết nối đến các hệ thống nhặt điểm và cắt gel tự động và thủy phân các điểm protein này để phục vụ cho việc phân tích trên hệ thống khối phổ [15, 45]. Tuy nhiên, điện di 2-DE cũng gặp phải một số vấn đề trong đó phổ biến nhất là tính lặp lại tương đối của thí nghiệm điện di. Kết quả điện di của cùng một mẫu có thể có những sai lệch giữa các lần chạy khác nhau [32, 35]. Vấn đề này càng trở nên nghiêm trọng khi sử dụng 2-DE cho mục đích so sánh sự khác biệt giữa hai mẫu khác nhau [32]. 1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của điện di 2-DE Sự thành công của điện di 2-DE phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: phương pháp chuẩn bị mẫu, kích thước của thanh strip, lượng protein tải lên strip, độ nhạy của phương pháp nhuộm, ... trong đó quan trọng nhất là phương pháp chuẩn bị mẫu. Ảnh hưởng của phương pháp chuẩn bị mẫu: Phương pháp chuẩn bị mẫu được lựa chọn phụ thuộc vào mục đích nghiên cứu và là chìa khóa thành công của thí nghiệm. Các thông số như tính tan, kích thước, điện tích và điểm đẳng điện của các protein được quan tâm nhiều nhất trong quá trình chuẩn bị mẫu [37, 38]. Phạm vi của phương pháp chuẩn bị mẫu bắt đầu từ sự chiết ra protein với các giải pháp hòa tan đơn giản đến những hỗn hợp phức tạp của các chất gây biến tính, chất tẩy rửa và các tác nhân khử. Sự chuẩn bị mẫu có thể bao gồm những chiến lược làm giàu hoặc làm đơn giản hóa mẫu protein bằng cách chia chúng thành các phân đoạn nhỏ có tính lặp lại. Hình 3. Ảnh hưởng của nồng độ Tris đến quá trình hội tụ đẳng điện của protein [17]. Hầu hết các thí nghiệm điện di 2-DE đều phải xác định một phương pháp chuẩn bị mẫu tối ưu. Sự thay đổi nồng độ của các chất biến tính, chất tẩy rửa, các chất lưỡng tính và các tác nhân khử điển hình có thể ảnh hưởng đáng kể đến kết quả điện di 2-DE [37, 38]. Một ví dụ điển hình là ảnh hưởng của Tris ở nồng độ cao đến quá trình điện di IEF (hình 3)[17]. Ảnh hưởng của kích thước và dải pH của thanh Strip: Thông thường việc tăng kích thước của thanh Strip và lựa chọn dải pH hẹp sẽ cho phép tăng cường sự phân tách của các protein mà điểm đẳng điện của chúng có độ tương đồng cao [39]. Người ta thường sử dụng pH 3-10 trên một bản gel trước, sau đó sử dụng các dải pH hẹp gối lên nhau (sole nhau) để tăng cường độ phân giải của bản gel thu được. Hình 4. Hiệu quả của việc lựa chọn dải pH hẹp gối lên nhau [39]. Khi lựa chọn dải pH hẹp, các protein nằm ngoài vùng pH đã chọn sẽ không được tải lên thanh Strip, lượng protein quan tâm được tải lên thanh Strip nhiều hơn và do đó cho phép phát hiện được nhiều điểm protein hơn [39] (hình 4). Ảnh hưởng của việc lựa chọn phương pháp nhuộm Protein phân tách được bằng kỹ thuật 2-DE có thể được nhuộm màu bằng các phương pháp nhuộm truyền thống để dễ quan sát, bao gồm nhuộm bạc, Coomasie và amido đen, ... Trong đó, phương pháp nhuộm bạc và nhuộm huỳnh quang kiểu mới cho độ phân giải cao nhất [32]. Mặc dù có nhiều phương pháp nhuộm khác nhau, nhưng không phải tất cả các phương pháp này đều phù hợp với những thí nghiệm phân tích tiếp theo. Ví dụ phương pháp nhuộm bạc và cố định bằng formalin sẽ cố định các protein trong gel và ngăn cản sự thủy phân chúng bằng enzyme khi phân tích bằng khối phổ [32]. 1.2.5. Nhận diện protein bằng điện di hai chiều kết hợp khối phổ (2DE-MS) Nguyên lý chung của khối phổ Khối phổ (Mass spectrometry-MS) là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các phân tử tích điện khi chúng di chuyển trong điện trường. Mẫu được ion hóa trở thành các phân tử tích điện khác nhau và được phân tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z. Dữ liệu phổ khối được tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng protein bằng các công cụ tin sinh học. Cấu tạo chung của máy khối phổ Máy khối phổ thường được cấu tạo từ các bộ phận chính sau đây: (1) bộ phận đưa mẫu; (2) nguồn ion hóa; (3) hệ thống bơm chân không; (4) bộ phận phân tích khối (mass analyzer) đo tỷ lệ m/z; (5) bộ phận đo tín hiệu (detector) xác định số lượng các ion ở mỗi giá trị m/z; (6) hệ thống phân tích dữ liệu, bao gồm máy tính cấu hình cao với các phần mềm chuyên dụng [2]. Hình 5. Sơ đồ cấu tạo hệ máy khối phổ với các khả năng lắp đặt khác nhau [2] Kết hợp điện di 2 chiều - khối phổ (2DE-MS) Phương pháp điện di hai chiều, thủy phân protein trong gel, sau đó nhận dạng bằng khối phổ đang là một trong những cách tiếp cận thường được sử dụng nhất trong nghiên cứu proteomics [20, 22]. Hình 6. Sơ đồ kết hợp 2-DE và khối phổ MS/MS trong xác định protein [2] Quá trình này có thể chia thành 5 giai đoạn (hình 6). Ở giai đoạn (1), hỗn hợp protein được phân tách và tinh sạch trên gel nhờ kỹ thuật 2-DE. Sau quá trình điện di là sự phân tích hình ảnh các điểm protein trên gel bằng các phần mềm đặc biệt. Vì phổ khối của toàn bộ protein có độ nhạy kém hơn phổ khối của peptide và chỉ riêng thông tin về khối lượng của protein là không đủ để xác định nên ở giai đoạn (2), các điểm và vệt protein quan tâm được lựa chọn, cắt và thủy phân bằng enzyme Tripsin. Sự thủy phân này tạo ra các peptide được ion hóa ở đầu C, cung cấp một lợi thế để xác định trình tự các peptide. Trong giai đoạn (3), các peptide được phân tách bởi phương pháp sắc ký lỏng nano hoặc sắc ký lỏng cao áp trong các ống vi mao quản và được thôi ra rất tinh tế vào trong một nguồn ESI, nơi chúng được bốc hơi, tạo thành những giọt nhỏ tích điện. Ở giai đoạn (4), những peptide sau khi ion hóa được chuyển vào phổ kế và phổ khối được xác định. Máy tính sẽ thiết lập một danh sách những peptide được lựa chọn cho sự phân mảnh tiếp theo bằng năng lượng thích hợp và các phép đo MS/MS sẽ được thực hiện ở giai đoạn (5). MS và hình ảnh MS/MS tiêu biểu được thu nhận để so sánh với những cơ sở dữ liệu mà kết quả là sự nhận biết các peptide/protein [2]. Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Máu được thu từ những người tình nguyện tại bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội. Các mẫu được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chặt chẽ về lâm sàng, có hồ sơ, bệnh án rõ ràng và có kết luận là mẫu bình thường từ các bác sỹ chuyên khoa của bệnh viện. Máu toàn phần sau khi xử lý, thu huyết thanh và chia nhỏ lượng mẫu vào các eppendorf, được bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng. 2.1.2. Hóa chất Tất cả các hóa chất đều có độ tinh sạch cần thiết, đảm bảo các tiêu chuẩn dành cho hóa chất dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử và được sử dụng đúng theo những hướng dẫn và khuyến cáo của nhà sản xuất. Một số hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê ở bảng 2. Bảng 2. Một số hóa chất chính đã sử dụng trong nghiên cứu Hãng Vật liệu Fisher Scientific Methanol (HPLC grade), Acetonitrile (HPLC grade) Bio-Rad Hoá chất điện di SDS-PAGE (Bio-Rad, USA), hóa chất điện di 2 chiều (strip, đệm cân bằng 1, đệm cân bằng 2…) Merck Acetonitrile, muối NaCl... New England Biolab Thang protein chuẩn (Protein Marker) Promega Trypsin Sigma TriChloroAcetic (TCA), acrylamide, bis- acrylamide, N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylendiamine (TEMED), Ammonium persulfate (APS), Sodium dodecyl sulfate (SDS), TriFlourAcetic (TFA), Formic acid (FA), Dithiothreitol (DTT), Amonium bicarbonate (NH4HCO3) 2.1.3. Thiết bị Các thiết bị điện di 1 chiều SDS-PAGE và hai chiều 2-DE mua từ Bio-Rad (Hercules, CA, Mỹ). Hệ sắc ký lỏng nanoLC đa chiều từ LC Packings (LC Packings, Amsterdam, Hà Lan) được sử dụng để phân tách. Hệ sắc ký gồm một microautosampler FAMOS, bơm Ultimate micro HPLC, và thiết bị chuyển cột Swichos. Hệ máy khối phổ QSTAR® XL, sử dụng nguồn ESI (AplliedBiosystems, MDS SCIEX, Canada). Cột sắc ký ngược pha C18 (Vydac, Mỹ), đầu đưa mẫu Sillica PicoTip (New Objective, Mỹ). Phần mềm Mascot v1.8 (MatrixScience, London, Anh). Phần mềm BioAnalyst QS v1.1 (Applied Biosystems, MDS SCIEX, Canada). Ngân hàng Dữ liệu Protein NCBI (Mỹ) với hơn 4,8 triệu trình tự protein khác nhau được cài trên hệ thống máy chủ Workstation XW6200 BASE UNIT. Các trang thiết bị thực nghiệm cơ bản khác thuộc phòng Hóa sinh Protein, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen Quốc gia, Viện Công nghệ Sinh học. 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Thu nhận protein bền nhiệt từ hệ protein huyết thanh Các protein bền nhiệt từ hệ protein huyết thanh được thu nhận lại theo phương pháp của Goufman và cộng sự năm 2006 [19]. Một thể tích (1V) huyết thanh tổng số được trộn đều với 1V đệm ETP (20 mM EDTA pH 8.1, 0.2 M Tris-HCl pH 8.9, 7% (w/v) PEG 6000). Hỗn hợp được ủ 10 phút ở 98oC, 10 phút tiếp theo ở nhiệt độ phòng, sau đó được ly tâm tách pha ở điều kiện 12000 vòng/phút trong 15 phút. Phần dịch nổi chứa các protein huyết thanh bền nhiệt được thu nhận lại và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.2.2. Kết tủa protein bằng TCA ở các điều kiện khác nhau Protein bền nhiệt thu nhận được theo phương pháp trình bày ở phần 2.2.1 được hòa tan trong đệm ETP có nồng độ Tris cao (~ 200mM) làm ảnh hưởng đến kết quả phân tách bằng kỹ thuật 2-DE. Để loại bỏ Tris, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp kết tủa protein trong đệm chứa Tris bằng trichloroacetic acid (TCA) ở nồng độ và thời gian ủ thích hợp. Protein trong dung dịch thu được sau khi biến tính nhiệt được kết tủa bằng TCA. Quy trình thí nghiệm cụ thể như sau: (i) Bổ sung TCA vào dung dịch protein bền nhiệt với nồng độ cuối của TCA lần lượt là 15%, 20%, 25% và 30%; (ii) Hỗn hợp phản ứng trên đây được chia thành 2 nhóm không ủ và có ủ 10 phút tại 4oC; (iii) Sau thời gian đó, các hỗn hợp được ly tâm thu tủa với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút; (iv) Loại bỏ phần dịch nổi, rửa lại phần kết tủa bằng aceton lạnh, bước thí nghiệm này được lặp lại 3 lần; (v) Làm khô kết tủa protein bằng máy biến tính nhiệt tại nhiệt độ 100oC trong 5 phút; (vi) Hòa tan lại protein trong đệm (8M ure, 2% CHAPS, 50 mM DTT, 0,2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 ampholyte). Dung dịch protein bền nhiệt được bảo quản ở -80oC. 2.2.3. Xác định hàm lượng protein trong dung dịch bằng phương pháp Bradford Hàm lượng protein trong mẫu được xác định bằng phương pháp Bradford với thuốc nhuộm Quick Start Bradford Dye Regent 1x của hãng Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, Mỹ). Cơ sở của phương pháp là định lượng protein dựa vào đặc điểm liên kết của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 với protein [12]. Trong môi trường axit, Coomassie Brilliant Blue G-250 tồn tại chủ yếu ở dạng cation màu đỏ, hấp thụ hai proton (Amax = 470 nm), còn khi thuốc nhuộm liên kết với các gốc axit amin kiềm (arginine) hoặc thơm của protein, chúng chuyển sang dạng màu xanh và không hấp thụ proton (Amax = 595 nm). Dạng liên kết thuốc nhuộm - protein được phát hiện ở bước sóng 595 nm bằng máy quang phổ. Protein chuẩn được sử dụng để định lượng protein trong nghiên cứu này là albumin huyết thanh bò (BSA - Bovine Serum Albumin). Các bước thí nghiệm được tiến hành như sau: Dựng đường chuẩn bằng cách đo OD tại các nồng độ chuẩn khác nhau của BSA Chuẩn bị 7 ống eppendorf với các nồng độ protein chuẩn BSA như sau: 0,125 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,75 mg/ml; 1 mg/ml; 1,5 mg/ml; 2 mg/ml. Rút 20 ml dung dịch BSA ở từng nồng độ kể trên trộn đều với 1ml dung dịch Bradford 1x. Để phản ứng trong hỗn hợp xảy ra tổi thiểu 5 phút (tối đa không quá 1h) ở nhiệt độ phòng trước khi đem đo trên máy quang phổ, tại bước sóng 595 nm. Lặp lại thí nghiệm từ 2-3 lần cho mỗi nồng độ BSA kể trên. Đặt máy quang phổ ở bước sóng 595 nm, đo độ hấp thụ của các dung dịch BSA và mẫu protein, ghi kết quả và dựng đường chuẩn BSA bằng phần mềm Exel của hãng Microsoft. Xác định nồng độ protein bền nhiệt Bổ sung 20 ml protein bền nhiệt thu được ở phần 2.2.1 hoặc 2.2.2 vào 1 ml dung dịch Bradford 1x. Trộn đều hỗn hợp, để tổi thiểu 5 phút (tối đa không quá 1h) ở nhiệt độ phòng để phản ứng xảy ra trước khi đem đo trên máy quang phổ. Lặp lại thí nghiệm từ 2-3 lần cho mỗi mẫu protein bền nhiệt. Đặt máy quang phổ ở bước sóng 595 nm, đo độ hấp thụ của các dung dịch protein bền nhiệt, ghi kết quả hấp phụ protein tại bước sóng 595, tính toán nồng độ protein dựa trên đường chuẩn BSA bằng phần mềm Exel của hãng Microsoft. 2.2.4. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE) Trong khóa luận này, kỹ thuật SDS-PAGE được thực hiện theo LaemLi, 1970 [27]. Các thiết bị, hóa chất được sử dụng trong kỹ thuật SDS-PAGE do hãng Bio-Rad cung cấp. Protein được phân tách trong gel polyacrylamide với các nồng độ khác nhau. Đối với các protein có trọng lượng phân tử từ 6 kDa-160 kDa, gel 10%, 12.6% và 15% (w/v) thường được sử dụng. Trong nghiên cứu này, SDS-PAGE được tiến hành trên gel 12.6% với các thành phần cơ bản như ở bảng 3 cho 3 mẫu: (i) huyết thanh pha loãng 40 lần (ii) dịch nổi protein bền nhiệt (iii) dịch hòa tan của protein bền nhiệt sau khi kết tủa. Bảng 3. Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE Thành phần Gel cô 5% 2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6.8, 10 ml 10% (w/v) SDS, 0,35 ml acrylamid 30 % (w/v), 1,3 ml H2O, 20 ml 10% (w/v) APS, 2 ml TEMED Gel tách 12,6% 4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-Cl pH 8.8, 45ml 10% (w/v) SDS, 0,9 ml 50% glycerol, 1,89 ml acrylamid 30% (w/v), 0,55 ml H2O, 30 ml 10% (w/v) APS, 3 ml TEMED Đệm hòa mẫu 5x 25% (v/v) glycerol, 14,4 mM 2-mercapto ethanol, 2% (w/v) SDS, 0,1 (w/v) bromophenol blue, 60 mM 1M Tris-Cl pH 6.8 Đệm điện di 25 mM TrisCl, 192 mM glycine, 0,1% (w/v) SDS, pH 8.3 Quá trình điện di được thực hiện ở 2 vùng điện thế: (i) 75V trong 30 phút và (ii) 150V cho đến khi thuốc nhuộm trong mẫu bắt đầu đi ra khỏi bản gel. Kết thúc quá trình điện di, bản gel được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R-250. Sau khi ủ với dung dịch nhuộm (0.1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue, 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) trong 30 phút, bản gel được tẩy màu bằng dung dịch tẩy (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) cho đến khi có thể quan sát thấy các băng protein. 2.2.5. Phân tách protein bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE) 2-DE là kỹ thuật phân tách các protein dựa trên sự khác nhau về điểm đẳng điện và khối lượng phân tử trên gel polyacrylamide. Ở chiều điện di thứ nhất (điện di đẳng điện, isoelectric focusing - IEF), dưới tác dụng của điện trường, các protein di chuyển đến các vị trí pH mà tại đó điện tích tổng số của protein bằng 0, nói cách khác là di chuyển tới điểm đẳng điện pI của chúng. Ở chiều điện di thứ hai (điện di biến tính SDS-PAGE), các protein tại những giá trị pH nhất định tiếp tục được phân tách theo khối lượng phân tử. Điện di chiều thứ nhất (điện di đẳng điện) Protein huyết thanh sau khi xử lí nhiệt và loại Tris bằng phương pháp kết tủa được hòa trong đệm (8M urea, 2% CHAPS, 50 mM DTT, 0,2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 ampholyte và 0.001% Bromophenol Blue). Hỗn hợp mẫu được thấm vào thanh gel dài 7cm, chứa dải pH từ 3 đến 10 hoặc 17cm, chứa dải pH từ 4 đến 7 (do hãng Bio-Rad, Mỹ cung cấp) trong thời gian từ 12 giờ đến 16 giờ. Sau đó, các protein trên thanh gel được phân tách theo điểm đẳng điện trên hệ PROTEAN IEF (Bio-Rad). Thể tích mẫu sử dụng, thời gian thấm mẫu lên các thanh gel và các bước biến đổi hiệu điện thế trong quá trình điện di được cài đặt theo theo chương trình được khuyến cáo trong hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Bio-Rad). Cân bằng gel Sau quá trình điện di đẳng điện, protein trên gel được khử bằng dung dịch chứa 6 M urea, 20% glycerol 2% SDS, 37,5 mM Tris-HCl pH 8.8, 2% DTT w/v và alkyl hóa bằng dung dịch chứa 6 M urea, 2% SDS 37.5 mM Tris-HCl pH 8.8, glycerol 20% and 40 mM IAA. Điện di chiều hai  Các protein trong thanh gel sau khi được phân tách theo điểm đẳng điện và được cân bằng trong các dung dịch trên sẽ tiếp tục được phân tách trên gel polyarcrylamid 12.5% theo kích thước phân tử của chúng với hiệu điện thế không đổi 150 V. Bản gel 2-DE được nhuộm bằng thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue R-250 rồi tẩy màu tương tự như với bản gel SDS – PAGE ở mục 2.2.4. 2.2.6. Thủy phân protein trong gel bằng enzym trypsin  Các vùng protein đã đánh dấu trên bản gel điện di 2-DE được cắt ra và chuyển vào ống eppendof 1,5 ml. Gel được rửa, loại thuốc nhuộm bằng dung dịch rửa (50 mM NH4HCO3, pH 8.0, 50% ACN). Sau đó, các mảnh gel được làm khô bằng 100% ACN và khử bằng DTT với dung dịch khử chứa 5 mM DTT ở 56 0C trong 1h. Sau khi khử, gel được alkyl hóa bằng IAA với dung dịch alkylation chứa 5 mM IAA trong tối, 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Enzym trypsin (loại sử dụng cho đọc trình tự, Sigma-Aldrich) được thêm vào với tỷ lệ enzym : cơ chất là 1 : 50, ở 37 0C qua đêm. Sau khi thủy phân, các peptide được chiết ra khỏi gel bằng dung dịch chiết (50% ACN, 0,1% FA) và siêu âm 20 phút. Quá trình chiết peptid khỏi gel được lặp lại 3 lần. 2.2.7. Phân tách các protein huyết thanh bền nhiệt bằng hệ sắc ký nanoLC-MS Phương pháp sắc ký lỏng nhiều chiều kết hợp với khối phổ được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu các mẫu protein phức tạp. Phương pháp này giúp làm giảm độ phức tạp của mẫu khi đi vào phân tích bằng khối phổ MS/MS và do đó làm tăng khả năng phát hiện các thành phần protein có nồng độ thấp trong mẫu. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ sử dụng sắc ký một chiều kết nối khối phổ 1D nanoLC-ESI-MS/MS để phân tích và nhận dạng protein do các protein đã được phân tách trước đó nhờ kỹ thuật 2-DE. Hỗn hợp peptide sau khi thủy phân được cô đặc muối trên cột Trap, sau đó sẽ được phân tách trên cột sắc ký ngược pha C18. Cuối cùng hỗn hợp sẽ đưa vào hệ thống khối phổ để phân tích. Các thông số của hệ thống sắc ký lỏng nanoLC được tổng kết trong bảng 4. Bảng 4. Các thông số của hệ thống sắc ký lỏng NanoLC Sắc ký lỏng nano UltiMate™ / FAMOS/ Switchos™ (LC Packings/Dionex) Cột ngược pha 300ml x 5 mm C18 PepMap100, LC Parking, Nertherland) Cột C18 75ml ID. x 15 cm, Grace Vydac, Hesperia, CA, USA Tốc độ dòng 200 nl/phút Tốc độ dòng Switchos 30 ml /phút Thể tích mẫu 20 ml (mẫu và muối) Các loại đệm A: 0,1% FA B: 85% ACN trong 0,1% FA Thời gian 90 phút, phút 10 bắt đầu tạo gradient với nồng độ đệm B tăng từ 0-100% trong 65 phút. Ghi phổ NanoLC-ESI- MS/MS Máy khối phổ QSTARÒXL được vận hành ở chế độ IDA (Information Dependent Acquisition) để thực hiện việc chuyển từ quét phổ TOF MS đơn đối với các ion nằm trong dải khối từ 400 amu đến 1200 amu sang khối phổ liên tiếp (MS/MS) trên 3 ion phân tử có mật độ cao nhất và lớn hơn 20 được xác định tự động nhờ phần mềm BioAnalyst QS v1.1 (Applied Biosystems) (Hình 7). Sai số về khối (mass tolerance) được đặt ở mức ± 0,5 Da, thời gian không thực hiện lại MS/MS đối với một mảnh là 90 giây. Hiệu điện thế được đặt ở nguồn để ion hoá mẫu là 2200V. 2.2.8. Phân tích phổ khối nanoLC-ESI-MS/MS bằng phần mềm Mascot v1.8 Phổ khối CID thu được từ nanoLC-MS/MS được phân tích bằng phần mềm Mascot v1.8. Đây là phần mềm có khả năng phân tích dữ liệu phổ MS/MS để nhận dạng protein dựa trên thuật toán Mowse được phát triển bởi MatrixScience (London, UK). Cơ sở dữ liệu được dùng để tìm kiếm trong Mascot là NCBInr, một cơ sở dữ liệu các protein không đồng nhất và toàn diện với khoảng gần 3 triệu trình tự khác nhau được cài đặt trên một máy tính HP Proliant Server. Các thông số để tìm kiếm dữ liệu được cài đặt như sau (hình 7) : Hình 7. Hình minh họa các thông số của phần mềm Mascot v1.8 Cơ sở dữ liệu: NCBI. Sai số khối peptid và MS/MS: 0,5 Da Cải biến cố định: carbamindomethyl (C) Điện tích của peptid: +2 hoặc +3. Cải biến biến đổi: oxidation (methyonine, M). Enzym: trypsin Quá trình nhận diện protein với công cụ tìm kiếm Mascot v1.8 được lặp lại 3 lần. Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu nhận các protein bền nhiệt bằng phương pháp biến tính nhiệt Huyết thanh chứa một hệ protein hết sức đa dạng và phức tạp, trong đó, chỉ tính riêng 22 protein có hàm lượng cao nhất đã chiếm đến 99% lượng protein tổng số [30]. Các protein này gây nhiều cản trở cho quá trình nghiên cứu các protein có hàm lượng thấp, trong khi đó nhiều protein có hàm lượng thấp mới thực sự có nhiều ý nghĩa trong nghiên cứu sinh học và y học [9]. Do đó, phương pháp biến tính nhiệt được sử dụng để làm giảm bớt mức độ phức tạp của mẫu huyết thanh đồng thời giúp thu nhận thêm các protein chịu nhiệt trong huyết thanh. Huyết thanh tổng số được trộn đều với đệm chiết ETP theo tỷ lệ thể tích 1:1 rồi ủ 10 phút ở 98oC. Sau khi đã biến tính hoàn toàn, mẫu được đưa về nhiệt độ phòng trong vòng 10 phút rồi ly tâm tách pha ở 12000 vòng/phút trong 15 phút. Kết quả của quá trình xử lý nhiệt được thể hiện trong hình 8. Hình 8. Kết quả thu nhận các protein bền nhiệt bằng phương pháp biến tính nhiệt. A. Huyết thanh trước khi xử lý biến tính nhiệt. B. Huyết thanh sau khi biến tính nhiệt (Phần dịch nổi là dung dịch chứa các protein bền nhiệt. Phần cặn là kết tủa của các protein không bền nhiệt đã bị biến tính) Kết quả thu được trên ảnh cùng với việc hút chuyển dịch nổi bằng pipetman chính xác cho thấy tỷ lệ thể tích giữa phần cặn và phần dịch nổi xấp xỉ 1:1. Như vậy, có khả năng các protein bền nhiệt trong huyết thanh chưa bị pha loãng và nếu phương pháp xử lý nhiệt, thu hồi mẫu có hiệu quả thì nồng độ các protein bền nhiệt trong dịch nổi xem như tương đương với nồng độ của chúng trong huyết thanh nguyên. Hàm lượng của các protein bền nhiệt này sẽ tiếp tục được đánh giá tương đối bằng phương pháp điện di biến tính SDS-PAGE và khẳng định lại bằng phép đo Bradford. 3.2. Điện di SDS-PAGE kiểm tra các protein bền nhiệt thu được Để định lượng tương đối và đánh giá thành phần các protein bền nhiệt thu được, phần dịch nổi thu được từ huyết thanh sau khi biến tính nhiệt được chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng điện di biến tính SDS-PAGE ở nồng độ gel 12,6%, bản điện di được hiện màu bằng Comassive Blue Brilliant R-250. Kết quả điện di kiểm tra của các protein huyết thanh chịu nhiệt được thể hiện trong hình 9. Hình 9. Ảnh điện di SDS – PAGE protein bền nhiệt. Đường chạy M: Thang protein marker chuẩn; Đường chạy 1: Dung dịch huyết thanh đã pha loãng 40 lần; Đường chạy 2: Dịch nổi chứa protein bền nhiệt. Với lượng mẫu ở đường chạy số 1 là 10ml huyết thanh đã pha loãng 40 lần, ở đường chạy số 2 là 15ml dịch nổi chứa protein bền nhiệt và mức độ biểu hiện trên gel điện di, có thể thấy hàm lượng protein bền nhiệt trong huyết thanh nguyên là rất thấp so với hàm lượng protein tổng số. Ở đường chạy số 1, xuất hiện một băng lớn có kích thước khoảng 66.2 kDa, tương đương kích thước của protein Albumin trong huyết thanh, sự có mặt của Albumin sẽ cản trở việc nghiên cứu trên protein khác. Trong khi đó ở đường chạy số 2 không còn thấy xuất hiện băng lớn của Albumin chứng tỏ bằng phương pháp biến tính nhiệt, chúng tôi đã loại bỏ được hầu hết protein này. Nhờ đó sự phân tách của các protein khác rõ ràng hơn, xuất hiện nhiều băng có kích thước nhỏ hơn. Các kết quả trên cho thấy, bằng phương pháp xử lý biến tính nhiệt, chúng tôi đã thu được các protein bền nhiệt, đồng thời làm đơn giản thành phần protein trong huyết thanh. Kết quả này sẽ giúp cho các protein phân tách tốt hơn khi điện di 2-DE [22]. Ngoài ra, nếu so sánh với các phương pháp làm đơn giản mẫu protein huyết thanh khác như Aurum serum protein Mini Kit, cột sắc ký đa ái lực (Multiple Affinity Removal LC Column - Agilent), IgY-microbeads kit (SepproÒ), Cut off, … thì phương pháp biến tính nhiệt rõ ràng là đơn giản, dễ làm và đỡ tốn kém hơn. 3.3. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp so màu Bradford Bradford là phương pháp định lượng protein đơn giản và chính xác trong số các phương pháp xác định nồng độ protein trong dung dịch. Sử dụng phương pháp so màu Bradford cho phép chúng tôi xác định chính xác hàm lượng protein bền nhiệt thu được từ dịch nổi, đánh giá được tỷ lệ protein bền nhiệt so với hàm lượng protein tổng số của huyết thanh trong mẫu nghiên cứu, đồng thời cũng giúp cho việc tính toán chính xác lượng mẫu cần thiết phục vụ cho các thí nghiệm điện di 2-DE sau này. Đường chuẩn nồng độ BSA được xây dựng từ số liệu đo OD của 7 dung dịch BSA chuẩn với các nồng độ khác nhau (từ 0,125 mg/ml đến 2 mg/ml), thí nghiệm đo được lặp lại 3 lần và lấy giá trị đo trung bình. Kết quả đo OD của các dung dịch chuẩn này được ghi lại trong bảng 5. Bảng 5: Kết quả đo OD của các nồng độ BSA chuẩn STT Nồng độ BSA (mg/ml) OD 1 0.125 0.163 2 0.25 0.294 3 0.5 0.560 4 0.75 0.747 5 1 0.850 6 1.5 1.058 7 2 1.258 Từ kết quả đo OD các nồng độ BSA chuẩn ở bước sóng A595 nm trên máy quang phổ, chúng tôi đã sử dụng phần mềm xử lý số liệu thống kê Excel để xây dựng đường chuẩn và phương trình tuyến tính dạng y = ax + b nhằm xác định chính xác nồng độ protein có mặt trong các mẫu nghiên cứu. Kết quả dựng đường chuẩn và phương trình tuyến tính lý thuyết được thể hiện trong hình 10. Hình 10: Đường chuẩn xác định nồng độ protein theo phương pháp Bradford Phương trình đường chuẩn thu được có bình phương hệ số tương quan R2 = 0,9502 đảm bảo mức độ tuyến tính và xác suất tin cậy của phương trình đã đưa ra. Dựa trên phương trình này và tiếp tục tính toán trên phần mềm Excel, chúng tôi thu được kết quả xác định nồng độ protein trong các mẫu nghiên cứu, kết quả được thể hiện trong bảng 6. Bảng 6 : Kết quả tính toán nồng độ protein trong mẫu theo phương pháp Bradford STT Mẫu OD Hàm lượng 1 Huyết thanh bền nhiệt 0.644 0.77365 2 Huyết thanh pha loãng 40 lần 1.1048 1.54724 3 Huyết thanh nguyên 61.89 Kết quả định lượng protein bằng phương pháp Bradford cho thấy với phương pháp xử lý biến tính nhiệt như chúng tôi đã thực hiện thì hàm lượng protein bền nhiệt trong huyết thanh thu được từ mẫu nghiên cứu chỉ chiếm một tỷ lệ rất nhỏ so với protein tổng số, khoảng 1,25%. Kết quả này được thể hiện trong hình 11. Hình 11: Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ protein huyết thanh bền nhiệt trong mẫu nghiên cứu so với protein tổng số 3.4. Điện di 2-DE protein bền nhiệt Điện di hai chiều là phương pháp nghiên cứu protein truyền thống, tuy nhiên đến nay vẫn có nhiều ưu thế như có thể xác định, so sánh hình ảnh tương quan của các mẫu với hàng nghìn protein ở các trạng thái khác nhau (dạng bình thường, bệnh lý, nghiên cứu mức độ biểu hiện của các protein khác nhau, đánh giá khả năng phân tách protein từ mẫu huyết thanh nguyên và huyết thanh sau khi được xử lý loại các protein hàm lượng lớn ...) [19,20,21]. Mẫu protein huyết thanh sau khi được xử lý biến tính nhiệt và thu dịch nổi đã loại bỏ được hầu hết các protein có hàm lượng lớn, kém bền nhiệt và trở nên đơn giản hơn nhiều so với mẫu huyết thanh ban đầu, tạo điều kiện cho các protein phân tách tốt hơn trên bản điện di 2-DE. Tuy nhiên, trong dung dịch protein thu được còn chứa đệm ETP mà các thành phần có mặt trong đó có thể gây ảnh hưởng đáng kể đến quá trình chạy điện di 2-DE. Do đó, để đánh giá ảnh hưởng của các thành phần này và tối ưu hóa kết quả của thí nghiệm điện di 2-DE, chúng tôi tiến hành khảo sát thí nghiệm này trên thanh Strip pH 3-10 với kích thước 7cm theo quy trình đã nêu ở mục 2.2.5, bản điện di được nhuộm màu bằng Comassive Blue Brilliant R-250. Trong quá trình tiến hành điện di IEF, chúng tôi nhận thấy các thông số hiệu điện thế (Voltage) trong các bước thí nghiệm đều không đạt được như chương trình đã đặt (xem bảng 5). Tại một số thời điểm, sự gia tăng tuyến tính của hiệu điện thế bị gián đoạn kéo dài, do đó hiệu điện thế của dòng điện không đạt được các giá trị đã chọn, làm tăng thời gian chạy thí nghiệm và gây ra những ảnh hưởng không mong muốn đến kết quả điện di. Bảng 7: Sự biến đổi của hiệu điện thế theo thời gian (A) theo chương trình cài đặt ; (B) trong thực tế theo dõi Voltage Time Volt - Hours Ramp Step 1 250 20 min -------- Linear Step 2 4000 2hr ----- Linear Step 3 4000 -------- 10000 V - hr Rapid Total 5hr 14000 V - hr A Step 1 Step 2 Step 3 Phút thứ 8 10 15 20 90 95 105 140 180 188 3000 12000 Voltage 17 59 23 27 140 150 207 122 364 270 127 1036 B Kết quả ảnh điện di 2-DE thu được (hình 12) cũng cho thấy sự phân tách protein chưa tốt, nhiều protein xuất hiện ở dạng vệt – dải (được đánh số 1, 2, 3 ở trên hình) pH 3 10 Hình 12: Ảnh điện di 2-DE phân đoạn protein bền nhiệt. HW: vùng khối lượng phân thử cao; LW: vùng khối lượng phân tử thấp Tất cả các đặc điểm này cho thấy đã có sự ảnh hưởng của các thành phần đệm trong mẫu đến quá trình điện di IEF, đặc biệt là rất phù hợp với các nghiên cứu về ảnh hưởng của Tris ở nồng độ cao đến điện di IEF và 2-DE (hình 3)[17], trong đó đặc trưng nổi bật là vùng hội tụ của Tris (được đánh dấu bằng mũi tên đỏ trên ảnh) ở khoảng pH 8 mà tại đó có sự tập hợp của các protein thành một hàng dọc. Tris là một phân tử nhỏ hơi base, có pKa ở 20oC là 8,3 và có thể thay đổi theo nhiệt độ [17, 18]. Trong quá trình điện di IEF, nồng độ Tris được tăng lên nhanh chóng do có sự hội tụ tại pKa của nó, quá trình này diễn ra nhanh hơn nhiều so với sự hội tụ của các protein. Khi đó Tris sẽ tạo ra một vùng hội tụ cục bộ (local) gọi là Tris zone mà tại đó, tính dẫn điện của dung dịch tăng mạnh làm sụt giảm điện thế ở các vùng lân cận [17]. Kết quả là sự dịch chuyển trong điện trường của các protein đến điểm đẳng điện bị cản trở và phần lớn protein sẽ bị tập hợp thành một hàng dọc tại vùng hội tụ của Tris (Tris zone) (hình 13). Hình 13: Sự hội tụ của Tris trên bản điện di 2-DE tại pH ứng với pKa của nó Như vậy, việc sử dụng Tris ở nồng độ cao là một yếu tố cần thiết để thu được các protein bền nhiệt trong quá trình biến tính. Tuy nhiên, sự có mặt của nó trong quá trình điện di IEF có thể gây ra những ảnh hưởng không mong muốn đến sự hội tụ của các protein tại pI tương ứng của chúng. Nhằm loại bỏ những ảnh hưởng này của Tris, chúng tôi đã thử nghiệm nghiên cứu và đề ra 2 chiến lược như sau: Thu hẹp dải pH dùng trong điện di IEF sao cho pH < 8. Loại bỏ Tris ra khỏi mẫu bằng phương pháp kết tủa protein và tiếp tục tiến hành điện di 2-DE trên dải pH 3-10. 3.5. Điện di 2-DE protein bền nhiệt trên dải pH hẹp Do pKa của Tris là 8,3 ở 20oC nên việc lựa chọn dải pH < 8, không chứa vùng hội tụ của Tris, sẽ giúp loại bỏ ảnh hưởng của nó đến quá trình điện di. Việc thu hẹp dải pH nghiên cứu kết hợp với tăng kích thước của thanh Strip cũng giúp cho các protein phân tách nhau tốt hơn [39]. Ngoài ra, đa số các protein trong huyết thanh có pI nằm trong khoảng 4-8 [46] nên việc khảo sát các protein bền nhiệt trong huyết thanh ở vùng pH này vẫn cho những kết quả có ý nghĩa. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn thanh Strip có dải pH 4-7 và kích thước 17cm. Kết quả điện di sau khi hiện màu bằng thuốc nhuộm Comassive Blue Brilliant R-250 được thể hiện trong hình 14. Hình 14: Ảnh điện di phân đoạn protein bền nhiệt trên dải pH 4-7. HW: vùng khối lượng phân thử cao; LW: vùng khối lượng phân tử thấp Kết quả theo dõi cho thấy sự biến đổi hiệu điện thế theo thời gian hoàn toàn tương ứng với chương trình đã cài đặt. Đồng thời, kết quả thu được trên ảnh điện di cũng cho thấy các protein phân tách nhau khá tốt, đặc biệt là không còn thấy xuất hiện vùng hội tụ của Tris. Điều này chứng tỏ chiến lược thu hẹp dải pH đã đặt ra là hoàn toàn phù hợp, quá trình điện di IEF không bị ảnh hưởng bởi Tris trong dải pH này. Kết quả này cũng rất phù hợp và đủ điều kiện để tiến hành các bước thí nghiệm tiếp theo, bao gồm cắt gel, thủy phân và nhận diện bằng hệ thống sắc ký lỏng Nano một chiều kết nối với khối phổ liên tục (1DnanoLC-ESI-MS/MS). 7 vùng được đánh dấu đỏ và đánh số trên hình 14 là những vùng đã được chúng tôi lựa chọn để tiến hành nhận diện bằng hệ thống phân tích khối phổ. 3.6. Loại bỏ Tris bằng phương pháp kết tủa protein Để tiếp tục khảo sát thành phần protein bền nhiệt trong huyết thanh trên dải pH 3-10, nhằm đánh giá toàn diện hơn hệ protein này, đặc biệt là các protein có pI nằm trong vùng pH thấp hoặc cao mà không bị ảnh hưởng bởi sự hội tụ của Tris trong quá trình điện di IEF, chúng tôi tiến hành loại bỏ Tris có mặt trong mẫu. Có nhiều phương pháp giúp loại bỏ Tris ra khỏi mẫu protein, nhưng trong điều kiện cụ thể của nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn phương pháp kết tủa protein. Phương pháp này cho phép loại bỏ hầu hết các thành phần đệm, muối tự do có mặt trong mẫu, đồng thời cô đặc protein có trong mẫu, giúp người nghiên cứu chủ động hơn trong tính toán nồng độ protein sau khi hòa tan kết tủa trở lại [29]. Trong số các phương pháp kết tủa protein thì kết tủa bằng TCA (trifloracetic acid) là một trong những phương pháp phổ biến và đã chứng minh được hiệu quả trong việc làm sạch mẫu, phục vụ cho thí nghiệm điện di 2-DE [29]. Để tối ưu hóa qui trình kết tủa với TCA, chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu quả kết tủa với các dung dịch TCA có nồng độ khác nhau ở 2 điều kiện là: (i) có ủ ở 4oC trong 10 phút và (ii) không ủ. Protein trong dung dịch thu được sau khi biến tính nhiệt được kết tủa bằng TCA theo các bước như quy trình đã nêu ở mục 2.2.2. Kết tủa protein sau đó được hòa tan trong nước cất 2 lần và đệm mẫu dùng cho điện di biến tính SDS-PAGE. Dung dịch thu được dùng để kiểm tra bằng phương pháp điện di biến tính SDS-PAGE trên bản gel có nồng độ 12,6%. Sau khi nhuộm gel bằng dung dịch Comassive Blue Brilliant R-250 và tẩy màu, chúng tôi thu được kết quả điện di SDS-PAGE như trong hình 15. Hình 15: Ảnh điện di SDS – PAGE khảo sát các điều kiện kết tủa với TCA Đường chạy 1: Protein huyết thanh nguyên pha loãng 40 lần; Đường chạy 2 đến 5( nhóm I): Protein bền nhiệt thu được sau khi xử lý kết tủa bằng TCA trong điều kiện không ủ ở các nồng độ tương ứng tăng dần: 15% - 20% - 25% và 30%; Đường chạy 6 đến 9 (nhóm II): Protein bền nhiệt thu được sau khi xử lý kết tủa bằng TCA trong điều kiện có ủ ở 4oC trong 10 phút ở các nồng độ tương ứng giảm dần: 30% - 25% - 20% và 15% Kết quả trên ảnh điện di khảo sát cho thấy, có 2 điều kiện kết tủa tương đối tốt là: (i) TCA nồng độ 30% trong điều kiện không ủ và (ii) TCA nồng độ 25% trong điều kiện có ủ. Tuy nhiên, kết quả điện di cũng cho thấy ở các giếng sử dụng TCA trong điều kiện có ủ sẽ thu được nhiều băng protein hơn, đặc biệt là các protein có hàm lượng thấp (băng nhỏ) và các proten có khối lượng phân tử thấp. Điều này có ý nghĩa rất quan trọng trong nghiên cứu với điện di 2-DE sau này. Bảng 8: Kết quả tính toán nồng độ protein trước và sau khi kết tủa bằng phương pháp Bradford STT Mẫu OD Hàm lượng 1 Huyết thanh bền nhiệt 0.644 0.77365 2 Kết tủa với TCA 25% 0.612 0.7199 Hiệu quả kết tủa với TCA ở nồng độ 25% và có ủ 10 phút trong 4oC được kiểm tra lại bằng số liệu đo Bradford (bảng 8) Kết quả thu được từ phương pháp so màu Bradford cho thấy, hàm lượng protein bị hao hụt không đáng kể (khoảng 7%) so với trước khi kết tủa và có tới hơn 93% protein trong mẫu đã được thu hồi. Do đó, qua kết quả khảo sát này, chúng tôi quyết định lựa chọn phương pháp kết tủa với TCA nồng độ 25% trong điều kiện có ủ ở 4oC trong 10 phút để chuẩn bị mẫu cho thí nghiệm điện di 2-DE. 3.7. Kiểm tra hiệu quả loại Tris trên bản điện di 2-DE Với kết quả khảo sát các điều kiện kết tủa để loại bỏ Tris như trên, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu bằng phương pháp biến tính nhiệt, sau đó kết tủa protein bằng TCA ở nồng độ 25% trong điều kiện có ủ 10 phút trong 4oC. Kết tủa protein được hòa tan trở lại trong nước cất 2 lần và đệm mẫu dùng cho điện di 2-DE. Thể tích mẫu sử dụng được tính toán dựa theo kết quả đo Bradford để đảm bảo lượng protein đưa lên thanh Strip đạt khoảng 80mg. Kích thước và dải pH dùng để khảo sát là trên thanh Strip pH 3-10, 7cm. Quy trình thí nghiệm được thực hiện như mục 2.2.5. Kết quả điện di 2-DE kiểm tra sau khi được nhuộm bằng dung dịch Comassive Blue Brilliant R-250 và tẩy màu, được so sánh với bản điện di 2-DE tương ứng trước khi loại Tris như trong hình 16. pH 10 3 Hình 16: Ảnh điện di 2-DE so sánh hiệu quả của việc loại Tris bằng phương pháp kết tủa protein đối với quá trình điện di 2-DE trên dải pH 3-10. (A) Trước khi loại Tris; (B) sau khi loại Tris; (C) Ảnh 2-DE phóng đại của mẫu sau khi loại Tris với các vùng tiềm năng cho phân tích khối phổ. So sánh kết quả điện di 2-DE trước và sau khi kết tủa protein bằng TCA cho thấy chiến lược phân tích trên dải pH 3-10 đã đề ra là rất hợp lý. Ở bản gel sau khi kết tủa (B), các protein đã phân tách nhau tốt hơn, xuất hiện nhiều điểm protein hơn so với trước khi kết tủa (A) và đặc biệt là tại vùng pH 8 đã không còn xuất hiện hiện tượng các protein tập hợp thành một hàng dọc tại vùng hội tụ của Tris. Kết quả này cho thấy Tris đã được loại bỏ hoàn toàn khỏi mẫu và không còn gây ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu bằng điện di 2-DE trên dải pH 3-10. Kết quả này cũng cho phép chúng tôi lựa chọn và đánh dấu các vùng protein phù hợp để cắt gel, thủy phân và nhận dạng bằng phương pháp khối phổ (C). 3.8. Nhận dạng các protein bền nhiệt trên gel bằng hệ 1DnanoLC-ESI-MS/MS Do thời gian tiến hành nghiên cứu có hạn, chúng tôi chỉ lựa chọn phân tích, nhận dạng một số protein từ các kết quả điện di 2-DE thu được. Sau khi tiến hành so sánh trên 2 bản điện di 2 chiều 2-DE đã loại bỏ các ảnh hưởng của Tris, bản gel có dải pH 4-7, kích thước 17cm được chúng tôi lựa chọn. 7 vùng protein bền nhiệt phù hợp được đánh dấu, lựa chọn, thủy phân bằng trypsin và nhận dạng bằng hệ sắc ký lỏng nano một chiều kết nối trực tiếp khối phổ liên tục (1DnanoLC-ESI-MS/MS). Phổ MS/MS của các mảnh peptide thu được so sánh với phổ MS/MS lí thuyết trên cơ sở dữ liệu NCBInr dưới sự hỗ trợ của phần mền Mascot v1.8. Kết quả là trong 7 vùng đã lựa chọn, có 7 protein đã được nhận dạng là Alpha-1 acid glycoprotein, Haptoglobin, Haptoglobin alpha2 chain, Apolipoprotein A-I, Alpha1 antitrypsin, Alpha 2- HS- Glycoprotein và Transthyretin. Kết quả nhận dạng các protein chịu nhiệt đã được đánh dấu trên bản điện di 2-DE được thể hiện trong bảng 9. Bảng 9 : Kết quả nhận dạng các protein chịu nhiệt bằng phương pháp 2DE-LC-MS/MS STT Tên protein GI Number Swissprot ID KLPT pI 1 Transthyretin gi|1181953 P02766 13,8 kDa 5.0-5.23 2 Haptoglobin alpha 2 chain gi|229323 P00738 16,8 kDa 5.13-5.4 3 Apolipoprotein AI gi|37499465 P02647 23,1 kDa 5.56 4 Haptoglobin gi|4826762 P00738 45,9 kDa 6.13 5 Alpha1 antitrypsin gi|1942629 P01009 55 kDa 4.8-5.0 6 Alpha 2- HS- Glycoprotein gi|4502005 P02765 55,4 kDa 4.5-4.7 7 Alpha 1 acid Glycoprotein gi|1197209 P02763 45 kDa 4.0-4.2 Tất cả 7 protein được nhận dạng bằng hệ 2DE-1DnanoLC-MS/MS trên cơ sở dữ liệu NCBI được xác nhận tính hợp lệ trên cơ sở dữ liệu protein Swiss-Prot của viện tin sinh học Thụy Sĩ với các thông số như tên protein, số đăng ký, khối lượng phân tử, pI, trình tự axit amin và vị trí trên bản điện di 2DE chuẩn. Danh sách các protein thu được hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu về protein bền nhiệt trong huyết thanh đã công bố của Goufman [22]. 3.9. Tìm hiểu chức năng một số protein bền nhiệt đã được nhận diện 3.9.1. Haptoglobin Haptoglobin là một protein có cấu trúc tetramer gồm hai chuỗi alpha (haptoglobin a2 chain, haptoglobin a1 chain) và hai chuỗi beta (haptoglobin b2 chain, haptoglobin b1 chain), được biểu hiện trong gan và tiết vào máu. Nó là một glycoprotein có mặt trong huyết thanh, tham gia vào quá trình vận chuyển và liên kết với các ion sắt tự do nhằm ngăn chặn các ion này đi qua thận, bảo vệ thận khỏi tác động của hemoglobin. Mức độ glycosyl hóa haptoglobin bất thường sẽ liên quan đến các trạng thái bệnh lý của cơ thể như: quá trình phá hủy mô, các phản ứng viêm nhiễm do sự hoại tử (necrosis) hoặc là ung thư [16, 40]. Haptoglobin được nhận dạng với 58 trình tự peptide được xác định, tổng điểm 514 phù hợp với số đăng ký gi|4826762 trên cơ sở dữ liệu NCBInr (hình 17) [5, 26]. Mascot Search Results Protein View Match to: gi|4826762; Score: 514 haptoglobin [Homo sapiens] Found in search of C:\WINNT\Profiles\ADMINI~1\LOCALS~1\Temp\mas107.tmp Nominal mass (Mr): 45861; Calculated pI value: 6.13 NCBI BLAST search of gi|4826762 against nr Unformatted sequence string for pasting into other applications Taxonomy: Homo sapiens Hình 17: Kết quả nhận dạng haptoglobin với số đăng ký gi|4826762 Haptoglobin có khối lượng khoảng 45,861 kDa, giá trị pI = 6,13. Trong phân tích này chúng tôi đã xác định được 58 mảnh peptide đều có điểm số lớn hơn 31 và cho thấy sự tương đồng cao với haptoglobin, dưới đây là kết quả xác định trình tự của một trong số các mảnh peptide đó. K Q V W D Q T S T Hình 18. Phổ MS/MS của ion peptide (TSTQDWVQK) có m/z bằng 602.3 với z=+2 của Haptoglobin gi|4826762 So sánh các trình tự peptide xác định được với trình tự amino acid của Haptoglobin số đăng ký gi|4826762 trên cơ sở dữ liệu NCBInr thu được kết quả tương đồng (hình 19). Trong đó trình tự amino acid in đậm là các peptide đã được xác định. 1 MSALGAVIAL LLWGQLFAVD SGNDVTDIAD DGCPKPPEIA HGYVEHSVRY 51 QCKNYYKLRT EGDGVYTLND KKQWINKAVG DKLPECEADD GCPKPPEIAH 101 GYVEHSVRYQ CKNYYKLRTE GDGVYTLNNE KQWINKAVGD KLPECEAVCG 151 KPKNPANPVQ RILGGHLDAK GSFPWQAKMV SHHNLTTGAT LINEQWLLTT 201 AKNLFLNHSE NATAKDIAPT LTLYVGKKQL VEIEKVVLHP NYSQVDIGLI 251 KLKQKVSVNE RVMPICLPSK DYAEVGRVGY VSGWGRNANF KFTDHLKYVM 301 LPVADQDQCI RHYEGSTVPE KKTPKSPVGV QPILNEHTFC AGMSKYQEDT 351 CYGDAGSAFA VHDLEEDTWY ATGILSFDKS CAVAEYGVYV KVTSIQDWVQ 401 KTIAEN Hình 19. Trình tự amino acid của protein haptoglobin gi|4826762 3.9.2. Apolipoprotein A (Apo) Apolipoprotein là một nhóm apoprotein, phải phụ thuộc vào sự có mặt của các phân tử nhỏ khác hay cofactor để thực hiện chức năng, là protein cấu thành nên các lipoprotein cùng với các phân tử phospholipid, triacylglycerol, cholesterol và các este cholesterol. Có năm loại apolipoprotein: Apo A , Apo B, Apo C, Apo D và Apo E. Apolipoprotein AI (ApoAI) là các protein gắn với lipid, vận chuyển các phân tử lipid từ ruột đến gan. ApoAI là thành phần chính của các lipoprotein có tỷ trọng lớn trong hệ tuần hoàn, đóng một vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa và loại cholesterol ra khỏi tế bào. Các nghiên cứu cho rằng những biến đổi của ApoAI có liên quan đến các bệnh về tim mạch. Đây là một họ protein có khả năng chịu nhiệt cao. Người ta cũng cho rằng ApoAI điều chỉnh hoạt tính của các enzym quan trọng trong cơ chế chuyển hóa lipoprotein. Sự thay đổi nồng độ ApoAI được coi như chỉ thị của nhiều loại ung thư khác nhau như ung thư vú [24], ung thư ruột kết [42], ung thư buồng trứng [34]. Bằng phương pháp sắc ký lỏng Nano kết nối khối phổ và sự hỗ trợ của phần mềm Mascot v1.8, chúng tôi đã nhận dạng được apoA-I phù hợp với số đăng ký gi|37499465 trên cơ sở dữ liệu NCBInr như hình 20. Mascot Search Results Protein View Top of Form Match to: gi|37499465; Score: 351 apolipoprotein A-I [Homo sapiens] Found in search of C:\WINNT\Profiles\ADMINI~1\LOCALS~1\Temp\mas34E.tmp Nominal mass (Mr): 30759; Calculated pI value: 5.56 NCBI BLAST search of gi|37499465 against nr Unformatted sequence string for pasting into other applications Taxonomy: Homo sapiens Hình 20. Kết quả nhận dạng ApoA-I với số đăng ký gi|37499465 ApoA-I được nhận dạng có tổng điểm 351 cho thấy kết quả thu được qua thực nghiệm rất phù hợp với trình tự của ApoA-I trên cơ sở dữ liệu với 7 trình tự peptide đã được xác định. Hình 21 là phổ MS/MS của một trong số các peptide đã xác định được. R L E D S Y P A L H Hình 21. Phổ MS/MS của ion peptide (HLAPYSDELR) có m/z bằng 651.3 với z=+2 của apoA-I gi|37499465 So sánh các trình tự peptide xác định được với trình tự amino acid của ApoA-I số đăng ký gi|37499465 trên cơ sở dữ liệu NCBInr thu được kết quả tương đồng (hình 22). Trong đó trình tự amino acid in đậm là các peptide đã được xác định. 1 MKAAVLTLAV LFLTGSQARH FWQQDEPPQS PWDRVKDLAT VYVDVLKDSG 51 RDYVSQFEGS ALGKQLNLKL LDNWDSVTST FSKLREQLGP VTQEFWDNLE 101 KETEGLRQEM SKDLEEVKAK VQPYLDDFQK KWQEEMELYR QKVEPLRAEL 151 QEGARQKLHE LQEKLSPLGE EMRDRARAHV DALRTHLAPY SDELRQRLAA 201 RLEALKENGG ARLAEYHAKA TEHLSTLSEK AKPALEDLRQ GLLPVLESFK 251 VSFLSALEEY TKKLNTQ Hình 22: Trình tự amino acid của protein apoA-I gi|37499465 3.9.3. Transthyretin (TTR) Transthyretin – TTR (hay prealbumin) là một glycoprotein (55 kDa) được tiết bởi gan vào hệ tuần hoàn. Transthyretin gồm 4 đơn phân (homotetramer), mỗi đơn phân là một polypeptid dài 127 axit amin có nhiều cấu trúc gấp nếp β. Transthyretin là một protein đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển hocmon thyroid đến các mô đích và đã được coi là một biomarker đánh giá tình trạng dinh dưỡng ở nhiều bệnh khác nhau như bệnh tụy [28], bệnh thận giai đoạn cuối [41] và ung thư phổi [33]. Transthyretin huyết thanh với số đăng ký gi|1181953 trên cơ sở dữ liệu NCBInr đã được nhận dạng với tổng điểm rất cao 274 (hình 23). Mascot Search Results Protein View Match to: gi|1181953; Score: 274 Transthyretin [Homo sapiens] Found in search of c:\winnt\pROFILES\admini~1\locals~1\tEMP\MAS19c.TMP Nominal mass (Mr): 13809; Calculated pI value: 5.55 NCBI BLAST search of gi|1181953 against nr Unformatted sequence string for pasting into other applications Taxonomy: Homo sapiens Bottom of Form Hình 23. Kết quả nhận dạng của transthyretin với số đăng ký gi|1181953 Mỗi đơn phân của transthyretin là một polypeptide với 127 amino acid, kích thước phân tử 13,809 kDa và pI=5.55. Kết quả đã xác định 4 peptide có trình tự amino acid giống với trình tự amino acid của transthyretin có số đăng ký trên cơ sở dữ liệu NCBInr. Hình 24 là kết quả xác định trình tự của một trong số các peptide nhận được. R FR VR HR VR AR VR NR IR AR PR Hình 24. Phổ MS/MS của ion peptide (GSPAINVAVHVFR) của transthyretin gi|1181953 So sánh trình tự peptide được xác định với trình tự amino acid của transthyretin trên cơ sở dữ liệu NCBInr cho thấy chúng có độ tương đồng khá cao là 55% (hình 25). 1 GPTGTGESKC PLMVKVLDAV RGSPAINVAV HVFRKAADDT WEPFASGKTS 51 ESGELHGLTT EEQFVEGIYK VEIDTKSYWK ALGISPFHEH AEVVFTANDS 101 GPRRYTIAAL LSPYSYSTTA VVTNPKE Hình 25. Trình tự amino acid của transthyretin với số đăng ký gi|1181953 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Từ các kết quả nghiên cứu đã trình bày ở trên, chúng tôi xin đưa ra một số kết luận và kiến nghị như sau: Kết luận Bằng các phương pháp biến tính nhiệt của Goufman, đã xử lý và thu nhận thành công phân đoạn chứa các protein bền nhiệt trong huyết thanh người, phục vụ cho các nghiên cứu proteomics. Thông qua quá trình khảo sát, đánh giá và tối ưu hóa đã đề ra được 2 chiến lược hợp lý và hiệu quả nhằm phân tích hệ protein huyết thanh bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều 2-DE trên các thanh Strip có kích thước và dải pH khác nhau. Kết quả điện di 2-DE thành công đã tạo điều kiện cho việc nhận dạng các protein bền nhiệt bằng khối phổ theo hướng kết hợp điện di hai chiều 2-DE với sắc ký lỏng nano một chiều, ion hóa bằng nguồn ESI và nhận dạng bằng khối phổ liên tục MS/MS (2DE-1DnanoLC-ESI-MS/MS). Danh sách 7 protein bền nhiệt đã được nhận dạng hoàn toàn phù hợp với các công bố hiện có về hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh và với các cơ sở dữ liệu hiện có về protein huyết thanh. Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện phương pháp nghiên cứu hệ protein huyết thanh bền nhiệt, mở rộng việc khảo sát các protein này trên các dài pH hẹp hơn và kích thước lớn hơn nhằm đánh giá đầy đủ và xây dựng cơ sở dữ liệu hoàn chỉnh về các protein bền nhiệt ở người Việt Nam bình thường, đóng góp vào các công bố về danh sách protein người theo sáng kiên của tổ chức HUPO thế giới. Tiếp tục nghiên cứu hệ protein bền nhiệt trên các đối tượng khác nhau, đặc biệt quan tâm đến các nhóm bệnh lý như ung thư, đái tháo đường, …., phân tích, so sánh nhằm tìm ra những thay đổi trong biểu hiện giữa người thường với người bệnh, tạo cơ sở cho việc tìm kiếm các ứng viên chỉ thị protein phục vụ cho điều trị và chẩn đoán. Tiếp tục nghiên cứu các protein bền nhiệt theo hướng phân tích về mặt cấu trúc nhằm lý giải nguyên nhân làm nên tính bền nhiệt, những thay đổi cấu trúc liên quan đến tính bền nhiệt và ứng dụng những hiểu biết đó vào việc phát triển công nghệ protein. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Phan Văn Chi (2003), Proteomics và những nghiên cứu ứng dụng, Tạp chí Công Nghệ Sinh học, 1(4), tr. 397-414. Phan Văn Chi (2006), Proteomics: Khoa học về hệ protein, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tr. 112-129. Đỗ Ngọc Liên (2004), Miễn dịch học cơ sở, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia, Hà nội. Đỗ Trung Phấn (2004), Bài giảng huyết học-truyền máu, Nhà Xuất Bản Y Học, Hà Nội. Vũ Minh Thiết, Nguyễn Nam Long, Đặng Thành Nam, Phan Văn Chi (2004), Nghiên cứu hệ protein huyết thanh người bằng sắc ký lỏng đa chiều kết hợp với khối phổ MS/MS, BCKH Hội Nghị Toàn Quốc 2004, NCCB Đinh hương Y-Dược học, Học viện Quân Y, Hà Nội, 27-27/10/2004, tr. 470-474. Tiếng Anh Adkins J., Susan N., Varnum M., Auberry K.J. (2002), Toward a human bloodserum proteome analysis by multimensional seperation coupled with mass spectrometry, Molecular Cellular proteomics, 1, pp. 947-955. Aebersold R., Mann M. (2003), Mass spectrometry-based proteomics, Nature, 422(6928), pp. 198–207. Anderson N. L., Anderson N. G. (1998), Proteome and proteomics: new technologies, new concepts, and new words, Electrophoresis, 19(11), pp. 1853-1861. Anderson N. L., Anderson N. G. (2002), The human plasma proteome, history, character and diagnostic prospects, Molecular Cellular Proteomics, 1, pp. 845-867. Anderson N. L., Polanski M., Rembert P., Gatlin T., Tirumalai R. S., Conrads T. P., Veenstra T. D., Adkins J. N., Pounds J. G., Fagan R., Anna L. (2004), The Human Plasma Proteome-A Nonredundant List Developed by Combination of Four Separate Sources, Molecular & Cellular Proteomics, 3, pp. 311-326. Anderson N. L. (2005), The Diagnostic Proteome: Multivariate Markers in Plasma, Founder & CEO, Plasma Proteome Institute Board Member, Dade Behring. Bradford M. M. (1976), A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal Biochem, 72, pp. 248–254. Chan K. C., Lucas D. A., Hise D., Schaefer C. F., Xiao Z., Janini G. M., Kenneth H. B., Haleem J. I., Veenstra T. D., Conrads T. P. (2004), Analysis of the Human serum proteome, Clinical Proteomics I, 1(2), pp. 101-225. Choe L. H., Lee K. H .(2000), A comparison of three commercially available isoelectric focusing units for proteome analysis: The multiphor, the IPGphor and the protean IEF cell, Electrophoresis, 21, pp. 993-1000. Ducret A., Bruun C. F., Bures E. J., Marhaug G., Husby G. and Aebersold R. (1996), Characterization of human serum amyloid A protein isoforms separated by two-dimensional electrophoresis by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry, Electrophoresis, 17, pp. 866–876. Fella K., Gluckmann M., Hellman J., Karas M., Kramer P. J., Kroger M. (2005 ), Use of two-dimensional gel electrophoresis in predictive toxicology: Identification of potential early protein biomarkers in chemically induced hepatocarcinogenesis, Proteomics, 5, pp. 1914-1927. Gary B. S., Myra H. R. (2007), Tris interference in IEF and 2-DE, Electrophoresis, 28, pp. 1601–1606. Gomori G. (1955), Preparation of Buffers for Use in Enzyme Studies, Methods Enzymology, 1, pp. 138-146. Gorg A. (1991), Two-dimensional electrophoresis, Nature, 349, pp. 545-546. Gorg A., Obermaier C., Boguth G., Harder A., Scheibe B., Wildgruber R., Weiss W. (2000), The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients, Electrophoresis, 21, pp. 1037-1053. Gorg A., Weiss W., Dunn J. M. (2004 ), Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics, Proteomics, 4, pp.3665–3685. Goufman E. I., Moshkovskii S. A., Tikhonova O. V., Lokhov P. G., Zgoda V. G., Serebryakova M. V., Toropygin I. Y., Vlasova M. A., Safarova M. R., Makarov O. V., Archakov A. I. (2006), Two-dimensional electrophoretic proteome study of serum thermostable fraction from patients with various tumor conditions, Biochemistry (Mosc), 71(4), pp. 354-360. Gromov P. S., Ostergaard M., Gromova I., Celis J. E, (2002 ), Human proteomic databases: a powerful resource for functional genomics in health and diesease, Prog. Biophys Mol. Biol., 80, pp. 3-22. Huang H. L., Stasyk T., Morandell S., Dieplinger H., Falkensammer G., Griesmacher A., Mogg M., Schreiber M., Feuerstein I., Huck C. W., Stecher G., Bonn G. K., Huber L. A. (2006 ), Biomarker discovery in breast cancer serum using 2-D differential gel electrophoresis/ MALDI-TOF/TOF and data validation by routine clinical assays, Electrophoresis, 27(8), pp.1641-1650. Klose J., Kobalz U. (1995), Two-dimensional electrophoresis of proteins: An updated protocol and implications for a functional analysis of the genome, Electrophoresis, 16(6), pp. 1034-1059. Krajewska M., Krajewski S., Banares S., Huang X., Turner B., Bubendorf L., Kallioniemi O., Shabaik A., Vitiello A., Peehl D., Gao G. J., Reed J. C. (2003 ), Elevated Expression of Inhibitor of Apoptosis Proteins in Prostate, Cancer Clinical & Cancer Research, 9, pp. 4914-4925. Laemmli U. K. (1970 ), Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, pp. 680-685. Lasztity N., Biro L., Nemeth E., Pap A., Antal M. (2002), Transthyretin is a sensitive biomarker of malnutrition in acute and chronic pancreatitis, Clin Chem Lab Med., 40, pp. 1320-1324. LeiJiang L. H., Michael F. (2004 ), Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis, Journal of Chromatography A, 1023, pp. 317–320. Li J., Kelly J. F., Chernushevich I., Harrison D. J., Thibault P. (2000), Separation and Identification of Peptides from Gel-Isolated Membrane Proteins Using a Microfabricated Device for Combined Capillary Electrophoresis/ Nanoelectrospray Mass Spectrometry, Anal. Chem, 72, pp. 599-609. Li X., Dina A., Fred R. (2003), Comparative Proteomics of Glycoproteins Based on Lectin Selection and Isotope Coding, Journal of Proteome Research, 2, pp. 618-625. Liebler D. C. (2002), Introduction to Proteomics:Tools for the New Biology, Humana Press Totowa, New Jersey, pp. 31-49. Maciel C. M., Junqueira M., Paschoal M. E., Kawamura M. T., Duarte R. L., Carvalho Mda G., Domont G. B. (2005), Differential proteomic serum pattern of low molecular weight proteins expressed by adenocarcinoma lung cancer patients, J Exp Ther Oncol, 5(1), pp. 31-38. Moore L. E., Fung E. T., McGuire M., Rabkin C. C., Molinaro A., Wang Z., Zhang F., Wang J., Yip C., Meng X. Y., Pfeiffer R. M. (2006), Evaluation of apolipoprotein A1 and posttranslationally modified forms of transthyretin as biomarkers for ovarian cancer detection in an independent study population, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 15(9), pp. 1641-1646. Nagele E., Vollmer M., Horth P. (2003), Two-dimensional nano-liquid chromatography–mass spectrometry system for applications in proteomics, Journal of Chromatography A, 1009, pp. 197–205. O'Farrel P.H. (1975), High resolution two-dimentional electrophoresis of proteins, J Biol Chem, 250, pp. 4007-4021. Rabilloud T. (1998), Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis, Electrophoresis, 19, pp. 758–760. Rabilloud T. (1999), Solubilization of proteins in 2-D electrophoresis, An outline, Methods Mol Biol , 112, pp. 9–19. Righetti P. G. (1990), Recent developments in electrophoretic methods, J Chromatogr, 516, pp. 3–22. Saraiva M. J. (1995 ), Transthyretin mutations in health and disease, Human Mutation, 5(3), pp. 191-196. Sreedhara R., Avram M., Blanco M., Batish R., Mittman N. (1996), Prealbumin is the best nutritional predictor of survival in hemodialysis and peritoneal dialysis, American Journal of Kidney Disease, 28, pp. 937-942. Tachibana M., Ohkura Y., Kobayashi Y., Sakamoto H., Tanaka Y., Watanabe J., Amikura K., Nishimura Y., Akagi K. (2003 ), Expression of apolipoprotein A1 in colonic adenocarcinoma, Anticancer Research, 23(5), pp. 4161-4167. Tirumalai, R. S., Chan, K. C., Prieto, D. A., Issaq, H. J., Conrads, T. P., Veenstra, T. D. (2004), Characterization of the Low Molecular Weight Human Serum Proteome, Molecular & Cellular Proteomics, 2, pp. 1096-1103. Turner M. W., Hulme B. (1970), The Plasma Proteins: An Introduction, Pitman Medical & Scientific Publishing Co., Ltd., London. Wilkins M. R., Williams K. L., Appel R. D., Hochstrasser D. F. (1997), Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics. Springer, Berlin. YaJin G. L., Tomoko O., Takashi M. (2002), Estimation of isoelectric points of human plasma proteins employing capillary isoelectric focusing and peptide isoelectric point markers, Electrophoresis, 23, pp. 3385–3391.