Đề tài Phân tích giá trị sinh học

XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ SINH HỌC CỦA THỰC PHẨM: Xác định giá trị sinh học của glucid: Phương pháp đo lường chất bột đường: Đầu tiên là tách rời những hợp chất đường ra khỏi những hợp chất khác như: đạm, béo… để tránh những sai lệch kết quả do sự tác động giữa các chất này . Phương pháp dùng rượu ethanol hay 2- propanol 80% được coi là hữu dụng nhất vì nó làm cho các enzyme, nếu có trong mẫu, bị ngưng hoạt động. Các đường đơn, amino acid, acid hữu cơ, muối cũng như các hợp chất khác được hòa tan trong rượu. Sau đó các hợp chất khác ngoài đường đơn sẽ được tách rời bằng cách cho trầm lắng bởi muối bạc hay tốt hơn nữa với ion exchangeresins. Phần bã lọc được dùng để đo lượng tinh bột. Sau đó dùng dung dịch muối chì trung tính để trầm lắng các hợp chất khác ngoài đường đơn rồi đem lọc, tiếp theo dùng bột khô Natri oxalat để trầm lắng chì trong nước lọc trước khi lọc qua giấy. Phần nước lọc được dùng cho phân tích. Phương pháp định tính: Phản ứng Molisch: Tất cả các hợp chất đường (đơn và đa) đều cho phản ứng tạo màu với nhiều hợp chất phenol, phản ứng giữa chất đường và phenol được gọi là phản ứng Molisch cho ra hợp chất Fufural hay hydroxy methyl fufurol, sản phẩm này sẽ cho ra màu đỏ thẫm khi tác dụng với acid sulfuric đậm đặc. Đây là một trong những phản ứng tạo màu để định tính chất bột đường, nó tác dụng với tất cả đường đơn và đường đa, nhưng không tác dụng với acid amin và carbohydrate acid. Phản ứng Anthrone: Đây là phản ứng dùng định tính và định lượng hợp chất đường, dùng dung dịch 0.2% anthrone trong acid sulfuric đậm đặc. Nếu có chất bột đường dẽ cho ra màu xanh tươi rồi dần dần đậm hơn. Dùng một mẫu trắng hòa trộn mẫu với acid sulfuric đậm đặc để so sánh với mẫu có tác dụng của anthrone, vì các chất hữu cơ khác với acid sulfuric chỉ cho ra màu nâu. Phản ứng với dung dịch Feehling đo lường chất đường khử: Phản ứng này được dùng nhiều trong chế biến thực phẩm để biết lượng đường khử trong sản phẩm. Nhờ đó, nhà sản xuất điều chỉnh các phản ứng khác xảy ra trong chế biến. Nguyên tắc của phương pháp này là dùng hợp chất đường khử để khử ion đồng trong dung dịch alkaline copper tartrate để cho ra màu đỏ đến vàng đậm của oxyde đồng. Phản ứng Barfoed: Phản ứng này dùng để phân biệt đường đơn và đường đôi khử. Mẫu trộn trong dung dịch đồng acetat trong nước và acid acetic, sau đó nung nóng sẽ xuất hiện kết tủa màu đỏ, chứng tỏ mẫu có đường đơn, nhưng nó không cho phản ứng với đường đôi. Chính vì vậy, phản ứng này được dùng với phản ứng Feehling để xác định đường nhị khử trong mẫu. Phương pháp định lượng: Một số phản ứng tạo màu ở trên có thể sử dụng để định lượng những hợp chất đường, chẳng hạn như phương pháp dùng phản ứng Anthrone hay những chất dẫn xuất rồi dùng máy quang phổ để đo lường nồng độ của chất đường trong mẫu. Ngoài những phương pháp đặc biệt, hiện nay người ta đang sử dụng rộng rãi các enzyme và máy sắc ký. Hiện nay phần lớn các phương pháp hóa học để định lượng chất bột đường trong thực phẩm đều dựa trên khả năng khử oxy của chất đường đối với những dung dịch kiềm có chứa những kim loại như bạc, thủy ngân và đồng, trong đó đồng là kim loại được sử dụng nhiều nhất. Sau đây là phương pháp hóa học đại diện cho rất nhiều phương pháp định lượng chất đường trong các phòng nghiên cứu thực phẩm. Phương pháp của Munson và Walker: Đây là phương pháp dựa theo nguyên tắc của dung dịch Feehling để định lượng những chất đường khử bằng cách đo lường trọng lượng của hợp chất oxyde đồng được trầm lắng trong phản ứng rồi từ đó so sánh với một bảng tiêu chuẩn để tính ra trọng lượng của chất đường khử trong mẫu. Mỗi loại đường khử có khả năng khử và cho ra lượng oxyde đồng khác nhau. Đây là phương pháp đo lường bằng trọng lượng. Phương pháp của Dubois: Phương pháp này đơn giản hơn, dùng máy quang phổ ở 490nm cho đường hexose và 480nm cho đường pentose để đo độ hấp thu của màu vàng đỏ của dung dịch sau phản ứng. Mẫu lỏng được cho tác dụng với dung dịch phenol 5% trước khi cho vào hỗn hợp một lượng acid sulfuric đậm đặc 96%, làm ấm và khuấy đều khoảng 10 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng trước khi cho máy quang phổ đo độ hấp thu. Kết quả được tính ra bằng cách so sánh với đường chuẩn cho từng loại đường khác nhau. Phương pháp sắc ký trên giấy: Có rất nhiều cách thức áp dụng cho phương pháp sắc ký trên giấy, chẳng hạn như dùng đĩa sắc ký loại đặc biệt dành cho định lượng để tách rời hợp chất đường được phân ly bởi dung dịch dẫn thấm sau đó đem vào máy quang phổ để so sánh với đường chuẩn và tính ra số lượng đường có trong mẫu. Nhưng phương pháp dùng máy đo mật độ phản hồi màu sắc ở ánh sáng có bước sóng 515nm được coi là dễ dàng, chính xác và nhanh hơn cả. Dung dịch mẫu được trích trên một đĩa sắc ký, cho thấm chạy bởi dung dịch dẫn thấm, chẳng hạn như hỗn hợp butanol – pyridine – nước với tỷ lệ 6: 4: 3. Rồi dùng chất chỉ thị gồm có aniline và trichloroacetic trong ethyl acetat phun lên đĩa sắc ký để xác định màu sắc của mẫu trước khi đưa vào máy đo mật độ phản hồi vật thể màu sắc để đo lường và so sánh với mức chuẩn của từng loại đường để suy ra kết quả. Phương pháp sắc ký bằng gas: Đây là một trong những phương pháp rất thông dụng và được sử dụng gần như ở hầu hết các viện nghiên cứu trên thế giới vì những ưu điểm: rất chính xác và có thể phân tích rất nhiều mẫu vật cùng lúc nhờ hệ thống tự động. Nguyên tắc của phương pháp này là kết hợp chất đường với một chất bay hơi như: O- methyl ete hay O- trimethylsilyl ete trước khi chích vào một cột chứa resin, sau đó với sự giúp đỡ của nhiệt độ và áp suất người ta cho chạy qua một luồng gas như helium để phân ly hợp chất đường trước khi ra khỏi cột, sau đó được thu nhận bằng hệ thống thu nhận và được vẽ những cột trên giấy qua một máy thu nhận. Phương pháp sắc ký khác: Với sự phát triển của máy móc, ngày nay vấn đề chính xác trong phân tích hợp chất đường đã trở nên đơn giản và đạt được mức chính xác nhanh chóng… thỏa mãn hầu hết các nhà nghiên cứu, chẳng hạn như máy sắc ký dùng áp suất cao HPLC. Phương pháp định lượng bằng enzyme: Mặc dù máy sắc ký có nhiều ưu điểm vượt bậc nhưng phương pháp dùng enzyme để đo lường chất bột đường trong thực phẩm cũng như trong y học vẫn được sử dụng rất rộng rãi. Phương pháp này rất tiện dụng cho những phẩm vật đơn lẻ, không có tính đại trà. Có rất nhiều công ty hóa dược phẩm đã sản xuất ra những dung dịch rất tiện lợi và sử dụng dễ dàng dùng cho các phản ứng sinh học xảy ra trong phương pháp phân tích bằng enzyme đã làm cho công việc đo lường trở nên đơn giản và mau chóng. Nguyên tắc là sử dụng enzyme để phá vỡ những liên kết glucoside trong đường đa để phóng thích ra đường đơn, sau đó lại dùng enzyme khác để tạo ra những hợp chất khác rồi dùng máy quang phổ để xác định số lượng của hợp chất đường trong mẫu. Chỉ cần 15 – 20 phút có thể xác định chính xác số lượng những hợp chất đường trong thực phẩm một cách dễ dàng. Xác định giá trị sinh học của protein: Giá trị sinh học của protein là thuật ngữ dùng để đánh giá chất lượng protein. Sự thiếu hụt một số axit amin không thay thế trong khẩu phần hoặc sự mất cân đối về thành phần của các axit amin so với nhu cầu, chẳng những làm rối loạn quá trình tổng hợp protein mà còn dẫn đến phá huỷ quá trình trao đổi chất và tổng hợp enzym, hormon…Tất cả những điều đó là nguyên nhân kìm hãm quá trình sinh trưởng, giảm năng suất và giảm hiệu quả sử dụng thức ăn. Giá trị sinh học của protein không chỉ phụ thuộc vào thành phần các axit amin trong protein, mà còn phụ thuộc vào khả năng tiêu hoá và hấp thu axit amin trong các loại nguyên liệu thức ăn khác nhau. Phân tích protein để biết được: Hàm luợng thành phần protein. Thành phần axit amin. Hàm lượng protein đặc thù trong hỗn hợp. Hàm lượng protein trong quá trình tách và tinh sạch 1 loại protein. Nitơ phi protein. Giá trị dinh dưỡng của protein (sự tiêu hoá, tỉ lệ protein chức năng và sự cân bằng Nitơ). Xác định các chỉ số đánh giá giá trị sinh học protein Chỉ số hóa học (CS-Chemical Score) Tỷ số các axit amin cần thiết trong protein nghiên cứu so với axit amin trong protein chuẩn (thường dùng trứng hay mô hình axit amin mà tổ chức Nông Nghiệp và Lương Thực thế giới (FAO) / Tổ chức Y Tế thế giới (WHO) đưa để làm protein tham khảo). CS = a x 100 b Trong đó: a = hàm lượng axit amin có trong protein nghiên cứu ( mg/g protein) b = hàm lượng axit amin cùng loại trong protein tham khảo ( mg/g protein) Axit amin có chỉ số hoá học thấp nhất sẽ là “yếu tố hạn chế thứ nhất”. Axit amin hạn chế phần nhiều là methionein + cysteine, lysine, tryptophan, threonine nên thường chỉ so sánh 4 loại axit amin này. Đây là phương pháp phân tích đối chiếu các axit amin để tính tỉ lệ tận dụng protein thức ăn, còn gọi là phân loại axit amin. => Việc xác định giá trị dinh dưỡng của protein giúp ta xác đinh được lượng protein đưa vào cơ thể ,từ đó có sự điều chỉnh cho hợp lý Tỉ lệ tiêu hoá protein (TD): Lượng hoặc mức độ protein thức ăn được hấp thụ sau khi đã qua tiêu hóa: tỉ lệ tiêu hoá protein được tính dựa vào việc đo lượng nitơ trong phân và trong thức ăn TD(%) = I-(F-Fm) x 100% I Trong đó: I : Nitơ thức ăn F : Nitơ phân Fm : Nitơ chuyển hoá phân(Nitơ vi sinh vật đường ruột) – được đo trong phân trong trường hợp cơ thể được nạp thức ăn đầy đủ năng lượng nhưng hoàn toàn không hấp thu protein) Nếu bỏ qua Fm thì kết quả có được sẽ gọi là “ tỉ lệ tiêu hoá bề ngoài“, nếu tính cả Fm thì gọi là “tỉ lệ tiêu hoá thực“ hay “tỉ lệ tiêu hoá“. Ví dụ: Tỉ lệ tiêu hoá albumin trong trứng các loại là 98% nghĩa là: khi ăn 100 g protein trong trứng các loại sẽ có 98g được hấp thu vào cơ thể thông qua tiêu hoá , 2g không được tiêu hoá hấp thu, thải ra ngoài theo phân . Lưu ý: Tỉ lệ tiêu hoá của protein động vật thường cao hơn thực vật. Tỉ lệ này phụ thuộc vào 2 yếu tố: cơ thể (trạng thái toàn thân,tinh thần, tình cảm, cảm quan đối với thức ăn, tập quán ăn uống, chức năng tiêu hoá…) và thức ăn (thuộc tính, cách chế biến, thức ăn ăn cùng…). Để xác định lượng nitơ trong các mẫu ta sẽ sử dụng phương pháp Kjeidahl Giá trị sinh học protein (BV-Biological Value): Giá trị sinh học protein hay tỉ lệ tận dụng protein thức ăn: tỉ lệ phần trăm của Nitơ tích trữ chiếm trong lượng Nitơ hấp thu. BV = Lượng Nitơ tích trữ x 100 Lượng Nitơ hấp thu Trong đó: Lượng Nitơ tích trữ = I - ( F - Fm) - ( U - Um) Lượng Nitơ hấp thụ = I - ( F – Fm ) Với I, F, Fm giống như trên U: Nitơ niệu Um: Nitơ có từ trong nước tiểu (Nitơ niệu khi trong bữa ăn không có protein ) BV cao hay thấp phụ thuộc vào sự cấu thành các axitamin của prôtein (về chủng loại , số lượng , tỉ lệ tương hỗ lẫn nhau của các axitamin cần thiết có trong đó). Nếu sự cấu thành các axitamin gần hoặc tiếp cận với loại protein mà cơ thể đòi hỏi thì giá trị sinh học của nó cao,ngược lại sẽ thấp. BV chỉ phản ánh mức độ tận dụng protein sau khi được tiêu hoá hấp thu khi vào cơ thể , còn quá trình tiêu hoá hấp thu protein phải chịu ảnh hưởng của rất nhiều nhân tố .Vì thế ta lại có thêm tỉ lệ tận dụng protein NPU. => Nguyên tắc : Nên dùng động vật làm đối tượng thử nghiệm, lấy protein được tính làm nguồn nitơ duy nhất trong bữa ăn. Bảng: Giá trị sinh học của protein thức ăn thường dùng. Protein Giá trị sinh học Protein Giá trị sinh học Protein trứng gà 94 Đậu nành sống 57 Lòng trắng trứng gà 83 Khoai lang 72 Lòng đỏ trứng gà 96 Khoai tây 67 Sữa bò tách bơ 85 Ngô 60 Cá 83 Đậu nành chín 64 Thịt bò 76 Lạc 59 Thịt lợn 74 Tỉ lệ tận dụng protein (NPU-Net Protein Utilization): Tỉ lệ lượng Nitơ giữ lại so với lượng Nitơ ăn vào hay tỉ lệ protein giữ lại so với protein ăn vào, bao gồm cả giá trị sinh học BV và hệ số tiêu hoá D của protein. NPU = BV. D = Nitơ giữ lại x 100% Nitơ ăn vào NPU gồm cả quá trình tiêu hoá và hấp thu. Hiện nay khẩu phần ăn với protein có NPU xung quanh 70 được khuyến cáo là thích hợp cho phần lớn đối tượng ,tuy nhiên ở trẻ em chất kượng protein đòi hỏi tốt hơn là do trong những tháng đầu protein là từ sữa mẹ , sau đó mới chyển dần sang chế độ ăn bổ sung vì vậy chất lượng proteincũng giảm dần ở những lứa tuổi lớn gần với chế độ ăn của người trưởng thành. Tỉ lệ hiệu quả của protein hay Hệ số tăng trọng (PER: Protein Efficiency Ratio): Phản ánh tỉ lệ hiệu quả mà protein được tận dụng cho sự sinh trưởng của chuột theo những điều kiện quy định ( hay hiểu đơn giản hơn : tỷ số phản ánh số g trọng lượng chuột tăng lên trên số gam protein sử dụng ở chuột đang lớn ). Hệ số tăng trọng càng cao chứng tỏ protein càng tốt PER = Trọng lượng tăng thêm của động vật (g) x 100 Protein đã ăn (g) => PER dùng để đánh giá chất lượng của protein. Phần trăm năng lượng protein được sử dụng (NDp Cals%: Net-Dietary calories percent): Các xét nghiệm trên chỉ đánh giá về chất lượng protein . Để thể hiện về chất và lượng protein trong khẩu phần ăn, ta sẽ xem xét đến NDp Cals % (phần trăm năng lượng protein được sử dụng ) NDp Cal% = ( NPU) . (% năng lượng do protein) Tỉ lệ protein tịnh NPR: Tỉ số giữa nhóm động vật chênh lệch về cân nặng được nuôi lần lượt bằng protein thức ăn thử nghiệm và bằng thức ăn không có protein có năng lượng tương đương với lượng protein ăn vào. NPR = Trọng lượng tăng bình quân (g) + Trọng lượng giảm bình quân (g) Protein ăn vào (g) NPR dùng để tính tỉ lệ tận dụng protein thức ăn . Phương pháp phân tích thành phần acid amin: Axit amin là đơn vị cấu tạo cơ sở của peptit và protein, các axit amin kết hợp với nhau qua liên kết peptit (-CO-NH-) tạo thành peptit có chiều dài mạch khác nhau gọi là polypeptit, một phân tử protein có một hay nhiều chuổi polypeptit. Như vậy thông qua liên kết peptit, các gốc axit amin, nhóm amin tự do đầu N của chuỗi polypeptit ta có những phản ứng đặc trưng để định tính và định lượng protein. Hiện nay có nhiều phương pháp khác nhau để xác định giá trị protein của thức ăn. Một protein thức ăn có giá trị cao khi nó được sử dụng hữu hiệu, nghĩa là protein ấy có một số lượng đúng các axit amin thiết yếu và số lượng đầy đủ các axit amin không thiết yếu. Đã từ lâu việc phân tích định tính và định lượng amino acid thường là sự kết hợp của nhiều phương pháp hoá lí và sắc ký. Có thể dựa vào phổ hấp phụ các amino acid không giống nhau để phân tích. Hoặc dựa và cấu trúc của amino acid tự do sau khi chuỗi polypeptide đã bị thuỷ phân, có thể định lượng amino acid đầu N-tận cùng bằng phản ứng Sanger hoặc Edman. Cũng như vậy, có thể xác định amino acid đầu C tận cùng nhờ phản ứng khử nhóm carboxyl với tác nhân khử NaBH4, hoặc sử dụng enzyme carboxypepitdase.. Sắc ký: Người ta có thể dùng nhiều phương pháp sắc ký khác nhau, ở đây chỉ giới thiệu nguyên tắc của một số phương pháp thông dụng để phân tích amino acid. Sắc ký giấy. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân bố giữa hai pha dung môi: dung môi cố định và dung môi di động. Dung môi cố định thường là nước giữ ở giấy sắc ký (trong điều kiện bảo hoà hơi nước, giấy có thể giữ 15-22% nước tính theo trọng lượng giấy). Dung môi di động thường là một dung môi hữu cơ bão hoà nước di chuyển trên tờ giấy theo mao dẫn kéo theo các chất trong dung dịch. Tốc độ di chuyển của từng chất không giống nhau và mỗi chất được đặc trưng bởi một trị số nhất định gọi là Rf. Có nhiều kiểu sắc ký giấy khác nhau đó là sắc ký một chiều đi lên, sắc ký một chiều đi xuống, sắc ký vòng nằm ngang và sắc ký hai chiều. Loại giấy thường dùng là Whatman số 1 và Schleicher-Schull 2044 a và b, dung môi gồm các chất như 4 Butanol:1 Acetic acid: 5 Nước (dùng cho chiều thư nhất); 3 Phenol: 1 Nước (dùng cho chiều thứ hai). Sắc ký lớp mỏng. Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên lý thuyết của sắc ký giấy, nghĩa là cũng dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha: chất hấp phụ được tráng rộng trên một phiến kính tạo thành một lớp mỏng và pha di động là dung môi thích hợp. Dung môi di chuyển làm dịch chuyển các chất trong mẫu thử. Các chất hấp phụ thường dùng là silicagel, alumin oxyt, sephadex ,v.v...được kết hợp với thạch cao (gypse) để dán vào phiến kính Sắc ký khí. Nguyên tắc của phương pháp này là lợi dụng tính chất khó bay hơi của các amino acid nên có thể sử dụng chương trình nhiệt để chuyển chúng thành các dẫn xuất (thường là N-acetyl-amin). Cho tác dụng amino acid với cồn amylic và HBr khan, sau đó cho tác dụng hỗn hợp này với anhydrit acetic. Cột thường dùng là loại Chromosorb W (60-80 mesh) có một lớp polyetylenglycol 1% (carbowax 1564 hoặc 6000). Chương trình nhiệt giữa 125o C và 155oC, tốc độ chảy 60-240 ml/phút. Phân tích bằng máy tự động Xác định trình tự (sequence) amio acid trong chuỗi polypeptid Máy phân tích amino acid trong chuỗi polypeptide tự động dựa trên nguyên tắc của phương pháp Edman, nghĩa là tách tách lần lượt từng amino acid ở đầu N tận cùng và xác định lần lượt theo thứ tự từng amino acid được tách ra đó, vì vậy có thể xác định chính xác trình tự sắp xếp của các amino acid trong chuỗi. Xác định thành phần amio acid trong chuỗi polypeptide bằng máy sắc ký lỏng cao áp-HPLC (High Liquid Pressor Chromatography ) Trước hết protein hay peptide phải được thuỷ phân băng HCl 6N ở 1100C trong ống hàn kín chứa nitrogen (để tránh sự oxy hoá phá huỷ amino acid) trong thời gian 12-15 giờ. Sau đó trung hoà hỗn hợp dịch thuỷ phân amino acid và cho vào máy phân tích tự động HPLC thành phần amino acid cùng với mẫu chuẩn amino acid. Máy tự động sẽ cho biết hàm lượng (tỷ lệ %) của từng amino acid dựa theo các đỉnh (peak) của amino acid chuẩn. cần nhớ mấy HPLC chỉ cho biết thành phần (composition) của từng amion acid chư không cho biết trình tự các amino acid Điện di Dựa vào tính chất tích điện của các amino acid trong môi trường có pH nhất định, mà có thể phân tích amino acid bằng kỹ thuật điện di. Dưới tác dụng của điện trường các amino acid tích điện dương (+) sẽ chạy về phía cực (-), các amino acid tích điện âm sẽ chay về cực (+). Do khả năng tích điện không giống nhau giữa các amino acid vì vậy chúng di chuyển không giống nhau trong điện trường. Kết qủa các amino acid phân bố trãi ra trên giá thể (giấy hoạc tấm polyamide). Phân tích bằng quang phổ khối Quang phổ khối (MS- mass spectrophotometer) là một công cụ phân tích với độ chính xác cao. Nguyên tắc của phương pháp này là: Dùng một chùm electron bắn vào một lượng chất thử rất nhỏ, các phân tử chất thử trước hết được phá thành nhiều mảnh ion mang điện dương trong điều kiện chân không. Các mảnh ion nhờ một bộ phân phát hiện và ghi thành pic với cường độ khác nhau tương ứng với khối lượng của mỗi ion - đó là khối phổ. Hình 1 Có nhiều loại máy quang phổ khối với mức độ phân giải khác nhau, máy có độ phân giải cao là máy có khả năng tách được hai mảnh ion có khối lượng chỉ chênh nhau phần trăm đơn vị khối. Phương pháp đồng vị Phương pháp đồng vị có thể sử dụng để xác định một hoặc vài amino acid trong hỗn hợp có nhiều loại amino acid khác nhau, hay một amino acid cần được xác định trong nhiều mẫu của một loạt thí nghiệm. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào hoạt tính phóng xạ của amino acid cùng một loại đã đánh dấu để xác định ví trí và số lượng của amino acid đó trong chuỗi polypeptide. Ngoài ra người ta có thể dùng phương pháp này để nghiên cứu tính đặc hiệu của các amino-acyl-tRNAsynthetase và tRNA Phương pháp enzyme Có thể xác định amino acid bằng phương pháp enzyme dựa trênnguyên tắc mỗi một loại enzyme có khả năng phân giải đặc hiệu một loại L-amino acid nhất định. Xác định sản phẩm tạo thành sau phản ứng với enzyme tương ứng có thể biết được amino acid trong hỗn hợp. Phương pháp vi sinh vật Một số vi khuẩn sinh trưởng trong một điều kiện thích hợp, chúng rất nhạy cảm với pH để sản xuất ra các enzyme L-amino aciddecarboxylase đặc hiệu với từng loại amino acid và hoạt động của chúng giải phóng CO2 trong môi trường. Xác định nồng độ CO2 bằng áp kế Warburg để suy ra thành phần của amino acid. Phần lớn trường hợp điều kiện pH thích hợp thường nằm trong vùng acid, ví dụ: ở pH 4,5 tạo ra L-glutamate 1-carboxy-lyase; EC 4.1.1.15 xúc tác chuyển hoá L-glutamic thành γ-amino butyric; ở pH 5,5 tạo ra L-tyosinecarboxy-lyase, EC 4.1.1.25 xúc tác chuyển hoá L-tyrosine thành Tyramine v.v... Xác định giá trị sinh học của lipid: Ta xác định giá trị sinh học của lipid bằng cách xác định thành phần acid béo không no, không thay thế trong thành phần thực phẩm có chứa lipid. Quan trọng nhất là xác định DHA Nguyên liệu Trích ly bằng dung môi chiết lỏng siêu tới hạn tổng chất chiết Chiết phân đọan lipid Phân đoạn lipid Phân tích trực tiếp TLC-FID FAB-MS HPLC- MS HPLC Phân tích và phân tách bằng dung môi CC SF TLC Chú thích : TLC (Thin-Layer Chromatography) sắc kí lớp mỏng FID (Flame Ionization Detection) sắc kí khí đầu dò ion hoá ngọn lửa FAB (Fast Atom Bombardment) : bắn phá nguyên tử MS (Mass Spectrometry) : khối phổ HPLC ( High-Perfomance Liquid Chromatograph) sắc kí lỏng cao áp CC (Column Chromatograph) : sắc kí cột SF (Solvent Fractional) : trích ly phân đoạn LIPID Ít phân cực Rất phâncực DUNG MÔI Hydrocacbons Wax ester Aldehydes Triacylglycerol Fatty alconhols Fatty acids Sterol Dyacylglycerols Monoacylglycerol Phospholipids Hexane Cyclohexan Dyethyleter Chloroform Acetone Acetonitrile Etanol metanol Phân tích DHA: Giới thiệu về acid docosahexaenoic (DHA) Acid docosahexaenoic (DHA) là một acid béo bất bão hòa đa thuộc nhóm Ω-3. DHA chứa 22 nguyên tử carbon và 6 nối đôi, có công thức tổng quát là : CH3(CH2-CH=CH)6(CH2)2COOH Trọng lượng phân tử của DHA là 328,6 và điểm nóng chảy là -440C. DHA còn được kí hiệu là 22:6n-3 và trong tự nhiên có dạng acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic. 2 3 Phương pháp ly trích, cô lập và tinh sạch DHA: Phương pháp tách phân đoạn bằng li tâm phân tử (molecular centrifugal) Acid béo của dầu cá mòi (10% DHA) được phân chia thành những phân đoạn bằng ly tâm phân tử cho đến khi được những phân đoạn chứa 5, 11, 20, 21 và 30%. Phân đoạn cuối cùng được khuấy với urê trong MeOH ở 450C, làm lạnh trong 18 giờ ở 160C, lọc, nước lọc cho tiếp xúc với nhiều urê hơn, làm lạnh ở 130C qua đêm, lọc, nước lọc được cô đặc và tái xử lý với urê. Nước lọc cuối cùng được rót vào nước, dung dịch nước này được trích ly với ether, , làm khan dung dịch eter với Na2SO4 và dung môi được loại bỏ. Sản phẩm bây giờ chứa 88% DHA, và được làm tinh khiết hơn bằng cách chuyển thành methyl ester, đi qua silica gel, giải li bằng dung môi ether dầu hỏa, và loại bỏ những tạp chất còn dư bởi sự chưng cất phân tử. Phương pháp CO2 siêu tới hạn (supercritical carbon dioxide) CO2 siêu tới hạn (SC-CO2) là một chất thích hợp để trích ly các chất không phân cực (triacylglycerol). Hiệu quả trong việc sử dụng SC-CO2 và hỗn hợp ethanol để trích ly và phân đoạn các phospholipid từ trứng cá hồi đã được khảo sát. Sự trích ly được thực hiện ở nhiệt độ 330C và áp suất thấp 17,7MPa để tránh sự oxide hóa các acid béo bất bão hòa đa. Các phospholipid đươc trích ly hiệu quả với 10, 15 hay 20% ethanol trong SC-CO2. Lượng phospholipid được trích ly tăng cùng với sự bổ sung ethanol (với hỗn hợp 20% ethanol, có 80% các phospholipid được thu nhận). Phương pháp trích bằng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid extraction – SFE) Các acid béo được trích ly bằng cách sử dụng “máy trích CO2 lỏng siêu tới hạn” (Supercritical Fluid CO2 Extraction Machine). 3 mức áp suất khác nhau (200, 240 và 280 bar), 3 mức nhiệt độ khác nhau (35, 40 và 450C) và 5 khoảng thời gian khác nhau (60, 120, 180, 240 và 300 phút) được chọn. Điều kiện lý tưởng nhất cho sự trích ly acid béo bất bão hòa đa được xác định là áp suất 280 bar ở nhiệt độ 400C và 300 phút. Phương pháp sắc ký cột CC (Column Chromatography) Các acid béo bất bão hòa (C ≥ 16) và những dẫn xuất của chúng được tách bởi sắc ký cột sử dụng CO2 siêu tới hạn hoặc CO2 lỏng như là pha động và oxit nhôm đã xử lý với kiềm như là pha tĩnh. Phosphate kim loại cũng được sử dụng như là tác nhân tách chiết các acid béo bất bão hòa và các chất tương đồng của chúng. Các tác nhân tách chiết bao gồm các muối phosphoric acid với Ag (và các kim loại khác). Hỗn hợp chứa ethyl eicosapentaenoate và ethyl docosahexaenoate được: Đưa lên sắc ký cột silica gel phủ Ag phosphate Cột được giải li với hỗn hợp n-hexane và n-hexane-isopropanol để thu nhận lượng ester. Phương pháp sắc ký cột ion bạc cũng được dùng để thay thế cho việc trích pha rắn để tách các acid béo methyl ester. Cột trích pha rắn loại Bond Elut SCX (0.5g propylbenzene sulphonic acid) được cân bằng bởi 5ml NaOH 1M, 10ml nước, 5ml HCl 4M, nước cho đến khi đạt pH trung tính và tiếp tục với acetonitrile-nước (10:1). Cột được bọc lại trong cuộn nhôm để tránh ánh sáng.Cột được chuyển sang dạng ion bạc bằng cách cho ngấm kiệt từ từ 1ml dung dịch AgNO3 (40mg AgNO3 trong 1ml acetonitrile-nước 10:1). Sau đó cột được giải ly lần lượt với 5ml acetonitrile, 5ml acetone và 10ml dichloromethane, 0,1ml dichloromethane chứa không quá 1mg acid béo methyl ester. Các (hệ) dung môi dùng để giải ly có độ phân cực tăng dần (từ dichloromethane đến acetone-acetonitrile) theo số liên kết đôi của acid béo (từ acid béo bão hòa đến acid béo 6 nối đôi). Sự giải ly tiến hành ở áp suất khí quyển (vận tốc dòng chảy 0,5ml/phút). Phương pháp bạc nitrate (silver nitrate method) DHA và các dẫn xuất của nó được cô lập từ hỗn hợp các acid béo bất bão hòa đa từ nguồn tự nhiên bằng phương pháp bạc nitrate. Phương pháp bao gồm sự tính toán lượng bạc nitrate cần để tạo phức với các acid bất bão hòa đa dựa trên số mol nối đôi có trong acid béo bất bão hòa. DHA được tách chiết và tinh sạch từ dầu cá ngừ bằng phương pháp tách chiết nhiệt độ thấp kết hợp với phương pháp kết tinh sắc ký cột Ag+/silica gel hoặc phương pháp riêng lẻ với sắc kí cột Ag+/silica gel. Dung môi giải ly cột là hỗn hợp của aceton (hoặc diethyl ether)-hexane. Một phương pháp khác được sử dụng để tinh sạch hỗn hợp các acid béo methyl ester từ dầu cá hoặc dầu thực vật là phương pháp sắc ký lớp mỏng ion bạc. Các bản mỏng silica gel được nhúng trong 1 phút vào dung dịch bạc nitrate 4% trong methanol-nước (9:1). Sau đó bản mỏng được sấy khô 2 phút dưới ánh sáng mờ trong tủ sấy thông gió và tiếp tục trong 20 phút ở 1000C. Chúng được giữ trong 1 hộp được đậy kín ở trong tối. Dung môi giải ly có thể là hexane-diethyl ether (9:1) để tách các acid béo bão hòa, acid béo có 1 nối đôi và acid béo có 2 nối đôi, hoặc là toluen-ethyl acetate (9:1) để tách tất cả các loại acid béo theo độ bất bão hòa. Tỷ lệ dung môi có thể thay đổi 1 ít theo điều kiện thí nghiệm (loại bản mỏng, độ ẩm, nhiệt độ, hình dạng của bình giải ly …) để nâng cao hiệu quả của việc phân tách. Việc thêm 1% acid acetic theo thể tích vào pha động cho phép các vết acid béo đạt độ phân giải tốt. Bảng mỏng được sấy trong tủ sấy thông gió, nhúng vào dung dịch nước đã bão hòa sodium thiosulphate trong 1 phút và rửa dưới dòng nước chảy trong 1 phút. Sau đó tiếp tục sấy khô và phun xịt với primuline để phát hiện các vết acid béo phát huỳnh quang dưới đèn UV. Phương pháp nhận danh DHA: Phương pháp sắc ký khí (gas chromatography – GC), sắc ký khí ghép khối phổ (gaschromatography/mass spectrometry – GC/MS) và sắc ký khí mao dẫn (capillary gas chromatography). Các acid béo tự do và acid béo trong triglyceride trong dầu cá biển sâu được biến đổi thành acid béo methyl ester bằng cách sử dụng tetramethylammonium hydroxide methanoal (N(CH3)4OH-CH3OH). Sau đó, các acid béo methyl ester này được phân tích bằng GC và GC/MS. Kỹ thuật sắc ký khí mao dẫn được áp dụng trong việc định danh các acid béo bão hòa chuỗi dài và acid béo bất bão hòa trong lòng đỏ trứng và gan gà. Mẫu trước tiên được làm đồng nhất và trích ly bằng cách sử dụng chloroform-methanol (CHCl3-MeOH) hay methylene chloride-methanol (CH2Cl2-MeOH) 2:1, những acid béo trong chất trích được methyl hóa với KOH-MeOH. Acid béo methyl ester được phân tích bằng sắc ký khí mao dẫn. Các Ω-3 LC PUFAs có hoạt tính sinh học dễ bị oxde hóa như EPA, DPA (docosapentaenoic acid, 22:5n-3) và DHA có thể được xác định bởi phương pháp này. Phương pháp ái lực pha rắn với ion bạc và sắc ký lớp mỏng có chỉnh đổi (affinity solidphasepurification with argentous ions and modified thin layer chromatography) Đây là phương pháp đơn giản để nhận danh DHA trong sữa bò. Phương pháp bao gồm ba bước : (1) sự methyl hóa DHA một lần trong sữa bò mà không cần phải loại béo trước (2) sự cô đặc methyl ester bằng sắc ký cột silica gel có chỉnh đổi với AgNO3 (3) sự phát hiện DHA methyl ester bằng cách sử dụng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao-tập trung vết (spot focusing-high performance thin layer chromatography). DHA được methyl hóa trực tiếp trong sữa bò và được cô đặc một cách có chọn lọc nhờ vào ái lực của nó với các ion bạc. Phương pháp này không cần sự trích ly lipid tốn hao lượng lớn dung môi hữu cơ và không cần hệ thống sắc ký khí. Phương pháp phổ hồng ngoại chuyển dạng Fourier (Fourier transform infrared spectroscopy – FT-IR) Những co giãn của nối =C-H alkene của các acid béo bất bão hòa trong dầu sẽ hấp thu ở bước sóng 3010cm-1 với những cướng độ khác nhau. Nguyên tắc hoạt động của phương pháp này : nguồn sáng phát ra một chùm bức xạ đến gương cầu lõm, tại gương cầu lõm sẽ cho chùm tia phản xạ song song đập vào gương phẳng. Ánh sáng phản xạ từ gương phẳng sẽ đi vào giao thoa kế michelson rồi đi qua mẫu đến detector. Tín hiệu quang sau đó sẽ được biến đổi thành tín hiệu điện, qua bộ khuếch đại rồi và bộ máy tính lắp ghép với máy phổ. Máy tính sẽ xử lý tín hiệu và in ra phổ. Sự đo bằng FT-IR trên thực tế có thể dự đoán được thành phần của mỗi loại PUFA trong mẫu dầu được kiểm tra. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography – HPLC) hay còn gọi là sắc ký lỏng cao áp (high pressure liquid chromatography) Phương pháp HPLC thuộc loại sắc ký cột có pha động là chất lỏng. Khác với các loại sắc ký lỏng khác, hiệu quả phân tích của HPLC rất cao là do vật liệu nhồi cột có kích thước hạt rất bé (5-10 μm) và độ đồng nhất cao cùng với việc sử dụng nhiều đầu dò khác nhau. HPLC tỏ ra ưu việt hơn so với sắc ký khí khi phân tích thành phần của dầu cá do dầu cá không cần phải methyl ester hóa trước khi phân tích. Dầu cá khi phân tích sẽ được hòa tan vào dung môi thích hợp và được phân tích ở nhiệt độ phòng. Trong sắc ký phân bố, thông thường người ta sử dụng pha tĩnh phân cực hơn so với pha động và gọi là sắc ký thuận (normal phase). Nhưng trong kỹ thuật HPLC ngược lại người ta thường dùng pha tĩnh kém phân cực hơn và gọi đó là sắc ký pha đảo (inversed phase) (RP-HPLC). Dung môi sử dụng ở phương pháp này là dung môi phân cực, thường ít độc hại, rẻ tiền và không gây ô nhiễm môi trường (thường dùng nước có bổ sung methanol, ethanol hoặc acetonitrile). Sử dụng phương pháp tủa urê (urea complexation) để loại bỏ các acid béo bão hòa Theo những nghiên cứu gần đây, mỡ cá có vai trò rất quan trọng đối với con người bởi vì nó có chứa nhiều PUFA (polyunsaturated fatty acid – acid béo bất bão hòa đa), đặc biệt là DHA và EPA (acid eiscosapentaenoic). Tuy nhiên, lượng DHA và EPA này (đặc biệt là DHA) chiếm tỷ lệ rất thấp trong mỡ cá. Do đó đã có nhiều nghiên cứu về cách làm giàu PUFA trong mỡ cá để đưa vào sử dụng. Các PUFA có thể được làm giàu lên bằng nhiều phương pháp khác nhau như tạo tinh thể ở nhiệt độ thấp, tủa urê, lọc phân tử, tạo kết tủa với ion bạc hoặc bằng cách sử dụng lipase. Tuy nhiên, phương pháp đơn giản và hiệu quả nhất để thu nhận những PUFA được làm giàu dưới dạng những acid béo tự do từ mỡ cá là phương pháp tủa urê. Đây là một phương pháp sử dụng urê để tạo tủa với các acid béo bão hòa, loại bỏ bớt các acid này ra khỏi hỗn hợp acid acid béo ban đầu. Phương pháp này dựa trên hiện tượng urê sẽ tạo thành tinh thể (kết tủa) ở nhiệt độ thấp và các acid béo bão hòa sẽ liên kết với những tinh thể urê. Bằng cách loại bỏ những kết tủa này có thể loại bỏ được những acid béo bão hòa trong hỗn hợp. Phương pháp này đã được áp dụng trên dầu gan cá tuyết và kết quả thu được là rất khả quan, hàm lượng DHA và EPA trong hỗn hợp tăng lên đến 60-85% . Cách tiến hành: Mỡ cá đem đi thủy giải để thu được những acid béo tự do. Acid béo tự do thu được sau đó sẽ được trộn lẫn với urê (10%, w/v) trong ethanol 95%. Hỗn hợp này được đun nóng kết hợp với khuấy kĩ ở 60 – 700C đến khi thành một dung dịch đồng nhất. Tỷ lệ của urê với lượng acid béo tự do theo nghiên cứu tốt nhất là 1 : 15 theo số mol. Dung dịch này sau đó được cho vào tủ đông -50C trong 22 giờ. Loại bỏ kết tủa tạo thành bằng phương pháp lọc. Nước lọc sau đó được pha loãng với một lượng nước cất và được acid hóa bởi acid H2SO4 6M sao cho pH= 2-3. Thêm vào dung dịch nước lọc một lượng hexan (hoặc ether dầu hỏa) và lắc kỹ. Dung dịch nước lọc sau đó sẽ tách làm hai lớp : lớp nước chứa urê nằm phía dưới và lớp hexan (ether dầu hỏa) chứa acid béo nằm phía trên. Thu lấy lớp hexan (ether dầu hỏa), làm khan nước, đem cô quay đuổi dung môi thu được acid béo tự do chứa chủ yếu là các acid béo bất bão hòa. Phương pháp sắc ký ghép khối phổ (gas chromatograph /mass spectrometry – GC/MS) Nguyên tắc hoạt động: Vào những năm đầu của thập kỷ 70, kỹ thuật liên hợp giữa hệ thống sắc ký khí và phổ khối lượng được ra đời. Trong trường hợp này các cấu tử sau khi tách khỏi cột sắc ký sẽ lần lượt được đưa vào buồng ion hóa của máy khối phổ. Tại đó chúng được phân mảnh và tách theo khối lượng nhờ một từ trường rồi đi vào bộ nhân quang để chuyển hóa thành tín hiệu điện ứng với mỗi peak trên sắc ký đồ mà ta sẽ nhận được một khối phổ riêng biệt và hoàn chỉnh. Sơ đồ thiết bị GC/MS: 4 So sánh giữa phương pháp sắc ký và phương pháp khối phổ thấy có những đặc tính chung sau : Mẫu được nghiên cứu trong trạng thái khí. Cả hai phương pháp đều có độ nhạy cao. Tốc độ phân tích của cả hai phương pháp tương tự nhau. Sự khác biệt duy nhất giữa hai phương pháp này là trong cột sắc ký luôn tồn tại một áp suất lớn hơn áp suất môi trường, trong khi đó buồng ion của máy khối phổ lại hoạt động ở một chân không cao (khoảng 10-6mmHg). Để có thể ghép nối giữa cột sắc ký và buồng ion, giữa hai thiết bị này có một bộ phận dùng để táchkhí mang (thường là helium) trước khi vào buồng ion hóa. Nhờ đó mà độ chân không của nguồn ion không bịảnh hưởng. Toàn bộ hệ thống GC/MS được nối với máy tính để điều khiển tự động, xử lý số liệu, lưu trữ và ghi phổ. Phổ MS ghi được sẽ được so sánh với các phổ MS chuẩn chứa trong thư viện máy tính, nhờ đó mà xácđịnh được các chất có trong mẫu. Thư viện phổ cần phải có nhiều phổ chuẩn để tăng độ chính xác cho sựdò tìm và so sánh. Những ưu điểm của phương pháp GC/MS : Lượng mẫu cần phân tích nhỏ. Nghiên cứu được các hợp chất không bền. Tiến hành tốt việc tách và nhận biết đồng thời hỗn hợp nhiều cấu tử. Nhược điểm của phương pháp này là không phân tách được các chất có trọng lượng phân tử cao, có nhiệt độ bay hơi cao. Vì acid béo khó bay hơi nên thường phải được ester hóa để trở thành dạng methyl hoặc ethyl ester là dạng dễ bay hơi để có thể phân tích bằng sắc ký khí ghép khối phổ. Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography – TLC) Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatogaphy), là kỹ thuật phân bố rắn - lỏng, trong đó pha động là chất lỏng được cho đi ngang qua một lớp chất hấp thu trơ (ví dụ như : silica gel hoặc oxid alumin) chất hấp thu này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu này được tráng thành một lớp mỏng nên được phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng. Trong phần tích lipid, loại bản mỏng được sử dụng là bản nhôm tráng silica gel có trộn thêm chất phát huỳnh quang (Merck). Muốn thực hiện việc sắc ký, người ta cho mẫu cần phân tích (có thể chứa nhiều hợp chất khác nhau) hòa tan vào một dung môi dễ bay hơi, dùng vi quản để chấm một ít dung dịch mẫu chất này thành một vết nhỏ gọn lên tấm lớp mỏng nói trên, vết chấm ở vị trí cách cạnh đáy 1 – 1,5cm. Sấy nhẹ để đuổi bay đi phần dung môi hòa tan mẫu, như thế mẫu chất chỉ còn là dạng bột khô ở trên tấm lớp mỏng. Đặt tấm lớp mỏng này theo chiều thẳng đứng vào trong một bình có chứa sẵn dung môi phù hợp (chiều dày của lớp dung môi trong bình không quá 1cm). Trước khi đặt bản vào bình, bình được bão hòa dung môi để có một bầu khí quyển đồng nhất bằng cách phủ bề mặt trong của bình bằng một tờ giấy lọc có tẩm ướt dung môi dùng để giải ly. Dung môi sẽ bị lực mao quản hút di chuyển lên cao trong tấm bảng, quá trình như thế sẽ phân chia hỗn hợp mẫu chất ban đầu thành những vết riêng biệt . Khi dung môi lên gần hết tấm bảng (còn cách khoảng 0,5cm), lấy bảng ra khỏi bình và sấy khô bảng. Các vết mẫu sẽ được xác định bằng phương pháp vật lý (nhìn trực tiếp bằng mắt thường, soi tấm bảng bằng đèn phát huỳnh quang…) hoặc bằng phương pháp hóa học (phun xịt lên tấm bảng bởi một loại dung dịch thuốc thử phù hợp). Ở đây, chúng tôi đã sử dụng phương pháp hóa học với thuốc thử là dung dịch H2SO4 đậm đặc để xác định vết mẫu. Bản mỏng sau đó được lưu trữ trong bao plastic hoặc chụp hình và scan lại cho việc nghiên cứu về sau. Một hợp chất tinh khiết sau khi sắc ký lớp mỏng sẽ cho một vết, với giá trị Rf không đổi, trong một hệ dung môi xác định, bởi bảng sắc ký của một lô sản xuất nhất định. Rf được tính theo công thức sau : Rf = (khoảng đường di chuyển của hợp chất)/ (khoảng đường di chuyển của dung môi) Giá trị Rf không bao giờ > 1 và thay đổi tùy theo : loại chất hấp thu dùng để tráng bảng mỏng, bảng mỏng tráng sẵn dù của cùng một hãng sản xuất cũng khác nhau từ lô này đến lô kia, hoạt độ của bảng lúc sử dụng, việc tồn trữ bảng , độ dày của bảng, thành phần của dung môi giải ly (chỉ cần thay đổi một ít cũng làm ảnh hưởng kết quả), độ bão hòa của dung môi trong bình giải ly của 2 lần giải ly khác nhau cũng khác nhau, kỹ thuật giải ly (dung môi đi lên hay đi xuống cũng cho kết quả khác nhau). Dung môi giải ly phù hợp là dung môi có thể là cho hỗn hợp các chất ban đầu tách thành nhiều vết khác nhau, các vết này sắc nét, rõ ràng và có vị trí nằm trong khoảng từ 1/3 đến 2/3 chiều dài bản sắc ký (các vết chính có Rf khoảng từ 0,3 đến 0,7) Sắc ký lớp mỏng có các ưu điểm sau : Mẫu để phân tích chỉ cần một lượng rất ít. Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng một điều kiện phân tích. Việc triển khai sắc ký nhanh nên trong một thời gian ngắn có thể biết kết quả mẫu cần phân tích. Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng. Sau quá trình giải ly, dung môi sẽ được loại bỏ khỏi tấm bảng mỏng trước khi dùng kỹ thuật vật lý hoặc hóa học để phát hiện sự hiện diện chất nên không phải lo đến vấn đề hậu sắc ký như ở sắc ký lỏng cao áp (HPLC). XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ NHIỆT LƯỢNG CỦA THỰC PHẨM: Trong quá trình sống của mình, cơ thể con người luôn phải thay cũ đổi mới và thực hiện các phản ứng sinh hóa, tổng hợp xây dựng các tế bào, tổ chức mới đòi hỏi cung cấp năng lượng. Nguồn năng lượng đó là từ thức ăn dưới dạng protein, lipit, gluxit. Các nhà khoa học đã xác định và thể hiện đơn vị năng lượng bằng đơn VỊ KILOCALO ( VIẾT TẮT LÀ KCAL ). ĐÓ là nhiệt lượng cần thiết để đưa 1 lít nước từ 150C. Ngày nay còn một đơn vị năng lượng được dùng là Jun, đơn vị này dựa và cách tính cơ năng, 1 Jun được tính là lực 1(N) chuyển một vật có trọng lượng 1 kg dời một khoảng cách 1m. 1 Kcal = 4,184 Kilojun. Ðể xác định năng lượng cung cấp từ thức ăn người ta sử dụng Bom calori Quá trình phản ứng sinh nhiệt từ thức ăn trong Bom calori được biểu diễn dưới cơ chế phản ứng sau: Gluxit, protein, lipit + O2 à Nhiệt năng + H2O + CO2 Quá trình này cũng tương tự trong cơ thể người, quá trình đó khá giống ở cơ và gan. Trong cơ thể người năng lượng tạo ra từ cùng một lượng thức ĂN SO VỚI Ở BOM CALORI THÌ thấp hơn. Do trong cơ thể một lượng thức ăn không được tiêu hóa hấp thu hết thải ra theo phân, lý do thứ hai là trong cơ thể một số chất không được đốt cháy hoàn toàn và thải ra theo nước tiểu như protein, urê, axit uric... Giá trị sinh nhiệt của các chất Chất (g) Năng lượng sinh ra Ở Bom calori Ở CƠ THỂ Protein Kcalo Kcalo KJ 5.65 4 17 Carbohydrate 4.1 4 17 Lipit 9.45 9 38 Rượu 7.1 7 29 Xác định năng lượng tiêu hao của cơ thể có hai phương pháp trực tiếp và gián tiếp: Phương pháp trực tiếp tương tự cách xác định năng lượng của thực PHẨM Ở BOM CALORI. Ở phương pháp này năng lượng tiêu hao tương đương với năng lượng làm nhiệt độ nước tăng lên, thường nhiệt lượng đo được ở CÁCH HỢP VỚI VIỆC ÐO lượng O2 sứ dụng và CO2 sinh ra trong quá trình hoạt động của cơ thể ở NHÀ ÐO NHIỆT VÀ DỰA vào thương số hô hấp phụ thuộc vào chất được đốt cháy NẾU GLUXIT ÐƯỢC ÐỐT CHÁY RQ = 1,0 , LIPIT RQ - 0,71, protein được đốt cháy thì RQ = 0,81.(RESPIRATORY quotient - RQ) Thường chế độ ăn nói chung là hỗn hợp của cả 3 chất do đố thương số hô hấp thường tính trung bình: 0,8-0,85. Phương pháp gián tiếp xác định tiêu hao năng lượng qua lượng oxy cơ thể sử dụng. Từ đó tính năng lượng được sinh ra liên quan với 1 lít oxy sử dụng là 4,82 Kcal.