Đề tài Phân lập vi khuẩn lactobacillus thuần từ tự nhiên để sản xuất măng tre lên men chua

TRƯỜNG ðẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TNTN PHÒNG THÍ NGHIỆM ________________ ðỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG PHÂN LẬP VI KHUẨN Lactobacillus THUẦN TỪ TỰ NHIÊN ðỂ SẢN XUẤT MĂNG TRE LÊN MEN CHUA Chủ nhiệm ñề tài: Ths. NGUYỄN VĂN CHƯƠNG Long Xuyên, tháng 12 năm 2008 i TÓM LƯỢC Lactobacillus là một trong những giống quan trọng nhất của vi khuẩn axit lactic và ñược dùng trong sản xuất các sản phẩm lên men chua trong thực phẩm, trong sản xuất chế phẩm sinh học cho vật nuôi. Chúng cư ngụ trong ñường ruột và bảo vệ cơ thể các vi sinh vật gây bệnh. Mục tiêu chính của nghiên cứu là phân lập và chọn dòng vi khuẩn axit lactic thuần chủng cho hiệu suất lên men cao từ môi trường nước măng chua Nhằm tìm ra quy trình chế biến măng phù hợp với việc bổ sung chủng vi khuẩn lactic thuần vừa phân lập và tìm ra biện pháp bảo quản phù hợp với sản phẩm này, nghiên cứu ñược tiến hành qua các thí nghiệm sau: Bước 1 :Phân lập vi khuẩn axit lactic từ nước măng chua trên môi trường agarose MRS. Khảo sát các dòng vi khuẩn ñã phân lập ñược trên ñường lactose 4% ñể chọn dòng tối ưu nhất Khảo sát các dòng vi khuẩn ñã chọn trên các lọai ñường như ñường saccharose 4%, lactose 4%, glucose 4%, fructose 4%, thốt lốt 4%. Bước 2: Khảo sát ảnh hưởng của cách xử lý nguyên liệu, liều lượng LAB thuần sử dụng tối ưu, công thức phối chế gia vị , ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến khả năng lên men lactic. Bước 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thanh trùng và ñiều kiện bảo quản tối ưu. Kết quả thí nghiệm cho thấy: -Dòng LX1 là dòng LAB tối ưu nhất, có khả năng sinh axit tổng số cao nhất là 3.89% và thời gian ngắn nhất sau 4 ngày lên men trên môi trường ñường lactose 4%. -ðường thích hợp cho dòng LX1 là saccarose 4% dùng bổ sung cho quá trình lên men -Luộc măng ở 100oC trong thời gian 20 phút, cho sản phẩm sau khi luộc có màu sắc và ñộ giòn tốt nhất, hàm lượng xianua giảm thấp nhất. -Với công thức phối chế tối ưu : 0,1 % vi khuẩn + 3 % ñường + 2 % muối ở nhiệt ñộ lên men 25oC cho sản phẩm tốt nhất về cảm quan và thời gian lên men ngắn nhất. Nhiệt ñộ lên men là 37oC trong thời gian là 4 ngày là tối ưu nhất -Tỷ lệ 14 % ñường: 2 % muối: 1 % nước chua trong dịch phối chế tạo sản phẩm sau ñiều vị có mùi vị tốt nhất. -Với thời gian thanh trùng là 10 phút ở 75oC giúp sản phẩm bảo quản ñược trong 4 tuần ở nhiệt ñộ thấp 5 – 10oC). - Bảo quản ở nhiệt ñộ phòng ( 5 -10oC) có chất bảo quản là kali sorbat 0.1% là tốt nhất. ii MỤC LỤC TÓM LƯỢC.................................................................................................................................. i MỤC LỤC................................................................................................................................... iii DANH SÁCH BẢNG ...............................................................................................................viii DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................................. ix CHƯƠNG I :GIỚI THIỆU CHUNG .......................................................................................... .1 1.Giới thiệu ............................................................................................................................ 1 2. Vấn ñề nghiên cứu ............................................................................................................ .1 3. Mục tiêu nghiên cứu.......................................................................................................... .1 CHƯƠNG II:LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ..................................................................................... .2 1. Giới thiệu nguyên liệu....................................................................................................... .2 2. Cơ sở của quá trình lên men lactic ..................................................................................... 4 2.1. ðịnh nghĩa quá trình lên men lactic ............................................................................. 4 2.2. axit lactic ..................................................................................................................... 4 2.3. Vi khuẩn lactic ............................................................................................................. 4 2.3.1. ðặc ñiểm chung .................................................................................................. 5 2.3.2. Phân loại............................................................................................................. .5 2.4. Nấm men ..................................................................................................................... .6 2.5. Nấm mốc ..................................................................................................................... .6 2.6. Cơ chế của quá trình lên men lactic ............................................................................. 7 2.7. ðiều kiện của quá trình lên men lactic......................................................................... 7 2.7.1. Các cấu tử môi trường......................................................................................... 7 2.7.2. Các nhân tố bên ngoài ......................................................................................... 7 3. Cơ sở lý thuyết của quá trình muối chua rau quả.............................................................. .8 4.Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình muối chua rau quả.................................................... .9 4.1.Hàm lượng ñường ......................................................................................................... 9 4.2. ðộ axit và ñiều kiện không khí .................................................................................... 9 4.3. Nhiệt ñộ........................................................................................................................ 9 iii 4.4. Nồng ñộ muối............................................................................................................... 9 4.5. pH của môi trường ..................................................................................................... 10 5. Một số hiện tượng xảy ra trong quá trình muối chua..................................................... .10 5.1.Biến màu ..................................................................................................................... 10 5.2.Tăng ñộ nhớt ............................................................................................................... 10 5.3. Nổi váng trắng........................................................................................................... .10 5.4. Thay ñổi cấu trúc....................................................................................................... .10 5.5. Thay ñổi thành phần dinh dưỡng .............................................................................. .11 6. Các phương pháp bảo quản rau quả muối chua .............................................................. .11 6.1. Bảo quản ở nhiệt ñộ thường ...................................................................................... .11 6.2. Bảo quản bằng cách thanh trùng ............................................................................... .11 6.3. Bảo quản bằng hóa chất ............................................................................................ .11 6.4. Bảo quản lạnh............................................................................................................ .11 6.5. Bảo quản bằng phương pháp kết hợp........................................................................ .11 CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. .12 1. Phương tiện ..................................................................................................................... .12 1.1. ðịa ñiểm nghiên cứu ................................................................................................. .12 1.2. Thời gian thực hiện ................................................................................................... .12 1.3. Thiết bị và dụng cụ.................................................................................................... .12 1.4. Hóa chất .................................................................................................................... .12 1.5. Nguyên liệu ............................................................................................................... .12 2. Phương pháp thí nghiệm ................................................................................................. .12 2.1.Thu thập mẫu.............................................................................................................. .12 2.2. Phân tích thành phần nguyên liệu ............................................................................. .12 3.Các thí nghiệm ................................................................................................................. .13 3.1.Qui trình phân lập vi khuẩn axit lactic ....................................................................... .13 3.2.Thí nghiệm 1:Kiểm tra khả năng lên men ñường lactose của vi khuẩn Lactic......... .13 3.2.1.Mục ñích: ......................................................................................................... .13 iv 3.2.2.Bố trí thí nghiệm ............................................................................................... .13 3.2.3.Thực hành thí nghiệm ....................................................................................... .14 3.3.Thí nghiệm 2:Kiểm tra khả năng lên men ñường lactose, saccharose, thốt lốt, fructose, glucose của các dòng vi khuẩn.................................................................................. .14 3.3.1.Mục ñích ........................................................................................................... .14 3.3.2.Bố trí thí nghiệm ............................................................................................... .15 3.3.3.Thực hành thí nghiệm ....................................................................................... .15 3.3.4.Sơ ñồ sản xuất chung ........................................................................................ .15 3.3.5.Giải thích qui trình ............................................................................................ .16 3.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng thời gian chần ñến màu sắc, cấu trúc và sự giảm hàm lượng xianua trong măng. ........................................................................................ .16 3.4.1. Mục ñích .......................................................................................................... .16 3.4.2. Bố trí thí nghiệm .............................................................................................. .16 3.4.3.Thực hành thí nghiệm ...................................................................................... .17 3.5. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của công thức phối chế ñến quá trình lên men .............. .17 3.7.1 Mục ñích ........................................................................................................... .17 3.5.2.Bố trí thí nghiệm ............................................................................................... .17 3.5. 3.Phương pháp tiến hành..................................................................................... .18 3.6. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến khả năng lên men ................. .18 3.6.1. Mục ñích .......................................................................................................... .18 3.6.2. Bố trí thí nghiệm .............................................................................................. .18 3.6.3. Phương pháp tiến hành..................................................................................... .18 3.7. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ ñường: muối trong dịch phối chế ñến hương vị của sản phẩm sau khi lên men ................................................................................... .19 3.7.1.Mục ñích ........................................................................................................... .19 3.7.2.Bố trí thí nghiệm ............................................................................................... .19 3.7.3.Phương pháp tiến hành...................................................................................... .19 3.8. Thí nghiệm 7: Khảo sát thời gian bảo quản ............................................................. .20 3.8.1.Mục ñích ........................................................................................................... .20 v 3.8.2.Bố trí thí nghiệm ............................................................................................... .20 3.8.3. Phương pháp tiến hành..................................................................................... .21 3.9. Phân tích, ñánh giá chất lượng măng chua thành phẩm............................................ .21 3.10. Phân tích thống kê................................................................................................... .21 CHƯƠNG IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................... .22 1.Kết quả thu các mẫu nước măng chua và phân lập vi khuẩn lactic ................................. .22 2.Phân lập các dòng vi khuẩn lactic .................................................................................... .22 3.Kết quả Kiểm tra khả năng lên men ñường lactose của vi khuẩn Lactic ........................ .26 4.Kết quả kiểm tra khả năng lên men 05 loại ñường lactose, saccharose, glucose, ñường thốt lốt, và fructose.................................................................................................................... .27 5.Kết quả phân tích thành phần măng chua ñiền trúc ......................................................... .28 6. Kết quả thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng thời gian chần ñến màu sắc, cấu trúc và sự giảm hàm lượng xianua trong măng ......................................................................................... .29 7.Kết quả thí nghiệm 4: ảnh hưởng của công thức phối chế ñến quá trình lên men……….29 7.1.Ảnh hưởng của lượng vi khuẩn lactic bổ sung ñến quá trình lên men của sản phẩm. 30 7.1.1. Ảnh hưởng của lượng vi khuẩn lactic bổ sung ñến mật số vi khuẩn lactic (CFU/ml) trong thời gian lên men ............................................................................................ .30 7.1.2. Ảnh hưởng của lượng vi khuẩn lactic bổ sung ñến sự sản sinh axit tổng số (%, tính theo axit lactic) trong thời gian lên men lên men........................................................ .30 7.1.3. Ảnh hưởng của lượng vi khuẩn lactic bổ sung ñến giá trị cảm quan của sản phẩm................ .......................................................................................................................... .31 7.2. Ảnh hưởng của lượng ñường bổ sung ñến quá trình lên men của sản phẩm ............ .31 7.2.1. Ảnh hưởng của lượng ñường bổ sung ñến mật số vi khuẩn lactic (CFU/ml) trong thời gian lên men ............................................................................................................. .31 7.2.2. Ảnh hưởng của lượng ñường bổ sung ñến sự sản sinh axit tổng số theo thời gian lên men .............................................................................................................................. .31 7.2.3. Ảnh hưởng của lượng ñường bổ sung ñến giá trị cảm quan của sản phẩm ..... .32 7.3. Ảnh hưởng của lượng muối bổ sung ñến quá trình lên men của sản phẩm .............. .32 7.3.1. Ảnh hưởng của lượng muối bổ sung ñến mật số vi khuẩn lactic (cfu/ml) trong thời gian lên men....................................................................................................................... .32 vi 7.3.2. Ánh hưởng của lượng muối bổ sung ñến sự sản sinh axit tổng số (%, tính theo axit lactic) trong thời gian lên men ........................................................................................... .33 7.3.3. Ánh hưởng của lượng muối bổ sung ñến giá trị cảm quan của sản phẩm ............. .33 8. Kết quả thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến khả năng lên men..... ....... .34 9. Kết quả thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ ñường: muối trong dịch phối chế ñến hương vị của sản phẩm sau khi lên men............................................................................. .34 10. Ảnh hưởng của thời gian thanh trùng ñến khả năng bảo quản sản phẩm ..................... .35 10.1. ðánh giá về màu sắc, cấu trúc sản phẩm sau khi thanh trùng................................. .35 10.2. Ảnh hưởng của thời gian thanh trùng và ñiều kiện bảo quản ñến sự thay ñổi lượng axit tổng số trong quá trình bảo quản ............................................................................. .36 11. Khảo sát thời gian bảo quản sản phẩm......................................................................... .37 12. Kết quả phân tích thành phần măng chua thành phẩm.................................................. .38 CHƯƠNG V :KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ ............................................................................... .39 1. Kết luận ........................................................................................................................... .39 2. ðề nghị ............................................................................................................................ .40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ CHƯƠNG A PHỤ CHƯƠNG B vii DANH SÁCH BẢNG Bảng1: Thành phần dinh dưỡng của măng tre (trong 100 g phần ăn ñược) ................................ 3 Bảng 2: Hàm lượng axit xianhydric ở măng tươi và măng chế biến ........................................... 3 Bảng 3 : ðộ pH của các mẫu nước măng chua .......................................................................... 22 Bảng 4: Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn............................................................................. 25 Bảng 5 : Kết quả thống kê axit tổng số theo thời gian lên men của dòng LX1 trên 05 lọai ñường lactose 4%, saccarose 4%, glucose 4% va thốt lốt 4% ................................................... 26 Bảng 6 : Kết quả thống kê axit tổng số theo thời gian lên men của 12 dòng vi khuẩn và một dòng ñối chứng trên ñường lactose 4%...................................................................................... 27 Bảng 7 :Kết quả phân tích thành phần măng tre ñiền trúc ......................................................... 28 Bảng 8: Kết quả thống kê ảnh hưởng của cách xử lý nguyên liệu ñến màu sắc, cấu trúc và hàm lượng xianua của măng ...................................................................................................... 28 Bảng 9:Kết quả kiểm tra mật số vi khuẩn lactic sinh ra theo thời gian lên men ñược trình bày ở bảng sau ........................................................................................................................... 29 Bảng 10:Kết quả kiểm tra mật số vi khuẩn lactic sinh ra theo thời gian lên men ñược trình bày ở bảng sau .......................................................................................................................... 31 Bảng 11:Kết quả kiểm tra mật số vi khuẩn lactic sinh ra theo thời gian lên men ñược trình bày ở bảng sau ......................................................................................................................... 32 Bảng 12: Kết quả thống kê ảnh hưởng của tỷ lệ muối: ñường: nước chua trong dịch phối chế ñến mùi vị sản phẩm sau khi lên men.................................................................................. 35 Bảng 13: Tổng số vi sinh vật hiếu khí, tổng số nấm mốc, nấm men theo thời gian bảo quản... 37 Bảng 14: Thành phần hóa học của măng chua thành phẩm....................................................... 38 viii DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Tre ðiền trúc ................................................................................................................... 2 Hình 2: Công thức hóa học của axit lactic (Wikipedia, 2007)..................................................... 4 Hình 3: Sơ ñồ các bước phân lập vi khuẩn ................................................................................ 13 Hình 4: Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng lên men ñường .................................................... 13 Hình 5 :Qui trình Kiểm tra khả năng lên men ñường ................................................................ 14 Hình 6 :Qui trình sản xuất măng muối chua ñược ñề nghị ........................................................ 16 Hình 7 :Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic MB1 trong môi trường MRS agar........................... 22 Hình 8: Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic MB2 trong môi trường MRS agar........................... 23 Hình 9: Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic MB2 trong môi trường MRS agar........................... 23 Hình 10: Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic LX1 trong môi trường MRS agar.......................... 23 Hình 11: Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic LX2 trong môi trường MRS agar.......................... 23 Hình 12: Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic LX3 trong môi trường MRS agar.......................... 24 Hình 13: Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic MX1 trong môi trường MRS agar ........................ 24 Hình 14: Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic MX2trong môi trường MRS agar ......................... 24 Hình 15: Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic MX3 trong môi trường MRS agar agar................. 24 Hình 16 : Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic AC1 trong môi trường MRS agar ........................ 25 Hình 17: Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic AC2 trong môi trường MRS agar ........................ 25 Hình 18: Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic AC3 trong môi trường MRS agar ......................... 25 Hinh 19 : Hàm lượng axit sinh ra theo thời gian của 05 lọai ñường.......................................... 27 Hình 20: Ảnh hưởng của lượng vi khuẩn lactic bổ sung ñến lượng axit tổng số trong thời gian lên men ............................................................................................................................... 30 Hình 21: ðồ thị biểu diễn ảnh hưởng của lượng vi khuẩn lactic bổ sung ñến giá trị cảm quan của sản phẩm ..................................................................................................................... 30 Hình 22: ðồ thị biểu diễn ảnh hưởng của lượng ñường bổ sung ñến axit tổng số trong thời gian lên men ............................................................................................................................... 31 ix Hình 23: ðồ thị diễn ảnh hưởng của lượng ñường bổ sung ñến giá trị cảm quan của sản phẩm........................................................................................................................................... 32 Hình 24: ðồ thị biểu diễn ảnh hưởng của lượng muối bổ sung ñến axit tổng số trong thời gian lên men ............................................................................................................................... 33 Hình 25: ðồ thị biểu diễn ảnh hưởng của của lượng muối bổ sung ñến giá trị cảm quan của sản phẩm .................................................................................................................................... 33 Hình 26:ðồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến lượng axit tổng số trong thời gian lên men............................................................................................................................................. 34 Hình 27: ðồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian thanh trùng ñến màu sắc, cấu trúc của sản phẩm .................................................................................................................................... 35 Hình 28: Hàm lượng axit tổng số của sản phẩm ở thời gian thanh trùng và ñiều kiện bảo quản khác nhau........................................................................................................................... 36 Hình 29: Sản phẩm măng chua thành phẩm .............................................................................. 37 Hình 30: Quy trình sản xuất măng chua ñề nghị........................................................................ 40 CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU CHUNG 1. Giới thiệu Kỹ thuật muối chua là phương pháp chế biến cổ truyền đã xuất hiện ở nước ta từ lâu đời. Sản phẩm rau quả muối chua giúp bổ sung hệ vi sinh vật đường ruột, kích thích tiêu hóa và hấp thu thức ăn, lại có tính an toàn sinh học. Bản chất của quá trình muối chua là quá trình lên men lactic. Axit lactic tạo thành làm cho sản phẩm có hương vị đặc trưng làm cho bữa ăn trở nên ngon miệng hơn. Song hiện nay ở nước ta việc sản xuất sản phẩm dưa muối chua chỉ thực hiện chủ yếu ở quy mô thủ công, thường làm theo kinh nghiệm, chế biến nhanh, tiêu thụ tại chỗ do đó chất lượng sản phẩm không ổn định, thời gian bảo quản ngắn mà hiệu quả kinh tế lại không cao, không chủ động phát huy hết tác dụng hữu ích của vi sinh vật. Vì vậy, để sản xuất sản phẩm muối chua đạt chất lượng tốt, thời gian bảo quản kéo dài hơn và có thể xuất khẩu thì việc chế biến sản phẩm muối chua phải được công nghiệp hóa bằng cách kết hợp hài hòa giữa tính dân gian và khoa học. Các sản phẩm được chế biến từ măng cũng rất đa dạng: măng tươi, măng khô, măng đóng hộp,… Đặc biệt, sản phẩm măng muối chua có hương vị chua chua, ngọt ngọt, cay nồng, ăn rất ngon miệng, vừa là món ăn giàu vitamin, vừa tốt cho tiêu hoá. Măng muối chua vừa là hình thức chế biến làm tăng giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan, vừa là hình thức bảo quản nguồn măng khi đến mùa thu hoạch rộ. Bằng cách nào có thể làm giảm được độc tố xianua có trong măng đến mức an toàn cho người sử dụng mà vẫn tạo ra được những món ăn ngon, bổ dưỡng? Đây là một vấn đề cần được quan tâm giải quyết và cũng là mong muốn của nhiều người tiêu dung, chính vì thế đề tài“Phân lập vi khuẩn lactobacillus từ tự nhiên để sản xuất măng chua ” ra đời. 2. Vấn đề nghiên cứu Phân lập chọn dòng vi khuẩn thuần từ nước măng chua có họat tính vượt trội và hiệu suất lên men cao Cải tiến phương pháp lên men truyền thống bằng cách chủng giống vi khuẩn lactic từ nguồn vi khuẩn thuần vừa phân lập được Làm giảm độc tố xianua có trong măng, tạo ra sản phẩm an toàn, hợp vệ sinh. Ưu điểm qui trình của đề tài này sử dụng vi khuẩn thuần, giúp quá trình lên men ổn định, không tạp nhiễm vi khuẩn tạp 3. Mục tiêu nghiên cứu Tên đề tài “Phân lập vi khuẩn lactobacillus từ tự nhiên để sản xuất măng chua” Phân lập vi khuẩn lactic thuần từ nước măng chua. Khảo sát khả năng lên men và sinh acid lactic từ các lọai đường phổ biến như lactose, fructose, glucose, thốt lốt và saccharose của dòng vi khuẩn phân lập được. Tìm ra dòng vi khuẩn lactic phù hợp cho lên men măng chua. Sử dụng vi khuẩn lactic đã qua phân lập để lên men măng chua Tìm ra qui trình sản xuất măng chua thích hợp Khảo sát chọn thời gian thanh trùng và chế độ bảo quản thích hợp. 1 CHƯƠNG II :LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1. Giới thiệu nguyên liệu Ở Việt Nam, măng tre rất quen thuộc đối với nhân dân ta từ bao đời nay. Tuy nhiên, diện tích trồng tre lấy măng còn hạn hẹp. Rất nhiều loài tre ở nước ta cho măng ngon như Luồng (Dendrocalamus membranaceus), Lồ ồ (Bambus procera), Mai ống (Dendrocalamus giganteus), Là ngà (Bambusa blumeana), Vầu đắng (Indosasa amabilis), Tre gầy (Dendrocalamus sp.),....(Đỗ Văn Bản, 2005). Tại miền Nam trước đây, tre Mạnh tông chuyên măng đã được đưa từ Thái Lan về gây trồng. Mạnh tông có tên khoa học là Denldrocalamus asper, là loài tre có măng lớn, được trồng thành rừng thuần chuyên sản xuất măng để xuất khẩu (Đỗ Văn Bản, 2005). Tre Điền trúc (Dendrocalamus latiflorus) hay "Trúc ngọt". Loài này phân bố tại Mianma và Nam Trung Quốc. Điền trúc có đường kính thân gần gốc đến 20 cm, đặc biệt lá có màu lục sẫm, kích thước lớn (chiều dài đến 40 cm, chiều rộng từ 7 đến 10 cm), măng to và có chất lượng cao, hương vị măng giòn ngọt, dễ chế biến nhiều món ăn, rất được ưa chuộng trên thị trường. Điền trúc thích hợp trên nhiều loại đất và khí hậu khác nhau, nhưng phát triển tốt trên tầng đất dày, khí hậu ẩm, đất không bị ngập úng. Đây là loại măng rau dễ trồng, cho măng quanh năm, thích nghi rộng với vùng đất đồng bằng sông Cửu Long nói chung và Chợ Mới nói riêng (Đỗ Văn Bản, 2005). Hình 1: Măng tre Điền Trúc Ở Việt Nam, măng tây đã được trồng từ thời Pháp thuộc, do người Pháp mang sang. Măng tây là một rau cao cấp có giá trị, có lợi cho sức khỏe con người, có hương vị thơm mềm, ngon ở cả dạng rau tươi và rau đóng hộp, đông lạnh, là một mặt hàng xuất khẩu có giá trị. Măng tây là loại cây rau có tính thích ứng rộng với điều kiện khí hậu, đất đai cũng như mọi điều kiện canh tác như trồng ở diện tích sản xuất lớn, diện tích sản xuất nhỏ trong vườn,…(Mai Thị Phương Anh, 2000). Ở Nhật Bản, theo ghi nhận của bảo tàng tre nước này, cây măng rất có giá trị bởi đây là món ăn quan trọng có tính thời vụ của các đầu bếp nổi tiếng. Măng cũng là món cung 2 cấp nhiều chất carbohydrate, dầu thực vật, chất đạm và vitamin B, hỗ trợ cho việc tuần hoàn máu... Có rất nhiều cách chế biến các món ăn từ măng ở Nhật. Măng của giống tre Mosochiku là món thông dụng do nó lớn, đầy đặn, mềm và thơm hơn các loài măng khác. Có những món thông dụng như: măng hầm (Nimono), măng nấu đậu tương (Dengaku), măng nấu súp với ngọn sancho (Kimone-ae), măng nướng (Yakimono), măng tươi ăn sống (Shashimi), súp măng (Wanmono) và măng hầm gạo (Takenoko- gohan),... Ngoài các món ăn thông dụng, các viên thuốc từ vỏ tre tán bột rồi làm như bánh in có thể uống với trà mỗi ngày để ngăn ngừa vi khuẩn phát triển, giúp duy trì tuổi thanh xuân hoặc chống lão hóa (Trương Điện Thắng, 2006). Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng của măng tre (trong 100 g phần ăn được) TT Thành phần Hàm lượng 1 Nước,g 89 – 93 2 Protein,g 2,6 – 4 3 Chất xơ,g 0,5 –0,9 4 Đường,g 0,5 –0,9 5 Canxi, mg 1,8 – 4,1 6 Thiamine và niacin, mg 81 – 86 7 Oxalic axit,g 0,7 – 1,4 8 Choline, mg 2 9 Rhibiflavin, mg 0,19 10 Vitamin C5, mg 3,2 – 5,7 Nguồn : (Đỗ Văn Bản, 2005) Nhiều người lo ngại trong măng có độc tố xianua nên sức tiêu thụ các sản phẩm được chế biến từ măng còn hạn chế. Theo Nguyễn Đức Lượng và Phạm Minh Tâm (2005) khi bị ngộ độc axit cyanhydric sẽ có triệu chứng là nhức đầu, chóng mặt, buồn nôn, mệt toàn thân, khô cổ họng và mũi. Bảng 2: Hàm lượng axit xyanhydric ở măng tươi và măng chế biến Loại măng Hàm lượng axit cyanhydric (mg/kg) Măng tươi chưa luộc kỹ Măng tươi luộc kỹ Nước luộc măng Măng ngâm chua 313 – 314 27 100 21,6 Nguồn : ( Nguyễn Đức Lượng và Phạm Minh Tâm, 2005) 3 Muốn hạn chế hiện tượng ngộ độc khi sử dụng măng cần phải luộc măng thật kỹ và bỏ nước luộc. Phương pháp sản xuất măng muối chua cũng có thể làm giảm độc tố xianua trong quá trình lên men, giúp người tiêu dùng an tâm hơn khi thưởng thức loại sản phẩm này. 2. Cơ sở của quá trình lên men lactic 2.1. Định nghĩa quá trình lên men lactic Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kị khí đường tạo axit lactic dưới tác dụng của một số giống vi khuẩn lactic như: Bacterium lactic, Bacterium delbriski, Bacterium casei,… (Trần Minh Tâm, 1998) 2.2. Axit lactic Axit lactic là chất lỏng hòa tan trong nước, được sản sinh trong bắp thịt như kết quả của sự chuyển hóa kỵ khí glucose và hiện hữu trong sữa chua, mật đường, nhiều loại quả và rượu vang. Tổng hợp từ hỗn hợp được sử dụng trong thực phẩm và đồ uống như một mùi thơm có tác dụng bảo quản (The American Heritage® Dictionary of the English Language, 2006).Năm 1780 nhà bác học người Thụy Điển Scheele lần đầu tiên đã tách được axit lactic từ sữa bò lên men chua. Năm 1857 Pasteur chứng minh rằng việc làm chua sữa là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. Năm 1878 Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt tên là bacterium lactis (hiện nay gọi là Streptococcus lactis); về sau các nhà khoa học liên tiếp phân lập được nhiều loài vi khuẩn lactic khác nhau. Công nghiệp lên men sản xuất axit lactic có thể nói đã được hình thành từ năm 1881 (Nguyễn Lân Dũng, 2002). Công thức hóa học của axit lactic là C3H6O3 (2-hydroxypropanoic axit), có khối lượng phân tử bằng 90,08 g/mol. Hình 2:Công thức hóa học của axit lactic (Wikipedia, 2007) 2.3. Vi khuẩn lactic Năm 1780 nhà bác học Thụy Điển Schaele lần đầu tiên đã tách được axit lactic từ sữa bò lên men chua. Năm 1857 Pasteur đã chứng minh được sự lên men chua sữa là do nhóm vi khuẩn lactic. Đến năm 1878 Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactis, nay gọi là Streptococcus lactis. Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều loại khác nhau về hình dạng, sinh lý và khả năng lên men là vi khuẩn gram âm, kị khí không bắt buộc. Môi trường sinh trưởng của chúng ngoài gluxit khoáng, muối amoni, còn cần vitamin nhóm B, vitamin H, axit folic, acit nicotinic và các acit amin khác (Đồng Thị Thanh Thu, 2003). Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kị khí nhưng chịu được điều kiện có oxy (Van den Broek et al. 1999). Chúng được tìm thấy trong những thực phẩm: yaourt, nem chua, rau 4 quả muối chua, cơm mẻ, thức ăn gia súc ủ chua, nước thải các nhà máy sản xuất tinh bột, nhà máy sữa,…Chúng được quan tâm đặc biệt do khả năng lên men cũng như những lợi ích về dinh dưỡng và sức khỏe cho người và vật nuôi. 2.3.1. Đặc điểm chung Theo I.Edward Alcamo (1998), lactobacilli phát triển trong điều kiện kị khí và sản sinh axit lactic. Trong quá trình sản xuất bơ sữa, axit lactic này chuyển sữa đông đặc thành yogurt. Lactobacilli cũng phát triển trong âm đạo của con người, trong đường ruột và sản xuất axit nên hạn chế được sự phát triển của một số vi khuẩn khác. Chúng được sử dụng trong sản xuất thương nghiệp các món dưa cải bắp và dưa góp. Lactobacilli thuộc vi khuẩn axit lactic, là nhóm vi khuẩn có cùng chung những đặc điểm về sinh lý, biến dưỡng và hình thái. Chúng là những vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, không di động, hình dạng thay đổi: que thẳng dài, hoặc que hơi cong như hình lưỡi liềm cho đến hình que tròn. Chiều dài của hình que và mức độ cong tùy thuộc vào tuổi của giống, thành phần của môi trường nuôi cấy và hàm lượng oxy. Hàm lượng G + C trong ADN thường nhỏ hơn 50 % mol (Wood B.J.B. and Holzafpel W.H., 1995). Khuẩn lạc lactobacilli trên môi trường thạch thường nhỏ (đường kính 2 – 5 mm), có bờ đều, láng và lồi, mờ đục không có chất màu. Lactobacilli không tạo mùi đặc trưng trên môi trường nuôi cấy thông thường. Tuy nhiên, chúng góp phần tạo hương vị trong những thực phẩm lên men bằng cách sản xuất nhiều hợp chất dễ bay hơi như diacetyl và những dẫn xuất của nó, thậm chí chúng tạo H2S và các amin trong phô mai (Mair S., Holt., Sharpe H and Sneath A., 1986). Lactobacilli được sử dụng nhằm mục đích ức chế tác dụng có hại đối với nhiều vi khuẩn bao gồm những vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm và vi khuẩn gây bệnh. Việc tạo chất chuyển hóa sơ cấp, axit lactic và làm giảm pH là nhân tố bảo quản chính trong lên men muối chua. 2.3.2. Phân loại: vi khuẩn lên men lactic được chia làm hai nhóm: - Nhóm vi khuẩn lactic dị hình: Khi tiến hành lên men các dung dịch đường, các vi khuẩn lactic dị hình thường tạo ra lượng axit lactic không lớn lắm. Ngoài axit lactic, chúng còn tạo ra hàng loạt các sản phẩm khác như: axit acetic, axit propionic, ethanol, CO2 (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Vi khuẩn lên men lactic dị hình rất cần cho quá trình lên men rau muối chua vì chúng sinh ra axit dễ bay hơi và các hợp chất khác (ester, diacetyl, acealdehyde,…) tạo mùi vị ưa thích cho sản phẩm. Các chủng vi khuẩn chủ yếu lên men lactic dị hình là: Lactobacillus pasteurianus: trực khuẩn, gram dương, rộng: 0,5 – 1 µm, dài: 7 – 35 µm, không di động, có khả năng lên men glucose, fructose, galactose, maltose, saccharose,…Trong quá trình lên men tạo ra một loạt các sản phẩm như CO2, alcohol, axit lactic, axit acetic, axit formic. Nhiệt độ thích hợp là 29 – 33oC (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Lactobacillus brevis: trực khuẩn gram dương, kích thước rộng: 0,7 – 1 μm, dài: 2 – 4 µm, liên kết thành chuỗi, không di động, có khả năng lên men các loại đường như: xylose, glucose, fructose, maltose,…Nhiệt độ phát triển tối đa là 30oC. Vi khuẩn này có nhiều trong sữa, trong kefia, trong dưa chua (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Lactobacillus lycopessici: trực khuẩn, gram dương, tồn tại thành từng đôi, có khả năng 5 tạo bào tử. Trong quá trình lên men đường chúng tạo ra cồn, axit lactic, axit acetic và CO2 và nhiều chủng khác như: Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mensenteroides,…(Nguyễn Đức Lượng, 2004). - Nhóm vi khuẩn lactic đồng hình: Vi khuẩn lactic đồng hình là những vi khuẩn trong tế bào của chúng có chứa enzym aldolase và enzym triosophotphatizomerase. Khi tiến hành lên men các loại đường chúng tạo ra chủ yếu là axit lactic (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Ở vi khuẩn lên men lactic đồng hình, sự chuyển hóa thành axit lactic thường đi theo con đường lên men rượu đến giai đoạn tạo axit pyruvic, rồi sau đó tạo axit lactic (Nguyễn Đức Thạch, 2000). Ở vi khuẩn lên men lactic đồng hình, sự chuyển hóa thành axit lactic thường đi theo con đường lên men rượu đến giai đoạn tạo axit pyruvic, rồi sau đó tạo axit lactic ( Nguyễn Đức Thạch, 2000). Lactobacillus axitophilus: trực khuẩn, gram dương, có khả năng chuyển động, có kích thước: rộng 0,6 – 0,9 μm; dài 1,5 – 6 μm; tồn tại riêng lẽ, đôi khi tạo thành những chuỗi ngắn. Chúng có khả năng lên men các loại đường như: glucose, fructose, galactose, maltose, lactose, saccharose để tạo ra axit lactic. Nhiệt độ phát triển tối ưu của chúng là 45 – 50oC (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Lactobacillu bungaricus: trực khuẩn có kích thước rất dài, gram dương, liên kết với nhau thành chuỗi, không có khả năng di chuyển. Chúng có khả năng lên men các loại đường như glucose, galactose, lactose; không lên men được xylose, arabinose, mannitol, dextrin. Nhiệt độ phát triển 45 – 50oC (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Một số vi khuẩn lên men lactic đồng hình khác như: Lactobacillus bifidus, Lactobacillus delbruckii,… 2.4. Nấm men Nấm men là tên gọi thông thường để chỉ một nhóm vi nấm thường là đơn bào và sinh sản bằng cách nảy chồi. Nấm men phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, trong nước, trong không khí, nhất là trong môi trường có chứa đường, có pH thấp như trong lương thực, thực phẩm, hoa quả, rau dưa, mật mía, rỉ đường, trong đất ruộng mía, đất vườn cây ăn quả, trong các đất có nhiễm dầu mỏ (Nguyễn Xuân Thành, va csv. 2005). Nấm men thường có các hình dáng khác nhau. Thường chúng có hình cầu, hình elip, hình bầu dục và cả hình dài. Một số loài nấm men có tế bào hình dài nối với nhau thành những sợi gọi là khuẩn ty hay khuẩn ty giả. Hình dạng nấm men hầu như không ổn định. Nó phụ thuộc vào tuổi của nấm men và điều kiện nuôi cấy. Trong điều kiện yếm khí nấm men có hình tròn, ngược lại, trong điều kiện hiếu khí tế bào kéo dài hơn (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Nấm men có giá trị dinh dưỡng cao vì giàu protein (45 – 55 % theo khối lượng khô) và vitamin. Nó lại có độc tố phát triển rất nhanh, có thể đồng hóa trực tiếp với các muối vô cơ chứa N – P – K và hầu hết các hợp chất hữu cơ đều có thể trực tiếp hoặc gián tiếp được dùng làm thức ăn nuôi cấy nấm men (Nguyễn Đức Thạch, 2000). 2.5. Nấm mốc Nấm mốc là tên chung chỉ tất cả những vi sinh vật không phải là nấm men cũng không phải là các nấm mũ lớn. Chúng được phân bố rộng rãi trong thiên nhiên (Nguyễn Đức 6 Lượng, 2004). Nấm mốc có cấu tạo hình sợi phân nhánh, những sợi này sinh trưởng ở đỉnh và phát triển rất nhanh, tạo thành một đám chằng chịt các sợi, từng sợi được gọi là các khuẩn ty hay sợi nấm, còn cả đám sợi thì được gọi là khuẩn ty thể hay sợi nấm (Nguyễn Xuân Thành va csv., 2005). Khuẩn ty của nấm mốc ở dạng bột màu xanh, vàng, trắng, đen. Chúng là những vi sinh vật hiếu khí. Nhiều loại nấm mốc có lợi trong công nghệ sản xuất các chế phẩm enzym, tổng hợp các acit hữu cơ,…Nhưng bên cạnh đó cũng có một số loại gây tác hại như làm mốc sản phẩm, thực phẩm, có thể gây bệnh cho người (Nguyễn Đức Thạch, 2000). Trong và sau quá trình lên men lactic thường gặp các loại mốc: Aspergillus, Penicillium, Cidium lactic,… 2.6. Cơ chế của quá trình lên men lactic Có hai quá trình lên men lactic khác nhau là: lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình. Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucose sẽ được chuyển hóa theo chu trình Emden - Meyerhof để tạo thành axit pyruvic và NAD – H+. Acit pyruvic sẽ tiếp tục bị khử thành axit lactic: C6H12O6 → 2CH3COCOOH + 4H+ 2CH3COCOOH + 4H+ → 2CH3CHOHCOOH + Q Lượng axit lactic tạo thành chiếm hơn 90 %. Chỉ một lượng nhỏ piruvat bị khử cacbon để chuyển thành axit axetic, etanol, CO2 và axeton. Trong quá trình lên men lactic dị hình, ngoài axit lactic còn tạo thành các sản phẩm khác như axit acetic,CO2, etanol, glycerin. 2C6H12O6 → 2CH3CHOHCOOH + CH3COOH + CH3CH2OH + 2CO2 (Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Bá Hiên, Hoàng Hải và Vũ Thị Hoan, 2005). 2.7. Điều kiện của quá trình lên men lactic 2.7.1. Các cấu tử môi trường Nguồn gluxit là một trong những thành phần chủ chốt của môi trường cần thiết cho quá trình lên men. Khi nuôi cấy các vi sinh vật khác nhau, người ta dùng nồng độ đường khác nhau. Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn có nhu cầu về chất dinh dưỡng phức tạp, không một đại diện nào thuộc nhóm này có thể phát triển trên môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucose và NH4+, đa số chúng cần hàng loạt các vitamin như: lactoflavin, tiamin, axit pantotenic, axit nicotinic, axit folic, biotin,… và các acit amin (Ngô Thị Hồng Thẫm, 2005). 2.7.2. Các nhân tố bên ngoài Vi khuẩn lactic thường ở nhiệt độ cao thì phát triển tốt. Tùy loại, yêu cầu nhiệt độ khác nhau nhưng để thuận lợi cho quá trình lên men, nhiệt độ thường từ 20oC đến 45oC, pH từ 4 ÷ 8. Ngoài ra, sự lên men lactic cần tiến hành trong điều kiện không có oxy, các vi khuẩn lactic hoạt động trong điều kiện yếm khí tùy nghi, tức là chúng cần một ít khí oxy nhưng chúng lên men và phát triển tốt trong điều kiện không có oxy, đôi khi có oxy làm cho một số loài thuộc vi khuẩn lactic bị giảm hoạt động. Trong khi đó một số loài vi sinh vật khác như vi khuẩn axetic, nấm men và mốc có khả năng làm giảm chất lượng 7 sản phẩm lại hoạt động trong điều kiện hiếm khí và khi không có không khí thì không thể hoạt động được. Vi khuẩn lactic thường ít gặp trong đất và trong nước, chúng thường phát triển ở những nơi có chứa nhiều chất hữu cơ phức tạp như trên xác thực vật, sữa,… (Ngô Thị Hồng Thẫm, 2005). Bất kỳ quá trình lên men chua nào cũng là kết quả hoạt động không phải của một mà của nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Khi quyết định nhiệt độ, phản ứng môi trường, ta cần chú ý đảm bảo yêu cầu thuận lợi chỉ cho vi khuẩn lactic phát triển. Nhưng ngay từ đầu của quá trình lên men thường có mặt hàng chục loại vi sinh vật khác nhau. Mỗi loài sản sinh ra các loại men của chúng với tính chất đặc trưng nhất định. Trong số này không chỉ thuần túy có các vi sinh vật lên men lactic mà còn có các vi sinh vật lên men axetic, rượu và các loại men khác (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Các chủng vi sinh vật khác nhau có khả năng thực hiện quá trình tạo thành axit lactic từ đường bằng nhiều cách khác nhau, với sự tách ra các sản phẩm phụ khác nhau. Nếu chúng ta không có tác động vào quá trình phức tạp đó thì có thể đưa đến kết quả không tốt, sản phẩm muối chua có mùi vị không đặc trưng, tạo nên các lỗ hổng bên trong rau quả do sự tách ra của các khí,…vì vậy cần tiến hành lên men có định hướng. Muốn cho sản phẩm có hương vị tốt nhất, người ta cho vào rau quả lên men chủng vi sinh vật thuần khiết đã được phát triển trước và có khả năng tạo nên các men để tiến hành quá trình lên men với kết quả mong muốn (Nametnhicov, 1977). 3. Cơ sở lý thuyết của quá trình muối chua rau quả Trong quá trình lên men xảy ra hàng loạt quá trình: quá trình trích ly hay thẩm thấu các chất từ mô bào thực vật, quá trình tăng sinh khối của vi sinh vật (chủ yếu là vi khuẩn lactic), quá trình tạo axit lactic, quá trình ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây thối bởi axit lactic và muối, quá trình tạo hương của sản phẩm. Quá trình lên men này hoàn toàn là quá trình lên men tự nhiên gây ra bởi nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau. Bởi vậy quá trình này xảy ra ba giai đoạn cơ bản: - Giai đoạn thứ nhất: đường và các chất hòa tan có trong dịch bào của mô bào thực vật được thẩm thấu ra ngoài, nhờ vậy tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lactic và một số vi sinh vật khác phát triển. Điều này dễ nhận thấy là trên bề mặt khối dịch lên men có nhiều bọt khí. Khí tạo thành do hoạt động của các vi sinh vật tạo khí. Trong giai đoạn này vi khuẩn Leuconostoc mensenteroides phát triển rất mạnh. Loài vi khuẩn này sinh acit lactic và sinh khí. Lượng axit lactic ở giai đoạn này rất nhỏ( 1 %). - Giai đoạn thứ hai: trong giai đoạn này số lượng vi khuẩn lactic đạt cao nhất, đồng thời axit lactic tích tụ rất nhiều, pH dịch lên men giảm nhanh. Do tác dụng của axit lactic mà các vi khuẩn gây thối giảm mạnh. Trong giai đoạn này, hương vị đặc trưng của sản phẩm lên men bắt đầu hình thành, chất lượng sản phẩm cuối cùng phụ thuộc nhiều ở giai đoạn này. Cuối giai đoạn hai lượng axit lactic đạt cực đại và tác động ngược lại với vi khuẩn lactic, quá trình lên men chuyển sang giai đoạn thứ ba. - Giai đoạn ba: ở giai đoạn này vi khuẩn lactic chết dần trong khi nấm sợi và nấm men tăng dần số lượng. Do sự phát triển mạnh của nấm sợi axit lactic bắt đầu giảm dẫn tới sự hư hỏng nhanh chóng của sản phẩm. Khối rau quả lên men bắt đầu bị các vi khuẩn P gây thối. Để kéo dài giai đoạn ba nên đưa sản phẩm kết thúc ở giai đoạn 2 vào điều kiện lạnh (2 – 4oC) hay dùng hóa chất chống nấm sợi, nấm men và vi khuẩn gây thối, thường sử dụng axit sorbic và benzoat natri (Nguyễn Thị Hiền, 2004). 4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình muối chua rau quả 8 4.1. Hàm lượng đường Các loại lên men đều lợi dụng đường trong môi trường để lên men. Nó là nguồn quan trọng để tích tụ nhiều axit lactic. Trường hợp lượng đường trong nguyên liệu không đầy đủ thì lượng axit cần thiết cho sản phẩm muối chua sẽ không đảm bảo và chất lượng kém. Thông thường lượng đường trong lên men lactic tốt nhất là 1,5 – 4 %. Đối với một số nguyên liệu có hàm lượng đường thấp thì phải phối hợp với các nguyên liệu có hàm lượng đường cao hơn hoặc cho thêm đường (Trần Minh Tâm, 1998). 4.2. Độ axit và điều kiện không khí Mỗi loại vi sinh vật lên men đều thích ứng ở một độ axit khác nhau. Axit lactic được tạo thành trong quá trình lên men khi ở nồng độ 0,5 % đã có thể ức chế hoạt động của một số vi sinh vật lạ khác có ảnh hưởng đến quá trình lên men. Khi axit lactic tích tụ nhiều làm cho pH giảm xuống đến 3 – 4, khi tích tụ quá nhiều từ 1 – 2 % axit lactic trong sản phẩm thì vi khuẩn lactic ngưng hoạt động và quá trình lên men lactic ngừng lại. Nồng độ của axit lactic phụ thuộc vào lượng đường ban đầu, nồng độ muối của dung dịch và điều kiện tiến hành quá trình lên men. Axit lactic không kìm hãm được quá trình phát triển của một số men nhất là mốc (Trần Minh Tâm, 1998). 4.3. Nhiệt độ Nhiệt độ là yếu tố có ảnh hưởng rất lớn. Mỗi loại vi sinh vật có một yêu cầu nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của mình (Trần Minh Tâm, 1998). Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn lên men lactic là khoảng 26oC. Ở nhiệt độ 30 – 40oC nó vẫn phát triển đồng thời cũng kích thích sự phát triển của các vi khuẩn khác như Butyric(ở 30oC). Trong phạm vi thích hợp thì nhiệt độ càng tăng sự lên men càng mạnh: Ở nhiệt độ 25 – 30oC: lên men lactic từ 6 – 8 ngày. Ở nhiệt độ 20 – 22oC: lên men lactic từ 8 – 10 ngày. Ở nhiệt độ 18 – 20oC: lên men lactic từ 9 – 12 ngày. Ở nhiệt độ 14 – 16oC: lên men lactic từ 14 – 16 ngày(Trần Minh Tâm, 1998). 4.4. Nồng độ muối Nếu chỉ để cho sự lên men lactic tiến triển tốt thì nồng độ muối trong nước muối chua thích hợp nhất là 3% hoặc cao hơn. Nhiều khi dưa muối lại bị hư do quá mặn (Nguyễn Đức Thạch, 2000). Khi nồng độ dung dịch muối cao sẽ làm ngừng sự phát triển của các vi sinh vật kể cả vi khuẩn gây chua lactic. Các loại vi khuẩn sẽ ngừng hoạt động ở các nồng độ muối khác nhau. Vì vậy khi muối chua phải làm sao đảm bảo cho vi khuẩn gây chua lactic phát triển đồng thời hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật khác, do đó nồng độ muối không được cao lắm (Trần Minh Tâm, 1998). Ở nồng độ muối 2 % có ảnh hưởng đến vi khuẩn Butyric và nhóm Coli. Ở nồng độ muối lên đến 5 – 6 % thì hoàn toàn ức chế vi khuẩn Butyric và trực khuẩn đường ruột nhưng vi khuẩn lactic giảm 30 % (Trần Minh Tâm, 1998). Để đảm bảo cho sự lên men lactic bình thường, nồng độ muối cho sản phẩm khi muối chua là 3 %, đôi khi cho vào nguyên liệu dung dịch muối 6 – 12 %. Với dung dịch như thế, vi khuẩn lactic phát triển rất yếu. Song nước muối sẽ làm co nguyên sinh tế bào rau quả. Khi đó dịch bào sẽ chuyển sang nước muối, do vậy nồng độ nước muối giảm xuống và tạo điều kiện hoạt động bình thường của các vi sinh vật lên men chua lactic 9 (Trần Minh Tâm, 1998). 4.5. pH của môi trường Cũng như nhiệt độ, pH cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật và hiệu quả lên men của chúng. Đối với vi sinh vật, bao giờ cũng có một khoảng pH thích hợp với sinh lý của chúng cũng như có một khoảng pH tối ưu để vận tốc lên men đạt cực đại, hoặc theo đúng hướng tạo sản phẩm theo yêu cầu. Ở các giá trị pH khác nhau của môi trường lên men, ta có thể thu nhận các sản phẩm khác nhau (Đồng Thị Thanh Thu, 2003). Nồng độ ion H+ có ảnh hưởng lớn tới hoạt động của nấm men, pH tối ưu cho nấm men hoạt động là 4,5 – 5. Đối với vi khuẩn lactic khi pH < 4 thì vi khuẩn ngừng hoạt động, trong khi nấm men vẫn có thể phát triển (Trần Minh Tâm,1998). 5. Một số hiện tượng xảy ra trong quá trình muối chua 5.1. Biến màu Rau quả muối chua còn có thể bị biến màu. Sở dĩ như vậy là do hàm lượng diệp lục bị mất đi do nồng độ pH tăng lên thay thế Mg++. Cũng có thể do vi sinh vật lẫn tạp vào làm cho màu sắc sản phẩm bị thay đổi hoặc do phản ứng giữa tanin với sắt trong nước hoặc trong muối ăn mà màu sắc của sản phẩm cũng bị biến màu (Trần Minh Tâm, 1998). Đôi khi dưa muối bị thâm do tiếp xúc với oxy không khí trong trường hợp nước dưa không đủ ngập rau. Hiện tượng dưa thâm còn do sự phát triển của các tạp khuẩn, đặc biệt là trong trường hợp lên men ở nhiệt độ cao (trên 30oC) hoặc khi muối phân bố không đều đặn hoặc nồng độ muối quá cao làm cho vi khuẩn lactic bị ức chế và các vi khuẩn khác phát triển (Văn Quốc Thanh Thủy, 2005). 5.2. Tăng độ nhớt Dưa muối thỉnh thoảng bị nhớt do các chủng sinh nhầy của vi khuẩn lactic phát triển. Hiện tượng này hay gặp khi lên men ở nhiệt độ cao. Đôi khi những loại nấm dại phát triển làm giảm độ axit của nước dưa, làm dưa có dư vị khác (Văn Quốc Thanh Thủy, 2005). 5.3. Nổi váng trắng Trong quá trình dưa chua dần lên và đến một độ chua nhất định thì sẽ ức chế ngay cả hoạt động của các nhóm vi khuẩn lactic. Khi đó, trên bề mặt dung dịch có thể thấy xuất hiện những lớp váng trắng. Đó là loại nấm men (chủ yếu là Geotrichum candidum) có khả năng phát triển ngay trong điều kiện pH rất thấp. Những loại nấm men này có khả năng oxy hóa axit lactic thành CO2 và nước, do đó làm cho dưa giảm dần độ chua. Khi độ chua giảm đến một mức độ nhất định rồi thì vi khuẩn gây thối lại bắt đầu phát triển và dẫn đến việc làm khú dưa. Để hạn chế sự phát triển của váng nấm men nhằm kéo dài được thời gian bảo quản dưa (trong điều kiện sản xuất lớn) có thể lấy một tấm nhựa mỏng làm thành một cái túi lớn đựng nước muối rồi áp sát lên toàn bộ bề mặt của bể muối dưa (Văn Quốc Thanh Thủy, 2005). 5.4. Thay đổi cấu trúc Rau quả muối chua còn bị mềm nhũn do quá trình thủy phân protopectin dưới tác dụng của men protopectinase (Trần Minh Tâm, 1998). Dưa mềm nhũn còn do lượng muối không đủ, hoặc do nhiệt độ lên men cao quá hoặc 10 không đảm bảo yếm khí trong khi lên men (Văn Quốc Thanh Thủy, 2005). 5.5. Thay đổi thành phần dinh dưỡng Hàm lượng đường trong rau quả giảm xuống, lượng axit tăng lên, lượng đạm giảm đi vì các loại vi khuẩn lên men đều dùng đạm để sống và phát triển. Lượng vitamin C trong sản phẩm cũng bị hao hụt. Nếu đảm bảo điều kiện yếm khí tốt ta sẽ hạn chế được sự hao hụt này (Trần Minh Tâm, 1998). 6. Các phương pháp bảo quản rau quả muối chua 6.1. Bảo quản ở nhiệt độ thường Khi tồn trữ ở nhiệt độ thường, quá trình lên men của sản phẩm muối chua vẫn tiếp tục diễn ra. Do đó, pH của sản phẩm sẽ hạ thấp, dẫn đến sản phẩm chua hơn so với ban đầu. Sản phẩm biến đổi chậm hay nhanh còn tùy thuộc vào nhiệt độ môi trường bảo quản cao hay thấp (Văn Quốc Thanh Thủy, 2005). 6.2. Bảo quản bằng cách thanh trùng Tùy theo đặc tính của sản phẩm mà có chế độ thanh trùng thích hợp. Có thể thanh trùng ở nhiệt độ từ 75 – 100oC trong thời gian từ 5 – 20 phút, tùy vào lượng axit của môi trường (Trần Minh Tâm, 1998). Nếu thanh trùng ở nhiệt độ cao sẽ làm cho sản phẩm mềm , kém hấp dẫn. 6.3. Bảo quản bằng hóa chất Bảo quản rau muối chua bằng axit sorbic với tỷ lệ 0,5 – 0,1 % hạn chế được hiện tượng rỗng ruột và có thể bảo quản sản phẩm trong 5 – 6 tháng. Axit sorbic còn giữ cho sản phẩm ít bị mất màu, ít bị mềm nhũn, không bị nhớt (Trần Minh Tâm, 1998). 6.4. Bảo quản lạnh Sau khi muối dưa cho vào bao bì ghép kín đem bảo quản ở nhiệt độ từ 0 – 2oC. Sản phẩm muối chua cho vào bao bì có thể bảo quản 6 tháng ở nhiệt độ 0 – 2oC và 1 – 3 tháng ở nhiệt độ 10 – 18oC.Nhược điểm của phương pháp này là đắt tiền vì chi phí năng lượng và đầu tư thiết bị cao, dẫn đến giá thành sản phẩm cao (Trần Minh Tâm, 1998). 6.5. Bảo quản bằng phương pháp kết hợp Có thể kết hợp biện pháp bảo quản lạnh với biện pháp bảo quản bằng hóa chất để giúp sản phẩm bảo quản được lâu hơn, ngon hơn. 11 CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Phương tiện 1.1. Địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm khu A của khoa NN – TNTN, trường Đại Học An Giang. 1.2. Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ tháng 8/2007 đến tháng 3/2008. 1.3. Thiết bị và dụng cụ Autoclave (Memmert – Đức), máy chiết xơ FIWE, bếp cách thủy (Memmert – Đức) Lò nung (Memmert – Đức), tủ ấm (Memmert – Đức), tủ sấy (Memmert – Đức) Tủ cấy vô trùng, bộ chưng cất đạm, cân phân tích, bơm chân không Becher, bình tam giác, phễu lọc G4, buret, pipette, crucible, giấy lọc Các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm 1.4. Hóa chất -NaOH, SnCl2 , KMnO4 ,AgNO3,HCl đậm đặc,Axetat chì, kali sorbat -Na2SO4 bão hòa hoặc Na2HPO4 bão hòa,CuSO4.5H2O -H2SO4 0,1N, NaOH 0,1N,Chất xúc tác K2SO4/CuSO4: 10/1 -Chỉ thị hỗn hợp (metyl red: 2 g + metyl blue: 1 g + cồn 60%→ 100 ml) -N-octanol, cồn tuyệt đối, muối seignette, Phenolphtalein 1 % MRS agar là môi trường tổng hợp đặc hiệu cho việc nuôi cấy vi khuẩn lactic, tên đầy đủ là DE MAN, ROGOSA and SHARPE. 2. Phương pháp thí nghiệm 2.1.Thu thập mẫu Mẫu nước măng chua được lấy từ 04 nơi gồm Mỹ Xuyên được kí hiệu là MX, Mỹ Bình được kí hiệu là MB, An Châu được kí hiệu là AC và Long Xuyên được kí hiệu là LX. Tại 12 địa điểm lấy khoảng 300 ml lần lượt là MX1, MX2, MX3, MB1, MB2, MB3, AC1, AC2, AC3, LX1, LX2, LX3 và tất cả là 12 mẫu . Măng tre Điền Trúc được mua tại vườn măng của ông Võ Văn Em ngụ tại ấp Long An, xã Long Kiến, huyện Chợ Mới, tỉnh An Giang 2.2. Phân tích thành phần nguyên liệu Nguyên liệi là măng tre Điền Trúc, thời gian thu họach từ tháng 5 – tháng 9 Mục đích: phân tích thành phần nguyên liệu để tạo cơ sở cho việc bố trí các thí nghiệm tiếp theo. Các chỉ tiêu cần phân tích: Ẩm độ: phương pháp sấy khô ở nhiệt độ 105oC đến khối lượng không đổi. Đạm tổng số: phương pháp Kjedahl. 12 Cấy vào ống thạch nghiêng Ủ ở 370C trong 2 ngày Hút 0.1ml cấy vào đĩa petri Nước măng chua Cấy chuyền ra đĩa thạch Tách ròng Trữ ở 40C Axit tổng số: xác định bằng phương pháp chuẩn độ NaOH. Xianua: TCVN 6181 – 1996 Đường tổng số, xơ thô ( phương pháp Weende) 3.Các thí nghiệm Nuôi cấy thuần: là phương pháp nuôi cấy một dòng vi khuẩn thuần khiết được sinh ra qua nhiều thế hệ từ một tế bào ban đầu phân chia vô tính. 3.1.Qui trình phân lập vi khuẩn acit lactic Hình 3:Sơ đồ các bước phân lập vi khuẩn 3.2.Thí nghiệm 1:Kiểm tra khả năng lên men lactose của vi khuẩn lactic 3.2.1.Mục đích: tìm ra dòng vi khuẩn cho khả năng lên men tốt nhất Thử khả năng lên men đường của dòng vi khuẩn phân lập được xem thời gian chuyển hóa đường thành axit trong bao lâu. Định lượng axit tổng số được sinh ra theo thời gian. 3.2.2.Bố trí thí nghiệm: Hình 4: Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng lên men đường. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, ba lần lặp lại,lên men ở nhiệt độ phòng 13 Cấy dòng vi khuẩn lactic 0.1% Lên men A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 D2 D3 Cho vào bình tam giác 250ml Đường lactose 4% A1 là dòng vi khuẩn lactic MX1 C1 là dòng vi khuẩn lactic AC1 A2 là dòng vi khuẩn lactic MX2 C2 là dòng vi khuẩn lactic AC2 A3 là dòng vi khuẩn lactic MX3 C3 là dòng vi khuẩn lactic AC3 B1 là dòng vi khuẩn lactic MB1 D1 là dòng vi khuẩn lactic LX1 B2 là dòng vi khuẩn lactic MB2 D2 là dòng vi khuẩn lactic LX2 B3 là dòng vi khuẩn lactic MB3 D3 là dòng vi khuẩn lactic LX3 3.4.3.Thực hành thí nghiệm Chuẩn bị 3600 ml dung dịch đường lactose 4% và muối 3% muối , rồi cho vào 12 bình tam giác 250 ml. Mỗi bình tam giác chứa 300ml dung dịch đường lactose 4%, Dùng giấy nhôm bịt kín miệng các bình tam giác lại, tiến hành thanh trùng ở nhiệt độ 90 – 950C trong 15 – 30 phút. Lấy ra để cho dung dịch đường nguội. Sau đó, cấy 0.1% vi khuẩn thuần của 12 dòng vi khuẩn phân lập được vào các bình tam giác, lắc nhẹ để vi khuẩn phân tán đều trong dịch đường. Đậy kín nắp, chuyển các bình tam giác vào tủ ấm ủ ở 370C. Tiến hành phân tích hàm lượng axit tổng số theo ngày 0, 2, 4, 6, 8… 3.5.Thí nghiệm 2:Kiểm tra khả năng lên men đường lactose, saccharose, thốt lốt, fructose, glucose của các dòng vi khuẩn 3.5.1.Mục đích Thí nghiệm này là tìm lọai đường thích hợp nhất để bổ sung đường cho quá trình lên men măng chua. Trong phạm vi luận văn này, chúng tôi chọn các lọai đường như đường fructose, lactose, saccharose, glucose, đường thốt lốt cho quá trình khảo sát. Hình 5 :Qui trình kiểm tra khả năng lên men đường 14 Rót vào lọĐậy nắp lọ Ủ ấm khoảng 37°C Phân tích axit tổng số ngày 0, ,4,6,8,.. Thanh trùng (90 – 95°C trong 15 – 30 phút) Nồi hấp tiệt trùng Chủng vi khuẩn lactic Làm nguội đến 40 – 45°C 8 gam đường + 6 g NaCl 186 ml nước cất Khuấy đều 3.5. 2.Bố trí thí nghiệm Với A là yếu tố khuẩn lạc vi khuẩn lactic ( Mật độ vi khuẩn lactic là 108 CFU/ml ) Với B là yếu tố dung dịch từng lọai đường : B1=saccarose, B2 = lactose, B3= glucose, B4 = fructose, B5= thốt lốt Với C là yếu tố thời gian C1 = ngày 0; C2 = ngày 2; C3 = ngày 4; C4 = ngày 6; C5= ngày 8 3.5.3.Thực hành thí nghiệm Chuẩn bị 200 ml dung dịch các lọai đường 4% các lọai bằng cách pha từng lọai đường , muối và nước cất theo tỷ lệ 8 gam đường + 6 gam muối + 186 ml nước, rồi cho vào các bình tam giác 250 ml. Mỗi bình tam giác chứa 200ml dung dịch đường lactose 4%, saccharose 4%, Thốt lốt 4%, fructose 4%, glucose 4% . Dùng giấy nhôm bịt kín miệng các bình tam giác lại, tiến hành thanh trùng ở nhiệt độ 90 – 950C trong 15 – 30 phút. Lấy ra để cho dung dịch đường nguội bớt. Sau đó, cấy dòng vi khuẩn phân lập được vào các bình tam giác ở nồng độ 4% ( lắc nhẹ để vi khuẩn phân tán đều trong dịch đường. Đậy kín nắp, chuyển các bình tam giác vào tủ ấm ủ ở Ủ ấm khoảng 37°C. ) Tiến hành phân tích hàm lượng axit tổng số theo ngày 0,2,4,6, 8… Chỉ tiêu theo dõi Hàm lượng axit tổng số sinh ra trong các dung dịch đường theo thời gian. 15 Chủng vi khuẩn lactic 0.1% Dung dịch đường 4%+ NaCl 3% Ủ ở 37°C A B 2B1 B3 B4 B5 C 1 C 2 C 3 C 4 C 5 C 1 C 2 C 3 C 4 C 5 C1C2C3C4C5 C1C2C3C4C5 C1C2C3C4C5 Phân tích 3.5.4.. Sơ đồ sản xuất chung Măng tươi ↓ Xử lý sơ bộ ↓ Chần 1phút ở 100oC → Cho vào keo → Lên men → thanh trùng → Sản phẩm ↑ bổ sung VK lactic 0.1% thuần, đường , muối, phụ liệu Hình 6 :qui trình sản xuất măng muối chua được đề nghị 3.5.5. Giải thích qui trình Xử lý sơ bộ : loại bỏ vỏ bên ngoài, cắt bỏ phần cứng, già, rửa sạch, cắt thành từng miếng nhỏ. Chần: nhằm làm giảm bớt độc tố xianua có trong măng, tiêu diệt các vi sinh vật có hại, tạo màu sắc và cấu trúc tốt cho sản phẩm. Phối chế : bổ sung vi khuẩn lactic thuần , đường, muối trong giai đoạn lên men để đẩy nhanh tiến trình lên men, hạn chế hoạt động của các vi khuẩn gây hại, rút ngắn thời gian sản xuất ra sản phẩm. Chắt nước chua: nước chua sau khi lên men chứa rất nhiều vi khuẩn lactic, chúng sản sinh nhiều axit lactic. Đến giai đoạn nào đó, lượng acit này sẽ ức chế ngược lại vi khuẩn lactic, tạo điều kiện cho nấm men, nấm mốc hoạt động làm cho sản phẩm hư hỏng nhanh chóng . Thanh trùng nước chua: nhằm hạn chế hoạt động của vi khuẩn lactic, giúp sản phẩm được bảo quản lâu hơn Điều vị: nhằm tạo vị chua, mặn, ngọt hài hòa trong sản phẩm cuối. 3.6. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng thời gian chần đến màu sắc, cấu trúc và sự giảm hàm lượng xianua trong măng. 3.6.1. Mục đích: cách xử lý nguyên liệu thích hợp cho quá trình lên men. 3.6.2. Bố trí thí nghiệm Măng ↓ Làm sạch ↓ Luộc (100oC) T1 T2 T3 16 ↓ Lên men …… → Thành phẩm Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với ba lần lặp lại Với T1 = 10 phút T2 = 20 phút T3 = 30 phút 3.6. 3.thực hành thí nghiệm: Măng được loại bỏ vỏ bên ngoài, cắt bỏ phần cứng, già, cắt măng thành từng khúc ngắn. Cho măng vào nồi nước, nấu sôi. Khi nước sôi mới tính thời gian Chỉ tiêu theo dõi: Phân tích hàm lượng xianua trong măng sau khi luộc. Đánh giá cảm quan về màu sắc và cấu trúc sản phẩm theo phương pháp cho điểm. 3.7. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của công thức phối chế đến quá trình lên men 3.7.1.Mục đích: chọn ra tỉ lệ phối chế hỗn hợp chủng vi khuẩn lactic thuần chủng, muối, đường thích hợp cho quá trình lên men để tạo được sản phẩm có chất lượng cao nhất. 3.7.2.Bố trí thí nghiệm: Với V (%) là nồng độ vi khuẩn ( mật độ vi khuẩn lactic là 108 cfu / ml ): V1 = 0; V2 = 0,05; V3 = 0,1 Với D (%) là nồng độ đường: D1 = 3, D2 = 5, D3 = 7 Với E (%) là nồng độ muối: E1 = 2, E2 = 3, E3 = 4 Măng ………….. Phối trộn V1 V2 V3 D1 D2 D3 D1 D2 D3 D1 D2 D3 E1E2E2 E1E2E3 E1E2E3 E1E2E3 E1E2E3 E1E2E3 E1E2E3 E1E2E3 E1E2E3 Lên men ….. Thành phẩm 17 3.7. 3.Phương pháp tiến hành: Măng sau khi luộc ở thời gian thích hợp nhất, để cho nguội và ráo nước, cắt măng thành từng miếng nhỏ, cho vào keo. Bổ sung cà rốt, gừng, tỏi, ớt với tỷ lệ măng / (cà rốt + gừng + tỏi + ớt) là :10/2. Pha dung dịch phối chế ở từng mức độ khác nhau của các yếu tố: vi khuẩn, đường, muối. Nước sử dụng trong công thức phối chế phải được nấu sôi, để nguội. Cho dung dịch phối chế vào keo, gài nén cho măng chìm hẳn trong dung dịch phối chế. Tiến hành quá trình lên men. Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá cảm quan về mùi vị, màu sắc và cấu trúc sản phẩm thu được theo phương pháp cho điểm. Xác định lượng axit tổng số theo thời gian (ngày 0, ngày 2, ngày 4, ngày 6, ngày 8). 3.8. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men 3.8.1.Mục đích: tìm ra nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn lactic hoạt động, nhằm đẩy nhanh tiến trình lên men, rút ngắn thời gian sản xuất ra sản phẩm. 3.8.2.Bố trí thí nghiệm: Măng …. Lên men vi khuẩn lactic thuần (0,1 %) T1 T2 T3 Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với ba lần lặp lại. Với mật độ vi khuẩn lactic là 108 CFU/ml : T1 = 28-32oC (nhiệt độ phòng ). T2 = 37oC T3 = 40oC Chú ý: % tính trên thể tích dung dịch phối chế. 3.8.3.Phương pháp tiến hành: Măng được luộc ở thời gian thích hợp và cắt thành từng miếng nhỏ. Công đoạn lên men bổ sung tỷ lệ vi khuẩn/đường/muối tối ưu trong thí nghệm 2. Đặt mẫu vào tủ ấm với hai mức nhiệt độ khác nhau và ở nhiệt độ phòng. Kết quả ghi nhận: 18 Xác định hàm lượng axit tổng số trong thời gian lên men (ngày 0, 2, 4, 6, 8). 3.9. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường: muối trong dịch phối chế đến hương vị của sản phẩm sau khi lên men 3.9.1.Mục đích: điều vị cho sản phẩm có vị chua, mặn, ngọt hài hòa. 3.9.2.Bố trí thí nghiệm: Măng lên men Thanh trùng nước chua Điều vị M1 M2 M3 D1 D2 D3 D1 D2 D3 D1 D2 D3 Bảo quản Thành phẩm Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với ba lần lặp lại. Với M (%) là nồng độ muối: M1 = 1, M2 = 2, M3 = 3 Với D (%) là nồng độ đường: D1 = 13, D2 = 14, D3 = 15 Chú ý: % tính trên thể tích dung dịch phối chế. 3.9.3.Phương pháp tiến hành: Măng được cho lên men với các nồng độ vi khuẩn, đường, muối và ở nhiệt độ tối ưu. Loại bỏ nước chua của quá trình lên men, rửa măng với nước sạch, để cho ráo nước và xếp măng vào keo. Pha dung dịch điều vị ở ba mức độ khác nhau của hai yếu tố: đường, muối Dung dịch điều vị được nấu sôi, để nguội rồi cho vào keo măng. Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá cảm quan về độ hài hòa giữa vị chua, mặn, ngọt của sản phẩm theo phương 19 pháp cho điểm. 3.10. Thí nghiệm 7: Khảo sát thời gian bảo quản 3.10.1.Mục đích: xác định thời gian bảo quản sản phẩm tốt nhất ở các điều kiện thường, điều kiện lạnh ( 5 – 10oC ) với điều kiện có và không có sử dụng chất bảo quản ( kali sorbat ). 3.10.2.Bố trí thí nghiệm: -Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với ba lần lặp lại. -Sản phẩm sau khi được thanh trùng được theo dõi thời gian bảo quản. Với A1 là măng chua bảo quản ở nhiệt độ thường không hóa chất bảo quản Với A2 là măng chua bảo quản ở nhiệt độ lạnh không hóa chất bảo quản Với A3 là măng chua bảo quản ở nhiệt độ thường có hóa chất bảo quản Với A4 là măng chua bảo quản ở nhiệt độ lạnh hóa chất bảo quản Với T là thời gian bảo quản T1 = ngày 0 T3 = ngày 14 T2 = ngày 07 T4 = ngày 21 T5 = ngày 28 Măng lên men ............. Thanh trùng nước chua Lọc Điều vị Xếp keo Bảo quản A1 A2 A3 A4 T1T2T3T4T5 T1T2T3T4T5 T1T2T3T4T5 T1T2T3T4T5 Thành phẩm 3.10.3. Phương pháp tiến hành Nước chua sau khi được chắt ra và được thanh trùng ở 75oC với mức thời gian đã chọn 20 và sau đó đem đi lọc, xếp keo, điều vị, đóng nắp và đem đi bảo quản ở trong 02 điều kiện thường và điều kiện lạnh ( 5 – 10oC ) theo thời gian và ở hai lọai có sử dụng chất chống mốc và không sử dụng chất chống mốc ( kali sorbat 0.1%). Chỉ tiêu theo dõi: Khảo sát mật số vi sinh vật, nấm mốc, nấm men theo thời gian bảo quản là ( 0 ngày, 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày, 28 ngày, .....) 3.11. Phân tích, đánh giá chất lượng măng chua thành phẩm Các chỉ tiêu phân tích: đạm tổng số, đường tổng số, axit tổng số, xianua trong măng chua thành phẩm. 3.12. Phân tích thống kê Các số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Stagraphics XV.I và vẽ đồ thị biểu diễn bằng phần mềm Microsoft Excel. 21 CHƯƠNG IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1.Kết quả thu các mẫu nước măng chua và phân lập vi khuẩn lactic Hút 100 μl mẫu nước măng chua cho vào các đĩa petri ủ ở 37oC từ hai đến ba ngày thì các khuẩn lạc mọc lên nhiều, chúng tôi nhận thấy khuẩn lạc mọc tốt và có thể cấy chuyền sang đĩa petri. Kết quả từ bốn mẫu nước chua chia mỗi mẫu thành 03 mẫu nhỏ kí hiệu là MX1, MX2, MX3, MB1, MB2, MB3, AC1, AC2, AC3, LX1, LX2, LX3 Sau 24 giờ tiến hành đo pH với những thông số thu được như sau Bảng 3 : Độ pH của các mẫu nước măng chua Mẫu nước chua pH MX1 MX2 MX3 MB1 MB2 MB3 LX1 LX2 LX3 AC1 AC2 AC3 4,41 4,48 4,44 4,85 4,82 4,80 4,65 4,62 4,65 4,75 4,70 4,70 Sau khi đo pH hút 100 μl mẫu nước chua cho vào các đĩa petri ủ ở 280C từ hai đến ba ngày thì các khuẩn lạc mọc lên nhiều, chúng tôi nhận thấy khuẩn lạc mọc tốt và có thể cấy chuyền sang đĩa petri. Kết quả từ 12 mẫu nước chua, chúng tôi phân lập được 12 dòng vi khuẩn mọc tốt trên môi trường MRS agar, ký hiệu từ MX1 đến AC3. 2.Phân lập các dòng vi khuẩn lactic: kết quả phân lập được 12 dòng vi khuẩn lactic ở các mẫu nước măng chua được trình bày ở các hình sau đây 22 Hình 7 :Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic MB1 trong môi trường MRS agar Hình 8: Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic MB2 trong môi trường MRS agar Hình 9: Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic MB3 trong môi trường MRS agar Hình 10: Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic LX1 trong môi trường MRS agar 23 Hình 11 : Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic LX2 trong môi trường MRS agar Hình12: Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic LX3 trong môi trường MRS agar Hình 13:Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic MX1 trong môi trường MRS Hình 14 Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic MX2 trong môi trường MRS Hinh 24 Hình 15: : Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic MX2 trong môi trường MRS Hinh 16 : Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic AC1 trong môi trường MRS Hinh 17 : Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic AC2 trong môi trường MRS Hinh 18: Các khuẩn lạc và vi khuẩn lactic AC3 trong môi trường MRS 25 Hầu hết các khuẩn lạc đều có dạng mô tròn, về màu sắc các khuẩn lạc đếu có màu trắng đục, khi già có màu nâu. Bảng 4:Kết quả phân lập 12 dòng vi khuẩn lactic được quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần Mẫu Dòng vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc Đặc điểmvi khuẩn Hình dạng Màu sắc Hình cầu Hình que 1 MX1 Tròn, nhỏ, mô Nâu ۷ 2 MX2 Tròn, nhỏ, mô Nâu ۷ 3 MX3 Tròn, mô Trắng đục ۷ 4 AC1 Tròn, mô Trắng đục ۷ 5 AC2 Tròn, nhỏ, mô Trắng đục ۷ 6 AC3 Tròn, nhỏ, mô Trắng đục ۷ 7 LX1 Tròn, nhỏ, mô Nâu ۷ 8 LX2 Tròn, nhỏ, mô Trắng đục ۷ 9 LX3 Tròn, mô Trắng đục ۷ 10 MB1 Tròn, nhỏ, mô Trắng đục ۷ 11 MB2 Tròn, nhỏ, mô Trắng đục ۷ 12 MB3 Tròn, nhỏ, mô Trắng đục ۷ 3.Kết quả kiểm tra khả năng lên men đường lactose của vi khuẩn lactic Để kiểm tra khả năng lên men trên cùng 01 lọai đường lactose có cùng một nồng độ 4% và cùng mật số 0,1 % của12 dòng vi khuẩn phân lập được và 01 mẫu đối chứng . Khảo sát khả năng lên men bằng cách phân tích lượng axit tổng số sinh ra theo thời gian. Nếu dòng vi khuẩn nào cho axit tổng số cao nhất và thời gian ngắn nhất sẽ được chọn để sử dụng cho quá trình chế biến măng tre lên men tiếp theo Bảng 5: Kết quả kiểm tra khả năng lên men lactic của 12 dòng vi khuẩn và một dòng đối chứng trên đường lactose 4% được trình bày ở bảng sau Nghiệm thức ( NT ) Acit tổng số ( % ) theo các ngày lên men 0 2 4 6 8 1 0,416233a 1,05553ab 2,36103abc 2,22213abcd 1,9444ab 2 0,4169a 1,1111abc 2,22217ab 1,94437abc 2,36103abc 3 0,416533a 1,66663abcd 2,4999abc 1,9444abc 1,9444ab 4 0,416933a 1,38887abc 3,33323bcd 1,38887a 1,52773a 5 0,416667a 1,8055bcd 2,7777abcd 1,52773ab 1,52773a 6 0,416233a 1,6666abcd 3,19433abcd 1,80553abc 1,94437ab 7 0,4169a 1,9444cd 3,05543abcd 1,9444abc 2,08327abc 8 0,416533a 2,22213d 2,7777abcd 2,6388bcd 2,08327abc 9 0,416933a 1,66663abcd 2,6388abcd 2,36103bcd 2,6388bc 10 = LX1 0,416667a 1,9444cd 3,88873d 3,33323d 2,77767bc 11 0,4092a 1,38887abc 3,611cd 2,63883bcd 2,36103abc 12 0,417067a 1,94437cd 3,611cd 2,36103bcd 2,49993abc 13 0,4164a 0,584667a 1,83233a 2,95367cd 3,32167c 26 Ghi chú : sự khác biệt ý nghĩa thống kê chỉ có ý nghĩa theo cột. Các giá trị trung bình cùng chữ thể hiện sự khác biệt thống kê ở độ tin cậy 95% NT1 :Dòng vi khuẩn LAB phân lập được từ mẫu Mỹ Xuyên 1 ( MX1) NT2 :Dòng vi khuẩn LAB phân lập được từ mẫu Mỹ Xuyên 2 ( MX2) NT3 :Dòng vi khuẩn LAB phân lập được từ mẫu Mỹ Xuyên 3 ( MX3) NT4 :Dòng vi khuẩn LAB phân lập được từ mẫu Mỹ Bình 1 ( MB1) NT5 :Dòng vi khuẩn LAB phân lập được từ mẫu Mỹ Bình 2 ( MB2) NT6 :Dòng vi khuẩn LAB phân lập được từ mẫu Mỹ Bình 3 ( MB3) NT7 :Dòng vi khuẩn LAB phân lập được từ mẫu An Châu 1 ( AC1) NT8 :Dòng vi khuẩn LAB phân lập được từ mẫu An Châu 2 ( AC2) NT9 :Dòng vi khuẩn LAB phân lập được từ mẫu An Châu 3 ( AC3) NT10 :Dòng vi khuẩn LAB phân lập được từ mẫu Long Xuyên 1( LX1) NT11 :Dòng vi khuẩn LAB phân lập được từ mẫu Long Xuyên 2 ( LX2) NT12 :Dòng vi khuẩn LAB phân lập được từ mẫu Long Xuyên 3 ( LX3) NT13 :Dòng vi khuẩn LAB từ mẫu đối chứng ( ĐC ) Qua bảng 5 ta thấy rằng ở ngày 0 và ngày 2 không có sự khác biệt về mặt thống kê ở các mẫu. Tuy nhiên, đến ngày thứ 4 thì có sự khác biệt, đặc biệt mẫu LX1 cho kết quả axit tổng số cao nhất với thời gian lên men ngắn nhất. Vì vậy, đây là dòng LAB tốt nhất được chọn cho quá trình lên men măng chua sau này. 4.Kết quả kiểm tra khả năng lên men 05 loại đường lactose, saccharose, glucose, đường thốt lốt, và fructose Để kiểm tra khả năng lên men trên 05 lọai đường lactose, saccharose, fructose, glucose và thốt lốt của dòng vi khuẩn phân lập được vừa chọn từ thí nghiệm1 ( LX1 ) .Chúng tôi tiến hành nuôi cấy dòng vi khuẩn này trong môi trường các lọai đường trên ở cùng nồng độ 4% với mật số vi khuẩn 0.1% theo thể tích dịch đường ( Mật độ vi khuẩn lactic là 108 cfu/g ) và ủ ấm khoảng 28-32°C ( nhiệt độ phòng ) Sau đó, khảo sát khả năng lên men bằng cách phân tích lượng axit tổng số sinh ra theo thời gian. Nếu lọai đường nào cho axit tổng số cao nhất và thời gian ngắn nhất sẽ được chọn cho việc bổ sung trong quá trình chế biến măng tre lên men tiếp theo Bảng 6 : Kết quả thống kê axit tổng số theo thời gian lên men của dòng LX1 trên 05 lọai đường lactose 4%, saccarose 4%, glucose 4% va thốt lốt 4% Ngày lactose saccarose glucose thot lot fructose 0 0,4167a 0,25a 0,75a 0,5a 0,5a 2 0,611067a 0,326667a 0,7222a 0,58331a 0,972133ab 4 2,44433b 1,72213b 0,777767a 1,3055c 2,19437b 6 3,30543c 2,74703c 1,38883b 1,4442d 3,111d 8 1,8333b 3,06783d 1,72213c 1,1944bc 1,27773b 10 1,8055b 2,85667cd 3,16657d 1,16662b 1,44439b Chú ý: Các số liệu thống kê chỉ có ý nghĩa theo cột. Các chỉ số có cùng chữ thể hiện sự 27 khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ ý nghĩa 95 %. Hàm lượnng acit theo các lọai đường 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0 2 4 6 8 10 Thời gian ( ngày ) A ci t t ổ ng s ố ( % ) lactose saccarose glucose thot lot fructose Hinh 19 : Hàm lượng axit sinh ra theo thời gian của 05 lọai đường Kết quả trình bày trong bảng 6 cho thấy dòng LX1 đều có khả năng sinh axit lactic từ 05 lọai đường lactose 4%, saccharose 4%, glucose 4% và thốt lốt 4%. Trong đó, khả năng sinh axid cao nhất với thời gian ngắn nhất trên dung dịch đường lactose. Ở các mẫu đường glucose, lactose, và saccharose vẫn cho kết quả lên men tốt, nhưng thời gian dài hơn, nồng độ axit thấp hơn đường lactose. Đặc biệt, ngoại trừ đường thốt lốt không cho kết quả lên men tốt.Tuy nhiên, giá thành đường saccarose vẫn rẽ nhất và so với các đường khác vẫn không có sự khác biệt về mặt thống kê. Vì vậy, đường saccharose là lọai thích hợp nhất được chọn bổ sung cho quá trình lên men măng chua sau này. 5. Phân tích thành phần măng tre Điền trúc Bảng 7: Kết quả phân tích thành phần măng tre Điền trúc Chỉ tiêu Kết quả (*) Độ ẩm, % Đạm tổng, % thô Đường tổng, % Xơ, % Axit toàn phần, % Xianua, mg/kg 82,28 8 9,06 2,92 0,87 0,23 289,12 (*) Kết quả là trung bình của 3 lần lặp lại Trong lên men rau quả muối chua, đường là nguồn quan trọng để tích tụ axit lactic. Theo kết quả phân tích ở bảng 7, măng tre Điền trúc có hàm lượng đường tương đối thấp chưa đáp ứng đủ nhu cầu lên men. Vì thế cần phải bổ sung lượng đường vừa đủ giúp quá trình lên men diễn ra tốt. Măng tre có chứa một hàm lượng xianua nhất định, nếu không được chế biến kỹ sẽ gây ngộ độc cho người tiêu dùng. Do đó, trước khi lên men cần phải luộc măng kỹ với nước sôi để xianua hòa tan vào nước và bay hơi, làm giảm độc tố xianua. 6. Kết quả thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng thời gian chần đến màu sắc, cấu trúc và sự giảm hàm lượng xianua trong măng 28 Măng tre cần được luộc kỹ trong một thời gian nhất định nhằm làm giảm hàm lượng xianua mà vẫn giữ được màu sắc đẹp và cấu trúc giòn. Để tìm được cách xử lý nguyên liệu thích hợp cần tiến hành khảo sát nhiều chế độ xử lý khác nhau. Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát ba chế độ xử lý nguyên liệu khác nhau Bảng 8: Kết quả kiểm tra ảnh hưởng của cách xử lý nguyên liệu đến màu sắc, cấu trúc và hàm lượng xianua của măng được trình bày ở bảng sau Luộc Điểm màu sắc Điểm cấu trúc Hàm lượng xianua (mg/kg) 100oC, 10 phút 100oC, 20 phút 100oC, 30 phút 4,000b 4,667c 3,000a 2,000a 4,667c 3,667b 133,667c 73,000b 31,667a Quá trình luộc măng giúp đuổi khí trong gian bào, làm tăng tính thẩm thấu, tiêu diệt một số vi sinh vật bên ngoài, giúp quá trình lên men diễn ra tốt, sản phẩm sau khi lên men có màu sắc đẹp, cấu trúc giòn, đồng thời làm giảm được hàm lượng xianua một cách đáng kể. Màu sắc và cấu trúc sản phẩm sau khi lên men phụ thuộc nhiều vào thời gian và nhiệt độ xử lý nguyên liệu. Khi luộc măng, dưới tác dụng của nhiệt sẽ làm bất hoạt một số enzym như: polyphenoloxydase, peroxydase, chlorophyllase giữ cho màu sắc của nguyên liệu không bị xấu đi. Tuy nhiên, khi kéo dài thời gian luộc sẽ làm cho sản phẩm trở nên mềm, ít giòn, có màu sắc kém đặc trưng do vách tế bào bị phá vỡ, protopectin chuyển thành pectin, một số hợp chất màu bị phá hủy, hòa tan vào nước. Thời gian luộc măng có ảnh hưởng đến màu sắc, cấu trúc và sự giảm hàm lượng xianua trong măng. Theo kết quả thống kê ở bảng 8 thì chế độ luộc ở 100oC trong thời gian 20 phút sẽ cho sản phẩm có điểm trung bình về màu sắc và độ giòn cao nhất so với các mẫu khác. Chế độ luộc ở 100oC trong thời gian 30 phút làm giảm hàm lượng xianua nhiều hơn, tuy nhiên lại cho sản phẩm có điểm trung bình về màu sắc và độ giòn thấp nhất. Quá trình lên men ở giai đoạn sau cũng làm giảm được độc tố xianua, do đó ta chọn chế độ luộc ở 100oC trong thời gian 20 phút để xử lý nguyên liệu. 7.Kết quả thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của công thức phối chế đến quá trình lên men Các thành phần được sử dụng để phối chế có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men. Mỗi thành phần có tác dụng nhất định đối với quá trình lên men. Bổ sung vi khuẩn lactic thuần sẽ rút ngắn thời gian lên men, mật số vi khuẩn lactic và lượng axit tổng đạt được cao hơn, tạo hương vị đặc trưng hơn cho sản phẩm so với sản phẩm được sản xuất theo phương pháp truyền thống. Đường là nguồn dinh dưỡng quan trọng của vi khuẩn lactic. Muối làm hạn chế sự phát triển của các vi khuẩn tạp. 7.1. Ảnh hưởng của lượng vi khuẩn lactic bổ sung đến quá trình lên men của sản phẩm 7.1.1. Ánh hưởng của lượng vi khuẩn lactic bổ sung đến mật số vi khuẩn lactic (cfu/ml) trong thời gian lên men Bảng 9:Kết quả kiểm tra mật số vi khuẩn lactic sinh ra theo thời gian lên men được trình bày ở bảng sau Vi khuẩn (%) Mật số vi khuẩn lactic ( log10/ml) 0 ngày 2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày 0 6,60927a 6,72907b 7,01536c 7,15625d 7,24055e 0,05 6,60927a 6,981b 7,18893c 7,26717d 7,33746e 29 0,1 6,60927a 7,17493b 7,37566e 7,36361d 7,3216c Chú ý: Các chỉ số có cùng chữ thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ ý nghĩa 95 %. Trong những ngày đầu của quá trình lên men vi khuẩn lactic tăng sinh khối mạnh do có nguồn cơ chất dồi dào. Từ bảng 9 ta thấy có sự tương tác tỷ lệ thuận giữa lượng vi khuẩn lactic bổ sung và mật số vi khuẩn lactic đạt được. Ở mẫu không bổ sung vi khuẩn lactic thuần chủng, vi khuẩn lactic tăng sinh khối chậm nhưng tăng đều đặn từ ngày đầu cho đến ngày cuối của quá trình lên men. Ở mẫu bổ sung 0,05 % vi khuẩn lactic thì sinh khối của chúng tăng mạnh hơn so với mẫu không bổ sung vi khuẩn lactic, đến ngày 6, ngày 8 thì tăng chậm. Khi bổ sung 0,1 % vi khuẩn lactic, mật số vi khuẩn lactic đếm được là cao nhất và tăng mạnh mẽ trong những ngày đầu nhưng đến ngày 6, ngày 8 thì giảm do lượng axit lactic tạo thành ức chế sự phát triển của vi khuẩn lactic. Rõ ràng, với lượng vi khuẩn lactic bổ sung là 0,1 % thì mật số vi khuẩn đếm được trong dịch lên men cao hơn so với mẫu bổ sung 0,05 % và 0 % vi khuẩn. 7.1.2. Ảnh hưởng của lượng vi khuẩn lactic bổ sung đến sự sản sinh axit tổng số (%,tính theo acit lactic) theo thời gian lên men lên men 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0 2 4 6 8 Ngày lên men Ax it tổ ng s ố ( % , t ín h th eo ax it lac tic ) 0 % vi khuẩn 0,05 % vi khuẩn 0,1 % vi khuẩn Hình 20: Ảnh hưởng của lượng vi khuẩn lactic bổ sung đến lượng axit lactic sinh ra theo thời gian lên men Vi khuẩn sản sinh axit mạnh nhất trong những ngày đầu. Theo đồ thị hình 20, cho thấy lượng vi khuẩn lactic bổ sung là 0,1 % thì hàm lượng axit lactic sản sinh ra mạnh mẽ từ ngày 0 đến ngày 4, sang ngày thứ 6 thì tăng chậm, đến ngày thứ 8 thì tăng rất ít. Ở những mẫu bổ sung 0,05 % vi khuẩn lactic, hàm lượng axit tổng số thấp hơn ở mẫu bổ sung 0,1 % vi khuẩn nhưng lượng axit tổng tăng đều hơn trong suốt thời gian lên men. Ở những mẫu không bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic, lượng axit tăng dần từ ngày đầu đến ngày cuối của quá trình lên men nhưng thấp hơn ở những mẫu bổ sung 0,05 % và 0,1 % vi khuẩn. Điều này cho thấy tỷ lệ 0,1 % vi khuẩn sẽ kết thúc sớm giai đoạn đầu của quá trình lên men, rút ngắn được thời gian sản xuất. 7.1.3. Ảnh hưởng của lượng vi khuẩn lactic bổ sung đến giá trị cảm quan của sản phẩm 30 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 0 % vi khuẩn 0,05 % vi khuẩn 0,1 % vi khuẩn Mẫu Đ iể m c ảm q ua n Màu sắc Cấu trúc Mùi vị Hình 21: Ảnh hưởng của lượng vi khuẩn lactic bổ sung đến giá trị cảm quan Ở những mẫu không bổ sung vi khuẩn lactic thuần chủng, quá trình lên men diễn ra chậm, yếu nên không tạo được màu sắc, cấu trúc và mùi vị đặc trưng cho sản phẩm. Ở tỷ lệ vi khuẩn bổ sung là 0,05 % và 0,1 %, quá trình lên men diễn ra mạnh mẽ, đều tạo được màu sắc, cấu trúc tốt cho sản phẩm. Tuy nhiên, tỷ lệ 0,1 % vi khuẩn lactic bổ sung sản sinh được nhiều axit lactic nhất nên sản phẩm có hương vị đặc trưng nhất, cho điểm trung bình về mùi vị cao nhất. Tổng hợp các kết quả nhận thấy: khi xem xét ảnh hưởng của tỷ lệ vi khuẩn lactic bổ sung đến mật số vi khuẩn lactic, sự sản sinh hàm lượng axit tổng số và giá trị cảm quan của sản phẩm ta chọn tỷ lệ 0,1 % vi khuẩn để phối chế là tốt nhất. 7.2. Ảnh hưởng của lượng đường bổ sung đến quá trình lên men sản phẩm Đường là nguồn cơ chất quan trọng cho quá trình lên men. Đường có ảnh hưởng tới sự tăng sinh khối của vi khuẩn lactic. Hàm lượng đường tự nhiên trong nguyên liệu không đáp ứng đủ nhu cầu cho vi khuẩn lactic vì thế cần phải bổ sung đường vào dịch lên men. Tuy nhiên, khi nồng độ đường trong dịch lên men cao, việc gia tăng mật số vi khuẩn lactic có thể chậm lại do hoạt động của vi khuẩn lactic bị hạn chế. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát ở ba nồng độ đường là 3 %, 5 % và 7 %. 7.2.1. Ảnh hưởng của lượng đường bổ sung đến mật số vi khuẩn lactic (CFU/ml) trong thời gian lên men Bảng 10: Kết quả kiểm tra mật số vi khuẩn lactic sinh ra theo thời gian lên men được trình bày ở bảng sau Đường (%) Mật số vi khuẩn lactic( log10 / ml ) 0 ngày 2ngày 4 ngày 6ngày 8ngày 3 6,63679a 7,17898b 7,27184c 7,30255d 7,9983e 5 6,66219a 7,20978b 7,2634c 7,29535d 7,98277e 7 6,60141a 7,01242b 7,22789c 7,27875d 7,30899e Chú ý: Các số liệu thống kê chỉ có ý nghĩa theo hàng. Các chỉ số có cùng chữ thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ ý nghĩa 95 %. Bảng 10 cho thấy với ba mức độ đường là 3 %, 5 %, 7 % thì mật số vi khuẩn lactic đều tăng mạnh những ngày đầu và tăng chậm ở ngày 6, ngày 8 của quá trình lên men do hoạt động của vi khuẩn lactic bị giảm ở giai đoạn cuối của chu kỳ sinh trưởng. Ở mức độ là 3 %, mật số vi khuẩn lactic đếm được là cao nhất, kế đến là mẫu bổ sung 5 % đường và thấp nhất ở mẫu bổ sung 7 % đường. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt 31 thống kê. 7.2.2. Ảnh hưởng của lượng đường bổ sung đến sự sản sinh axit tổng số theo thời gian lên men Hình 22: Ảnh hưởng của lượng đường bổ sung đến axit tổng số trong thời gian lên men Đồ thị hình 22 cho thấy, hàm lượng axit đều tăng dần ở các mẫu trong quá trình lên men. Với các tỷ lệ đường khác nhau, lượng axit sinh ra khác nhau. Lượng axit sinh ra cao nhất ở mẫu bổ sung 3 % đường, kế đến là mẫu bổ sung 5 % đường và thấp nhất ở mẫu bổ sung 7 % đường. Điều này cho thấy, nồng độ đường là 5 % và 7 % trong dịch lên men đã ức chế hoạt động của vi khuẩn lactic nên lượng axit sinh ra thấp hơn. 7.2.3. Ảnh hưởng của lượng đường bổ sung đến giá trị cảm quan của sản phẩm 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 3% đường 5% đường 7% đường Mẫu Đ iể m c ảm q ua n Màu sắc Cấu trúc Mùi vị Hình 23: Đồ thị diễn ảnh hưởng của đường bổ sung đến giá trị cảm quan Màu sắc, cấu trúc, mùi vị sản phẩm chịu ảnh hưởng của quá trình lên men. Đồ thị hình 23 cho thấy mẫu có lượng đường 3 % cho sản phẩm có điểm cảm quan trung bình cao nhất; 3,6 điểm về màu sắc; 4,0 điểm về cấu trúc và 3,9 điểm về mùi vị. Mẫu bổ sung 5 % đường cho điểm cảm quan trung bình thấp hơn mẫu bổ sung 3 % đường. Mẫu có 7 % đường cho sản phẩm có màu sắc, cấu trúc và mùi vị kém nhất. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê. Tổng hợp các kết quả nhận thấy: khi xem xét ảnh hưởng của lượng đường đến mật số vi khuẩn lactic, hàm lượng axit tổng số và giá trị cảm quan của sản phẩm ta chọn mẫu có 3 % đường để phối chế là tốt nhất. 7.3. Ảnh hưởng của lượng muối bổ sung đến quá trình lên men Muối có tính chất sát trùng, hạn chế sự hoạt động của các vi khuẩn gây thối, tăng cường 32 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0 2 4 6 8 Ngày lên men Ax it tổ ng s ố ( % , t ín h th eo a xi t la ct ic ) 3 % đường 5 % đường 7 % đường sự hoạt động của vi khuẩn lactic, làm cho đường cùng với nước trong nguyên liệu thoát ra môi trường để cung cấp cho vi khuẩn lactic. Nhờ vậy tạo điều kiện lên men tốt và sản phẩm có hương vị thơm ngon. Tuy nhiên, nồng độ muối cao sẽ hạn chế cả hoạt động của vi khuẩn lactic làm quá trình lên men diễn ra yếu. Trong thí nghiệm này, có 3 nồng độ muối được khảo sát là 2 %, 3% và 4 %. 7.3.1. Ảnh hưởng của lượng muối bổ sung đến mật số vi khuẩn lactic (cfu/ml) trong thời gian lên men Bảng 11:Mật số vi khuẩn lactic sinh ra theo thời gian lên men được trình bày ở bảng sau Muối (%) Mật số vi khuẩn lactic ( log10 cfu/ ml ) 0 ngày 2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày 2 6,67006a 6,99826b 7,22789c 7,27875d 7,30899e 3 6,63679a 7,17898b 7,22789c 7,27184d 7,30255e 4 6,66219a 6,98277b 7,21775c 7,2634d 7,29535e Chú ý: Các số liệu thống kê chỉ có ý nghĩa theo hàng. Các chỉ số có cùng chữ thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ ý nghĩa 95 %. Với các nồng độ muối khác nhau, mật số vi khuẩn lactic đều tăng trong suốt thời gian lên men, chúng nhân sinh khối mạnh trong các ngày 0, 2, 4 đến ngày 6, 8 thì tăng chậm. Bảng 11 cho thấy có sự tương tác tỷ lệ nghịch giữa lượng muối bổ sung và mật số vi khuẩn lactic đếm được. Mẫu có nồng độ muối trong dịch lên men là 2 %, vi khuẩn lactic tăng sinh khối mạnh hơn mẫu có nồng độ muối là 3 % và 4 %. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê. 7.3.2. Ánh hưởng của lượng muối bổ sung đến sự sản sinh axit tổng số (%, tính theo axit lactic) trong thời gian lên men 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0 2 4 6 8 Ngày lên men A xi t tổ ng s ố ( % , t ín h th eo a xi t la ct ic ) 2 % muối 3 % muối 4 % muối Hình 24: ảnh hưởng của muối bổ sung đến axit tổng số trong thời gian lên men Trong suốt quá trình lên men, ở những tỷ lệ muối khác nhau, lượng axit tổng số sinh ra trong sản phẩm đều tăng. Đồ thị hình 24 cho thấy có sự tương tác tỷ lệ nghịch giữa lượng muối bổ sung và lượng acit sinh ra. Lượng axit sinh ra cao nhất ở mẫu bổ sung 2 % muối, thấp nhất ở mẫu bổ sung 4 % muối. Rõ ràng, lượng muối là 2 % trong dịch lên men giúp hạn chế được hoạt động của các vi khuẩn có hại nhưng vi khuẩn lactic vẫn hoạt động tốt nên lượng acit sinh cao. Lượng muối trong dịch lên men là 3 % và 4 % đã hạn chế hoạt động của các vi khuẩn có hại và cả vi khuẩn lactic nên quá trình lên men diễn ra yếu, lượng axit sinh ra thấp. 33 7.3.3. Ánh hưởng của lượng muối bổ sung đến giá trị cảm quan của sản phẩm 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 2 % muối 3% muối 4% muối Mẫu Đ iể m c ảm q ua n Màu sắc Cấu trúc Mùi vị Hình 25: ảnh hưởng của của lượng muối bổ sung đến giá trị cảm quan Đồ thị hình 25 cho thấy sản phẩm có nồng độ muối 4 % cho điểm cảm quan trung bình về màu sắc, cấu trúc và mùi vị thấp nhất. Sản phẩm có nồng độ muối 3 % cho điểm cảm quan trung bình về màu sắc, cấu trúc và mùi vị thấp hơn sản phẩm có nồng độ muối 2 %. Sản phẩm có nồng độ muối 2 % cho điểm trung bình về màu sắc, cấu trúc và mùi vị cao nhất. Sự khác biệt bày có ý nghĩa về mặt thống kê. Tổng hợp các kết quả ta nhận thấy: khi xem xét ảnh hưởng của lượng muối đến mật số vi khuẩn lactic, lượng axit tổng số và giá trị cảm quan của sản phẩm ta chọn nồng độ 2 % muối để phối chế là tối ưu. 8. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men Ở nhiệt độ thường, quá trình lên men vẫn diễn ra nhưng dễ bị các vi khuẩn gây thối, nấm men, nấm mốc xâm nhập làm cho sản phẩm bị biến màu, mềm nhũn và có vị lạ. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát ở 3 mức nhiệt độ là 28-32oC (nhiệt độ phòng ) , 37oC và 40oC. Hàm lượng acit tổng số theo thời gian 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 2 4 6 8 10 Ngày lên men A c it t ổ n g s ố ( % ) 28-32oC 37oC 40oC Hình 26: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến lượng axit tổng số trong thời gian lên men Đồ thị hình 26 cho thấy trong suốt thời gian lên men, lượng axit tổng số ở các mẫu đều 34 tăng đến một thời gian thì axit lại giảm là do quá trình độ pH trong lên men men giảm làm ức chế lại vi khuẩn lactic . Ở nhiệt độ nhiệt độ phòng (28 – 32oC) và nhiệt độ 40oC, lượng axit tổng tăng một cách đều đặn đến ngày thì 6 thì bắt đầu giảm xuống. Tuy nhiên, lượng axit tổng sinh ra ở nhiệt độ phòng và 40oC thấp hơn ở nhiệt độ 37oC và thời gian lên men lại dài hơn , vi khuẩn lactic hoạt động yếu nhất nên lượng axit tổng sinh ra thấp nhất. Từ kết quả trên ta nhận thấy nhiệt độ 37oC là thích hợp nhất cho hoạt động của vi khuẩn lactic nên ta chọn nhiệt độ 37oC cho quá trình lên men sản phẩm. 9. Kết quả thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường: muối trong dịch phối chế đến hương vị của sản phẩm sau khi lên men Trong nước chua, mật số vi khuẩn lactic rất cao, nếu không thanh trùng thì lượng axit sinh ra sẽ ức chế ngược lại chúng, nấm sợi và nấm men sẽ phát triển làm cho sản phẩm hư hỏng nhanh chóng. Do đó, sản phẩm sau khi lên men phải loại chắt nước chua, đem thanh trùng nước và lọc . Sau đó, cái ( không thanh trùng ) được phối chế với dung dịch gồm: đường, muối, nước chua đã thanh trùng nhằm điều vị và bảo quản. Bảng 12: Kết quả kiểm tra ảnh hưởng của tỷ lệ muối: đường: nước chua trong dịch phối chế đến mùi vị sản phẩm sau khi lên men dược trỉnh bày ở bảng sau Tỷ lệ đường (%) Tỷ lệ muối (%) Tỷ lệ nước chua (%) Mùi vị 13 1 0,5 3,5bcd 1,0 4,0cde 1,5 3,0abc 2 0,5 4,0cde 1,0 4,5de 1,5 3,5bcd 3 0,5 3,0abc 1,0 3,0abc 1,5 2,5ab 14 1 0,5 3,5bcd 1,0 4,0cde 1,5 3,5bcd 2 0,5 4,5de 1,0 5,0e 1,5 4,0cde 3 0,5 3,0abc 1,0 3,5bcd 1,5 2,5ab 15 1 0,5 3,0abc 1,0 3,5bcd 1,5 2,5ab 2 0,5 4,0cde 1,0 4,5de 1,5 3,5bcd 3 0,5 2,0a 1,0 3,0abc 1,5 2,0a 35 Chú ý :Những chữ số trong cùng một cột có cùng mẫu tự khác biệt không có nghĩa về mặt thống kê ở mức 95 %. Các thành phần: muối, đường, nước chua có ảnh hưởng rất lớn đến mùi vị của sản phẩm sau khi lên men. Theo kết quả thống kê ở bảng 12, tỷ lệ 14 % đường: 2 % muối: 1 % nước chua cho sản phẩm có vị chua, mặn, ngọt hài hòa, đặc trưng nhất, đạt điểm cảm quan cao nhất so với các mẫu khác. Do đó, chúng tôi chọn tỷ lệ này để phối chế. 10. Ảnh hưởng của thời gian thanh trùng đến khả năng bảo quản sản phẩm 10.1. Đánh giá về màu sắc, cấu trúc sản phẩm sau khi thanh trùng 0 1 2 3 4 5 10 phút 20 phút 30 phút Thời gian thanh trùng Đ iể m c ả m q u a n Màu sắc Cấu trúc Hình 27: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian thanh trùng đến màu sắc, cấu trúc của sản phẩm Đồ thị hình 27 cho thấy thời gian thanh trùng là 10 phút cho sản phẩm có điểm cảm quan trung bình cao nhất; 4,7 điểm về màu sắc; 4,4 điểm về cấu trúc. Khi kéo dài thời gian thanh trùng, sản phẩm bị tái màu và độ giòn bị giảm nhiều. Do đó, mẫu được thanh trùng 20 phút cho điểm trung bình thấp hơn mẫu được thanh trùng 10 phút. Mẫu được thanh trùng 30 phút cho điểm cảm quan trung bình thấp nhất. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê. 10.2. Ảnh hưởng của thời gian thanh trùng và điều kiện bảo quản đến sự thay đổi lượng axit tổng số trong quá trình bảo quản Các mức thanh trùng khác nhau có ảnh hưởng khác nhau đến quá trình lên men. Khi tăng thời gian thanh trùng sản phẩm thì cường độ của quá trình lên men bị giảm. 0,66 0,665 0,67 0,675 0,68 0,685 0,69 0,695 0,7 10 phút 20 phút 30 phút 10 phút 20 phút 30 phút 5 - 10oC 28 - 32oC Thời gian thanh trùng và nhiệt độ bảo quản A xi t t ổn g số ( % , t ín h th eo a xi t la ct ic ) Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Hình 28: Axit tổng số của sản phẩm ở thời gian thanh trùng và điều kiện bảo quản 36 Khi bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ phòng (28 – 32oC) và nhiệt độ 5 – 10oC , các mẫu được thanh trùng trong thời gian 10 phút, 20 phút, 30 phút đều có lượng acit tổng tăng dần trong thời gian bảo quản. Tuy nhiên, lượng axit tổng tăng khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê. Thời gian thanh trùng sản phẩm càng lâu thì sản phẩm càng an toàn về mặt vi sinh nên có thể bảo quản lâu hơn. Theo kết quả thống kê, các sản phẩm được thanh trùng trong thời gian 20 phút và 30 phút không đạt được các chỉ tiêu về màu sắc và độ giòn, lượng axit tổng không cao do một phần vi khuẩn lactic đã bị tiêu diệt. Đồ thị hình 28 cho thấy: mẫu được thanh trùng trong thời gian 10 phút có lượng axit tổng số cao nhất sao với các mẫu được thanh trùng trong thời gian 20 phút và 30 phút. Tổng hợp các kết quả ta chọn thời gian thanh trùng sản phẩm là 10 phút và tùy theo điều kiện có thể bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ 5 – 10oC hay nhiệt độ phòng (28 – 32oC). 11. Khảo sát thời gian bảo quản sản phẩm Bảng 13 : Tổng số vi sinh vật hiếu khí, tổng số nấm mốc, nấm men theo thời gian bảo quản Thời gian bảo quản Tổng số vi khuẩn hiếu khi gia (log cfu/ml ) Tổng số nấm mốc, nấm men (log cfu/ml ) TK TC LK LC TK TC LK LC Tuần 0 3,94a 4,89a 3,37a 3,95a 2,37a 3,08a 2,74a 2,394a Tuần 1 4,33a 6,09c 5,18b 4,19b 4,48b 5,93c 5,46c 3,46b Tuần2 4,1a 5,52b 5,37b 4,35c 4,48b 5,72c 5,42c 3,60c Tuần3 6,47b 5,16a 5,12b 4,40d 6,53c 5,3b 5b 3,70d Tuần4 6,68b 5,16a 5,59b 4,20b 6,73c 5,28b 4,93b 4.01e Chú ý :Những chữ số trong cùng một cột có cùng mẫu tự khác biệt không có nghĩa về mặt thống kê ở mức 95 %. TK :Mẫu bảo quản ở nhiệt độ phòng, không có chất bảo quản TC :Mẫu bảo quản ở nhiệt độ phòng, có chất bảo quản LK :Mẫu bảo quản lạnh (5-10ooC ) , không có chất bảo quản LC: Mẫu bảo quản lạnh (5-10ooC ) , có chất bảo quản Theo bảng 13, cho thấy rằng khi bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ phòng (28 – 32oC) và nhiệt độ 5 – 10oC có chất bảo quản và không có chất bảo quản , các mẫu đều có mật số vi sinh vật, nấm mốc nấm men tăng đều ở ba tuần đầu và có chiều hướng tăng chậm hoặc giảm ở tuần thứ 4 trở di. Nguyên nhân, là do thành phần dinh dưỡng trong sản phẩm giảm, do pH dung dịch giảm.Tuy nhiên, lượng mật số vi sinh vật, nấm mốc nấm men của mẫu LC tăng chậm nhất.Vì vậy, phương pháp bảo quản ở nhiệt độ 5-10oC có chất bảo quản được chọn để bảo quản sản phẩm là thích hợp nhất. 37 12. Kết quả phân tích thành phần măng chua thành phẩm Hình 29: Sản phẩm măng chua thành phẩm Bảng 14: Thành phần hóa học của măng chua thành phẩm Chỉ tiêu Kết quả (*) Độ ẩm, % Đường tổng số, % Đạm tổng số, % thô Muối, % Xơ, % Axit toàn phần, % Xianua, mg / kg 89,04 8 8,13 7,75 2,67 0,82 0,69 24,47 (*) Kết quả là trung bình của 3 lần lặp lại 38 CHƯƠNG V :KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi rút ra được một số kết luận như sau: Trong các lọai nước măng chua đều có chứa vi khuẩn lactic . Trong 12 dòng vi khuẩn phân lập được thì dòng vi khuẩn LX1 có khả năng sinh axit tổng cao nhất. Saccharose được chọn trong 5 loại đường để bổ sung cho quá trình lên men măng chua tiếp theo Chế độ xử lý nguyên liệu: luộc ở 100oC trong thời gian 20 phút giúp sản phẩm lên men có màu sắc và cấu trúc tốt nhất. Công thức phối chế: 0,1 % vi khuẩn lactic: 2 % muối: 3 % đường giúp quá trình lên men diễn ra tốt, mật số vi khuẩn lactic, hàm lượng axit tổng số cao, đồng thời đáp ứng được yêu cầu cảm quan về màu sắc, cấu trúc và mùi vị. Hàm lượng xianua giảm hơn 10 lần. Về nhiệt độ lên men: nhiệt độ 37oC là thích hợp nhất cho quá trình lên men lactic, axit tổng thu được cao nhất. Tỷ lệ 14 % đường: 2 % muối: 1 % nước chua trong dịch phối chế giúp sản phẩm được điều vị sau khi lên men có mùi thơm đặc trưng, vị chua, mặn, ngọt hài hòa. Về bảo quản: thanh trùng sản phẩm ở 75oC trong thời gian 30 phút, có thể bảo quản ở nhiệt độ thấp 5 – 10oC có sử dụng kali sorbat 0.1%. 39 Quy trình công nghệ được đề xuất như sau: Măng tre ↓ Xử lý sơ bộ ↓ Luộc ở 100oC, 20 phút ↓ Cắt miếng nhỏ ↓ Phối trộn ↓ Lên men 4 ngày ở 37oC ↓ Chắt nước chua ↓ Thanh trùng ở 75oC, 10 phút ↓ Lọc ↓ Xếp keo 40 Dung dịch: Đường: 14 % Muối: 2 % Nước chua:1 % Dung dịch: Vi khuẩn: 0,1 % Đường: 3 % Muối: 2 % ↓ Phối chế → ↓ Bổ sung chất bảo quản ( kalisorbat 0.1% ) ↓ Đậy nắp ↓ Bảo quản ở nhiệt độ phòng (5– 10oC) Hình 30: Quy trình sản xuất măng chua đề nghị 2. Đề nghị Trong phương hướng nghiên cứu tới, đề nghị nghiên cứu một số vấn đề như sau: - Sản xuất măng chua với nhiều loại măng khác nhau để tìm ra loại măng thích hợp nhất, tạo ra được sản phẩm măng chua ngon nhất. - Nghiên cứu sản xuất giống vi khuẩn lactic để công nghiệp hóa quá trình lên men. 41 25.100.P PHỤ LỤC 1. Xác định độ axit toàn phần (Phạm Văn Sổ và Bùi Thị Nhu Thuận, 1991) 1.1. Nguyên lý Dùng dung dịch kiềm chuẩn (NaOH hoặc KOH) để trung hòa hết các axit trong thực phẩm, với phenolphtalein làm chỉ thị màu. 1.2. Hóa chất NaOH 0,1 Nhoặc KOH 0,1 N Dung dịch phenolphtalein 1 % trong cồn 90o. 1.3. Tiến hành Chuẩn bị mẫu thử: Cân thật chính xác khoảng 10 g thực phẩm. Nghiền nhỏ, lắc với nước trung tính trong 1 giờ. Sau đó, cho thêm nước trung tính vừa đủ 50 ml. Để lắng, lấy 25 ml nước trong ở trên để định lượng. Nếu thực phẩm là chất lỏng, lấy V ml và định lượng. Nếu thực phẩm có màu sẫm, có thể pha loãng với nước trung tính hoặc cồn trung tính để dễ nhận điểm chuyển màu. Cũng có thể dùng giấy quỳ hoặc giấy chỉ thị màu vạn năng làm chỉ thị màu (thử điểm chuyển màu bằng cách chấm một giọt dung dịch thử lên giấy chỉ thị màu). Định lượng: Cho vào bình tam giác 25 ml dịch thử và 5 giọt phenolphtalein. Chẩn độ bằng dung dịch NaOH cho đến khi dịch thử có màu hồng nhạt bền vững. 1.4. Tính kết quả Độ axit toàn phần tình theo phần trăm (%) theo công thức: X = Trong đó: n: số ml NaOH 0,1 N sử dụng để chuẩn độ 25 ml dịch thử P: trọng lượng mẫu thử (g) k: hệ số của loại axit. Với thực phẩm lên men chua lactic k = 0,009 2. Xác định hàm lượng đường tổng số