Đề tài Nuôi cấy mô sẹo và tế bào đơntạo và chọn dòng đột biến thu nhận các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học

NUƠI CẤY MƠ SẸO VÀ TẾ BÀO ĐƠNTẠO VÀ CHỌN DỊNG ĐỘT BIẾN THU NHẬN CÁC CHẤT THỨ CẤP CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC GV hướng dẫn:Võ Thị Xuyến Nhĩm thực hiện:Trịnh Thị Huyền Huỳnh Thị Kim Chi Bùi Thị Thu Hương Nguyễn Anh Thư Vương Thị Ngọc Diệp Ngơ Như Ngọc Lê Thị Anh Đào  A-Nuơi cấy mơ sẹo B-Nuơi cấy dịch huyền phù tế bào đơn C- Nuơi cấy tế bào để sản xuất hợp chất thứ cấp A-NUƠI CẤY MƠ SẸO 1-Sự hình thành mơ sẹo 2-Sự hình thành chồi từ mơ sẹo 3-Tính bất định về mặt di truyền 4-So sánh vi nhân giống và nuôi cấy mô sẹo 1-Sự hình thành mơ sẹo Cơ sở sinh lí:tính tồn năng Mơ sẹo là một khối tế bào (Mơ sẹo từ rễ cây cúc gai) - Sự hình thành mơ sẹo gồm 3 giai đoạn : phát sinh mơ sẹo phân chia tế bào biệt hĩa - tế bào nhu mơ và thành phần tế bào râybiệt hĩa tế bào những chất liệu cấu tạo nhu mơ các loại,các tế bào rây...hơn nữa hình thành mơ phân sinh(trung tâm của sự tạo nên chồi và rễ)mơ sẹo Một vấn đề quan tâm trong nuơi cấy mơ sẹo: sự biến tính tế bào do độ già của mẫu sự thay đổi tế bào chất của nhân thời gian duy trì điều kiện nuơi cấy thành phần mơi trường, nhất là chất sinh trưởng 2-Sự hình thành chồi từ mơ sẹo Được điều khiển bằng: Các chất sinh trưởng đi vào mơi trường Điều kiện nuơi cấy. Dịch chiết Tỷ lệ cytokinin/auxin Quá trình hình thành chồi xảy ra qua 2 giai đoạn: tái phân hĩaxảy ra quá trình chuyển các tế bào biệt hĩa thành mơ sẹo hình thành các mầm mống cơ quansử dụng các phương pháp phù hợp tổng hợp DNA và protein xảy ra rất mạnh, hàm lượng đường cũng tăngcác mơ sẹo hình thành cấu trúc hình tháitạo chồi 3-Tính bất định về mặt di truyền NCMS: biến dị tế bào soma(biến dị về chất lượng , số lượng và năng suất và biến dị này khơng di truyền. ). Tần số biến dị thì hồn tồn khác nhau và khơng lặp lại. Nhân tố thường gây ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyền. 4-So sánh vi nhân giống và nuôi cấy mô sẹo Vi nhân giống :tách đỉnh chồi hoặc mô phân sinh  khử trùngđưa vào nuôi cấy ở môi trường phù hợpChồichồi nhân lêntách chồi chuyển sang môi trường mới và qui trình cứ thế được lặp lại. cho hệ số nhân thấp hơn ,nhưng các chồi nhân giữ lại được những đặc điểm của phôi gốc, ít hoặc không bị thay đổi về mặt di truyền. Nuơi cấy tb đơn Những hệ thống NC DHPTB đơn ST và TĐC ở tb thực vật trong NC batch TT ổn định về ST và TĐC trong hệ thống NC liên tục mở Tạo và chọn dịng ĐB qua NCTB NCTB đơn cây mía và tạo dịng chống chịu amino acid NUƠI CẤY TẾ BÀO ĐƠN: Là nuơi cấy dịch huyền phù chứa nhiều tế bào liên kết với nhau. Dịch huyền phù được tạo ra do sự nuơi cấy một mảnh mơ sẹo cĩ khả năng biệt hĩa trong mơi trường lỏng, và được chuyển động trong suốt thời gian nuơi cấy. NHỮNG HỆ THỐNG NC DHPTB ĐƠN: Nuơi cấy batch trên máy lắc: Nuơi cấy batch trên qui mơ cơng nghiệp: Hệ thống nuơi cấy liên tục kín: Hệ thống nuơi cấy liên tục mở: ST VÀ TĐC Ở TBTV TRONG NC BATCH: Trong suốt giai đoạn lag-phase, tb giai đoạn stasionary-phase trong NC phát triển một sinh khối tổng hợp TBC mới và các cơ quan tử liên hệ, lặp lại DNA và bắt đầu phân chia. Kế là giai đoạn cĩ tốc độ phân bào giới hạn khơng đổi và cực đại→thể tích tb trung bình giảm nhanh. Sự ST bắt đầu giảm, và tb đi vào giai đoạn stasionary-phase. TÌNH TRẠNG ỔN ĐỊNH VỀ ST VÀ TĐC TRONG NHỮNG HTNC LIÊN TỤC MỞ: Trong mơi trường nuơi cấy đơn thì trạng thái ổn định kéo dài cĩ thể đạt được. Trạng thái cân bằng của tế bào: Cĩ đặc tính được xác định bằng: số tb đầu tiên, thể tích tb đậm đặc, trọng lượng khơ tb, tp protein, DNA và RNA, tốc độ hơ hấp. Cĩ tốc độ khơng đổi đồng hĩa nitrogen, khơng đổi nồng độ các amino acid và sự hoạt động của các enzyme cĩ liên quan đến sự đồng hĩa nitrogen, và trong hơ hấp protein. Khi tình trạng ổn định được thiết lập trong chemostat, MTNC cũng cĩ tp khơng đổi. Turbidostat cĩ thể được sử dụng để khảo sát, trong NC đạt tới tốc độ cao sx sinh khối tương tự, chất điều hịa ST kiểm sốt sự cân bằng giữa sự phân bào và sự nở lớn của tb. CHỌN VÀ TẠO DỊNG ĐB QUA NCTB: ĐB chống chịu amino acid: ĐB chống chịu bệnh: ĐB chống chịu mặn: ĐB chống chịu nhiệt: NCTB ĐƠN MÍA VÀ CHỌN DỊNG TB CHỐNG CHỊU AMINO ACID: Tạo mơ sẹo: cấy Tái sinh cây từ mơ sẹo: Kỹ thuật tách và NCTB đơn trong MT lỏng: cấy đặt trên máy lắc lọc và gạn dd Kỹ thuật gieo tb đơn trên đĩa petri và tái sinh cây từ tb đơn: gieo Mảnh mơ sẹo MT dd bán rắn Mơ sẹo Bình tam giác Huyền phù Huyền phù (3-5 ngày tuổi) MT thạch Mơ sẹo Chồi… Ảnh hưởng của Lysine, Thrionine, Methionine và Homoserine đến ST của mơ sẹo, cây con, cụm chồi, tb đơn mía. cấy Chọn dịng tb chống chịu ngược Lys+Thr (2mM+2mM) và khảo xác hàm lượng amino acid của dịng chống chịu Cấy cấy lại cấy Chồi mía MT thạch Lys+Thr(0,5-2mM) Mơ sẹo sống sĩt LT2 MT khơng cĩ Lys+Thr MT cĩ Lys+Thr Dịng mơ sẹo MT mới Thu nhận C- Nuơi cấy tế bào để sản xuất hợp chất thứ cấp 1. Các hợp chất thứ cấp thực vật 2.Nuơi cấy tế bào thực vật 3. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật 4. Ứng dụng nuơi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học 1. Các hợp chất thứ cấp thực vật -Tiến hố của thực vật: là sản phẩm của các phản ứng hĩa học giữa thực vật với mơi trườngchất độc,màu sắc và hương vị đặc biệtvai trò hết sức quan trọng trong quá trình đấu tranh sinh tồn -Con người: các hợp chất dùng làm hĩa học ,dược liệu hoặc phụ gia thực phẩm cĩ giá trị. Những chất thứ cấp như: alkaloid, antibiotic, tinh dầu, resin,taxol, tannin, các glycoside, sterol, polysaccharide, hormone thực vật và saponin. Các chất trao đổi thứ cấp cĩ thể xếp trong ba nhĩm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside. Các alkaloid Họ alkaloid gồm: codein,nicotine, caffeine và morphinetác dụng lên hệ thần kinh,hệ cơ,mạch máu,bộ máy hơ hấp,làm thuốc chữa bệnh. Cà độc dược Trà xanh và quả thuốc phiện Cây cà phê Các tinh dầu chất mùi, chất thơm và dung mơi. Giống như những lipit khác,khơng tan trong nước. Các glycoside thuốc nhuộm, chất mùi thực phẩm và dược phẩm. 2.Nuơi cấy tế bào thực vật 2.1-Phương pháp tái sinh mơ sẹo và dịch huyền phù: khối callusđặt trong mơi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy)tế bào dịch huyền phù nuơi cấy callusnuơi cấy trên mơi trường rắntế bào mơ sẹo 2.2-Phương pháp chọn lọc dịng đột biến: a)Kỹ thuật dịng hĩa tế bào đơn: Nguyên tắc: dựa trên kỹ thuật trải tế bào trên đĩa petri cĩ agar Cĩ 2 kĩ thuật thường được sử dụng để trải tế bào: -Nuơi cấy khối mơ sẹo dinh dưỡng bên trên lớp tế bào được trải để lớp tế bào này nhận những chất thúc đẩy sinh trưởng tiết ra từ mơ sẹo. -Nuơi cấy tế bào trên mơi trường điều kiện. b)Phát sinh đột biến : Chất gây đột biếnnhững dịng tế bào đơn bội những dịng tế bào đột biến với tỉ lệ cao c) chọn dịng tế bào đột biến  3. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật Điều kiện tích lũy các hợp chất thứ cấp: Tối ưu hĩa điều kiện nuơi cấy Chọn lọc các dịng tế bào cho năng suất cao Cung cấp tiền chất c dịng tế bào cho năng suất cao Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation). Quá trình thu nhận các chất cĩ hoạt tính sinh học được điều khiển bởi nhiều nhân tố khác nhau 4.Những thành tựu trong nuơi cấy tế bào thực vật sản xuất các hoạt chất sinh học Nuơi cấy tế bào các lồi Taxus nguồn taxol và dẫn xuất taxane của nĩ nuơi cấy dịch huyền callus cĩ nguồn gốc thân và lá cây T. Mairei(Đài Loan)  sản xuất khoảng 200 mg taxol. nuơi cấy tế bào huyền phù của cây Angelica dahurica var. Formosanasản xuất imperatorin chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến Nuơi cấy callus rễ của cây Panax ginseng(nhân sâm)  saponins và sapogenins dược phẩm quý giáchữa bệnh rối loạn tiêu hĩa, bệnh đái đường, suy nhược cơ thể Nuơi cấy tế bào cây Podophyllum peltatum và Podophyllum hexandrum Podophyllotoxin  điều trị chống khối u 5.Thu nhận taxol từ nuơi cấy mơ cây thơng đỏ- dược phẩm chủ yếu trong hố trị ung thư Phần 1: Tổng quan về thơng đỏ: Taxus wallichiana zucc - Giới :Plantae - Ngành : Pinophyta - Lớp: Pinopsida - Bộ : Pinales - Họ : Taxaceae - Các chi:Taxaceae Cephalotaxaceae -Phân bố :Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Myanmar, Philippines, Indonesia, Nepal, Afghanistan…  Một số giá trị từ cây thơng đỏ - Lá trị hen suyễn, viêm phế quản, nấc, tiêu hố. - Cành và trị bệnh thực tích, giun đũa; nước sắc của thân non dùng trị bệnh đau đầu. -Từ cây thơng đỏ  Taxol . Taxol chiết xuất từ vỏ các lồi: T.brevifolia, T. cuspidata, T. yunnanensis, T. baccata và T. wallichiana. Taxol chữa trị các bệnh ung thư Phần 2: Nuơi cấy thơng đỏ để thu nhận taxol Nuơi cấy tạo callus thơng đỏ Mẫu thực vật Xử lý mẫu thực vật Nuơi cấy tạo thành mơ sẹo Nuơi cấy trong mơi trường lỏng trong các bình thủy tinh cĩ dung tích nhỏ, lắc liên tục Nuơi cấy trong các thiết bị lên men cĩ dung tích lớn, khuấy đảo liên tục Ly tâm hoặc lọc Bã Dịch lọc được xử lý để thu nhận sản phẩm Đặc biệt, "Trong thời gian sắp tới, sẽ tiếp tục tiến hành thử nghiệm hình thức nuơi cấy tế bào thơng đỏ dạng bioreactor ("lắc lớn") trong mơi trường lỏng để cĩ thể tạo nguồn nguyên liệu tách chiết taxol một cách nhanh chĩng: Cứ 32.000 lít vừa tế bào vừa dung dịch được nuơi cấy dạng bioreactor sẽ thu được 1kg taxol". Xin chân thành cảm ơn cơ và các bạn đã lắng nghe