Đề tài Nuôi cấy in vitro hoa mười giờ

Chương 1. Mở đầu 1.1. Đặt vấn đề Hoa mười giờ (Portulaca grandiflora) là cây thân thảo thuộc họ rau sam, mặc dù là một lồi cây thân thảo phổ biến và dễ trồng nhưng chính nhờ tính đa dạng và màu sắc sặc sỡ mà lồi cây này mới giúp tơn lên vẻ đẹp của những khu vườn hay khuơn viên, đặc biệt là lúc hoa nở rộ. Nuơi cấy in vitro hoa mười giờ để khảo sát điều kiện sinh sống của hoa mười giờ trong ống nghiệm khác thế nào so với điều kiện bên ngồi, ở bên ngồi mơi trường tự nhiên hoa mười giờ rất dễ trồng và thời gian phát triển cũng khá nhanh nhưng khi tiến hành nuơi cấy in vitro mất khá nhiều thời gian thì mục đích chính là khảo sát tập tính cũng như điều kiện sống của hoa mười giờ. Đây là lồi cây thân cĩ nhiều lơng nhỏ gây khĩ khăn trong việc tạo nguồn mẫu vơ trùng. Đĩ là những bước nghiên cứu ban đầu làm tiền đề cho việc nghiên cứu nuơi cấy hoa mười giờ ra hoa trong ống nghiệm là một loại hình được khá nhiều người ưa thích vì nhìn rất đẹp, cĩ thể kinh doanh được, khơng phải chăm sĩc như hoa ngồi tự nhiên mà cây vẫn tươi tốt. Hoa mười giờ chính là đồng hồ sinh học vì cứ khoảng 8 – 10 giờ sáng là hoa nở rộ, nghiên cứu này cũng để khảo sát vấn đề này xem vì sao hoa mười giờ lại cĩ tập tính này, cũng như hoa quỳnh nở vào lúc 12 giờ đêm, đĩ chính là điều đặc biệt của lồi cây này nhưng khi nuơi cấy trong ống nghiệm với điều kiện khơng cĩ oxy cây vẫn phát triển tốt nhưng để cây ra hoa và nở cả ngày là điều khơng dễ chút nào vì nĩ phá vỡ quy luật tự nhiên của cây, đĩ là cứ 8 – 10 giờ cây mới cho hoa nở. Đây là vấn đề cần phải nghiên cứu khá lâu và mất nhiều thời gian. Là lồi cây rất phổ biến và dễ trồng nên nĩ cĩ giá trị kinh tế khơng cao khi chưa tiến hành nuơi cấy in vitro. Đây là bước đầu khai thác giá trị kinh tế của lồi cây này, mặc dù khá phổ biến nhưng đây cũng là một loại thuốc nam rất cơng dụng cùng với một số cây thuốc khác trong họ của nĩ như lồi rau sam rất tốt cho sức khỏe. 1.2. Mục đích và yêu cầu 1.2.1. Mục đích Nghiên cứu khả năng nuơi cấy mơ cây hoa mười giờ nhằm tạo nguồn mẫu vơ trùng ban đầu để cung cấp mẫu thực hiện các nghiên cứu tiếp theo là ra hoa trong ống nghiệm. 1.2.2. Yêu cầu Phải đưa được mẫu vào để tạo mẫu vơ trùng, khảo sát mẫu ban đầu ở các mơi trường bổ sung chất điều hịa tăng trưởng Chương 2: Tổng quan 2.1. Khái quát về kỹ thuật vi nhân giống 2.1.1. Khái niệm Kỹ thuật nhân giống in vitro hay nuơi cấy mơ và tế bào thực vật đều là thuật ngữ mơ tả các phương pháp nuơi cấy các cơ quan của thực vật trong ống nghiệm cĩ chứa mơi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khống, vitamin, đường và các chất điều hịa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vơ trùng (Dương Cơng Kiên, 2002). Kỹ thuật nuơi cấy mơ và tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mơ như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng. Trước kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hĩa chất đối với tế bào và mơ trong quá trình nuơi cấy. Những năm 70 của thế kỷ XX là thập niên của sự bùng nổ cơng nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là kỹ thuật nuơi cấy mơ và tế bào thực vật. Nĩ là cơng cụ nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học. Điều quan trọng nhất trong vi nhân giống là việc nghiên cứu vai trị và tác động của các chất điều hịa sinh trưởng thực vật nhằm kích thích sự hình thành chồi với số lượng lớn phục vụ cho cơng tác nhân giống. Trong vịng 30 năm trở lại đây, kỹ thuật vi nhân giống đã làm được một cuộc cách mạng lớn trong nhân giống thực vật và hiện nay người ta đang hướng tới mục tiêu áp dụng kỹ thuật này để sản xuất cây giống thương mại. Vi nhân giống đã trở thành một phương pháp nhân giống chuẩn và phổ biến đối với nhiều loại cây trồng như: cây cơng nghiệp, cây lâm nghiệp, cây cảnh, cây dược liệu, cây ăn trái và rau xanh. Phương pháp này cĩ những ưu điểm vượt trội so với phương pháp truyền thống: Cĩ khả năng tái sinh cây con từ các vùng mơ và cơ quan khác nhau của cây (trục thân, lĩng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn) mà ngồi tự nhiên khơng thể thực hiện được. Cĩ thể sản xuất được số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn, trên một diện tích nhỏ nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại. Cây con tạo ra đồng nhất về mặt di truyền. Tạo cây sạch virus thơng qua xử lý nhiệt hay nuơi cấy đỉnh sinh trưởng. Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm sốt được các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm,… Bảo quản nguồn giống cây in vitro với số lượng lớn nhưng lại chiếm diện tích rất nhỏ. Tạo cây cĩ khả năng ra hoa, tạo quả sớm. Tạo dịng tồn cây cái (cây chà là) hoặc tồn đực (cây măng tây) theo mong muốn. Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen. Bên cạnh những ưu điểm nổi bật thuận lợi cho mục đích nhân giống như đã được đề cập ở trên thì phương pháp vi nhân giống cũng cĩ những nhược điểm cần phải được khắc phục: Giá thành cây con được sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống cịn khá cao. Tiến trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần khoảng thời gian dài trước khi cĩ thể thích ứng trồng ngồi vườn ươm. Sự đa dạng của dịng sản phẩm nhân giống rất hạn chế, nghĩa là cây con tạo ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình. Cĩ thể xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hịa sinh trưởng được bổ sung vào mơi trường nuơi cấy. Hiện nay, vấn đề đáng quan tâm nhất trong việc áp dụng kỹ thuật vi nhân giống vào sản xuất thương mại là giá thành sản phẩm tạo ra cịn quá cao. Theo Kozai và cộng sự (1992), nguyên nhân chính của vấn đề này là sự thất thốt do nhiễm khuẩn và nấm trong quá trình nuơi cấy, tỷ lệ sống sĩt thấp của cây trong giai đoạn chuyển ra vườn ươm, giá nhân cơng lao động chiếm 60 – 70% tổng giá thành sản phẩm cần thiết trong quá trình cấy chuyền mẫu cấy sang mơi trường mới, giá thành trang thiết bị (thiết bị chiếu sáng, bình nuơi cấy,…) và nguyên liệu cơ bản (đường, agar,…) cịn khá cao. Việc cấy chuyền lặp lại nhiều lần làm giảm đáng kể sức sinh trưởng và phát triển của thực vật, cĩ khi cịn làm tăng tính bất thường về di truyền của tế bào. Tuy nhiên, hạn chế nghiêm trọng nhất trong kỹ thuật vi nhân giống là tỷ lệ sống sĩt của cây con sau khi chuyển ra vườn ươm thường rất thấp do sự khác biệt lớn giữa điều kiện mơi trường in vitro và ex vitro. 2.1.2. Các phương pháp nuơi cấy mơ tế bào thực vật Nuơi cấy đỉnh sinh trưởng Nuơi cấy đỉnh sinh trưởng bao gồm nuơi cấy chồi đỉnh và chồi bên. Sau khi vơ trùng, mẫu sẽ được nuơi cấy trên mơi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khống vơ cơ và hữu cơ hoặc mơi trường khống cĩ bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuơi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành một cây hồn chỉnh. Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thường. Nuơi cấy mơ sẹo Mơ sẹo là một khối tế bào phát triển vơ tổ chức, hình thành do sự phản phân hĩa của các tế bào đã phân hĩa. Mơ sẹo sẽ phát triển nhanh khi mơi trường cĩ sự hiện diện của auxin. Khối mơ sẹo cĩ khả năng tái sinh thành cây hồn chỉnh trong điều kiện mơi trường khơng cĩ chất kích thích tạo mơ sẹo. Nuơi cấy mơ sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật khơng cĩ khả năng nhân giống thơng qua nuơi cấy đỉnh sinh trưởng. Cây tái sinh từ mơ sẹo cĩ đặc tính giống như cây mẹ. Từ một cụm tế bào mơ sẹo cĩ thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuơi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn. Nuơi cấy tế bào đơn Khối mơ sẹo được nuơi cấy trong mơi trường lỏng và được đặt trên máy lắc cĩ tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn. Tế bào đơn được lọc và nuơi cấy trên mơi trường đặc biệt để tăng sinh khối. Với các cơ chất thích hợp được bổ sung vào trong mơi trường tế bào cĩ khả năng sản xuất các chất cĩ hoạt tính sinh học. Sau một thời gian nuơi cấy kéo dài trong mơi trường lỏng tế bào đơn được tách ra và trải trên mơi trường thạch. Khi mơi trường thạch cĩ bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành từng cụm tế bào mơ sẹo. Khi mơi trường thạch cĩ tỷ lệ cytokinin auxin thích hợp, tế bào đơn cĩ khả năng tái sinh thành cây hồn chỉnh. Nuơi cấy protoplast – chuyển gen Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, cĩ sức sống và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn cĩ. Trong điều kiện nuơi cấy thích hợp, protoplast cĩ khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hồn chỉnh (tính tồn thế ở thực vật). Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast cĩ khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng. Quá trình dung hợp protoplast cĩ thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng lồi hay khác lồi. Nuơi cấy hạt phấn đơn bội Hạt phấn ở thực vật được nuơi cấy trên những mơi trường thích hợp tạo thành mơ sẹo. Mơ sẹo này được tái sinh thành cây hồn chỉnh là cây đơn bội. 2.1.3. Những vấn đề trong nhân giống vơ tính in vitro Tính bất định về mặt di truyền Tính bất định về mặt di truyền là do tác động của một số chất kích thích sinh trưởng. Tần số biến dị thường khác nhau và khơng lặp lại. Việc nuơi cấy mơ sẹo tế bào đơn thường tần số biến dị cao hơn so với nuơi cấy đỉnh sinh trưởng. Tần số biến dị xảy ra cịn phụ thuộc các yếu tố: Kiểu di truyền hay giống cây nuơi cấy. Loại mơ cấy. Số lần cấy chuyền nhiều hay ít, trong đĩ loại biến dị về nhiễm sắc thể sẽ xuất hiện cao khi thời gian nuơi cấy kéo dài. Số lần cấy chuyền ít và thời gian cấy chuyền giữa hai lần ngắn sẽ làm giảm khả năng gây biến dị. Sự nhiễm mẫu Do mẫu nhiễm virus hay vi sinh vật. Cĩ thể giảm khả năng lại mẫu bằng cách: Sử dụng mẫu nuơi cấy là mơ phân sinh đỉnh. Sử dụng các loại kháng sinh như: Amphostericin B, Gentamicin, Vacomicin hoặc Penicillin với nồng độ phụ thuộc vào vật liệu nuơi cấy. Sự hĩa thủy tinh thể Hiện tượng thủy tinh thể là một dạng bệnh lý của cây, cây sẽ bị mất nước khi chuyển cây từ mơi trường in vitro ra mơi trường ngồi. Nguyên nhân là do cây in vitro cĩ lớp sáp ở bên ngồi biểu bì mỏng, tế bào chứa nhiều phân tử cĩ cực dễ dàng nhận các phân tử nước, về cấu tạo khí khổng của cây thường cĩ hình trịn thay vì hình elip như cây trong tự nhiên, khí khổng mở suốt trong quá trình nuơi cấy và mật độ khí khổng cao. Ngồi ra nhu mơ thịt lá và lớp mơ bảo vệ mặt ngồi của lá kém phát triển, tế bào chất kém đậm đặc, diệp lục ít so với các cây bình thường nên khi đưa cây ra mơi trường ngồi với điều kiện tự nhiên hồn tồn khác, cây khơng thể thích nghi dẫn đến stress và chết. Cĩ một số phương pháp hạn chế quá trình hĩa thủy tinh thể như sau: Giảm sự hút nước của cây trong in vitro bằng cách tăng nồng độ đường trong mơi trường cấy hoặc dùng các chất cĩ áp suất thẩm thấu cao. Tuy nhiên, điều này cĩ thể làm giảm sự tổng hợp của diệp lục tố và ức chế sự hình thành chồi. Tránh gây thương tổn trên mẫu cấy khi khử trùng và tiếp xúc với mơi trường cấy ít nhất. Ở một số lồi cĩ thể sử dụng chất ABA. Giảm nồng độ đạm trong mơi trường cấy. Giảm C2H2 trong bình nuơi cấy bằng cách thơng giĩ tốt, tăng cường ánh sáng và giảm nhiệt độ phịng cấy. 2.1.4. Ứng dụng của kỹ thuật nuơi cấy mơ Phương pháp nuơi cấy mơ và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số lĩnh vực như: Lai tạo giữa những lồi xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp (nuơi cấy tế bào trần). Nuơi cấy tế bào thực vật trong mơi trường lỏng (nuơi cấy huyền phù tế bào) trên quy mơ lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp. Chọn lọc tế bào cĩ những đặc điểm mong muốn, cho phát triển thành cây con thay vì chọn lọc cây ngồi đồng ruộng (nuơi cấy tế bào đơn). Sản xuất dịng cây đồng hợp tử (nuơi cấy bao phấn và túi phấn). Vi nhân giống những giống cây cĩ giá trị khoa học và thương mại. Bảo quản phơi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp. Nuơi cấy phơi sinh dưỡng, phơi hợp tử. Nuơi cấy quang tự dưỡng. 2.1.5. Sự khác nhau giữa nhân giống in vitro cây thân thảo và cây thân gỗ Các lồi cây thân gỗ ít cĩ khả năng tái sinh hơn các lồi cây thân thảo. Các nghiên cứu nhân giống trên cây thân gỗ được bắt đầu trễ hơn so với cây thân thảo. Việc cảm ứng sự trẻ hĩa ở cây thân gỗ khĩ hơn ở cây thân thảo. Tốc độ nhân giống cây thân gỗ thấp hơn cây thân thảo. Tác động của trạng thái hưu miên trên sự tăng trưởng của chồi và sự kéo dài của thân cây thân gỗ theo từng thời kì trong năm. Cây thân gỗ dễ bị ảnh hưởng bởi các chất độc tiết ra trong mơi trường nuơi cấy. Mơ của cây thân gỗ khĩ khử trùng hơn vì đại đa số mọc ở ngồi thiên nhiên. Cây thân gỗ và cây bụi thường được chọn lọc để nhân dịng sau khi cây đã trưởng thành. Ở giai đoạn này các mơ của cây thường rất khĩ hoặc khơng thể sử dụng được trong nhân giống in vitro. Sự đa dạng về mặt di truyền của cây thân gỗ lớn hơn so với cây nơng nghiệp và các loại cây thân thảo khác, do đĩ sau khi nhân giống sẽ thu được nhiều kết quả khác nhau khĩ kiểm sốt. Cây thân gỗ khơng thể trồng được trong nhà kính, vì vậy việc thu mẫu bị ảnh hưởng rất nhiều bởi điều kiện khí hậu và các điều kiện tăng trưởng khác. 2.1.6. Sự khác nhau giữa nhân giống in vitro và nhân giống in vivo Nhân giống vơ tính in vitro nhanh hơn nhân giống vơ tính in vivo. Cĩ thể tạo được một số lồi thực vật mà khơng thể tiến hành in vivo do nhân giống in vitro cĩ thể cảm ứng được sự trẻ hĩa của mơ. Sự tăng trưởng của những cây nhân giống vơ tính in vitro thường mạnh hơn những cây được nhân giống vơ tính in vivo vì những cây này đã được trẻ hĩa và sạch bệnh. Việc nhân giống cây in vitro tạo được những cây sạch bệnh do cĩ sự chọn lọc các đối tượng sạch bệnh để đưa vào nuơi cấy đồng thời cũng cĩ thể xử lý mẫu cấy của các cây cĩ mang mầm bệnh trước khi đưa vào mơi trường nuơi cấy. Các cây sạch bệnh này cĩ thể được trao đổi dễ dàng giữa các nơi với nhau do cây cĩ kích thước nhỏ và khơng trồng trong đất. Trong nuơi cấy in vitro chỉ sử dụng những mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho nên cĩ thể chọn lọc kỹ lưỡng và dễ dàng. Việc nhân giống in vitro giúp làm giảm khơng gian sử dụng so với nhân giống in vivo và giảm các chi phí về năng lượng đối với các trường hợp các loại cây cần được nhân giống trong nhà kính. Do cây in vitro được nuơi cấy trong điều kiện hồn tồn thích hợp (nguồn dinh dưỡng và điều kiện mơi trường) do đĩ cĩ thể sản xuất cây con quanh năm. Cĩ thể sử dụng cây nhân giống in vitro để làm cây mẹ cho các bước nhân giống kế tiếp. Cĩ thể tạo ra các đột biến điểm trong quá trình nuơi cấy. Phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng để tạo ra các ngân hàng gen. Các tế bào trần và huyền phù tế bào là đối tượng hữu dụng trong việc lai soma. Một số loại cây bị mất khả năng sinh sản hữu tính như các cây đơn bội, cây bất thụ đực, cây bất thụ do đột biến,… cĩ thể được duy trì và nhân giống bằng phương pháp nhân giống in vitro. Những bất lợi của phương pháp nhân giống vơ tính in vitro: - Kiểu gen thực vật khơng được ổn định trong một số hệ thống nuơi cấy. - Tạo ra những cây khơng hồn tồn đúng như mong muốn: mọc um tùm vì một số cây cịn giữ được khả năng trẻ hĩa trong quá trình nuơi cấy. - Đặc biệt, đối với một số lồi cây thân gỗ, việc cảm ứng rễ rất khĩ thực hiện. Trong một số trường hợp, cĩ những loại cây tạo được rễ in vitro nhưng những rễ này khơng phù hợp do đĩ những cây này sẽ tạo mới rễ sau khi được chuyển ra trồng trong đất. - Việc chuyển cây từ trong ống nghiệm ra vườn ươm rất khĩ đối với một số cây. - Cây khi được chuyển từ phịng thí nghiệm ra vườn ươm rất dễ bị tấn cơng bởi một số loại bệnh hại do nĩ đã quen sống trong điều kiện vơ trùng. Vì vậy, cần phải xử lý mơi trường và giá thể sống của cây thật cẩn thận. - Khả năng tái sinh cây cĩ thể bị mất đi do việc cấy chuyền mơ sẹo và huyền phù tế bào được lặp lại nhiều lần. - Đối với một số mơ, việc vơ trùng trước khi đưa vào cấy rất khĩ thực hiện. - Phương pháp nhân giống in vitro tốn nhiều cơng lao động làm cho giá thành của cây tăng lên. Hiện nay, các kỹ thuật hiện đại đang được tiến hành như tăng sinh tế bào trong các thiết bị lên men nhưng vẫn cịn trong giai đoạn thí nghiệm. 2.1.7. Các bước nhân giống in vitro Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy Mẫu cấy là mảnh mơ thực vật được đặt vào trong mơi trường nuơi cấy. Để tiến hành nuơi cấy in vitro thành cơng, khi lựa chọn mơ cấy cần lưu ý đến tuổi sinh lý của cơ quan được dùng làm mẫu cấy, mùa vụ lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu cấy đĩ. Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà phịng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hĩa học như calcium hypocloride, sodium dichloroisocyanurate, chlorur thủy ngân,… Tạo thể nhân giống in vitro Mẫu được nuơi cấy trên mơi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống in vitro. Cĩ hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt. Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngồi tự nhiên của cây trồng. Đối với những lồi khơng cĩ khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ callus (mơ sẹo). Trong mơi trường nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác. Nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuơi cấy mơ tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuơi cấy là những thể chồi, mơi trường nuơi cấy thường giống mơi trường tạo thể chồi, đơi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuơi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh. Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hĩa và được duy trì trong thời gian dài. Tái sinh cây in vitro hồn chỉnh Đây là giai đoạn tạo cây con hồn chỉnh cĩ đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra mơi trường bình thường. Các chất cĩ tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đĩ là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuơi cấy gần với điều kiện tự nhiên bên ngồi, một bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hĩa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro. Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm Cây con đã ra rễ được lấy khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậu nơi cĩ bĩng râm, độ ẩm cao, cường độ ánh sáng thấp,… Sau khoảng 2 tuần, cây đã bắt đầu thích nghi với điều kiện bên ngồi, lúc này cĩ thể tăng cường độ chiếu sáng và hạ độ ẩm. Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quy trình nhân giống vơ tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro. Cây in vitro được nuơi cấy trong điều kiện ổn định dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hồn tồn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng cĩ cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mất nước và mau héo dẫn đến hiện tượng chết. Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mơ phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, ẩm độ cao. Cây con thường được cấy trong luống ươm cây cĩ cơ chất dễ thốt nước, tơi xốp, giữ được ẩm, trong những ngày đầu cần được phủ nylon để giảm sự thốt hơi nước ở lá (thường 7 – 10 ngày kể từ ngày cấy). Rễ được tạo ra trong quá trình nuơi cấy mơ sẽ dần dần lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các hợp chất kích thích ra rễ ở nồng độ thấp để rút ngắn thời gian ra rễ. 2.1.8. Quá trình tái sinh cơ quan trong nhân giống in vitro Sự tái sinh cơ quan trong nuơi cấy in vitro là một quá trình phức tạp vì: Quá trình tái sinh chỉ xảy ra khi mối tương quan cũ được phá vỡ và những mối tương quan mới được hình thành. Quá trình này bao gồm nhiều giai đoạn khác nhau: Loại bỏ sự phản biệt hĩa của các tế bào phản biệt hĩa (dẫn đến sự trẻ hĩa tế bào). Sự phân chia tế bào (đơi khi dẫn đến sự hình thành mơ sẹo): sự hình thành cơ quan bắt đầu xảy ra khi sự phân chia tế bào diễn ra. Sự hình thành cơ quan. Sự phát triển cơ quan. Sự tái sinh bị giới hạn về số lượng và chất lượng do nhiều nhân tố: nguồn mẫu cấy ban đầu, sự tăng trưởng của mẫu cấy trong điều kiện nhà kính hay ngồi đồng ruộng, vị trí của mẫu cấy trên cây, thời điểm lấy mẫu cấy, hàm lượng hormone nội sinh, kích thước mẫu cấy, phương pháp cấy, chất dinh dưỡng, chất điều hịa sinh trưởng, điều kiện sinh lý, một số hợp chất được tiết ra trong quá trình nuơi cấy,… Tất cả những nguyên nhân trên cho thấy quá trình tái sinh rất phức tạp, chúng ta khơng thể đề cập hết những khía cạnh liên quan nhưng cần lưu ý một số vấn đề sau: Quá trình tái sinh phức tạp do chịu sự tương tác của nhiều nhân tố khác nhau (mơi trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ và các chất điều hịa sinh trưởng,…). Khơng thể khái quát chung quá trình tái sinh cho tất cả các lồi vì mỗi lồi khác nhau cần điều kiện tái sinh khác nhau. Khĩ cĩ thể điều hịa quá trình tái sinh vì khả năng tái sinh của mỗi lồi khác nhau: trong những trường hợp này các nhân tố nội sinh đĩng vai trị quyết định do đĩ các yếu tố ngoại sinh như chất điều hịa ảnh hưởng khơng nhiều. Sự hình thành rễ bất định thườn đối lập với sự hình thành chồi bất định. Nếu cả hai quá trình này được thúc đẩy đồng thời, cây con tạo ra sẽ mang nhiều thiếu sĩt. Để thu nhận một cây hồn chỉnh tốt nhất chúng ta nên tạo chồi bất định trước sau đĩ cảm ứng tạo rễ. 2.1.8.1. Sự hình thành chồi bất định Sự hình thành chồi bất định được xem là một trong những phương pháp nhân giống sinh dưỡng trong nuơi cấy mơ. Ngày nay một số lồi như Saintpaulia, Begonia, Achimenes, Streptocarpus, Lilium, Ferine đang được nhân giống bằng phương pháp này. Cĩ nhiều điểm giống nhau giữa sự hình thành chồi bất định và rễ bất định: các nhân tố cĩ ảnh hưởng tích cực lên sự hình thành rễ bất định cũng thúc đẩy sự hình thành chồi bất định. Điều này được thể hiện qua một số điểm sau: Sự hình thành chồi bất định ở cây hạt trần chỉ thành cơng khi sử dụng các bộ phận của cây con (Anonymous, 1984). Đường đĩng vai trị rất quan trọng trong sự hình thành chồi và rễ. Sự hình thành chồi hay rễ đều bị ức chế bởi gibberellin và acid abscisic. Trong đa số trường hợp, ánh sáng thúc đẩy sự hình thành chồi bất định. Tuy nhiên một số lồi cây cần điều kiện tối để hình thành chồi bất định: chồi hoa Freesia (Pierik và Steegmans, 1975), các mẫu cấy từ cuống hoa Nerine bowdemi (Pierik và Steegmans, 1985). Economou và Read (1986) cho rằng các mẫu lá của Petunia hybrida tăng trưởng trên mơi trường khơng cĩ cytokinin và được xử lý ánh sáng đỏ tạo ra nhiều chồi hơn những mẫu cấy được xử lý ánh sáng đỏ xa. Tuy nhiên trên mơi trường cĩ BA, các mẫu cấy được xử lý ánh sáng đỏ và đỏ xa tạo ra số lượng chồi bằng nhau và nhiều hơn các mẫu cấy trên mơi trường khơng cĩ cytokinin. Nhiệt độ cao thường cần thiết cho sự hình thành chồi nhưng cũng cĩ một số trường hợp ngoại lệ đối với BegoniaI (Heide, 1965) và Streptocarpus (Appelgren và Heide, 1972). Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự hình thành chồi bất định rất phức tạp: Một số cây khơng cần auxin hay cytokinin để hình thành chồi bất định như Cardamine pratensis (Pierik và Segers, 1972), Streptocarpus (Appenlgren và Heide, 1972). Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp cytokinin và auxin đều cĩ ảnh hưởng đến quá trình tạo chồi. Hầu hết thực vật cần cytokinin để thúc đẩy tạo chồi trong khi auxin cĩ tác dụng ngược lại (Miller và Skoog, 1953; Nitsch, 1968). Một số lồi cần auxin ngoại sinh cho sự tạo chồi như Lilium (Aartrijk, 1984), Hyacinth (Pierik và Steegmans, 1975). Nồng độ cytokinin/auxin cao rất quan trọng cho sự tạo chồi ở nhiều lồi thực vật khác nhau, ví dụ như ở lồi Begonia (Heide, 1965), Súp lơ (Margara, 1969). Chúng ta cĩ thể kết luận rằng ở những lồi cần cytokinin và auxin cho sự tái sinh chồi, nồng độ cytokinin bao giờ cũng cao hơn nồng độ auxin. Tỉ lệ của hai chất điều hịa sinh trưởng này sẽ quyết định sự hình thành cơ quan (Skoog và Tsui, 1948; Miller và Skoog, 1953). Cytokinin BA rất hiệu quả trong việc thúc đẩy tạo chồi ở nhiều lồi thực vật nhưng nếu sử dụng BA ở nồng độ cao sẽ xuất hiện nhiều biến dị (chồi biến dạng). Trong một số trường hợp, sự kết hợp giữa cytokinin và adenine (sulphate) sẽ tăng hiệu quả tạo chồi (Skoog và Miller, 1975; Nitsch và cộng sự, 1969). Trong một số trường hợp, việc sử dụng một mình adenine cũng cĩ thể cảm ứng tạo chồi: Begonia (Ringle và Nitsch, 1968), cây Thuốc lá (Skoog và Tsui, 1948), Plumbago indica (Nitsch, 1968). Sự gia tăng nồng độ gibberellin ức chế quá trình tạo chồi: ở lồi Begonia rex (Schrandolf và Reinert, 1959), Plumbago indica (Nitsch, 1968)… Acid abscisic ức chế sự hình thành chồi bất định mặc dù vẫn cĩ trường hợp cảm ứng sự hình thành chồi như ở cây Ipomoea batatas. 2.1.8.2. Sự hình thành rễ bất định Rễ bất định được hình thành trên các cơ quan khác nhau của cây, nơi mơ của chúng cịn giữ khả năng phân sinh. Quá trình hình thành rễ rất quan trọng vì nĩ ảnh hưởng đến khả năng sống sĩt của mẫu cấy khi cây in vitro được chuyển ra vườn ươm. Cĩ nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành rễ bất định: đặc điểm di truyền lồi, tuổi của mẫu, vị trí mẫu cấy trên thân, kích thước mẫu cấy, vết thương, số lần cấy chuyền, nguồn oxy, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hịa sinh trưởng, than hoạt tính, đường, agar, pH,… 2.1.9. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái in vitro 2.1.9.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy Vật liệu nuơi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển in vitro: Kiểu di truyền Khả năng tái sinh của thực vật rất đa dạng. Những cây hai lá mầm thơng thường cĩ khả năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm và cây hạt trần rất khĩ tái sinh (trừ khi chúng cịn non). Trong số các cây hai lá mầm, Solanaceae, Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae, Cruciferae là những họ thực vật dễ tái sinh nhất. Nếu một lồi dễ tái sinh cơ quan trong mơi trường tự nhiên (các giống lai Saintpaulia ionantha, Begonia rex, Streptocarpus) thì chúng hầu như dễ tái sinh in vitro. Cũng cĩ những trường hợp ngoại lệ như những đoạn cắt từ lá của Kalanchoe farinacea hầu như khơng cĩ khả năng hình thành chồi bất định in vivo nhưng cĩ thể thực hiện trong điều kiện in vitro, điều này cĩ thể do sự hấp thu các chất điều hịa sinh trưởng cĩ trong mơi trường nuơi cấy. Tuổi của cây Các mơ phơi thường cĩ khả năng tái sinh cao do đĩ ở ngũ cốc người ta thường dùng phơi và hạt làm vật liệu nuơi cấy mơ. Khi cây già đi, khả năng tái sinh của chúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn như trong trường hợp cây bụi. Một vài ví dụ cụ thể chỉ ra sự khác nhau về khả năng tái sinh và phân chia tế bào giữa cây già và cây non in vitro: Hedera helix (Stoutemeyer và Britt, 1965), Lunaria annua (Bajaj và Pierik, 1974) và Anthurium andreanum (Pierik và cộng sự, 1974). Khi mơ phân sinh và chồi đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ những đặc tính già hay non trong điều kiện in vitro tùy vào điều kiện ban đầu. Đơi khi qua nhiều lần cấy chuyền, mơ phân sinh già từng bước được trẻ hĩa do tăng khả năng tái sinh và phân chia tế bào. Điều này được chứng minh trên những đối tượng như Pinus vinifera, Malus sylvestris, Cryptomeria japonica. Tuổi của mơ và cơ quan Những mơ cịn non và mềm thường dễ nuơi cấy hơn những mơ cứng nhưng cũng cĩ nhiều trường hợp ngoại lệ. Các mẫu cấy từ cuống lá cịn non tái sinh tốt hơn những mẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan của chúng già hơn nên khả năng tái sinh và phân chia tế bào giảm. Khả năng tái sinh của những lồi khác nhau tăng lên trong suốt giai đoạn ra hoa: các bộ phận của phát hoa cịn non đơi khi tái sinh rất mạnh, ví dụ như Freesia (Bajaj và Pierik, 1974), Lunaria annua (Pierik và cộng sự, 1974), Primula obconica (Coumans và cộng sự, 1979). Tình trạng sinh lý Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế bào in vitro. Thơng thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh hơn trong giai đoạn sinh sản. Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ tây ở giai đoạn sinh dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản (Robb, 1957). Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đơng (cuối thu đầu đơng) khĩ nuơi cấy in vitro hơn chồi của những cây đã vượt qua được giai đoạn này (vào mùa xuân trước khi chúng bắt đầu phát triển). Vị trí của mẫu cấy trên cây Ever (1984) đã khảo sát sự ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy lên sự sinh trưởng và phát triển in vitro sau khi tách mẫu ở cây Pseudotsuga menziesii, ơng nhận thấy những chồi ban đầu được tách từ những vị trí thấp trên cây phát triển trong mơi trường in vitro tốt hơn, và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn chồi nách. Sự hình thành các giả hành bất định của mẫu cấy lan dạ hương được tách ra từ phần gốc của vảy hành tốt hơn từ phần đỉnh. Điều này cũng xảy ra tương tự đối với lily (Robb, 1957). Điều đáng lưu ý là những mơ sẹo phát sinh từ những mẫu cấy cĩ nguồn gốc từ các phần khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều cĩ phản ứng in vitro giống nhau. Kích thước mẫu cấy Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mơ phân sinh khĩ cảm ứng để tăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ. Các phần được tách rời khỏi cây tự nĩ cung cấp chất dinh dưỡng và hormone, do đĩ mẫu cấy cĩ kích thước càng lớn càng dễ tái sinh và phát triển. Các bộ phận của cây cĩ chứa nhiều chất dinh dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái sinh trên mơi trường in vitro hơn những cơ quan ít chất dự trữ. Đối với những mẫu bị cắt, phần trăm bề mặt bị tổn thương cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh. Ảnh hưởng của vết thương lên sự tái sinh của các mẫu cấy từ vảy hành lily đã được Aartrijk (1984) chứng minh. Vết thương Sự tổn thương trên bề mặt mẫu cấy đĩng vai trị quan trọng trong sự tái sinh mẫu cấy. Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng và các chất điều hịa đồng thời ethylene được tạo ra nhiều hơn. Ngồi ra, cĩ thể tăng cường sự hình thành rễ bất định bằng vết thường. Phương pháp cấy Các mẫu cấy cĩ thể được đặt trên mơi trường theo nhiều cách khác nhau: cĩ cực (thẳng đứng với phần gốc cắm xuống mơi trường) hoặc khơng cực (cắm phần ngọn xuống mơi trường). Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh khi mẫu được cấy khơng cực (Pierik và Steegmans, 1975). Mẫu tái sinh tốt khi được cung cấp đầy đủ oxy nhưng những nhân tố khác cũng đĩng vai trị quan trọng. Phần gốc của mẫu cấy khơng cực cĩ các chất dự trữ khơng cĩ khả năng khuếch tán vào trong agar do nĩ khơng tiếp xúc với mơi trường. Như ở trường hợp tất cả các cây thuộc họ Amaryllidaceae (Pierik và cộng sự, 1974), sự tái sinh chỉ xảy ra ở phần gốc của vảy hành, do đĩ phương pháp cấy khơng cực dẫn đến sự hình thành thân hành bất định tốt hơn phương pháp cấy cĩ cực. Ảnh hưởng của nguồn carbon dioxide và ánh sáng Ở vùng lạnh, những thay đổi trong quá trình sinh trưởng của mẫu cấy xảy ra suốt mùa đơng cĩ thể giải thích dựa trên những thay đổi bức xạ. Khi giảm 1% ánh sáng sẽ làm giảm 1% năng suất trong nhà kính nhưng mối tương quan này khơng đĩng vai trị trong trường hợp với những cây con. Điều kiện ánh sáng trong nhân giống những cây cấy ghép cĩ thể đem lại nhiều lợi ích khơng chỉ trong giai đoạn vườn ươm mà cịn cĩ lợi sau khi trong bên ngồi. Ảnh hưởng của nhân tố khống Sự kết hợp giữa muối đa lượng và vi lượng phụ thuộc nhiều vào loại cây thí nghiệm. Mơi trường Murashige và Skoog (1962) là mơi trường phổ biến nhất vì hầu hết các lồi cây cĩ thể thích nghi được. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng dung dịch dinh dưỡng khơng phải lúc nào cũng thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển vì nồng độ muối khống trong dung dịch quá cao. Ví dụ cây đồng tiền rất nhạy cảm với muối đa lượng in vitro (Pierik và Seger, 1972). Lloyd và McCown (1980) đã tìm ra một mơi trường thích hợp cho một số lồi thân gỗ nhạy cảm với muối gọi là mơi trường WPM (woody plant medium). Ảnh hưởng của pH pH của mơi trường nuơi cấy thường được điều chỉnh từ 5.5 – 6. pH dưới 5.5 thì agar khơng đơng thành dạng gel hồn tồn và trên 6 thì gel lại quá cứng. pH của mơi trường thường giảm từ 0.6 – 1.3 đơn vị sau khi hấp khử trùng. Cĩ một số trường hợp, sau một thời gian nuơi cấy, pH của mơi trường giảm dần do sự hình thành một số acid hữu cơ trong mơi trường. Điều chỉnh pH bằng cách dùng HCl hay NaOH 1N hoặc 0.1N và nhỏ từng giọt vào trong mơi trường, khuấy đều mơi trường rồi mới đo. Luơn nhớ phải điều chỉnh pH trước khi thêm agar. 2.1.9.2. Ảnh hưởng của chất điều hịa sinh trưởng lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Chất điều hịa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp, ở liều cao chúng trở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sử dụng như các chất diệt cỏ dại. Các chất điều hịa nội sinh cĩ thể được kiểm sốt do cơ chế chuyển hĩa của tế bào nên chúng được kiểm sốt hoặc đào thải khá nhanh. Trái lại các chất điều hịa tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng dụng trong thực tế. Auxin Auxin là nhĩm chất điều hịa sinh trưởng thực vật được sử dụng rất thường xuyên trong nuơi cấy mơ – tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng trong mơi trường nuơi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mơ sẹo, huyền phù tế bào và điều hịa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nĩ được sử dụng phối hợp với các cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong mơi trường nuơi cấy phụ thuộc vào: Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu. Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy. Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy. Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh. Hàm lượng auxin tự nhiên trong mẫu cấy phụ thuộc vào trạng thái của cây mẹ: tuổi cây mẹ, thời gian thu mẫu trong năm. Auxin là hợp chất cĩ nhân indole, cĩ cơng thức nguyên là C10H9O2N. Auxin gồm cĩ hai loại là auxin cĩ nguồn gốc nội sinh do thực vật tạo ra (IAA), và auxin tổng hợp do con người tạo ra (IBA; NAA; 2,4-D;…). IAA tổng hợp được sử dụng trong nuơi cấy mơ nhưng nĩ dễ bị biến tính trong mơi trường nuơi cấy và nhanh chĩng thối biến ở trong mơ. Tuy nhiên những đặc tính này cĩ thể trở nên hữu dụng bởi vì trong cây IAA cùng với cytokinin sau khi cảm ứng sự hình thành mơ sẹo sẽ kích thích sự tạo chồi hoặc phơi khi hàm lượng của nĩ trong mơ giảm dần. IAA thường được sử dụng phối hợp với các chất điều hịa sinh trưởng khác để kích thích sự phát sinh hình thái trực tiếp. Tuy nhiên, tùy theo mục đích thí nghiệm mà người ta cĩ thể sử dụng các hợp chất giống auxin khác được tổng hợp và nĩ cĩ những hoạt động hơi khác với auxin như: IBA, 2,4 – D, NAA. 2,4 – D thường được sử dụng phối hợp với cytokinin để cảm ứng sự tạo mơ sẹo và huyền phù tế bào và nĩ sẽ được thay thế bởi IBA hay NAA để kích thích sự phát sinh hình thái. IBA và NAA là loại auxin thích hợp trong nuơi cấy chồi. IAA và IBA nhạy cảm với nhiệt độ và bị phân hủy trong quá trình hấp tiệt trùng và IAA khơng ổn định trong mơi trường nuơi cấy cho dù nĩ được lọc qua màng lọc vơ trùng. Nồng độ của IAA cĩ thể giảm đi 10 lần trong 4 tuần nuơi cấy ở trong tối nếu khơng được bổ sung thêm, tốc độ phân hủy của auxin ở ngồi sáng xảy ra nhanh hơn đặc biệt trong mơi trường MS. IBA ổn định trong mơi trường hơn là IAA, mức độ giảm của IBA thấp. Cịn NAA và 2,4 – D khơng bị biến tính trong mơi trường nuơi cấy. Ngồi ra, cịn cĩ một số auxin khác nhưng chúng rất ít được sử dụng như: 2,4,5 – T, 4 – CPA, MPCA, NOA, Dicamba, Picloram. Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nĩ tùy thuộc vào nồng độ và tác động bổ trợ của chúng với các chất điều hịa tăng trưởng khác. Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên trong tế bào, sức căng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra. Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phĩng thích ion H+. Ion này gây ra một hoạt tính acid chịu trách nhiệm làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+. Auxin tác động lên các quá trình chuyển hĩa, đặc biệt nhất là trên sự tổng hợp ARN ribosome. Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình thành mơ sẹo và sự hình thành rễ bất định. Auxin cũng ức chế sự phát triển của chồi nách và sự hình thành phơi sinh dưỡng trong mơi trường nuơi cấy mơ sẹo. Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng. Auxin được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa, ở các quả cịn non và lưu thơng từ đỉnh xuống phía dưới với một sự phân cực rõ ràng được nhìn thấy rõ trên các cơ quan thực vật cịn non. Nhưng trong quá trình vận chuyển này, chúng bị oxy hĩa do hoạt động của các enzyme auxin - oxidase, điều này cho thấy nồng độ auxin luơn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng. Đối với một số lồi, auxin cần cho sự hình thành rễ của các cành giâm (Võ Thị Bạch Mai, 2004). Cytokinin Cytokinin là một trong nhĩm chất điều hịa sinh trưởng thực vật. Cytokinin ít cĩ ảnh hưởng trên một thực vật nguyên vẹn và nĩ cĩ hiệu quả trong việc kích thích sự sinh tổng hợp protein. Cytokinin được phát hiện sau auxin và gibberellin. Người ta biết rằng trong mơi trường nuơi cấy, việc bổ sung cytokinin sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phân chia tế bào và hình thành chồi. Cytokinin là các hợp chất adenin được thay thế, cĩ 2 nhĩm cytokinin nội sinh được biết đến là zeatin và IPA, ngồi ra cịn cĩ 2 nhĩm cytokinin tổng hợp được sử dụng nhiều nhất trong nuơi cấy mơ thực vật là Kinetin và BAP. Các loại cytokinin tự nhiên như zeatin và IPA ít được sử dụng trong các thí nghiệm vì giá thành cao, chỉ thường sử dụng Kinetine và BAP. Cytokinin tác động hiệu quả lên sự phân chia tế bào khi cĩ sự hiện diện của auxin: auxin tạo điều kiện thuận lợi cho sự nhân đơi DNA và cytokinin cho phép tách rời nhiễm sắc thể. Trong nuơi cấy mơ, nếu lượng cytokinin khơng đủ thì sự phân chia của nhân tế bào sẽ bị chặn lại tại một giai đoạn trong chu trình tế bào. Khi cấy chuyển mơ sang mơi trường mới cĩ chứa cytokinin thì tế bào sẽ phân chia liên tục sau giai đoạn nghỉ. Người ta cịn cho rằng sự phân chia tế bào trong mơ sẹo xảy ra khi khơng cĩ sự hiện diện của cytokinin trong mơi trường nuơi cấy là do tế bào đã tự tổng hợp được cytokinin cho nĩ Cytokinin rất cĩ hiệu quả trong vai trị kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như trên mơ thực vật nuơi cấy in vitro. Tác dụng này của cytokinin đơi khi trở nên hiệu quả hơn khi phối hợp với auxin. Một tỉ lệ thích hợp giữa auxin và cytokinin sẽ cĩ hiệu quả trên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy. Cytokinin cũng cĩ khả năng kích thích sự tăng trưởng của chồi bên và làm giảm hiện tượng ưu tính ngọn trong nuơi cấy chồi của những lồi cây lá rộng, người ta thường bổ sung một hoặc vài loại cytokinin vào mơi trường nuơi cấy. Nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này khơng thể kéo dài hoặc làm cho lá bị biến dạng hoặc làm cho chồi chứa nhiều nước. Để kích thích sự tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua sự tạo mơ sẹo thì người ta thường phối hợp cytokinin với auxin. Cytokinin cĩ vai trị trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ sự thành lập chồi non, trái lại ở nồng độ cytokinin cao chúng thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ. Đơi khi người ta cũng nhận thấy rằng cytokinin cũng cảm ứng sự tạo rễ hoặc kích thích sự tăng trưởng của rễ hoặc kích thích sự tạo thành rễ bất định khi khơng cĩ sự hiện diện của auxin. Trong hầu hết các trường hợp, chỉ cĩ nồng độ cytokinin thấp là cĩ hiệu quả. Người ta thường bổ sung cytokinin với nồng độ thấp vào mơi trường nuơi cấy để cảm ứng sự tạo mơ sẹo cĩ khả năng sinh phơi đặc biệt là những cây lá rộng. Tuy nhiên, cũng cĩ vài bằng chứng cho rằng cytokinin lại cản sự sinh phơi ở cây một lá mầm ví dụ như: cytokinin ngoại sinh 0.001 µM đủ để ngăn cản sự sinh phơi ở Dactylis glomerata. Cytokinin nội sinh cũng cĩ thể ngăn cản sự tạo phơi ở một số lồi thực vật. Cytokinin kích thích quá trình chuyển hĩa, bảo vệ các chất chuyển hĩa chống lại tác động của enzyme phân giải, làm chậm quá trình lão hĩa. Các chồi nách được xử lý bằng cytokinin sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi ngọn. Ảnh hưởng của cytokinin trên sự nuơi cấy mơ và cơ quan phụ thuộc vào loại cytokinin sử dụng, kiểu nuơi cấy, lồi thực vật được nuơi cấy và mẫu cấy được thu từ mơ cịn non hay mơ đã trưởng thành. Trường hợp duy trì mẫu cấy trong điều kiện nhiệt độ cao bất thường thì làm giảm hiệu quả của cytokinin nhưng cĩ thể làm tăng hiệu quả của auxin. Hầu như sự tăng trưởng chồi khơng xảy ra ở 30oC. Tĩm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mơ, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế bào trong con đường phân hĩa, tạo điều kiện thuận lợi cho nuơi cấy in vitro. 2.1.9.3. Ảnh hưởng của vitamin lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Vitamin thường cĩ chức năng xúc tác trong các phản ứng enzyme. Vitamin được xem là quan trọng cho sự phát triển của thực vật là thiamine (vitamin B1). Các vitamin khác như acid nicotinic (B3) và pyridoxine (B6) cũng cĩ thể được thêm vào mơi trường nuơi cấy bởi chúng cĩ thể tăng cường sự đáp ứng của tế bào. Các dung dịch vitamin được bảo quản tốt nhất trong tủ lạnh và dùng 10 ml cho 1 lít mơi trường. Các dung dịch vitamin sử dụng trong các thí nghiệm. Hiện nay, trong quá trình pha chế mơi trường ta thường thêm các dung dịch vitamin vào mơi trường trước khi hấp khử trùng. Tuy nhiên, trong các nghiên cứu đặc biệt về vitamin thì ta nhận thấy rằng tốt nhất là nên lọc khử trùng các dung dịch vitamin và sau đĩ thêm vào mơi trường đã hấp khử trùng. 2.1.9.4. Ảnh hưởng của đường lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Khi được nuơi cấy in vitro, thường thì các tế bào thực vật khơng cĩ khả năng quang hợp và do đĩ nĩ địi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động biến dưỡng của tế bào. Trong nuơi cấy protoplast (nuơi cấy tế bào trần) thì lượng đường sử dụng thường thấp, ngược lại trong nuơi cấy phơi và bao phấn thì dùng đường nhiều hơn. Đường cĩ thể bị caramel hĩa nếu bị hấp khử trùng quá lâu và sẽ ức chế phản ứng với các hợp chất amino. Sự caramel hĩa xảy ra khi đường bị đun nĩng, thối biến và hình thành melanoidin, một chất sẫm màu và cĩ phân tử lượng cao, ức chế sự phát triển của tế bào. 2.1.10. Các chất khử trùng hĩa học được sử dụng trong nuơi cấy mơ Cĩ thể nĩi, khĩ khăn lớn nhất khi tiến hành nuơi cấy mơ là phải tạo được thể nhân giống in vitro vơ trùng. Cĩ nhiều nguyên nhân gây ra sự nhiễm trùng, trong quá trình nuơi cấy cĩ thể bị nhiễm vi sinh vật từ: mẫu cấy, người cấy, hệ thống lọc khí trong tủ cấy, cơn trùng, dụng cụ hay bản thân mơi trường nuơi cấy. Mẫu cấy, các mảnh mơ thực vật, dùng để nuơi cấy thường là nguồn nhiễm chính vì cĩ rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rãnh nhỏ hoặc giữa các lớp vảy chồi, mầm chồi. Đối với một số lồi thực vật được bao phủ bên ngồi bởi một lớp sáp dày hoặc cĩ lơng tơ thì càng khĩ khử trùng vì đây là nơi cư ngụ của rất nhiều vi sinh vật. Ngồi ra, những cây đã bị nhiễm ngay trong hệ thống mơ mạch thì xem như khơng thể dùng phương pháp khử trùng thơng thường để loại bỏ vi sinh vật được. Để giải quyết những vấn đề này, đầu tiên người ta sử dụng các chất khử trùng. Để tăng cường hiệu quả khử trùng của các chất khử trùng, người ta thường rửa sơ mơ cấy với xà phịng để loại bỏ bụi đất và gia tăng sự tiếp xúc với các chất khử trùng, ngồi ra cĩ thể dùng dung dịch Tween-20 như là chất hoạt động bề mặt. Sau khi khử trùng phải rửa sạch mẫu cấy bằng nước cất vơ trùng 3 – 5 lần. Một số chất khử trùng thường được sử dụng như: Chlorur thủy ngân (HgCl2): đây là chất khử trùng rất hiệu quả, thường dùng với lượng rất thấp từ 0.01% - 0.05%, chất này rất khĩ đào thải, vì vậy cẩn thận khi tiếp xúc. Sodium hypochlorite NaOCl: cĩ trong các dung dịch tẩy trắng 5 – 20%. Thời gian khử trùng từ 5 – 30 phút, sau đĩ rửa sạch bằng nước cất vơ trùng 3 – 5 lần. Chất này ngấm vào trong mơ thực vật, làm cản trở sự tăng trưởng của mơ về sau. Calcium hypochlorite Ca(OCl)2: nồng độ khoảng 5 – 10%, xử lý mơ cấy từ 5 – 30 phút. Ethyl hay isopropyl alcohol 70%: thường sử dụng để lau sạch các vật liệu nuơi cấy trước khi khử trùng hoặc dùng để ngâm nguyên liệu trước hoặc sau khi xử lý với NaOCl hoặc Ca(OCl)2 trong khoảng 1 – 5 phút. Nước oxy già (H2O2): là một chất oxy hĩa cực mạnh, cĩ thể sử dụng ở nồng độ 3 – 10% trong 1 – 30 phút trước khi rửa bằng nước cất vơ trùng khi sử dụng. Sự kết hợp giữa NaOCl và H2O2 là rất độc đối với mơ thực vật, do đĩ phải rửa thật sạch. Khí Clo (Cl2): thường sử dụng nhiều trong khử trùng hạt khơ. Sodium dichloroisocyanurate (NADCC): chất này ít độc đối với mơ thực vật, khơng cần rửa lại mẫu cấy bằng nước cất vơ trùng sau khi xử lý bằng chất này. Chất kháng sinh: Gentamicine và Ampicilline: những kháng sinh này cĩ tác dụng hỗ trợ thêm cho việc sử dụng ethanol và thuốc tẩy. Dung dịch kháng sinh 50 – 100 mg/l được dùng để ngâm mẫu trong 30 phút trước khi nuơi cấy. Sodium dichloroiso cyanurate (dichloroiso cyanuric acid sodium salt) (NADCC): chất này ít độc đối với mơ thực vật, vốn rất dễ tổn thương bởi Ca(OCl)2 và NaOCl, khơng cần rửa lại mẫu cấy bằng nước vơ trùng sau khi xử lý bằng chất này. Iso thiazolone biocide (PPM): là một loại sản phẩm được chào bán của viện Plant Cell Technology (Washington DC.) và được quảng cáo là :”… cĩ khả năng ngăn chặn sự tạp nhiễm vi sinh trong nuơi cấy mơ thực vật”. Cũng đã cĩ những thử nghiệm và khẳng định cơng dụng diệt trùng của chất này nhưng nếu sử dụng với nồng độ cao sẽ gây độc cho tế bào thực vật. Nĩi chung việc tìm ra thời gian khử trùng ngắn và nồng độ chất khử trùng thấp mà vẫn thu được mẫu cấy sạch là điều rất quan trọng, vì các chất khử trùng cĩ thể phá hủy mơ của mẫu cấy và làm chết mẫu cấy (Dương Cơng Kiên, 2002). 2.2. Sự tạo mơ sẹo từ mơ hay cơ quan thực vật Kỹ thuật tạo mơ sẹo được tiến hành lần đầu tiên vào cuối những năm 1920, đầu những năm 1930, là một trong những phương pháp đầu tiên của kỹ thuật nuơi cấy mơ trong nhiều năm. Mơ sẹo là một khối tế bào khơng cĩ tổ chức, hình thành từ các mơ hoặc cơ quan đã phân hĩa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý các chất điều hịa sinh trưởng thực vật,…). Các tế bào thuộc các mơ hoặc các cơ quan này, trừ các tế bào của mơ phân sinh, phải chịu một sự phản phân hĩa trước lần phân chia đầu tiên. Sự phản phân hĩa cĩ vai trị rất quan trọng, nĩ cho phép một tế bào đã trưởng thành trở lại trạng thái trẻ (trẻ hĩa). Sự trẻ hĩa giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạo phơi soma trong điều kiện thích hợp. Các tế bào thuộc các mơ hoặc các cơ quan đã phân hĩa của các cây song tử diệp thường phản phân hĩa dưới tác động của auxin (riêng rẽ hay kết hợp với một cytokinin) để cho ra mơ sẹo. Mơ sẹo được tạo ra ngồi nguyên nhân do các tế bào nhu mơ chịu sự phản phân hĩa cịn do sự phân chia các tế bào tượng tầng, sự xáo trộn trong các mơ phân sinh sơ khởi hay sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan. 2.2.1. Hình thái tế bào trong sự phát sinh mơ sẹo từ các mảnh mơ hay cơ quan song tử diệp khi nuơi cấy in vitro Ở các cây song tử diệp, auxin gây ra tình trạng rối loạn tổ chức của sinh mơ ngọn rễ, làm chậm sự kéo dài rễ. Ở thân, auxin kích thích hoạt động của tượng tầng và cĩ thể cảm ứng sự phản phân hĩa của các tế bào nhu mơ vỏ trong, libe 1 và libe 2, các tia tủy và tủy để tạo nên những vùng mơ phân sinh rộng lớn, cịn các tế bào vỏ ngồi và các tế bào biểu bì thường chỉ phù ra mà khơng phân chia. Tuy nhiên, ở nồng độ thích hợp auxin cĩ thể dẫn tới sự tạo những điểm dinh dưỡng mà trong phần lớn các trường hợp chúng cĩ thể trở thành mơ phân sinh rễ, trong vài trường hợp khác thì là mơ phân sinh chồi. Nhìn chung người ta xác nhận sự tạo mơ sẹo in vitro nhờ áp dụng auxin cĩ thể do ba quá trình khác nhau: sự phản phân hĩa của vài tế bào nhu mơ, sự kích thích hoạt động của các mơ phân sinh cấp 2 và sự xáo trộn của các mơ phân sinh cấp 1, đặc biệt là các mơ phân sinh rễ của các cây con. Tạo mơ sẹo từ sự phản phân hĩa của vài tế bào nhu mơ Tế bào nhu mơ vỏ của thân song tử diệp cĩ thể tạo ra mơ sẹo, nhưng thường nhất là các tế bào nhu mơ ở sâu bên trong: các tế bào nhu mơ của mộc và libe, các tế bào tiết và các tế bào nhu mơ tủy. Auxin riêng rẽ khơng đủ kích thích sự phân chia của các tế bào nhu mơ tủy được cơ lập từ vài loại cây mà phải dùng phối hợp với một cytokinin để kích thích sự phân chia này. Những tế bào được tạo ra sẽ hợp thành một vùng nhu mơ phân sinh, ở giữa vùng nhu mơ này các tế bào phân chia theo mọi hướng và biểu lộ những đặc tính tế bào học của các tế bào ở tầng phát sinh. Đây cĩ thể là nơi xảy ra hiện tượng tái phân hĩa để tạo các mơ dẫn truyền hay phản phân hĩa dẫn đến sự thành lập những điểm sinh trưởng của thân hay rễ. Tạo mơ sẹo từ sự phân chia của các tế bào tượng tầng Các tế bào tượng tầng của song tử diệp khơng cần phải qua giai đoạn phản phân hĩa trong quá trình tạo mơ sẹo khi cĩ sự hiện diện của auxin trong mơi trường nuơi cấy. Các tế bào tượng tầng của phần nhiều song tử diệp cĩ thể phân chia trong điều kiện hồn tồn thiếu auxin ngoại sinh, nhất là đối với các trường hợp của các lồi cỏ hay dây leo. Tạo mơ sẹo từ các xáo trộn của các mơ phân sinh sơ khởi Dù ở đơn tử diệp hay song tử diệp, các mơ sinh rễ của những cơ quan trưởng thành cĩ tập tính giống như các mơ ở cây mầm. Trong thực nghiệm, các xử lý với auxin thường khơng được áp dụng đối với các rễ cơ lập, nhưng lại xử lý trên các cây mầm nguyên vẹn để tạo nên những khối u lớn ở mức cổ rễ. Các khối u này phát triển chủ yếu từ các sơ khởi rễ. Các rễ bị biến dạng cũng thường được thấy trong quá trình kích thích tiềm năng sinh rễ của trụ hạ diệp rễ sơ cấp. Mặt khác, ở các song tử diệp, rễ thường cho những tổ chức hình thái thứ cấp rất phát triển như các rễ củ. Trong điều kiện nuơi cấy in vitro, các rễ mới được thành lập, được nuơi cấy liên tục với mơi trường cĩ chứa auxin, các rễ này dính với nhau và cĩ thể tạo nên một mơ sẹo. Mơ sẹo được hình thành sẽ tiếp tục phát triển qua các lần cấy chuyền trên những mơi trường thích hợp. 2.2.2. Vai trị của loại cơ quan, tuổi cơ quan và ánh sáng trong sự tạo mơ sẹo Đa số các mơ và cơ quan của thực vật đều cĩ khả năng tạo mơ sẹo dưới một tác động thích hợp nào đĩ và chỉ cĩ rất ít cơ quan thực vật khơng thể hiện khả năng này. Khả năng tạo mơ sẹo của mơ và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hĩa và kiểu gen. Sự tăng sinh của mơ sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất điều hịa sinh trưởng thực vật ngoại sinh áp dụng trong mơi trường nuơi cấy. Vai trị của loại cơ quan thực vật thường được sử dụng để tạo mơ sẹo Cĩ thể tạo được mơ sẹo từ nhiều loại cơ quan khác nhau của một cơ thể thực vật. Tuy nhiên, với mỗi loại mơ hay cơ quan, thường phải sử dụng các chất điều hịa sinh trưởng thực vật với loại và nồng độ khác nhau tùy theo mức độ nhạy cảm của các tế bào trong mơ hay cơ quan đĩ. Các mơ và các cơ quan khác nhau của một thực vật cĩ thể được sử dụng làm vật liệu tạo mơ sẹo như: rễ, thân, lá, củ, chồi hoa, túi phấn,… Vai trị của tuổi cơ quan thực vật trong sự tạo mơ sẹo Tuổi của những mảnh mơ hay cơ quan cĩ ảnh hưởng rất lớn trong khả năng tạo mơ sẹo. Những mảnh cơ quan đã trưởng thành thường khơng cĩ khả năng tạo mới cơ quan, cũng khơng cĩ khả năng tạo mơ sẹo. Ngược lại, cây non hay những mảnh thân cịn rất non của cây trưởng thành cĩ thể tạo mơ sẹo trên mơi trường cĩ chất điều hịa sinh trưởng thực vật, đặc biệt là auxin. Vai trị của ánh sáng trong quá trình tạo mơ sẹo Tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần hoặc khơng cần trong suốt thời gian tạo mơ sẹo. Trong đa số trường hợp, sự tạo mơ sẹo trong tối thường tốt hơn ngồi sáng, đặc biệt đối với mẫu cấy là lá. Ví dụ: Các trường hợp tạo mơ sẹo trong tối như: Lá khoai tây, Lá Vitis rupestris,… Các trường hợp tạo mơ sẹo trong điều kiện chiếu sáng như: Lá cây thuốc lá Nicotiana tabacum, mơ củ khoai tây,… Vai trị của các chất điều hịa sinh trưởng thực vật trong thu nhận mơ sẹo Auxin cĩ vai trị quan trọng trong sự tạo mơ sẹo. Trong mơi trường nuơi cấy, auxin thường gây ra: sự tạo bướu ở các mơ và cơ quan, kích thích sự phân chia tế bào (tạo mơ sẹo), kích thích sự tạo rễ bất định, gây ra sự phát sinh phơi từ tế bào soma từ các huyền phù tế bào. Khi nồng độ auxin thấp thì sự tạo rễ bất định chiếm ưu thế, khi nồng độ auxin cao sẽ khơng cĩ sự tạo rễ nhưng lại xảy ra sự tạo mơ sẹo. Auxin được sử dụng để tạo mơ sẹo với loại và nồng độ thay đổi khác nhau tùy thuộc vào vật liệu nuơi cấy. Đa số mẫu cấy thực vật thuộc nhĩm song tử diệp khơng cĩ khả năng tạo mơ sẹo trong mơi trường chỉ cĩ auxin mà cần phải cĩ một sự phối hợp giữa cytokinin và auxin. Ví dụ: Sự tạo mơ sẹo từ lá Solanum melongena xảy ra trên mơi trường cĩ bổ sung nhiều loại auxin khác nhau như: NAA; 2,4 – D; 2,4,5 – T ở các nồng độ thay đổi từ 0.1 – 10 mg/l. Tử diệp cây mầm Azadirachta indica A. cần IAA ở nồng độ 0,5 mg/l và BAP 1,0 mg/l để cĩ thể tạo mơ sẹo. Lá của Solanum tuberosum L. cần cĩ sự phối hợp giữa 2,4 – D 3,0 mg/l; NAA 1,0 mg/l và Kinetin 0,2 mg/l cho sự tạo mơ sẹo. Vai trị của auxin trong tăng trưởng của mơ sẹo: mơ sẹo sau khi hình thành nếu được tiếp tục duy trì trong mơi trường cĩ auxin thì mơ sẹo sẽ tăng sinh nhanh, nếu chuyển sang mơi trường cĩ đầy đủ các thành phần dinh dưỡng nhưng khơng cĩ sự hiện diện của auxin thì sự tăng sinh của mơ sẹo xảy ra rất chậm. Tốc độ tăng trưởng của mơ sẹo phụ thuộc vào thành phần cũng như nồng độ của auxin. Vai trị của các chất điều hịa sinh trưởng thực vật trong phát sinh hình thái mơ sẹo: hình thái của mơ sẹo phụ thuộc rất nhiều vào loại cũng như nồng độ của các chất điều hịa sinh trưởng thực vật hiện diện trong mơi trường nuơi cấy. Qua các thí nghiệm ghi nhận được nếu giữ nguyên nồng độ và loại auxin trong mơi trường nuơi cấy nhưng thay đổi thành phần và nồng độ cytokinin thì hình thái mơ sẹo thay đổi. Trong đa số các trường hợp, sự hiện diện của BAP trong mơi trường nuơi cấy kích thích sự tạo mơ sẹo dạng nốt, chắc, màu nâu và cĩ khả năng sinh phơi; mơ sẹo trên mơi trường cĩ kinetin cĩ dạng bở và thường khơng cĩ khả năng sinh phơi. Nồng độ auxin tăng cao kích thích sự tạo mơ sẹo dạng bở nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mơ sẹo cĩ dạng nốt và chắc. 2.2.3. Tạo mơ sẹo từ lá song tử diệp Trong quá trình tạo mơ sẹo từ lá song tử diệp, mơ sẹo xuất hiện trước hết là ở vị trí vết cắt, kế đến xuất hiện ở vùng đáy lá, vùng giữa của lá, hay dọc theo hệ thống mạch. Mơ sẹo ít được tạo ra ở vị trí ngọn lá mà thường ở đĩ chỉ cĩ sự phân hĩa rễ, sự phân hĩa rễ cũng xảy ra ở vị trí cuống lá để ngăn chặn sự lão suy của lá. 2.2.4. Mơi trường nuơi cấy mơ sẹo Sự đáp ứng của những mẫu cấy, việc cung cấp tất cả các nguyên tố khác ở mức độ tối thích phụ thuộc phần lớn vào nồng độ auxin và cytokinin. Sự đáp ứng của mẫu phụ thuộc vào cả hai lượng chất điều hịa sinh trưởng thực vật nội sinh và ngoại sinh. Auxin thường được sử dụng để khởi đầu và duy trì mơ sẹo gồm IAA (10-10 ÷ 10-5M) và NAA (10-10 ÷ 10-5M). Một vài mơ khơng thể tạo được mơ sẹo khi chỉ cĩ tác dụng của auxin mà địi hỏi cả sự cĩ mặt của cytokinin. Để duy trì mơ sẹo địi hỏi cần phải cĩ sự hiện diện của các amino acid khác nhau trong mơi trường nuơi cấy. Các amino acid thường được sử dụng trong mơi trường nuơi cấy là glycine, arginine hoặc hỗn hợp các amino acid như trong casein hydrolysate. Mơ sẹo thường tăng trưởng trong mơi trường đặc cịn mơi trường lỏng thì đơi khi cũng được sử dụng. Trước đây, người ta đã làm nhiều thí nghiệm tạo mơ sẹo trên mơi trường đặc cĩ agar, gelatine hoặc silicagen. Hiện tại cĩ những dạng xác định của acrylamide gel được dùng để làm đặc mơi trường. Agar là chất làm đặc mơi trường thơng dụng nhất và được sử dụng với nồng độ 8 ÷ 10 g/l. Một thuận tiện khi sử dụng agar để làm đặc mơi trường là khi cho vào trong nước thì nĩ trở thành dạng gel, sẽ lỏng ra ở 100oC và đặc lại ở 45oC. Đặc điểm này giúp cho mơi trường agar ổn định trong điều kiện nhiệt độ nuơi cấy mẫu. Hơn nữa agar khơng phản ứng với các chất hiện diện trong mơi trường nuơi cấy và khơng bị phân hủy bởi enzyme. Nuơi cấy trên mơi trường đặc đơi khi cũng cĩ những bất lợi, do đĩ người ta cũng sử dụng mơi trường lỏng để nuơi cấy. Ví dụ như khi nuơi trên mơi trường đặc thì chỉ cĩ một phần của mơ sẹo tiếp xúc với mơi trường nuơi cấy do đĩ sự tăng trưởng của mơ sẹo sẽ khơng đều do gradient các khống chất, sự trao đổi khí và sự tiết ra các sản phẩm cĩ độc tính ra mơi trường từ mơ sẹo. Đồng thời sự phân phối ánh sáng lên tồn bộ khối mơ sẹo khơng đều sẽ làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của mơ sẹo. Sự tăng trưởng của mơ sẹo sẽ bị giới hạn ở mặt tiếp xúc với mơi trường. Cuối cùng, mơ sẹo tăng trưởng trên mơi trường đặc khi được chuyển qua mơi trường lỏng thì khơng thể tránh khỏi sự xáo trộn bên trong mơ. Bên cạnh những hạn chế này thì việc tạo mơ sẹo trên mơi trường đặc vẫn là phương pháp được lựa chọn để duy trì việc tạo mơ sẹo. Việc nuơi cấy mơ sẹo ổn định trong mơi trường lỏng khơng lắc cĩ những thuận lợi là những hợp chất cản tiết ra từ mẫu cấy sẽ phân tán trong mơi trường chứ khơng cố định quanh mẫu như trong mơi trường đặc. Phương pháp nuơi cấy tăng trưởng này dành riêng cho sự nuơi dưỡng khống. Mơ sẹo được đặt trên một tờ giấy lọc trong một đĩa petri trên bề mặt mơi trường. Giấy lọc sẽ hút mơi trường cung cấp cho mơ đồng thời cũng giúp mơ tiếp xúc tốt với khơng khí. 2.2.5. Cấy chuyển mơ sẹo Mơ sẹo thường được chuyển sang mơi trường dinh dưỡng mới theo từng giai đoạn. Sự tăng trưởng của mẫu cấy sẽ làm tích tụ các sản phẩm thải, cạn kiệt nguồn dinh dưỡng và mơi trường bị khơ nước. Mẫu được nuơi ở 25oC thì nên được cấy chuyển sau mỗi 4 – 6 tuần. Hầu hết mơ sẹo nuơi cấy đều địi hỏi phải được phân cắt thường xuyên và đặt các mặt cắt úp trên mơi trường mới trừ khi mơ sẹo đang ở giai đoạn đầu của sự tăng trưởng. Các mẫu mơ sẹo tươi tốt khơng được cắt ra quá nhỏ, nếu khơng thì nĩ khơng thể sống được khi được chuyển sang mơi trường mới. Nếu như cứ nuơi mãi mà khơng tách ra và cấy chuyền thì mơ sẹo sẽ bị hoại tử và chết. Mơ sẹo cĩ khả năng tạo phơi sẽ tăng trưởng chậm hơn mơ sẹo khơng cĩ khả năng tạo phơi. Đây là những mơ chắc và dễ tái sinh hơn mơ khơng sinh phơi. 2.3. Giới thiệu chung về cây hoa mười giờ 2.3.1. Các đặc điểm của cây hoa mười giờ Cây hoa mười giờ cĩ nguồn gốc Nam Mỹ, nhưng được trồng rộng rãi trong các khu vực ơn đới. Tại Việt Nam hoa mười giờ được trồng trong vườn hay làm cảnh. Đây là lồi cây thích hợp với những chỗ đất ráo nước và nhiều nắng. Hoa mười giờ thuộc họ rau sam là một họ trong thực vật cĩ hoa, bên cạnh hoa mười giờ thì cịn cĩ 500 lồi khác thuộc họ rau sam đều là những cây thân thảo hay cây bụi nhỏ. Theo tạp chí Birds & Blooms, ngày 1 tháng 6 năm 2006 thì "nĩ được đưa vào các khu vườn của châu Âu khoảng 300 năm trước và nhanh chĩng thu được sự phổ biến vì các tính chất y học của nĩ. Cây mười giờ cĩ khả năng chữa một số bệnh trong y học như: bệnh co thắt cơ, làm dịu vết bỏng do thuốc súng, làm mất tiếng nghiến răng, bệnh viêm họng, bệnh chàm, ghẻ, mụn nhọt,… Trong họ rau sam cịn cĩ cây rau sam trơng nĩ gần giống với cây hoa mười giờ, cũng là lồi cây dễ mọc và cĩ rất nhiều tác dụng trong y học như làm lành vết thương, chống lão hĩa, tác dụng diệt khuẩn, giúp làm gia tăng sự co bĩp của tử cung, cĩ tác dụng diệt giun mĩc, giun kim, điều trị bệnh goute, phịng ngừa bệnh tim mạch, trị mụn trứng cá,…; các tác dụng đĩ đã được nghiên cứu và thử nghiệm trên một số động vật như chuột, chĩ, thỏ và cũng đã thử nghiệm trên một số bệnh nhân. Mặc dù chỉ là những lồi cây thân thảo rất phổ biến và dễ trồng nhưng chúng cĩ rất nhiều tác dụng tốt đối với con người mà nhiều lồi cây khác khơng cĩ. Một số bài thuốc thơng thường chữa bệnh bằng hoa mười giờ: Đau họng: nghiền cây và chiết dịch, lấy một lượng nhỏ dùng ngậm. Chàm, đinh nhọt: nghiền cây tươi đắp ngồi. Một số bài thuốc thơng thường chữa bệnh bằng rau sam: Trừ giun kim: rau sam tươi 50g, rửa sạch, thêm ít muối, giã nát, vắt lấy nước, uống liên tiếp 3 – 5 ngày, cĩ thể thêm ít đường cho dễ uống. Tẩy giun mĩc: rau sam tươi 300g giã vắt lấy nước nấu lên thêm ít muối hoặc đường, ngày uống 2 lần khi đĩi, uống trong 3 ngày. Trị mụn trứng cá: rau sam tươi khoảng 30 – 50g, rửa sạch, giã nhỏ lấy nước cốt để riêng, bã để riêng, rửa mặt sạch và lau khơ, dùng bơng y tế thấm nước cốt rau sam bơi lên mặt mụn, bơi nhiều lần trong ngày, cứ khơ là bơi tiếp, vào buổi trưa hoặc tối cĩ thể đắp xác và nước cốt rau sam lên mặt như thế khơng những các nốt mụn sẽ lặn dần mà cịn đem lại cảm giác dễ chịu. Hình 2.1. Hoa mười giờ 2.3.1.1. Vị trí phân loại Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Caryophyllales Họ: Portulacaceae Chi: Portulaca Lồi: P. grandiflora 2.3.1.2. Đặc điểm hình thái Hoa mười giờ hay cịn được gọi là rau sam hoa lớn, nĩ được gọi là mười giờ vì hoa của nĩ thường chỉ nở từ khoảng 8 – 10 giờ sáng trong ngày. Là loại cây thân thảo, cĩ những đặc điểm hình thái như sau: Thân: mọng nước, nhỏ, cĩ nhiều nhánh và lớn nhanh, thân cao khoảng 10 – 15 cm. Thân cĩ màu hồng nhạt. Lá: hình trụ, hơi dẹt, dài 1.5 – 2.0 cm, lá cĩ màu xanh nhạt Hoa: cĩ nhiều màu sắc sặc sỡ như đỏ, cam, hồng, trắng hay vàng. Hoa to, thường mọc ở đỉnh, cĩ đường kính từ 3 – 4 cm. 2.3.2. Một số nghiên cứu đã được tiến hành Năm 2006, một nhĩm sinh viên của Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh (nhĩm sinh viên gồm Nguyễn Sĩ Tuấn, Du Ngọc Yến, Hà Bảo Ngọc, Hứa Mỹ Ngọc và Nguyễn Thanh Mai) đã nghiên cứu thành cơng nuơi cấy mơ cây mười giờ và cho ra hoa trong ống nghiệm, đã cĩ thể cho cây tượng nụ và ra hoa trong khoảng thời gian 1 tháng nuơi cấy và hoa cĩ thể tươi 2 ngày kể từ khi nụ hé nở. Năm 2000, Trung tâm nghiên cứu Bhabha Atomic, Mumbai 400 085, Ấn Độ đã tiến hành nghiên cứu dùng GA3 thay đổi màu sắc và kích thước hoa mười giờ, màu hoa được thay đổi từ đỏ sang trắng hồn tồn hoặc nửa trắng nửa đỏ tùy vào lượng GA3 bổ sung, kích thước hoa tăng từ 20 – 40%. Hình 2.2. Các loại hoa mười giờ Chương 3: Vật liệu và phương pháp Thời gian và địa điểm thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 4 đến tháng 6 năm 2009 tại phịng thí nghiệm thực vật trường Đại học Kỹ Thuật Cơng Nghệ TP. Hồ Chí Minh. Vật liệu Đối tượng nghiên cứu Đối tượng chính được sử dụng trong nghiên cứu là cây hoa mười giờ (Portulaca grandiflora) được bán ở các nhà vườn. Nguồn mẫu được sử dụng là đốt thân hoa mười giờ được chọn để cấy tạo nguồn mơ sẹo để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Đốt thân hoa mười giờ được chọn phải to, khỏe, tươi, thân cĩ màu hồng nhạt. Trang thiết bị và dụng cụ Thiết bị: tủ vơ trùng, nồi hấp, máy đo pH, cân điện tử, máy lạnh, kệ đặt bình, đèn neon,… Dụng cụ: pince, kéo, dao cấy, chai nước biển 500ml, đĩa thủy tinh, đèn cồn, đũa thủy tinh. Các loại mơi trường nuơi cấy Mơi trường sử dụng là mơi trường muối khống cơ bản của Murashige và Skoog (1962), cĩ bổ sung thêm đường sucrose (30g/l), agar (10g/l) và các chất điều hịa tăng trưởng thực vật. Tùy theo mục đích của từng thí nghiệm mà mơi trường cĩ thể bổ sung các chất điều hịa sinh trưởng ở những nồng độ khác nhau. Mơi trường sau khi được bổ sung đầy đủ các chất cần thiết thì được điều chỉnh về pH = 5.7 ± 0.05 (bằng KOH 1N và HCl 1N) trước khi hấp khử trùng bằng autoclave ở 1atm, 121oC trong 30 phút. Điều kiện nuơi cấy ở phịng nuơi cấy in vitro Thời gian chiếu sáng: 10 giờ/ngày Cường độ chiếu sáng: 2500 lux Nhiệt độ: 25oC Khử trùng mẫu Mẫu thân sau khi được cắt ra thì cắt bỏ hết lá, cắt thành từng đoạn khoảng 3cm rồi khử trùng theo các bước sau: Khử trùng sơ bộ Mẫu đốt thân được cho vào một cái cốc đặt dưới vịi nước chảy khoảng 30 phút để loại bỏ bớt sự nhiễm bẩn bề mặt. Rửa kỹ từng đốt thân trong nước rửa chén sunlight pha lỗng. Rửa sạch lại bằng nước máy khoảng 3 – 4 lần rồi đưa vào tủ cấy. Khử trùng mẫu trong tủ cấy Chuyển mẫu đốt thân từ cốc sang một erlen đã được hấp khử trùng. Cho dung dịch Javel (NaOCl) 7% cĩ bổ sung thêm 1 – 2 giọt Tween 20 vào erlen rồi lắc khử trùng mẫu đốt thân trong các khoảng thời gian khác nhau. Rửa sạch mẫu lại bằng nước cất vơ trùng khoảng 3 – 4 lần. Ngâm mẫu trong nước cất vơ trùng để chuẩn bị tiến hành các thí nghiệm. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu đốt thân hoa mười giờ bằng dung dịch Javel 7% cĩ bổ sung thêm Tween 20 Mục đích thí nghiệm Xác định thời gian khử trùng thích hợp đối với mẫu cấy đốt thân để tìm ra thời gian khử trùng cho tỉ lệ nhiễm và chết thấp nhất để mẫu cấy vẫn cĩ khả năng tăng trưởng và phát triển để cĩ nguồn mẫu thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Tiến hành thí nghiệm Mẫu sau khi thu nhận được khử trùng sơ bộ và đưa vào tủ cấy, tiến hành khử trùng bằng dung dịch Javel 7% cĩ bổ sung Tween 20 với các khoảng thời gian lần lượt như trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ bằng dung dịch Javel 7% cĩ bổ sung thêm Tween 20 Nghiệm thức Nồng độ Natri hypochlorit (%) Thời gian (phút) 1 7 5 2 7 7 3 7 10 4 7 15 Chỉ tiêu theo dõi Tỉ lệ nhiễm của mẫu cấy ứng với các khoảng thời gian khử trùng khác nhau. Ghi nhận kết quả và chọn thời gian khử trùng cĩ tỉ lệ mẫu cấy nhiễm ít nhất đồng thời tỉ lệ mẫu sống sĩt phải cao để áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên sự phát sinh mơ sẹo Mục đích thí nghiệm Đánh giá tác động của chất kích thích tăng trưởng IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên sự phát sinh mơ sẹo. Tiến hành thí nghiệm Mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ sau khi khử trùng, cắt bỏ hai đầu của đốt thân cĩ màu trắng đục do tác động của chất khử trùng và cắt đốt khoảng 0.5cm để nuơi cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung 30 g/l đường sucrose, 10 g/l agar và các chất điều hịa tăng trưởng thực vật như trong bảng 3.2. Bảng 3.2. Mơi trường khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên sự phát sinh mơ sẹo của mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ Ký hiệu IBA (mg/l) BA (mg/l) Kinetine (mg/l) A0 - - - A1 0.1 0.1 - A2 0.25 0.25 - A3 0.5 0.5 - A4 0.1 - 0.1 A5 0.25 - 0.25 A6 0.5 - 0.5 Sau 4 tuần, ghi nhận sự phát sinh mơ sẹo của mẫu cấy. Đánh giá hình thái của mơ sẹo ở từng nồng độ khác nhau. Cân để xác định trọng lượng mơ sẹo ở từng mẫu. Chỉ tiêu theo dõi Quan sát màu sắc, hình dạng, đặc điểm, trọng lượng của mơ sẹo phát sinh sau 4 tuần theo dõi. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ các dịng mơ sẹo khác nhau. Mục đích thí nghiệm Đánh giá khả năng tái sinh chồi từ hai dịng mơ sẹo khác nhau trên cùng một mơi trường. Tiến hành thí nghiệm Các dịng mơ sẹo thu được ở thí nghiệm 2 được cấy chuyển vào mơi trường bổ sung IBA và BA hoặc Kinetin nhưng với tỉ lệ cytokinin cao hơn (tỉ lệ auxin:cytokinin = 1:5) để đánh giá khả năng tái sinh chồi từ các dịng mơ sẹo khác nhau. Bảng 3.3. Mơi trường khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo Ký hiệu IBA (mg/l) BA (mg/l) Kinetine (mg/l) Auxin/cytokinin B0 - - - - B1 0.1 0.5 - 1:5 B2 0.1 - 0.5 1:5 Sau 4 tuần, ghi nhận hình thái mơ sẹo, khả năng tái sinh chồi ở hai dịng mơ sẹo khác nhau. Chọn dịng mơ sẹo cĩ khả năng tái sinh chồi tốt nhất để tiến hành thí nghiệm tiếp theo. Chỉ tiêu theo dõi Quan sát khả năng tái sinh chồi, đếm số lượng chồi, đo chiều cao chồi, hình thái chồi. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA và BA lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo Mục đích thí nghiệm Đánh giá khả năng tái sinh chồi của dịng mơ sẹo từ thí nghiệm trên khi được nuơi cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung các chất kích thích tăng trưởng IBA và BA ở các nồng độ khác nhau. Tiến hành thí nghiệm Từ thí nghiệm 3, chọn dịng mơ sẹo cĩ khả năng tái sinh chồi tốt nhất và nuơi cấy trên mơi trường cĩ bổ sung IBA và BA ở các nồng độ khác nhau như trong bảng 3.4. Bảng 3.4. Mơi trường khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo ở các nồng độ khác nhau Ký hiệu IBA (mg/l) BA (mg/l) Auxin/cytokinin C1 0.1 0.25 1:2.5 C2 0.1 0.5 1:5 C3 0.1 0.75 1:7.5 C4 0.1 1.0 1:10 C5 0.25 0.5 1:2 C6 0.25 0.75 1:3 C7 0.25 1.0 1:4 C8 0.25 1.25 1:5 Sau 4 tuần, ghi nhận khả năng tái sinh chồi của mơ sẹo trên mơi trường cĩ bổ sung IBA và BA ở các nồng độ khác nhau, tiến hành đếm số lượng chồi thu được và đo chiều cao chồi. Chỉ tiêu theo dõi Quan sát khả năng tái sinh chồi, đặc điểm chồi, số lượng chồi thu được, đo chiều cao chồi. Phương pháp xử lý số liệu Tất cả các số liệu sau khi được đo đạc, tính tốn ứng với từng chỉ tiêu theo dõi được phân tích, xử lý thống kê bằng chương trình MS – EXCEL biểu diễn dưới dạng trung bình mẫu ± độ lệch chuẩn và xử lý bằng chương trình Statgraphics. Chương 4: Kết quả - Thảo luận 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu đốt thân hoa mười giờ bằng dung dịch Javel 7% cĩ bổ sung thêm Tween 20 Mẫu đốt thân hoa mười giờ sau khi được khử trùng sơ bộ bên ngồi dưới vịi nước chảy và nước rửa chén sunlight pha lỗng sẽ được đưa vào tủ cấy để tiến hành khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel 7% cĩ bổ sung vài giọt Tween 20 với các khoảng thời gian khác nhau. Mẫu đốt thân sau khi khử trùng sẽ được cắt bỏ hai đầu của đốt thân cĩ màu trắng đục do tác dụng của chất khử trùng, sau đĩ cắt từng đoạn ngắn khoảng 0.5cm và cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.1 mg/l BA. Tỉ lệ mẫu nhiễm được ghi nhận sau 1 tuần nuơi cấy và trình bày trong bảng 4.1 Bảng 4.1. Kết quả khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ Thời gian khử trùng (phút) Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) Tỉ lệ mẫu chết (%) Tỉ lệ mẫu sống (%) 5 7 10 15 10.4c (*) 4.2b 0a 0a 0a 35.4b 43.75c 68.75d 89.6a 60.4b 56.25b 31.25c Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái khơng cùng kí tự thì cĩ sự khác biệt rất cĩ ý nghĩa về mặt thơng kê với mức xác suất P = 0,05. Từ bảng kết quả cho thấy thời gian khử trùng ở 5 phút thì tỉ lệ mẫu bị nhiễm cao (10,4%) so với các khoảng thời gian khác nhưng mẫu khơng bị chết. Ở thời gian 10 và 15 phút thì tỉ lệ mẫu chết lại cao (tương ứng là 43,75% và 68,75%), ở 15 phút mẫu chết khá nhiều vì để mẫu lâu trong dung dịch Javel 7% thì mẫu cấy bị tổn thương và dẫn đến chết mẫu cấy sau đĩ. Do đĩ thời gian khử trùng tốt nhất đối với mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ là 5 phút với Javel 7% cĩ bổ sung thêm 1 – 2 giọt Tween 20. Khi tiến hành nuơi cấy mơ thực vật thì vấn đề quan trọng nhất là phải tạo được nguồn mẫu ban đầu đảm bảo vơ trùng. Mục đích của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ đảm bảo vơ trùng và vẫn cĩ khả năng tăng trưởng để tạo ra nguồn nguyên liệu ban đầu cho các thí nghiệm tiếp theo. Cĩ rất nhiều nguyên nhân gây ra sự nhiễm trùng trong quá trình nuơi cấy như từ mẫu cấy, người cấy, hệ thống lọc khí trong tủ cấy, cơn trùng, dụng cụ hay bản thân mơi trường nuơi cấy. Mơi trường nuơi cấy mơ thực vật cĩ chứa đường, muối khống và vitamin rất thích hợp cho các lồi nấm và vi khuẩn phát triển, tốc độ phát triển của nấm và vi khuẩn rất nhanh so với tế bào thực vật nên rất dễ nhiễm nấm hay vi khuẩn và tốc độ lan truyền rất nhanh gây ảnh hưởng lớn đến mẫu hoặc thường gây chết mẫu. Nếu nhiễm vi khuẩn thì sẽ thấy trên bề mặt lớp mơi trường cĩ một lớp màng mỏng cĩ màu trắng đục, màu vàng, hồng, cam,… Những loại vi khuẩn thường gặp ở mơ thực vật là: Agrobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Xanthomonas,… Nếu nhiễm nấm thì thường thấy một lớp dày trên bề mặt lớp mơi trường cĩ màu xanh, nâu, xám, trắng, đen,… Nếu việc nhiễm trùng phát đi từ vùng tiếp xúc giữa mơ và mơi trường cấy thì đây là nhiễm do mơ cấy. Nếu sự nhiễm đi từ một điểm bất kỳ nào đĩ trong mơi trường thì nguồn nhiễm cĩ thể do khơng khí hoặc sự khử trùng mơi trường khơng tốt hoặc do nhiễm từ khơng khí xung quanh. (Dương Cơng Kiên, 2002). Khử trùng mẫu cấy là việc làm khĩ vì mẫu sống khơng thể khử trùng bằng nhiệt độ cao mà mẫu phải giữ được bản chất sinh học của nĩ. Do đĩ, mẫu cấy phải được khử trùng bằng các dung dịch khử trùng như: Hypoclorite calcium Ca(OCl)2, Hypochlorite sodium NaOCl, Clorur thủy ngân HgCl2, H2O2,… Ở đây sử dụng dung dịch Javel 7% (Hypochlorite sodium). Các chất khử trùng phải ức chế hoặc phá hủy sự tăng trưởng của vi sinh vật. Hiệu lực của các chất khử trùng phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mơ cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mơ cấy và cĩ độc tính thấp đối với mơ cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn thì ta cĩ thể thêm Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) vào dung dịch khử trùng sẽ làm tăng hiệu quả khử trùng vì làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mơ thực vật do vậy bề mặt tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn. (Nguyễn Đức Lượng – Lê Thị Thủy Tiên, 2006). Cơ chế tác động của chất khử trùng là: phá hủy lớp màng phospholipid, phân hủy lipid và acid béo, hình thành chloramine – cản trở quá trình biến dưỡng của tế bào vi sinh vật; gây oxy hĩa ức chế khơng thuận nghịch các loại enzyme của vi sinh vật cần thiết cho quá trình biến dưỡng, phân chia tế bào, hình thành vách tế bào, sinh tổng hợp lipid, vận chuyển các electron trong quá trình hơ hấp của tế bào vi sinh vật. 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hịa IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên sự phát sinh mơ sẹo Tác động của các chất điều hịa tăng trưởng thực vật được ghi nhận sau 4 tuần nuơi cấy, kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.2 và 4.3 Bảng 4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA lên sự phát sinh mơ sẹo Mơi trường Trọng lượng mơ sẹo trung bình (g) 0.1 mg/l IBA + 0.1 mg/l BA 0.4752b (*) 0.25 mg/l IBA + 0.25 mg/l BA 1.0160b 0.5 mg/l IBA + 0.5 mg/l BA 1.6637a Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái khơng cùng kí tự thì cĩ sự khác biệt rất cĩ ý nghĩa về mặt thơng kê với mức xác suất P = 0,05. Bảng 4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với Kinetine lên sự phát sinh mơ sẹo Mơi trường Trọng lượng mơ sẹo trung bình (g) 0.1 mg/l IBA + 0.1 mg/l Kinetine 0.0953b (*) 0.25 mg/l IBA + 0.25 mg/l Kinetine 0.0963b 0.5 mg/l IBA + 0.5 mg/l Kinetine 0.1608a Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái khơng cùng kí tự thì cĩ sự khác biệt rất cĩ ý nghĩa về mặt thơng kê với mức xác suất P = 0,05. Các mẫu cấy trong mơi trường MS khơng bổ sung chất kích thích tăng trưởng thì mẫu cấy chỉ kéo dài ra sau đĩ đen dần và chết. Các loại auxin và cytokinin khác nhau cĩ tương tác khác nhau. Do đĩ, ảnh hưởng của chúng lên mẫu cấy cũng khác nhau. Trong mơi trường MS cĩ bổ sung thêm IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine dù ở nồng độ nào thì vẫn hình thành mơ sẹo nhưng loại cytokinin khác nhau thì cho loại mơ sẹo khác nhau. Nếu là IBA kết hợp với BA thì hình thành loại mơ sẹo đặc, cĩ màu trắng vàng và nâu nhạt, xốp bơng, mơ sẹo phát triển nhanh. Cịn IBA kết hợp với Kinetine thì hình thành loại mơ sẹo cứng, cĩ màu nâu đen, ít hoặc ko xốp, mơ sẹo phát triển chậm. Điều này cũng được chứng minh bởi Mehra và Jaidka, 1985; Pal và cộng sự, 1985; Shrikhande và cộng sự, 1993). Nếu giữ nguyên nồng độ và loại auxin trong mơi trường nuơi cấy, nhưng thay đổi thành phần và nồng độ cytokinin thì hình thái mơ sẹo thay đổi. Tốc độ tăng trưởng của mơ sẹo phụ thuộc vào thành phần, cũng như nồng độ của auxin (Bonner và Galston, 1959; De Garcia và Martnez, 1995; Grant và Fuller, 1968). Nồng độ auxin tăng cao kích thích tạo mơ sẹo dạng bở nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mơ sẹo cĩ dạng nốt và chắc (Ceriani và cộng sự, 1992). Auxin cĩ vai trị quan trọng trong sự tạo mơ sẹo (Ahloowalia, 1991; Komamin và cộng sự, 1992; Liu và cộng sự, 1993; Zimmerman, 1993). Trong mơi trường nuơi cấy, auxin thường gây ra sự tạo bướu ở các mơ và cơ quan, kích thích sự phân chia tế bào (tạo mơ sẹo), kích thích sự tạo rễ bất định, gây ra sự phát sinh phơi từ tế bào soma từ các huyền phù tế bào (Pierik, 1987). Khi nồng độ auxin thấp thì sự tạo rễ bất định chiếm ưu thế, khi nồng độ auxin cao sẽ khơng cĩ sự tạo rễ nhưng lại xảy ra sự tạo mơ sẹo (Torres, 1989). Đa số mẫu cấy thực vật thuộc nhĩm song tử diệp khơng cĩ khả năng tạo mơ sẹo trong mơi trường chỉ cĩ auxin mà cần phải cĩ một sự phối hợp giữa cytokinin và auxin (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006). Đối với cây hoa mười giờ cũng là cây thuộc nhĩm song tử diệp nên mơi trường nuơi cấy cĩ sự kết hợp giữa auxin và cytokinin là rất cần thiết cho cây để tạo mơ sẹo. Điều này cũng được chứng minh bởi Shrikhande và cộng sự, 1993 khi nghiên cứu trên tử diệp cây mầm Azadirachta indica A. cần IAA ở nồng độ 0.5 mg/l và BA 1.0 mg/l để cĩ thể tạo mơ sẹo ; lá của Solanum tuberosum L. cần cĩ sự phối hợp giữa 2,4-D 3.0 mg/l, NAA 1.0 mg/l và kinetine 0.2 mg/l cho sự tạo mơ sẹo (Nguyễn Đức Thành, 1983). Cĩ một số cơng trình nghiên cứu của Libbenga và Torrey, 1973 ; Simpson và Torrey,1977 trên mơ rễ cây đậu nành, ghi nhận cĩ sự tổng hợp DNA trước khi phân bào thì cần auxin và cytokinin. Nếu mơi trường chỉ cĩ auxin thì hàm lượng DNA được ghi nhận là khơng thay đổi. Khi nồng độ auxin tăng thì nhận thấy trọng lượng tươi của mơ sẹo cũng tăng lên, do auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng nhưng hầu như khơng tác động trên mơ phân sinh sơ cấp, nên auxin tác động lên sự tăng trưởng theo đường kính. Sau một thời gian nuơi cấy, nồng độ auxin nội sinh sẽ từ từ tăng lên (Phan Hồng Anh, 2000). Khả năng tạo mơ sẹo của mơ và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hĩa và kiểu gen (Torres, 1989). Sự tăng sinh của mơ sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất điều hịa sinh trưởng thực vật ngoại sinh áp dụng trong mơi trường nuơi cấy (Pal, Banerjee và Dhar, 1985). Do vậy, việc chọn lựa ở cơ quan để tiến hành cấy vơ mẫu ban đầu là rất quan trọng, ở thí nghiệm này mẫu cấy được chọn là những đốt thân cịn non ở cây tươi, khỏe, kết quả thu được sau khi vơ mẫu là mơ sẹo để tiến hành thí nghiệm 3. 3 2 1 Hình 4.1. Mơ sẹo ở mơi trường cĩ bổ sung IBA kết hợp với BA [1]: Mơi trường bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.1 mg/l BA [2]: Mơi trường bổ sung 0.25 mg/l IBA và 0.25 mg/l BA [3]: Mơi trường bổ sung 0.5 mg/l IBA và 0.5 mg/l BA 3 2 1 Hình 4.2. Mơ sẹo ở mơi trường cĩ bổ sung IBA kết hợp với Kinetine [1]: Mơi trường bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.1 mg/l Kinetine [2]: Mơi trường bổ sung 0.25 mg/l IBA và 0.25 mg/l Kinetine [3]: Mơi trường bổ sung 0.5 mg/l IBA và 0.5 mg/l Kinetine Mơ sẹo là một đám tế bào khơng phân hĩa, cĩ đặc tính phân chia mạnh, thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ (Bùi Trang Việt, 2000). Các tế bào thuộc các mơ hoặc các cơ quan này, trừ các tế bào của mơ phân sinh, phải chịu một sự phản phân hĩa trước lần phân chia đầu tiên (Halperin, 1969). Sự phản phân hĩa cĩ vai trị rất quan trọng, nĩ cho phép một tế bào đã trưởng thành trở lại trạng thái trẻ (trẻ hĩa). Sự trẻ hĩa giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạo phơi soma trong điều kiện thích hợp (Pierik, 1987). Các tế bào thuộc các mơ hoặc các cơ quan đã phân hĩa của các cây song tử diệp thường phản phân hĩa dưới tác động của auxin riêng rẽ hay kết hợp với một cytokinin để cho ra mơ sẹo. Mơ sẹo được tạo ra ngồi nguyên nhân do các tế bào nhu mơ chịu sự phản phân hĩa cịn do sự phân chia các tế bào tượng tầng, sự xáo trộn trong các mơ phân sinh sơ khởi hay sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan (Hunault, 1979). Khi đặt trong mơi trường, các mẫu cấy sẽ phồng ra, dày lên do sự hấp thu nước, dinh dưỡng và các chất điều hịa sinh trưởng thực vật. Cĩ rất nhiều mơ và cơ quan thực vật cĩ thể được sử dụng để làm vật liệu tạo mơ sẹo như: thân, lá, phát hoa, cuống lá, rễ,… (Street, 1969) ; ở thí nghiệm này sử dụng mẫu cấy là đốt thân hoa mười giờ, khi cấy vào mơi trường đã bổ sung auxin và cytokinin thì mẫu cấy phồng ra và chỗ phồng đĩ to dần tạo thành mơ sẹo. Điều này cũng được chứng minh bởi Ochatt và Caso (1986) người ta cĩ thể tạo được mơ sẹo từ nhiều loại cơ quan khác nhau của một cơ thể thực vật. Tuy nhiên, với mỗi loại mơ hay cơ quan thường phải sử dụng các chất điều hịa sinh trưởng thực vật với loại và nồng độ khác nhau tùy theo mức độ nhạy cảm của các tế bào trong mơ hay cơ quan đĩ. Mơ sẹo phát sinh từ gân và cuống cịn sĩt lại trên lá sớm hơn từ phần phiến lá gần như đồng thời với sự phát sinh mơ sẹo từ thân và cuống. Điều này cĩ thể hiểu là do gân cĩ kiểu phân chia giống như thân và cuống (Bùi Trang Việt, 2000), mà thân, cuống (với mơ vỏ) cĩ xu hướng tạo mơ sẹo hơn mơ lá (Dương Cơng Kiên, 2003). Chọn mẫu cấy là đốt thân vì mẫu đốt thân non, cĩ xu hướng tạo mơ sẹo hơn mơ lá, mơ lá hoa mười giờ quá nhỏ nên khĩ tạo mơ sẹo. Cây non (nguyên vẹn hay được cắt đoạn)hay mảnh thân non của cây trưởng thành dễ cho mơ sẹo trong điều kiện nuơi cấy in vitro, dưới tác động của một auxin mạnh được áp dụng riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin (Bùi Trang Việt, 2000). Nhờ vậy trong thân non ‘Sorbone’ cĩ thể tồn tại một lượng auxin nội sinh khá cao nên khi mơi trường khơng chứa bất kì chất điều hịa nào, các mẫu cấy vẫn cĩ thể tạo mơ sẹo và lên chồi. Sự phát triển của mơ sẹo cĩ thể chia thành 3 giai đoạn: cảm ứng, phân chia tế bào và phân hĩa. Ở giai đoạn phân chia, tế bào mơ cấy trở về dạng phân sinh hay trạng thái phản phân hĩa. Trong giai đoạn thứ ba, mẫu cấy hình thành nhiều loại mơ sẹo khác nhau và cĩ thể hình thành đỉnh chồi, rễ sơ khởi hay tiền phơi. Kết quả thí nghiệm cho thấy chất kích thích tăng trưởng ở nồng độ nào cũng đều cảm ứng tạo mơ sẹo, nên sử dụng mơi trường nuơi cấy là 0.1 mg/l IBA kết hợp với 0.1 mg/l BA hoặc 0.1 mg/l Kinetine vì ở mơi trường này vẫn hình thành mơ sẹo mà lại tiết kiệm được lượng chất kích thích điều hịa tăng trưởng thực vật. Theo Skoog, tỉ lệ A/C gần một đơn vị sẽ thu được sinh tạo mơ sẹo. Sự phát sinh chồi ở Torenia cũng tuân theo nguyên tắc về tỉ lệ A/C: A/C cao sẽ kích thích tạo rễ, A/C tiến gần về 1 sẽ kích thích tạo mơ sẹo, từ những mơ sẹo này sau đĩ hình thành chồi gián tiếp, A/C thấp sẽ kích thích tạo chồi trực tiếp. Tỉ lệ giữa A/C xác định sự tạo cơ quan, tỉ lệ cao tạo chồi, tỉ lệ thấp tạo rễ (Skoog và Tsui, 1948; Miller và Skoog, 1953; Paulet, 1965; Gautheret, 1959). 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ các dịng mơ sẹo khác nhau Mục đích thí nghiệm xem xét khả năng tái sinh chồi từ các dịng mơ sẹo thu được ở thí nghiệm 2 từ đĩ tìm ra được dịng mơ sẹo cĩ khả năng cảm ứng lượng chồi nhiều phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Hình thái mơ sẹo phụ thuộc rất nhiều vào loại cũng như nồng độ của các chất điều hịa sinh trưởng thực vật hiện diện trong mơi trường nuơi cấy. Qua số thí nghiệm, ghi nhận nếu giữ nguyên nồng độ và loại auxin trong mơi trường nuơi cấy, nhưng thay đổi thành phần và nồng độ cytokinin thì hình thái của mơ sẹo thay đổi (Mehra và Jaidka, 1985; Pal và cộng sự, 1985; Shrikhande và cộng sự, 1993). Ở thí nghiệm 3 lượng auxin giữ nguyên cịn lượng cytokinin tăng (auxin/cytokinin = 1:5) thì cĩ sự tạo chồi từ mơ sẹo. Những mơ sẹo sau khi thành lập sẽ phát sinh chồi do tác động của cytokinin ngoại sinh. Vì vậy, tổng số chồi tạo ra là kết quả của cả hai quá trình phát sinh trực tiếp và gián tiếp. Tuy nhiên, sự hình thành chồi từ mơ sẹo khơng kéo dài do hoạt tính của cytokinin giảm theo thời gian. Do đĩ, đến một thời điểm nào đĩ, mặc dù mơ sẹo cịn nhưng chồi khơng phát sinh. Lượng auxin nội sinh lúc này sẽ cĩ tác dụng lên quá trình tạo rễ là chủ yếu. Sự dừng phát sinh chồi từ mơ sẹo sẽ sớm hơn cũng như số lượng và chiều dài rễ tạo ra sẽ lớn hơn khi sử dụng cytokinin hoạt tính thấp hơn. Khả năng tái sinh chồi của 2 dịng mơ sẹo được ghi nhận và trình bày trong bảng 4.4. Bảng 4.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên sự phát sinh chồi từ hai dạng mơ sẹo khác nhau Nghiệm thức Mơi trường Số chồi trung bình Chiều cao chồi TB (cm) 1 0.1 mg/l IBA + 0.5 mg/l BA 12a(*) 1.24b 2 0.1 mg/l IBA + 0.5 mg/l Kinetine 9b 1.34a Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái khơng cùng kí tự thì cĩ sự khác biệt rất cĩ ý nghĩa về mặt thơng kê với mức xác suất P = 0,05. Tuy nhiên, xét về mặt hình thái thì các chồi trong mơi trường cĩ chất điều hịa khác nhau cũng rất khác nhau.Trên mơi trường cĩ bổ sung IBA và BA, mơ sẹo tái sinh chồi, chồi khỏe, cĩ thân màu hồng nhạt, ở ngọn chồi cĩ màu trắng, chồi ra lá tươi, cĩ màu xanh; trên mơi trường cĩ bổ sung IBA và Kinetin, mơ sẹo cũng cĩ khả năng tái sinh chồi nhưng chồi yếu, cĩ màu hồng nhạt, đầu chồi bị đen và chồi chết dần từ ngọn xuống (Hình 4.3). Cytokinin thuận lợi cho sự phân nhánh của các chồi non của cây thân thảo. Để tăng hệ số nhân giống người ta tăng nồng độ cytokinin trong mơi trường nuơi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro. Nhĩm cytokinin đẩy nhanh sự phân chia tế bào, sự nhân chồi và sự phát triển chồi. Các chồi đang tăng trưởng được kích thích mạnh mẽ bởi nồng độ cytokinin. Từ nhiều nghiên cứu, người ta rút ra kết luận vai trị của cytokinin trong nuơi cấy chồi: tăng sinh chồi bên, tạo chồi bất định, cản sự tạo rễ (nồng độ cytokinin cao từ 0.5 – 10 mg/l thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ, đồng thời cũng cản sự tăng trưởng của rễ và cản hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin). Cytokinin là một nhĩm hormon thực vật đặc biệt đĩng vai trị chính trong chu trình tế bào và ảnh hưởng đến nhiều quá trình phát triển. Srinivasan và Mullin phát biểu rằng các cytokinin ngoại sinh hoạt hĩa các cytokinin nội sinh đang đi lên trong mạch mộc. Sự thiếu hụt cytokinin ở thực vật sẽ làm xuất hiện các chồi bị lùn, đồng thời các đỉnh sinh trưởng nhỏ lại, ti thể và lạp thể kéo dài ra, sự tạo tế bào mới chỉ cịn khoảng 3 – 4% so với bình thường. Ngồi ra, các đỉnh sinh trưởng rễ của các cây này phình to, phát triển nhanh hơn và cĩ nhiều rễ nhánh hơn. Tất cả các hiện tượng trên cho thấy rằng cytokinin là một yếu tố rất quan trọng ở thực vật giúp điều hịa hoạt động và kiểm sốt sự phát sinh hình thái của đỉnh sinh trưởng. Qua thí nghiệm điều khiển sự hình thành cơ quan từ đốt thân của cây thuốc lá, Skoog thấy rằng hoạt động của cytokinin cĩ ảnh hưởng đáng kể đến ribonucleic acid (RNA), ơng cho rằng cytokinin điều hịa sự hình thành cơ quan thơng qua việc ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp các yếu tố sinh trưởng khác như: thiamin, auxin, ngồi ra cytokinin cịn đĩng vai trị như các chất điều hịa sự sinh tổng hợp protein. Qua đĩ thấy được một hiện tượng rất phổ biến trong sinh vât, đĩ là sự xuất hiện của yếu tố này làm thay đổi ngưỡng của yếu tố khác. Ảnh hưởng của cytokinin trên mơ, cơ quan nuơi cấy phụ thuộc vào loại cytokinin sử dụng, kiểu nuơi cấy, lồi thực vật được nuơi cấy và mẫu cấy thu từ mơ cịn non hay mơ đã trưởng thành. BA kích thích sự tăng sinh chồi bên của Castanea, trong khi kinetine khơng cĩ ảnh hưởng gì cả, kinetine chỉ kích thích sự tạo chồi bên trong quá trình nuơi cấy chồi Prunus và để tăng sinh chồi cần sử dụng đến BA. Qua các kết quả trên cho thấy được vai trị của chất điều hịa sinh trưởng thực vật ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái thực vật là rất đáng kể và rất khác nhau giữa các lồi. Khơng chỉ cĩ thể tái sinh chồi thơng qua mơ sẹo mà cịn cĩ thể tái sinh chồi trực tiếp từ các cơ quan như: lá, thân, cuống lá, chồi ngủ, đế hoa, lát mỏng tế bào,… Những chồi phát sinh từ những mơ trưởng thành khơng liên quan đến mơ phân sinh ngọn gọi là chồi bất định. Về cơ bản, mọi cơ quan thực vật đều cĩ khả năng tái sinh các mơ phân sinh ngọn chồi bởi sự sinh cơ quan trực tiếp hay gián tiếp. Ở các cây hạt kín, nguồn gốc của chồi cĩ thể là tế bào biểu bì, mơ hàng rào, mơ khuyết hay mơ bao quanh mạch của mơ cấy. Trước khi phân hố để tạo mới chồi thì mọi tế bào đã phân hố đều phải được tái hoạt động. Sự tái hoạt động trong quá trình phát sinh cơ quan cần phải được cảm ứng bằng cách: gỡ hiệu ứng cản tương quan trên cây nguyên, như cắt chồi ngọn để gỡ ưu tính ngọn; hoặc dùng mơi trường thích hợp cho mơ cấy mơ in vitro. Các thí nghiệm tạo chồi bất định thường cho kết quả cao khi sử dụng cytokinin ở nồng độ cao và auxin từ nồng độ thấp đến trung bình (Gaspar và cs., 2003). Kết quả này đã được ghi nhận trên nhiều đối tượng như Diospyros kati Thunb. (Choi, 2001), cà chua Licopersicon esculentum L. (Chaudary, 2001), hoa loa kèn Zantedeschia albomaculata (Chang, 2003), Crataeva adansonii (dc.) prodr. (Sharma, 2003), khoai tây (Yasmin, 2003). 2 1 Hình 4.3. Chồi được tái sinh từ 2 dịng mơ sẹo trên 2 mơi trường khác nhau [1]: Mơi trường cĩ bổ sung IBA và BA [2]: Mơi trường cĩ bổ sung IBA và Kinetine Trong sự khởi đầu và điều hồ sự tăng trưởng của cơ quan, chất điều hịa tăng trưởng thực vật cĩ vai trị quan trọng. Khi nuơi cấy trên mơi trường cĩ cytokinin và auxin thì sự phát triển chồi được kích thích. Cần cĩ một sự cân bằng về nồng độ của từng loại hormone trong từng loại mơ, ở từng vị trí chuyên biệt. Khi tỷ lệ cytokinin/auxin (C/A) cao thì kích thích tạo chồi; ngược lại tỷ lệ C/A thấp thì kích thích tạo rễ (Bùi Trang Việt, 2000) và dựa vào thí nghiệm 2 nên ở thí nghiệm 3 cấy mẫu trên mơi trường sử dụng 0.1 mg/l IBA kết hợp với 0.5 mg/l BA hoặc 0.5 mg/l Kinetine. Sự phát sinh chồi ở Torenia cũng tuân theo nguyên tắc về tỉ lệ A/C: A/C cao: kích thích tạo rễ, A/C tiến gần về 1: kích thích tạo mơ sẹo, từ những mơ sẹo này sau đĩ hình thành chồi gián tiếp, A/C thấp: kích thích tạo chồi trực tiếp. Tỉ lệ giữa A/C sẽ xác định sự tạo cơ quan: tỉ lệ cao: tạo chồi, tỉ lệ thấp: tạo rễ (Skoog và Tsui, 1948; Miller và Skoog, 1953; Paulet, 1965; Gautheret, 1959). Một nồng độ cytokinin cao phối hợp với auxin nồng độ thấp rất quan trọng trong việc tạo chồi ở nhiều lồi thực vật khác nhau như Begonia (Ringe và Nitsch, 1968; Heide, 1965), cây cải ốc biển (horse radish) (Wurm, 1960; Sastri, 1963), cây mao địa hồng (foxglove) (Dolfus và Nicolas-Prat, 1969), Atropa belladonna (Zenkteler, 1971) và cây bơng cải (Margara, 1969). Ngồi ra, sự tái sinh chồi cịn phụ thuộc vào hiện tượng ưu thế ngọn và sự hình thành các mơ phân sinh bên để hình thành các chồi bên mới dọc theo trục của chồi chính. Ưu thế ngọn là một hiện tượng do chồi đỉnh ức chế sự phát triển của các chồi bên nằm bên dưới. Trong điều kiện nuơi cấy in vitro, cĩ rất nhiều nhân tố ảnh hưởng đến tăng trưởng và phát triển của chồi, cũng như sự ức chế mối tương quan giữa chồi đỉnh và chồi bên nằm dưới chồi đỉnh. Trong các loại chất điều hồ tăng trưởng, thì auxin và cytokinin được sử dụng để điều hồ hiện tượng ưu tính ngọn. Theo mơ hình giải thích cổ điển thì: auxin được tổng hợp tại ngọn, sau đĩ di chuyển trong libe (hữu cực) và trong tế bào (vơ cực) đến cơ quan cuối cùng là rễ. Auxin điều hồ một cách trực tiếp hoặc gián tiếp thơng qua các cơ chế khác bao gồm hoạt hố các chất điều hồ thứ cấp, điều hồ tỷ lệ A/C. Khi gia tăng hàm lượng cytokinin trong mơ thì hiện tượng ưu tính ngọn bị phá vỡ sự bật chồi được kích thích bởi cytokinin; trái ngược với tác động của auxin (Bùi Trang Việt, 2000). Áp dụng vào thí nghiệm này cũng sử dụng auxin (IBA) và cytokinin (BA hoặc Kinetine). BA là loại cytokinin cĩ hiệu quả cao trong sự cảm ứng tạo chồi ở nhiều lồi thực vật. Các loại cytokinin khác (kinetine, 2i – P, PBA và zeatin) cũng cĩ thể được sử dụng nhưng ít hơn BA (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006). Kết quả thí nghiệm 3 cho thấy khi kết hợp IBA và BA thì cho số chồi nhiều, cịn sự kết hợp của IBA và Kinetine thì cho số chồi ít nhưng chồi kéo dài thân. Để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo là cần số chồi để tiến hành tiếp nên tiếp tục khảo sát ở dải nồng độ khác nhau của IBA và BA để đưa ra được nồng độ thích hợp nhất cho số chồi nhiều nhất. Hầu hết những bằng chứng về nhu cầu cytokinin đặc biệt đều được thực hiện trong nuơi cấy chồi của nhiều lồi thực vật khác nhau. Cytokinin sẽ hoạt hố sự phân chia tế bào bằng cách kích thích sự tổng hợp mạnh mẽ acid nucleic, protein và các chất cần thiết cho quá trình phân chia tế bào với điều kiện cĩ auxin kết hợp. Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào. Cytokinin giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein, nhưng cytokinin cản sự kéo dài tế bào. Ở giai đoạn gia tăng kích thước tế bào thì auxin cĩ vai trị quan trọng, kích thích mạnh sự kéo dài tế bào diệp tiêu và tế bào vùng kéo dài dưới ngọn. BA kích thích sự tăng sinh chồi bên của Castanea (Vieitez, 1980) trong khi kinetine khơng cĩ ảnh hưởng gì. Zeatin cĩ khuynh hướng kích thích sự tăng trưởng của chồi chính và chỉ làm tăng nhẹ sự nảy các chồi bên. Tương tự, 2-iP và kinetine chỉ kích thích sự tạo chồi bên trong quá trình nuơi cấy chồi Prunus; và để tăng sinh chồi cần phải sử dụng đến BA (Martinelli, 1985). Ở thí nghiệm này sự kết hợp của IBA và BA cho ra chồi tốt hơn khi kết hợp giữa IBA và Kinetine. Quan sát hình thái và số lượng chồi cho thấy ở mơi trường cĩ bổ sung IBA và BA cho số lượng chồi nhiều và chồi tươi tốt, cịn ở mơi trường cĩ bổ sung IBA và Kinetine chồi cao hơn nhưng số lượng chồi ít hơn và chồi cĩ xu hướng chết. Do đĩ chúng tơi tiến hành nghiên cứu tiếp trên mơi trường cĩ bổ sung IBA và BA để tái sinh chồi ở nhiều nồng độ khác nhau để chọn ra nồng độ cho tỉ lệ chồi cao nhất để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA và BA lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo Với mục đích tạo chồi bất định thì sự kết hợp của auxin và cytokinin cho kết quả tốt hơn khi sử dụng một mình cytokinin (Vũ Văn Vụ, 1999). Ở thí nghiệm này sử dụng kết hợp IBA và BA với nồng độ khác nhau để tái sinh chồi từ mơ sẹo nhằm thu được lượng chồi nhiều phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Các thí nghiệm tạo chồi bất định thường cho kết quả cao khi sử dụng cytokinin ở nồng độ cao và auxin từ nồng độ thấp đến trung bình (Gaspar và cộng sự, 2003), kết quả này được ghi nhận trên nhiều đối tượng như Diospyros kati Thunb (Choi, 2001), cà chua Licopersicon esculentum L. (Chaudary, 2001), hoa loa kèn Zantedeschia albomaculata (Chang, 2003), Crataeva adansonii (dc.) prodr (sharma, 2003), khoai tây (Yasmin, 2003). Kết quả sau 4 tuần nghiên cứu khả năng bật chồi của mơ sẹo ở mơi trường bổ sung chất kích thích tăng trưởng IBA kết hợp với BA ở nhiều nồng độ khác nhau được trình bày trong bảng bảng 4.5. Bảng 4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA lên sự phát sinh chồi Mơi trường Số chồi trung bình C1 3.33b (*) C2 20.67ab C3 18b C4 22.33ab C5 20.0b C6 49.33a C7 24.33ab C8 22.67ab Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái khơng cùng kí tự thì cĩ sự khác biệt rất cĩ ý nghĩa về mặt thơng kê với mức xác suất P = 0,05. Trong hầu hết các trường hợp, sự hình thành chồi, rễ từ mơ của những cây cịn non dễ hơn là từ những cây trưởng thành. Tuổi mơ ảnh hưởng đến cả số lượng chồi hình thành cũng như kích thước của chồi hay cây con. Mơ trẻ cho thấy là nguồn mẫu tốt nhất cho vài nghiên cứu. Giai đoạn sinh lý của cây mẹ ảnh hưởng đến sự hình thành chồi trên mơ nuơi cấy. Các chất điều hịa kích thích sự hình thành chồi đáng kể và một sự tương tác giữa khả năng tái sinh, tuổi mơ và nồng độ chất điều hịa tăng trưởng tối ưu. Sự tạo chồi và rễ từ mơ sẹo địi hỏi cần phải cĩ sự điều chỉnh lại nồng độ auxin và cytokinin cảm ứng ban đầu. Khi nồng độ cytokinin cao hơn auxin thì sẽ cĩ sự tạo chồi từ mẫu cấy. Ngược lại, khi nồng độ auxin cao hơn cytokinin hoặc khi chỉ xử lý với auxin thì rễ sẽ được hình thành. Trong sự tạo rễ thì lượng cytokinin ngoại sinh sẽ là chất cản. Người ta cho rằng auxin cảm ứng sự tạo rễ là do nĩ cảm ứng sự tổng hợp polyamine (Friedman và cộng sự, 1985). Bởi vậy tỉ lệ giữa auxin và cytokinin ở thí nghiệm 2 và 3 cĩ sự khác biệt rõ ràng để cĩ thể tạo mơ sẹo hay tạo chồi hay rễ từ mẫu cấy. 4 3 2 1 8 7 6 5 Hình 4.4. Chồi tái sinh trên các mơi trường bổ sung IBA và BA ở các nồng độ khác nhau [1]: Mơi trường C1 bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.25 mg/l BA [2]: Mơi trường C2 bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.5 mg/l BA [3]: Mơi trường C3bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.75 mg/l BA [4]: Mơi trường C4 bổ sung 0.1 mg/l IBA và 1.0 mg/l BA [5]: Mơi trường C5 bổ sung 0.25 mg/l IBA và 0.5 mg/l BA [6]: Mơi trường C6 bổ sung 0.25 mg/l IBA và 0.75 mg/l BA [7]: Mơi trường C7 bổ sung 0.25 mg/l IBA và 1.0 mg/l BA [8]: Mơi trường C8 bổ sung 0.25 mg/l IBA và 1.25 mg/l BA Quan sát hình thái và số liệu cho thấy, khi cố định lượng IBA, thay đổi lượng BA tăng thì số chồi tăng đến một mức nhất định thì số chồi lại giảm dần, khi số chồi tăng lên thì chiều cao chồi lại giảm vì số chồi quá nhiều chồi ko thể kéo dài thân ra được. Điều này được chứng minh bởi Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2006), để kích thích sự tăng trưởng của chồi bên và làm giảm hiện tượng ưu tính ngọn trong nuơi cấy chồi của những lồi cây lá rộng, người ta thường bổ sung một hoặc vài loại cytokinin vào mơi trường nuơi cấy ở giai đoạn II. Cách này cĩ thể cảm ứng được sự tăng trưởng của một vài chồi nhỏ từ mỗi mẫu cấy sau khoảng 4 – 6 tuần. Nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này khơng thể kéo dài. Để kích thích tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua sự tạo mơ sẹo thì người ta thường phối hợp cytokinin với auxin (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006). Ở mơi trường cĩ bổ sung 0.25 mg/l IBA kết hợp với 0.75 mg/l BA cho số lượng chồi cao nhất nhưng chiều cao chồi rất thấp vì số lượng chồi quá nhiều. Từ đĩ cho thấy chỉ cĩ thể chọn một trong hai yếu tố là số lượng chồi hoặc chiều cao chồi, nếu muốn thu được số lượng chồi nhiều thì khơng thể cĩ chồi kéo dài thân. Khi nồng độ cytokinin cao hơn auxin thì sẽ cĩ sự tạo chồi từ mẫu cấy. Ngược lại, khi nồng độ auxin cao hơn hoặc khi xử lý auxin thì rễ sẽ được hình thành. Trong sự tạo rễ thì lượng cytokinin ngoại sinh là chất cản. Khi phối hợp cùng với auxin thì cytokinin sẽ kích thích sự phân chia tế bào và điều khiển sự phát sinh hình thái. Khi được bổ sung vào trong mơi trường nuơi cấy chồi thì những hợp chất này phá vỡ trạng thái hưu miên của chồi non và kích thích sự hoạt động của các chồi bên. Khi khơng cĩ cytokinin trong mơi trường nuơi cấy thì kì giữa của chu trình tế bào sẽ bị kéo dài vì vậy người ta cho rằng cytokinin cần thiết trong sự điều hịa sinh tổng hợp protein tế bào trong sự tăng trưởng và phát triển của tế bào. Cytokinin rất cĩ hiệu quả trong vai trị kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như mơ thực vật nuơi cấy in vitro. Tác dụng này của cytokinin đơi khi trở nên hiệu quả hơn khi phối hợp với auxin. Trong thí nghiệm, việc kết hợp hai loại chất điều hịa là cytokinin và auxin cũng cho kết quả làm tăng số lượng chồi hình thành. Đặc biệt là sự kết hợp của IBA và BA cho lượng chồi hình thành khá cao. Sau khi cĩ được số lượng chồi nhiều, chúng tơi tiến hành tách cụm chồi lớn ra thành từng cụm nhỏ và cấy chuyển sang mơi trường MS khơng bổ sung chất kích thích tăng trưởng để chồi cĩ thể kéo dài thân và ra rễ thành cây con. Từ đây cĩ thể tiến hành các nghiên cứu tiếp theo như cấy chuyển sang mơi trường kích thích tượng nụ và ra hoa trong ống nghiệm hoặc tiến hành giai đoạn đưa cây con ra vườn trồng. Hình 4.5. Cây con hồn chỉnh cĩ chồi và rễ Chương 5. Kết luận – Đề nghị 5.1. Kết luận Nhân giống in vitro hoa mười giờ là một cơng cụ giúp ích cho việc nghiên cứu đặc điểm sinh lý của cây, quy trình ra hoa của cây khác với những lồi cây khác như thế nào và tại sao trong nuơi cấy in vitro hoa cĩ thể tồn tại cả ngày với điều kiện hồn tồn khác ngồi tự nhiên. Qua quá trình làm thí nghiệm tơi rút ra được một số kết luận sau: Cơng việc tạo nguồn mẫu vơ trùng rất khĩ khăn vì nĩ ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Dung dịch Javel 7% sử dụng trong thời gian 5 phút là điều kiện thích hợp nhất để tạo được nguồn mẫu vơ trùng. Chỉ cần lượng auxin và cytokinin thấp bổ sung vào mơi trường MS là cĩ thể cho mẫu hoa mười giờ cảm ứng tạo được mơ sẹo. Với tỉ lệ cytokinin cao thì lại cho ra chồi từ mẫu mơ sẹo cấy được. Với mỗi nồng độ chất kích thích tăng trưởng IBA và BA thì cho ra số lượng chồi và kích thước chồi khác nhau. Dựa vào mơi trường tạo chồi này để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo như nhân chồi, ra rễ, kéo dài thân, cho ra hoa trong ống nghiệm đem lại giá trị kinh tế cao. 5.2. Đề nghị Do thời gian tiến hành thí nghiệm và thiết bị sử dụng trong phịng thí nghiệm cĩ hạn nên tơi xin đưa ra một số đề nghị để nghiên cứu này được hồn thiện hơn. Nghiên cứu thêm các loại hĩa chất khử trùng khác khi đưa mẫu từ bên ngồi vào. Nghiên cứu thêm mẫu cấy là lá với loại cây mười giờ cĩ lá lớn. Khảo sát thêm ảnh hưởng của một số chất điều hịa sinh trưởng khác lên khả năng tái sinh mơ sẹo Khảo sát thêm ảnh hưởng của một số chất điều hịa sinh trưởng khác lên khả năng