Đề tài Nước chiết của nụ Vối là thành phần của thuốc trợ tim

LỜI CẢM ƠN Bản khoá luận này được thực hiện tại phòng thí nghiệm các hợp chất thiên nhiên, Bộ môn Hoá Hữu Cơ, khoa Hoá, trường ĐHQGHN. Em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Hoá học, các thầy các cô trong bộ môn Hoá hữu cơ, khoa Hoá trường ĐHKHTN-ĐHQGHN, các thầy các cô trong bộ môn Hoá sinh thực nghiệm Viện KHTN và CNQG, và các phòng máy khối phổ, phòng cộng hưởng từ hạt nhân, phòng phổ hấp thụ nguyên tử thuộc Viện hoá học-Trung tâm khoa hoá tự nhiên và công nghệ Quốc gia, cùng toàn thể anh chị nghiên cứu sinh, học viên cao học trong phòng hợp chất thiên nhiên và các bạn cùng khoá đã giúp đỡ em trong quá trình làm việc tại khoa. MỞ ĐẦU Việt Nam có khí hậu nhiệt đới ẩm nên hệ thực vật rất phong phú với hơn 12000 loài cây chia làm 2500 chi và 300 họ. Đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên quý giá, cung cấp nguồn nguyên liệu cho ngành hương liệu, mỹ phẩm và hoá dược. Các nhà nghiên cứu đã tổng hợp được rất nhiều hợp chất có tác dụng chữa bệnh, song các hợp chất này có một số hạn chế nhất định, như là gây những phản ứng phụ không mong muốn. Mặt khác, Việt Nam là nước đang phát triển, thu nhập bình quân đầu người thấp, các loại thuốc chữa bệnh hầu hết nhập từ nước ngoài và có giá thành cao, gây nên khó khăn cho người sử dụng. Do đó, nhà nước đã có chủ trương tăng cường sản xuất thuốc trong nước, hạn chế nhập khẩu, hạ giá thành sản phẩm. Một trong các nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc được lấy ra từ thiên nhiên. Vì vậy vấn đề đang được đặc biệt quan tâm là nghiên cứu các hợp chất được tách ra từ sản phẩm thiên nhiên. Trong số các loài cây cần quan tâm nghiên cứu cây vối (Cleistocslyx Operculatus Roxb). Ở nước ta cây vối mọc nhiều nơi, tập trung nhiều ở miền Trung , được nhân dân dùng nấu nước uống, kích thích tiêu hoá. Lá vối và nụ vối làm thuốc chữa mụn nhọn, lở loét, ghẻ. Mới đây viện Đông y cũng thử áp dụng vối làm thuốc chữa các bệnh đường ruột, viêm họng, bệnh ngoài da. Từ năm 1991 trở lại đây, một số công trình trong nước và trên thế giới nghiên cứu cây vối cho thấy hàm lượng flavonoit chứa trong cây cao và một số chất có hoạt tính kháng HIV. Đặc biệt một nghiên cứu gần đây nhất cho thấy nước chiết của nụ Vối là thành phần của thuốc trợ tim. Như vậy, cùng với sự thuận lợi về nguyên liệu thì đây là những lý do khích lệ chúng tôi nghiên cứu cây vối Việt Nam. PHẦN I. TỔNG QUAN 1.1 Khái quát về họ Sim Myrtaceae Cây vối có tên khoa học là Cleistocalyx operculatus Roxb, thuộc chi Cleistocalyx, họ Sim Mytaceae. Các cây thuộc họ Sim thường mọc xen lẫn với các cây gỗ khác thành đai rừng nhiệt đới, ít khi mọc thuần loại. Họ Sim phân bố ở các vùng rừng nhiệt đới và Á nhiệt đới, chủ yếu ở châu Mỹ và châu Úc. Họ Sim là một họ lớn gồm 90 chi và 3000 loài, cây thuộc họ Sim có đặc điểm thực vật như sau : Cây gỗ lớn, cây nhỡ hoặc cây bụi. Lá đơn, hoặc mép có khía răng, lá thường mọc đối nhau và có tuyến mỡ. Hoa mọc thành cụm ở nách hay ở đầu cành, có hình xim hoặc hình chùm. Hoa đều lưỡng tính. Đài hình ống dính hoàn toàn vào bầu hay chỉ dính một ít. Lá đài gồm 4-5 cánh xếp lợp vào nhau, ít có ống dài nguyên. Nhị xếp thành một hay nhiều dãy rời nhau hoàn toàn hoặc dính ở gốc thành ống ngăn : bao phấn đính ở lưng hay gốc. Đĩa mật không có hay nếu có thì hình vành khăn, che kín ở phía gốc vòi. Bầu hoàn toàn hạ hay hạ một phần, có 4-5 ô hay nhiều hơn; vòi đơn kéo dài, đầu tròn, rất ít khi chia 3-4 thuỳ; trong bầu thì noãn xếp thành hai hay nhiều dãy. Quả nang hoặc thịt, có sợi và thường được bọc kín bởi ống đài. Trong quả thường có 1 hạt, hạt có nội nhũ, phôi thẳng hay cong, đôi khi nạc với hai lá mầm không xa nhau. 1.2 Tổng quan về chi Cleistocalyx [6,9] Chi Cleistocalyx là một chi tương đối lớn của họ Sim. Ngoài đặc điểm chung của họ sim, các loài cây thuộc chi Cleistocalyx còn có đặc điểm thực vật riêng : quả nạc, khi chín không nở. Vòi không có lông, ô quả không có vách ngang chia thành ô nhỏ, ống đài nguyên hay rách bất định, đài nguyên thành mũ, quả mập có một hạt. Cụm hoa xim hay chuỳ. Sau đây là giới thiệu một số cây đại diện thuộc chi Cleistocalyx thường thấy ở Việt Nam. 1.2.1 Cleistocalyx circumcissa Tên ở Việt Nam là Trâm Ô. Đặc điểm thực vật : Cây đại mộc cao 15m, nhánh mảnh, lá có phiến xoan thon, dài 4-7cm, chót có mũ, có đốm trong gân phụ, rất mảnh, nụ cao 13mm, rộng 3mm, phần của đài và cánh hoa làm thành một lớp rụng sớm với nhị, noãn gồm 3 buồng, quả mập. Phân bố : rừng Biên Hoà. 1.2.2 Cleistocalyx nigrans Tên Việt Nam : Trâm lá đen. Đặc điểm thực vật : Cây đại mộc nhỏ, nhánh vàng đỏ. Lá có phiến bầu dục, màu nâu đen trên mặt lúc khô, gân phụ cách nhau 2-3mm, cuống dài 1cm. Chùm tụ tán cao 6cm ở ngọn nhánh, hoa trắng, nụ dài 5mm, hoa 5 cánh rụng 1 lượt, tiểu nhị nhiều. Quả mập tròn, lúc khô đen, to hơn 1cm, một hạt. Phân bố : rừng Bình Dương, Thủ Đức. 1.2.3 Cleistocalys nervosum Tên Việt Nam : Trâm nấp vối. Đặc điểm thực vật : Cây đại mộc trung, nhánh non dẹp, không lông. Lá có phiến bầu dục thon, dài 12-13cm, có đốm nâu, gân phụ vào 10 cặp, gân cách bìa 3-5mm. Phát hoa ở nách lá rụng, cao 5-8cm, đài hình đĩa hơi đứng, nắp cao; hoa có 4 cánh, cao 3mm, có nhiều tiểu nhụy. Phì quả tròn hay dài, to 7-14mm, đỏ hoặc đỏ đen chói, nạc ngọt, một hạt. Phân bố : rừng và Bắc Trung Nam. 1.2.4 Cleistocalyx rehnervinus Tên Việt Nam : Vối gân mạng Đặc điểm thực vật : Cây đại mộc nhỏ, nhánh tròn xám, to 2-3mm. Lá có phiến bầu dục đến trái xoan, to 9-14x5.5-7cm chót lá rộng, đáy tròn gân phụ mịn, cách nhau 4-8mm, gân cách bìa 2-3mm. Phát hoa ở lá và ngọn. Hoa như không cọng, cao 7mm, đài rụng thành chóp, tiểu nhụy nhiều. Trái tròn, to 1.5mm, lùm bụi. 1.2.5 Cleistocalyx consperipuactatus Tên Việt Nam : Vối nước Đặc điểm thực vật : Cây gỗ thường xanh, cao 20-25m. Vỏ dày 6-8mm, màu xám trắng hay nâu đen nhạt. Cành non màu nâu xám, hình vuông, lúc già hình cột tròn. Lá đơn, mọc đối, hình bầu dục dạng trứng ngược dài 6-12cm, rộng 2.5-5.5cm, đầu tròn tù. Hoa mọc cụm, sinh ra đầu cành. Hoa lưỡng tính, đài đính thành 1 thể dạng mũ, lúc nở hoa rụng dạng vòng. Nhiều nhị, rời nhau, lúc chồi hoa cong vào. Quả mọng hình cầu hay hình trứng, lúc chín có màu nâu tím. Một năm có 2 mùa hoa nở vào tháng 3 và giữa tháng 7. Phân bố : Thanh Hoá, Nghệ Tĩnh, Bình Trị Thiên, Quảng Nam, Đà Nẵng, GiaLai-KonTum. 1.3 Tổng quan về cây Vối (Cleistocalyx operculatus) 1.3.1 Đặc điểm thực vật Cây nhỡ, cao 5-6m có khi hơn, cành non, tròn hay hơi hình 4 cạnh, nhẵn. Lá có cuống, dài 8-20cm, hình trứng, rộng 5-10cm. Hai mặt lá có những đốm màu nâu, cuống dài 1-1.5cm. Hoa gần như không có cuống, màu lục trắng nhạt hợp thành cụm hoa hình tháp toả ra ở những lá đã rụng. Quả hình cầu hay hơi hình trứng, đường kính 7-12cm, xù xì. Toàn lá, cành non, và nụ vối có mùi thơm đặc biệt dễ chịu của vối. [3,5] 1.3.2 Phân bố Cây vối được trồng và mọc hoang ở khắp các tỉnh nước ta, chủ yếu để lấy lá ủ nấu nước uống. Vối còn thấy ở các nước nhiệt đới châu Á, Trung Quốc. [3,4] 1.3.3 Ứng dụng của cây vối Vối được trồng để lấy gỗ dùng trong xây dựng, làm công cụ, vỏ có chất dùng để nhuộm đen. Quả vối ăn được. Lá vối tươi đem thái nhỏ, rửa sạch nhựa rồi cho vào thùng ủ cho đến khi đen đều thì lấy ra rửa sạch, phơi khô dùng để nấu làm nước uống rất thông dụng ở nông thôn Việt Nam. Nụ và hoa thu hái vào vào tháng tư hoặc tháng sáu dương lịch cũng được pha làm trà uống. Kinh nghiệm dân gian thường phối hợp lá vối với lá Hoắc hương làm nước uống lợi tiêu hóa. Nước sắc đậm đặc của lá cây dùng như thuốc sát trùng, để rửa mụn nhọt, lở loét, ghẻ. Lá, vỏ thân, hoa còn dùng làm thuốc chữa bệnh đầy bụng, khó tiêu, mụn nhọt, viêm đại tràng mãn tính, ly trực trùng. [3,4,5] Năm 2003, Đào Thị Thanh Hiền, trường ĐH Dược Hà Nội và những người khác đã tiến hành thử nghiệm nghiên cứu một số tác dụng của cây vối. Kết quả cho thấy : - Tính kháng khuẩn của lá vối, đặc biệt là lá vối ủ có tác dụng rất tốt trên vi khuẩn E.coli, là loại vi khuẩn thường gây ra bệnh đường ruột, và hai vi khuẩn Gr(+) và Gr(-) thường gặp ở bệnh viêm da. Điều này làm sáng tỏ việc uống nước sắc lá vối để chữa bệnh tiêu chảy và tắm nước sắc lá vối để chữa bệnh viêm da của nhân dân. - Nước sắc lá vối ủ có tác dụng lợi mật rất mạnh, kết quả này góp phần giải thích được vì sao nhân dân ta thường uống nước sắc lá vối để chữa bệnh đầy bụng, khó tiêu. - Kết quả thử tác dụng độc tế bào của mẫu chiết từ lá vối bước đầu cho thấy cả tinh dầu và cao thô toàn phần đều có khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư (ung thư gan, ung thư màng tim, ung thư tử cung). Điều này mở ra hướng nghiêm cứu mới đối với dược liệu lá vối. Năm 1986, Nguyễn Đức Minh, phòng đông y thực nghiệm Viện nghiên cứu đông y đã tiến hành nghiên cứu thăm dò tính chất kháng sinh của lá và nụ cây vối đối với một số vi khuẩn Gram(+) và Gr(-) đã đi tới kết luận rằng: ở tất cả các giai đoạn phát triển của cây, lá và nụ vối đều có tác dụng kháng sinh, vào mùa đông, tính kháng sinh cao nhất ở lá và hoàn toàn không độc đối với cơ thể [7]. Đặc biệt năm 2002, một nhóm nhà khoa học Trung Quốc đã công bố kết quả ngiên cứu về cây vối: nước chiết của nụ vối là thành phần của nước uống bổ dưỡng trợ tim, làm giảm khả năng nhiễm bệnh. [18] 1.3.4 Thành phần hóa học 1.3.4.1 Thành phần hóa học của tinh dầu nụ hoa vối Năm 1994, Lê Thị Anh Đào, Nguyễn Xuân Dũng, và Hoàng Văn Lựu đã nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu vối [10] ở các địa phương khác nhau của tỉnh Nghệ An, thu được những kết quả như sau : + Hàm lượng tinh dầu dao động trong khoảng 0.1-0.4%. Hàm lượng tinh dầu vối ở Quế Phong (0.4%) là cao nhất. Thấp nhất là tinh dầu vối ở thành phố Vinh (0.1%). Trong các bộ phận khác nhau của cây vối thì hàm lượng dầu cao nhất tập trung ở nụ hoa (0.48%), trong đó hoa đã nở lượng tinh dầu giảm dần (0.28%) và ít nhất trong hoa già (0.18%). Đối tượng nghiên cứu Địa điểm Hàm lượng (%) Lá vối Nụ vối Hoa mới nở Nụ hoa Hoa nở sau 2 ngày Hoa già Thành phố Vinh Huyện Hưng Nguyên Tây Nghi Lộc Huyện Nam Đàn Huyện Tân Kỳ Huyện Quế Phong Thành phố Vinh Thành phố Vinh Thành phố Vinh 0.10 0.18 0.20 0.21 0.24 0.40 0.48 0.28 0.18 Bảng 1.1: Hàm lượng tinh dầu vối ở các địa phương của Nghệ An + Thành phần hóa học của tinh dầu vối được chỉ ra trong bảng dưới đây: Stt Tên chất Hoa vối (nụ + hoa ) (%) Nụ vối (%) Hoa già (%) Lá (%) 1 α-Thujen 0.1 Vết Vết Không có 2 α-Pinen 1.8 3.2 2.4 3.7 3 Camphen Vết Vết Vết Không có 4 Sabinen 0.2 Không có Không có Vết 5 β-Pinen 2.9 0.3 0.2 0.6 6 β-Myrcen 32.3 35.1 38.0 24.6 7 p-Cymem 0.1 Vết Vết Vết 8 Limonen 2.4 0.2 Vết 0.3 9 (Z)-β-oxymen 29.1 34.6 32.5 32.1 10 (E)-β-oxymen 12.0 13.3 12.3 9.4 11 Tecpinolen 0.1 Không Không có Vết 12 Linalool 0.7 0.1 0.5 0.5 13 Perilen Vết Vết 0.1 Vết 14 Neo-allocymen 0.9 1.4 0.5 1 15 Tecpinen-4-ol Vết Không có Không có Không có 16 α-Tecpineol 0.1 Vết 0.3 Không có 17 Nerylaxetat Vết Vết Vết 0.2 18 Geranylaxetat 0.2 0.2 0.1 0.7 19 α-Copanen Vết Vết 0.2 Vết 20 α-Gurunen Vết Vết 0.2 Không có 21 β-Caryophyllen 5.3 4.6 4.2 14.5 22 Bergamoten 1.5 1.2 2.0 Không có 23 α-Humuluen 1.1 1.1 0.6 2.7 24 Allo-oxymen 0.3 Vết Vết 0.3 25 Germacen 0.4 0.3 0.1 0.4 26 β-Selinen 0.8 0.4 Vết 0.1 27 Ledren Vết 1.0 0.1 1.0 28 Murenoen Vết Vết Vết Vết 29 γ-Cadinen 0.1 Vết Vết 0.3 30 δ-Cadinen Vết Vết Vết Vết 31 Calamen 0.4 0.3 Vết 0.6 32 Epiglobilol 0.1 0.1 0.1 Không có 33 (Z)-nerolidol 0.3 Không có Không có 0.2 34 (E)-nerolidol Không có 0.4 0.2 Không có 35 Caryophylenoxit 1.8 0.5 1.2 2.9 36 Globulot 0.2 Không có 0.1 Không có 37 Cembren, MW=272 0.5 0.3 0.3 Không có 38 Các chất chưa nhận biết 4.2 0.7 3.5 3.8 Bảng 1.2 : Thành phần hóa học của tinh dầu vối Qua bảng 1.2 nhận thấy thành phần chính của tinh dầu vối là : 1). β-myrcen 24.6% (trong lá); 32.3% (trong nụ hoa vối); 35.1% (trong nụ); 38% (trong hoa già). 2). (Z)-β-oxymen dao động từ 29.1% (trong nụ hoa); 34.6% (trong nụ); 32.5% (trong hoa già ; 32.1% (trong lá). 3). (E)-β-oxymen 12.0-13.3% (trong nụ hoa); và 9.4% (trong lá). 4). β-caryophyllen 14.5% (trong lá), cao hơn hẳn trong hoa và nụ (4.2-5.3%). 5). α-pinen dao động trong khoảng 1.8-3.7%. Trong lá cao nhất là 3.7%. 6). Caryophyllen và α-humulen trong lá cao hơn trong hoa. Như vậy thành hóa học của tinh dầu nụ hoa già là như nhau nhưng hàm lượng của các chất khác nhau, trong tinh dầu lá vối thì ít chất hơn (28 chất). 1.3.4.2 Thành phần hóa học của nụ hoa vối Năm 1990, nhóm tác giả Zhang, Fengxian, Liumeifang: Lu Renrong (Trung Quốc) đã phân lập một số chất trong hoa và nụ vối : Axit xinamic (C9H8O2) (1); axit galic (C7H6O5) (2); etylgalat (C9H10O5) (3); 7-hidroxi-5-metoxi-6,8-dimetylflavon (C18H18O4) (4); 2,4-đihidroxyl-6-metoxi-3,5-dimetylchacon (C18H18O4) (5); 5,7-đihidroxi-6,8-đimetylflavanon (C17H16O4) (6); axit oleanolic (C30H48O3) (7); axit ursolic (C30H48O3) (8); β-sitosterol (C27H40O) (9); Cấu trúc của các chất đã được xác định : (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) 1.4 Một số tritecpenoit có hoạt tính sinh học liên quan đến đối tượng nghiên cứu 1.4.1 C¸c tritecpen khung oleanan Theo c¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu cña Woldemichael G.M [28], axit oleanolic cã ho¹t tÝnh kh¸ng 2 chñng vi khuÈn B. Subtilis (MIC=8 mg/ml) vµ S.aureus (MIC=64 mg/ml). Trong khi ®ã, ho¹t tÝnh chèng ung th­ cña nã l¹i dùa trªn sù ng¨n c¶n qu¸ tr×nh sao m· cña virus HIV-1 ë trªn tÕ bµo H9 (IC50=21,8 mg/ml; EC50=1,7 mg/ml). Axit oleanolic(2) C¸c saponin cã chøa khung oleanan nh­ Gleditsia saponin C t¸ch ra tõ loµi Gleditsia japonica vµ Gymnocladus G t¸ch ra tõ loµi Gumnocladus chinensis còng thÓ hiÖn kh¶ n¨ng chèng HIV in vitro kh¸ m¹nh. Gleditsia saponin C Gymnocladus saponin G Trong khi ®ã, Glycyrrhizin, mét saponin chÝnh t¸ch ra tõ c©y Cam th¶o nh·n (Glycyrrhiza glabra) l¹i øc chÕ sù ph¸t triÓn cña mét sè loµi virus bao gåm c¶ virus HIV-1 in vitro. C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu trªn bÖnh nh©n AIDS ë NhËt cho thÊy Glycyrhizin lµm chËm qu¸ tr×nh ph¸t triÓn cña virus HIV. RÊt cã thÓ nã ®· k×m h·m qu¸ tr×nh sao chÐp cña virus HIV in vitro. Glycyrrhizin Theo nh÷ng nghiªn cøu míi nhÊt th× 3 tritecpen míi khung oleanan lµ: (23Z)-coumaroyl hedreagenin, (23E)- coumaroyl hedreagenin vµ (3Z)- coumaroyl hedreagenin, t¸ch ra tõ c©y Rau m­¬ng l«ng (Ludwigia octovalis), cã ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo rÊt tèt trªn 2 dßng tÕ bµo ung th­ KB vµ HT29 víi gi¸ trÞ IC50trong kho¶ng 1,2-3,6 mM. Ho¹t tÝnh cña 3 tritecpen nµy cã thÓ so s¸nh víi Etoposide (IC50=1,2-2,3 mM), mét lo¹i thuèc chèng ung th­. 1.4.2 C¸c hîp chÊt kh¸c C¸c dÉn xuÊt tritecpen khung ursan: axit 2a,19a-®ihi®roxy-3-oxo-12-ursen-28-oic, axit ursolic, axit maslinic t¸ch ra t­ c©y Geum japonicum ®Òu thÓ hiÖn ho¹t tÝnh øc chÕ enzym proteaza cña virus HIV-1 kh¸ tèt. Gi¸ trÞ nång ®é øc chÕ 50% tÕ bµo HIV cña axit ursolic lµ 18,6 mg/ml. 2a,19a-Dihi®roxy-3-oxo-12-ursen-28-oic Axit maslinic Axit ursolic Bªn c¹nh ®ã, 3b-O-trans-p-coumaroyl maslinic vµ 3b-O-cis-p- coumaroyl maslinic, c¸c dÉn xuÊt cña axit maslinic ph©n lËp tõ loµi Licania heteromorpha, l¹i thÓ hiÖn kh¶ n¨ng kh¸ng mét sè lo¹i vi khuÈn Gram (+) vµ nÊm men. 1.5 Một số đặc điểm của flavonoit liên quan đến đối tượng nghiên cứu của đề tài 1.5.1 Sự phân bố flavonoit trong thực vật Trong thực vật bậc thấp flavonoit ít được gặp. Trong ngành rêu chỉ phát hiện được rất ít chất. Trong dương xỉ số lượng flavonoit ít nhưng đều có mặt các nhóm anthocyanin, flavanon, flavon, chacon, dihydrochacon. Ngành hạt trần có khoảng 700 loài, 20 họ, số lượng flavonoit cũng không nhiều nhưng cũng đủ các nhóm anthocyanidin, leucoanthocyanidin, flavanon, flavon, flavonol, isoflavon. Nét đặc trưng của ngành hạt trần có khác thực vật bậc thấp và ngành hạt kín ở chỗ sự hiên diện của nhiều dẫn chất biflavonoit. Flavonoit tập trung chủ yếu vào trong ngành hạt kín ở lớp 2 lá mầm. Có rất nhiều họ chứa flavonoit và đủ các loại flavonoit. Tuy nhiên cũng có một vài nét đặc trưng cho một số họ; ví dụ, họ Asteraceae là một họ lớn với 15.000 loài , 1000 chi, có rất nhiều dẫn chất thuộc các nhóm khác nhau. Tuy nhiên một số chi có nét đặc trưng riêng của nó; ví dụ, các chi Carthamus, Coreopsis, Cosmos, Dahlia thì hay gặp các dẫn chất chalcon và auron. Chi Gymnosperma, Ageratum thì gặp các dẫn chất flavon và flavonol có nhiều nhóm thế có oxy (có thể đến 8 nhóm). Họ Fabaceae thì hay gặp các chất thuộc nhóm isoflavonoit. Họ Rutaceae thường gặp các flavon và flavonol có nhiều nhóm methoxy. Họ Theaceae hay gặp các flavan-3-ol. Họ Raunculaceae và Paeoniaceate hay gặp các dẫn chất flavonol 3,7 diglycosid. Họ Rosaceae chi Rurbus và Prunus ở trong quả hay gặp cá anthocyanin có mạch đường phân nhánh. Họ Polygonaceae ở chi Hydropiper hay gặp các flavon và flavon sulfat. Lớp một lá mầm có 53 họ nhưng cho đến nay chỉ khoảng trên 10 họ tìm thấy có flavonoit : Amaryllidaceae, Araceae, Cannaceae, Commelinaceae, Idrilaceae, Lemnaceae, Liliaceae, Musaceae, Orchidaceae, Poaceae. Động vật không tổng hợp được flavonoit nhưng trong một loài bướm khi phân tích thấy có flavonoit là do chúng lấy từ thức ăn thực vật. Hàm lượng và cả thành phần flavonoit trong cây phụ thuộc vào nơi mọc. Cây mọc ở vùng nhiệt đới và núi cao thì hàm lượng cao hơn ở nơi thiếu ánh sáng. 1.5.2 Phản ứng định tính Các dẫn xuất flavonon có màu vàng rất nhạt có khi không màu (trường hợp các nhóm OH đã methyl hóa), flavonol màu vàng nhạt đến vàng, chalcon và auron vàng đậm đến đỏ cam. Các chất thuộc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanol, leuco-anthocyanidin, flavan-3-ol do không có nối đôi liên hợp giữa vòng B với nhóm carbonyl nên không màu. Các dẫn chất anthocyanidin thì màu thay đổi tùy theo độ PH của môi trường. Tuy nhiên khi các flavonoit ở trong bộ phận của cây thì còn phụ thuộc vào hỗn hợp với các sắc tố khác. Độ tan không giống nhau, thường flavonoit glycozit và flavonoit sulfat là những hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan được trong nước tốt nhất là cồn nước. Các dẫn chất flavonoit có nhóm 7-hydroxy thường dễ tan trong dung dịch kiềm loãng. * Một số phản ứng định tính - Tác dụng với FeCl3. Tùy theo nhóm của flavonoit là tùy theo số lượng vị trí nhóm OH trong phần tử mà cho màu lục, xanh, nâu. - Tác dụng với kiềm. Nếu hơ một tổ chức thực vật như cánh hoa, nhát cắt của gỗ hoặc tờ giấy thấm cỡ nhỏ, dịch chiết trên miệng lọ amoniac thì có màu vàng tăng lên tùy theo nồng độ flavonoit và tùy theo nhóm flavonoit. Flavon và flavonol cho màu vàng sáng, anthocyanidin cho màu xanh dương. Chalcon và auron có thể cho màu đỏ và da cam. Một số nhóm khác như flavan-3-ol, flavanon, isoflavan màu không thay đổi. Tuy nhiên nếu thực hiện trong ống nghiệm với dung dịch alkali thì một số dẫn chất flavan-3-ol lại cho màu xanh vì dễ bị oxi hóa, còn flavonon dễ bị isomer hóa thành chalcon nên nếu để một lúc lại cho màu vàng đậm đến đỏ. - Tác dụng với NaOH đậm đặc và đun nóng (phân hủy kiềm). Đun nóng flavonoit với dung dịch 30% KOH thì sẽ mở vòng C rồi dẫn đến tạo thành dẫn chất axit thơm và dẫn chất phenol. Tùy theo nhóm thế và vị trí thế vào vòng A và B mà có các dẫn chất axit thơm và phenol khác nhau. Có thể xác định các dẫn chất này bằng phương pháp sắc kí đối chiếu với chất mẫu, kết quả thu được dùng để góp phần biện luận cấu trúc. Ví dụ, khi phân hủy chất chrysin thì thu được phloroglucin, axit benzoic. - Tác dụng với H2SO4 đậm đặc. Axit sunfuric khi nhỏ lên các dẫn chất flavon, flavonol thì cho màu vàng đậm. Đối với chalcon và auron cho màu đỏ, đỏ thắm, đỏ tươi. Flavanon cho màu đỏ cam rồi đỏ thắm, có thể do chuyển flavonon thành chalcon. - Tác dụng với antimoin pentacholorid (Phản ứng Martini Bettolo). Dung dịch SbCl5 trong CCl4 cho màu từ đỏ đến tím với chalcon, vàng đến vàng cam với flavon. Dihydrochalcon thì mất màu nối đôi liên hiệp giữa nhóm carbonyl và vòng B nên không cho màu với SbCl5 hoặc H2SO4. - Phản ứng cyanidin (Phản ứng Shinoda hay Willstater). Đây là phản ứng khử thường được sử dụng để tìm sự có mặt của các dẫn xuất nhóm flavonoit. Dung dịch flavonoit trong etanol, thêm bột Mg rồi nhỏ từ từ HCl đậm đặc. Sau 1 đến 2 phút sẽ có màu đỏ cam, đỏ thắm hoặc đỏ tươi với các dẫn xuất flavon, flavonol, flavanonol, flavonon. Màu sắc đôi khi có thể bị thay đổi tùy theo loại, số lượng, vị trí nhóm thế; ví dụ, các dẫn chất methoxy flavon (Tangeretin, Nobiletin) thì âm tính. Để phân biệt giữa flavonoit glycozit và aglycol của chúng, đem lắc dung dịch có màu với octanol, nếu màu ở lớp dưới lên hết ở lớp octanol, chất thử là aglycol, nếu lớp octanol không màu, chất thử là glycozit. Cũng cần lưu ý rằng các dẫn chất xanthon ví dụ mangierin (có trong lá xoài) cũng dương tính với thuốc thử cyanidin. - Tác dụng với chì acetat trung tính hoặc kiềm. Phản ứng thực hiện trên giấy thấm. Nhiều dẫn chất flavonoit tạo thành muối hoặc phức có màu khi nhỏ thêm dung dịch chì axetat trung tính hoặc kiềm. Màu phụ thuộc vào các dẫn chất flavonoit . Nếu tiến hành trong ống nghiệm, chì axetat kiềm cho tủa màu với hầu hết các flavonoit phenol còn chì axetat trung tính tạo tủa với những dẫn chất có nhóm o-dihydroxyphenol. - Phản ứng ghép đôi muối diazoni. Các dẫn chất flavonoit có nhóm OH ở vị trí 7 có thể phản ứng với muối diazoni để tạo thành chất màu azoic vàng cam đến đỏ. 1.5.3 Tác dụng sinh học của flavonoit Các dẫn chất của flavonoit có khả năng dập tắt các gốc tự do như •OH, ROO•. Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DNA thì sẽ gây ra những ảnh hưởng nguy hại như gây ra biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng nhanh sự lão hóa. Thí nghiệm cho thấy khả năng dập tắt của một số flavonoit theo thứ tự: Myricetin > quercetin > morin > diosmetin > naringenin > apigenin > catechin > 5,7 dihydroxyl-3’, 4’, 5’-trimethoxy flavon > robinin > kaempferol > flavon. Flavonoit tạo được phức với các ion kim loại mà chính các ion kim loại này là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hóa. Các flavonoit có 3, 5, 3’, 4’-hydroxy có khả năng liên kết tốt với các ion kim loại đó theo phức oxychromon , oxicarbonyl hoặc 3’, 4’-octo-dioxyphenol . Thành phần của màng tế bào có các chất lipid dễ bị peroxyt hóa, tạo ra những sản phẩm làm rối loạn sự trao đổi chất cũng dẫn đến sự hủy hoại tế bào. Đưa các chất chống oxi hóa như flavonoit vào cơ thể để bảo vệ tế bào thì có thể ngăn ngừa các nguy cơ như xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, tổn thương do bức xạ, thoái hóa gan. Flavonoit cùng với axit ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động của enzym oxi hóa-khử. Flavonoit còn ức chế tác động của hyaluronidazơ. Enzym này làm tăng tính thẩm của mao mạch. Khi enzym này thừa thì gây hiện tượng xuất huyết dưới da mà y học gọi là bệnh thiếu vitamin P (Pavitaminose). Các chế phẩm chứa flavonoit chiết từ các loài Citrus như “Cemaflavone”, “Circularine”… Flavonoit từ lá bạc hà (diosmin) như “Daflon”, “Diosmil”, flavonoit từ hoa hòe (rutin) với nhiều biệt dược khác nhau đã chứng minh tác dụng làm bền thành mạch, làm giảm tính “dòn” và tính thấm của mao mạch. Tác dụng này được hợp lực cùng với axit ascorbic. Flavonoit được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, tĩnh mạch suy yếu, giãn tĩnh mạch, trĩ, chảy máu do đặt vòng trong phụ khoa, các bệnh trong nhãn khoa như sung huyết kết mạc, rối loạn tuần hoàn võng mạc. Các dẫn chất anthocyanozit có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc và đã được chứng minh có tác dụng tăng thị lực vào ban đêm. Tác dụng chống độc cua flavonoit thể hiện làm giảm thương tổn gan, bảo vệ được chức năng gan khi một số chất độc được đưa vào cơ thể súc vật thí nghiệm (CCl4,, benzen, etanol, CHCl3, quinin, novasenol…). Dưới tác dụng của flavonoit ngưỡng ascorbic được ổn định đồng thời lượng glycogen trong gan tăng. Sự tích lũy glycogen có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao chức năng giải độc gan. Việc sử dụng một số dược liệu trong điều trị viêm gan, xơ gan, bảo vệ tế bào gan rất hiệu quả như : cây actiso, có biệt dược là Chophytol. Cây Silibum marianum Gaertn có biệt dược là Chophytol. Cây Silibum marianum Gaertn có biệt dược “Leganlon”; cây bụt dấm-Hibiscus sabdariffa. Tác dụng kích thích tiết mật thể ở các chất thuộc nhóm flavanon, flavon, flavonol và flavan-3-ol. Flavonoit thể hiện tác dụng chống co thắt những tổ chức cơ nhẵn (túi mật, ống dẫn mật, phế quản và một số tổ chức khác). Ví dụ, apigenin có tác dụng làm giảm co thắt phế quản gây ra bởi histamin, axetylcholin, seretonin. Trên bộ máy tiết niệu, nhiều flavonoit thuộc nhóm flavon, flavonol thể hiện tác dụng thông tiểu rõ rệt. Scoparosid trong Sarothamnus scoparius, lespecapitosid trong Lespedeza capitata, quercitrin trong lá diếp cá, flavonoit của cây râu mèo đều có tác dụng thông tiểu. Tác dụng chống loét của flavanon và chalcon glycozit của rễ cam thảo đã được ứng dụng để chữa đau dạ dầy. một số dẫn chất khác như catechin, 3-O-methyl catechin, naringenin cũng đã được thử thấy có tác dụng chống loét. Tác dụng chống viêm của nhiều flavonoit thuộc các nhóm flavon, flavanon, dihydroflavonol, anthocyanin, flavan-3-ol, chaleon, isoflavon, biflavon, 4-arylcoumarin, 4-arylchroman đều được chứng minh bằng thực nghiệm do các chất flavonoit này ức chế con đường sinh tổng hợp prostagladin. Người ta sử dụng rutin, citrin, leucodelphinidin, quercetin, catechin để điều trị ban đỏ, viêm da, tổn thương da và màng nhầy trong trường hợp xạ trị. Trên hệ tim mạch , nhiều flavonoit thuộc nhóm flavonol, flavan-3-ol, anthocyanin như quercetin, rutin, myricetin, pelargonin, hỗn hợp catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp và tăng thể tích phút của tim, thí nghiệm làm hồi phục tim khi bị ngộ độc bởi CHCl3, quinin, metanol, bình thường lại sự rối loạn nhịp. Cao chiết từ lá cây bạch quả, Ginko biloha chứa các dẫn chất 3-rutinosid của kaempferol, quercetin và isorhammetin (trong lá già đã vàng thì chứa ginkgetin và isoginkgetin) đã được một số hãng của Pháp bào chế thành biệt dược; ví dụ, “Ginkogink”, “Tanakan” có tác dụng tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch. Thuốc dùng cho những người có biểu hiện lão suy: rối loạn trí nhớ, khả năng làm việc bằng trí óc sút kém, mất tập trung tư tưởng, hay cáu gắt. Trên hệ thần kinh, một số C-flavon glycozit của hạt táo, Ziziphus vulgais var.spinosus (chứa spinosin, swertisin và các dẫn chất acyl của spinosin) có tác dụng an thần rõ rệt. Một số tài liệu gần đây có nói đến tác dụng chống ung thư của một số chất như leucocyanidin, leucopelargonidin, leucodelphinidin và tác dụng kháng HIV của một số dẫn chất thuộc nhóm flavon như chrysin, acacetin 7-O-β-D-galactopyranosid. Các dẫn chất thuộc nhóm isoflavonoit có tác dụng estrogen ví dụ genistein (=5, 7, 4’ trihydroxyisoflavon) daizein (=7, 4’ dihydroxyisoflavon). Tác dụng này được giải thích do sự gần nhau về cấu trúc với diethylstillboestrol. 8,55A0 15,5A0 3,88A0 Một số flavonoit khác thuộc nhóm rotenoid như chất rotenon có trong dây mật, Derris elliptica Benth thì tác dụng diệt côn trùng đã được biết và đã được ứng dụng từ lâu. PHẦN 2. MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu - Xây dựng qui trình chiết tách các lớp chất trong lá vối. - Phân tích thành phần hoá học các cặn chiết bằng các phương pháp SKLM. - Phân tách các chất từ cặn chiết. - Xác định cấu trúc phân tử các chất phân lập. 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp chiết các lớp chất theo độ phân cực của dung môi. - Phương pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột để phân lập các chất từ cặn chiết. - Phương pháp vật lý hiện đại IR, UV, MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1 chiều và 2 chiều) để xác định cấu trúc phân tử các chất phân lập. PhÇn 3. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 3.1 Xö lý mÉu vµ chiÕt Xö lÝ mÉu. L¸ vèi (Cleistocalyx operculatus Roxb) ®­îc thu h¸i ë VÜnh phóc, vµo th¸ng 8 n¨m 2005. L¸ kh«ng bÞ s©u ®­îc röa s¹ch, råi ph¬i kh« trong bãng r©m, sau ®ã sÊy ë nhiÖt ®é kho¶ng 45-500C cho ®Õn kh« gißn. NghiÒn nhá l¸ thµnh bét mÞn ®Ó lµm nguyªn liÖu chiÕt. C¸c líp chÊt cã mÆt trong l¸ vèi mµ chóng t«i quan t©m lµ c¸c flavonoit vµ c¸c axit tritecpen-cacboxylic. Do vËy, mét qui tr×nh xö lÝ mÉu ®· ®­îc x©y dùng ®Ó chiÕt ®Þnh h­íng hai líp chÊt nµy. Qui tr×nh chiÕt. Bét l¸ vèi (1,2kg) ®­îc ng©m chiÕt víi etanol 950 ë nhiÖt ®é phßng trong thêi gian 1-2 ngµy. Sau ®ã läc lÊy dÞch chiÕt etanol, b· l¹i cho vµo b×nh ng©m tiÕp víi etanol. Qu¸ tr×nh ®­îc lÆp l¹i nh­ vËy 3 lÇn. C¸c dÞch chiÕt etanol ®­îc gép l¹i vµ cÊt lo¹i dung m«i ë 500C d­íi ¸p suÊt thÊp ®Õn khi cßn 0,3 lÝt. Pha lo·ng dÞch nµy víi n­íc cÊt, vµ chiÕt víi ete dÇu ho¶ (30-600C) ®Ó lo¹i s¾c tè, c¸c axit bÐo,.... TiÕp theo, chiÕt dÞch etanol-n­íc lÇn l­ît víi cloroform vµ etylaxetat. HiÖu suÊt thu 3 cÆn chiÕt nµy so víi l­îng mÉu c©y kh« ban ®Çu nh­ sau: cÆn ete dÇu háa (kÝ hiÖu cÆn A) 50,8g, (hiÖu suÊt 8,26%); cÆn CHCl3 (cÆn C) 86,8g (hiÖu suÊt 14,26%) vµ cÆn chiÕt EtOAc (cÆn E) 7,4g (hiÖu suÊt 1,24%). Quy tr×nh chiÕt ®­îc chØ ra trªn h×nh 3.1: H×nh 3.1 Quy tr×nh ®iÒu chÕ c¸c cÆn chiÕt tõ l¸ vèi 3.2 Kh¶o s¸t ho¹t tÝnh sinh häc cña c¸c phÇn chiÕt Do sù quan t©m cña chóng t«i tËp trung vµo hai cÆn chiÕt clorofom vµ etylaxetat nªn sù kh¶o s¸t ho¹t tÝnh sinh häc nh­ kh¸ng khuÈn vµ kh¸ng «xi hãa chØ ®­îc thùc hiÖn víi hai cÆn nµy. 3.3 §Þnh tÝnh flavonoit vµ axit triterpen-cacboxylic Để định hướng cho việc phân lập, chúng tôi đã tiến hành thử định tính các flavonoit và axit cacboxylic trong các cặn chiết. Để nhận biết các flavonoit người ta thường dùng phản ứng với dung dịch FeCl3 và phản ứng tạo màu xianidin (phản ứng Shinoda). Peach K. và Traecy M.V đã chỉ ra rằng tuỳ theo cấu tạo của flavonnoit mà khi tạo phức với FeCl3 cho màu khác nhau, lục, tím, hoặc nâu [17]. Cũng phụ thuộc vào cấu trúc phân tử của flavonoit mà khi khử hoá với Mg/HCl cho màu khác nhau, từ đỏ vừa đến đỏ sẫm hay màu fucsin và gọi chung là màu xianidin [21]. Thực hiện hai phản ứng này chúng tôi nhận thấy trong cặn A không có flavonoit. Còn cặn C và E thì có flavonoit. Các axit hữu cơ, đặc biệt là các axit có phân tử lượng lớn hay mạch các bon dài thường cho kết tủa với chì axetat. Áp dụng phản ứng này chúng tôi nhận thấy cặn C có các axit tritecpenoit. 3.4 Nghiªn cøu thµnh phÇn cña cÆn chiÕt clorofom (cÆn C) 3.4.1 Ph©n tÝch b»ng s¾c kÝ líp máng (TLC) CÆn chiÕt clorofom ®­îc kh¶o s¸t b»ng TLC ®Ó ®Þnh h­íng cho viÖc ph©n t¸ch c¸c thµnh phÇn cña nã. Sù ph©n tÝch ®­îc thùc hiÖn trªn b¶n máng silica gel víi hÖ dung m«i ete dÇu háa (30-600C)/ clorofrom : 9/1 (v/v). KÕt qu¶ cho thÊy phÇn chiÕt nµy kh¸ phøc t¹p, gåm 9 thµnh phÇn vµ ®­îc ph¸t hiÖn d­íi d¹ng vÖt râ nÐt cã mµu vµng hoÆc tÝm nh¹t víi thuèc thö vanilin - axit sunfuric khi h¬ nãng (xem kÕt qu¶ ph©n tÝch TLC ë phÇn Thùc nghiÖm, b¶ng 4.1, trang 44). 3.4.2 Ph©n t¸ch b»ng s¾c kÝ cét C¸c thµnh phÇn cña cÆn chiÕt clorofom ®· ®­îc ph©n t¸ch trªn cét trung ¸p, sö dông thiÕt bÞ t¸ch MPLC trªn chÊt hÊp phô silicagel röa gi¶i theo gradient, ¸p dông víi c¸c hçn hîp nh­ ete dÇu háa-clorofom, n-hexan-axeton, clorofom-metanol. Dùa trªn kÕt qu¶ kh¶o s¸t TLC, c¸c ph©n ®o¹n röa gi¶i gièng nhau ®­îc gom l¹i thµnh c¸c nhãm ph©n ®o¹n, kÝ hiÖu tõ C0 ÷ C8. C¸c ph©n ®o¹n gép l¹i ®­îc ph©n t¸ch tiÕp b»ng s¾c kÝ cét nhanh vµ kÕt hîp víi sù kÕt tinh ph©n ®o¹n, tõ mét sè ph©n ®o¹n chóng t«I ®· thu ®­îc 3 chÊt tinh khiÕt: (i)- ChÊt C5 nhËn ®­îc d­íi d¹ng c¸c tinh thÓ h×nh kim mµu vµng tõ ph©n ®o¹n C5.1; (ii)- ChÊt C6 nhËn ®­îc d­íi d¹ng c¸c tinh thÓ h×nh kim mµu vµng tõ ph©n ®o¹n C6.1.4 vµ (iii)- ChÊt C7 nhËn ®­îc d­íi d¹ng c¸c tinh thÓ h×nh kim mµu tr¾ng tõ ph©n ®o¹n C7.1.2. Sù ph©n t¸ch c¸c chÊt tõ cÆn clorofom ®­îc minh häa nh­ ë h×nh 3.2 : 3.5 Ph©n tÝch thµnh phÇn cña cÆn chiÕt etylaxetat (cÆn E) CÆn chiÕt etylaxetat ®­îc kh¶o s¸t b»ng TLC ®Ó ®Þnh h­íng cho viÖc ph©n t¸ch c¸c thµnh phÇn cña nã. Sù ph©n tÝch ®­îc thùc hiÖn trªn b¶n máng silica gel víi hÖ dung m«i etylaxetat/ n-hexan : 7/3 (v/v). KÕt qu¶ cho thÊy phÇn chiÕt nµy gåm nhiÒu vÖt cã Rf kh¸ gÇn nhau, trong ®ã c¸c vÖt chÊt ®­îc ph¸t hiÖn qua sù hiÖn mµu xanh sÉm víi thuèc thö FeCl3 5%. Do bÞ h¹n chÕ vÒ thêi gian, c¸c thµnh phÇn cña cÆn C ch­a ®­îc ph©n t¸ch tinh khiÕt. 3.6 Kh¶o s¸t cÊu tróc cña c¸c chÊt ph©n lËp 3.6.1 CÊu tróc chÊt C5. Dùa vµo ph¶n øng ®Þnh tÝnh còng nh­ ®Æc ®iÓm mang mµu vµng cña chÊt chóng t«I dù ®o¸n C5 lµ mét flavonoit. §iÒu nµy ®­îc thÊy râ trong phæ hång ngo¹i (IR, KBr, cm-1) cña nã. Ch¼ng h¹n, c¸c d¶i hÊp thô ®Æc tr­ng cho mét hîp chÊt phenol (nOH ë 3241,81; nC-H ë 1538.76 vµ 1620,58); nhãm cacbonyl liªn hîp a,β-kh«ng no (nC=O 1760). Th«ng qua c¸c d÷ liÖu tõ phæ NMR (1H- vµ 13C-) vµ phæ MS (M+, m/z= 298), c«ng thøc ph©n tö cña C5 ®· ®­îc x¸c ®Þnh lµ C18H18O4, phï hîp víi c«ng thøc cña mét dÉn xuÊt chalcon. CÊu tróc cña C5 ®· ®­îc lµm s¸ng tá khi kh¶o s¸t c¸c phæ 1H-NMR. Theo phæ nµy vßng B lµ vßng phenyl víi 5 H: 2H t­¬ng ®­¬ng ë d 7.49 ppm cña C-2’ vµ C-6’; 2H t­¬ng ®­¬ng ë d 7.43 ppm cña C-3’ vµ C-5’ vµ 1H ë d 7.26 ppm cña C-4’). TÝn hiÖu cu¶ hai proton Hγ vµ Hβ ®Æc tr­ng cho c¸c chalcon còng cã mÆt trong phæ nµy (d 8.00 ppm vµ d 7.90 ppm). Ngoµi ra, tÝn hiÖu cña hai nhãm metyl xuÊt hiÖn ë tr­êng thÊp h¬n so víi c¸c nhãm metyl th«ng th­êng kh¸c (d 2.13 ppm vµ d 2.13 ppm) lµ do chóng n»m gÇn c¸c nguyªn tö/nhãm hót electron m¹nh. Trong phæ 1H-NMR cña C5 cßn cã tÝn hiÖu cña mét nhãm metoxi (-OCH3) ë d 3.66 ppm vµ mét nhãm OH n»m gÇn nhãm C=O (d 13.58 ppm). Tõ sù ph©n tÝch ë trªn còng nh­ ®èi chiÕu víi c¸c gi¸ trÞ dC trong phæ 13C-NMR vµ kh¶o s¸t phæ HMQC vµ HMBC cÊu tróc cña chÊt C5 ®· ®­îc x¸c ®Þnh lµ 2,4-®ihidroxi-6-metoxi-3,5-dimetylchalcon. ChÊt nµy ®· ®­îc nhãm nghiªn cøu cña PGS. NguyÔn V¨n §Ëu t¸ch tõ c©y vèi Nam §Þnh [Gãp phÇn nghiªn cøu thµnh phÇn ho¸ häc cña l¸ c©y vèi - NguyÔn V¨n ThuÊn, Khãa luËn tèt nghiÖp, tr­êng §HKHTN, §HQG HN, 2005]. γ β 2,4-dihidroxi-6-metoxi-3,5-dimetyl chalcon (C18H18O4) Cấu trúc phân tử của cũng phù hợp với sơ đồ phân mảnh của nó trong phối khổ ở một số mảnh chính như sau: Phæ NMR vµ MS xem phÇn thùc nghiÖm vµ Phô lôc [] Đặc điểm vật lý Mét sè h»ng sè vËt lý cña C5 ®­îc nªu ra trong b¶ng 3.1 Chất Hình dạng mầu sắc Nhiệt độ nóng chảy (◦C) Dung môi kết tinh SKLM Hiệu suất phân lập (◦/◦◦) RF Dung môi sắc ký Sắc phổ Vanilin /HsSO4 5% FeCl3 Hình kim- màu vàng sẫm 125±1◦C Cloroform 0.74 Ete dầu hỏa / cloroform (9/1) Vàng sẫm Nâu nhạt 2.711 Dạng bột- màu vàng sẫm 216±1◦C Ete dầu hỏa / axeton 0.76 Ete dầu hỏa / cloroform (1/9) Da cam Nâu 0.176 Hình kim-màu vàng sẫm 306±1◦C Metanol 0.71 Ete dầu hỏa / axeton Tím sẫm Không màu 0.112 Bảng 3.1: Đặc điểm vật lý và hiệu suất phân lập các chất từ cặn chiết cloroform của lá vối. 3.6.2 CÊu tróc chÊt C6. Dùa vµo ph¶n øng ®Þnh tÝnh chÊt C6 cã thÓ dù ®o¸n lµ mét flavonoit. Trong phæ hång ngo¹i cña nã cã c¸c giao ®éng cña nhãm hidroxi ë 3227 cm-1, cña nhãm cacbonyl ë 1693 cm-1 vµ cña vßng phenyl ë 1608 vµ 1515 cm-1. Qua c¸c d÷ liÖu tõ c¸c phæ NMR (1H- vµ 13C-) vµ MS (M+, m/z= 298) chÊt C6 cã c«ng thøc ph©n tö lµ C18H18O4. So s¸nh phæ 1H-NMR cña C5 vµ cña chÊt C6 chóng t«i nhËn thÊy ë chÊt C6 kh«ng cã 2 proton Hβ vµ Hγ n÷a nh­ng thay vµo ®ã lµ 2 proton cña nhãm metylen, CH2. Kh¶o s¸t kü h¬n c¸c phæ HMQC vµ HMBC ®· cho phÐp kÕt luËn cÊu tróc cña chÊt C6 lµ 7-hidroxi-5-metoxi-6,8-dimetylflavanon. ChÊt nµy lµ s¶n phÈm ®ãng vßng cña chÊt C5 vµ nã h×nh thµnh trong qu¸ tr×nh sinh tæng hîp xÈy ra trong c©y vèi.[] 7-hidroxi-5-metoxi-6,8-đimetyl flavanon (C18H18O4) Công thức cấu tạo này phù hợp với sự phân mảnh như sau : Phæ NMR vµ MS xem phÇn thùc nghiÖm vµ Phô lôc []. Mét sè h»ng sè vËt cña C6 ®­îc nªu ra trong b¶ng 3.1 3.6.3 CÊu tróc chÊt C7. Phæ 1H- vµ 13C-NMR cho thÊy chÊt C7 cã 48 proton vµ 30 nguyªn tö cacbon. Phæ khèi l­îng (EI-MS) chØ ra pic ion ph©n tö m/z 456 (M+) vµ c¸c m¶nh ph©n r· ë 248, 203, 189 t­¬ng øng víi sù ph©n r· retro Diels-Alder tõ mét tritecpen thuéc d·y urs-12-en víi nhãm OH ë vßng A. Nh­ vËy, c«ng thøc ph©n tö cña C7 lµ C30H48O3. CÊu tróc cña ®· ®­îc x¸c ®Þnh dùa vµo c¸c tÝn hiÖu xuÊt hiÖn trªn c¸c phæ NMR. Phæ DEPT cña C7 cho thÊy trong 30 nguyªn tö cacbon, cã 7 nguyªn tö cacbon bËc bèn, 5 nhãm CH, 10 nhãm CH2 vµ 7 nhãm CH3. Vµ ®iÒu nµy phï hîp víi nhËn xÐt r»ng chÊt C7 lµ mét hîp chÊt tritecpen n¨m vßng. KÕt hîp ph©n tÝch c¸c tÝn hiÖu trªn c¸c phæ 1H- vµ 13C-NMR, vµ HMQC nhËn thÊy r»ng proton cña nhãm hidroxymetin xuÊt hiÖn ë d 3,20 ppm (1H, dd, J=9,0 vµ 7,1 Hz, Ha-3) ®­îc g¾n vµo nguyªn tö >CH cã dc 79,1 ppm (d, C-3). Sù cã mÆt cña nhãm metin olefinic thÓ hiÖn qua tÝn hiÖu ë 5,28 ppm (1H, t, J=3,5 Hz, H-12) ®­îc g¾n vµo nguyªn tö C-12 cã dc 125,66 ppm. Ngoµi ra, tÝn hiÖu cña nhãm cacboxyl ®­îc ph¸t hiÖn dÔ dµng trong phæ 13C-NMR ë d 180,94 ppm (s, C-28). Trªn c¬ së nh÷ng ph©n tÝch ë trªn còng nh­ so s¸nh víi c¸c sè liÖu phæ ®· c«ng bè trong tµi liÖu [19], cho phÐp kÕt luËn C7 lµ axit oleanolic. CÊu tróc ph©n tö cña C7.1.2 phï hîp víi s¬ ®å ph©n m¶nh cña nã trong khèi phæ ë mét sè m¶nh chÝnh nh­ sau: m/z=13 m/z=248 m/z=438 m/z=187 m/z=203 m=18 m=16 m٠=45 m٠=45 M+456 Phæ NMR vµ MS xem phÇn thùc nghiÖm vµ Phô lôc []. Mét sè h»ng sè vËt cña C7.1.2 ®­îc nªu ra trong b¶ng 3.1 PHẦN 4. THỰC NGHIỆM 4.1 Mẫu nguyên liệu Mẫu lá vối được thu hái vào tháng 5 dương lịch 2003 tại tỉnh Vĩnh Phúc. Lá vối được rửa sạch, phơi khô và sấy ở nhiệt độ 45-500C đến khi lá vối có màu đen đều, giòn dễ vỡ thì đem xay thành bột mịn và cho vào chai màu nâu, bảo quản nơi khô ráo. 4.2 Dụng cụ và hoá chất Các dung môi hữu cơ dùng để chiết thực vật là các dung môi tinh khiết (pure); khi dùng sắc kí lớp mỏng, sắc kí cột phải sử dụng dung môi tinh khiết (PA), nếu dung môi công nghiệp thì phải xử lí như sau: + Dung môi etylaxetat kỹ thuật được rửa axit ba lần với dung dịch natri cacbonat 5%, sau đó rửa bằng nước cất đến pH=7. Làm khô bằng natri sunfat khan sau đó bằng canxi clorua khan, cất lấy etylaxetat ở phân đoạn có nhiệt độ sôi 76-780C. + Dung môi toluen và methanol loại (PA) của Trung Quốc. + Dung môi n-hexan kỹ thuật được rửa bằng H2SO4 đậm đặc, sau đó bằng nước cất đến pH=7. Làm khô bằng natri sunfat khan và cất lấy phân đoạn có nhiệt độ sôi 67-690C. + Dung môi cloroform kỹ thuật đem lắc với H2SO4 đặc, tiếp đó rửa với nước, làm khan bằng canxi clorua khô và cất cloroform ở nhiệt độ 61-62oC. Sắc kí lớp mỏng được chạy trên bản nhôm tráng sẵn Silica gel 60F254 độ dầy 0,2mm (hãng Merck). Các sắc kí đồ lớp mỏng được thực hiện bằng các thuốc thử sau : + Dung dịch Vanilin H2SO4 : dùng để nhận biết các nhóm chất như steroit, tepenoit, flavonoit ... Điều chế : cho 1g vanilin vào 100ml H2SO4 đặc 98% khuấy đều cho tan hết. + Dung dịch 5% FeCl3 : dùng dung dịch FeCl3 để hiện các flavonoit, phenolic và axit cacboxylic. Điều chế : pha FeCl3 trong hỗn hợp cồn-nước để đạt nồng độ 1M. Chất hấp thụ dùng trong quá trình sắc kí cột là Silicagen cỡ hạt 40-62µm của hãng Merck. 4.3 Thiết bị nghiên cứu Điểm nóng chảy được xác định trên máy Boetius Phổ hồng ngoại (IR), được đo trên máy Nicolet 760 FT - IR (theo phương pháp ép viên) Phổ khối lượng (MS), đo trên máy HP 5989 B Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) : 1H-NMR, 13C-NMR, 13C-NMR-DEPT-135, 13C-NMR-DEPT-90, HMQC, HMBC được ghi trên máy Bruker Advance 500 MHZ 4.4 Nghiên cứu các hợp chất trong lá vối 4.4.1 Chiết phân lớp các chất trong lá vối Ngâm bột lá vối trong dung môi MeOH, 3 ngày lọc tách lấy dịch MeOH, bảơ quản trong chai 1000ml, và ngâm tiếp mẫu trong dung môi MeOH nhiều lần đến khi nào dịch gần như trong suốt. Tiến hành cô quay dung dịch MeOH đến khoảng 200ml thì dừng lại, pha loãng bằng nước cất đến 200ml. Tiến hành chiết dịch metanol nước với ete dầu hoả đến khi nào dung môi trong suốt. Sau đó chiết tiếp dịch MeOH nước với cloroform đến khi nào dung môi trong suốt. Tiếp theo dịch metanol nước được chiết với EtOAc đến khi nào dung môi trong suốt. Làm khô 3 dịch chiết trên với Na2SO4 khan. Tiến hành cất loại dung môi các dịch chiết thu được 3 cặn tương ứng có khối lượng như sau : Ete dầu hoả Cloroform Etylaxetat KL 58,8g 86,80g 7,40g % 8,46g 14,46g 1,24g 4.4.2 Phản ứng định tính flavonoit * Phản ứng tạo mầu với FeCl3 Lấy 0,02g các cặn A (C hoặc E) hoà vào 10ml nước nóng được các dung dịch A (C hoặc E) tương ứng. Lấy riêng 1ml dung dịch A (C hoặc E) cho vào 1 giọt FeCl3 và quan sát mầu. * Phản ứng tạo mầu xianidin (phản ứng shinoda) Lấy 0,02g cặn A, C, E hoà tan vào 3 ống nghiệm khác nhau có chứa 5ml etanol nóng được các dung dịch A, C, E. Thêm vào mỗi ống nghiệm đó 0,1g magê kim loại và 1ml axit clohidric đặc và quan sát mầu của sản phẩm thử. * Phản ứng tạo kết tủa với chì axetat Pha mẫu giống như trên, sau đó lấy riêng 5ml mỗi dung dịch trên vào 3 ống nghiệm khác nhau, thêm vào mỗi ống nghiệm đó 5 giọt chì axetat bazơ, quan sát kết tủa. Kết quả các phản ứng định tính được chỉ ra trong bảng dưới đây : Mẫu Thuốc hiện Mg + HCl / etanol Dung dịch FeCl3 Dung dịch chì axetat bazơ Cặn A Không phản ứng Không phản ứng Không phản ứng Cặn C Dung dịch màu da cam Dung dịch màu xanh lục Kết tủa màu vàng Cặn E Dung dịch màu da cam nhạt Dung dịch màu xanh lục nhạt Kết tủa màu vàng Bảng 4.1 Kết quả các phản ứng định tính 4.4.3 Sắc kí lớp mỏng khảo sát cặn cloroform 4.4.3.1 Phương pháp sắc kí lớp mỏng (SKLM) * Hoà tan hoàn toàn chất nghiên cứu với dung môi dùng để chiết sao cho dung dịch thu được không quá loãng, không quá đặc. Dùng capila lấy chất rồi chấm lên bản mỏng, sao cho vệt chất phải tròn, gọn cách mép bên của bản mỏng 0,7cm, cách chân bản mỏng 1cm và cách nhau 0,5cm, chiều dài bản mỏng là 10cm. * Tiến hành SKLM. Pha hệ dung môi với tỷ lệ thích hợp cho vào bình sắc kí có nắp nhám và lắc kỹ. Đặt 1 mảnh giấy lọc vào thành bình để bão hoà dung môi. Lượng dung môi lấy cần được tính toán sao cho khi triển khai SKLM không để cho dung môi ngập vết chất. Cho bản mỏng đã chấm chất vào bình sắc kí, để bản nghiêng 1 góc 150, để yên bình sắc kí trong suốt quá trình triển khai. Khi tiền tuyến dung môi cách mép trên 0,5cm thì lấy bản mỏng ra. Làm khô bản mỏng, sau đó hiện sắc phổ bằng máy soi tử ngoại rồi bằng các thuốc hiện. 4.4.3.2 Kết quả khảo sát SKLM cặn C Tiến hành SKLM cặn C theo phương pháp trên với các tỷ lệ dung môi khác nhau. Kết quả là tìm được hệ dung môi tối ưu là cloroform : ete dầu hoả (30-60o) = 9:1. Sắc đồ hiện lên các vệt sau : Stt Rf UV 5% Vanilin -H2SO4 đặc 5% FeCl3 1 0,94 tím 0 0 2 0,85 đỏ tím 0 3 0,75 sáng tím nhạt 0 4 0,65 xám đen vàng sẫm Nâu nhạt 5 0,61 hồng 0 0 6 0,56 hồng tím 0 7 0,49 sáng tím sậm 0 8 0,35 nâu sẫm đen 0 9 0,00 hồng sáng tím nhạt xanh nhạt 4.4.4 Phân lập các chất trong cặn C bằng sắc ký lỏng trung áp * Chuẩn bị cột theo phương pháp nhồi khô : Cho silicagel vào cột, tiến hành gõ để silicagen phân bố đều, dùng bơm nén để silicagen được nén chặt. * Tẩm chất : Cân 5g cặn C hoà tan hoàn toàn bằng 10ml MeOH trong bình cầu 100ml. Sau đó thêm từ từ, vừa lắc đều đến hết 6g Silicagen, loại hết dung môi thu bột Silicagen đã tẩm chất. * Tiến hành SKC : Cho bột Silicagen đã tẩm chất vào cột, rắc 1 lớp mỏng Silicagen lên trên để bảo vệ. Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi theo độ phân cực tăng dần: ete dầu hoả - CHCl3 1:1; 3:7; 2:8; 1:9; 100% CHCl3: CHCl3 - MeOH 9:1; 8:2; 7:3. Kết quả thu được 70 phân đoạn. Các phân đoạn thu được đem tiến hành SKLM với hệ dung môi ete dầu hoả: CHCl3=2:8. Gộp các phân đoạn có sắc đồ giống nhau thành một nhóm đánh số từ C0 ÷ C8. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các nhóm chất sau : Nhóm Các phân đoạn gộp Khối lượng(gam) Co 7 - 10 0,06 C2 12 - 15 0,08 C3 16 - 21 0,07 C4 23 - 29 0,23 C5 30 - 35 0,56 C6 37 - 47 2,50 C7 49 - 59 2,25 C8 60 - 70 2,62 4.4.5 Phân lập các chất từ nhóm C5 bằng SK cột nhanh Nhóm C5 là một hỗn hợp chất rắn có khối lượng là 560mg, màu đen sẫm. Hỗn hợp này tiếp tục được SKLM với nhiều hệ dung môi và tỉ lệ khác nhau. Trong đó hệ dung môi ete dầu hoả - CHCl3 1:9 là tốt nhất, và kết quả được ghi trong bảng sau : STT vệt Rf UV 5% Vanilin -H2SO4 đặc 5% FeCl3 1 0,73 Xám đen Vàng thẫm Nâu nhạt 2 0,56 Hồng Xanh 0 3 0,47 Hồng Xanh 0 Tiến hành sắc kí cột nhanh nhóm C5, Silicagel sử dụng có kích thước hạt 40-62µm. Cột sắc kí có đường kính 1,5cm, chiều dài 45cm, tỉ lệ chất/ silicagel là 1/50. Hệ dung môi rửa dải là ete dầu hoả / CHCl3 1:9. Kết quả thu được 32 phân đoạn, mỗi phân đoạn chứa 5ml. Khảo sát SKLM các phân đoạn. Gom các phân đoạn có sắc đồ giống nhau và loại dung môi. Kết quả được ghi trong bảng sau : Nhóm Các phân đoạn gộp Khối lượng C5.1 2-14 152mg C5.2 16-32 201mg Nhóm C5.1 sau khi kết tinh lại nhiều lần trong axeton thu được chất tinh khiết C5.1 có khối lượng 152mg, hình kim, màu vàng; t0nc = 125 ± 10C; SKLM cho Rf = 0,73 với hệ ete dầu hoả : CHCl3=1:9, hiện màu xám đen với tử ngoại, màu vàng thẫm với vanilin/H2SO4, màu nâu với FeCl3. Phổ IR (KBr) : 3341,81; 3936,03; 1760; 1425,06; 1538,76; 1620,58 (cm-1). Phổ MS : cho các mảnh m/z : 298; 283; 221; 194; 104; 77. Phổ 1H-NMR : cho biết có 18H trong phân tử. Phổ DEPT-90 : cho biết có 7 nhóm CH. Phổ DEPT-135 : cho biết có 3 nhóm CH3, không có nhóm CH2. Phổ 13C-NMR : cho biết có 18C trong phân tử. 4.4.6 Phân lập các chất từ nhóm C6 bằng SK cột nhanh Nhóm C6 là một hỗn hợp chất rắn có khối lượng là 250mg, màu da cam. Hỗn hợp này tiếp tục được SKLM với nhiều hệ dung môi và tỉ lệ khác nhau. Trong đó hệ dung môi axeton / n-hexan 2:8 là tốt nhất và kết quả được chỉ ra trong bảng dưới đây : Stt vệt Rf UV 5% Vanilin -H2SO4 98% 5% FeCl3 1 0,77 Không màu Xám Không màu 2 0,65 - Không màu - 3 0,63 - Tím - 4 0,53 - Tím - 5 0,35 - Tím nhạt - 6 0,27 Hồng sậm Vàng Nâu 7 0,19 Không màu Hồng Không màu 8 0,18 Hồng sáng Không màu - Tiến hành sắc kí cột nhanh nhóm C6. Hệ dung môi rửa giải là axeton / n-hexan 2:8. Kết quả thu được 60 phân đoạn, mỗi phân đoạn chứa 5ml. Khảo sát SKLM các phân đoạn. Gom các phân đoạn có sắc đồ giống nhau và loại dung môi. Kết quả thu được trong bảng sau : Nhóm Các phân đoạn có sắc phổ giống nhau Khối lượng(mg) C6.1.1 2-9 72 C6.1.2 10-16 98 C6.1.3 17-19 128 C6.1.4 20-39 153 C6.1.5 40-60 96 Nhóm C6.1.4 sau khi kết tinh lại nhiều lần trong metanol cho tinh thể màu vàng, hiện màu hồng sẫm với tử ngoại (UV), màu da cam với vanilin/H2SO4, màu nâu với dung dịch 5% FeCl3. Nhiệt độ nóng chảy là 126±10C, có Rf=0,73. Phổ IR, √cm-1 (KBr), (xem phụ lục 2) : 3427; 2949; 2896; 1695; 1639; 1608; 1515. Phổ MS, m/z (%), (xem phụ lục 1) : 298 (M+, 100); 284 (17); 221 (92); 194 (59); 180 (19); 166 (26). Phổ (UV), λmax (nm) (lgε) (xem phụ lục 3) : 300,1; 333,8. 4.4.7 Phân lập các chất từ nhóm C7 bằng SK cột nhanh Nhóm C7 là một hỗn hợp chất rắn màu vàng nâu, khối lượng 225mg. SKLM nhóm C7 với hệ dung môi cloroform : metanol, 200 : 1. Các vệt trên sắc đồ như sau : Stt Rf UV 5% Vanilin - H2SO4 5% FeCl3 1 0.74 Sáng Không màu Không màu 2 0,69 Sáng - - 3 0,57 Sáng - - 4 0,54 Hồng nhạt Vàng nhạt Nâu nhạt 5 0,41 Sáng Không mầu Không màu 6 0,43 Không mầu Tím - 7 0,23 Sáng Không màu - Sắc kí cột nhóm C7 sử dụng silicagel có kích thước hạt 40-60µm, cột sắc kí có đường kính 1,5cm và dài 45cm, hệ dung môi rửa dải là cloroform : metanol, 200 : 1, chia làm 60 phân đoạn, mỗi phân đoạn là 5ml. Tiến hành SKLM và gom các phân đoạn có sắc đồ hiện trên bản mỏng giống nhau, thu được các phân nhóm sau : Nhóm Các phân đoạn có sắc phổ giống nhau Khối lượng (mg) C7.1.1 1 - 20 60 C7.1.2 23 - 28 181 C7.1.3 29 - 34 101 C7.1.4 40 - 60 156 Nhóm C7.1 sau khi kết tinh lại nhiều lần trong metanol thu được chất tinh khiết, có khối lượng 95mg. Trên bản mỏng có Rf = 0,73 với hệ dung môi cloroform : metanol, 100 : 1, không màu với tử ngoại và dung dịch 5% FeCl3, màu tím sẫm với thuốc hiện vanilin/H2SO4. Tinh thể C7.1 dạng hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy là 306±1oC. Tan tốt trong cloroform, etylaxetat. Phổ IR, √cm-1 (KBr) : 3478; 2940 - 2638; 1690; 1624; 820 (cm-1) (xem phụ lục 10). Phổ MS, m/z (%) : 456 (M+); 438 (0.70; 410(0.6); 248(100); 203(92); 189(17); 175(14); 105(19.9) (xem phụ lục 11). Phổ H-NMR (xem phụ lục 4) : có tổng số hydro (H) là 48. Phổ DEP-90 (xem phụ lục 6) : cho biết có 5 nhóm CH Phổ DEP-135 (xem phụ lục 6) : cho biết có 10 nhóm CH2 , 7 nhóm CH3 Phổ C13CPD (xem phụ lục 5) : cho biết có 3 OC, ứng dụng độ chuyển dịch hóa học (δppm) như sau : 182,96; 143,63; 122,66; 79,06; 55,26; 47,67; 46,55; 44,92; 41,64; 41,05; 39,31; 38,78; 38,44; 37,12; 33,84; 33,08; 32,66; 32,47; 30,70; 28,12; 27,72; 27,21; 25,95; 23,59; 23,43; 22,97; 18,33; 17,61; 15,56; 15,33 PHÂN V. KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Võ Văn Chi Từ điển cây thuốc Việt Nam. NXB Y học, Tr 1330. 2. Từ điển Bách khoa Dược học. NXB từ điển Bách khoa, Hà Nội, 1999, Tr75. 3. GS. TS Đỗ Tất Lợi. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học, 1999, Tr 423. 4. Lương y Lê Trần Đức. Cây thuốc Việt Nam. NXB NN Hà Nội, 1997, Tr 514-515. 5. Võ Văn Chi, Vũ Văn Chuyên và các cộng sự. Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam (II). NXB KH và KT Hà Nội, 1971, Tr 449-467. 6. Phạm Hoàng Hộ Cây cỏ Việt Nam (II). NXB Trẻ, 1994. 7. Nguyễn Đức Minh. Tính kháng khuẩn của cây thuốc Việt Nam. NXB Y học, 1972. 8. Nguyễn Tích, Trần Hợp. Tên cây rừng Việt Nam. NXB Nông thôn, 1971. 9. Viện điều tra quy hoạch rừng cây gỗ Việt Nam. NXB Nông nghiệp, 1982. 10. Lê Thị Anh Đào, Nguyễn Xuân Dũng, Hoàng Văn Lựu. Nghiên cứu thành phần hoá học của cây vối Việt Nam. Tạp chí khoa học, 1997, số 3, Tr 47-51. MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 PHẦN I. TỔNG QUAN 2 1.1 Khái quát về họ Sim Myrtaceae 2 1.2 Tổng quan về chi Cleistocalyx 2 1.2.1 Cleistocalyx circumcissa 3 1.2.2 Cleistocalyx nigrans 3 1.2.3 Cleistocalyx nervosum 3 1.2.4 Cleistocalyx rehnervinus 4 1.2.5 Cleistocalyx consperipuactatus 4 1.3 Tổng quan về cây vối (Cleistocalyx operculatus Roxb) 5 1.3.1 Đặc điểm thực vật 5 1.3.2 Phân bố 5 1.3.3 Ứng dụng của cây vối 5 1.3.4 Thành phần hoá học 7 1.3.4.1 Thành phần hoá học của tinh dầu nụ hoa vối 7 1.3.4.2 Thành phần hoá học của nụ hoa vối 10 1.4 Một số tritecpen có hoạt tính sinh học liên quan đến đối tượng  nghiên cứu 12 1.4.1 Các tritecpen khung oleanan 12 1.4.2 Các hợp chất khác 151.5 Một số tính chất flavonoid liên quan đến đối tượng nghiên cứu  của đề tài 16 1.5.1 Sự phân bố flavonoid trong thực vật 16 1.5.2 Tính chất định tính của flavonoid 17 1.5.3 Tác dụng sinh học của flavonoid 20 PHẦN II. MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Mục tiêu 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 PHẦN III. CÁC KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Nguyên liệu thực vật 26 3.2 Chiết các hoạt chất sinh học trong là vối 27 3.3 Thử định tính các flavonoit trong các cặn 28 3.4 Phân lập các chất trong cặn C 28 3.4.1 Sắc ký lớp mỏng khảo sát cặn C 28 3.4.2 Phân lập các chất tinh khiết trong cặn C 29 3.5 Ph©n tÝch thµnh phÇn cña cÆn chiÕt etylaxetat (cÆn E) 31 3.6 Kh¶o s¸t cÊu tróc cña c¸c chÊt ph©n lËp 31 3.6.1 CÊu tróc chÊt C5. 31 3.6.2 CÊu tróc chÊt C6. 33 3.6.3 CÊu tróc chÊt C7. 35 PHẦN IV. THỰC NGHIỆM 37 4.1 Mẫu nguyên liệu 37 4.2 Dụng cụ và hoá chất 37 4.3 Thiết bị nghiên cứu 38 4.4 Nghiên cứu các chất trong lá vối 38 4.4.1 Chiết phân lớp các chất trong lá vối 38 4.4.2 Phản ứng định tính flavonoit 39 4.4.3 Sắc ký lớp mỏng khảo sát cặn cloroform 40 4.4.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) 40 4.4.3.2 Kết quả khảo sát SKLM cặn C 41 4.4.4 Phân lập các chất trong cặn C bằng sắc ký lỏng trung áp 41 4.4.5 Phân lập các chất từ nhóm C5 bằng sắc ký cột nhanh 43 4.4.6 Phân lập các chất từ nhóm C6 bằng sắc ký cột nhanh 44 4.4.7 Phân lập các chất từ nhóm C7 bằng sắc ký cột nhanh 46 PHẦN V. KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC