Đề tài Nội chuyển hóa ester bằng enzyme

Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 1 PHẦN 1 Giới thiệu phương pháp Nội chuyển hóa ester bằng enzyme 1.1. GIỚI THIỆU VÀ PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN HÓA ESTER 1.1.1. Giới thiệu Chất béo là một trong những thành phần không thể thiếu trong khẩu phần ăn hằng ngày của chúng ta. Không những mang lại giá trị dinh dưỡng cao, chất béo còn góp phần tạo nên mùi vị, cấu trúc và tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm thực phẩm mà chúng ta tiêu thụ. Tuy nhiên, đối với dầu và mỡ tự nhiên thì tính chất chức năng và dinh dưỡng của chất béo không thể đạt được một cách toàn diện. Do đó, việc phát triển các phương pháp cải thiện tính chất chức năng và dinh dưỡng của dầu mỡ là điều mà các nhà sản xuất thực phẩm luôn quan tâm. Chúng ta biết rằng khối lượng phân tử (hay chiều dài mạch), mức độ không bão hòa và vị trí của các acid béo trên mạch glycerol là những yếu tố quan trọng quyết định đến tính chất vật lý của triacylglycerol (TAG) như nhiệt độ nóng chảy, chỉ số chất béo rắn, cấu trúc và tính ổn định. Vì vậy để sản xuất được loại chất béo có tính chất theo yêu cầu thì phải thay đổi các yếu tố quyết định trên. Và cho đến hiện nay, có ba kỹ thuật giúp điều chỉnh tính chất vật lý của chất béo đó là kỹ thuật tách phân đoạn, kỹ thuật hydro hóa và kỹ thuật nội chuyển hóa ester (S. Ramamurthi và A.R. McCurdy, 1995). Đối với kỹ thuật tách phân đoạn, đây hoàn toàn là một phương pháp vật lý dựa vào đặc tính kết tinh của những TAG khác nhau để thu nhận một hoặc một số phân đoạn béo có giá trị dinh dưỡng hoặc tính chất cảm quan phù hợp hơn so với nguyên liệu ban đầu. Ngược lại, kỹ thuật hydro hóa là một phương pháp hóa học làm thay đổi mức độ không bão hòa của hỗn hợp TAG. Và cuối cùng là kỹ thuật nội chuyển hóa ester, một trong những phương pháp chuyển hóa ester, làm thay đổi vị trí của acid béo trên những phân tử TAG trong hỗn hợp nguyên liệu ban đầu (F.D. Gunstone, 2006). Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 2 1.1.2. Phân loại các phương pháp chuyển hóa ester Chuyển hóa ester là phản ứng hóa học làm thay đổi liên kết ester trong phân tử TAG. Dựa vào cơ chất tác dụng mà ta phân loại thành các phương pháp chuyển hóa sau (W. Willis và A. Marangoni, 2002): 1.1.2.1. Acidolysis Acidolysis là phản ứng hóa học giúp chuyển đổi gốc acyl giữa một acid và một ester. Và đây cũng là một phương pháp giúp gắn kết những acid béo tự do vào phân tử TAG. Phương pháp này được dùng để cải thiện giá trị dinh dưỡng của dầu mỡ. Ví dụ như các aicd béo tự do hoặc ethyl ester của acid eicosapentaenoic (EPA) và acid docosahexaenoic (DHA) được gắn và thay thế các gốc acyl trên phân tử dầu thực vật hoặc dầu cá. Theo Yamane và cộng sự (1993), ông có thể tăng hàm lượng EPA trong dầu gan cá từ 8,6% lên 25% và hàm lượng DHA từ 12,7% đến 40% khi ông tiến hành phản ứng acidolysis với việc sử dụng enzyme lipase cố định từ loài Mucor miehei. Trong suốt quá trình phản ứng này, hàm lượng các acid béo không bão hòa đa (PUFA) trong dầu cá tăng khi nhiệt độ trong khoảng âm từ 10oC đến 20oC vì sự kết tinh và tách ra khỏi hỗn hợp của những acid béo bão hòa. Ngoài ra, Oba và Witholt (1994) còn sử dụng phản ứng acidolysis để gắn các phân tử acid oleic lên chất béo có trong sữa. Do đó hàm lượng các acid béo không bão hòa trong bơ tăng mà không làm thay đổi hương vị của bơ. Ngoài ra, phương pháp acidolysis còn được dùng để tổng hợp chất béo có cấu trúc. Đây là những chất béo được tạo thành từ các acid béo mạch dài hay trung bình. Các loại acid béo này có chức năng dinh dưỡng đối với bệnh nhân ăn kiêng, bởi vì khi được hấp thu vào cơ thể, các acid béo như acid capric và caproic dễ dàng bị oxy hóa để tạo ra năng lượng thay vì được dự trữ như những loại acid béo khác (J. Kennedy, 1991). Còn đối với các loại acid béo mạch dài mà đặc biệt là PUFA, việc sử dụng chúng sẽ làm giảm đi nguy cơ mắc những bệnh về tim mạch (C. Akoh, 1995). Tóm lại, chất béo cấu trúc có dạng MUM với acid béo mạch trung bình (M-medium chain fatty acid)) nằm ở vị trí sn-1,3 và acid béo không bão hòa (U- unsaturated fatty acid) nằm ở vị trí sn-2 thì được xem là nguồn cung cấp năng lượng lý tưởng. Việc tổng hợp nên loại chất béo có cấu trúc xác định này đã được nghiên cứu rất nhiều với việc sử dụng enzyme lipase (Xu, 2000). Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 3 Một trong những chất béo cấu trúc xác định có giá trị kinh tế cao là sản phẩm thay thế bơ ca cao (CBE – Cocoa Butter Equivalent) cũng được sản xuất theo phương pháp acidolysis. Nguồn cơ chất sử dụng là phân đoạn giữa của dầu cọ (1,3-dipalmitoyl-oleoyl-glycerol) và acid stearic (Chong và cộng sự, 1992). 1.1.2.2. Alcoholysis Alcoholysis là phản ứng chuyển hóa ester xảy ra giữa rượu và ester. Phản ứng này được dùng để tổng hợp methyl ester (biodiesel) với nồng độ có thể lên đến 53% (D. Briand, 1994). Ngoài ra, sản phẩm của phản ứng còn có thể là những hợp chất trao đổi gốc acyl (acyl donor) được sử dụng trong sản xuất chất béo có cấu trúc xác định, như ethyl ester của acid béo (Xu, 2000). Nếu phản ứng xảy ra giữa TAG và một glycerol thì được gọi là glycerolysis. Phản ứng này được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất mono- và diacylglycerol. Hiện nay, việc tổng hợp monoacylglycerol (MAG) sử dụng xúc tác enzyme lipase được thực hiện bằng quá trình kết tinh điều khiển nhiệt độ để tách các tinh thể MAG không bão hòa ra khỏi hỗn hợp phản ứng (G. McNeill, 1992). Enzyme lipase sử dụng là của loài vi khuẩn Pseudomonas fluorescens và Chromobacterium vicosum vì nó thể hiện hoạt tính cao đối với phản ứng glycerolysis (G. McNeill, 1991). Tc là nhiệt độ tới hạn mà nếu thấp hơn nhiệt độ này thì MAG sẽ kết tinh và tách ra khỏi dung dịch. Lúc này cân bằng của phản ứng sẽ dịch chuyển về chiều tạo thành MAG. Kết quả là hàm lượng MAG sẽ được tổng hợp nhiều hơn (từ 30% đến 90%). Nhiệt độ tới hạn của dầu thực vật (5 – 10oC) sẽ thấp hơn nhiệt độ tới hạn của mỡ động vật (30 – 46oC). Hàm lượng ẩm cũng có ảnh hưởng đến phản ứng. Mcneill và cộng sự nhận thấy rằng nếu lượng ẩm tăng từ 0,5 đến 5,7% thì sẽ tăng sự tổng hợp MAG, nếu vượt quá mức thì sẽ không ảnh hưởng đến tốc độ của phản ứng. Tuy nhiên, thời gian thực hiện phản ứng khá dài, từ 4 đến 5 ngày. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 4 1.1.2.3. Nội chuyển hóa ester Đây là một trong những phương pháp chuyển hóa ester mà được sử dụng nhiều nhất trong công nghiệp thực phẩm. Phương pháp này sẽ thay đổi vị trí các acid béo của phân tử TAG. Phản ứng được thực hiện qua nhiều bước. Đầu tiên, các liên kết ester của glycerol sẽ bị cắt đứt, giải phóng một số phân tử acid béo vào trong dung dịch phản ứng. Sau đó, những acid béo tự do này hoặc những acid béo đã có sẵn trong dung dịch sẽ kết hợp ngẫu nhiên với glycerol tạo nên liên kết ester mới. Liên kết này có thể được hình thành trên phân tử glycerol cũ (intraesterification) hoặc phân tử glycerol hoàn toàn mới (interesterification). Tuy nhiên tốc độ phản ứng intraesterification sẽ nhanh hơn so với interesterification (B. Sreenivasan, 1978). Cuối cùng, khi phản ứng đạt cân bằng, ta sẽ thu được một hỗn hợp TAG. Sự ảnh hưởng của phương pháp này đến tính chất của chất béo phụ thuộc rất nhiều vào thành phần của nguyên liệu ban đầu. Nếu ta chỉ sử dụng một loại nguyên liệu thì hiệu quả phản ứng sẽ không cao so với một hỗn hợp nguyên liệu (D. Rousseau, 1996). Hình 1.1 – Sự hình thành triacylglycerol trong phản ứng nội chuyển hóa ester: S, stearoyl; O, oleoyl; L, linoleoyl. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 5 1.2. PHƯƠNG PHÁP NỘI CHUYỂN HÓA ESTER BẰNG ENZYME Phản ứng nội chuyển hóa ester xảy ra giữa hai TAG, hoặc giữa một TAG và một ethyl ester. Phản ứng này được xúc tác bởi hợp chất hóa học hoặc bằng enzyme. Tuy nhiên, hỗn hợp sản phẩm sẽ rất khác nhau khi sử dụng hai loại xúc tác trên vì enzyme lipase có tính đặc hiệu về vị trí (Hình 1.2). Phản ứng này được ứng dụng để sản xuất margarine, shortening và một số chất béo có cấu trúc và chức năng xác định (Zhang và cộng sự, 2004). Hiện nay, loại bơ có thành phần acid béo là PUFA cũng được nghiên cứu sản xuất theo phương pháp nội chuyển hóa ester bằng enzyme. Hình 1.2 – Phản ứng nội chuyển hóa ester có sử dụng xúc tác hóa học và enzyme giữa hai triacylglycerol ACA và BBB. Những phân tử được gạch dưới là nguyên liệu ban đầu; dấu sao (*) thể hiện những phân tử có thể được tổng hợp trong phản ứng sử dụng enzyme. Triacylglycerol có dạng UPU (U, acid béo không bão hòa; P, acid palmitic) được xem là chất béo rất tốt cho trẻ sơ sinh bởi vì tính dễ hấp thụ của nó. Loders – Croklaan đã sản xuất thành công sản phẩm thay thế chất béo có trong sữa mẹ với nguyên liệu là tripalmitin, dầu thực vật giàu acid oleic và sử dụng enzyme lipase đặc hiệu vị trí sn-1,3 (Kavanagh, 1997). Còn đối với phản ứng xảy ra giữa một TAG và một ethyl ester (EE) của acid béo thì phản ứng này được xem như phản ứng acidolysis, được dùng để sản xuất chất béo có thành phần acid béo xác định. Vì vậy, khi tổng hợp chất béo thay thế cho chất béo trong sữa mẹ bằng phản ứng này thì ta sử dụng nguyên liệu là PPP và U-EE. Hỗn hợp sau phản ứng đem đi chưng cất để tách P-EE ra khỏi sản phẩm là hỗn hợp PPU và UPU. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 6 1.2.1. Mục đích và ứng dụng Vào những năm 1990, những acid béo dạng trans (TFA-trans fatty acid) đã gây nên những cuộc tranh cãi về việc sử dụng có thể dẫn đến nguy cơ mắc bệnh về tim mạch. Vì vậy trong tất cả các sản phẩm thực phẩm người ta luôn lưu ý đến hàm lượng acid béo này. Nguyên nhân dẫn đến xuất hiện TFA là do sự hydro hóa không hoàn toàn hỗn hợp dầu béo. Vì vậy để tránh sự tạo thành TFA, phương pháp nội chuyển hóa ester đã được ứng dụng để tạo thành những sản phẩm hoàn toàn không chứa TFA. Phương pháp nội chuyển hóa ester bằng enzyme hiện nay được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều, tuy nhiên đây không phải là một công nghệ mới. Unilever đã sử dụng phương pháp này vào năm 1977 để sắp xếp các acid béo của hỗn hợp dầu mỡ, tạo thành sản phẩm có độ mềm dẻo cao. Đột phá cộng nghệ này đã bị trì hoãn bởi vì chi phí cho enzyme lipase cố định sử dụng trong phản ứng quá đắt tiền. Vì vậy chỉ những chất béo có giá trị cao mới được tổng hợp bằng phương pháp nội chuyển hóa ester như bơ ca cao (Chang và cộng sự, 1990), chất béo trong sữa mẹ (BetapolTM), dầu cá giàu PUFA (Shimada và cộng sự, 1997; Haralddsson và Kristinsson, 1998), và các chất béo có cấu trúc khác (Soumanou và cộng sự, 1998; Xu và cộng sự, 1999). Tuy nhiên những năm gần đây, phương pháp này đã được mở ra một cơ hội mới với sự phát triển của công nghệ enzyme. Đó là việc ứng dụng Lipozyme TL IM (Thermomyces lanuginosus lipase được cố định trên những hạt silicagen) vào trong phương pháp nội chuyển ester bằng enzyme. 1.2.2. Cơ chế phản ứng Phản ứng nội chuyển hóa ester bằng enzyme lipase cần sự tham gia của phân tử nước trong suốt quá trình phản ứng và những phân tử TAG mới luôn được tạo thành cùng với một vài diacylglycerol (DAG) và acid béo tự do (FFA-free fatty acid) được xem là những sản phẩm phụ trong dung dịch (Wong, 1995). Cơ chế phản ứng được minh họa bởi một số phản ứng sau đây: (E là enzyme) Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 7 Phản ứng sẽ tiếp tục xảy ra cho đến khi đạt trạng thái cân bằng giữa các sản phẩm tạo thành và nguyên liệu ban đầu. Nếu hàm lượng nước trong phản ứng tăng thì lượng acid béo tự do sẽ tăng, trong khi đó FFA1.E hoặc FFA2.E sẽ giảm. Điều này dẫn đến hàm lượng các DAG cũng tăng theo. Vì vậy tổng hàm lượng TAG sẽ giảm. Kiểm soát lượng nước tự do trong phản ứng là điều cần thiết để hạn chế FFA và DAG trong sản phẩm. Khi sử dụng enzyme lipase đặc hiệu vị trí sn-1,3, phản ứng nội chuyển hóa ester sẽ tạo thành các hợp chất trung gian như 1,2(2,3)-DAG và FFA.E. Các gốc acyl trên những phân tử DAG sẽ chuyển vị khi có sự xúc tác của acid, base hoặc do trao đổi ion trên chất mang (resin). Điều này gây cản trở cho sự gắn kết các gốc acyl lên mạch glycerol không còn đặc hiệu nữa. Nhiệt độ cao và thời gian thực hiện phản ứng là hai yếu tố ảnh hưởng đến sự chuyển vị của gốc acyl (Bloomer và cộng sự, 1991; Xu và cộng sự, 1998). Do đó để hạn chế sự không đặc hiệu của enzyme, thông số nhiệt độ và thời gian phản ứng cần được kiểm soát. Hình 1.3 – Cơ chế sự chuyển vị gốc acyl bằng xúc tác acid Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 8 1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính enzyme lipase 1.2.3.1. pH Enzyme lipase chỉ thể hiện hoạt tính ở những giá trị pH nhất định. Giá trị pH này phụ thuộc vào nguồn gốc thu nhận enzyme và tình trạng ion hóa của trung tâm hoạt động. Mặc dù enzyme lipase có thể hoạt động trong dải pH khá rộng từ 4 đến 10, nhưng pH tối ưu chỉ nằm trong khoảng từ 7 đến 9 (F.X. Malcata và cộng sự, 1992; T. Yamane, 1987). Ví dụ như enzyme lipase từ các loài Pseudomonas có giá trị pH tối ưu nằm trong khoảng 8,5 nhưng từ Aspergillus niger và Rhizopus delemar enzyme lipase có pH tối ưu dưới 7 (M. Iwai và Y. Tsujisaka, 1974). Ngoài ra, việc cố định enzyme cũng có ảnh hưởng đến giá trị pH tối ưu. Sự ảnh hưởng này phụ thuộc vào mức độ khuếch tán ion giữa pha liên tục và môi trường vi mô xung quanh chất mang. Trong trường hợp enzyme được cố định bằng chất mang polyanion (polymer tích điện âm), khi đó chất mang sẽ tác động mạnh với cơ chất tích điện dương, chẳng hạn như các proton H+ , thì các ion này sẽ tập trung xung quanh polymer chất mang. Lúc đó mật độ của nó ở khoảng không gian gần enzyme cao , mặc dù nồng độ trung bình của nó trong cả hệ thấp. Từ đó, pH ở môi trường vi mô xung quanh enzyme thấp hơn so với pH trong toàn hệ. Kết quả là pH tối ưu của enzyme liên kết đồng hóa trị với chất mang có điện tích âm sẽ chuyển dịch sang phía pH kiềm so với enzyme hòa tan. Ví dụ đối với enzyme lipase tự do có giá trị pH tối ưu là 8,0 , khi được cố định trên chất mang có điện tích âm trong dung dịch cũng có pH bằng 8,0 thì pH ở vùng xung quanh enzyme có thể chỉ bằng 7,0. Do đó enzyme lipase hoạt động ở điều kiện pH thấp hơn giá trị tối ưu của nó. Dung dịch cần tăng giá trị pH lên 9,0 để làm cho vùng xung quanh enzyme có giá trị pH là 8,0 đạt điều kiện tối ưu. Hiện tượng này chỉ xảy ra đối với chất mang có điện tích và lực ion thấp (M.D. Trevan, 1980). Nếu proton H+ được sinh ra trong quá trình phản ứng thì pH ở vùng xung quanh enzyme sẽ giảm xuống cho đến khi enzyme bị mất hoạt tính hoàn toàn. 1.2.3.2. Nhiệt độ Nhìn chung khi tăng nhiệt độ thì tốc độ của phản ứng sẽ tăng , nhưng nếu nhiệt độ quá cao thì sẽ làm biến tính không thuận nghịch enzyme dẫn đến làm giảm tốc độ phản ứng. Lipase thu nhận từ động vật và thực vật thường có khả năng chịu nhiệt kém hơn từ vi sinh vật (T. Yamane, 1987). Trong dung dịch phản ứng không sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan cơ chất, nhiệt độ phản ứng phải đủ cao để giữ cho cơ chất ở trạng thái lỏng (A.P. Ison và cộng sự, 1994; P. Forssel và cộng sự, 1992). Tuy nhiên, trong ngành công nghiệp thực Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 9 phẩm, khi không có sử dụng dung môi thì nhiệt độ phản ứng vẫn cao và tăng đến giá trị 60oC để hóa lỏng cơ chất. Nhiệt độ cao như thế sẽ làm giảm sự ổn định và tuổi thọ của enzyme mặc dù enzyme đã được cố định trên chất mang. Việc cố định enzyme sẽ làm cho nó có hình dạng nhất định, giảm tính nhạy cảm với nhiệt độ và chống lại sự biến tính bởi nhiệt. Vì vậy khoảng nhiệt độ tối ưu cho enzyme cố định là từ 30 đến 62oC, cao hơn so với enzyme tự do. 1.2.3.3. Hàm lượng và hoạt độ nước Sự ảnh hưởng của hàm lượng nước đến hoạt tính enzyme lipase phụ thuộc vào nguồn thu nhận enzyme. Lipase thu nhận từ nấm mốc có khả năng chịu được hoạt độ nước thấp hơn từ vi sinh vật. Hàm lượng nước tối ưu cho phản ứng nội chuyển hóa ester đối với các loại lipase khác nhau nằm trong khoảng 0,04 – 11% (w/v), mặc dù hầu hết các phản ứng cần hàm lượng nước ít hơn 1% để đạt hiệu quả chuyển hóa ester (S. Bornaz, 1994; F.X. Malcata, 1992). Hàm lượng nước là yếu tố quyết định để xảy ra phản ứng thủy phân hay phản ứng tạo thành liên kết ester. Hoạt độ nước thấp thì phản ứng tạo thành liên kết ester sẽ xảy ra một cách thuận lợi. Tuy nhiên, trong điều kiện đó hoạt tính của enzyme lipase sẽ bị hạn chế (D. Briand, 1994; I. Svesson, 1994). Khi được cố định trên chất mang kị nước, hoạt tính của enzyme lipase sẽ ổn định hơn. Khi tiếp xúc với hệ nhũ tương dầu trong nước, pha dầu có xu hướng hấp phụ trên bề mặt và khuếch tán vào bên trong chất mang. Do đó, môi trường xung quanh enzyme và chất mang sẽ bị ngăn cách với pha nước bởi lớp dầu bao phủ. Nhưng để phản ứng có thể xảy ra thì các phân tử nước phải tiếp xúc với enzyme. Vì vậy để đảm bảo sự khuếch tán những phân tử nước vào bên trong chất mang thì pha dầu phải được bão hòa nước (F.X. Malcata, 1992). Hàm lượng nước quá nhiều có thể kìm hãm phản ứng nội chuyển hoá ester bởi vì nó sẽ ngăn cản sự tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme. Theo Abraham và cộng sự (1998), phản ứng thủy phân sẽ chiếm ưu thế khi tỉ lệ giữa nước và enzyme lipase là 0,9. Trong phản ứng tạo thành liên kết ester, cân bằng của phản ứng sẽ bị ảnh hưởng bởi những phân tử nước được giải phóng khi tạo thành liên kết. Sự tích tụ những phân tử nước này sẽ ngăn cản phản ứng xảy ra theo chiều tạo thành liên kết ester. Vì vậy, hoạt độ nước cần phải được giữ ổn định bằng cách loại bỏ liên tục những phân tử nước trong suốt quá trình phản ứng. Một cách thực hiện rất đơn giản là ta tiến hành phản ứng trong điều kiện chân không. Khi đó, những phân tử nước được tạo thành sẽ bốc hơi mà vẫn giữ được hoạt tính của enzyme lipase. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 10 1.2.3.4. Thành phần cơ chất và sự cản trở không gian Thành phần cơ chất sẽ ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng thủy phân và nội chuyển hóa ester bằng enzyme lipase. Sự có mặt của nhóm hydroxyl (-OH) ở vị trí sn-2 sẽ làm tăng dần tốc độ phản ứng thủy phân từ MAG, DAG đến TAG (P. Desnuelle, 1972). Bên cạnh đó, cấu hình không gian của cơ chất sẽ ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng. Điều đó thể hiện ở sự cản trở bởi cấu hình không gian sẽ làm giảm tốc độ phản ứng nhiều hơn mặc dù tính ái nhân (nucleophilicity) của cơ chất sẽ làm tăng tốc độ phản ứng. Cấu trúc phân tử cơ chất cũng có ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng bởi vì nó ảnh hưởng đến sự tiếp xúc có hiệu quả giữa cơ chất và trung tâm hoạt động của enzyme. Enzyme lipase có vùng trung tâm hoạt động bị che phủ bởi đoạn peptide có tính kỵ nước. Vì vậy phân tử cơ chất có tính ưa béo hoặc có cấu trúc vòng thơm sẽ được hấp phụ dễ dàng hơn so với phân tử cơ chất có mạch nhánh. Ví dụ khi ta sử dụng acid carboxylic có độ dài mạch khác nhau thì việc tăng độ dài mạch lên 7 carbon sẽ làm tăng tốc độ phản ứng đối với enzyme lipase từ loài Mucor miehei (Miller và cộng sự, 1988). Sự oxy hóa cơ chất, mà đặc biệt là PUFA , sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme lipase do tạo thành những gốc tự do. Do đó, trước khi tiến hành phản ứng nội chuyển hóa ester, đặc biệt là thực hiện trong thiết bị liên tục có sử dụng chất đệm (fixed bed reactor), dầu chứa hàm lượng PUFA cao cần được tinh luyện thật sạch. 1.2.3.5. Chất hoạt động bề mặt Việc sử dụng chất hoạt động bề mặt khi cố định enzyme lipase sẽ làm tăng hoạt tính của enzyme trong phản ứng nội chuyển hóa ester. Tuy nhiên, nếu sử dụng chất hoạt động bề mặt để tạo thành hệ nhũ tương thì nó sẽ ngăn cản sự tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme. Ngoài ra, sự có mặt của protein sẽ làm giảm sự hấp phụ của enzyme lipase lên trên bề mặt cơ chất đã được nhũ hóa. Thành phần phospholipid trong dầu (0,1 – 3,2%) cũng có ảnh hưởng không tốt đến hoạt tính của enzyme. Tốc độ của phản ứng sẽ giảm bởi vì phospholipid sẽ cạnh tranh tiếp xúc enzyme với cơ chất. Trong đó, phosphatidylethanolamine có tác động ức chế enzyme lipase nhiều nhất vì có chứa nhóm amine. Do đó, hàm lượng phospholipid trong dầu cần phải được kiểm soát để đảm bảo hoạt tính enzyme lipase được ổn định, thường nhỏ hơn 500ppm đối với enzyme lipase cố định. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 2 – Enzyme Lipase Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 11 PHẦN 2 Enzyme Lipase trong phương pháp Nội chuyển hóa ester bằng enzyme 2.1. GIỚI THIỆU Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3) là enzyme tham gia quá trình xúc tác cho phản ứng thủy phân thuận nghịch triacylglycerol ở điều kiện bình thường. Lipase khác với enzyme esterase ở điểm chỉ thủy phân cơ chất không tan trong nước và hoạt tính được tăng cường khi ở bề mặt phân chia pha cơ chất – nước (interfacial activation). Vì vậy hoạt tính tối ưu của lipase chỉ được thể hiện trong hệ nhũ tương, khi đó thì diện tích bề mặt tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme sẽ tăng lên rất nhiều. Ngoài ra, không những xúc tác cho hệ nhũ tương bình thường (dầu trong nước) lipase còn hoạt động mạnh ở những hệ nhũ là nước trong dầu và dầu hòa tan trong dung môi hữu cơ. Hơn thế nữa, enzyme lipase rất linh hoạt vì có thể xúc tác cho phản ứng chuyển hóa ester và tổng hợp ester đặc hiệu về cấu hình không gian với sự đa dạng về cơ chất phản ứng. Những tiến bộ quan trọng gần đây đã nghiên cứu về cấu trúc của tinh thể lipase để giúp chúng ta tìm hiểu sâu hơn về cơ chế xúc tác, hoạt tính bề mặt, tính đặc hiệu và bản chất của trung tâm hoạt động. Do đó việc ứng dụng enzyme lipase ngày càng trở nên đa dạng và đầy tiềm năng. Trong phần 2 này, tổng quan về lipase và tính chất của enzyme sẽ được trình bày, đặc biệt là về cấu trúc của lipase, hoạt tính bề mặt, tính chọn lọc và ứng dụng. 2.2. NGUỒN THU NHẬN ENZYME LIPASE 2.2.1. Lipase từ động vật Enzyme lipase thu nhận từ những cơ quan, mô của một số loài động vật hữu nhũ đã được nghiên cứu rất nhiều, nhưng toàn diện hơn cả là lipase có nguồn gốc từ con người và một số lipase từ tuyến tụy. Những enzyme tuyến tụy này được tiết ra ở tá tràng xúc tác cho sự thủy phân triacylglycerol. Lipase tuyến tụy có thể thủy phân hoàn toàn triacylglycerol thành acid béo và glycerol. Bản chất của chúng là những glycoprotein, phân tử lượng 50kDa, không có hoặc ít hoạt tính đối với phospholipid và được hoạt hóa ở bề mặt phân chia pha dầu Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 2 – Enzyme Lipase Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 12 nước, nhưng lại bị ức chế bởi muối mật. Tuy nhiên, lipase tuyến tụy từ một số động vật lại có thêm hoạt tính của phospholipase A (Hjorth và cộng sự, 1993). Enzyme lipase của động vật hữu nhũ bền ở pH thấp, được hoạt hóa bởi muối mật và đặc hiệu tại vị trí sn-3 của cơ chất (J.D. Weete, 2002). Lipoprotein lipase người có chức năng thủy phân triacylglycerol trong chylomicron. Để có hoạt tính thì enzyme này kết hợp với apolipoprotein C-II để tạo thành dimer thay vì kết hợp với colipase và được hoạt hóa bởi heparin (Dugi và cộng sự, 1992). Tuy nhiên, enzyme lipase trong gan thực hiện chức năng chuyển hóa lipoprotein nhưng không liên kết với apoC-II (Clark và cộng sự, 1991). Lipase có trong sữa mẹ được hoạt hóa bởi muối mật để giúp trẻ sơ sinh tiêu hóa chất béo có trong sữa (Baba và cộng sự, 1991). 2.2.2. Lipase từ thực vật Lipase từ thực vật không được chú ý nhiều so với những nguồn thu nhận khác, nhưng gần đây đã được nghiên cứu bởi hai nhà khoa học Mukherjee và Mills (1994). Trong đó, lipase từ những hạt có dầu là được quan tâm nhất. Những enzyme này nếu khác nhau từ nguồn nguyên liệu thu nhận thì tính đặc hiệu về cơ chất, pH tối ưu, khả năng phản ứng với sulfuhydryl, tính kỵ nước cũng khác nhau. Những enzym này có quan hệ mật thiết với triacylglycerol có trong bản thân hạt dầu đó và chỉ được tổng hợp trong quá trình nảy mầm của hạt. 2.2.3. Lipase từ vi sinh vật Đây là nguồn enzyme được quan tâm và sản xuất nhiều nhất theo qui mô công nghiệp. Khác với thực vật và động vật, vi sinh vật được cấu tạo từ một tế bào, chính vì vậy mà nó có những ưu điểm hơn hẳn động vật và thực vật. Vi sinh vật có khả năng tổng hợp một lượng enzyme rất lớn trong một khoảng thời gian ngắn; hoạt tính của enzyme cao hơn hoạt tính của enzyme được tổng hợp từ động vật và thực vật; và ta hoàn toàn có thể điều khiển tốc độ sinh tổng hợp enzyme trong khi sản xuất. Lipase được thu nhận từ vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm men và nấm mốc là những enzyme ngoại bào có tính chất gần giống lipase tuyến tụy. Các loài nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp lipase như: Aspergillus spp., Mucor spp., Rhizopus spp., Penicillium spp., Geotrichum spp. Đối với nấm men gồm những loài: Torulopsis spp., Candida spp. Và vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Pseudomonas spp., Achromobacter spp., Staphylococcus spp. Tính chất của một số enzyme lipase vi sinh vật được tổng hợp và trình bày trong bảng 2.1. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 2 – Enzyme Lipase Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 13 Vì enzyme lipase từ vi sinh vật có những ưu điểm hơn hẳn so với từ động vật và thực vật nên những phần tiếp theo sẽ trình bày chi tiết về cấu trúc và các tính chất của những enzyme này. Bảng 2.1 – Tính chất một số enzyme lipase từ vi sinh vật 2.3. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH LIPASE 2.3.1. Sinh tổng hợp lipase từ vi sinh vật Giống như sự tổng hợp protein, enzyme lipase sẽ được hình thành khi trải qua các quá trình phiên mã, dịch mã và sau dịch mã diễn ra trong tế bào chất của vi sinh vật. Đã có rất nhiều tài liệu nghiên cứu về các quá trình trên, vì thế trong phần này sẽ trình bày các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất sinh tổng hợp lipase của vi sinh vật. Đầu tiên là sự phiên mã. Quá trình chỉ xảy ra khi đoạn gen tổng hợp nên enzyme lipase phải được hoạt hóa trước bằng chất cảm ứng. Chất này sẽ giúp giải phóng enzyme RNA polymerase thoát khỏi sự kìm hãm của chất ức chế bằng cách kết hợp với chính chất ức chế đó. Bản chất của chất cảm ứng chính là cơ chất chịu sự xúc tác của loại enzyme lipase này. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 2 – Enzyme Lipase Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 14 Kết thúc quá trình phiên mã diễn ra trong nhân tế bào sản phẩm sẽ là phân tử mRNA, nhưng phân tử này rất dễ bị thủy phân trong môi trường tế bào chất. Bên cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây (Scherer và Rossi, 2003) cho thấy phân tử siRNA (short interference RNA) được hình thành trong quá trình phiên mã có tác động kìm hãm sự dịch mã hoặc thúc đẩy sự phân hủy những phân tử mRNA. Vì vậy số lượng enzyme được tổng hợp sẽ giảm đi đáng kể. Tiếp theo, quá trình dịch mã sẽ sử dụng tài liệu mã chứa trong phân tử mRNA để tạo thành mạch protein có thứ tự acid amin chính xác. Tuy nhiên, chuỗi polypeptide này rất dễ bị thủy phân bởi enzyme peptidase (Enfors, 1992). Quá trình này cần một loại protein “chuyển giao” để tái sử dụng các acid amin của protein có cấu trúc gấp khúc (folded protein) mà không còn sử dụng được nữa (Wickner và cộng sự, 1999; Henge và Buckau, 2003). Khi những chuỗi polypeptide enzyme đã được tổng hợp khá nhiều thì những polypeptide ở gần nhau sẽ tương tác với nhau tạo thành cấu trúc gấp khúc làm cho khối enzyme trở nên không tan. Điều này đã làm cho enzyme mất đi hoạt tính sinh học (Mitraki và cộng sự, 1991). Quá trình này được điều khiển bởi chaperone, là một đoạn polypeptide có chức năng làm gấp khúc các enzyme nội bào trước khi những enzyme này được vận chuyển qua màng membrane. Đối với pre-pro-enzyme ngoại bào thì cấu trúc phân tử không được gấp khúc trong suốt quá trình vận chuyển qua màng membrane. Do đó, một số protein khác đã hỗ trợ enzyme ngoại bào chống lại sự gấp khúc trong tế bào chất để không hình thành khối protein không tan và chống lại sự thủy phân nội bào. Hoạt tính của enzyme còn phụ thuộc vào cofactor là những ion kim loại. Sự cung cấp không đủ những ion này trong tế bào chất sẽ làm giảm đi hoạt tính của enzyme. Vì vậy phải đảm bảo nồng độ bão hòa các ion đối với enzyme phải thấp hơn nồng độ các ion đó trong tế bào chất (Jones và cộng sự, 2002). Đối với pre-pro-enzyme, khi không đủ cofactor để đảm bảo hoạt tính cũng như sự vận chuyển qua màng membrane thì một lượng enzyme này bị giữ lại trong tế bào chất làm ảnh hưởng hiệu suất sinh tổng hợp enzyme. Sau khi được vận chuyển qua màng membrane, enzyme ngoại bào vẫn có thể bị phân hủy bởi enzyme peptidase trong không gian chu chất. Trong giai đoạn này pro-enzyme vẫn tiếp tục hoàn thiện cấu trúc của nó nhờ những phản ứng thủy phân. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 2 – Enzyme Lipase Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 15 2.3.2. Phương pháp thu nhận enzyme Để thu nhận được lipase, ta phải thực hiện quá trình lên men tổng hợp enzyme từ vi sinh vật. Quá trình này phụ thuộc vào ba yếu tố rất quan trọng, đó là giống vi sinh vật, môi trường và điều kiện nuôi cấy. Đối với mỗi loài vi sinh vật khác nhau thì điều kiện tối ưu cho tổng hợp lipase cũng sẽ khác nhau. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật có thể là rắn hoặc lỏng. Chất cảm ứng được sử dụng để thu nhận enzyme này thường là dầu olive hoặc dầu đậu nành, nhưng acid béo cũng có thể cảm ứng cho sự sinh tổng hợp lipase. 2.3.3. Phương pháp tách và tinh sạch enzyme Tùy theo môi trường và phương pháp nuôi cấy mà ta áp dụng kỹ thuật tách và tinh sạch enzyme một cách hợp lý. Song, cần phải lưu ý một số tính chất của enzyme có ảnh hưởng đến những phương pháp này: − Khối lượng phân tử − Điểm đẳng điện − Cofactor bị tổn thất sẽ làm mất hoạt tính enzyme − Khoảng pH đảm bảo sự ổn định cho enzyme Các phương pháp tách enzyme bao gồm hai phương pháp cơ bản sau: − Phương pháp ly tâm − Phương pháp lọc Các phương pháp phá vỡ tế bào: − Phương pháp cơ học: đồng hóa áp lực cao, nghiền ẩm. − Phương pháp vật lý: shock nhiệt hay shock thẩm thấu. − Phương pháp sinh học: tự phân và sử dụng enzyme để thủy phân. Các phương pháp tinh sạch enzyme: − Phương pháp kết tinh − Phương pháp điện di − Phương pháp sắc ký Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 2 – Enzyme Lipase Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 16 2.4. TÍNH CHẤT VÀ PHẢN ỨNG CỦA ENZYME 2.4.1. Cấu trúc phân tử Enzyme lipase thu nhận từ vi sinh vật là nguồn enzyme đầy tiềm năng và được nghiên cứu một cách sâu rộng. Nhìn chung, enzyme lipase có cấu trúc α/β với vị trí trung tâm là lưới hỗn hợp β chứa bộ ba xúc tác và có cấu trúc xoắn ngăn cản cơ chất tiếp xúc trung tâm hoạt động (Dominic W.S. Wong, 2003). Rhizomucor miehei (Mucor miehei) sản xuất enzyme lipase ngoại bào có khả năng thủy phân rất nhiều cơ chất lipid khác nhau. Trong quá trình sinh tổng hợp, cấu trúc phân tử của enzyme được gắn thêm một đoạn peptide tín hiệu (signal peptide) và một đoạn propeptide bên cạnh mạch enzyme chính bao gồm 269 amino acid có phân tử lượng là 29.472 Dalton. Có hai dạng đồng phân của enzyme là dạng A (pI=3,9) và dạng B (pI=4,3) phụ thuộc mức độ deglycosylation trong quá trình sau dịch mã. Cấu trúc của lipase Rhizomucor miehei là cấu trúc dạng α/β gồm vùng lưới β trung tâm có tám dải β liên kết song song cuộn lên trên vùng xoắn lưỡng cực (N-terminal). Tất cả các cấu trúc xoắn đều nằm một bên lưới β. Ba liên kết disulfide trong phân tử lipase, Cys29-Cys268; Cys40-Cys43 và Cys235-Cys244 có tác dụng làm cho toàn bộ cấu trúc của enzyme được ổn định. Vùng trung tâm hoạt động của enzyme có chứa bộ ba xúc tác Ser144, His257 và Asp203 nhưng lại bị che phủ bởi phần không phân cực của cấu trúc xoắn lưỡng cực “lid”. “Lid” là một đoạn oligopeptide kỵ nước mà enzyme esterase không có. Chính vì điều này đã giúp enzyme lipase hấp phụ được trên bề mặt phân chia pha dầu-nước và sau đó diễn ra sự tái sắp xếp cấu trúc enzyme, đoạn phân tử “lid” sẽ cuộn vào trong để lộ vùng trung tâm hoạt động xúc tác thủy phân cơ chất. Vì thế, ta có thể nhận thấy rằng hoạt tính bề mặt của enzyme lipase chính là việc tạo thành cấu trúc bền vững trên bề mặt phân chia giữa hai pha dầu và nước. Enzyme lipase từ Geotrichum candidum cũng tồn tại dưới hai dạng đồng phân: dạng I (pI=4,56) và dạng II (pI= 4,46) có cùng chiều dài mạch là 544 amino acid, phân tử lượng 59.085 Dalton và có từ hai đến ba vị trí N-glycosylation tương ứng với từng dạng đồng phân. Tuy nhiên, lipase I và II được mã hóa bởi hai đoạn gen khác nhau. Cấu trúc của enzyme cũng có dạng α/β với lưới hỗn hợp β hình thành bởi 11 dải trong đó có 7 dải song song với nhau. Những cấu trúc cuộn xoắn liên kết với các dải đều nằm ở hai bên vùng lưới β. Hai liên kết disulfide được tìm thấy là Cys61-Cys105 và Cys276-Cys288. Bộ ba xúc tác là Ser217, His463 và Glu354 nằm trong vùng trung tâm hoạt động bị che khuất bởi hai cấu trúc xoắn α gần như song song với nhau. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 2 – Enzyme Lipase Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 17 Một số cấu trúc phân tử của enzyme lipase thu nhận từ Candida rugosa, C. antarctica, Rhizopus delmar, Pseudomonas glumae và Ps. aeruginosa cũng được nghiên cứu. Song, sự khác biệt quan trọng về cấu trúc giữa lipase tuyến tụy và vi sinh vật chính là phần enzyme chứa đầu Carbon (C-terminal domain) được dùng để liên kết với colipase không có trong cấu trúc enzyme của vi sinh vật. Một điều cần phải lưu ý là không phải tất cả enzyme lipase đều có hoạt tính bề mặt. Ví dụ như lipase từ Pseudomonas aeruginosa thiếu cấu trúc xoắn “lid” bao phủ trung tâm hoạt động, do đó enzyme này không có hoạt tính bề mặt. 2.4.2. Hoạt tính bề mặt và phản ứng thủy phân 2.4.2.1. Hoạt tính bề mặt Nhờ vào kỹ thuật X quang mà cấu trúc tinh thể của một số enzyme lipase đã được xác định. Chúng ta biết rằng trong cấu trúc đó có một phân đoạn xoắn α, được gọi là “lid”, đã che lắp trung tâm hoạt động làm cho enzyme không thể có hoạt tính xúc tác trong dung dịch nước hoặc trong dung môi hữu cơ. Nhưng nếu trong dung dịch xuất hiện bề mặt phân chia pha giữa dầu và nước thì sự hấp phụ enzyme này lên bề mặt đó sẽ làm thay đổi hình dạng enzyme dẫn đến việc mở rộng cửa rào “lid” tạo điều kiện cho sự tiếp xúc cơ chất với trung tâm hoạt động (Tatsuo Maruyama và cộng sự, 2000). Hình 2.1 – Hoạt tính bề mặt của enzyme lipase: E, enzyme trong pha nước; Ea, enzyme hấp phụ trên bề mặt; Ea*, enzyme được hoạt hóa; S, cơ chất; Ea*S, phức enzyme cơ chất; Ea*- Ac, acylenzyme; P1,P2 sản phẩm thủy phân. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 2 – Enzyme Lipase Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 18 2.4.2.2. Cơ chế phản ứng thủy phân Phản ứng thủy phân được thực hiện nhờ bộ ba xúc tác Ser, His, Asp trải qua năm giai đoạn sau: Hình 2.2 – Cơ chế phản ứng thủy phân enzyme lipase 1. Enzyme kết hợp với cơ chất hình thành phức chất hoạt động. 2. Nhóm chức hoạt động –OH của Serine tấn công vào gốc acyl của cơ chất tạo liên kết đồng hóa trị hình thành hợp chất trung gian. Giai đoạn này được hỗ trợ bởi hoạt tính xúc tác base của His trong bộ ba xúc tác. 3. Tạo thành acyl enzyme và tách khỏi phản ứng oxy của liên kết ester (R1OH). 4. Tách gốc acyl còn lại ra khỏi trung tâm hoạt động bởi nhóm chức hoạt động của His, có sự tham gia của phân tử nước và hình thành hợp chất trung gian có cấu trúc tứ diện. 5. Giải phóng acid carboxylic (R2COOH). 2.4.3. Sự hoạt hóa và ức chế enzyme 2.4.3.1. Sự hoạt hóa enzyme Nguyên tố Ca có thể tăng cường hoạt tính thủy phân của enzyme lipase bằng cách hỗ trợ cho sự thay đổi hình dạng cấu trúc phân tử, tạo điều kiện dễ dàng cho sự hấp phụ enzyme và giảm lượng acid béo tạo thành trên bề mặt phân chia pha mà có thể gây ức chế phản ứng thủy phân. Sự hoạt hóa enzyme lipase ở tuyến tụy của người phụ thuộc rất nhiều vào cơ chất và sự có mặt của muối mật. Bên cạnh đó, sự ảnh hưởng Ca đến hoạt tính lipase vi sinh vật phụ Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 2 – Enzyme Lipase Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 19 thuộc loại enzyme và điều kiện thí nghiệm. Ví dụ, để tăng cường hoạt tính enzyme lipase C. rugosa ta có thể bổ sung muối Ca của acid béo tạo thành vào dung dịch đã được nhũ hóa nhưng chỉ đối với cơ chất là dầu olive không phải tributyrin. Tuy nhiên, Ca không có tác dụng đối với hệ nhũ tương nước trong dầu và nếu không sử dụng chất nhũ hóa thì Ca cũng không ảnh hưởng đến hoạt tính lipase C. rugosa nhưng lại tăng sự ức chế của acid mật. 2.4.3.2. Colipase và sự ức chế enzyme Hoạt tính của enzyme lipase chỉ thể hiện trên bề mặt phân chia pha dầu và nước khi enzyme này được hấp phụ lên trên bề mặt đó. Nếu trong dung dịch có sự xuất hiện của muối mật (taurodeoxycholate, glycodeoxycholate hoặc taurocholate) thì những hạt micelle sẽ bị bao phủ một lớp điện tích âm ngăn cản sự hấp phụ enzyme lipase. Sự ức chế này không những tác động lên lipase tuyến tụy mà còn đối với lipase vi sinh vật. Tuy nhiên, chỉ có hoạt tính của lipase tuyến tụy mới được phục hồi nhờ sự tác động của colipase. Colipase thuộc tuyến tụy lợn là một chuỗi polypeptide đơn bao gồm 96 amino acid, trong phân tử có năm liên kết disulfide, pI=5,0. Đầu tiên colipase được sinh tổng hợp dưới dạng procolipase bao gồm 101 amino acid nhưng sau đó mạch polypeptide bị thủy phân hình thành cấu trúc hoạt động colipase (năm liên kết peptide Val-Pro-Asp-Pro-Arg bị thủy phân từ đầu Nitơ). Cấu trúc phân tử colipase bao gồm hai vùng: vùng chứa đầu Nitơ (N-terminal region) và vùng có hình dạng như “ba ngón tay” được liên kết với nhau bằng cầu disulfide. Vì vậy mà colipase có tính chất lưỡng cực được thể hiện ở vùng chứa đầu Nitơ có tính ưa nước trong khi tính kỵ nước tập trung ở đầu vùng “ba ngón tay”. Ngoài ra, hai vùng này còn là hai vị trí liên kết đối với lipase và cơ chất. Sự liên kết giữa colipase và lipase được thực hiện nhờ hai liên kết ion và sáu liên kết hydro ở hai chuỗi xoắn ốc vùng chứa đầu Nitơ của colipase và lưới β vùng chứa đầu Carbon của lipase. Mặt khác, colipase liên kết được với cơ chất là nhờ sự tương tác kỵ nước của vùng “ba ngón tay”. Nhưng ở “ngón tay giữa” có chứa ba phân tử Tyrosine (Tyr55, Tyr 58, Tyr59) bị “giấu” kỹ trong cấu trúc xoắn kỵ nước được xem là vị trí liên kết với cơ chất. Bên cạnh đó, colipase còn liên kết với cấu trúc xoắn “lid” nhờ ba liên kết hydro (Arg38, Leu16, Glu15 của colipase và Val246, Ser343, Asn240 của “lid”). Chính vì liên kết này mà cấu trúc xoắn “lid” sẽ được ổn định trong khi thể hiện hoạt tính của enzyme và diện tích tiếp xúc với cơ chất sẽ được mở rộng hơn nữa. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 2 – Enzyme Lipase Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 20 Một điều cần phải lưu ý là natri taurodeoxycholate có khả năng ức chế lipase tuyến tụy khi cơ chất là tributyrin nhưng hoạt tính thủy phân của enzyme lại được tăng cường bởi muối mật khi cơ chất là triolein. Mặt khác, khi sử dụng natri taurocholate đối với lipase C. rugosa và cơ chất là dầu olive thì khả năng ức chế tăng dần theo nồng độ muối mật. Vì vậy ta phải chọn được nồng độ tối ưu cho từng loại muối mật để đạt được sự ổn định của hệ nhũ, tăng diện tích tiếp xúc với lipase và đồng thời giảm đi sự ức chế của nó. Một số những chất khác có khả năng ức chế enzyme lipase bao gồm chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm, một vài protein, ion kim loại, acid boric và hợp chất phospho như diethyl p-nitrophenyl phosphate, phenylmethyl sulfonylfluoride, các hợp chất carbamate, β- lactone và diisopropylfluorophosphate. 2.4.4. Tính đặc hiệu của enzyme Dựa vào tính đặc hiệu, enzyme lipase vi sinh vật có thể được phân thành ba nhóm (Macrae, 1983). Nhóm đầu tiên bao gồm những enzyme không đặc hiệu với vị trí hoặc cấu trúc gốc acyl trên mạch triglyceride, ví dụ như lipase từ Candida cylindracea (Benzonana và Esposito,1971) và Staphylococcus aureus (Vadehra, 1974). Nhóm thứ hai được xem là quan trọng nhất bao gồm những enzyme xúc tác đặc hiệu vị trí 1, 3 trên phân tử triacylglycerol, trong đó thông dụng là lipase từ Aspergillus niger, Rhizopus delemar (Okumura và cộng sự, 1976), Mucor miehei và Pseudomonas fragi (Alford và cộng sự, 1964). Cuối cùng là nhóm thứ ba gồm những enzyme chỉ xúc tác đặc hiệu một số acid béo nhất định, ví dụ lipase từ Geotrichum candidum (Alford và cộng sự, 1964) chỉ thủy phân acid béo mạch dài hoặc acid béo không no dạng cis-9. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 2 – Enzyme Lipase Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 21 Bảng 2.2 – Tính đặc hiệu của enzyme lipase ngoại bào từ các chủng Geotrichum và Mucor miehei Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 22 PHẦN 3 Các phương pháp Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Lipase 3.1. NỘI CHUYỂN HÓA ESTER BẰNG ENZYME LIPASE CỐ ĐỊNH Việc cố định enzyme lipase để ứng dụng trong phản ứng thủy phân cũng như tổng hợp liên kết ester đã trở nên phổ biến. Bởi vì enzyme lipase cố định có những ưu điểm hơn hẳn so với enzyme lipase tự do, ví dụ như khả năng tái sử dụng enzyme, sự kết thúc phản ứng nhanh chóng, việc điều khiển tạo thành sản phẩm và tách enzyme ra khỏi hỗn hợp phản ứng một cách dễ dàng. Hơn thế nữa, việc cố định mỗi loại enzyme khác nhau sẽ ảnh hưởng đến tính chất lý và hóa học cũng như tính đặc hiệu của enzyme đó. Cố định enzyme còn có thể tăng độ tinh sạch của enzyme. Phương pháp cố định enzyme có thể chia làm hai loại, bao gồm: phương pháp vật lý: hấp phụ và gói enzyme trong khuôn gel hay các bao vi thể; phương pháp hóa học: gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết đồng hóa trị (Willis và cộng sự, 2002). 3.1.1. Các phương pháp cố định enzyme lipase 3.1.1.1. Phương pháp hấp phụ Đây là một trong những phương pháp cố định enzyme dễ thực hiện và thông dụng nhất được sử dụng trong phản ứng nội chuyển hóa ester. Nguyên tắc của phương pháp: là hấp phụ enzyme lên các chất mang nhờ lực tương tác yếu giữa chất mang và protein enzyme như: lực van der Waals, liên kết hydro và liên kết kỵ nước. Nếu chất mang có chứa điện tích thì liên kết giữa enzyme và chất mang là liên kết ion (bền hơn so với hấp phụ). Phương pháp thực hiện: cho enzyme và chất mang tiếp xúc nhau (khuấy trộn), sau đó rửa để loại những phân tử bị gắn yếu lên chất mang (Zaborsky, 1973). Một phương pháp cố định khác cũng được sử dụng là dùng dung môi để kết tủa dung dịch enzyme lên chất mang (Mustranta và cộng sự, 1993). Các dung môi được sử dụng là acetone, ethanol, hoặc methanol. Và cuối cùng là chất mang sau khi lọc sẽ được đem đi sấy. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 23 Một số chất mang thường sử dụng để cố định enzyme bằng hấp phụ hay liên kết ion bao gồm: chất mang hữu cơ (than hoạt tính, cellulose, tinh bột, dextran, collagen, albumin, agarose, chitin), chất mang vô cơ (silic, thủy tinh xốp, oxit kim loại), chất trao đổi ion (amberlit, DEAE-Sephadex, CM-Sephadex, DEAE-Cellulose, CM-Cellulose), và polymer tổng hợp (polyamit, polyacrylamit, polystyrol, polyvinyl, nilon). Các yếu tố ảnh hưởng: mức độ cố định enzyme bao gồm lượng enzyme được cố định và độ bền của liên kết cố định phụ thuộc vào những yếu tố như pH, nhiệt độ, loại dung môi, lực ion, và nồng độ protein cũng như chất hấp phụ (Đặng Thị Thu, 2003).
pH của môi trường phụ thuộc vào số lượng và bản chất của các nhóm tích điện ở chất mang cũng như protein enzyme. Sự thay đổi pH thường ảnh hưởng lớn đến lượng enzyme cố định bằng liên kết ion. Đồng thời, sự thay đổi pH đột ngột có thể dẫn đến sự nhả hấp phụ của enzyme.
Lực ion môi trường: sự có mặt của các ion muối tích điện trái dấu với chất mang có thể kéo theo sự kết tủa cục bộ enzyme trong dung dịch. Tuy nhiên, sự có mặt của muối cũng có thể làm tăng độ hòa tan của enzyme, do đó làm ảnh hưởng xấu đến hiệu quả cố định.
Nhiệt độ tăng làm duỗi mạch enzyme, do đó làm tăng liên kết enzyme với chất mang. Nhưng hạn chế nhiệt độ cao để tránh làm mất hoạt tính của enzyme.
Nồng độ protein enzyme tỷ lệ thuận với lượng enzyme cố định lên chất mang ở một giới hạn nhất định.
Việc lựa chọn chất mang phải đảm bảo những yêu cầu về độ bền cơ học, độ bền hóa học, khả năng hấp phụ một lượng lớn enzyme, giá thành, tính chức năng và độ phân cực. Nhìn chung, lipase sẽ giữ được hoạt tính khi được cố định trên chất mang kỵ nước (polyethylene, polypropylene, styrene, polyacrylic) vì sự nhả hấp phụ enzyme xảy ra không đáng kể và sự hấp phụ cơ chất kỵ nước lên bề mặt chất mang sẽ làm tăng sự tiếp xúc cơ chất đối với enzyme. Sử dụng chất mang ưu nước (Duolite, Celite, silica gel, than hoạt tính, đất sét hoạt tính và Sepharose) có thể làm giảm hoạt tính enzyme vì các nhóm chức ưu nước trên chất mang sẽ biến tính cấu trúc enzyme và ngăn cản enzyme tiếp xúc với cơ chất. Bên cạnh đó, nếu cấu trúc chất mang có tính chất lỗ xốp vừa đủ để enzyme chui vào thì sẽ làm giảm sự tiếp xúc cơ chất với enzyme. Vì vậy, hoạt tính của enzyme lipase cố định thường nhỏ hơn hoạt tính của enzyme hòa tan cùng loại. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 24 Theo Lee và Akoh (1998), việc cố định enzyme lipase lên các chất mang khác nhau sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính cũng như độ bền của enzyme được sử dụng trong phản ứng nội chuyển hóa ester. Enzyme lipase thu nhận từ hai loài Pseudomonas spp. (Lipase AK và PS) và Candida rugosa (Lipase AY) được hấp phụ trên các chất mang đất sét, Celite 545, DEAE- Sephadex, CM-Sephadex và được sử dụng để tổng hợp chất béo có cấu trúc từ tricaprylin và trilinolein. Các yếu tố cần khảo sát là hàm lượng enzyme hấp phụ trên mỗi loại chất mang, độ ẩm của enzyme cố định, hàm lượng sản phẩm tạo thành (hỗn hợp monocaprinyllinolein và dicaprinyllinolein) và hoạt độ của mỗi loại enzyme cố định trong 24 giờ đầu phản ứng (µmol sản phẩm/phút). Bảng 3.1 – Các loại enzyme lipase cố định AK, AY, PS lên các chất mang khác nhau Enzyme lipase AK và AY thể hiện hoạt độ cao nhất khi được hấp phụ trên chất mang Celite 545, trong khi đó thì lipase PS có hoạt độ cao nhất đối với chất mang là CM-Sephadex (Bảng 3.1). Trong số các enzyme, lipase AY có hoạt độ cao nhất (0,35 U), tạo thành 501µmol sản phẩm (monocaprinyllinolein=103 µmol, dicaprinyllinolein=398 µmol) sau 24 giờ phản ứng. Bên cạnh đó, ta nhận thấy tất cả các enzyme cố định đều thể hiện tính đặc hiệu cơ chất đối với trilinolein. Tuy nhiên, đối với chất mang CM-Sephadex, việc cơ chất trilinolein được thủy phân nhanh hơn tricaprylin không được thể hiện rõ trong suốt thời gian phản ứng. Từ đó ta nhận thấy rằng có thể sử dụng các loại chất mang khác nhau để thay đổi tính đặc hiệu của enzyme. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 25 Bảng 3.2 – Hàm lượng các sản phẩm sau 24, 48, và 72 giờ phản ứng nội chuyển hóa ester Trong suốt 72 giờ phản ứng, hàm lượng SL1 (dicaprinyllinolein) được tổng hợp nhiều hơn SL2 (monocaprinyllinolein), và trong một số trường hợp cho thấy không tạo thành SL2 (Bảng 3.2). Một số enzyme lipase cố định, Clay AY, Celite AY, CM PS và DEAE AK được chọn để kiểm tra độ bền hoạt tính khi tái sử dụng các loại enzyme này. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.3. Chỉ duy nhất enzyme lipase AK được cố định trên DEAE-Sephadex có thể duy trì được hoạt tính sau 5 lần sử dụng. Phương pháp hấp phụ vật lý tương đối dễ thực hiện và đơn giản để không làm biến tính cấu trúc của enzyme. Tuy nhiên, lực liên kết enzyme với chất mang là rất yếu khi so sánh với các phương pháp cố định khác. Vì vậy, hoạt tính của enzyme cố định bằng phương pháp này sẽ giảm đáng kể sau 5 lần sử dụng ( hoạt tính giảm 97% đối với DEAE AK; Clay AY hoàn toàn mất hoạt tính sau lần sử dụng đầu tiên). Hàm lượng nước là yếu tố quan trọng trong phản ứng nội chuyển hóa ester. Nếu lượng nước quá dư sẽ dẫn đến phản ứng thủy phân thay vì tổng hợp những liên kết ester mới. Các enzyme lipase cố định có hàm lượng nước từ 8,9 đến 18,7% khi điều kiện sấy không hiệu quả sẽ ảnh hưởng đến hàm lượng sản phẩm tạo thành do cơ chất bị thủy phân hoàn toàn. Bảng 3.3 – Hàm lượng sản phẩm tạo thành khi tái sử dụng enzyme lipase cố định Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 26 3.1.1.2. Phương pháp gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết đồng hóa trị Nguyên tắc: dựa trên sự tương tác đồng hóa trị giữa phân tử enzyme và chất mang. Các chất mang phải là những chất không được tan trong nước. Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong quy mô công nghiệp. Các nhóm chức của phân tử protein enzyme có khả năng tạo liên kết đồng hóa trị với chất mang là: nhóm COOH (acid aspartic, acid glutamic), ε-NH2 (lysin), OH (serin), nhân indol (tryptophan), imidazol (histidin). Các liên kết đồng hóa trị giữa chất mang và enzyme có thể phân loại như sau:
Diazo hóa : chất mang – N=N – enzyme
Tạo cầu amit : chất mang – CO – NH – enzyme
Alkyl hóa và aryl hóa : chất mang – CH2 – NH2 – enzyme
Tạo base Schiff : chất mang –CH=N – enzyme
Trao đổi tidol-disulfua : chất mang – S – S – enzyme Phương pháp: có hai phương pháp gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết đồng hóa trị
Gắn một giai đoạn: quá trình kết hợp enzyme có thể xảy ra qua một giai đoạn nếu chất mang có chứa các nhóm chức có khả năng tham gia trực tiếp với nhóm amin của protein enzyme.
Gắn hai giai đoạn: giai đoạn đầu để hoạt hóa chất mang bằng cách đưa vào các nhóm có khả năng phản ứng hơn; giai đoạn hai là giai đoạn kết hợp enzyme. Các chất mang thường sử dụng:
Polymer hữu cơ: polysaccarit dextran (sephadex), agarose (sepharose).
Dẫn xuất cellulose: carboxyl methyl cellulose (CMC), diethylaminoethyl cellulose (DEAE-Cellulose), DEAE-Sephadex, CM-Sephadex.
Polymer tổng hợp: polyacrylamit, polystyrol, polyamit, polyvinyl.
Chất vô cơ: silicagel, bentonit, nhôm hydroxyt. Các polymer vô cơ bền với các tác nhân lý học (nhiệt, cơ học), hóa học (môi trường acid, kiềm, dung môi hữu cơ), sinh học (vi sinh vật) hơn polymer hữu cơ. Đặc biệt không bị biến đổi cấu hình khuôn khi thay đổi môi trường xung quanh. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 27 Ưu điểm của phương pháp là tạo độ bền cao cho liên kết protein enzyme và chất mang nên tránh được sự mất mát enzyme trong quá trình phản ứng. Do đó phương pháp này rất thích hợp cho thiết bị phản ứng liên tục. Tuy nhiên, lượng enzyme cố định thường thấp hơn những phương pháp khác. Hoạt tính enzyme có thể bị giảm do sự biến đổi cấu trúc hình thể enzyme trong quá trình cố định và do sự tiếp xúc hạn chế giữa cơ chất và trung tâm hoạt động của enzyme. Lee và cộng sự (2006) đã tập trung nghiên cứu vào việc thực hiện và tối ưu hóa các bước cố định enzyme lipase trên chất mang bằng liên kết đồng hóa trị (cross-linking method) để đạt được hiệu quả cao nhất. Enzyme lipase sử dụng để nghiên cứu thuộc loài Rhizopus oryzae và chất mang là silica gel. Quy trình cố định enzyme lipase được thực hiện theo sơ đồ như Hình 3.1
Chuẩn bị enzyme lipase: enzyme lipase được thu nhận từ chủng Rhizopus oryzae KCCM 11970. Toàn bộ canh trường sau khi trích ly enzyme được đem đi ly tâm (10.000 vòng/phút, 15 phút) để tách bã rắn. Ta thu được dung dịch enzyme thô, tiếp tục làm dung dịch bão hòa bởi muối ammoni sulfate (NH4)2SO4 đến nồng độ 60% để kết tủa protein enzyme. Sau đó ly tâm dung dịch với điều kiện như trên để thu nhận enzyme. Hòa tan enzyme trong dung dịch đệm phosphate 0,05M (pH=7) và lọc qua màng membrane siêu lọc để thu nhận dung dịch enzyme tinh khiết. Bảo quản ở 4oC.
Tiền xử lý chất mang: là hòa trộn silica gel với 15% 3-APTES (3- amino propyltriethoxysilane) trong 20mL acetone và ngâm trong 2 giờ ở 50oC, khuất trộn liên tục. Sau đó silica gel được rửa với nước và sấy ở nhiệt độ 60oC trong 2 giờ.
Xử lý glutaraldehyde: bằng cách đun sôi hợp chất này trong nước 64oC, 20 phút. Mục đích của việc xử lý chất hoạt hóa glutaraldehyde là nhằm giảm bớt chất độc, có hại trong hợp chất.
Hoạt hóa silica gel: trong môi trường đệm phosphate 0,05M (pH=7), hòa trộn chất hoạt hóa glutaraldehyde và khuấy đảo liên tục trong 2 giờ ở nhiệt độ 20oC. Sau đó, lọc silica gel đã được hoạt hóa, rửa và ngâm trong dung dịch đệm phosphate 0,05M (pH=7).
Cố định enzyme: bằng cách cho 2mL dung dịch enzyme lipase vào trong dung dịch ngâm silica gel đã được hoạt hóa, khuất trộn trong 2 giờ ở 20oC. Thu nhận enzyme cố định bằng phương pháp lọc, sau đó rửa bằng nước và bảo quản trong dung dịch đệm phosphate 0,05M (pH=7) ở nhiệt độ 4oC. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 28 Lọc Rửa Bảo quản Tiền xử lý Sấy Hoạt hóa Rửa Cố định enzyme Lọc Enzyme lipase trong dd đệm Silica gel Đệm phosphate 0,05M (pH=7) Enzyme cố định Glutaraldehyde Xử lý Hình 3.1 – Sơ đồ quy trình cố định enzyme lipase bằng liên kết đồng hóa trị Phương pháp thí nghiệm:
Xác định hoạt tính enzyme lipase cố định: 10mL dung môi isooctane có chứa 10%(w/v) dầu olive cho vào 10mL dung dịch đệm phosphate 0,05M (pH=7) có 1g enzyme lipase cố định. Thực hiện phản ứng trong bồn điều nhiệt (37oC, 150 vòng/phút, 30 phút). Kết thúc phản ứng bằng cách cho vào dung dịch 1mL dung dịch acid HCl 6N và lắc mạnh hỗn hợp trong 30 giây. Lấy phần trên của dung dịch (2mL) cho vào ống nghiệm có chứa sẵn đồng acetate-pyridine (0,5mL). Các acid béo tự do sẽ hòa tan trong dung môi isooctane và được đem đi định lượng bằng phương pháp Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 29 quang phổ tia UV ở bước sóng 715nm. Hoạt độ của enzyme là lượng enzyme cần để thủy phân 1mol acid béo tự do trong 1 phút.
Xác định mức độ silan hóa: sử dụng phương pháp ninhyrin.
Xác định lượng enzyme gắn kết với silica gel: sử dụng phương pháp Bradford (Kwon và Rhee, JAOCS, 63,1986). Kết quả thí nghiệm:
Quá trình tiền xử lý silica gel: có ảnh hưởng đến mức độ silan hóa và lượng enzyme liên kết chất mang. Mục đích của quá trình này là loại bỏ tạp chất trên bề mặt chất mang, đồng thời hoạt hóa bề mặt silanol (Si – OH) để tăng khả năng phản ứng với chất hoạt hóa. Rất nhiều hóa chất được sử dụng đối với mẫu silica gel đã qua tiền xử lý. Sử dụng 35% hydrogen peroxide đối với silica gel tiền xử lý cho kết quả tốt nhất (Hình 3.2). Hình 3.2 – Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý silica gel đối với việc cố định enzyme (
) Mức độ silan hóa; (O) Glutaraldehyde (1) không tiền xử lý; (2) sử dụng bồn siêu âm nhiệt độ phòng trong 2 giờ; và kết hợp với (3) H2SO4:H2O2 (5:1); (4) 5% H2O2; (5) 10% H2O2; (6) 15% H2O2; (7) 20% H2O2; (8) 25% H2O2; (9) 27% H2O2; (10) 30% H2O2; (11) 35% H2O2.
Hóa chất sử dụng để hoạt hóa: 3-APTES, 3-APTMS (3-aminopropyltrimethoxy silane), 3-TMSPEDA (3-(trimethoxysilyl)propylethylendiamine) hòa tan trong dung môi acetone để kiểm tra khả năng silan hóa bề mặt chất mang. Trong đó, 3-APTES cho kết quả tốt nhất (Hình 3.3) với nồng độ 15% (w/v) (Hình 3.4). Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 30 Hình 3.3 – Ảnh hưởng của hóa chất hoạt hóa đối với mức độ silan hóa (
) hàm lượng enzyme liên kết; (O) hoạt độ enzyme cố định Hình 3.4 – Ảnh hưởng nồng độ 3-APTES đối với mức độ silan hóa (
) hàm lượng enzyme liên kết; (O) hoạt độ enzyme cố định
Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian phản ứng đối với hoạt độ của enzyme lipase khi được cố định trên silica gel: điều kiện thực hiện phản ứng tại 20oC thì enzyme lipase cố định có hoạt tính cao nhất (8,0 U/g chất mang) sau 120 phút (Hình 3.5). Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 31 Hình 3.5 – Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian phản ứng đến hoạt độ enzyme cố định
Sự ảnh hưởng của nhóm chức aldehyde chưa liên kết đối với hoạt độ enzyme lipase cố định: Glutaraldehyde là chất có thể làm giảm hoạt tính enzyme lipase vì những nhóm chức aldehyde sẽ liên kết với các nhóm amin của enzyme. Vì vậy sau khi liên kết với chất mang và enzyme, những gốc aldehyde còn tự do phải bị khóa lại bởi những hợp chất phân tử lượng thấp như L-lysine, glycine, và ethanolamine (sau khi cố định enzyme, bổ sung những hợp chất này tiếp tục thực hiện phản ứng tại 20oC trong 2 giờ). Kết quả thí nghiệm cho thấy sử dụng 0,2% (v/v) ethanolamine thì enzyme có hoạt độ cao nhất (Hình 3.6 và Hình 3.7). Hình 3.6 – Ảnh hưởng của những hợp chất phân tử lượng thấp đến hoạt độ enzyme cố định (A) không xử lý; (B) L-lysine; (C) ethanolamine; (D) glycine Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 32 Hình 3.7 – Ảnh hưởng của nồng độ ethanolamine đến hoạt độ enzyme cố định
Độ bền của enzyme cố định: sau mỗi lần sử dụng, enzyme lipase cố định được rửa sạch và tái sử dụng 20 lần. Kết quả thí nghiệm cho thấy enzyme vẫn giữ được 80% hoạt tính so với ban đầu (Hình 3.8). Hình 3.8 – Độ bền enzyme lipase cố định sau mỗi lần tái sử dụng Kết luận: Các bước thực hiện việc cố định enzyme lipase trên chất mang silica gel bằng liên kết đồng hóa trị phải được tối ưu như sau:
Tiền xử lý silica gel với 35% hydrogen peroxide.
Silan hóa bề mặt chất mang bằng 15% 3-APTES trong acetone và sử dụng 2% glutaraldehyde đã được xử lý trong dung dịch nước ở 65oC trong 25 phút. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 33
Sau khi liên kết với enzyme, những gốc aldehyde tự do sẽ được loại bằng 0,2% (v/v) ethanolamine.
Hoạt độ enzyme vẫn giữ được 80% sau 20 lần sử dụng (hoạt hóa lại enzyme cố định sau mỗi lần sử dụng). 3.1.1.3. Phương pháp gói enzyme trong khuôn gel Nguyên tắc: phân tử enzyme được giữ trong mạng lưới không gian của một polymer không tan trong nước. Gel có thể được điều chế từ các polyacrylamit, hydroxyethyl-2-metacrylat tạo mạng lưới bằng ethylenglycol dimetacrylat, polyurethane, polyvinyl. Yokozeki và cộng sự (1981) đã khảo sát sự ảnh hưởng của các phương pháp cố định đối với hoạt độ enzyme trong phản ứng tổng hợp chất béo thay thế bơ ca cao từ dầu olive và acid stearic, acid palmitic. Enzyme lipase thu nhận từ loài Rhizopus delemar (6000 U/mg). Hóa chất sử dụng:
Resin ưu nước (hydrophilic photo-crosslinkable resin prepolymer): ENT-1000, 2000, 4000, 6000 (tương ứng với khối lượng phân tử polyethylene glycol).
Resin kỵ nước (hydrophobic photo-crosslinkable resin prepolymer): ENTP-2000.
Urethane tiền polymer: PU-3, 6, 9.
Bột silic dioxide: Spherosil (XOB 15, QMA, XOB 15 hoạt hóa bằng glutaraldehyde).
Celite (No. 535).
Dung môi: n-hexane.
Dung dịch đệm: TES (N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid) (pH=6,5). Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 34 Phương pháp cố định:
Hấp phụ lipase lên Celite và Spherosil XOB 15: enzyme cố định C-Lipase; Spherosil XOB 15.
Gói enzyme trong khuôn gel:  Resin ưu nước: trộn 0,5g chất mang mỗi loại với 5mg benzoin ethyl ether và 100µl dung dịch đệm 0,3M TES (pH=6,5). Đun nóng chảy ở 60oC, sau đó làm mát về nhiệt độ phòng và bổ sung 5mg lipase tự do hòa tan sẵn trong 100µl dung dịch đệm. Hỗn hợp dạng gel được chiếu qua tia UV và cắt thành hạt nhỏ (3 x 3 x 3 mm).  Resin kỵ nước: trộn 0,5g chất mang với 5mg benzoin ethyl ether hòa tan trong 400µl dung môi n-hexane bão hòa nước. Bổ sung 5mg lipase tự do hòa tan sẵn trong 200µl dung dịch đệm, thêm 40mg Tween 80 hoặc 5mg C-Lipase. Hỗn hợp dạng gel được xử lý bằng tia UV trước khi cắt thành hạt nhỏ (3 x 3 x 3 mm).  Tiền polymer urethane: đun nóng chảy 0,5g chất mang mỗi loại ở nhiệt độ 60oC và bổ sung 200µl dung dịch đệm 0,3M TES (pH=6,5) có chứa 5mg enzyme lipase. Giữ nhiệt độ hỗn hợp ở 4oC trong vòng 1 giờ. Cắt khối gel thành hạt nhỏ (3 x 3 x 3 mm).
Tạo liên kết ion: 1g QMA (–[(CH3)3N]+Cl-) trộn với 10mg lipase hòa tan trong 3mL dung dịch đệm 0.03M TES, pH=6,5. Giữ hỗn hợp ở 4oC trong 1 giờ, khuấy đảo liên tục.
Tạo liên kết đồng hóa trị: 1g XOB 15 hoạt hóa bởi glutaraldehyde trộn với 10mg lipase hòa tan trong 3mL dung dịch đệm 0.03M TES, pH=6,5. Giữ hỗn hợp ở 4oC trong 1 giờ, khuấy đảo liên tục. Thí nghiệm: Hỗn hợp phản ứng bao gồm enzyme lipase cố định (tương ứng 5mg enzyme lipase), 0,25g dầu olive và 0,25g acid stearic trong 10mL dung môi n-hexane. Nhiệt độ thực hiện phản ứng 40oC, 120 vòng/phút, trong 1 giờ. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 35 Ảnh hưởng của chất mang đến hoạt tính enzyme lipase cố định Bảng 3.4 – Ảnh hưởng của chất mang và phương pháp cố định đến hoạt tính enzyme lipase Enzyme lipase tự do hoàn toàn không có hoạt tính trong dung môi hữu cơ n-hexane, tuy nhiên lipase hấp phụ trên Celite lại có hoạt tính rất tốt vì nó có khả năng phân tán trong hỗn hợp phản ứng. Mặc dù bị nhốt trong khuôn gel, nhưng ENTP-2000 có hoạt tính cao nhất trong số các enzyme cố định khác. Nhưng hoạt độ tương đối của enzyme này dao động trong một khoảng giới hạn (29 – 82%). Nguyên nhân là do enzyme lipase tự do không phân tán đều bên trong khuôn gel. Tuy nhiên, khi sử dụng C-Lipase để gói trong khuôn gel ENTP- 2000 thì hoạt độ tương đối enzyme rất ổn định (75%). Bên cạnh đó, hoạt tính enzyme giảm khi được cố định trên chất mang ưu nước (ENT) bởi vì cơ chất sẽ bị ngăn cản khuếch tán vào khối gel. Các enzyme cố định PU-3,6,9 cũng có hoạt tính thấp nhưng cũng thể hiện khá rõ sự ảnh hưởng của tính kỵ nước chất mang. PU-3 không tan trong nước nên có hoạt tính cao hơn các loại PU khác. Độ bền của enzyme cố định: khảo sát độ bền của hai loại enzyme cố định C-Lipase và ENTP-2000 – C-Lipase trong 12 ngày với 12 lần thí nghiệm liên tục, mỗi phản ứng nội chuyển hóa ester trong thí nghiệm được thực hiện trong 24 giờ. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 36 Hình 3.9 – Độ bền hoạt độ của enzyme lipase cố định (o) ENTP-2000-entrapped C-Lipase Sau 5 lần thí nghiệm, hoạt độ C-Lipase giảm gần phân nửa so với hoạt độ ban đầu. Nhưng enzyme gói trong khuôn gel có thể duy trì được hơn 90% hoạt độ sau 12 lần thí nghiệm. Nguyên nhân là do enzyme gói trong khuôn gel được bảo vệ không bị tổn thất và biến tính cấu trúc bởi dung môi n-hexane. 3.2.1.4. Phương pháp Bio – imprinting Định nghĩa: Bio-imprinting là kỹ thuật hoạt hóa bề mặt enzyme lipase để làm xuất hiện vùng trung tâm hoạt động của enzyme. Kỹ thuật này được sử dụng cho phản ứng của enzyme trong dung môi hữu cơ hoặc môi trường khan nước (Mosbach và cộng sự, 1991). Nguyên tắc: làm cho enzyme lipase tiếp xúc với bề mặt phân chia pha; vùng trung tâm hoạt động không còn bị che phủ bởi đoạn peptide cấu trúc xoắn “lid” thì làm khô lạnh (lyophilize) toàn bộ hỗn hợp enzyme để giữ cho cấu trúc hoạt hóa được ổn định. Phương pháp thực hiện:
Để tạo thành bề mặt phân chia pha, ta có thể sử dụng Tween 20, n-octyl-β-D-glucose (n-OG) đến nồng độ bão hòa hoặc cơ chất dầu và gum arabic.
Các bước thực hiện (Gonzalez-Navarro & Braco, 1997):  Hòa tan enzyme lipase trong dung dịch đệm  Bổ sung chất nhũ hóa, khuấy trộn và để ở nhiệt độ phòng  Làm khô lạnh dung dịch ở -30oC trong 36 giờ  Thu nhận enzyme hoạt hóa ở dạng muối Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 37  Các chất lưỡng cực được rửa sạch bằng dung dịch benzene/ethanol (90:10 v/v) Để tăng sự tiếp xúc enzyme với bề mặt phân chia pha, Yilmaz (2002) đã sử dụng không khí để sục vào hỗn hợp enzyme trong thiết bị tạo bọt (Hình 3.10) Hình 3.10 – Thiết bị tạo bọt trong kỹ thuật bio-imprinting Đối với phương pháp này, hỗn hợp enyzme và chất nhũ hóa không cần phải xử lý lạnh khô. Toàn bộ hỗn hợp cho vào thiết bị tạo bọt, duy trì nhiệt độ ở 50oC bằng nước nóng. Khi thiết bị ổn định nhiệt trong 10 phút, ta bắt đầu sục khí với lưu lượng 150mL/phút và tạo độ chân không 10mmHg. Thời gian tạo bọt là 2 giờ. Sau đó, khóa van hơi, tăng độ chân không đến 50mmHg trong 1 giờ. Enzyme rắn thu được ở dạng muối. Yilmaz (2002) đã tiến hành thí nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng của các phương pháp bio-imprinting đến hoạt tính enzyme lipase. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 38 Bảng 3.5 – So sánh sự ảnh hưởng các phương pháp bio-imprinting đến hoạt tính enzyme Lipase PS (Candida rugosa); Lipase AK (Pseudomonas spp.) Phản ứng nội chuyển hóa ester được thực hiện trong môi trường không có dung môi hữu cơ, thời gian phản ứng 24 giờ. Hoạt tính được đánh giá thông qua phần trăm chuyển đổi cơ chất (percentage of conversion) và được so sánh (change) với enzyme tự do không qua bất kỳ quá trình xử lý nào (direct from bottle-DFB). Các phương pháp bio-imprinting bao gồm sử dụng đệm không khí (air buffer) và lạnh khô (lyophilization); mỗi phương pháp có sử dụng chất nhũ hóa (Tween 20) hoặc cơ chất dầu olive. Kết quả thí nghiệm cho thấy sử dụng đệm không khí sẽ làm tăng hoạt tính enzyme lipase lên gấp 4,5 lần enzyme lipase tự do. Bổ sung Tween 20 hoặc dầu olive để tăng tính đồng nhất cho hỗn hợp enzyme nhưng hoạt tính enzyme lại thấp hơn khi không sử dụng chất nhũ hóa trong phương pháp sử dụng đệm không khí. Rõ ràng phương pháp này có thể làm tăng thêm sự tiếp xúc cơ chất cũng như hoạt tính của enzyme lipase. Nếu không sử dụng chất nhũ hóa mà làm lạnh khô hỗn hợp thì enzyme sẽ bị biến tính, hoạt tính của enzyme chỉ bằng phân nữa so với lipase tự do. Enzyme lipase được xử lý bằng phương pháp bio-imprinting có khuyết điểm là khá nhạy cảm với hàm lượng nước. Vì chính những phân tử nước này sẽ làm thay đổi cấu trúc đã được hoạt hóa của enzyme (Hình 3.11). Bổ sung thêm 0,5% hàm lượng nước, hoạt tính enzyme lipase giảm rõ rệt. Điều kiện tối ưu để thực hiện phương pháp đệm không khí cũng được nghiên cứu để đạt hoạt tính enzyme lipase cao nhất (50oC trong 2 giờ). Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 39 Hình 3.11 – Ảnh hưởng của hàm lượng nước đến hoạt tính enzyme bio-imprinted Bên cạnh việc nghiên cứu sự ảnh hưởng của các hợp chất lưỡng cực đến tính chất hoạt hóa bề mặt enzyme lipase, Yilmaz(2003) còn sử dụng chất ức chế enzyme để làm tăng hoạt tính enzyme trong phản ứng nội chuyển hóa ester. Chất ức chế được sử dụng có tên thương mại là Orlistat (C29H53NO5), không tan trong nước, chỉ hòa tan trong các dung môi hữu cơ như chloroform, methanol, và ethanol (Hình 3.12). Đây là chất ức chế enzyme lipase nhưng thuận nghịch. Các bước thực hiện giống như khi sử dụng các chất nhũ hóa, nhưng ta thay thế các chất nhũ hóa bằng Orlistat hòa tan trong chloroform. Sau quá trình làm khô lạnh, tiến hành rửa trôi Orlistat bằng chính dung môi chloroform. 1-(3-hexyl-4-oxo-oxetan-2- yl)tridecan-2-yl 2-formylamino-4- methyl-pentanoate Hình 3.12 – Cấu trúc phân tử Orlistat Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 40 Khi được hòa tan trong dung dịch enzyme lipase, Orlistat sẽ kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme. Nhưng sau quá trình làm lạnh khô và rửa trôi chất ức chế, vùng trung tâm hoạt động của enzyme sẽ không còn bị che phủ. Hoạt tính của enzyme lipase tăng lên rất nhiều so với enzyme tự do (Hình 3.13). Nhưng so sánh hoạt tính các enzyme sau khi xử lý bằng Orlistat và các chất nhũ hóa thì kết quả tương đương nhau (Bảng 3.6). Thí nghiệm của Yilmaz cũng nghiên cứu sự ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau đến hoạt tính enzyme lipase (Bảng 3.7). Hexane được xem là môi trường phản ứng tốt nhất so với những loại dung môi khác, nhưng hiệu quả hoàn toàn giống như phản ứng trong môi trường không sử dụng dung môi. Enzyme sau khi xử lý cũng khá nhạy cảm với hàm lượng nước (0,5%) (Hình 3.14). Một điểm thuận lợi khi sử dụng những loại enzyme này là khả năng tái sử dụng rất dễ dàng (hỗn hợp sau phản ứng được lọc qua cột Na2SO4 khan nước) và hoạt tính enzyme vẫn duy trì được 80% sau 3 lần sử dụng (Hình 3.15). Hình 3.13 – Hoạt tính của enzyme lipase bio-imprinted (Orlistat) và enzyme lipase tự do trong phản ứng nội chuyển hóa ester (solvent-free) 24 giờ Lipase PS (Candida rugosa); AK,AY-30 (Pseudomonas spp.); pfL (Pseudomonas fluorescens); cvL (Chromabacterium viscosum); ppL (porcine pancreatic lipase) (
) enzyme lipase tự do; (O) enzyme lipase Orlistat bio-imprinted Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 41 Bảng 3.6 – Ảnh hưởng của chất nhũ hóa và Orlistat trong phương pháp bio-imprinting đến hoạt tính enzyme lipase (% chuyển đổi cơ chất trong 24 giờ) (b: số liệu so sánh với enzyme lipase tự do (DFB- direct from bottle) Bảng 3.7 – Ảnh hưởng của môi trường phản ứng đến hoạt độ enzyme pfL Hình 3.14 – Ảnh hưởng của hàm lượng nước đến các enzyme lipase Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 42 Hình 3.15 – Khả năng tái sử dụng thể hiện qua hoạt tính enzyme (thứ tự cột từ trái sang phải: n-OG, Orlistat, enzyme lipase tự do) Không chỉ dừng lại ở đây, kỹ thuật bio-imprinting còn được kết hợp với kỹ thuật cố định enzyme để nâng cao hoạt tính của enzyme lipase. Yilmaz và cộng sự (2002) đã thực hiện nhiều thí nghiệm để xem xét hiệu quả của việc kết hợp hai phương pháp này so với những phương pháp xử lý enzyme khác (enzyme lipase sử dụng là ppL và pfL). Phương pháp kết hợp bio-imprinting và cố định enzyme lipase:
Nguyên tắc: áp dụng kỹ thuật cố định enzyme trên bề mặt chất mang (hấp phụ) có bổ sung chất nhũ hóa vào trong hỗn hợp enzyme.
Phương pháp 1: áp dụng cho chất nhũ hóa là n-OG và chất mang là đất hoạt hóa (bioimprinted – immobilized I).  Hòa tan enzyme lipase trong dung dịch đệm (pH=7,5)  Bổ sung chất nhũ hóa, khuấy trộn hỗn hợp trong 5 phút  Bổ sung đất hoạt hóa, khuấy trộn thêm 5 phút  Nhỏ giọt dung môi acetone được làm lạnh vào trong hỗn hợp để kết tủa enzyme lên chất mang  Lọc hỗn hợp enzyme và làm bay hơi acetone ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.  Rửa enzyme cố định bằng hỗn hợp benzene/ethanol (90:10 v/v) để loại n-OG (tiến hành 3 lần) Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 43
Phương pháp 2: áp dụng cho chất nhũ hóa là n-OG và chất mang là CM-Sephadex (bioimprinted – immobilized II).  Hòa tan enzyme lipase và chất nhũ hóa vào nước lạnh, khuấy trộn hỗn hợp trong 5 phút  Bổ sung CM-Sephadex hòa tan trong dung dịch đệm (pH=3,6), khuấy trộn thêm 5 phút  Làm lạnh khô hỗn hợp -30oC trong 36 giờ  Rửa enzyme cố định bằng hỗn hợp benzene/ethanol (90:10 v/v) để loại n-OG (tiến hành 3 lần) Tiến hành tương tự phương pháp cố định như trên nhưng không sử dụng chất nhũ hóa để đánh giá hiệu quả của việc kết hợp kỹ thuật bio-imprinting: Immobilized I – đất hoạt hóa, Immobilized II – CM-Sephadex. Kết quả thí nghiệm:
Phương pháp kết hợp cho thấy hoạt tính enzyme lipase cao hơn rất nhiều so với enzyme lipase tự do và cố định (Bảng 3.8).
Dung môi hữu cơ thích hợp cho phản ứng là hexane (Bảng 3.9).
Khả năng tái sử dụng enzyme vẫn duy trì được hoạt tính cao hơn phương pháp cố định (Hình 3.16).
Hàm lượng nước là yếu tố làm giảm hoạt tính enzyme rõ rệt (Hình 3.17)
Nhiệt độ tối ưu cho phản ứng là 55oC đối với tất cả enzyme, nhiệt độ càng tăng hoạt tính enzyme càng giảm. Tại nhiệt độ 85oC, enzyme gần như bị ức chế hoàn toàn (Hình 3.18). Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 44 Bảng 3.8 – Hoạt tính enzyme lipase với các phương pháp xử lý khác nhau (b: các phương pháp chuẩn bị enzyme được thực hiện như trên) (c : số liệu so sánh với enzyme lipase tự do (Solid enzyme supplied) Bảng 3.9 – Ảnh hưởng của dung môi đến hoạt tính enzyme (b: hỗn hợp enzyme và cơ chất) Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 45 Hình 3.16 – Khả năng tái sử dụng thể hiện qua hoạt tính enzyme (thứ tự cột từ trái sang phải: immobilzed I, II; bioimprinted-immobilized I, II) Hình 3.17 – Ảnh hưởng của hàm lượng nước đến các enzyme lipase (thứ tự cột từ trái sang: enzyme rắn; n-OG; immobilzed I, II; bioimprinted-immobilized I, II) Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 46 Hình 3.18 – Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme 3.1.2. Các thiết bị sử dụng enzyme lipase cố định 3.1.2.1. Thiết bị phản ứng dạng cột (Packed – bed reactor) Thiết bị phản ứng dạng cột có dạng hình trụ, được lắp đầy chất mang có gắn enzyme bằng một trong các nguyên tắc cố định enzyme. Đặc điểm của thiết bị phản ứng dạng cột là cơ chất chảy dòng qua khối enzyme cố định, song song với trục dọc thiết bị và không bị khuấy trộn ngược. Trong điều kiện lý tưởng, dòng cơ chất có vận tốc không đổi trong suốt chiều cao cột. Cơ chất tại mọi khu vực trong thiết bị đều có cơ hội tiếp xúc với enzyme như nhau, sản phẩm tại mọi vị trí trong thiết bị đều có thời gian lưu như nhau (Đặng Thị Thu, 2003). Hiệu quả chuyển hóa cơ chất của thiết bị phản ứng dạng cột tương đương với thiết bị gián đoạn có cánh khuấy có cùng thời gian lưu. Có thể xem mỗi phân đoạn chiều cao cột thiết bị như một thiết bị phản ứng gián đoạn. Mức độ chuyển hóa mong muốn có thể đạt được bằng cách sử dụng cột phản ứng có chiều cao thích hợp. Để có thể tạo ra chế độ chảy lý tưởng trong cột, chất lỏng trong thiết bị cần giữ ở chế độ chảy màng để ổn định mức độ đảo trộn và truyền nhiệt bình thường của dòng chảy, hạn chế sự đảo trộn ngược của dòng chất lỏng. Khó có thể đạt được giá trị Re cao trong thiết bị do khó đạt được vận tốc dòng cơ chất cao. Vì thế nồng độ cơ chất trong thiết bị phản ứng dạng cột thường rất cao và nồng độ sản phẩm thường rất thấp, kéo theo hệ số chuyển hóa thường Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 47 rất cao ở cửa vào và rất thấp ở cửa ra thiết bị. Thiết bị dạng cột thích hợp cho các quá trình bị ảnh hưởng của sự ức chế bởi sản phẩm cuối, bởi sự hoạt hóa của cơ chấ và tính thuận nghịch của phản ứng. Trong thiết bị dạng cột lý tưởng, 100% phân tử cơ chất có thời gian lưu bằng với thời gian lưu trung bình của cơ chất trong thiết bị. Đây là điểm khác biệt lớn của thiết bị dạng cột so với thiết bị liên tục có khuấy. Tại giá trị Re thấp, vận tốc dòng tỷ lệ thuận với sự giảm áp trong thiết bị. Thông thường sự giảm áp trong thiết bị tỷ lệ thuận với chiều cao lớp chất mang, vận tốc dòng, độ nhớt động học của dòng cơ chất và thể tích dung dịch trong thiết bị và tỷ lệ nghịch với diện tích cắt ngang của hạt enzyme cố định. Sự tăng vận tốc dòng có thể dẫn đến biến dạng vật lý và độ chắc của những hạt enzyme cố định trên chất mang mềm. Sự biến dạng các hạt enzyme có thể dẫn tới giảm bề mặt tiếp xúc của hạt enzyme với dòng cơ chất, giảm vận tốc truyền khối, hạn chế dòng chảy và gây giảm áp lớn trong thiết bị. Ảnh hưởng nối tiếp của các hiệu ứng tăng áp suất ngược , biến dạng hạt enzyme, hạn chế dòng chảy có thể dẫn đến hoàn toàn không có dòng chảy trong thiết bị. Thiết bị phản ứng dạng cột như một giá lọc cố định đối với dòng cơ chất. Do vậy cần sử dụng giá lọc sao cho thiết bị không bị những hạt enzyme nhỏ bít kín. Ngoài ra, cần tính đến khả năng lớp lọc bị bít kín bởi sự tạo keo hoặc kết tủa của cơ chất. Các thiết bị dạng cột có kích thước lớn thường gặp khó khăn trong kiểm soát nhiệt độ và pH. Hiện tượng đảo trộn ngược trong thiết bị phản ứng dạng cột làm sai lệch mô hình dòng chảy và làm cho thời gian lưu của cơ chất trong thiết bị thay đổi. Trong những trường hợp thiết bị chịu ảnh nhưởng lớn của hiện tượng này, cơ chất có thể chảy qua thiết bị nhanh hơn ở một số kênh được tạo ra do sự đảo trộn. Ngược lại vận tốc dòng chảy lại giảm ở một số vị trí khác. Các kênh này chỉ được tạo ra trong trường hợp có sự giảm áp lớn, lớp đệm không đồng đều, hoặc dòng cơ chất thay đổi, tạo ra vận tốc dòng khác nhau trong toàn bộ khối đệm. Khi đó, động học phản ứng trong thiết bị phản ứng dạng cột giống như trong trường thiết bị liên tục có cánh khuấy, dẫn đến khó có thể đạt được mức độ chuyển hóa cơ chất cao trong thiết bị. Các ảnh hưởng kể trên có thể được hạn chế nếu sử dụng enzyme cố định có kích thước đồng đều. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 48 Thùng chứa sản phẩm Thùng chứa nguyên liệu Mẫu Van Bơm Áp kế Cột đệm enzyme cố định Lưu lượng kế Hình 3.19 – Thiết bị phản ứng liên tục dạng cột (packed-bed reactor) Hoạt động của thiết bị: hỗn hợp nguyên liệu được phối trộn theo tỉ lệ thích hợp trong thùng chứa nguyên liệu, có thể được gia nhiệt đến nhiệt độ tối ưu cho enzyme xúc tác. Khi nhiệt độ ổn định, nguyên liệu được bơm vận chuyển vào cột phản ứng thông qua lưu lượng kế, kiểm soát thời gian lưu trong thiết bị. Việc lấy mẫu nhằm để xác định thời gian kết thúc phản ứng. Hỗn hợp sản phẩm cuối cùng được vận chuyển vào thùng chứa. Các yếu tố ảnh hưởng: các thông số cần kiểm soát khi sử dụng thiết bị liên tục dạng cột bao gồm: nhiệt độ, thời gian phản ứng, và lưu lượng vào cột đệm. Ngoài ra hàm lượng nước và các sản phẩm phụ trong phản ứng cần được theo dõi và điều khiển thông qua các yếu tố trên. Tỉ lệ phối trộn nguyên liệu có ảnh hưởng quan trọng đến thành phần và tính chất của hỗn hợp sản phẩm. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 49 Xuebing Xu và cộng sự (2002) đã tiến hành phản ứng nội chuyển hóa ester hỗn hợp dầu cá và TAG mạch ngắn (C8:0 và C10:0) trong thiết bị liên tục dạng cột. Các thông số cơ bản cần xác định bao gồm lưu lượng, nhiệt độ và độ bền của enzyme cố định (Lipozyme TL IM). Hình 3.20 – Ảnh hưởng thời gian lưu đến mức độ phản ứng và hàm lượng DAG, FFA Điều kiện phản ứng: nhiệt độ 60oC và không thêm nước Nồng độ những sản phẩm thủy phân trung gian (DAG và FFA) thay đổi rất ít trong suốt thời gian phản ứng khi thời gian lưu trong thiết bị khác nhau. Nguyên nhân là do nồng độ cơ chất nhập liệu vào trong cột đạt cân bằng sau vài giờ phản ứng và hàm lượng nước dư đã được lấy đi trước khi đo các thông số. Dựa trên đồ thị ta thấy thời gian lưu 45 phút là tối ưu cho mức độ phản ứng và hàm lượng các sản phẩm phụ. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 50 Hình 3.21 – Ảnh hưởng của nhiệt độ đến mức độ phản ứng và hàm lượng DAG, FFA Điều kiện phản ứng: Thời gian lưu 22 phút Nhiệt độ có ảnh hưởng mạnh đến mức độ phản ứng. Tuy nhiên, nhiệt độ phản ứng sẽ khác nhau vì phụ thuộc vào nguồn cơ chất sử dụng. Dựa vào đồ thị ta nhận thấy nhiệt độ 60oC là tối ưu cho phản ứng vì nó ảnh hưởng không những đối với nhiệt độ tối ưu của enzyme mà còn đối với sự khuếch tán vật chất vào bên trong chất mang. Bên cạnh đó, nồng độ những sản phẩm phụ tăng không đáng kể khi nhiệt độ phản ứng tăng. Hình 3.22 – Độ bền cột enzyme cố định thể hiện qua mức độ phản ứng Điều kiện phản ứng: thời gian lưu 45 phút, nhiệt độ 60oC, không thêm nước Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 51 Độ bền của cột nhồi enzyme là yếu tố quan trọng khi sử dụng thiết bị. Mức độ của phản ứng tương đối ổn định trong 2 tuần. Vì vậy enzyme hoàn toàn không bị mất hoạt tính bởi dòng cơ chất nhập liệu liên tục. Nguyên nhân là do chất mang thể hiện tính chất ưu nước và do đó đã giữ lại các phân tử nước cần thiết cho việc duy trì hoạt tính enzyme. Ngoài ra, độ bền cột còn được thể hiện ở lượng enzyme cố định trên chất mang, điều này làm giảm đi hoạt độ nước tối ưu. Một điều cần lưu ý là hàm lượng các sản phẩm phụ giảm nhiều trong thời gian đầu sử dụng cột vì cột còn mới. Nguyên nhân là do hàm lượng sẽ giảm dần khi phản ứng đạt cân bằng. 3.1.2.2. Thiết bị phản ứng dạng màng (Membrane reactor) Thiết bị dạng màng được trang bị một màng bán thấm cho phép các phân tử sản phẩm đi qua mà không cho phép các phân tử enzyme đi qua. Thiết bị có thể hoạt động gián đoạn hay liên tục. Sau phản ứng, sản phẩm được tách ra khỏi enzyme hoặc cơ chất dư. Nếu cơ chất có thể khuếch tán qua màng, có thể đặt enzyme và cơ chất ở hai phía khác nhau của màng. Nếu cơ chất không khuếch tán được qua màng, enzyme và cơ chất phải được đặt trong cùng một khoang của thiết bị, khi ấy cần có sự kiểm soát chặt chẽ vận tốc dòng trong trường hợp thiết bị vận hành liên tục. Trong trường hợp thiết bị sử dụng màng siêu lọc nhằm tách sản phẩm phản ứng, sử dụng enzyme tự do có thể tránh được các khó khăn như sự phân cực nồng độ hay vô hoạt enzyme trên bề mặt màng. Thiết bị dạng màng được thiết lập một cách dễ dàng nên thường được sử dụng ở quy mô nhỏ, đặc biệt trong các trường hợp phản ứng nhiều giai đoạn hoặc cần tái tạo CoE. Thiết bị phản ứng dạng màng cho phép dễ dàng thay thế enzyme đặc biệt khi enzyme không bền. Tuy nhiên, thiết bị màng có giá thành cao do màng đắt và phải thường thay thế sau một thời gian hoạt động nhất định. Vì vậy thiết bị này vẫn chưa áp dụng trong quy mô công nghiệp. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 52 Hình 3.23 – Mô hình thiết bị dạng màng (Ultrafiltration Membrane Reactor) Các yếu tố ảnh hưởng: Màng membrane được sử dụng như một thiết bị phân riêng đặc biệt mà cấu tạo và tính chất của nó ảnh hưởng quan trọng đến mục đích của quá trình. Cần phải chọn lựa hoặc chế tạo loại màng sao cho phù hợp để đảm bảo hiệu quả của quá trình. Các yếu tố như bề mặt, độ bền vững và khả năng tái sử dụng của màng cần phải xem xét đến. Bảng 3.10 – Tính chất của một số loại màng membrane Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 53 Aùp suất là yếu tố điều khiển sự hoạt động của thiết bị dạng màng. Aùp suất ảnh hưởng đến tính chọn lọc của màng đối với từng thành phần acid béo trong hỗn hợp phản ứng. Tính chọn lọc của màng được tính theo công thức: Trong đó, Cpermeate là nồng độ cấu tử cần khảo sát trong dòng đi qua màng; Cmixture là nồng độ cấu tử cần khảo sát trong hỗn hợp phản ứng. Động học phản ứng enzyme trong thiết bị màng giống như trong trường hợp thiết bị gián đoạn hoặc thiết bị liên tục. Sự khác biệt của động học trong thiết bị này là do sự khuếch tán hạn chế của enzyme và của sản phẩm qua màng bán thấm. Vì vậy, phản ứng enzyme trong thiết bị dạng màng sẽ chịu ảnh hưởng của hiệu ứng ức chế bởi sản phẩm cuối hơn so với phản ứng enzyme trong thiết bị khác. Tuy nhiên, một hiệu quả rất rõ ràng là nếu sử dụng màng membrane để tiến hành phản ứng nội chuyển hóa ester thì mức độ chuyển hóa của phản ứng sẽ cao hơn khi không sử dụng thiết bị. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 54 Hình 3.24 – Phản ứng acidolysis giữa EPA(20:5n-3)/DHA(22:6n-3) và các TAG mạch ngắn xúc tác bởi enzyme cố định Lipozyme IM (A) Thành phần EPA/DHA trong TAG theo thời gian (B) Tốc độ dòng permeate theo thời gian Điều kiện phản ứng: 50oC, 200-400 vòng/phút, 1bar (Xu và cộng sự, 2000) Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 55 3.2. PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG CO2 SIÊU TỚI HẠN 3.2.1. Định nghĩa CO2 siêu tới hạn Trạng thái siêu tới hạn là trạng thái của một chất, hợp chất hay hỗn hợp mà nhiệt độ và áp suất tồn tại của nó trên nhiệt độ tới hạn (Tc), áp suất tới hạn (Pc) và dưới áp suất chuyển sang thể rắn của chất đó. 3.2.1.1. Nguyên lý tạo thành CO2 siêu tới hạn Trạng thái của một chất biến đổi khi thay đổi các thông số trạng thái của chất đó. Nguyên tắc tạo trạng thái siêu tới hạn của một chất là hiệu chỉnh nhiệt độ và áp suất của chất đó phải lớn hơn nhiệt độ tới hạn và áp suất tới hạn của chính nó. Bảng 3.11 – Nhiệt độ tới hạn và áp suất tới hạn của một số chất thông dụng Như vậy, đối với CO2, ta duy trì áp suất trên 7,37 Mpa và nhiệt độ trên 31,1oC thì có thể tạo ra CO2 ở trạng thái siêu tới hạn. 3.2.1.2. Tính chất của lưu chất siêu tới hạn
Hằng số tới hạn Điểm tới hạn của một chất được xác định bởi nhiệt độ và áp suất, tại đó trạng thái pha lỏng và pha khí không thể phân biệt. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 56 Khi một chất bị nén và gia nhiệt đến một áp suất và nhiệt độ cao hơn điểm tới hạn thì chất đó chuyển sang một trạng khác được gọi là trạng thái siêu tới hạn. Nhiệt độ, áp suất và thể tích mol của một chất ở điểm tới hạn được gọi là nhiệt độ tới hạn (Tc), áp suất tới hạn (Pc) và thể tích mol tới hạn (Vc) tương ứng. Các tham số trên được gọi là hằng số tới hạn. Mỗi chất có một hằng số tới hạn nhất định (bảng 3.11).
Tỷ trọng Tỷ trọng của lưu chất siêu tới hạn sẽ thay đổi khi nhiệt độ và áp suất tương ứng của môi trường thay đổi. Trong mọi trường hợp, sự gia tăng nhiệt độ dẫn đến sự giảm tỷ trọng. Tỷ trọng của lưu chất biến đổi nhanh ở vùng nhiệt độ và áp suất gần điểm tới hạn. Tỷ trọng rút gọn (ρr = ρ/ρc) của hợp chất tinh khiết ở áp suất rút gọn (Pr = P/Pc) là 1,0 có thể thay đổi từ giá trị khoảng 0,1 (tỷ trọng giống chất khí) đến khoảng 2,0 (tỷ trọng giống chất lỏng) khi ta tiến hành hiệu chỉnh nhiệt độ rút gọn (Tr = T/Tc) trong dãy từ 0,9 – 1,2 (Hình 3.25, Bảng 3.12). Hình 3.25 – Sự biến thiên tỷ trọng rút gọn của một chất trong vùng lân cận tới hạn. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 57 Bảng 3.12 – So sánh đặc tính vật lý của chất lỏng, chất khí và chất lỏng siêu tới hạn. Khi tỷ trọng của lưu chất siêu tới hạn có giá trị tương đương với tỷ trọng của chất đó ở trạng thái lỏng thì chất lỏng siêu tới hạn hoạt động như dung môi lỏng. Tuy nhiên, khi nhiệt độ rút gọn tăng đến giá trị khoảng 1,6, chất lỏng siêu tới hạn trở nên giống chất khí do sự giãn nở tăng cùng với sự tăng nhiệt độ.
Hằng số điện môi. Tại áp suất cao, chất khí không còn tồn tại ở trạng thái khí lý tưởng do sự tăng cường liên kết vật lý giữa các ion, các lưỡng cực, các lưỡng cực tạm thời và nhiều cực ảnh hưởng tới các tương tác phân tử trong hệ. Năng lượng tương tác (Eq) giữa các điện tích q1, q2 được xác định bởi một hàm của hằng số điện môi (ε) và khoảng cách giữa các điện tích (r). r qqEq ..4 . 21 εpi = Hằng số điện môi tĩnh là một thông số hiệu quả để đánh giá đặc tính dung môi của chất lỏng có cực như ethanol, methanol và nước. Hằng số điện môi cũng là thông số phụ thuộc vào tỷ trọng và có thể thay đổi bằng cách hiệu chỉnh nhiệt độ và áp suất của hệ. Hằng số điện môi của chất lỏng siêu tới hạn là một thông số quan trọng để ước lượng sự tăng cường liên kết nội phân tử thông qua tương tác lưỡng cực – lưỡng cực. Ví dụ: ở nhiệt độ 40oC, giá trị hằng số điện môi của CO2 tăng khi áp suất tăng từ 70 – 200.105Pa và đạt trạng thái giống chất lỏng khi áp suất của hệ dao động quanh giá trị 200.105Pa. Như vậy, áp suất càng cao thì liên kết nội phân tử càng được củng cố, tính chất không phân cực của CO2 càng được tăng cường. Điều này giải thích nguyên nhân ở áp suất càng cao thì khả năng tan của các chất không phân cực và các hợp chất khó bay hơi trong dung môi CO2 càng tăng. Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp Đồ án môn học Công nghệ Thực phẩm 58 Hình 3.26 – Tỷ trọng và hằng số điện môi của CO2 theo áp suất ở 50oC.
Đặc tính chuyển động Độ nhớt Độ nhớt là mộ