Đề tài Nguyên liệu làm môi trường vi sinh vật

I. NGUYÊN LIỆU LÀM MÔI TRƯỜNG VI SINH VẬT: 1. Vi khuẩn lactic 1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacilliaceae. Vi khuẩn lactic có dạng hình cầu hoặc hình gậy, đứng riêng lẻ hoặc tạo chuỗi, thuộc vi khuẩn gram dƣơng (+). Vi khuẩn lactic không di động. Vi khuẩn lactic không tạo bào tử (tuy nhiên hiện nay ngƣời ta tìm thấy một số giống trong họ vi khuẩn lactic có khả năng tạo bào tử). Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn kị khí chịu dƣỡng. Vi khuẩn lactic không chứa cytochrom và enzyme ca talase. Vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh. Chúng phân giải H2O2 để tạo ra nƣớc và O2 để phát triển. 1.2. Sự phân bố: Ít gặp trong đất và nƣớc,thƣờng phát triển trong những môi trƣờng có chứa nhiều chất hữu cơ phức tạp nhƣ: - Trong sữa và các sản phẩm từ sữa thƣờng gặp Lactobacillus lactic, Lactobacillus bulgarius, Lactobacillus helviticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus ferment,Lactobacillus brevis, Streptococcus diacetyllactis. Để tồn tại trong môi trƣờng sữa vi khuẩn lactic tổng hợp ATP từ cơ chất lactose. - Trên bề mặt thực vật và xác thực vật đang bị phân giải hay có Lactobcillus plantanium, Lactobcillus delnikii, Lactobcillus ferment, Lactobacillus brevis, Streptococcus lactis...Chúng còn đƣợc tìm thấy trên các loại rau quả, trái cây. - Trong ruột và các niêm dịch ở ngƣời và động vật có Lactobacillus acidophilus, Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus salivanius, Streptococcus pyogenes, Bifidobacterrium, Pneumococcus. 1.3. Phân loại vi khuẩn lactic Dựa vào quá trình lên men đƣờng: có 2 loại - Vi khuẩn lactic đồng hình: Streptococus lactic, Streptococcus cremoris,… Vi khuẩn lên men lactic đồng hình sản sinh 85-95% acid lactic. Do thiếu porphyrin và cytochrom, không có chuỗi vận chuyển electron nên chúng thu năng lƣợng bằng con đƣờng lên men bắt buộc. Trong tế bào vi khuẩn có chứa enzymealdolase và triosophotphatizomerase. - Vi khuẩn lactic dị hình: Vi khuẩn lên men lactic dị hình sản sinh 50% ac id lactic, 25% cồn và 25% acid acetic. Nhóm vi khuẩn này gồm có các vi khuẩn sinh hƣơng Streptococcus votrovorus, Streptococcus paracotrovorus, Streptococcus diactylactis,...và Lactobacillus brevis,Lactobacillus fermenti,... Bảng 1 : Các chi vi khuẩn lactic, kiểu lên men và sản phẩm chính Chi và dƣới chi Kiểu lên men Sản phẩm chính (Tỷ lệ phân tử) Cấu hình của acid lactic Streptococcus Đồng hình lactat L (+) Pediococcus Đồng hình lactat DL và L (+) Lactobacillus Đồng hình lactat Thermobacterium Đồng hình lactat D (-),L (+), DL Streptobacterium Dị hình (tùy tiện) Lactat : axetat 1 : 1 D (-),L (+), DL Betabacterium Dị hình Lactat : axetat : CO2 1 : 1 : 1 DL Leuconostoc Dị hình Lactat : axetat : CO2 1 : 1 : 1 D (-) bifidobacterium Dị hình Lactat : axetat 2 : 3 L (+) Dựa vào hình thái: có 2 loại - Cầu khuẩn lactic: Streptococcus - Trực khuẩn lactic: Lactobacillus Dựa vào tính mẫn cảm với oxi: có 3 nhóm - Vi khuẩn lactic kỵ khí nghiêm ngặt - Vi khuẩn lactic yếm khí tùy tiện: Pediococcus cerevisiae - Vi khuẩn lactic vi hiếu khí (hiếu khí tùy tiện): Dựa vào nhiệt độ phát triển tối ƣu: có 2 nhóm - Vi khuẩn lactic ƣa ấm: 25-35 C Ví dụ: Streptococus lactic, Lactobacillus casei, L. plantarum,… - Vi khuẩn lactic ƣa nhiệt: 37-45 C Ví dụ: Streptococus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, L. helvetcus,… 2. SINH KHỐI VI KHUẨN LACTIC 2.1. Mục đích thu nhận sinh khối vi khuẩn lactic Trong thời gian trƣớc đây mỗi cơ sở sản xuất có phƣơng pháp và qui trình riêng để nhân giống và bảo quản giống dùng cho sản xuất. Khi cần sử dụng ngƣời ta sẽ tiến hành nhân giống qua nhiều giai đoạn theo nguyên tắc thu nhận một canh trƣờng vi sinh vật thuần khiết. Hiện nay một số nhà máy chế biến thực phẩm và những nhà máy sản xuất các sản phẩm trao đổi chất từ vi sinh vật vẫn đang sử dụng phƣơng pháp này nên giống vi sinh vật đƣợc xem là độc quyền sở hữu của mỗi nhà máy. Từ những năm 1980, trên thế giới phát triển mạnh một ngành công nghiệp mới, công nghiệp sản xuất và cung cấp giống vi sinh vật. Các chế phẩm giống thƣơng mại bao gồm đủ loại: vi khuẩn, nấm men, nấm sợi… Vi khuẩn lactic cũng không ngoại lệ, sinh khối vi khuẩn lactic đƣợc thu nhận, bảo quản và cung ứng cho ngành công nghiệp sản xuất các sản phẩm từ sữa. Chế phẩm giống thƣơng mại có thể cấy trực tiếp vào môi trƣờng lên men hoặc hoạt hoá chúng trên một môi trƣờng dinh dƣỡng trong một khoảng thời gian nhất định trƣớc khi cấy. 2.2. Các loài vi khuẩn lactic dùng trong công nghiệp sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic Quan trọng là sinh khối của vi khuẩn lactic lên men đồng hình. Streptococcus thermophilus Lactobacillus bulgaricus Streptococus lactic Streptococcus cremoris Lactobacillus acidophilus Nhóm vi khuẩn sinh hƣơng a/ Lactobacillus acidophilus Hình 1: Lactobacillus acidophilus  Thuộc trực khuẩn, có kích thƣớc : rộng 0.6-0.9 µm, dài 1.5-6 µm.  Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẻ, đôi khi chúng tạo thành những chuỗi ngắn, thuộc nhóm vi khuẩn gram dƣơng (+) và có khả năng chuyển động.  Chúng có khả năng lên men một loạt đƣờng nhƣ : glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose, saccharose để tạo acid lactic.  Chúng hoàn toàn không có khả năng lên men xylose, arabinose, rhamnose, glycerol, mannitol, sorbitol, dulcitol, inocitol.  Trong quá trình lên men chúng tạo ra cả hai dạng đồng phân quang học của acid lactic.  Nhiệt độ phát triển tối ƣu là 45 C, pH 4-5. b/ Lactobacillus bulgaricus Hình 2: Lactobacillus bulgaricus  Thuộc trực khuẩn có kích thƣớc rất dài, liên kết với nhau tạo thành chuỗi, gram (+).  Chúng không có khả năng di chuyển.  Có khả năng lên men đƣợc các loại đƣờng glucose, lactose, galactose.  Không lên men đƣợc xylose, arabinose, sorbose, dulcitol, mannitol, dextrin, inulin.  Chúng không có khả năng tạo initrit từ nitrate.  Nhiệt độ phát triển 40-50 C, pH thích hợp 5.5-6.0. c/ Streptococcus thermophilus Hình 3: Streptococcus thermophilus  Tế bào hình cầu hoặc hình trứng, đƣờng kính 0.7-0.9 µm, không chuyển động, thƣờng kết thành chuỗi ngắn, gram (+).  Phát triển tốt ở 40-45 C, pH 5.8-6.0. Không phát triển đƣợc ở 53 C và dƣới 20 C, sống đƣợc ở 65 C trong 30 phút.  Không phát triển đƣợc trong môi trƣờng sữa chứa 0.01% methylen blue, môi trƣờng máu chứa 10% mật.  Có khả năng lên men glucose, fructose,lactose, saccharose.  Nhạy cảm với các chất kháng sinh 0.01µg/ml tetracycline hay 0.1µg/ml chloremphen. d/ Streptococcus cremoris Hình 4: Streptococcus cremoris  Cầu khuẩn, trong thiên nhiên chúng tạo thành từng chuỗi rất dài, gram (+).  Nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển là 30 C.  Chúng không phát triển đƣợc ở nồng độ NaCl 4%.  Khi lên men đƣờng tạo ra acid acetic, CO2, diacetyl.  Chúng có khả năng tạo ra những chất kháng khuẩn e/ Streptococcus lactic Hình 5: Streptococcus lactic  Thuộc chuỗi cầu khuẩn, gram (+).  Nhiệt độ phát triển 10-45 C, tối thich ở 30-35 C.  Có khả năng chịu đƣợc nồng độ NaCl 4%.  Khi lên men đƣờng glucose, maltose, lactose, xylose, arabinose, saccharose, trehalose, mannitol, salicin tạo ra acid lactic, CO2, acid acetic, diacetyl. Chúng không có khả năng lên men đƣợc raffinose, insulin, glycerol, sorbitol 2.3. Giống vi sinh vật dùng cho sản xuất Giống vi sinh vật là một trong bốn yếu tố quyết định năng suất sản xuất sản xuất công nghiệp vi sinh vật. Cùng với chất lƣợng môi trƣờng, điều kiện lên men, các phƣơng pháp thu nhận và tinh chế sản phẩm,giống vi sinh vật là khâu đầu tiên can phải quan tâm đặc biệt. Giống vi khuẩn lactic dùng cho sản xuất phải đáp ứng các yêu cầu sau:  Giống có khả năng thích ứng nhanh, phát triển mạnh  Giống có khả năng sinh sản cao.  Giống có khả năng chống lại đƣợc đối với các điều kiện bất lợi.  Giống dễ dàng tách khỏi môi trƣờng nuôi cấy  Khả năng dễ bảo quản và bảo tồn đƣợc đặc tính di truyền trong suốt thời gian bảo quản và sử dụng.  Thời gian lên men ngắn, hiệu suất cao 3. MẬT RỈ: Mật rỉ là thứ liệu trong công nghệ sản xuất đƣờng từ cây mía hay củ cải đƣờng. Trƣớc đây mật rỉ ít đƣợc sử dụng trong công nghệ vi sinh. Sau này ngƣời ta thấy mậy rỉ có rất nhiều ƣu điểm để tạo môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật. Những đặc tính quan trọng phù hợp với qua trình lên men của mật rỉ bao gồm : - Chứa hàm lƣợng đƣờng cao. - Ngoài đƣờng saccharose còn chứa rất nhiều chất hƣu cơ, vô cơ, các chất thuộc vitamin và các chất kích thích sinh trƣởng - Tuy nhiên rỉ đƣờng cũng có những đặc điểm không phù hợp với quá trình lên men. Muốn sử dụng chúng cho quá trình lên men đòi hỏi phải có các quá trình sử lý thích hợp. Các đặc diểm cần lƣu ý ở mật rỉ bao gồm: Rỉ đƣờng có màu nâu sẫm. Màu này khó bị phá hủy trong quá trình lên men. Sau lên men chúng bám vào sinh khối vi sinh vật và bám vào sản phẩm. Việc tách màu ra khỏi sinh khối và sản phẩm thƣờng rất tốn kém và rất khó khăn. Hàm lƣợng đƣờng khá cao (thƣờng nằm trong khoảng 40-50%). Lƣợng này chủ yếu là saccharose nên khi tiến hành lên men phải pha loãng với nồng độ thích hợp. Đặc điểm gây khó khăn lớn nhất cho quá trình lên men là hệ keo trong mật rỉ. Keo càng nhiều, khả năng hòa tan oxy càng kém và khả năng trao đổi chất của vi sinh vật càng kém. Do đó công việc quan trọng của nhất khi sử dụng mật rỉ là phải phá hệ keo này. Vì rỉ đƣờng là chất dinh dƣỡng khá lý tƣởng nên chúng rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và phát triển. Nhƣ vậy chất lƣợng mật rỉ cũng dễ thay đổi theo thời gian bảo quản Thành phần hóa học: Thành phần rỉ đƣờng dao động nhƣ sau: - Nƣớc chiếm 15-20%, chất khô chiếm 80-85%. - Trong đó, có 60% là đƣờng ( 40% là đƣờng saccharose, 20% là fructose và glucose và 40% chất còn lại là chất phi đƣờng ) - Trong thành phần phi đƣờng có khoảng 30-32% hợp chát hữu cơ và 6-105 hợp chất vô cơ. Trong hợp chất vô cơ có : K2O: 3,5% Fe2O3: 0,2% MgO: 0,1% Sulfat: 1,6% CaO: 1,5% SiO2 : 0,5% P2O5: 0,2% Clorit: 0,4% - Trong những hợp chất hữu cơ gồm có các hợp chất chứ nitơ và không chứ nitơ ở dạng amin nhƣ: acid aspactic, acid glutamic, leuin, izoleuxin. Nito tổng số chiếm khoảng 0,3-0,5% ( ít hơn so với so với lƣợng nitơ có trong rỉ đƣờng củ cải) Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 7 Bảng 2: Thành phần các chất trong rỉ đường Các chất thành phần Hàm lượng % trong rỉ đường Saccharose 32 Chất hữu cơ phi đƣờng 10 Chất tro 8 Trong đó: K2O 3.5 CaO 1.5 MgO 0.1 SiO2 0.5 SO3 1.6 Cl2 0.4 Na2O + Fe2O3+ Al2O3 0.2 P2O5 0.2 N tổng 5-2.2 N-amin 0.2-0.5 Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 8 Bảng 3: Thành phần vitamin trong rỉ đường mía Các chất màu của rỉ đường mía bao gồm: - Caramel: xuất hiện nhờ quá trình nhiệt phân saccharose kèm theo loại trừ nƣớc và không chứa một chút nitơ nào. Khi pH không đổi, tốc độ tạo chất caramen tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. - Phức chất polyphenol-Fe2+: có màu vàng xanh, không b ị loại hết trong giai đoạn làm sạch và tồn tại trong mật rỉ - Melanodin: đây là sản phẩm ngƣng tụ của đƣờng khử và acid amin mà chủ yếu là acid aspartic. Sản phẩm ngƣng tụ quen biết nhất là acid fuscazinic đóng vai trò quan trọng làm tăng độ màu của rỉ đƣờng. - Melanin: đƣợc hình thành nhờ phản ứng oxy hóa khử các acidamin thơm nhờ xúc tác của enzym polyphenol oxydaza khi có mặt của oxy và Cu+2. - Các acid amin thơm thƣờng bị oxy hóa là tiroxin và brenzcatechin. Các melanin thƣờng bị loại hết ở giai đoạn làm sạch nƣớc đƣờng nên chỉ tìm thấy một lƣợng rất nhỏ trong rỉ đƣờng. - Chất keo: đƣợc hình thành bởi potein và pectin. Các chất này ảnh hƣởng rất nhiều đến sự phát triển của vi sinh vật tạo thành màng bao bọc quanh tế bào, ngăn cản Vitamin Hàm lượng (mg%) Thiamin 0.5 Riboflavin 0.12 Pyridoxin 0.9 Nicotinamit 1.5 Acid pantotenic 7.0 Acid foleic 0.02 Biotin 0.15 Inozit 500.0 Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 9 quá trình hấp thụ các chất dinh dƣỡng và thải các sản phẩm trao đổi chất của tế bào ra ngoài. Ngoài ra keo là nguyên nhân chính tạo ra một lƣợng bọt lớn trong môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật, giảm hiệu suất sử dụng thiết bị. Vi sinh vật trong rỉ đường mía. Có rất nhiều vi sinh vật trong rỉ đƣờng mía . Đa số chúng có từ nguyên liệu, một số nhỏ từ không khí, nƣớc, đất vào dịch đƣờng. Loại nào chịu đƣợc tác dụng nhiệt hay tác dụng của hoá chất thì tồn tại. Ngƣời ta chia rỉ đƣờng thành 3 loại tuỳ theo số lƣợng vi sinh vật tạp nhiễm. Bảng 4: Phân loại rỉ đường theo số lượng vi sinh vật tạp nhiễm. Loại rỉ đƣờng Số lƣợng VSV trong 1g đƣờng Đánh giá và xử lý I 100000 Rất tốt, không cần xử lý II 100000- 1000000 Trung binh, cần thanh trùng III 1000000- 5000000 Nhiễm nặng cần xử lý nghiêm ngặt Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 10 II. QUI TRÌNH THU NHẬN SINH KHỐI VI KHUẨN LACTIC Mật rỉ Xử lý Chuẩn bị Môi trƣờng Thanh trùng Nuôi cấy Sấy phun Ly tâm Đóng gói Nhân giống Giống VSV Sản phẩm Mật rỉ Xử lý Chuẩn bị Môi trƣờng Thanh trùng Nuôi cấy Sấy thăng hoa Ly tâm Đóng gói Nhân giống Giống VSV Sản phẩm Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 11 III. GIẢI THÍCH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ: 1. Xử lý mật rỉ: 1.1 Pha loãng sơ bộ: a. Mục đích: chuẩn bị cho quá trình acid hóa. b. Biến đổi: Hóa học: giảm nồng độ chất khô. Vật lý: giảm độ nhớt. Hoá lý: tăng độ hoà tan các chất. c. Thực hiện: Pha loãng với nƣớc theo tỉ lệ Vmật rỉ : Vnƣớc = 1 : 3 1.2 Xử lý dịch pha loãng: Truớc tiên, ta phải tẩy màu và tách các keo có trong mật rỉ 1.2.1. Acid hoá: a. Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men và tiêu diệt vi sinh vật b. Biến đổi: Hóa học: đƣờng saccharose chuyển thành glucose và fructose dƣới sự xúc tác của acid; pH giảm về 2.8-3.0 Hóa lý: hệ keo bị phá vỡ Vi sinh: vi sinh vật bị tiêu diệt do nhiệt độ cao và pH thấp. c. Thực hiện: Lƣợng acid sunfuric đậm đặc thêm vào là 5% khối lƣợng dung dịch. Trong giai đoạn này, ta đun dung dịch đến 90-95oC trong 6 giờ. Sau đó ta tiến hành ly tâm thu dịch trong. d. Thiết bị và thông số công nghệ: - Nồi phản ứng . Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 12 1- Ống nối để nạp chất tải nhiệt; 2- Ống chảy tràn sản phẩm; 3- Ống quá áp; 4- Đầu nối ống nạp nguyên liệu; 5- Cửa quan sát; 6- Cửa thoát chất tải nhiệt; 7- Cửa vào của chất tải nhiệt; 8- Cửa ra của sản phẩm; 9- Cửa thoát chất tải nhiệt Hình 6:Nồi phản ứng dạng đứng Nồi phản ứng bằng thép hay bằng gang tráng men dùng để tiến hành các quá trình hoá - lý khác nhau. Nồi phản ứng - máy trộn là một thiết bị dạng xilanh đứng có thể tích từ 0,1 ÷ 100 m 3 hoặc hơn, có áo hơi.Bên trong thiết bị có cơ cấu đảo trộn dạng tuabin hở. Khi sử dụng các thiết bị có áo hơi dạng bán ống thì áp suất làm việc cho phép đến 1,6 MPa, còn trong áo hàn phẳng không nhỏ hơn 0,4 MPa. Nƣớc máy hay nƣớc tuần hoàn, nƣớc muối, hơi nƣớc bảo hoà hay chất tải nhiệt hữu cơ có nhiệt độ cao có thể cho vào áo hay vào ruột xoắn. Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 13 Nồi phản ứng - máy trộn có thể tháo rời hay hàn cố định với các bộ phận đáy elip và nắp. Trên thiết bị có các khớp nối để nạp các chất tải nhiệt, chảy tràn sản phẩm, để nối ống quá áp, nối khớp đầu ống nguyên liệu, khảo sát chất liệu, các khớp nối để nạp và thải chất tải nhiệt và sản phẩm, van an toàn, nhiệt kế. Sau khi nạp vào thiết bị một lƣợng nƣớc nhất định.Tiến hành đun nóng môi trƣờng đến một nhiệt độ đã cho bằng phƣơng tiện điều chỉnh tự động. Tần số trộn của máy khuấy 0,2 ÷ 0,33 vòng/s, phụ thuộc vào dạng cơ cấu trộn và các tính chất của các cấu tử đem trộn. Khi thiết kế máy trộn dạng tuabin, số vòng quay 3 ÷ 3,3 vòng/s, dạng khung 0,33 ÷ 1 vòng /s. Dẫn động máy trộn đƣợc thực hiện nhờ động cơ điện qua hộp giảm tốc. 1.2.2. Ly tâm thu dịch trong: a. Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men b. Biến đổi: Hóa học: tạp chất bị loại bỏ, giữ lại chất hòa tan Hóa lý: tách pha rắn khỏi pha lỏng Vật lý: tăng độ trong, giảm khối lƣợng riêng dung dịch c. Thiết bị và thông số công nghệ: Hình 7:Thiết bị ly tâm lọc Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 14 Thiết bị ly tâm lọc hoạt động theo nguyên tắc: khi hệ thống quay với tốc độ cao tạo ra lực ly tâm mạnh và đẩy các thành phần pha lỏng và rắn ra sát thành thiết bị nhƣ hình vẽ, thành thiết bị có gắn vải lọc để các cấu tử chất hoà tan đi qua và giữ lại các thành phần pha rắn. 2. Chuẩn bị môi truờng: Khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy, ta phải chú ý những đặc điểm sau đây: Các nguyên vật liệu làm môi trƣờng nhất thiết phải cung cấp đầy đủ các thành phần dinh dƣỡng cho các quá trình trao đổi chất của tế bào vi sinh vật, đồng thời duy trì đƣợc thế oxy hóa–khử, áp suất thẩm thấu và tạo đƣợc sự ổn định của pH thích hợp của môi trƣờng. Thành phần nguyên vật liệu phải đƣợc cân đo chính xác và pha chế theo đúng trình tự hƣớng dẫn. 2.1.Nhu cầu dinh dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dƣỡng rất phức tạp, không một đại diện nào thuộc nhóm này có thể phát triển trên môi trƣờng đơn giản chỉ chứa glucose và NH4 + mà chúng đòi hỏi hàng loạt các vitamin nhƣ lactoflamin, thiamin, acid pantothenic, acid nicotinic, acid folic, biotin... và các acid amin. Vì thế ngƣời ta thƣờng nuôi cấy chúng trên một môi trƣờng phức tạp chứa một lƣợng tƣơng đối cao nấm men, cao thịt và nƣớc chiết cà chua. 2.1.1. Nhu cầu dinh dƣỡng cacbon: Vi khuẩn lactic có thể sử dụng đƣợc rất nhiều các loại carbonhydrate khác nhau từ glucose, fructose, maltose đến saccharose... Các nguồn cacbon này dùng để cung cấp năng lƣợng tham gia vào hầu hết các cấu trúc của tế bào. Vì vậy đây là nguồn thức ăn cacbon có ý nghĩa quan trọng nhất đối với sự sống của tế bào vi sinh vật. Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả các acid amin nhƣ acid glutamic, arginine hay tyrozyne làm nguồn cung cấp năng lƣợng. Khi đó diễn ra quá trình decacboxyl và tạo CO2. Nguồn cacbon tốt nhất là các loại đƣờng có tính khử ở liều lƣợng nhỏ. Nếu khi nhân giống ngƣời ta dùng một loại đƣờng thông thƣờng hiếm khi đƣợc dùng làm nguồn cacbon thì khi đƣa vào sản xuất vi khuẩn có thể phát triển hiệu quả trên chứa loại đƣờng này mà không làm ảnh hƣởng đến khả năng lên men đối với các nguồn cacbon thông thƣờng. 2.1.2. Nhu cầu dinh dƣỡng nitơ: Nguồn nittơ dễ hấp thụ đối với vi sinh vật là NH3,NH4 +.Sau khi đồng hóa gốc NH4 + trong môi trƣờng sẽ tích lũy các anion vô cơ (SO4 2-,HPO4 2-,Cl-…) làm hạ thấp rất nhiều trị số pH của môi trƣờng,ta phải điều chỉnh pH của môi trƣờng nuôi cấy. Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 15 Đa số vi khuẩn không có khả năng sinh tổng hợp chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ từ nguồn dinh dƣỡng vô cơ. Vì vậy, để đảm bảo cho sự phát triển của mình, vi khuẩn lactic phải dùng nguồn nitơ có sẵn trong môi trƣờng dƣới dạng các acid amin. Tuy nhiên để vi khuẩn phát triển bình thƣờng thì ngoài nguồn nitơ của acid amin thì vi khuẩn lactic còn cần những chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ nhƣ cao thịt, cao nấm men, peptone, cazein... 2.1.3. Nhu cầu về vitamin: Vi khuẩn lactic rất cần vitamin cho sự phát triển của mình và các vitamin này đóng vai trò là coenzyme trong quá trình trao đổi chất của chúng. Rất ít vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp vitamin, phần lớn chúng cần nhiều loại vitamin nhƣ riboflavin, thiamin, acid pantothenic, nicotinic, biotin.. Nhu cầu vitamin chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố nhƣ nhiệt độ nuôi cấy, pH, nồng độ CO2 ban đầu, thế oxy hoá khử và thành phần của môi trƣờng. Bảng 5: Vitamin và các chất sinh truởng cần thiết cho sự sinh truởng của các vi khuẩn lactic Chất Vi sinh vật điển hình Acid p-aminobenzoic Lactobacillus plantarum Acid folic Lactobacillus arabinosus Lactobacillus casei Streptococcus faecalis Acid 5-focmyl-5,6,7,8-tetrahidrofolic Leuconostos citrovorum Streptococcus faecalis Locovorin Lactobacillus casei Acid nicotinic Lactobacillus arabinosus Leuconostoc menssenteroides Streptococcus faecalis Riboflavin Lactobacillus casei Streptococcus lactic Acid pantothenic Lactobacillus casei Leuconostoc menssenteroides Streptococcus faecalis Panteterin.pantetin Lactobacillus acidophyllus Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus casei Acid lipoic Streptococcus lactic Streptococcus faecalis Lactobacillus fermenti Thiamin Streptococcus lactic Lactobacillus plantarum Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 16 Biotin Leuconostoc menssenteroides Streptococcus faecalis Lactobacillus arabinosus Bioxitin Lactobacillus casei 2.1.4. Nhu cầu về các muối khoáng: Để đảm bảo cho sự sinh trƣởng phát triển, vi khuẩn lactic cần rất nhiều hợp chất vô cơ nhƣ P, S, Mg, Ca, Zn, Mn, Fe, Na, Cl. Đối với lactobacillus thì Mn2+, Mg2+, Fe2+ có tác động tích cực lên sự phát triển và sinh ra acid lactic. - Các nguyên tố đa lƣợng: là những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi hỏi phỉa cung cấp với liều lƣợng lớn - Các nguyên tố vi lƣợng: là những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi hỏi phải đƣợc cung cấp với liều lƣợng rất nhỏ. - Các nguyên tố khoáng: + P : chiếm tỉ lệ cao nhất trong các nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật, có mặt trong cấu tạo của nhiều thành phần quan trọng của tế bào ( acid nucleic, phophoprotein, photpholipid…) + S : là khoáng quan trọng trong tế bào vi sinh vật trong một số acid amin (xixtrin,xixtein, metioin), một số vitamin (biotin, tiamin…) + Mg : nguyên tố vi sinh vật đòi hỏi với lƣợng khá cao, tham gia vào nhiều phản ứng enzyme có liên quan đến quá trình photphoryl hóa. + Ca : có vai trò quan trọng đáng kể trong việc xây doing cấu trúc tinh vi của tế bào,vai trò cầu nối trung gian giữa các thành phần quan trọng của tế bào sống. + Zn : tham gia vào nhiều quá trình enzyme, có tác dụng đáng kể trong việc hoạt hóa các enzyme. + Mn : chứa trong một số enzyme hô hấp, có vai trò trong việc hoạt hóa một số enzyme. Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 17 Bảng 6: Thành phần môi trường nuôi cấy Casein peptone, tryptic digest 10.00 g/l Cao thịt (Meat extract) 10.00 g/l Cao nấm men (Yeast extract) 5.00 g/l Glucose 20.00 g/l Tween 80 1.00 g/l K2HPO4 2.00 g/l CH3CO2Na (Acetat Natrium) 5.00 g/l (NH4)2 citrate (Citrat ammonium) 2.00 g/l MgSO4 x 7 H2O 0.20 g/l MnSO4 x H2O 0.05 g/l Điều chỉnh sao cho pH khoảng 6.2 - 6.5.  Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến sự sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn lactic Sự sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn lactic chịu tác động của các yếu tố môi trƣờng nhƣ: Nhiệt độ: -Hoạt động trao đổi chất là kết quả của các phản ứng hóa học. Vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ nên yếu tố ảnh hƣởng sâu sắc đến các quá trình sống của tế bào -Các tế bào sinh dƣỡng của vi khuẩn lactic bị chết ở nhiệt độ cao, protein bị biến tính -Nhiệt độ thấp có thể làm bất hoạt quá trình vận chuyển các chất hòa tan qua màng tế bào chất do thay đổi hình không gian của một số permeaza chứa trong màng hoặc ảnh hƣởng đến việc hình thành và tiêu thụ ATP cần cho quá trình vận chuyển chủ động các chất dinh dƣỡng. - Mỗi loài vi sinh vật có khoảng nhiệt độ tối thích khác nhau. Vi khuẩn lactic có thể phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ từ 15 - 50 C và đƣợc phân thành hai nhóm: Nhóm ƣa ấm (mesophilic): phát triển ở nhiệt độ trung bình,nhiệt độ phát triển tối ƣu là :25-35 C Nhóm ƣa nhiệt (thermophilic): thƣờng phát triển ở nhiệt độ tƣơng đối cao 37-45 C pH: có ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh trƣởng và phát triển của các vi khuẩn lactic. pH tối ƣu cho sự sinh phát triển của chúng nằm trong khoảng 5.5-6.5. Quá trình lên men bị ức chế mạnh tại pH dƣới 4.5. Oxy: vi khuẩn lactic thuộc loại vi hiếu khí , hàm lƣợng oxy nhiều sẽ là một chất độc đối với vi khuẩn lactic. Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 18 Độ ẩm: nƣớc là môi trƣờng cho các phản ứng trong tế bào do đó độ ẩm là một yếu tố quan trọng cho sự phát triển của vi khuẩn lactic. Áp suất thẩm thấu: màng tế bào chất của vi khuẩn là màng bán thấm. Khi nồng độ muối trong môi trƣờng nuôi cấy cao (trên 2%) sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn lactic. 3. Thanh trùng môi trƣờng Môi trƣờng sau khi đƣợc pha chế sẽ qua thanh trùng nhiệt để tiêu diệt, ức chế vi sinh vật và hoạt tính enzyme trong môi trƣờng, tạo điều kiện cho giống phát triển. Theo lý thuyết, nếu nhiệt độ thanh trùng càng cao với thời gian càng dài thì mức độ tiêu diệt và vô hoạt enzyme càng cao, tuy nhiên giá trị dinh dƣỡng của môi trƣờng sẽ bị giảm: o Vitamin bị phân huỷ. o Một phần đƣờng khử và acid amin tham gia phản ứng Maillard làm giảm hàm lƣợng cơ chất cacbon và nguồn nitơ của môi trƣờng Trong thực tế, tuỳ thuộc vào giống VSV, thành phần hoá học của môi trƣờng và mức độ nhiễm VSV trong các nguyên liệu pha chế môi trƣờng mà các nhà sản xuất sẽ đề xuất chế độ thanh trùng với giá trị nhiệt độ và thời gian thích hợp, thƣờng áp dụng chế độ thanh trùng dao động trong khoảng 80 - 90 C trong 30 - 60 phút.  Phƣơng pháp thực hiện: thiết bị ống lồng ống  Thông số công nghệ nhiệt độ 85-900 C a. Cấu hình nhiều kênh ; b. Cấu hình nhiều ống Hình 8 : Thiết bị trao đổi nhiệt dạng ống Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 19 4) Nhân giống a. Yêu cầu Số lƣợng tế bào trong môi trƣờng nuôi lên giá trị cao nhất, trong khoảng thời gian ngắn nhất, với những chi phí thấp nhất về nguyên liệu và năng lƣợng. Sinh khối thu đƣợc phải có hoạt tính lên men cao, tỷ lệ tế bào chết càng thấp càng tốt. Trong quá trình nhân giống cần đảm bảo cho giống đƣợc thuần khiết, điều này rất quan trọng vì nếu giống có lẫn các vi sinh vật lạ thì trong quá trình lên men sẽ gây hƣ hỏng và làm sản phẩm không đạt yêu cầu và đôi khi còn có hại cho ngƣời tiêu thụ. b. Cơ sở khoa học của quá trình nhân giống Chọn môi trƣờng với thành phần cơ chất thích hợp để nuôi vi sinh vật. Chọn phƣơng pháp và các điều kiện nuôi tối ƣu (pH, nhiệt độ, sự cung cấp oxi,...) cho quá trình tăng sinh khối của giống. Mục đích: tăng số lƣợng VSV c. Tiến hành nhân giống Để cấy giống, một lƣợng canh trƣờng vi khuẩn xác định đƣợc cho vào môi trƣờng dinh dƣỡng đã đƣợc xử lý nhiệt sau khi điều chỉnh đến nhiệt độ thích hợp. Để ngăn chặn những bất thƣờng trong canh trƣờng, điều quan trọng nhất là lƣợng giống cấy, nhiệt độ nuôi cấy và thời gian nuôi cấy phải đƣợc giữ không đổi trong suốt tất cả các giai đoạn.  Trong PTN: Giống đƣợc nhân trong các bình cầu. khi nhiệt độ khỏang 37 – 40 oC, cho canh trƣờng lỏng vào, tỷ lệ 5% thể tích. Giữ ở 40 – 45oC, sau 8 -10h, giống đạt yêu cầu. có thể dùng nhân giống tiếp tục ở các thể tích lớn hơn. Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 20 SƠ ĐỒ TỔNG QUÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG VI SINH VẬT CHO SẢN XUẤT Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 21  Trong phân xưởng Vi khuẩn lactic đã đƣợc nuôi cấy riêng ở phân xƣởng nhân giống. Khi lƣợng giống đảm bảo về số lƣợng tế bào( khoảng x*106 tế bào/1ml), tiến hành lên men. 5. Nuôi cấy: Ngƣời ta chuyển giống vào thùng lên men với tỷ lệ giống là 2.5- 3%. Trong sản xuất lactic, ngƣời ta thƣờng sử dụng các loại vi khuẩn lactic đồng hình , trong đó vi khuẩn lactic lactobacillus đƣợc sử dụng nhiều hơn cả. - Đối với vi khuẩn này ,ngƣời ta thƣờng duy trì nhiệt độ trong suốt quá trình lên men là 400C , pH duy trì ở 5-6, thời gian lên men 1-8 ngày, tuy nhiên,những điều kiện lên men trên có thể thay đổi tuỳ theo giống vi khuẩn lactic mà ta sử dụng để sản xuất. - Trong quá trình lên men ngƣời ta tiến hành khuấy trộn liên tục môi trƣờng. Nhiều trƣờng hợp, ngƣời ta tiến hành thổi khí, khi thổi khí lƣợng acid lactic tạo ra cao hơn nhiều so với không thổi khí. a. Phƣơng pháp thực hiện: Dùng thiết bị lên men bề sâu, gián đoạn: Thiết bị lên men có thể tích 63 m 3 : Dạng thiết bị lên men này là một xilanh đứng đƣợc chế tạo bằng thép X18H10T hay kim loại kép có nắp và đáy hình nón. Tỷ lệ chiều cao và đƣờng kính bằng 2,6 : 1. Trên nắp có bộ dẫn động cho cơ cấu chuyển đảo và cho khử bọt bằng cơ học; ống nối để nạp môi trƣờng dinh dƣỡng, vật liệu cấy, chất khử bọt, nạp và thải không khí; c ác cửa quan sát; cửa để đƣa vòi rửa; van bảo hiểm và các khớp nối để cắm các dụng cụ kiểm tra. Khớp xả 16 ở đáy của thiết bị dùng để tháo canh trƣờng. Bên trong có trục 6 xuyên suốt. Các cơ cấu chuyển đảo đƣợc gắn chặt trên trục. Cơ cấu chuyển đảo gồm có các tuabin 8 có đƣờng kính 600 ÷1000 mm với các cánh rộng 150 ÷ 200 mm đƣợc định vị ở 2 tầng, còn tuabin hở thứ ba đƣợc gắn chặt trên bộ sủi bọt 13 để phân tán các bọt không khí. Bộ sủi bọt có dạng hình thoi đƣợc làm bằng những ống đột lỗ. Ở phần trên của bộ sủi bọt có khoảng 2000 ÷ 3000 lỗ theo kiểu bàn cờ. Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 22 1- Động cơ; 2- Hộp giảm tốc; 3- Khớp nối; 4- Ổ bi; 5- Vòng bít kín; 6- Trục;7- Thành thiết bị ; 8- Máy khuấy trộn tuabin; 9- Bộ trao đổi nhiệt kiểu ống xoắn; 10- Khớp nối; 11- Ống nạp không khí; 12- Máy trộn kiểu cánh quạt; 13- Bộ sủi bọt; 14- Máy khuấy dạng vít; 15- Ổ đỡ; 16- Khớp để tháo; 17- Ao; 18- Khớp nạp liệu; 19- Khớp nạp không khí Hình 9 : Thiết bị lên men với bộ đảo trộn cơ học dạng sủi bọt có sức chứa 63 m 3 Động cơ - bộ truyền động làm quay trục 6 và các cơ cấu đảo trộn 8, 12, 14. Sử dụng bộ giảm tốc và bộ dẫn động có dòng điện không đổi để điều chỉnh vô cấp số vòng quay trong giới hạn 110 ÷ 200 vòng/ phút. Thiết bị lên men đƣợc trang bị áo 17, gồm từ 6 ÷ 8 ô. Mỗi ô có 8 rãnh đƣợc chế tạo bằng thép góc có kích thƣớc 120×60 mm. Diện tích làm việc của áo 60 m2. Bề mặt làm việc bên trong 45 m 2 gồm ống xoắn 9 có đƣờng kính 600 mm với số vít 23 khi tổng chiều cao của ruột xoắn 2,4 m. Thiết bị lên men đƣợc tính toán để hoạt động dƣới áp suất dƣ 0,25 MPa và để thanh trùng ở nhiệt độ 90-950C, cũng nhƣ để hoạt động dƣới chân không. Trong Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 23 quá trình nuôi cấy vi sinh vật, áp suất bên trong thiết bị 50 kPa; tiêu hao không khí tiệt trùng đến 1 (m3/phút). Chiều cao cột chất lỏng trong thiết bị 5 ÷ 6 m khi chiều cao của thiết bị hơn 8 m. Để tiện lợi cho việc thao tác và tránh những sai lầm cần dán vào thiết bị sơ đồ chỉ dẫn thao tác . Để đảm bảo tiệt trùng trong suốt quá trình (giữ đƣợc hơi), các trục của cơ cấu chuyển đảo phải có vòng bít kín. Các vòng bít kín đƣợc tính toán để hoạt động ở áp suất 0,28 MPa và áp suất dƣ không nhỏ hơn 2,7 kPa, nhiệt độ 30 ÷ 250 0 C và số vòng quay của trục đến 500 vòng/ phút. Nhờ các vòng đệm này mà ngăn ngừa đƣợc sự rò rỉ môi trƣờng hay sự xâm nhập không khí vào khoang thiết bị ở vị trí nhô ra của trục. Vòng bít kín khi tiếp xúc với môi trƣờng làm việc đƣợc chế tạo bằng thép X18H10T và X17H13M2T, cũng nhƣ bằng titan BT-10. Thời gian hoạt động ổn định của các vòng này không nhỏ hơn 2000 h khi tuổi thọ 8000 h. Độ đảo hƣớng kính cho phép của trục trong vùng đệm kín không lớn hơn 0,25 mm, độ đảo chiều trục của trục không lớn hơn 0,250. Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 24 1- Hơi vào; 2- Không khí tiệt trùng vào; 3- Không khí tiệt trùng hay hơi vào vùng bít kín; 4- Thoát hơi hay không khí tiệt trùng tới bộ sủi bọt; 5- Hơi hay không khí tiệt trùng vào thiết bị ở phần trên; 6- Thải hơi hay không khí tiệt trùng tới bộ lấy mẫu thử nghiệm; 7- Thải hơi hay không khí tiệt trùng; 8- Cơ cấu ống nhánh có van điều chỉnh bằng khí động học; 9- Nạp hơi hay không khí tiệt trùng vào thiết bị ở phần dưới; 10- Tháo nước ngưng; 11- Ap kế; 12- Van; 13- Ống tháo; 14- Van khoá; 15- Van lấy mẫu; 16- Nạp hơi hay không khí tiệt trùng khi lấy mẫu; 17- Đoạn ống để nối áp kế kiểm tra; 18, 25- Các áp kế; 19- Van để nạp vật liệu cấy; 20- Nạp canh trường; 21, 23- Nạp dung dịch chuẩn; 22- Thải hơi hay không khí từ vùng bít kín; 24- Ống nhánh để nạp dung dịch chuẩn; 26- Cung cấp khí thải từ thiết bị; 27- Cung cấp nước; 28- Van rót; 29- Van để rót nước từ áo; 30- Van để nạp nước lạnh; 31- Ống nhánh để nạp nước lạnh; 32- Lược; 33- Ap kế; 34- Van an toàn; 35- Cảm biến nhiệt độ; 36, 37- Các dụng cụ thứ cấp để đo nhiệt độ và độ pH; 38- Cảm biến pH met; 39- Thiết bị lên men; 40- Cơ cấu để làm sạch không khí Hình10 . Sơ đồ chỉ dẫn thao tác của thiết bị lên men  Thông số công nghệ - pH 4.5 - nhiệt độ 30-32oC Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 25 b. Caùc bieán ñoåi xaûy ra trong quaù trình nuoâi caáy  Caùc bieán ñoåi sinh hoïc Giai ñoaïn thích nghi (pha lag):  Vi khuaån chöa coù söï phaân chia nhöng coù söï taêng roõ reä t veà theå tích vaø khoái löôïng teá baøo do quaù trình toång hôïp caùc chaát, tröôùc heát laø caùc chaát cao phaân töû (protein, enzyme, acid nucleic…) dieãn ra maïnh meõ.  Hình thaønh caùc enzyme caàn thieát cho quaù trình toång hôïp cô chaát vaø caùc enzyme naèm trong quaù trình chuyeån hoaù glucide. Giai ñoaïn taêng tröôûng (pha log):  Vi khuaån sinh tröôûng vaø phaùt trieån theo caáp luyõ thöøa, nghóa laø sinh khoái vaø soá löôïng teá baøo taêng raát nhanh.  ÔÛ giai ñoaïn naøy xaûy ra haøng loaït caùc bieán ñoåi quan troïng ñeå taïo sinh khoái teá baøo: söï toång hôïp enzyme tieáp tuïc ñöôïc xuùc tieán, söï chuyeån hoaù caùc hôïp chaát cacbonhydate, söï chuyeån hoaù caùc hôïp chaát chöùa Nitô… Giai ñoaïn oån ñònh:  Quaàn theå vi khuaån ôû traïng thaùi caân baèng ñoäng hoïc, soá teá baøo môùi sinh ra baèng soá teá baøo cuõ cheát ñi, do ñoù soá löôïng teá baøo khoâng thay ñoåi.  Toác ñoä sinh tröôûng phuï thuoäc vaøo noàng ñoä cô chaát.Cho neân khi giaûm noàng ñoä cô chaát thì toác ñoä sinh tröôûng cuûa vi sinh vaät giaûm.Do ñoù vieäc chuyeån töø pha log sang pha oån ñònh dieãn ra daàn daàn.  Nguyeân nhaân toàn taïi cuûïa pha oån ñònh laø do sö tích luõy caùc saûn phaåm ñoäc haïi cuûa trao ñoåi chaát vaø vieäc caïn caùc chaát dinh döôõng.ï Hình 11 : Söï bieán ñoåi cuûa sinh khoái theo thôøi gian trong phöông phaùp nuoâi caáy tónh Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 26 Hình 12 : Söï bieán ñoåi cuûa haèng soá toác ñoä sinh tröôûng vsv theo thôøi gian trong phöông phaùp nuoâi caáy tónh  Caùc bieán ñoåi vaät lyù  Do söï trao ñoåi chaát dieãn ra lieân tuïc neân coù söï taêng nhieät ñoä cuûa canh tröôøng nuoâi caáy.  pH cuûa canh tröôøng cuõng thay ñoåi do coù söï xuaát hieän cuûa caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát.  Caùc bieán ñoåi hoaù sinh Caùc bieán ñoåi hoaù sinh chuû yeáu laø xaûy ra beân trong cuøng vôùi söï trao ñoåi chaát cuûa teá baøo vi khuaån lactic.  Caùc vi khuaån lactic ñoàng hình phaân giaûi glucose theo con ñöôøng EMP do chuùng chöùa caùc enzyme caàn thieát cho quaù trình naøy, keå caû enzyme aldolaza.  Caùc vi khuaån lactic dò hình do thieáu caùc enzyme aldolaza vaø trioxophotphatizomeraza neân giai ñoaïn ñaàu cuûa söï phaân giaûi glucose xaûy ra theo con ñöôøng PP. Muïc ñích cuûa caùc quaù trình naøy laø toång hôïp vaät chaát teá baøo vaø naêng löôïng cho vi khuaån lactic sinh tröôûng. 6. Ly tâm Sinh khối vi sinh vật nên thu nhận vào đầu giai đoạn pha ổn định. Canh trƣờng sau khi nhân giống đƣợc lọc và đƣa vào thiết bị ly tâm tách thu sinh khối. Thiết bị ly tâm có hai dòng thoát: hỗn hợp canh trƣờng đƣợc nạp vào theo ống dẫn bên dƣới thiết bị. Thông qua hệ thống kênh dẫn đƣợc tạo thành từ các lỗ trên dĩa ly tâm, dòng giàu VSV (có khối lƣợng riêng lớn hơn) sẽ chuyển động về phía bên ngoài Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 27 thùng quay và theo cửa bên hông thùng để thoát ra ngoài. Dòng chứa ít tế bào vi sinh vật do khối lƣợng riêng thấp hơn sẽ chuyển động về phía trục quay rồi thoát ra khỏi thiết bị theo cửa trên đỉnh thùng Hình 13 : Thiết bị ly tâm tách vi sinh vật 7. Sấy - Mục đích: thu chế phẩm VSV dạng hạt - Phƣơng pháp thực hiện: sấy thăng hoa Sấy thăng hoa là quá trình tách ẩm từ các sản phẩm bằng phƣơng pháp lạnh đông và tiếp theo là chuyển đá làm lạnh đông đƣợc tạo thành trong sản phẩm thành hơi, qua pha loãng ngắn ngủi khi đun nóng sản phẩm trong chân không. Khi sấy thăng hoa, ẩm chuyển dời trong sản phẩm ở dạng hơi không kéo theo nó những chất trích ly và những vi sinh vật. Trong sản xuất vi sinh, sấy thăng hoa đƣợc ứng dụng cho các vi sinh vật, nấm men, vitamin, kháng sinh, các enzim không bền ở nhiệt độ cao. Thƣờng quá trình sấy thăng hoa đƣợc bắt đầu từ lúc làm lạnh đông bề mặt sản phẩm đến nhiệt độ − 20 o C, − 30 o C. Tốc độ làm lạnh đông các vật liệu không bền nhiệt ảnh hƣởng tới việc bảo quản hoạt động sống của vi sinh vật và độ hoạt hoá của các chế phẩm sinh học, vì khi làm lạnh nhanh các sản phẩm tạo nên đá ở bên trong tế bào, xảy ra biến đổi nhanh chóng thành phần các dung dịch sinh lý bên trong và bên ngoài tế bào và dẫn tới sự phá huỷ và làm chết tế bào. Tất cả các vật liệu sinh học đem sấy thăng hoa có độ ẩm khác nhau, cho nên chúng có những điểm ba Ơtecti khác nhau, khi đó có thể có sự cân bằng đá, pha lỏng và pha hơi. Cho nên đối với các vật liệu vi sinh , tốc độ lạnh đông của chúng đƣợc xác định bằng thực nghiệm. Quá trình thăng hoa xảy ra ở những giá trị áp suất hơi trên bề mặt vật liệu và giá trị nhiệt độ trong các điểm nằm ở dƣới điểm ba cân bằng pha của dung môi (nƣớc). Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 28 Thƣờng khi sấy thăng hoa các vật liệu vi sinh, áp suất dƣ = 133,3 ÷ 13,3 Pa, và nhiệt độ của vật liệu bắt đầu sấy bằng − 20 o C, − 30 o C. Khi độ ẩm của sản phẩm bị giảm xuống tối thiểu, nhiệt độ của vật liệu tăng đến 30 o C, 40 o C. Điều kiện sấy nhƣ thế bảo đảm quá trình oxy hoá tối thiểu của sản phẩm do hàm lƣợng oxy không đáng kể trong môi trƣờng khí của phòng sấy. Trong các máy sấy thăng hoa dạng công nghiệp, việc nạp nhiệt tới sản phẩm hoặc bằng độ dẫn nhiệt hoặc nhờ các tia hồng ngoại. Hình 14:Thiết bị sấy thăng hoa tác động tuần hoàn Các máy sấy thăng hoa có sự tác động tuần hoàn hay liên tục. trên chỉ sơ đồ nguyên tắc sấy thăng hoa tác động tuần hoàn.Thiết bị này gồm phòng sấy hình trụ kín (nồi thăng hoa) 1, ở trong có giàn ống rỗng 2, vật liệu sấy cho vào đây. Nồi thăng hoa làm việc một cách tuần hoàn nhƣ một phòng lạnh. Ở chế độ làm lạnh, bơm 5 đẩy tác nhân lạnh ở bên trong ống rỗng 2. Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 29 Sự làm lạnh của chất tải nhiệt đƣợc tiến hành trong bộ trao đổi nhiệt 3 có đính ruột xoắn, chất làm nguội đi qua đó và vào thiết bị làm lạnh 4. Khi nồi thăng hoa làm việc ở chế độ của máy sấy, chất tải nhiệt đƣợc đun nóng trong bộ trao đổi nhiệt 7 và đẩy vào các ống rỗng nhờ bơm 6. Sự ngƣng tụ hơi đƣợc tạo ra khi sấy trong nồi thăng hoa đƣợc tiến hành trong nồi ngƣng tụ chống thăng hoa 10. Nó là một bộ trao đổi nhiệt, hỗn hợp hơi - không khí từ nồi thăng hoa vào không gian giữa các ống của bộ trao đổi nhiệt. Chất làm nguội (amoniac, freon) qua các ống 11 của nồi chống thăng hoa vào thiết bị làm lạnh 9. Thƣờng để làm lạnh bề mặt thăng hoa và ngƣng tụ, ngƣời ta sử dụng máy nén 2 hoặc 3 cấp có khả năng đảm bảo lạnh bề mặt đến nhiệt độ − 60 o C, − 40 o C. Các khí chƣa ngƣng tụ đƣợc tách ra khỏi nồi chống thăng hoa bằng bơm chân không 8. Hơi ngƣng tụ đƣợc làm lạnh ở dạng lớp đá trên bề mặt các ống lạnh của nồi chống thăng hoa. Vì trong quá trình làm việc của nồi chống thăng hoa, các ống 11 bị phủ bởi một lớp đá đáng kể, nên cần làm tan băng một cách chu kỳ. Để thực hiện điều đó, đẩy nƣớc nóng từ bộ đun 7 vào các ống 11. Hiện nay ngƣời ta bắt đầu sử dụng phổ biến các thiết bị thăng hoa tác động liên tục. Sấy thăng hoa liên tục gồm hai nồi thăng hoa và hai bộ chống thăng hoa, chúng làm việc luân phiên nhau. Năng suất của thiết bị thăng hoa tác động liên tục tính theo độ ẩm bốc hơi lớn hơn 200 kg/h. Thời gian có mặt của sản phẩm trong máy sấy từ 40 đến 110 phút, nhiệt độ cao nhất của sản phẩm cuối quá trình sấy nhỏ hơn 27 o C.  Thông số công nghệ - độ ẩm 5-12% - nhiệt độ chất tải nhiệt 130oC - nhiệt độ sản phẩm sấy ≤ 50oC 8. Đóng gói Sau quá trình nhân giống, ta nên sử dụng ngay sinh khối VSV để cấy giống cho các quá trình lên men công nghiệp. Những nhà sản xuất có thể bảo quản giống đã nhân trong một thời gian ngắn ở nhiệt độ 4 – 6 oC, trong điều kiện vô trùng. Tùy thuộc chủng vsv sử dụng và hoạt tính sinh lý của chúng mà thời gian bảo quản theo phƣơng pháp này có thể kéo dài từ vài giờ đến vài ngày. Nếu thời gian bảo quản kéo dài, giống sẽ giảm dần hoạt tính và số tế bào chết sẽ gia tăng. Nếu muốn kéo dài thời gian bảo quản giống sản xuất đến hàng tháng hoặc lâu hơn, ta nên tiến hành xử lý ngay canh trƣờng thu đƣợc sau quá trình nhân giống. Phƣơng pháp thông dụng cho các canh trƣờng lỏng là ly tâm lạnh để tách sinh khối, kế tiếp sử dụng phƣơng pháp sấy thăng hoa để tách ẩm rồi đem nghiền và rây để thu chế phẩm vsv dạng hạt. Giống vsv đông khô nếu đƣợc bảo quản ở 4 0C có thể bảo tồn đƣợc hoạt tính ban đầu trong thời gian 1 năm. Qua sấy lạnh, sau đó mới đóng gói, bảo quản ta đƣợc sản phẩm dạng hạt  Mục đích : bảo quản sản phẩm  Phƣơng pháp thực hiện Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 30 Hình 15 : Phƣơng pháp đóng gói  Thông sô công nghệ - Rót điều kiện vô trùng - Nhiệt độ 4oC bảo quản đƣợc 1 năm IV. SẢN PHẨM SINH KHỐI VI KHUẨN LACTIC Chế phẩm dạng hạt Các công nghệ mới áp dụng trong sấy thăng hoa làm cho canh trƣờng này có thể bổ sung trực tiếp vào sữa nhƣ phƣơng pháp trên. Sau khi làm lạnh, canh trƣờng cô đặc đƣợc đặt dƣới một áp suất chân không cao để tách nƣớc bằng sự thăng hoa. Luôn luôn có khoảng 60 – 70% tế bào sống sót. Tế bào sau khi sấy dƣợc đóng gói dƣới điều kiện vô trùng, tốt nhất là không có mặt oxi. Sự có mặt của oxi sẽ nhanh chóng làm hỏng sản phẩm.  Chỉ tiêu chất lƣợng: - Tỷ lệ tế bào sống sót : 60 – 70% - Độ ẩm : 5 – 12% - Kích thƣớc hạt : tùy thuộc nhà sản xuất, nhƣng nhỏ thì tốt, khoảng 1 – 2 mm. - màu sắc hạt: vàng nhạt. - Không có Oxy, vì sự có mặt của Oxy sẽ nhanh chóng làm hỏng sản phẩm. Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 31 Hình 16 : sinh khối sấy thăng hoa V. ỨNG DỤNG CỦA SINH KHỐI VI KHUẨN LACTIC Sinh khối vi khuẩn lactic đƣợc dùng cung cấp cho các nhà sản xuất các sản phẩm có liên quan đến quá trình lên men lactic. Khi mua chế phẩm sinh khối về, các nhà sản xuất chỉ cần hoạt hoá, nhân giống và đƣa vào sản xuất . Sinh khối vi khuẩn lactic chủ yếu đƣợc dùng nhiều trong công nghệ thực phẩm và y học. 1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm : Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn có rất nhiều trong thiên nhiên, vì thế chúng tham gia vào tất cả hoạt động sống của con ngƣời, trong đó đặc biệt quan trong la chế biến thực phẩm. a. Ứng dụng để sản xuất dƣa chua : Qúa trình muối chua rau quả chính là quá trình hoạt động sống của vi khuẩn latic và vi khuẩn axetic. Trong quá trình phát triển của chúng , trong rau quả khi lên men sẽ tạo ra acid lactic và acid axetic cùng một số loại acid hữu cơ khác. Các acid hữu cơ này làm giảm pH của dung dịch, chống lại hịên tƣợng gây thối rau quả. Mặt khác nhờ có lƣợng acid hữu cơ dƣợc tạo ra sẽ làm tăng hƣơng vị của khối ủ chua rau quả. Các sản phẩm muối chua rau quả: Bacillus brassicae fermentati, Lactobacillus cucummeris, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis,… b. Ứng dụng làm chua quả: Ngƣời ta thƣờng sử dụng acid lactic để ngâm chua quả.phƣơng pháp này hiệu quả vì chúng ít làm biến đổi màu tự nhiên của quả và vẫn đảm bảo chât lƣợng quả ngâm chua. c. Ứng dụng trong sản xuất tƣơng: Sản xuất tƣơng theo phƣơng pháp ngƣời miền Bắc( Việt Nam) có giai đoạn ngả nƣớc đậu sau khi rang. Quá trình ngả nƣớc đậu xảy ra nhiều phản ứng sinh hóa khác nhau, trong đó có quá trình lên men lactic tạo pH thích hợp cho sản phẩm và làm tăng hƣơng vị cho sản phẩm. Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 32 d. Ƣng dụng trong sản xụất đậu phụ Trong sản xuất đậu phụ có giai đoạn kết tủa protein của đậu. Phƣơng pháp truyền thống thƣờng làm là dùng nƣớc chua (chứa vi khuẩn lactic) để tạo kết tủa (nhờ pH giảm đến điểm đẳng điện của protein đậu nành. e. Ƣng dụng để sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa Trong sản xuất các loại sữa chua đều có sử dụng quá trình lên men lactic. Nhờ có quá trình chuyển hoá đƣờng thành acid lactic mà casein kết tủa và tạo cho sản phẩm hƣơng vị đặc trƣng. Bảng7 : Một số vi khuẩn đặc trƣng cho công nghiệp chế biến sữa Chủng vi sinh vật Nhiệt độ lên men 0C Lên men lactose đến Lên men acid xitric đến Sử dụng trong sản xuất Acid lactic Chất khác S.thermophilus 40-45 0,7 Sữa lên men S.lactic 25-30 0,7 Phomat S.cremoric 25-30 0,7 Sữa lên men S.diaxetylactic 25-30 0,7 CO2 Diaxetyl Sữa lên men, phomat, bơ Leuc.cremoric 25-30 0,4 CO2 CO2 Diaxetyl Sữa lên men L.casei 30 1,5 Phomat L.lactic 40-45 1,5 Phomat L.helveticus 40-45 2,0 Sữa lên men,phomat L.bulgaricus 40-45 1,5 Sữa lên men Bifidobacterium 37 0,9 Acid acetic Sữa lên men f. Công nghiệp chế biến thịt Các sản phẩm thịt lên men, xúc xích lên men: P. acidilactici, Lb. plantarum, Staphylococcus carnosus… g. Ƣng dụng để ủ thức ăn gia súc Về nguyên tắc, ủ các loại cỏ và lá cây làm thực phẩm gia súc cũng giống nhƣ công nghệ sản xuất dƣa chua. Quá trình lên men lactic xảy ra làm tăng giá trị dinh dƣỡng và khả năng bảo quản cỏ, lá cây cho gia súc. 2. Ứng dụng trong y học Ƣng dụng vi khuẩn lactic chữa bệnh đƣờng ruột Dựa vào hiệu quả sử dụng vi khuẩn lactic trong việc chữa trị tiêu chảy, Pháp đã sản xuất và đƣa ra thị trƣờng từ hàng chục năm nay sản phẩm mang tên Biolactyl. Sản phẩm này chuyên trị tiêu chảy bằng nhiều vi khuẩn lactic. Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 33 VI. THÀNH TỰU Hiện nay, với sự phát triển vƣợt bậc của khoa học kĩ thuật, và đáp ứng yêu cầu của canh trƣờng nuôi cấy, các chuyên gia đã tập trung phát triển rộng ở hai hƣớng sau: 1. Nghiên cứu mối quan hệ cộng sinh và ức chế lẫn nhau giữa các loài để tiến hành nuôi cấy canh trƣờng hỗn hợp gồm nhiều loài. Trƣớc đây, ngƣời ta chủ yếu tập trung sản xuất canh trƣờng giống thuần khiết, nhƣng hiện nay để đáp ứng yêu cầu sản xuất, đặc biệt trong ngành công nghiệp sữa, giống thƣờng đƣợc sử dụng dƣới dạng tổ hợp nhiều loài vi sinh vật khác nhau. Do đó để tiến hành nuôi cấy tổ hợp giống này thì các nhà sản xuất phải nghiên cứu, xem xét kỹ mối quan hệ lẫn nhau trong tổ hợp giống để chọn ra điều kiện nuôi thích hợp nhất để tổ hợp giống cùng nhau phát triển. Trong trƣờng hợp nhân giống là tổ hợp nhiều loại vi khuẩn lactic, do mỗi loại VSV có nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu riêng, việc chọn nhiệt độ cho quá trình nhân giống là rất quan trọng.Bằng cách thay đổi giá trị nhiệt độ trong khoảng vài 0C, ta sẽ có đƣợc các kết quả khác nhau về tỷ lệ số tế bào của từng loại vi khuẩn trong canh trƣờng thu đƣợc trong qá trình nhân giống.Ví dụ nhƣ theo Beal và Corrieu (1991), nếu nhân giông tô hợp Lactobacillus bugaricus và Streptococcus thermophilus ở 44 0C , lòai Lactobacillus bugaricus sẽ sinh truởng tố hơn và chiếm tỉ lệ cao hơn trong sinh khối thu đƣợc. Ngƣợc lại, nếu qúa trình nhân giống là 420C ,loài Streptococcus thermophilus chiếm tỉ lệ co hơ trong inh khối. Ví dụ trong sản xuất kefir, ngƣời ta dùng tổ hợp nhiều loài vi khuẩn lactic và nấm men để lên men tạo sản phẩm, hay trong công nghệ sản xuất yaout, giống là tổ hợp nhiều loài lactic khác nhau. 2. Nghiên cứu chuyển hoá gen Những giống truyền thống phát triển dựa trên sự tuyển chọn từ những giống tự nhiên và sự đột biến. Tuy nhiên, kỹ thuật mới trong thao tác gen, tách gen và chuyển hoá gen hứa hẹn nhiều cải tiến cho những giống ứng dụng trong ngành công nghiệp sữa. Kỹ thuật gen cho phép thay đổi trực tiếp những đặc điểm đang tồn tại, trao đổi những đặc tính (protease, bacteriocins, chuyển hoá cacbonhydrat) giữa những giống hoặc loài có mối quan hệ gần nhau và đƣa vào những gen ngoại từ những giống khác nhau. Phƣơng pháp chuyển gen vào giống mới gồm: tiếp hợp, chuyển nạp và biến nạp. Mặc dù việc sử dụng vi khuẩn lactic biến đổi gen không ảnh hƣởng đến khả năng rủi ro trong việc tiêu thụ những sản phẩm lên men từ sữa nhƣng để an toàn, ngƣời ta vẫn chú ý số lƣợng vi khuẩn đƣa vào. Điều này cũng bao gồm những tƣơng tác có khả năng xảy ra với vi sinh vật gây bệnh cũng nhƣ là những rắc rối có thể xảy ra với kỹ thuật xử lý, giá trị dinh dƣỡng và khả năng gây dị ứng của sản phẩm. Trong tất cả những loài lactic làm giống, vi khuẩn lactic ƣa ấm đƣợc nghiên cứu nhiều nhất. Bảng dƣới cung cấp những nghiên cứu về biến đổi gen quan trọng của vi khuẩn dùng trong công nghiệp sản xuất sữa. Nhiễm thể thực khuẩn là nguyên nhân quan trọng làm chậm quá trình hình thành acid trong khi lên men. Vì vậy có rất nhiều nghiên cứu tập trung vào việc thay đổi các tính trạng để cải tiến canh trƣờng giống dùng trong công nghiệp. Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 34 Bảng 8: Một số ví dụ về biến đổi gen của canh trường giống trong ngành sữa Loài Sự biến đổi Lc.lactics subsp Tạo ra giống có khả năng sinh nicin A kém Lc.lactis subsp.lactis Cải tiến hoạt tính phân huỷ protein của nó bằng cách nhận plasmid mã hoá gen proteinase từ Lc.lactis subsp. cremoris Lc.lactis subsp. lactis và Lc. Lactis subsp. cremoris Sức đề kháng thực khuẩn Lc.lactis Chuyển plasmid có sức đề kháng thực khuẩn Lc.lactis subsp. lactis subsp. lactis var. diacetylactis Kiểu hình Lac+ đƣợc sản xuất bằng cách chuyển plasmid lactose từ Lc.lactis subsp. lactis Lc.lactis subsp. lactis Giống Prt- đƣợc biến đổi từ Prt+ bằng sự biến đổi phức hợp gen proteinase từ Lc. Lactis subsp. cremoris Lc.lactis Gia tăng sản lƣợng diacetyl Pediococcus Cải tiến tính hấp thụ lactose và galactose và gia tăng hoạt tính phosphor-beta galactosidase bằng cách chuyển một plasmid lactose từ Lc.lactis Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 35 VII. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lê Văn Việt Mẫn, Công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa và thức uống, tập 1 – Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh - 2004 2. Nguyễn Đức Lƣợng, Công nghệ sinh học, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TpHCM, năm 2001, 342 trang. 3.Nguyễn Đức Lƣợng,Công nghệ vi sinh vật (tập 1: Cơ sở vi sinh vật công nghiệp), Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TpHCM, năm 2004, 236 trang. 4.Nguyễn Đức Lƣợng,Công nghệ vi sinh vật (tập 2: Vi sinh vật học công nghiệp), Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TpHCM, năm 2002, 370 trang. 5.Kiều Hữu Ảnh, Giáo Trình Vi Sinh Vật Học Công Nghiệp,Nhà Xuất Bản Khoa Học Và Kỹ Thuật Hà Nội, năm 1999, 291 trang 6. Lê Ngọc Tú, Hóa sinh công nghiệp - Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, 2002, 443 trang. 7. 8. MỤC LỤC Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 36 I. Nguyên liệu làm môi trƣờng vi sinh vật ---------------------------------------------- 1 1. Vi khuẩn lactic ------------------------------------------------------------------------------- 1 1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic --------------------------------------------------- 1 1.2. Sự phân bố --------------------------------------------------------------------------------- 1 1.3.Phân loại vi khuẩn lactic ------------------------------------------------------------------ 1 2. Sinh khối vi khuẩn lactic ------------------------------------------------------------------ 11 3. Nguyên liệu sản xuất và giống dùng cho nuôi cấy ---------------------------------- 11 II. Qui trình thu nhận sinh khối vi khuẩn lactic ----------------------------------------- 17 III. Giải thích quy trình công nghệ -------------------------------------------------------- 18 1. Xử lý nguyên liệu ------------------------------------------------------------------------ 18 2. Chuẩn bị môi trƣờng ---------------------------------------------------------------------- 18 3.Thanh trùng môi trƣờng ------------------------------------------------------------------- 18 4.Nuôi cấy (nhân giống) --------------------------------------------------------------------- 19 5, Thu sinh khối -------------------------------------------------------------------------------- 24 6. Làm lạnh ------------------------------------------------------------------------------------- 25 7. Đóng gói và bảo quản -------------------------------------------------------------------- 27 IV.Sản phẩm sinh khối vi khuẩn lactic ----------------------------------------------------- 28 V. Ƣng dụng của sinh khối vi khuẩn lactic ------------------------------------------------- 28 VI. Tài liệu tham khảo ------------------------------------------------------------------------ 34