Đề tài Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay ở nước ta, việc nghiên cứu sinh dược học và dược động học của thuốc là một lĩnh vực tương đối mới, đang ngày càng được quan tâm. Trong khi đó, ở các nước khác, đây là một tiêu chí bắt buộc các hãng Dược phẩm phải làm nếu muốn đưa thuốc ra thị trường. Một trong những vấn đề đánh giá sinh dược học của thuốc là mức độ hấp thu thuốc và nồng độ thuốc đạt được trong huyết tương. Các phương pháp phân tích hay dùng để xác định nồng độ thuốc trong huyết tương (dịch sinh vật) là sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ), sắc ký khí (GC), sắc ký khí gắn với máy khối phổ (GC - MS ), phóng xạ miễn dịch, điện di mao quản.... Trong đó, HPLC đặc biệt là HPLC pha đảo với detector UV là phương pháp hayđược dùng hơn cả, do tinh ưu việt nổi trội về độ nhạy, tính chính xác, độ chọn lọc, tính kinh tế. Để có một qui trình dùng HPLC đảm bảo độ tin cậy để phân tích thuốc trong dịch sinh vật, chúng ta khảo sát các điều kiện sắc ký thích hợp như cột; dung môi pha động; lưu lượng dòng; bước sóng.... quy trình xử lý mẫu, khoản nồng độ khảo sát. Ketoprofen- acid -2 (- benzoyl phenyl ) propionic - là thuốc chống viêm phi steroid; có tác dụng giảm đau, chống viêm, ức chế quá trình tổng hợp prostaglandin và leukotrien; ức chế sự kết dính tiểu cầu được dùng nhiều trong điều trị thấp khớp mãn tính, đặc biệt viêm đa khớp dạng thấp, thoái hoá khớp nặng. Ketoprofen là thuốc mới được đưa vào sản xuất ở nước ta và chưa có tài liệu trong nước nào đánh giá định lượng ketoprofen trong huyết tương. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương” với mục tiêu: -Khảo sát và lựa chọn dung môi chiết ketoprofen trong huyết tương cho hiệu xuất chiết cao. -Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng ketoprofen trong huyết tương . -Xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương bằng HPLC. -Áp dụng định lượng ketoprofen trong huyết tương người sau khi uống thuốc và theo dõi độ ổn định của ketoprofen theo thời gian bảo quản. PHẦN I: TỔNG QUAN. 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ KETOPROFEN. 1.1.1 Công thức và tính chất lý hoá[1] [ 5]. CH – COOH C O CH3 - Phân tử lượng : 254.29 - Tên khoa học :acid 2 ( - benzoyl phenyl ) propionic - Tính chất: Bột kết tinh trắng, không mùi. Thực tế không tan trong nước ở 200C, tan hoàn toàn trong kiềm mạnh, ethanol 960, aceton cloroform và ether. pKa =5,94 trong hỗn hợp methanol - nước (3 : 1). Cực đại hấp thụ trong methanol ở bước sóng 255 nm. Nhiệt độ nóng chảy khoảng 950C. 1.1.2 Tác dụng dược lý và dược động học [5] [6]. Ketoprofen là thuốc chống viêm phi steroid, thuộc dẫn chất của acid aryl propionic, có tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm. Ketoprofen ức chế quá trình tổng hợp prostaglandin và ức chế sự kết tập tiểu cầu. Ketoprofen được hấp thu rất nhanh vào máu , đạt nồng độ tối đa sau 45 - 60 phút nếu đặt hậu môn và 60- 90 phút sau khi uống. Liên kết với protein huyết tương 99%, thời gian bán thải là 1,5-2,5 giờ. Sau khi uống 4 giờ nồng độ ketoprofen trong bao hoạt dịch cao hơn trong máu. Thuốc qua được hàng rào nhau thai. Một phần nhỏ chuyển hoá bằng cách hydroxyl hoá, còn phần lớn liên hợp với acid glucuronic. Thải trừ chủ yếu qua nước tiểu (75- 90%), một ít qua phân( 1-8% ). Ở nước tiểu ( 65-75%) là dạng glucuronyl, 1% là dạng chưa biến đổi. Sau khi uống 6 giờ ketoprofen sẽ bị thải trừ 50% qua thận. 1.1.3 Chỉ định [5] [6]: Ketoprofen được chỉ định điều trị dài hạn các triệu chứng trong: - Viêm thấp khớp mãn tính, đặc biệt là viêm đa khớp dạng thấp, viêm cứng khớp cột sống. - Bệnh cứng khớp gây đau và tàn phế. Điều trị ngắn hạn các triệu chứng trong các cơn cấp tính của các bệnh: - Bệnh thấp khớp ngoài khớp (đau vai cấp tính, viêm gân ... ). - Viêm khớp vi tinh thể. - Thoái hoá khớp. - Dạng viên nang còn dùng để giảm đau: đau lưng, đau rễ thần kinh... 1.1.4 Chống chỉ định [6]: - Dị ứng với ketoprofen, aspirin, và các thuốc chống viêm phi steroid cùng loại. - Loét dạ dày-tá tràng tiến triển. - Suy thận nặng, suy gan tế bào nặng. - Phụ nữ có thai( 3 tháng cuối) và cho con bú. 1.1.5 Tác dụng không mong muốn [6] - Tác dụng phụ ở đường tiêu hoá: khó chịu vùng dạ dày-ruột, đau dạ dày, buồn nôn, nôn mửa, táo bón, tiêu chảy, nặng thì loét dạ dày, xuất huyết tiêu hoá, thủng ruột. - Nhức đầu, chóng mặt, buồn ngủ. - Phản ứng quá mẫn ở da( nổi ban, mề đay, ngứa) và đường hô hấp (suyễn, nhất là những người dị ứng với aspirin và các kháng viêm không steroid khác). - Giảm nhẹ hồng cầu ở người bị thiếu máu, một vài trường hợp giảm bạch cầu nhẹ đã được ghi nhận. 1.1.6 Liều dùng: Liều khởi đầu: 300 mg chia làm 3 lần, uống khi no. Liều duy trì: 150-200mg hoặc nạp ngày 1-2 viên thuốc đạn. Tiêm bắp ngày100-200mg chia 2 lần. Không nên phối hợp Ketoprofen với thuốc chống đông máu đường uống và các kháng viêm không steroid khác (kể cả salicylat liều cao) do làm tăng nguy cơ loét và xuất huyết tiêu hoá. 1.1.7 Dạng bào chế [5] [6]. - Viên nang 25mg, 50mg, 75mg. - Viên nén 100mg, 150mg. - Viến bao tan ở ruột 50mg. - Viên bao tác dụng kéo dài 200mg, viên nang tác dụng kéo dài 100mg, 150mg, 200mg. - Thuốc tiêm 100mg. - Thuốc mỡ 2,5%. Biệt dược: Biprofenid, Profenid, Kefenid, Fastum, Ketum, Ketopron…. 1.1.8 Các phương pháp định lượng. A. Phương pháp acid- bazơ: Định lượng ketoprofen nguyên liệu, xác định điểm tương đương bằng chỉ thị đỏ phenol [18] hoặc bằng phương pháp đo điện thế [ 10] [18]. Tiến hành: Hoà tan khoảng 200mg Ketoprofen (cân chính xác) vào 25ml alcol. Thêm 25ml nước và vài giọt đỏ phenol. Chuẩn độ với NaOH 0,1N. Song song làm một mẫu trắng trong cùng điều kiện. 1ml NaOH 0,1N tương đương với 25,43mg C16H14O3. - Hoặc: Hoà tan khoảng 200mg Ketoprofen (cân chính xác) vào 25ml alcol. Thêm 25ml nước Chuẩn độ với NaOH 0,1N, xác định điểm tương đương bằng bước nhảy điện thế. 1ml NaOH 0,1N tương đương với 25,43mg C16H14O3. B. Phương pháp quang phổ [7] [8][10]: Dùng để định lượng ketoprofen trong chế phẩm. Hoà một lượng chế phẩm có chứa khoảng 50 mg ketoprofen (cân chính xác) trong 300 ml methanol 75 %, lắc trong 10 phút, thêm methanol 75 % vừa đủ 500 ml. Lọc. Lấy 5 ml dịch lọc pha loãng thành 100 ml với methanol 75 % và đem đo độ hấp thụ của dung dich này ở bước sóng 258nm; cuvet thạch anh có chiều dày 1 cm với mẫu trắng là methanol 75%. Tính kết quả dựa vào A (1%, 1cm) ở bước sóng 258 nm là 662. C. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ). Dùng để định lượng ketoprofen trong huyết tương và xác định tạp chất trong nguyên liệu. STT TÀI LIỆU PHA ĐỘNG CỘT MẪU THỬ 1 [10] [18] Đệm phosphat pH 3,5 - ACN - H2O (2:43:55) C18 5mm 150*4,6 mm Nguyên liệu 2 [10] NH4CH3COO 1% - MeOH - ACN (55:30:15) C18 5mm 200*4,6 mm Nguyên liệu 3 [13] Đệm phosphat pH 3,2 - ACN (60:40) C18 2mm 250*4,6 mm Huyết tương 4 [12] NH4CH3COO 20 mM - MeOH; điều chỉnh pH 7,0. C18 4 mm Huyết tương 5 [11] ACN : AcOH 1% ( 38 : 62 ). C18 10mm 3,9*300 mm Huyết tương 6 [16] Đệm Phosphat 0,05M pH 7 : ACN (90 : 10 ). C18 5 mm 4,6*250mm Huyết tương D. Ph­¬ng ph¸p ®iÖn di mao qu¶n: §Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng [14] vµ t¸ch ®ång ph©n cña ketoprofen [17]. 1.2 Ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao ( HPLC ). S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao ( High Performance Liquid Chromatography ) cßn gäi lµ s¾c ký láng cao ¸p hay s¾c ký láng hiÖn ®¹i ra ®êi vµo nh÷ng n¨m cuèi 1960. Nã ®­îc x©y dùng vµ ph¸t triÓn kh«ng ngõng vµ ngµy cµng thÓ hiÖn râ tÝnh ­u viÖt, ®Æc biÖt lµ trong lÜnh vùc nghiªn cøu sinh d­îc häc cña thuèc. Ph©n lo¹i c¸c ph­¬ng ph¸p s¾c ký [ 2]: S¾c ký ph©n bè : + s¾c ký láng- láng. +s¾c ký ph©n bè pha liªn kÕt. S¾c ký hÊp phô hiÖu n¨ng cao. S¾c ký trao ®æi ion hiÖu n¨ng cao. S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao trªn gel ( s¾c ký theo lo¹i cì ). Trong ph©n tÝch sinh d­îc häc vµ kiÓm nghiÖm, ng­êi ta hay sö dông ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng ph©n bè pha liªn kÕt (Bonded Phase Chromatography ). §Æc ®iÓm ph­¬ng ph¸p [2]: Trong s¾c ký láng ph©n bè pha liªn kÕt, pha tÜnh ®­îc g¾n ho¸ häc (liªn kÕt ) víi chÊt mang ( Silicagel ) t¹o nªn hîp chÊt c¬ Siloxan Si CH3 CH3 CH3 Cl CH3 OH Si R Si Si O CH3 CH3 R + H3C H3C Nhãm Silanol DÉn chÊt DÉn chÊt Siloxan cña Silicagel clorosilan - NÕu R lµ mét nhãm Ýt ph©n cùc nh­ octyl (C8), octadecyl (C18) hay phenyl vµ dung m«i ph©n cùc nh­ methanol, acetonitril th× cã s¾c ký pha ®¶o (s¾c ký pha ng­îc ). - NÕu R lµ nhãm kh¸ ph©n cùc nh­: alkylamin - ( - CH2- )n-NH2 hay alkyl nitril -( - CH2- )n- CN vµ dung m«i Ýt ph©n cùc nh­ hexan th× ta cã s¾c ký pha thuËn. - C¸ch chän pha: th­êng chän pha tÜnh cã tÝnh chÊt ph©n cùc gièng c¸c chÊt cÇn t¸ch vµ kh¸c víi pha ®éng. Nguyªn t¾c cña ph­¬ng ph¸p [2] [3]: C¸c chÊt trong hçn hîp ®­îc t¸ch dùa trªn kh¶ n¨ng ph©n bè kh¸c nhau cña chóng vµo hai pha kh«ng hoµ lÉn vµo nhau, lu«n tiÕp xóc nhau: mét pha tÜnh vµ mét pha ®éng. Dung dÞch mÉu thö ®­îc ®­a vµo hÖ thèng s¾c ký qua van tiªm mÉu vµ ®­îc dung m«i pha ®éng kÐo tíi cét ph©n tÝch nhê mét b¬m cao ¸p. T¹i cét x¶y ra qu¸ tr×nh t¸ch, nh÷ng ph©n tö nµo cã ¸i lùc thÊp víi pha tÜnh th× ®­îc röa gi¶i ra tr­íc, cßn nh÷ng ph©n tö nµo cã ¸i lùc m¹nh víi pha tÜnh th× ®­îc röa gi¶i ra sau. ChÊt ra khái cét ®­îc ph¸t hiÖn b»ng detector g¾n víi m¸y ghi, m¸y tÝnh hay m¸y tÝch ph©n. Thêi gian l­u tR lµ ®Æc tr­ng ®Þnh tÝnh cña chÊt, chiÒu cao hay diÖn tÝch pic lµ ®Æc tr­ng ®Þnh l­îng cña chÊt. S¾c ký ®­îc tiÕn hµnh so víi chuÈn. Mét sè th«ng sè ®Æc tr­ng cña HPLC [2]: VÝ dô: Ta cã 1 s¾c ®å sau: - Thêi gian l­u tR ( phót ) lµ thêi gian tÝnh tõ lóc tiªm mÉu vµo hÖ thèng s¾c ký ®Õn lóc xuÊt hiÖn ®Ønh cña pic. So s¸nh thêi gian l­u cña mÉu thö vµ mÉu chuÈn lµm trong cïng ®iÒu kiÖn ta sÏ ®Þnh tÝnh ®­îc chÊt ®ã. - Thêi gian chÕt tM ( phót ) lµ thêi gian cña mét chÊt kh«ng bÞ l­u gi÷ tøc lµ b»ng tèc ®é di chuyÓn trung b×nh cña c¸c ph©n tö dung m«i. Thêi gian l­u hiÖu chÝnh tR, ®­îc tÝnh theo c«ng thøc: tR = tR, + tM ( hay tR, = tR - tM ). - Thõa sè dung l­îng k’ dïng ®Ó m« t¶ tèc ®é di chuyÓn cña mét chÊt Qs t’R tR - tM VR -VM k’ = = = = QM tM tM VM - Thõa sè chän läc a : M« t¶ tèc ®é di chuyÓn tû ®èi cña hai chÊt. kB k’B t’R,B a = = = kA k’A t’R,A Qui ­íc B lµ chÊt bÞ l­u gi÷ m¹nh h¬n A nªn a ³ 1. §Ó t¸ch riªng 2 chÊt th× a > 1, th­êng tõ 1,05 – 2,00. Sè ®Üa lý thuyÕt N: BiÓu thÞ hiÖu lùc cét s¾c ký. N = hoặc N = Trong đó: WB chiều rộng pic ở đáy pic. W1/2 chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh. - Độ phân giải RS là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký. tR,B – tR,A Rs = 1/2( WB + WA ) Để tách riêng hai chất, Rs ³ 1,5 ( khi 2 sắc đồ có độ lớn cùng cỡ ). - Chiều cao pic hay diện tích pic là đặc trưng định lượng của chất. Khi so sánh chiều cao pic hay diện tích pic của mẫu thử và chuẩn trong cùng điều kiện làm ta tính được hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử. Pha tĩnh và pha động trong HPLC [3]. *Pha tĩnh trong HPLC chính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất phân tích. Nó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ hạt từ 3-10mm, diện tích bề mặt riêng thường từ 50-500 m2/g.Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trên cột tách, người ta chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử. Tương ứng với loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc ký riêng trong kỹ thuật HPLC. Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký phân bố pha liên kết. Bản chất chính của sự tách trong loại sắc ký này là dựa trên khả năng tách của các chất trong hai pha không hoà lẫn vào nhau. Các yêu cầu chung của pha tĩnh trong kỹ thuật HPLC: + Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký, không có các phản ứng hoá học phụ với dung môi rửa giải hay với chất phân tích. + Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký. + Tính chất bề mặt phải ổn định. + Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt. + Cỡ hạt phải tương đối dồng nhất. Pha tĩnh thường được chế tạo trên các chất nền sau: + Pha tĩnh trên nền Silicagel ( SiO2 ) + Pha tĩnh trên nền Oxid nhôm ( Al2O3 ) + Pha tĩnh trên nền cao phân tử hữu cơ ( polystyren, cellulo...) + Pha tĩnh trên nền mạch carbon. Trong 4 loại này thì nền Silicagel được sử dụng nhiều nhất và pha tĩnh được chế tạo trên nền này cũng có nhiều ưu việt hơn, như khả năng chịu áp cao, độ trương nở nhỏ khi thay đổi dung môi rửa giải, bền với nhiệt. *Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan ( chất phân tích ) ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trính sắc ký. Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ như Metanol, Acetonitril, n-Hexan, hay cũng có thể là hỗn hợp của hai hay nhiều dung môi trộn với nhau theo những tỷ lệ phù hợp. Nó cũng có thể là dung dịch nước của các muối có chứa chất đệm, chất tạo phức, chất làm chậm. Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi rửa giải riêng cho nó, để có được hiệu quả tốt. Pha động là một trong những yếu tố quyết định thời gian lưu giữ của chất mẫu và hiệu quả sự tách sắc ký, ảnh hưởng tới sự phân giải của chất trong pha tĩnh. Pha động trong kỹ thuật HPLC cần phải thoả mãn một số điều kiện sau: + Phải trơ đối với pha tĩnh. + Phải hoà tan được chất mẫu + Phải bền vững theo thời gian +Phải có độ tinh khiết cao + Phải nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký + Phải phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích. Trong sắc ký phân bố pha liên kết, pha động là hệ dung môi phân cực, nó là những dung môi trộn lẫn đượcvới nước và trong nhiều trường hợp thì nước lại là một thành phần chính của pha động. Tiêu biểu và được dùng khá phổ biến trong loại sắc ký phân bố pha liên kết là các dung môi methanol, tetrahydrofuran, acetonitril, hay hỗn hợp của methanol, acetonitril với nước, với đệm. Sắc ký phân bố pha liên kết được sử dụng rất phổ biến để tách nhiều loại hỗn hợp mẫu từ vô cơ đến hữu cơ, chất không phân cực đến phân cực. Trong hệ pha này thì thành phần của pha động cũng ảnh hưởng đến kết quả tách sắc ký. Cách tính kết quả trong phương pháp HPLC. - Phương pháp đường chuẩn - Phương pháp thêm - Phương pháp so sánh Đối với việc xác định nồng độ hoạt chất trong dịch sinh học, tính toán kết quả dựa vào đường chuẩn được xây dựng bằng cách chủ động cho chất chuẩn với nồng độ khác nhau vào dịch sinh vật. Xử lý mẫu và đem chạy sắc ký. PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 2.1.1 Nguyên vật liệu và hoá chất *Nguyên vật liệu: - Ketoprofen 99,3% (Đạt theo BP 2001). - Ibuprofen 99,0 % (Đạt theo USP 24). - Naproxen 99,6% (Đạt theo USP 24). *Hoá chất: - Acetonitril ( HPLC grade-Merck ). - Methanol ( HPLC grade- Merck ). - Acid acetic băng ( HPLC grade - Merck ). - Triethylamin ( PA grade - Merck ). *Dụng cụ: - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. + Bơm cao áp Merck- Hitachi L-6000. + Detector Merck-Hitachi L-4000 UV. + Máy tích phân Merck - Hitachi D-2500 chromato-integrator. + Van tiêm mẫu Rheohyne 1725 - USA. - Máy quang phổ Beckman DU-640 spectrophotometer (Mỹ). - Máy lọc nước siêu sạch Elga (Anh). - Cân phân tích Satorius (Đức). - Ly tâm điện Jouan (Pháp). - Máy siêu âm Branson (Mỹ). - Máy lắc Labinco. - Autopipet 10-100mcl, 100 - 1000mcl. - Dụng cụ thuỷ tinh, bơm tiêm, ống nghiệm, bình định mức. 2.1.2 Phương pháp thực nghiệm a.Khảo sát điều kiện sắc ký Khảo sát chọn dung môi chiết Ketoprofen trong huyết tương Khả năng chiết hoạt chất được biểu thị bằng hiệu suất chiết và khả năng loại tạp cản trở sự phát hiện ketoprofen trong mẫu phân tích. Lắc 1 phút Cắn Dung môi hữu cơ Mẫu thử được xử lý với các dung môi khác nhau theo sơ đồ sau: Huyết tương Lắc 5 phút Ly tâm 15phút(3000 vòng/phút) Khí Pha động Dịch chiết Lọc Ly tâm 15 phút(3000 vòng /phút) Dịch lọc Hình 1: Sơ đồ xử lý mẫu huyết tương ( chiết đơn ) Để tăng hiệu suất chiết, nhằm mục đích chiết kiệt hết hoạt chất trong huyết tương, ta tiến hành chiết lặp (chiết 3 lần). Tiến hành như sơ đồ 1 thực hiện thêm hai lần từ lúc thêm dung môi hữu cơ đến khi thu được cắn. Tất cả các dịch chiết của 3 lần được tập trung vào một ống nghiệm, đuổi dung môi thu được cắn như sơ đồ 1. Tìm chất chuẩn nội. Dùng những chất có công thức hoá học gần giống với ketoprofen cho vào huyết tương đã chứa ketoprofen, xử lý mẫu như sơ đồ hình 1. Chạy sắc ký để xác định thời gian lưu của chất chuẩn nội và ketoprofen, tính thừa số chọn lọc a ( tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất ) xem mức độ tách của hai chất. Chất chuẩn nội phải tách hẳn với ketoprofen , hiệu suất chiết ổn định, bền vững, phát hiện dễ dàng ở điều kiện sắc ký trên. Khảo sát chọn hệ dung môi ( pha động ) chạy sắc ký. Trong sắc ký phân bố pha liên kết, pha động là một hệ dung môi phân cực, hay dùng là các dung môi methanol, acetonitril, hay hỗn hợp của methanol, acetonitril với nước, với đệm. Chuẩn bị các hệ dung môi khảo sát, tiến hành chạy sắc ký với từng hệ dung môi mẫu huyết tương có chứa ketoprofen và chuẩn nội được xử lý như sơ đồ hình 1.Tính RS của từng hệ dung môi từ đó chọn được hệ để phân tích ketoprfen trong huyết tương. b.Xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương Xây dựng đường chuẩn trong pha động: Pha 1 dãy dung dịch hỗn hợp ketoprofen và chất chuẩn nội trong pha động với nồng độ ketoprofen lần lượt là 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml; 0,8mcg/ml; 2mcg/ml; 5mcg/ml và nồng độ chất chuẩn nội là 25mg/ml. Tiến hành chạy sắc ký, xác định thời gian lưu và diện tích pic của ketoprofen và chuẩn nội, từ đó tính được tỷ số diện tích pic giữa ketoprofen và chất chuẩn nội . Xây dựng mối tương quan giữa nồng độ ketoprofen và tỷ số diện tích pic giữa ketoprofen và chất chuẩn nội. Xây dựng đường chuẩn trong huyết tương. Chủ động cho ketoprofen vào huyết tương để được một dãy các nồng độ 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml; 0,8mcg/ml; 2mcg/ml; 5mcg/ml. Tiếp đó cho vào các ống nghiệm cùng một nồng độ chất chuẩn nội. Xử lý mẫu như sơ đồ hình 1.Chạy sắc ký, từ đó tìm ra mối tương quan giữa nồng độ ketoprrofen và tỷ số diện tích pic giữa ketoprofen và chất chuẩn nội. Xác định tính chính xác của phương pháp (trong cùng một ngày và giữa các ngày phân tích). Làm nhiều lần ở cùng một nồng độ để xác định sai số của phương pháp ( biểu thị bằng RSD ). Làm ở hai nồng độ : 0,5mcg/ml; 4mcg/ml. Xác định tính đúng của phương pháp: Bằng phương pháp thêm Thêm chính xác một lượng mẫu chuẩn vào mẫu thử đã biết nồng độ ketoprofen, xử lý mẫu như sơ đồ hình 1 và tiến hành chạy sắc ký. Tính % ketoprofen chuẩn tìm lại được. ỨNG DỤNG Dùng phương pháp đã xây dựng để định lượng ketoprofen mẫu huyết tương người sau khi uống viên nang ketoprofen 50 mg; 1,50 giờ và theo dõi độ bền vững của ketoprofen trong huyết tương bảo quản ở - 300C, sau 1; 2; 3 tháng. 2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét 2.2.1 Khảo sát tìm dung môi chiết xuất Dung môi hữu cơ dùng để chiết xuất phải có khả năng hoà tan tốt ketoprofen và chất chuẩn nội, đồng thời phải loại được tạp chất và làm đông vón protein huyết tương. Khảo sát khả năng chiết của một số dung môi ta thu được kết quả sau: Bảng 1: Hiệu suất chiết ketoprofen từ huyết tương. Dung môi Hiệu suất chiết (%) Cloroform Ether Acetonitril Ethylacetat Dichloromethan 51.5 53.8 91.2 78.3 36,6 Tõ kÕt qu¶ trªn cho thÊy acetonitril cã hiÖu suÊt chiÕt ketoprofen cao nhÊt. Dïng Acetonitril chiÕt ketoprofen ë nång ®é 4mcg/ml. ChiÕt 1 lÇn vµ chiÕt 3 lÇn ta thu ®­îc kÕt qu¶ sau: B¶ng 2 : HiÖu suÊt chiÕt Ketoprofen b»ng ACN. Lần Chiết đơn ( % ) Chiết lặp ( % ) 1 83,32 96,45 2 84,56 99,91 3 80,44 96,72 4 82,32 95,1 5 81,5 97,12 Trung bình 82,43 97,06 RSD 1,934 1,818 Thời gian chiết 60 phút 160 phút §èi víi mÉu chiÕt lÆp, sau khi lÊy riªng dÞch chiÕt lÇn ®Çu, chiÕt lÇn hai, chiÕt lÇn ba, chiÕt lÇn bèn ®uæi dung m«i, hoµ tan trong pha ®éng vµ tiÕn hµnh ch¹y s¾c ký th× kh«ng ph¸t hiÖn ®­îc ketoprofen trong dÞch chiÕt lÇn bèn. Nh­ vËy chiÕt ba lÇn lµ phï hîp. NhËn xÐt: ChiÕt lÆp ketoprofen b»ng ACN hiÖu xuÊt chiÕt cao, gÇn nh­ chiÕt ®­îc hÕt (97,06%) ketoprofen trong huyÕt t­¬ng, nh­ng thêi gian xö lý mÉu qu¸ dµi. Cßn chiÕt ®¬n (chiÕt d­íi hîp thøc) ketoprofen trong huyÕt t­¬ng hiÖu xuÊt chiÕt tuy thÊp h¬n ( 82,43% ), nh­ng sai lÖch gi÷a c¸c lÇn lµm kh«ng cao ( RSD = 1,934 ), so víi chiÕt nhiÒu lÇn ( RSD = 1,818 ), vµ thêi gian xö lý mÉu kh«ng qu¸ dµi. Do ®ã, cã thÓ dïng ACN chiÕt mét lÇn ®Ó chiÕt ketoprofen trong huyÕt t­¬ng mµ vÉn thu ®­îc kÕt qu¶ tèt. 2.2.2 Kh¶o s¸t vµ lùa chän ®iÒu kiÖn s¾c ký: Dïng s¾c ký ph©n bè pha ®¶o Cét s¾c ký: TiÕn hµnh kh¶o s¸t trªn c¸c cét s¾c ký kh¸c nhau: cét C8, cét C18, cét phenyl. Qua c¸c kÕt qu¶ thu ®­îc thÊy cét C18 phï hîp. Kh¶o s¸t t×m chÊt chuÈn néi : Dïng nh÷ng chÊt cã c«ng thøc ho¸ häc gÇn gièng víi ketoprofen, kh¶o s¸t ®Ó t×m ra chÊt chuÈn néi. ChÊt chuÈn néi ph¶i ®¶m b¶o t¸ch khái ketoprofen vµ æn ®Þnh trong ®iÒu kiÖn s¾c ký. Pha c¸c dung dÞch ketoprofen vµ acid-2-(4-isobutylphenyl) propionic, ketoprofen vµ acid -2-[( 6- methoxy) naphtyl] propionic (IS1) trong pha ®éng vµ trong huyÕt t­¬ng. TiÕn hµnh ch¹y s¾c ký, x¸c ®Þnh thêi gian l­u tR cña c¸c chÊt, tÝnh thõa sè chän läc a cña c¸c chÊt ®èi víi ketoprofen, tõ ®ã x¸c ®Þnh chÊt néi chuÈn ( chÊt cã a lín nhÊt nh­ng thêi gian lµm mÉu kh«ng qu¸ dµi). KÕt qu¶ thu ®­îc nh­ sau: ChÊt tR a CH CH3 COOH C O Ketoprofen Acid - 2 ( - benzoyl phenyl ) propionic 6,77 CH3 CH COOH H3CO Acid -2-[( 6- methoxy) naphtyl] propionic (IS1) 6,90 1,019 CH3 CH COOH CH2 CH CH3 CH3 Acid - 2- ( 4 -isobutylphenyl ) propionic (IS2) 9,95 1,47 Trong ®ã a lµ tèc ®é di chuyÓn tû ®èi cña hai chÊt ®­îc ®Æc tr­ng bëi ®¹i l­îng thõa sè chän läc hay hÖ sè chän läc. a cµng lín th× hai chÊt cµng t¸ch ra khái nhau, th­êng dïng a trong kho¶ng 1,05- 2,0. Ở đây aIS2/ket > aIS1/ket nên khả năng tách của IS2 và ketoprofen sẽ tốt hơn khả năng tách của IS1 và Ketoprofen. Tốc độ di chuyển tỷ đối của IS2 và ketoprofen a = 1,47 và tR,IS2 = 9,96 nên thời gian làm mẫu cũng không quá lâu. Vì vậy, có thể dùng acid -2-(4 - isobutylphenyl) propionic làm nội chuẩn trong phương pháp định lượng Ketoprofen trong huyết tương . Pha động: Tiến hành khảo sát trên các hệ pha động khác nhau, xác định độ phân giải và khả năng tách của ketoprofen với các tạp chất trong huyết tương và khả năng tách của ketoprofen với chất chuẩn nội. Chúng tôi đã tiến hành sắc ký, dùng cột C18 với các hệ pha động sau: ACN: dung dịch đệm phosphat 0,05M pH = 7 (90 : 10). NH4CH3COO 1%: MeOH: ACN (điều chỉnh về pH= 6,5 bằng CH3COOH băng) ( 55 : 30 : 15 ) MeOH: AcOH: H2O ( 50 : 1 : 49 ). ACN: AcOH : H2O ( 60 : 1 : 39 ). Nhận xét : Các hệ 1, 2, 3 cho kết quả tách không tốt, ketoprofen chưa tách được khỏi tạp chất cũng như chất chuẩn nội. Riêng hệ 4 đã cho kết quả tách tốt nhưng các pic còn bị tù và chân pic tách không gọn. Khi ta cho thêm Triethylamin vào thì các pic sắc nét hơn và chân pic gọn hơn. Khảo sát hệ dung môi gồm 4 thành phần ( ACN, AcOH, Tri, H2O ) với các tỷ lệ ACN là 60, 50, 40, ta thu được các sắc đồ sau: Hình 2: Hệ ACN : AcOH : Tri : H2O ( 40 : 1 : 0,3 : 58,7 ). Hình 3 : Hệ ACN : AcOH : Tri : H2O ( 50 : 1 : 0,3 : 48,7 ). Hình 4 : Hệ ACN : AcOH : Tri : H2O ( 60 : 1 : 0,3 : 38,7 ). Hình 2 Hình 3 Hình 4 Bảng 3: Kết quả RS của các hệ dung môi đã chạy STT ACN AcOH Tri Lưu lượng dòng (ml/phút) RS , 1 RS ,2 RS ,3 Thời gian (phút) 1 60 1 0,3 0,85 0,97 0,99 0,97 11 2 60 1 0,3 1,2 1,05 1,44 1,22 10,62 3 60 1 0,3 0,5 1,23 1,41 0,98 12,5 4 50 1 0,3 0,5 1,05 1,28 0,99 20,28 5 50 1 0,3 0,85 1,63 1,61 1,09 17,94 6 50 1 0,3 0,85 1,39 2,99 1,35 16,52 7 40 1 0,3 1,2 2,04 6,39 6,39 25,5 8 40 1 0,3 0,5 7,35 17,28 17,28 50,71 9 40 1 0,3 0,85 2,2 8,08 6,96 30,28 NhËn xÐt: §é ph©n gi¶i RS cña c¸c hÖ t¨ng dÇn khi tû lÖ ACN gi¶m dÇn. Nh­ng thêi gian ch¹y s¾c ký còng t¨ng lªn rÊt nhiÒu. HÖ 7, 8, 9 ( tû lÖ ACN lµ 40 ) cã ®é ph©n gi¶i RS cao nhÊt nh­ng thêi gian ch¹y s¾c ký qu¸ l©u. HÖ 6 cã ®é ph©n gi¶i RS,1 =1,39; RS,2 =2,99; RS,3 =1,35 ; c¸c pic t¸ch nhau gÇn nh­ hoµn toµn vµ thêi gian ch¹y s¾c ký kh«ng qu¸ l©u. Do ®ã trong ®Ò tµi nµy chóng t«i chän hÖ dung m«i pha ®éng sè 6. ACN : AcOH : Tri : H2O ( 50 : 0,5 : 0,3 : 49,2 ). *B­íc sãng: §Ó t¨ng ®é nh¹y khi ph¸t hiÖn ketoprofen trong huyÕt t­¬ng chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh cùc ®¹i hÊp thô cña ketoprofen trong ®iÒu kiÖn gièng nh­ ph©n tÝch mÉu thùc. Pha dung dÞch ketoprofen chuÈn trong dung m«i pha ®éng. QuÐt phæ UV. Ketoprofen cã cùc ®¹i hÊp thô ë b­íc sãng 253 nm. Tõ c¸c kÕt qu¶ trªn, ®iÒu kiÖn s¾c ký ®­îc chän lµ: - Pha tÜnh : Cét Nucleosil ODS 5mm (4,6*250 mm) - Pha ®éng: ACN: AcOH : Tri :H2O ( 50 : 0,5 : 0,3 : 48,7). - L­u l­îng dßng: 0,85ml/ phót. - B­íc sãng : 253 nm. - ThÓ tÝch mÉu tiªm : 50ml. 2.2.3. X©y dùng ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng. Xây dựng đường chuẩn trong pha động: Pha một dãy các dung dịch hỗn hợp ket và IS trong pha động với các nồng độ của ket là 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml ; 0,8mcg/ml ; 2mcg/ml ; 5mcg/ml và nồng độ IS là 25mcg/ml. Tiến hành chạy sắc ký với điều kiện như ở trang 21. Kết quả thu được biểu thị bằng diện tích pic từ đó tính tỷ số diện tích pic của ket và IS . Bảng 4: Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng Ketoprofen trong pha động Nồng độ ( mcg/ml ) 0,05 0,2 0,8 2 5 AKet 4245 17779 900375 242424 613525 AIS 118674 110665 127804 119413 114211 RKet/IS 0,036 0,161 0,704 2,030 5,372 Đồ thị 1 : Đường chuẩn Ketoprofen trong pha động. Phương trình hồi qui y = 1,085 x - 0,087 Trong đó: y là tỷ số diện tích pic giữa Ket và IS x là nồng độ Ketoprofen (mcg/ml ). Hệ số tương quan hồi qui : r = 0,9998. Xây dựng đường chuẩn trong huyết tương . Chuẩn bị một thang chuẩn trong huyết tương với các nồng độ ket là 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml; 0,8mcg/ml; 2mcg/ml; 5mcg/ml, nồng độ IS 25mcg/ml. Tiến hành xử lý mẫu như sơ đồ hình 1 và tiến hành chạy sắc ký với điều kiện như ở trang 21. Kết quả thu được biểu thị bằng diện tích pic, từ đó tính RKet/IS. Bảng 5 : Kết quả xây dựng đường chuẩn Ketoprofen trong huyết tương. Nồng độ ( mcg /ml ) 0,05 0,2 0,8 2 5 AKet 3882 14047 86292 232658 607150 AIS 105190 105131 105812 104177 106458 RKet/IS 0,037 0,134 0,815 2,233 5,730 Đồ thị 2 : Đường chuẩn định lượng Ketoprofen trong huyết tương . Phương trình hồi qui : y = 1,154x - 0,074 Trong đó : y là tỷ số diện tích pic giữa ketoprofen và IS x là nồng độ Ketoprofen ( mcg/ml ). Hệ số tương quan hồi qui : r= 0,9998 y + 0,074 Từ đó suy ra: x = 1,154 Như vậy, đường chuẩn của ket/ huyết tương có độ dốc lớn hơn (1,154) so với đường chuẩn của nó trong pha động (1,085), do đó đường chuẩn có xu hướng đi lên. Xác định tính chính xác của phương pháp. Lấy các mẫu huyết tương có chứa ketoprofen với các nồng độ 0,5 mcg/ml; 4mcg /ml và chất chuẩn nội có nồng độ 25 mcg /ml. Xử lý mẫu như sơ đồ hình 1 và tiến hành chạy sắc ký với các điều kiện như ở trang 21. Kết quả thu được biểu thị bằng diện tích pic, từ đó tính được tỷ số diện tích pic giữa ketoprofen và IS. C 0,5 mcg/ml 4mcg/ml AKet AIS RKet/IS AKet AIS RKet/IS 1 55794 119470 0,4659 484278 115522 4,192 2 61432 128838 0,4768 483315 116414 4,152 3 57239 118666 0,4723 475357 114211 4,162 4 57678 129152 0,4466 483012 115792 4,171 5 58622 125792 0,4660 482356 116534 4,139 6 64353 148740 0,4426 476235 115235 4,132 TB Phương sai RSD 0,4617 TB Phương sai RSD 4,158 0,0139 0,0219 3,016 0,528 Chúng tôi tiến hành xác định độ chính xác như trên ở một ngày phân tích khác. Kết quả thu được như sau: 0,5 mcg/ml 4mcg/ml TB Phương sai RSD 0,4922 TB Phương sai RSD 4,037 0,0123 0,023 2,5 0,581 Từ các kết quả thu được (trong cùng một ngày và giữa các ngày phân tích) để đánh giá độ lặp lại của phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương ở 2 nồng độ 0,5mcg/ml; 4mcg/ml với n = 6, cho thấy phương pháp có tính chính xác cao. Tính đúng của phương pháp: - Mẫu thử: huyết tương người sau khi uống viên nang ketoprofen 50 mg khoảng 90 phút, thêm IS 25mcg/ml. - Mẫu chuẩn: Ketoprofen chuẩn 0,8mcg/ml trong huyết tương, thêm IS 25 mcg/ml. - Mẫu chuẩn + thử: mẫu thử + ketoprofen chuẩn 0,8mcg/ml + IS 25mcg/ml. Xử lý các mẫu trên như sơ đồ hình 1. Tiến hành chạy sắc ký với các điều kiện như ở trang 21. Xác định tỷ số diện tích pic giữa ketoprofen và IS, ta có các sắc đồ sau: Hình 5: Mẫu trắng. Hình 6: Mẫu chuẩn trong pha động. Hình 7: Mẫu chuẩn trong huyết tương. Hình 8: Mẫu thực. Hình 5 Hình 6 Hình 7 Hình 8 Kết quả thu được biểu thị bằng tỷ số diện tích pic giữa Ketoprofen và chất nội chuẩn. Mẫu Chuẩn Thử Thử + Chuẩn 1 0,704 1,116 1,867 2 0,684 1,217 1,845 3 0,712 1,119 1,905 4 0,728 1,136 1,83 5 0,685 1,122 1,901 Trung bình 0,7032 1,142 1,8696 RSD 2,5506 3,372 1,778 Bảng 7 : Kết quả xác định tính đúng của phương pháp. % Tìm lại = Nhận xét: Như vậy, lượng ketoprofen chuẩn tìm lại là 103,5%, RSD = 1,778, n = 5 cho thấy phương pháp định lượng này có tính đúng đảm bảo cho phép định lượng ketoprofen trong huyết tương. Kết luận: Với tính đúng đảm bảo, tính chính xác tốt và sự tuyến tính chặt chẽ giữa tỷ số diện tích pic ketoprofen / IS và nồng độ ketoprofen trong khoảng khảo sát, cho thấy phương pháp này có thể áp dụng để định lượng ketoprofen trong huyết tương. * ÁP DỤNG Áp dụng định lượng mẫu thực: một người tình nguyện khoẻ mạnh, uống1 viên nang 50 mg, sau 90 phút lấy máu đem ly tâm để lấy huyết tương. Xử lý mẫu như sơ đồ hình 1, tiến hành chạy sắc ký thu được sắc đồ hình 9. Thẩm định phương pháp dùng Detector UV Diod arrays (Phòng vật lý- Viện kiểm nghiệm - Bộ Y Tế) để định lượng ketoprofen trong mẫu thực Chọn 5 điểm: chân phía trước của pic, 1/2 phía trước của pic, đỉnh pic, 1/2 phía sau của pic, chân phía sau của pic của Ketoprofen. Quét phổ hấp thụ. Song song làm mẫu chuẩn Ketoprofen trong pha động, chồng phổ hấp thụ của mẫu thực và mẫu chuẩn ở các điểm tương ứng nhau. Ở các điểm đều thu được hệ số Match ³ 995. Hình 10: Chồng phổ hấp thụ của mẫu thực và mẫu chuẩn ở đỉnh pic. Hình 9 Hình 10 Kết luận: với điều kiện xử lý mẫu đã chọn và chương trình sắc ký đã xây dựng cho thấy phương pháp này hoàn toàn thích hợp để định lượng Ketoprofen trong huyết tương. Theo dõi độ ổn định của ket trong mẫu thử theo thời gian bảo quản. Mẫu huyết tương người sau khi uống thuốc 90 phút, được bảo quản ở -300C, sau thời gian 1, 2, 3 tháng lấy ra đem xử lý mẫu như sơ đồ hình 1 và tiến hành chạy sắc ký với các điều kiện như ở trang 21. Tính kết quả theo phương pháp đường chuẩn được xây dựng trong từng ngày phân tích. Kết quả thu được như sau: STT Thời gian bảo quản (tháng) Nồng độ (mcg/ml) 1 0 4,90 2 1 4,89 3 2 4.92 4 3 4,94 Kết luận: Sau 3 tháng bảo quản mẫu thử có chứa ketoprofen ở –300C, thấy nồng độ của ketoprofen trong huyết tương vẫn ổn định. PHẦN 3:KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Trong đề tài này chúng tôi đã thực hiện được một số công việc sau: 1. Đã khảo sát 5 dung môi chiết ketoprofen trong huyết tương tìm được ACN có khả năng chiết tốt nhất, cho hiệu xuất chiết cao (91,2%). Xây dựng qui trình xử lý mẫu thích hợp để chiết ketoprofen trong huyết tương, thời gian chiết ngắn (60phút), độ lặp lại tốt (RSD = 1,934). Khảo sát điều kiện sắc ký: Cột, pha động, bước sóng. - Cột: khảo sát 3 loại pha tĩnh C8, C18 , phenyl, cho thấy cột C18 là phù hợp nhất. - Pha động: Khảo sát 4 hệ dung môi pha động và chọn được một hệ cho kết quả khả quan. Khảo sát 9 lượt với hệ vừa tìm được với tỷ lệ các thành phần và lưu lượng dòng khác nhau để chọn được điều kiện hợp lý ( tách khỏi tạp và chất chuẩn nội, thời gian làm mẫu không quá lâu ) để định lượng ketoprofen trong huyết tương. - Bước sóng: Quét phổ hấp phụ xác định được lmax = 253nm. Từ đó chọn được điều kiện sắc ký là: Cột: Nucleosil C18. Pha động: ACN: AcOH: Tri: H2O ( 50: 1: 0,3: 48,7 ). Bước sóng: 253nm. Lưu lượng dòng: 0,85 ml/phút. 3. Xây dựng được phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương bằng HPLC với IS là acid 2- ( 4- isobutylphenyl )propionic. - Đường chuẩn trong huyết tương dược xây dựng từ 0,05 - 5 mcg/ml với IS là acid 2- ( 4- isobutylphenyl )propionic 25mcg/ml cho hệ số r = 0,998. - Tính chính xác: xác định độ lặp lại trong cùng một ngày và giữa các ngày ở 2 nồng độ 0,5 mcg/ml; 4mcg/ml cho kết quả tốt RSD ~ 2,5 ( nồng độ 0,5 mcg/ml ), RSD ~ 0,5 ( nồng độ 4mcg/ml ), n =6. - Tính đúng: Dùng phương pháp thêm cho khả năng tìm lại ketoprofen cho vào là 103,5%. 4. Áp dụng: Dùng phương pháp đã xây dựng để định lượng ketoprofen trong huyết tương người tình nguyện sau khi uống viên nang 50 mg cho kết quả định lượng đáng tin cậy ( đã được kiểm tra bằng HPLC gắn với detector Diod array ). - Đã theo dõi độ ổn định của mẫu thử trong điều kiên bảo quản ở - 300C trong 1, 2, 3 tháng. Đề tài này được thực hiện trong một thời gian ngắn, do đó chưa định lượng được nhiều mẫu thử. Trong thời gian tới, nếu kinh phí cho phép có thể sử dụng phương pháp này để nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của ketoprofen trong các dạng bào chế. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ y tế ( 2002 ) - Dược điển Việt Nam, Nhà xuất bản y học Hà nội. Phạm Gia Huệ, Trần Tử An ( 1998 ) - Hoá phân tích 2, chế bản và in tại trung tâm thông tin Đại học dược Hà Nội. Phạm Luận ( 1989 ) - GT cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng cao áp - HPLC, Trường đại học Tổng hợp Hà nội. Tào Duy Cần ( 1999 ) - Tra cứu và sử dụng thuốc và biệt dược nước ngoài, quyển 1. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Từ điển bách khoa dược học ( 1999 ). Nhà xuất bản từ điển bách khoa Hà nội. Vidal. Công ty dịch vụ y tế tổng hợp Q4 TPHCM - TCCS. XNLD Phone - Doulenc Poren - TCCS. AHSF Drug Fuformation. BP 93,98. Chi Yin Wong, Da Peng Wang - Drug development and industrial; Pharmany, 20, 1994, page 1077 - 1078. The transdermal Penetration of a series of Nonsteroidal Ation flammatory Drugs - Journal of pharmaceutical Sciences, 1997, Số 86, trang 503. John Mc Ewen, Masimo De Luca,Alessandro casini,...(1998 ) - the Effect of Foood and Antacid on the Bioavailability of Dexketoprrofen Trometamol - JournalClinical Pharmacology, page 42. J.R.Veraat et al. - At line Solid- phase extraction for capillary electrophoresis application to negatively charged Solutes (1998 ) - Journal of Chromatography B, No 719, page 199 -208. Martindal: The complete drug reference 32th Edi, 1999. N. Tarimci, D. Ermis (1997) - Sustained release characteristics and pharmacokinetic parameters of ketoprofen suppositories using chitosan, - International Journal of Pharmaceutics, No 147, page 72,73. S. Heitmeier, G. Blaschke (1999) - Direct assay of nonopiod analyesic and their metabolites in human urine by capillary ellectrophoresis and capillary electrophoresis - mass spectrometry- Journal of Chromatography B, No 721, page 124. USP 24.