Đề tài Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính enzyme proteaza kiềm

i LỜI CẢM ƠN Sau gần 3 tháng thực tập tại phòng Vi sinh vật – Viện Sinh học Nông Nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, dưới sự hướng dẫn của PGS – TS. Lương Đức Phẩm nên tôi đã hoàn thành cuốn luận văn này. Qua đây tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS – TS. Lương Đức Phẩm người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm và tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình thực tập, cùng các anh chị phòng Vi sinh vật, những người đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ của mình. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Nha Trang, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học đã tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong những năm học vừa qua. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, chị đang công tác tại Viện Sinh học Nông Nghiệp, trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội và các bạn cùng thực tập đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình cùng toàn thể bạn bè thân thiết, những người đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu. Hà Nội, tháng 6 – 2009 Sinh viên Nguyễn Thị Phương Như ii MỤC LỤC Trang Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................3 1.1. Đại cương về Bacillus ...............................................................................4 1.2. Protease...................................................................................................10 1.2.1. Tính chất, đặc điểm của protease ......................................................10 1.2.2. Ứng dụng của protease ....................................................................12 1.2.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng protease trong sản xuất ở Việt Nam ...........................................................................................................15 Phần II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................16 2.1 Đối tượng – Vật liệu.................................................................................17 2.1.1. Đối tượng .........................................................................................17 2.1.2. Vật liệu.............................................................................................17 2.1.2.1.Thiết bị ...........................................................................................17 2.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật ........................................................18 2.1.3.1. Môi trường NA (dùng để phân lập, giữ giống và nuôi cấy) (g/l):........................................................................................................18 2.1.3.2. Môi trường thử hoạt tính amylase, protease................................18 2.1.3.3. Cách chuẩn bị môi trường ..........................................................19 2.2. Các phương pháp nghiên cứu ..................................................................19 2.2.1. Phương pháp phân lập ......................................................................19 2.2.2. Phương pháp giữ giống cấy chuyển ..................................................19 2.2.3. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn .....20 2.2.3.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc .................................20 2.2.3.2. Phương pháp làm tiêu bản tế bào sống .......................................20 2.2.3.3. Phương pháp nhuộm Gram.........................................................21 2.2.3.4. Phương pháp xác định sự hình thành bào tử ...............................22 2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính Catalase..........................................22 iii 2.2.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang (OD620nm ) ...............................................................................................22 2.2.6. Nghiên cứu khả năng thủy phân tinh bột, protein..............................23 2.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nguyên liệu khác nhau lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của các chủng Bs, Bm, BM.............................................................................................................24 2.2.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan lên khả năng sinh trưởng của các chủng Bs, Bm, BM .............................................................25 Phần III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................26 3.1. Phân lập chủng Bacillus ..........................................................................27 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc...............................................................27 3.3. Đặc điểm hình thái tế bào ....................................................................28 3.4. Nghiên cứu hoạt tính Catalase .............................................................30 3.5. Nghiên cứu khả năng sinh enzym thuỷ phân tinh bột, protein của ba chủng Bs, Bm và BM.....................................................................................31 3.6. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của các chủng Bs, Bm và BM trên môi trường không có chất cảm ứng ............................................................33 3.7 Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzmy amylaza của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan ........................................................................................................34 3.7.1. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan...................................34 3.7.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan ..............................35 3.8 Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzmy proteaza của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein...............37 3.8.1. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein ..............................................37 iv 3.8.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme proteaza của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein .........................39 3.9. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzyme của các chủng Bs, Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO3 .................................................41 3.9.1. Nghiên cứu nuôi vi khuẩn trong môi trường có CaCO3 thu amylaza ......................................................................................................41 3.9.2. Nghiên cứu nuôi vi khuẩn trong môi trường có CaCO3 thu proteaza......................................................................................................44 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan.................................................47 3.11. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng và phát triển của ba chủng nghiên cứu...................................................................................50 3.12. Nghiên cứu sử dụng bột đậu tương làm nguồn nguyên liệu thay thế ..51 3.13. Nghiên cứu đồ thị tổng hợp động học của quá trình lên men..............54 Phần IV KẾT LUẬN .......................................................................................56 TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................58 v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1: Phân lập khuẩn lạc chủng Bs .........................................................................27 Hình 2: Phân lập khuẩn lạc chủng Bm........................................................................28 Hình 3: Phân lập khuẩn lạc chủng BM.......................................................................28 Hình 4: Hình thái tế bào chủng Bs..............................................................................29 Hình 5: Hình thái tế bào của chủng BM .....................................................................29 Hình 6: Hình thái tế bào của chủng Bm......................................................................30 Hình 7: Thử hoạt tính phân giải protease và amylase của 3 chủng Bs, Bm và BM ....32 Hình 8: Hoạt tính enzyme amylase của chủng Bs trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan..................................................................................................................36 Hình 9: Hoạt tính enzyme amylase của chủng Bm trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan..................................................................................................................36 Hình 10: Hoạt tính enzyme amylase của chủng BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan..............................................................................................................37 Hình 11: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng Bs trên môi trường có chất cảm ứng là cazein..........................................................................................................................39 Hình 12: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng Bm trên môi trường có chất cảm ứng là cazein......................................................................................................................40 Hình 13: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein......................................................................................................................40 Hình 14: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của chủng Bs.....................................................................................................................42 Hình 15: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của chủng Bm ...................................................................................................................42 Hình 16: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của chủng BM...................................................................................................................43 Hình 17: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của chủng Bs.....................................................................................................................44 vi Hình 18: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của chủng Bm ...................................................................................................................45 Hình 19: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của chủng BM...................................................................................................................45 Hình 20: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme amylaza của 3 chủng Bs, Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO3.......................................................49 Hình 21: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme proteaza của 3 chủng Bs, Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO3.......................................................50 Hình 22: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng Bs, Bm và BM.........................................................................................................................51 Hình 23: Đồ thị biến đổi pH, hoạt độ enzyme proteaza và mật độ tế bào của Bs trong môi trường bột đậu tương có CaCO3 ..........................................................................55 vii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1: Đường kính phân giải của các enzym và các chủng sinh ra:...............31 Bảng 3.2: Sự sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, và BM trên môi trường không có chất cảm ứng .....................................................................................................33 Bảng 3.3. Sự sinh trưởng của chủng Bs trên môi trường có tinh bột tan.............34 Bảng 3.4. Sự sinh trưởng của chủng Bm trên môi trường có tinh bột tan ...........34 Bảng 3.5. Sự sinh trưởng của chủng BM trên môi trường có tinh bột tan...........35 Bảng 3.6. Sự sinh trưởng của chủng Bs trên môi trường có cazein.....................38 Bảng 3.7. Sự sinh trưởng của chủng Bm trên môi trường có cazein ...................38 Bảng 3.8. Sự sinh trưởng của chủng BM trên môi trường có cazein...................38 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sự sinh trưởng trên môi ..........................43 trường có tinh bột của 3 chủng Bs, Bm và BM ..................................................43 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sự sinh trưởng trên môi trường có cazein của 3 chủng Bs, Bm và BM ...............................................................................46 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên khả năng sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, BM ............................................................................................................48 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của độ hiếu khí tới khả năng sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO3 .....................................................48 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của bột đậu tương lên khả năng sinh proteaza, amylaza của ba chủng Bs, Bm, BM .................................................................................52 Bảng 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ CaCO3 đến khả năng sinh amylaza, proteaza trên môi trường có bột đậu tương ......................................................................53 1 MỞ ĐẦU Vi sinh vật trong tự nhiên rất phong phú và đa dạng. Chúng ở xung quanh ta: trong đất, trong nước, không khí thậm chí cả trong cơ thể con người. Chúng có thể gây cho ta cả những bất lợi khôn lường như những bệnh lao, dịch hạch, dịch tả, đại dịch cúm ở người và gia cầm, lở mồm, long móng ở bò lợn... nhưng chúng cũng có thể đem lại cho chúng ta nguồn lợi vô cùng to lớn nếu ta biết, hiểu chúng và biết sử dụng chúng vào mục đích sẽ giúp cho cuộc sống con người tốt đẹp hơn. Từ thời xa xưa, con người đã biết ứng dụng những hoạt tính có lợi của vi sinh vật phục vụ cho đời sống của mình như tạo ra các loại rượu quý nhờ quá trình lên men của vi sinh vật, những bài thuốc chữa bệnh từ vi sinh vật... Ngày nay chúng ta đang sống ở thế kỷ 21, thế kỷ của khoa học kỹ thuật thì công nghệ sinh học và đặc biệt là công nghệ vi sinh càng chứng tỏ ưu thế của mình. Hiện nay đã có rất nhiều chất có hoạt tính sinh học khác nhau đã được tổng hợp từ vi sinh vật đã được đưa vào sản xuất ở mức độ công nghiệp để phục vụ cho nghiên cứu, công - nông nghiệp, y học và đời sống của con người. Các chủng vi khuẩn như: Bacillus, Lactobacillus… đã và đang được sử dụng trong các chế phẩm sinh học để phục vụ cho các ngành sản xuất như: rượu, bia, công nghiệp dệt, thuộc da, y học, bổ sung vào thức ăn gia súc, thức ăn trong nuôi trồng thủy sản, phân hủy thức ăn thừa của tôm, phế thải hữu cơ làm sạch môi trường nuôi trồng thủy sản... là nhờ khả năng sinh enzyme thủy phân amylaza, proteaza, xenlulaza của chúng. 2 Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: ”Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính enzyme proteaza kiềm”. Với các nội dung sau: 1. Phân lập từ đất vườn qua trung gian là cỏ khô và khoai tây để chọn các chủng Bacillus. 2. Nghiên cứu các đặc điểm về hình thái tế bào khuẩn lạc, nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng đã được tuyển chọn. 3. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối có hoạt tính cao. Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật của Viện Sinh học Nông nghiệp thuộc trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 3 Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Đại cương về Bacillus Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương. Thuộc chi Bacillaceae, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động bằng tiêm mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa,... nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N [ 10 ] Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,... Một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol; một vài loài như Bacillus megaterium thì không cần chất hữu cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid amin, vitamin B. Hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 - 450C, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 650C [11]. Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 – 6 như Bacillus acidocaldrius. Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase…), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường, … Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên: 5 Bacillus subtilis Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Robert Koch tên là Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 [13] . Bacillus subtilis được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiều trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô. Chúng phân hủy pectin và polysaccarit ở mô thực vật và góp phần gây nên các nốt trên củ khoai tây bị u. Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng. Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật. Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm có tính axit ở điều kiện tối ưu. Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì. Phần lớn thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu Bacillus subtilis [13]. Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước ( 3 – 5) x 0,6 m. Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi [13]. Khuẩn lạc khô, vô màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch. Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 360C – 500C, tối đa khoảng 600C. Là loại ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao. Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6m – 0,9m. Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng phát tán rộng rãi. Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển của vi khuẩn. Chúng không có khả năng trao đổi chất nên 6 có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200 – 300 năm [1]. Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những đặc tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides, acid amin, subtilisin [14]. Ngoài ra nhờ khả năng bám dính proton lên bề mặt mà B. subtilis có thể loại bỏ được chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV) [12]. Đặc biệt, B.subtilis được sử dụng trong lên men Natto của Nhật – một thực phẩm chức năng rất bổ dưỡng cho sức khỏe [15]. Bacillus megaterium Megaterium có nghĩa là “ con thú lớn” [13]. Tế bào của nó khá lớn khoảng gấp hơn 2 lần tế bào của Bacillus subtilis, chiều ngang (1,2 – 1,5)m có thể đến 2 m, dài từ 3 – 12 m, ở các ống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, tròn hơn, đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại. Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dinh dưỡng dự trữ (hạt mỡ, glycogen) [2]. Bào tử lớn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 x (0,7-1)m, bào tử lớn nhất có đường kính từ 1,2 đến 1,5 m [13]. Chúng nằm lệch tâm thường theo chiều ngang hoặc xiên của tế bào. Khuẩn lạc tròn đều không thùy, không nếp, mép tròn đều hoặc hơi lượn sóng, trông giống giọt bạch lạp, lồi nhẵn, nhưng thường có vòng viền quanh đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa hay đục. Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần thêm bất kỳ một yếu tố sinh trưởng nào. Bacillus megaterium cũng sản sinh ra các enzyme tương tự B.subtilis, do đó nó cũng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp. 7 Bacillus mensentericus Bacillus mensentericus còn được gọi là trực khuẩn khoai tây do nó có mặt chủ yếu trên khoai tây. Trực khuẩn gần giống Bacillus subtilis, mảnh dài hoặc ngắn ( 3- 10 ) x ( 0,5 – 0,6 ) m, có thể đứng riêng rẽ hoặc chuỗi dài. Bào từ hình bầu dục và kéo dài 0,5 – 0,9 m, nằm ở vị trí bất kỳ trong tế bào, tế bào Bacillus mensentericus không bị phình to khi mang bào tử. Khuẩn lạc bám chặt vào môi trường thạch, có khi dính vào môi trường, mỏng, nhăn nheo, xám nhạt – trắng, có thể màu Crem, vàng nâu, hồng hoặc đen như Bacillus mensentericus niger ( đen ), Bacillus mensentericus ruber (hồng). Bacillus mensentericus sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 36 – 450C tối đa 50 – 550C. pH = 4,5 – 5 thì nó ngừng phát triển. Bacillus mensentericus có hoạt tính amylase và protease lớn hơn hẳn Bacillus subtilis, nhưng lên men đường lại kém hơn. Hai loại trực khuẩn này rất phổ biến trong tự nhiên, chúng lây nhiễm làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các thực phẩm có chứa nitơ và các sản phẩm giàu đường ( bánh kẹo, hoa quả) đây cũng là loại được ứng dụng vào ngành công nghệ sản xuất enzyme protease, amylase… Ngoài ra, nó còn sinh ra một loại hợp chất có hoạt tính kháng với một số vi khuẩn khác ( như Vibrio) gọi là bacterioxin, ở Bacillus subtilis gọi là subtilin hay Irutin A, B Bacillus cereus Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không khí… Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng để 8 sản xuất kháng sinh, giống Bacillus này có độc tính, gây ngộ độc thực phẩm [13]. Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 – 1,5) x (3 – 5)m, có khi dài hơn, chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2 – 1,5)m nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào [2]. Khuẩn lạc của Bacillus cereus phẳng, khá khuyếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm [3] . Bacillus pumilus Bào tử phát tán rộng khắp mọi nơi, thường B.pumilus có mặt trong đất nhiều hơn subtilis. Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới. Tế bào của nó gần giống tế bào B.subtilis. Bacillus polymyxa Bacillus polymyxa có khuẩn lạc vô màu, phẳng hoặc lồi , trơn, nhày, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy. Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6 – 1) x (2 – 7)m, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, chuỗi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ phồng lên hình quả chanh [3]. Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao. Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng (1,7 – 2,6)m, nằm giữa tế bào [13]. Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây. Chúng còn có khả năng cố định đạm. Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kem và những môi trường có tính axit yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược. 9 Bacillus brevis Người ta thường tìm thấy và phân lập chúng từ đất và thực phẩm. Khuẩn lạc của chúng màu trắng, đôi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng lấp lánh, mép răng cưa giống dạng mỡ đặc. Bacillus brevis là trực khuẩn kích thước (0,7 – 1) x (3 – 5)m. Chúng thường đứng riêng rẽ. Bào tử hình bầu dục, có kích cỡ ( 0,8 – 1) m, nằm cuối tế bào làm cho đầu tế bào hơi phồng to lên [3]. Về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus brevis yêu cầu một hỗn hợp axit amin cho sinh trưởng và phát triển, không cần bổ sung vitamin [13] . Bacillus simplex Khuẩn lạc giống khuẩn lạc B.cereus, phẳng, khá khuyếch tán, với bề mặt hơi xù xì (dạng bột hoặc hạt nhỏ), hơi lõm, màu đục, mép lồi lõm. Đặc biệt khuẩn lạc của Bacillus simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi trường [3]. Tế bào của nó nhỏ bé, có kích thước (2 – 5) x 0,6m, thường đứng riêng rẽ không kết thành chuỗi. Bào tử hình bầu dục, có kích thước 0,6 x 0,9 m, nằm lệch tâm. Bacillus lincheniformis Chúng được áp dụng trong việc sản xuất loại vỏ bao poly D – glutamate và phẩm đỏ cùng với nhiều chủng khác. Bào tử của chúng phát tán chủ yếu trong đất. Chúng sinh trưởng phát triển trên các loại thực phẩm. Đặc biệt chúng có khả năng sản xuất ra bacitracin, một kháng sinh có ích trong y học, nên chúng được ứng dụng phổ biến trong công nghiệp dược [13]. 10 1.2. Protease 1.2.1. Tính chất, đặc điểm của protease Protease là enzyme xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptid [ - CO- NH-] giữa các loại acid amin trong phân tử protein (hay các nhóm polypeptide). Sản phẩm thủy phân là các acid amin, sản phẩm trung gian là các peptide có mạch dài ngắn khác nhau và peptone – sản phẩm thủy phân không hoàn toàn của protein H2N – CH – CO – NH – CH – CO -…- NH – CH – COOH H2N – CH – COOH + H2N – CH – COOH + … + H2N – CH – COOH Protease là một nhóm enzyme phân giải protein ( gồm proteinase, peptidase, desaminase,…) mà phần lớn được tế bào tiết ra ngoài và hoạt động ở bên ngoài tế bào. Protease có chức năng sinh học rất đa dạng, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa quá trình trao đổi chất ở sinh vật sống. Ngoài chức năng xúc tác cho phản ứng thủy phân protein thành acid amin và các hợp chất có phân tử lượng thấp mà các tế bào có thể dễ dàng hấp thu, protease còn có vai trò quyết định trong thiết lập, duy trì sự cân bằng giữa tổng hợp và phân giải protein. Bên cạnh đó chúng còn tham gia vào quá trình hình thành và nảy mầm bào tử của vi sinh vật, quá trình đông tụ máu, điều chỉnh huyết áp, biến hình các enzyme và điều hòa biểu hiện gen [4]. So với protease động vật và protease thực vật thì protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng H2O R1 Rx R2 R2 R1 Rx 11 nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. Người ta cũng phân loại protease theo vùng pH hoạt động tối thích: protease acid, trung tính và kiềm tính. Tuy nhiên sự phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng không thật sự chính xác vì pH hoạt động tối thích của mỗi enzyme còn phụ thuộc vào bản chất cơ chất và nhiều yếu tố khác nữa [7]. Vi khuẩn B.subtilis là một trong những nhóm vi sinh vật gây thối rữa tạo nhiều protease ngoại bào và đây là một enzyme protease kiềm (protease serin). Enzyme này có pH tối ưu trong vùng kiềm (9 – 11) và chứa một nhóm serin quan trọng ở trung tâm hoạt động. *Sự phân giải protein ( quá trình thối rữa ) Khác với lên men, cơ chất của quá trình thối rữa là protein. Protein là thành phần quan trọng của xác động thực vật và vi sinh vật. Protein thường chứa khoảng 15 – 17 % Nitơ (tính theo chất khô). Nếu như tổng lượng cacbon trong cơ thể sinh vật sống trên mặt đất là khoảng 7 tỷ tấn thì tổng lượng nitơ sinh ra cũng tới 10 – 25 tỷ tấn. Trong lớp đất sâu 30cm bao quanh trái đất và người ta còn thấy thường xuyên có khoảng 3 – 7,5 tỷ tấn nitơ mà phần lớn là tồn tại trong các hợp chất hữu cơ chứa nitơ. Sự phân giải các hợp chất chứa nitơ có ý nghĩa rất lớn đối với nông nghiệp và đối với vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Người ta gọi quá trình này là quá trình amon hóa. Muốn phân giải protein cũng như đối với các hợp chất cao phân tử khác, đầu tiên vi sinh vật phải tiết ra các enzyme phân giải protein ngoại bào và làm chuyển hóa protein thành các hợp chất có phân tử lượng nhỏ hơn (các polypeptid và các olygopeptid). Các chất này hoặc tiếp tục được phân hủy thành axitamin nhờ các peptidase ngoại bào, hoặc được xâm nhập 12 ngay vào tế bào vi sinh vật sau đó mới chuyển hóa thành axit amin. Một phần các axit amin này được các vi sinh vật sử dụng trong quá trình tổng hợp protein của chúng, một phần khác được tiếp tục phân giải theo những con đường khác để sinh ra NH3, CO2 và những sản phẩm trung gian khác. Những vi sinh vật không có khả năng sinh ra những enzyme phân giải protease ngoại bào rõ ràng là không có khả năng đồng hóa được các loại protein thiên nhiên. Chúng chỉ có thể sử dụng các sản phẩm thủy phân của protease (polypeptide, oligopeptid, axit amin) [5]. Các loài thuộc giống Bacillus (B.subtilis, B.mesentericus, B.megaterium…) có khả năng amon các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ. Chúng là những vi sinh vật đầu tiên tham gia vào quá trình phân cắt các protein để tạo thành những chất có phân tử lượng thấp hơn cho các vi sinh vật khác dễ sử dụng. 1.2.2. Ứng dụng của protease Trong khi cả protease từ động vật, từ thực vật được nghiên cứu và ứng dụng từ khá lâu trong các ngành công nghiệp sản xuất phomat, thuộc da, làm bánh mỳ, làm trong bia tươi, thủy phân các protein, làm mềm thịt… thì protease từ vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu từ 1950, mặc dù từ 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng sinh protease từ xạ khuẩn [6]. Do vậy, ngày nay protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược, nông nghiệp…  Ứng dụng trong xử lý nước thải và bảo vệ môi trường Protease đã được sử dụng dưới dạng chế phẩm thô để xử lý các chất protein tồn đọng trong môi trường. Vi sinh vật có khả năng sinh protease cũng được ứng dụng trong lĩnh vực phân hủy sinh học.  Trong công nghiệp thực phẩm 13 Trong sản xuất thịt, protease được sử dụng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả là làm cho thịt có độ mềm thích hợp và tăng hương vị thịt sau chế biến. Phương pháp làm mềm thịt nhờ tác dụng của protease cho phép nâng cao chất lượng thịt đưa vào chế biến, làm tăng tỷ lệ thịt có thể đưa vào sản xuất và rút ngắn thời gian chín của thịt nhiều lần. Người ta cũng dùng protease để sản xuất dịch đạm thủy phân từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, da… Người ta sử dụng dịch đạm thủy phân làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và bổ sung vào thức ăn gia súc. Dùng protease để thủy phân thường ít bị hao hụt axit amin như khi dùng phương pháp hóa học. Trong công nghiệp sữa, protease được dùng để sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Để làm đông tụ sữa có thể dùng rennin, pepxin hoặc một số protease vi sinh vật có hoạt tính làm đông tụ sữa được tách từ nấm mốc và vi khuẩn. Trong số các enzyme này, rennin là enzyme có giá trị đặc biệt, cho phép thu được sản phẩm có chất lượng cao nhất còn các protease vi sinh vật thì ngoài khả năng làm đông tụ sữa còn có khả năng thủy phân sâu sắc cazein, gây ảnh hưởng xấu đến mùi vị của phomat. Vì vậy người ta cố gắng tìm ra những chủng vi sinh vật sinh protease có đặc tính đông tụ sữa tương tự như rennin hoặc thay thế một phần rennin ( 25 – 50 %) [7] Trong công nghiệp nước giải khát, protease được sử dụng để làm trong bia, trong nước hoa quả.  Trong sản xuất các chất tẩy rửa và xà phòng Xà phòng có bổ sung protease đang chiếm lĩnh thị trường: “xà phòng sinh học”. Tuy tỷ lệ bổ sung protease vào xà phòng rất thấp (1g/kg) nhưng hàng năm trên thế giới đã sử dụng tới 50.000 – 60.000 tấn protease trong 14 công nghiệp xà phòng, chất tẩy [A6]. Hiện nay, ở Châu Âu sử dụng 80 – 85 % chất tẩy rửa có enzyme.  Trong nông nghiệp Protease được sử dụng để xử lý thức ăn thô chuyển hóa thành dạng dễ hấp thụ, bổ sung vào thức ăn gia súc.  Trong công nghiệp da Protease được dùng trong công nghiệp làm mềm da, làm sạch, tách lông,… nhờ sự thủy phân một phần protein của da. Chúng ta đã biết, chất quan trọng của da là collagen. Phân tử của nó gồm những acid amin kết hợp với nhau thành mạch dài vì vậy làm cho da bị cứng. Dưới tác dụng của protease các chất nhờn bị tách ra và một liên kết trong sợi collagen bị phá hủy. Kết quả của sự làm mềm da là loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da [8]. Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease khu trú trong cơ quan tiến hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa ra các protease tách từ vi khuẩn (là chủ yếu) vào công nghiệp da đã đem lại nhiều kết quả và dần chiếm một vị trí quan trọng.  Trong sản xuất tơ tằm Quá trình làm tơ tự nhiên tương đối phức tạp và khó khăn. Chúng ta đã biết tơ là sợi ngoại bào được nhả ra bởi cặp tuyến trùng của con tằm. Sợi tơ gồm hai sợi fibroin sơ cấp dính lại với nhau nhờ lớp vỏ bằng xerixin. Sau khi tách hết xerixin thì sẽ được sợi fibroin tinh khiết. Sợi thu được khi kéo ở kén ra thường có chứa 30% xerixin. Muốn tách xerixin thì phải nấu tơ tằm trong dung dịch xà phòng trong thời gian từ 1,5 – 2 giờ. Chỉ sau khi có sự gia công này tơ mới bắt đầu kéo chỉ. Một lượng nhỏ xerixin nằm lại trên lụa làm giảm độ đàn hồi của lụa, làm cho lụa bắt màu không đồng đều 15 và khó trang trí trên lụa. Người ta đã sử dụng chế phẩm protease từ nấm mốc, vi khuẩn để tách lượng xerixin còn lại này [8]. Ngoài ra, protease còn được ứng dụng trong công nghiệp mỹ phẩm, y học:  Trong hương phẩm và mỹ phẩm: dưới tác dụng của protease trong kem, các biểu b́ của da đã chết được tách ra, da non sẽ xuất hiện trên bề mặt, đồng thời sự phát triển lông (tóc) cũng chậm lại.  Trong công nghiệp y học: các chế phẩm protease cũng được sử dụng để sản xuất các môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein dùng trong nuôi cấy vi khuẩn và các vi sinh vật khác. Chẳng hạn, môi trường dinh dưỡng để nuôi các vi sinh vật sản xuất ra các kháng sinh kháng độc. Dĩ nhiên, các protein có trong môi trường phải ở dạng dễ đồng hóa đối với vi sinh vật. Do đó, phải thủy phân sơ bộ các protein bằng protease để cô đặc và tinh khiết các huyết thanh kháng độc để chữa bệnh (huyết thanh kháng độc) [8]. 1.2.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng protease trong sản xuất ở Việt Nam Ở Việt Nam protease chịu kiềm cũng đang được nghiên cứu ở Viện công nghệ sinh học thuộc trung tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên (Đại Học Quốc Gia Hà Nội), Đại Học Bách Khoa Hà Nội, viện Công nghệ Thực Phẩm, viện Sinh Học Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh và một số trường Đại Học, Viên nghiên cứu khác. Nhiều ứng dụng của protease đã được ứng dụng trong các lĩnh vực và ngành nghề sản xuất ở Việt Nam như: Trong các ngành nghề công nghiệp rượu, bia, sữa...Trong sản xuất chất tẩy rửa, trong công nghiệp thuộc da và trong sản xuất nước tương, nước mắm... 16 Phần II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng – Vật liệu 2.1.1. Đối tượng Các chủng được phân lập từ đất vườn, cỏ khô quanh Viện Sinh học Nông nghiệp trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, và khoai tây. 2.1.2. Vật liệu 2.1.2.1.Thiết bị - Tủ cấy vô trùng - Bình tam giác - Cân điện tử - Bếp ga - Kính hiển vi quang học - Máy lắc - Tủ ấm - Máy đo OD - Tủ sấy - Tủ lạnh - Nồi hấp thanh trùng - Máy đo pH - Bình trụ - Các dụng cụ khác: Pipet, đầu típ, nồi, đũa thủy tinh, đĩa petri, lam kính,… 2.1.2.2. Hóa chất Các hóa chất phòng Vi sinh vật – Viện sinh học Nông nghiệp – Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội NaCl Cao men Agar Glucose KI Cazein Iốt Tinh bột tan Fucshin HgCl2 Cao thịt Tím gential Pepton Cồn 960 18 2.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 2.1.3.1. Môi trường NA (dùng để phân lập, giữ giống và nuôi cấy) (g/l): Pepton 10 Cao thịt 5 NaCl 5 Glucose 10 Agar 20 Nước cất 1000 pH = 5,5 – 7,8 Môi trường lỏng nuôi Bacillus không cho agar 2.1.3.2. Môi trường thử hoạt tính amylase, protease Môi trường cơ sở: (g/l) Pepton 5 Cao men 2,5 Nước 1000ml pH = 5,5 – 7,8 Enzyme cần xác định Thành phần môi trường Amylase Môi trường cơ sở + 1% tinh bột tan Protease Môi trường cơ sở + 1% cazein Tất cả các môi trường đều được hấp ở 0,8 – 1 atm trong 30 phút Pha chế thuốc thử: + Pha thuốc thử Lugol: 1g I2 + 2g KI cho vào 100 ml nước cất, khuấy cho tan hết trong phòng tối, sau đó đổ vào lọ tối màu, để nơi thiếu ánh sáng và thoáng mát. 19 2.1.3.3. Cách chuẩn bị môi trường Các thành phần môi trường được hòa tan vào nước cất. Đối với môi trường có agar cần được đun sôi quấy đều sau đó đem thanh trùng. Môi trường được thanh trùng trong điều kiện: áp suất 1 atm ở nhiệt độ 1210C trong 30 phút. 2.2. Các phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân lập Lấy mẫu đất, đặc biệt ở những nơi có nhiều mùn, nhiều mẫu động thực vật thối giữa, hòa nước thành dịch nước đất (lấy một ít đất khoảng 10g và 90ml nước vô trùng cho vào bình tam giác 250ml). Dùng kéo cắt ngắn cỏ khô hơi mục khoảng 1cm, cho vào bình tam giác, cho dịch đất xâm xấp cỏ khô, có thể rắc thêm một ít bột CaCO3 lên bề mặt cỏ. Gia nhiệt tới 850C, giữ ở nhiệt độ này trong 10 – 15 phút. Các bình tam giác sau khi gia nhiệt ở 850C được nút bông và để vào tủ ấm ở nhiệt độ 320C trong 2 – 3 ngày đêm. Theo dõi sẽ thấy một lớp váng nhày trên bề mặt cỏ, lấy lớp váng này cấy ra đĩa petri trên bề mặt môi trường phân lập theo phương pháp pha loãng tới hạn và chọn các khuẩn lạc riêng biệt đặc trưng. Với khoai tây, không gọt vỏ, được cắt thành những thỏi dài có kích thước 0,5 × 0,5 × 3 cm đặt vào các hộp petri. Thêm dịch đất đã ra nhiệt ở 850C, có thể thêm một ít bột CaCO3 rắc lên thỏi khoai tây. Đặt đĩa có khoai tây vào tủ ấm ở 320C trong 2 ngày. Trên bề mặt thanh khoai tây hình thành lớp màng nhăn nheo, lấy màng này cấy ra môi trường phân lập trong đĩa petri. 2.2.2. Phương pháp giữ giống cấy chuyển Các chủng vi khuẩn đã được phân lập nhiều lần sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêng là môi trường giữ giống, ở trong ống nghiệm. 20 Cách tiến hành: Đổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm chờ thạch đông. Tiếp theo, dùng que cấy vô trùng lấy dịch vi khuẩn phân lập đã được pha loãng bằng nước cất vô trùng, và cấy zich zắc trên bề mặt thạch nghiêng. Nút ống nghiệm lại để ở tủ ấm 340C, sau 24h thấy xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh 40C giữ giống. Giống được cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống. 2.2.3. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn Các chủng được quan sát trên môi trường NA bằng mắt thường, và kính hiển vi quang học. Các đặc điểm nuôi cấy, hình thái được đánh giá dựa trên các chỉ số: khả năng phát triển, hình dáng, màu sắc, bề mặt và mép khuẩn lạc. 2.2.3.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng trên môi trường NA: Khả năng phát triển của khuẩn lạc Bề mặt khuẩn lạc Màu sắc khuẩn lạc 2.2.3.2. Phương pháp làm tiêu bản tế bào sống Loại tiêu bản này dùng để xem hình dạng, kích thước và sự sắp xếp các tế bào, khả năng hình thành bào tử, khả năng chuyển động. Cách tiến hành: Lấy một phiến kính khô và sạch đặt lên giá đỡ, nhỏ một giọt nước sạch vô trùng lên giữa phiến kính, dùng que cấy lấy một ít vi sinh vật mọc trên môi trường đặc, đặt vào chỗ giọt nước trên phiến kính, hòa nhẹ để tạo huyền phù. Đậy nhẹ lá kính, vừa đậy vừa kéo trên giọt dịch để tránh tạo thành bọt khí. Dùng khăn giấy lau nhẹ bề mặt lá kính cho khô. 21 Mọi thao tác cần tiến hành bằng các dụng cụ sạch, vô trùng và phải cạnh ngọn lửa đèn cồn. Sau đó đặt tiêu bản lên bàn kính quan sát với vật kính 40X [7]. 2.2.3.3. Phương pháp nhuộm Gram Nguyên tắc: Sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là một quá trình hấp phụ, khả năng bắt màu của tế bào vi sinh vật có liên quan đến muối magie của axit ribonucleic. Khi nhuộm phức tạp muối này có phản ứng với thuốc nhuộm loại Tryphenylmetan (Genlatin violet, Oryatan violet, Metyl violet) chịu được dưới tác dụng của cồn, nghĩa là không bị mất màu dưới tác dụng của cồn. Những vi khuẩn như vậy gọi là vi khuẩn Gram dương, ngược lại những vi khuẩn không giữ được màu khi xử lý như vậy gọi là vi khuẩn Gram âm. Cách tiến hành: Cho một giọt nước vô trùng lên phiến kính, dùng que cấy vô trùng lấy tế bào vi khuẩn hòa vào giọt nước. Hơ phiến kính lên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần, chú ý không để phiến kính nóng quá tế bào vi khuẩn sẽ bị biến dạng. Để giọt nước bay hơi dần như vậy vi khuẩn sẽ bị gắn chặt vào phiến kính. Nhuộm màu bằng tím Gentian bằng cách nhỏ thuốc tím này lên vết bôi, giữ 1 –2 phút rồi rửa bằng nước cất. Tiếp theo nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản để trong 1 phút cho đến khi thẫm lại Đổ hết thuốc nhuộm đi và lại tráng bằng nước cất. Sau đó nhúng vào dung dịch cồn 960 trong 30 – 40 giây. Rửa lại tiêu bản bằng nước cất rồi để khô vết bôi. Nhuộm bổ sung bằng Fucshin loãng trong 1 – 2 phút. Rửa lại bằng nước cất cho đến khi hết màu rồi đợi khô. Sau đó đem đi quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. 22 Nếu vi khuẩn nhuộm màu tím thi đó là vi khuẩn Gram dương. Nếu vi khuẩn nhuộm màu hồng thì đó là vi khuẩn Gram âm. 2.2.3.4. Phương pháp xác định sự hình thành bào tử Để xác định sự hình thành bào tử của vi khuẩn chúng tôi tiến hành theo phương pháp sốc nhiệt: Vi khuẩn được nuôi trong môi trường thạch trong 72h, sau đó sinh khối tế bào được hòa vào nước cất. Sốc nhiệt ở 80 – 850C trong 15 phút Sau khi sốc nhiệt gạt dịch vi khuẩn lên môi trường thạch đĩa, gói đĩa để vào tủ ấm 340C trong 24h. Nếu thấy xuất hiện khuẩn lạc chứng tỏ vi khuẩn có khả năng hình thành bào tử. 2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính Catalase Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 nồng độ 10% lên phiến kính, dùng đầu que cấy lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hóa (24 giờ) trộn vào giọt H2O2 trên phiến kính. Nếu chủng vi khuẩn nào sinh enzyme catalase sẽ tạo thành bọt khí trên phiến kính. 2.2.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang (OD620nm ) Cơ sở của phương pháp này là tính chất hấp phụ hoặc làm lệch một phần ánh sáng của các dung dịch có vật chất lơ lửng. Do vi sinh vật trong phần lớn trường hợp là không có màu và hầu như trong suốt, vì vậy dịch nuôi cấy của tế bào hấp phụ ánh sáng không đáng kể trong vùng quang phổ ánh sáng thấy được. Trong giới hạn nhất định, số lượng ánh sáng bị tán xạ do dịch nuôi cấy vi sinh vật tỷ lệ thuận với mật độ tế bào. Nên trong cùng một chiều dài sóng ánh sáng đập vào mà sự tán xạ ánh sáng càng nhiều nghĩa là môi trường càng đục tương đương với mật độ tế bào vi sinh vật càng nhiều. 23 Lấy 3 ml dịch nuôi cấy để tiến hành đo OD ở bước sóng 620 nm trên máy quang phổ kế với đối chứng là môi trường không chứa vi khuẩn. 2.2.6. Nghiên cứu khả năng thủy phân tinh bột, protein Để xác định khả năng thủy phân tinh bột, protein của các chủng vi khuẩn, chúng tôi tiến hành thử sơ bộ theo phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch. Cách tiến hành: Nuôi vi khuẩn trên các môi trường lỏng chứa cazein, tinh bột ở nhiệt độ phòng ( 30 – 320C) trên máy lắc tốc độ 125 vòng/ phút. Sau 36h lấy dịch nuôi trong điều kiện vô trùng. Tiếp theo, đổ môi trường đặc có chứa tinh bột, cazein đã được khử trùng vào đĩa petri. Chờ cho môi trường nguội và đông lại, sau đó dùng khuyên đục lỗ (đường kính khoảng 1cm) đã được khử trùng để đục lỗ trên bề mặt môi trường tạo thành các giếng. Dùng pipetman hút dịch đã được lọc nhỏ vào các giếng trong đĩa petri. Để đĩa vào tủ lạnh 2 tiếng để dịch khuyếch tán đều. Sau đó để vào tủ ấm ở nhiệt độ 340C. Sau khoảng 24h thử bằng thuốc thử. Dùng thuốc thử đổ lên bề mặt thạch, nếu có enzyme thì nó tạo thành vùng phân giải xung quanh giếng. Phương pháp này không cho phép xác định chính xác hoạt độ của các enzyme amylase, protease, nhưng cho phép định tính sự có mặt của các enzyme này nhanh và đơn giản.  Kiểm tra hoạt tính Protease trên môi trường chứa cazein: Dùng thuốc thử HgCl2 1% đổ lên bề mặt môi trường nuôi cấy. Nếu vi khuẩn sinh protease thì sẽ có một vòng trong suốt xung quanh giếng, do các protein bị phân giải không còn phản ứng kết tủa với HgCl2. Các vùng chưa phân giải sẽ có màu trắng đục mờ. 24  Kiểm tra hoạt tính Amylase trên môi trường chứa tinh bột tan: Dùng dung dịch Lugol đổ lên môi trường nuôi cấy chứa tinh bột. Vùng chưa bị phân giải có màu xanh mực, phần xung quanh giếng bị phân giải trở thành trong suốt không màu. Đánh giá khả năng sinh enzyme để tuyển chọn những chủng có hoạt tính enzyme cao: dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D). (D – d) càng lớn thì khả năng sinh enzyme càng cao ( d là đường kính giếng, d = 1cm). 2.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nguyên liệu khác nhau lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của các chủng Bs, Bm, BM Chuẩn bị môi trường có các nguồn nguyên liệu khác nhau ở các nồng độ khác nhau: 1.Tinh bột tan với các nồng độ 1,5 ; 2 và 2,5% 2.Cazein với các nồng độ 2, 3, và 4% 3.Bột đậu tương với các nồng độ 1, 2, 3 và 4% 4.CaCO3 với các nồng độ 1, 2, 3, và 4% Cho 50 ml môi trường vào bình tam giác khử trùng ở 1 atm/ 30 phút, để nguội sau đó cấy chủng có hoạt tính protease, amylase với tỷ lệ 1 – 2%. Sau đó lắc ở 125 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Đo OD620nm và pH ở các thời điểm khác nhau để đánh giá sự sinh trưởng của các chủng. Sau mỗi lần đo lấy 0,5 ml dung dịch vi khuẩn nhỏ vào các lỗ thạch có chứa cơ chất cảm ứng để nuôi trong tủ ấm 340C, trong 24 giờ. Xác định khả năng phân hủy của các chủng bằng thuốc thử sau đó đo vòng phân giải của chúng. 25 2.2.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan lên khả năng sinh trưởng của các chủng Bs, Bm, BM Chuẩn bị các môi trường lỏng NA vào trong các bình tam giác như nhau với các độ thông khí khác nhau là 10, 20, 30, 40%. Và các môi trường lỏng NA với các độ thông khí khác nhau như trên nhưng có bổ sung 1% CaCO3. Các môi trường đều được khử trùng ở 1atm / 30 phút. Để nguội, sau đó cấy mỗi chủng vào mỗi loại môi trường, đem lắc 125 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Sau 24 giờ đem đo OD620nm để xác định khả năng sinh trưởng của các chủng. 26 Phần III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 3.1. Phân lập chủng Bacillus Từ các mẫu cỏ khô, khoai tây và đất vườn, chúng tôi đã phân lập được 3 khuẩn lac, tạm kí hiệu là: Từ cỏ khô và đất phân lập được chủng kí hiệu là Bs và Bm Từ khoai tây và đất phân lập được chủng kí hiệu là BM 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Các khuẩn lạc được làm sạch thuần khiết bằng cách cấy phân lập và cấy lại nhiều lần. Sau đó đem quan sát thấy các khuẩn lạc có hình dạng khác nhau: Chủng Bs khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, mép nhăn, tạo thành màng mịn lan trên bề mặt thạch, đường kính 2 – 3mm. Chủng Bm có khuẩn lạc tròn, lồi ở giữa, màu trắng đục, mép trơn, đường kính 2 – 3 mm. Chủng BM khuẩn lạc màu xám nhạt, không lan ra môi trường, đường kính 2 – 3 mm. Hình 1: Phân lập khuẩn lạc chủng Bs 28 Hình 2: Phân lập khuẩn lạc chủng Bm Hình 3: Phân lập khuẩn lạc chủng BM 3.3. Đặc điểm hình thái tế bào Các chủng Bs, Bm, BM được làm tiêu bản sống và quan sát trên kính hiển vi ta thấy là trực khuẩn hình que, chuyển động, kích thước từ 3 – 5 29 µm, Bm có kích thước tế bào lớn hơn cả, chúng có thể đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi dài hay ngắn khác nhau. Khi nhuộm Gram quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần, nhận thấy cả 3 chủng đều bắt màu tím, tức cả 3 chủng đều là vi khuẩn Gram dương. Hình 4: Hình thái tế bào chủng Bs Hình 5: Hình thái tế bào của chủng BM 30 Hình 6: Hình thái tế bào của chủng Bm Qua nghiên cứu hình thái khuẩn lạc và tế bào chúng tôi sơ bộ bước đầu định tên cho 3 chủng này như sau: Bs – Bacillus subtilis, Bm – Bacillus megatherium, BM – Bacillus mesentericus. 3.4. Nghiên cứu hoạt tính Catalase Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với cả 3 chủng vi khuẩn nghiên cứu: Cấy từng chủng vi khuẩn ra đĩa và nuôi trong tủ ấm ở 340C. Sau khi thấy khuẩn lạc mọc lên thì nhỏ lên khuẩn lạc một giọt H2O2 10%. Kết quả cho thấy ở khuẩn lạc của cả 3 chủng đều có phản ứng dương tính với thuốc thử. Điều này chứng tỏ cả 3 chủng Bs, Bm, BM đều có khả năng tạo enzyme catalase và như vậy chúng là những chủng vi khuẩn hiếu khí. 2 H2O2 2 H2O + O2 Phản ứng dương tính được nhận thấy ở trên chính là do các phân tử oxy sinh ra làm xuất hiện bọt khí chứng tỏ cả hai chủng này đều có hoạt tính catalase phân hủy H2O2 và giải phóng oxy. Chính vì vậy trong quá trình nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sử dụng máy lắc: bình trụ 250 ml chứa Catalase 31 50 ml môi trường được bổ sung một vòng que giống đưa đi lắc ở 125 vòng/ phút trong 24 – 36 giờ. 3.5. Nghiên cứu khả năng sinh enzym thuỷ phân tinh bột, protein của ba chủng Bs, Bm và BM Ở nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên các môi trường đặc: môi trường thạch - tinh bột, môi trường thạch - cazein. Để thử hoạt tính enzym chúng tôi thực hiện theo phương pháp đục lỗ thạch. Nhỏ dịch nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng có cơ chất cảm ứng và đã được lọc vi khuẩn vào giếng, sau 35 giờ tiến hành thử thuốc thử theo dõi xem có vùng phân giải xung quanh giếng không và đo đường kính phân giải của các enzym quanh giếng. Kết quả đo thể hiện ở bảng 3.1: Bảng 3.1: Đường kính phân giải của các enzym và các chủng sinh ra: Môi trường Chủng (D – d) mm Enzym thuỷ phân Bs 9 Amylase Bm 8 Amylase Tinh bột BM 10 Amylase Bs 17 Protease Bm 15 Protease Cazein BM 15 Protease (d là đường kính giếng, d = 10 mm) Qua kết quả bảng 3.1 cho thấy, cả 3 chủng đều có khả năng sinh enzym amylase, protease. Trong đó, đường kính phân giải ở môi trường cazein lớn hơn. Có thể do nhiều nguyên nhân khác nhau hoặc hoạt tính enzym protease cao, hoặc lượng enzym vi khuẩn sinh ra nhiều, chúng tôi đưa ra điều kiện để nghiên cứu tiếp. Ở đây chúng tôi mới định tính của các enzym amylase, protease. Vậy 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm, BM đều có khả 32 năng sinh enzym amylase và protease, đây là cơ sở cho việc sản xuất enzym công nghiệp để ứng dụng trong nhiều ngành khác nhau. Hoạt tính protease Hoạt tính amylase Chủng Bs Chủng Bs Chủng BM Chủng BM Chủng Bm Chủng Bm Hình 7: Thử hoạt tính phân giải protease và amylase của 3 chủng Bs, Bm và BM Từ các thí nghiệm trên tôi thấy, 3 chủng nghiên cứu Bs, Bm, BM là 3 chủng đều có khả năng sinh enzym amylase, protease trên môi trường có cơ 33 chất cảm ứng. Khi các chủng này gặp môi trường chứa tinh bột, cazein chúng sẽ phát huy tác dụng của nó là sinh ra các enzym tương ứng để phân huỷ các cơ chất này. Hơn nữa, chúng dễ nuôi cấy, để tồn tại trong môi trường đất, nước, nhất là những nơi chứa nhiều chất hữu cơ. 3.6. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của các chủng Bs, Bm và BM trên môi trường không có chất cảm ứng Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với môi trường lỏng NA. Mỗi chủng giống được cấy vào trong các bình trụ chứa 40ml môi trường với lượng như nhau, nuôi lắc với vận tốc 125 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Cứ sau 6 giờ chúng tôi lại tiến hành theo dõi sự sinh trưởng của chúng bằng cách đo OD ở bước sóng 620nm. Kết quả được thể hiện ở bảng sau: Bảng 3.2: Sự sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, và BM trên môi trường không có chất cảm ứng Chủng vi khuẩn OD620nm sau 24 giờ nuôi cấy OD620nm sau 30 giờ nuôi cấy OD620nm sau 36 giờ nuôi cấy OD620nm sau 42 giờ nuôi cấy Bs 0,3 0,54 0,53 0,34 Bm 0,7 0,85 0,86 0,85 BM 0,35 0,90 0,84 0,78 Từ kết quả ở bảng 3.2 chúng tôi thấy, 3 chủng vi khuẩn sinh trưởng nhanh, mức sinh trưởng cao (từ 0,54 đến 0,90), thời gian đạt tối đa sinh trưởng ngắn (khoảng 30 – 36 giờ). 34 3.7 Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzmy amylaza của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan 3.7.1. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan Chúng tôi tiến hành nuôi chủng trong môi trường cơ sở với chất cảm ứng là tinh bột tan ở các nồng độ khác nhau, lắc với vận tốc 125 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Đánh giá sự phát triển của các chủng bằng cách tiến hành đo mật độ quang ở OD620nm ở các thời điểm khác nhau. Bảng 3.3. Sự sinh trưởng của chủng Bs trên môi trường có tinh bột tan Môi trường Nồng độ tinh bột tan (%) OD620nm sau 24h nuôi cấy OD620nm sau 30h nuôi cấy OD620nm sau 36h nuôi cấy OD620nm sau 42h nuôi cấy Đối chứng (môi trường NA) 0 0,3 0,54 0,53 0,50 1,5 0,34 0,71 0,70 0,60 2 0,52 0,97 0,85 0,83 Môi trường cơ sở + Tinh bột tan 2,5 0,42 0,85 0,85 0,82 Bảng 3.4. Sự sinh trưởng của chủng Bm trên môi trường có tinh bột tan Môi trường Nồng độ tinh bột tan (%) OD620nm sau 24h nuôi cấy OD620nm sau 30h nuôi cấy OD620nm sau 36h nuôi cấy OD620nm sau 42h nuôi cấy Đối chứng (môi trường NA) 0 0,70 0,85 0,85 0,79 1,5 0,66 0,68 0,60 0,55 2 1,05 1,1 1,05 0,88 Môi trường cơ sở +Tinh bột tan 2,5 0,75 0,90 0,85 0,80 35 Bảng 3.5. Sự sinh trưởng của chủng BM trên môi trường có tinh bột tan Môi trường Nồng độ tinh bột tan (%) OD620nm sau 24h nuôi cấy OD620nm sau 30h nuôi cấy OD620nm sau 36h nuôi cấy OD620nm sau 42h nuôi cấy Đối chứng (môi trường NA) 0 0,35 0,90 0,84 0,79 1,5 0,38 0,45 0,38 0,36 2 0,8 1,05 1,05 0,97 Môi trường cơ sở + Tinh bột tan 2,5 0,7 0,90 0,82 0,78 Từ kết quả ở các bảng 3.3 , 3.4 và 3.5 chúng tôi thấy cả 2 môi trường NA và môi trường có bổ sung tinh bột tan đều thích hợp để 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm, BM sinh trưởng. Đặc biệt môi trường có bổ sung tinh bột tan ở nồng độ 2% thì sự sinh trưởng của 3 chủng là tối đa. 3.7.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan Chúng tôi tiến hành nuôi chủng trong môi trường cơ sở với chất cảm ứng là tinh bột tan ở các nồng độ khác nhau, lắc với vận tốc 125 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó tiến hành thử hoạt tính amylase ở các thời điểm khác nhau bằng phương pháp đục lỗ thạch. 36 Hình 8: Hoạt tính enzyme amylase của chủng Bs trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan Hình 9: Hoạt tính enzyme amylase của chủng Bm trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan 37 Hình 10: Hoạt tính enzyme amylase của chủng BM trên môi trường có chất cảm ứng là tinh bột tan Như vậy qua ba bảng 3.3 , 3.4, 3.5 và ba hình 8, 9, 10 chúng tôi nhận thấy trong môi trường có nồng độ tinh bột là 2% tức 20g tinh bột tan cho 1 lít môi trường thì cả quá trình sinh trưởng và sinh enzyme ngoại bào amylaza của 3 chủng Bs, Bm và BM là tối đa, nhưng chủng BM thì khả năng sinh enzyme ngoại bào cao hơn ở nồng độ tinh bột tan là 2,5%. Với cả hai nồng độ thì đều chứng tỏ tinh bột là chất cảm ứng với amylaza rõ rệt. Do vậy muốn thu enzyme amylase nhất thiết trong môi trường nuôi cấy phải có tinh bột. Cả 3 chủng đạt mức sinh trưởng cao nhất ở thời điểm 30 giờ nuôi cấy, nhưng sinh tổng hợp enzyme ở 36 giờ mới đạt mức tối đa. 3.8 Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzmy proteaza của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein 3.8.1. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein Chúng tôi tiến hành nuôi các chủng nghiên cứu trong môi trường cơ sở với chất cảm ứng là cazein ở các nồng độ khác nhau, nuôi lắc ở nhiệt độ 38 phòng với vận tốc là 125 vòng/phút. Đánh giá sự phát triển của các chủng bằng cách tiến hành đo mật độ quang OD620nm ở các thời điểm khác nhau. Bảng 3.6. Sự sinh trưởng của chủng Bs trên môi trường có cazein Môi trường Nồng độ cazein (%) OD620nm sau 24h nuôi cấy OD620nm sau 30h nuôi cấy OD620nm sau 36h nuôi cấy OD620nm sau 42h nuôi cấy Đối chứng (môi trường NA) 0 0,3 0,54 0,53 0,34 2 0,8 0,90 0,86 0,80 3 1,09 1,25 1,21 1,15 Môi trường cơ sở + cazein 4 0,98 1,12 1,08 1,00 Bảng 3.7. Sự sinh trưởng của chủng Bm trên môi trường có cazein Môi trường Nồng độ cazein (%) OD620nm sau 24h nuôi cấy OD620nm sau 30h nuôi cấy OD620nm sau 36h nuôi cấy OD620nm sau 42h nuôi cấy Đối chứng (môi trường NA) 0 0,7 0,85 0,86 0,85 2 0,66 0,80 0,70 0,62 3 0,70 1,00 0,72 0,65 Môi trường cơ sở + cazein 4 0,83 0,85 0,85 0,80 Bảng 3.8. Sự sinh trưởng của chủng BM trên môi trường có cazein Môi trường Nồng độ cazein (%) OD620nm sau 24h nuôi cấy OD620nm sau 30h nuôi cấy OD620nm sau 36h nuôi cấy OD620nm sau 42h nuôi cấy Đối chứng (môi trường NA) 0 0,35 0,90 0,84 0,78 2 0,61 0,67 0,67 0,63 3 0,80 0,87 0,83 0,80 Môi trường cơ sở + cazein 4 0,70 0,73 0,68 0,62 39 Qua ba bảng 3.6, 3.7, 3.8 chúng tôi nhận thấy, ở nồng độ cazein là 3% thì thích hợp cho sự sinh trưởng của cả 3 chủng Bs, Bm và BM. Sự sinh trưởng đạt tối đa trong khoảng 30 đến 36 giờ. 3.8.2. Nghiên cứu quá trình sinh enzyme proteaza của 3 chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein Chúng tôi tiến hành nuôi chủng trong môi trường cơ sở với chất cảm ứng là cazein ở các nồng độ khác nhau, lắc với vận tốc 125 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó tiến hành thử hoạt tính proteaza ở các thời điểm khác nhau bằng phương pháp đục lỗ thạch. Hình 11: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng Bs trên môi trường có chất cảm ứng là cazein 40 Hình 12: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng Bm trên môi trường có chất cảm ứng là cazein Hình 13: Hoạt tính enzyme proteaza của chủng BM trên môi trường có chất cảm ứng là cazein Qua ba hình 11, 12, 13 chúng tôi nhận thấy trong môi trường có nồng độ cazein là 3% (30g cazein/ 1lít môi trường) thì quá trình sinh enzyme ngoại bào proteaza của cả 3 chủng Bs, Bm và BM là tối đa. Điều này chứng tỏ cazein là chất cảm ứng với proteaza rõ rệt. 41 Quan hệ giữa sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme proteaza ngoại bào cũng tương tự như ở trường hợp sinh amylaza: sinh trưởng đạt mức tối đa ở 30 giờ, còn enzyme ở mức 36 giờ nuôi cấy. 3.9. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng và sinh enzyme của các chủng Bs, Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO3 Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn Bacillus pH môi trường thường giảm làm cho môi trường axit và như vậy sẽ ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn. Muốn vi khuẩn phát triển tốt ta cần giữ pH môi trường lớn hơn 6,5. Muốn vậy, trong môi trường có bổ sung CaCO3 thì CaCO3 ở đây chỉ đóng vai trò là chất trung hòa môi trường và đưa pH về vùng trung tính để cho vi khuẩn Bacillus phát triển và sinh enzyme tốt hơn. 3.9.1. Nghiên cứu nuôi vi khuẩn trong môi trường có CaCO3 thu amylaza Từ môi trường cơ sở chúng tôi cộng thêm 2% tinh bột tan, CaCO3 được khử trùng riêng, khi lên men mới được bổ sung vào + Bổ sung CaCO3 vào môi trường với nồng độ 1, 2, 3, 4% + Tiếp một vòng que giống rồi nuôi lắc ở nhiệt độ phòng với chế độ lắc là 125 vòng/ phút. + Lấy 0,5 ml dịch nuôi cấy trên cho vào giếng thạch sau đó đưa đi nuôi tiếp trong tủ ấm 350C, 24 giờ rồi đổ thuốc thử lên và quan sát vòng phân giải của chúng. Tiến hành đánh giá sự phát triển của chúng thông qua OD620nm. Kết quả được thể hiện ở các hình và bảng dưới đây: 42 Hình 14: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của chủng Bs Hình 15: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của chủng Bm 43 Hình 16: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có tinh bột tan của chủng BM Bảng 3.9: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sự sinh trưởng trên môi trường có tinh bột của 3 chủng Bs, Bm và BM Chủng vi khuẩn Nồng độ CaCO3 (%) Khả năng sinh trưởng (OD620nm) Sau 24h Sau 30h Sau 36h Sau 42h 0 0,34 0,71 0,7 0,6 1 1,15 1,21 1,2 1,18 2 1,25 1,32 1,3 1,27 3 1,1 1,2 1,1 0,92 Bs 4 1,3 1,4 1,35 1,00 0 0,66 0,68 0,60 0,55 1 1,00 1,02 1,1 0,91 2 0,50 0,63 0,57 0,51 3 1,22 1,25 0,9 0,82 Bm 4 1,20 1,00 0,9 0,84 0 0,38 0,45 0,38 0,36 1 1,2 1,15 1,10 1,02 2 1,1 1,25 1,27 1,22 3 1,15 1,20 1,08 1,00 BM 4 1,1 1,21 1,2 1,17 44 Qua các hình 14, 15, 16 và bảng 3.9 chúng tôi nhận thấy ở nồng độ CaCO3 2% thì thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh amylaza của 2 chủng Bs và BM, còn ở chủng Bm là CaCO3 3%. Khả năng sinh trưởng và sinh enzyme cao hơn ở môi trường không bổ sung CaCO3. Sự sinh trưởng tối đa xảy ra trước (24-30 giờ) khi sự sinh enzyme đạt tối đa (30-36 giờ). 3.9.2. Nghiên cứu nuôi vi khuẩn trong môi trường có CaCO3 thu proteaza Từ môi trường cơ sở chúng tôi cộng thêm 3% cazein, CaCO3 được khử trùng riêng, khi lên men mới được bổ sung vào. + Bổ sung CaCO3 vào môi trường với nồng độ 1, 2, 3, 4% + Tiếp một vòng que giống rồi nuôi lắc ở nhiệt độ phòng với chế độ lắc là 125 vòng/ phút. + Lấy 0,5 ml dịch nuôi cấy trên cho vào giếng thạch sau đó đưa đi nuôi tiếp trong tủ ấm 350C, 24 giờ rồi đổ thuốc thử lên và quan sát vòng phân giải của chúng. Tiến hành đánh giá sự phát triển của chúng thông qua OD620nm. Kết quả được thể hiện ở các hình và bảng dưới đây: Hình 17: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của chủng Bs 45 Hình 18: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của chủng Bm Hình 19: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sinh enzyme trên môi trường có cazein của chủng BM 46 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của CaCO3 đến sự sinh trưởng trên môi trường có cazein của 3 chủng Bs, Bm và BM Chủng vi khuẩn Nồng độ CaCO3 (%) Khả năng sinh trưởng (OD620nm) Sau 24h Sau 30h Sau 36h Sau 42h 0 0,8 0,9 0,86 0,8 1 1,2 1,27 1,3 1,24 2 1,05 1,15 1,05 1,0 3 1,1 1,2 1,3 1,15 Bs 4 1,1 1,2 1,15 1,08 0 0,66 0,67 0,66 0,6 1 0,65 0,7 0,66 0,61 2 1,25 1,4 1,35 1,32 3 1,2 1,4 1,33 1,29 Bm 4 0,7 1,19 1,3 1,2 0 0,51 0,57 0,57 0,53 1 0,97 0,97 1,09 1,0 2 0,95 1,07 0,87 0,80 3 1,19 1,22 1,2 1,17 BM 4 1,18 1,2 1,2 1,16 Qua hình 17, 18, 19 và bảng 3.10 chúng tôi nhận thấy trong môi trường cazein có bổ sung CaCO3 thì ở nồng độ CaCO3 3% thích hợp nhất cho sự sinh enzyme proteaza của 2 chủng Bm và BM, với chủng Bs thì ở nồng độ CaCO3 2%. Khả năng sinh trưởng và sinh enzyme cao hơn ở môi trường cazein không bổ sung CaCO3. Sự sinh trưởng và sinh enzyme proteaza ngoại bào cũng tương tự như trường hợp sinh amylaza: sinh trưởng đạt mức tối đa (30 giờ) xảy ra trước khi sinh enzyme đạt mức tối đa (36 giờ). 47 Như vậy CaCO3 có vai trò điều chỉnh pH của môi trường, làm cho pH của môi trường nằm trong vùng hoạt động tối thích của chủng vi khuẩn Bacillus, làm cho chủng vi khuẩn Bacillus sinh trưởng và sinh enzyme tốt hơn. 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan Nồng độ oxy hòa tan trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật hiếu khí. Tuy nhiên ảnh hưởng này có khác nhau tùy từng loài, hầu hết là làm tăng tốc độ sinh trưởng , rút ngắn pha tiền phát, nâng cao lượng sinh khối nhưng trong một vài trường hợp thì thiếu oxy tuy có kìm hãm sinh trưởng nhưng lại gia tăng quá trình sinh tổng hợp enzyme. Đối với 3 chủng Bs, Bm, BM, chúng tôi nghiên cứu nhu cầu sử dụng lượng oxy hòa tan thông qua thí nghiệm nuôi lắc riêng rẽ 3 chủng ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ với độ hiếu khí khác nhau từ 10 đến 40%. Độ hiếu khí được tính qua tỷ lệ thể tích môi trường lên men (v) so với thể tích bình chứa (V): . Kết quả thể hiện ở các bảng sau: ( càng nhỏ thì độ hiếu khí càng lớn ) 48 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên khả năng sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, BM Độ hiếu khí (%) Chủng vi khuẩn 10 20 30 40 Bs 0.84 0.72 0.56 0.44 Bm 0.7 0.56 0.5 0.35 BM 0.76 0.66 0.56 0.48 Ba chủng Bs, Bm, BM đều thuộc loại hiếu khí. Trong các thí nghiệm đối với các độ hiếu khí khác nhau, cả 3 chủng đều dao động. Cả 3 chủng Bs, Bm và BM đều phát triển mạnh ở độ thông khí dao động từ 10 – 20 % với OD620nm dao động từ 0,56 – 0,84 , nhưng phát triển Ba chủng Bs, Bm, BM đều thuộc loại hiếu khí. Trong các thí nghiệm đối với các độ hiếu khí khác nhau, cả 3 chủng đều dao động. Cả 3 chủng Bs, Bm và BM đều phát triển mạnh ở độ thông khí dao động từ 10 – 20% với OD620nm dao động từ 0,56 – 0,84, nhưng phát triển mạnh nhất ở tỉ lệ 10% với OD620nm là 0,84 ở chủng Bs, OD620nm là 0,7 ở chủng Bm và 0,76 với chủng BM. Bảng 3.12: Ảnh hưởng của độ hiếu khí tới khả năng sinh trưởng của 3 chủng Bs, Bm, BM trên môi trường có bổ sung CaCO3 Trên môi trường có bổ sung CaCO3 mật độ tế bào thể hiện rất cao và đều hơn ở 3 chủng. Ở cả 3 chủng mật độ tế bào thể hiện cao ở độ thông Độ hiếu khí (%) Chủng vi khuẩn 10 20 30 40 Bs 0,90 0,84 0,68 0.60 Bm 0,82 0,71 0,65 0,57 BM 0,89 0,72 0,64 0,57 49 khí 10 – 20%, cao nhất ở độ thông khí là 10% với OD620nm là 0,9 với chủng Bs, OD620nm là 0,82 với chủng Bm và 0,89 với chủng Trên môi trường có bổ sung CaCO3 mật độ tế bào thể hiện rất cao và đều hơn ở 3 chủng. Ở cả 3 chủng mật độ tế bào thể hiện cao ở độ thông khí 10 – 20%, cao nhất ở độ thông khí là 10% với OD620nm là 0,9 với chủng Bs, OD620nm là 0,82 với chủng Bm và 0,89 với chủng BM. Xác định hoạt tính enzyme của các chủng ở các độ thông khí khác nhan trên môi trường có cơ chất cảm ứng bằng phương pháp đục lỗ thạch. Kết quả được thể hiện ở hình sau: Hình 20: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme amylaza của 3 chủng Bs, Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO3 50 Hình 21: Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên hoạt tính enzyme proteaza của 3 chủng Bs, Bm và BM trên ở môi trường có bổ sung CaCO3 Từ hai hình 3.20 và 3.21 chúng tôi nhận thấy hoạt tính enzyme thể hiện càng cao ở độ hiếu khí càng lớn. Vậy độ hiếu khí thích hợp để nuôi cấy 3 chủng là 10 – 20% 3.11. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng và phát triển của ba chủng nghiên cứu Ba chủng vi khuẩn Bs, Bm và BM sau 24 giờ nhân giống trên môi trường cơ sở đươc cấy vào môi trường có pH thay đổi 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 với tốc độ lắc 125 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau 36 giờ kiểm tra đánh giá khả năng phát triển của chúng bằng cách đo OD620nm. Kết quả thu được dưới h́nh sau: 51 Hình 22: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng Bs, Bm và BM Từ hình 22 cho thấy khi pH dao động từ 4 – 5 thì cả 3 chủng phát triển yếu: OD620nm thấp, chỉ đạt 0,34 ở Bm; 0,41 ở chủng Bs và 0,45 ở chủng BM. Khi pH tăng từ 6 – 8 đặc biệt ở khoảng giữa 7 – 8 thì cả 3 chủng bắt đầu phát triển mạnh, mật độ tế bào đạt giá trị cao nhất tại pH = 7 với OD620nm lần lượt là 0,80 và 0,81 của chủng Bs và BM, ở pH = 8 thì OD620nm là 0,80 của chủng Bm. Ba chủng phát triển có phần ổn đinh ở pH = 9, nhưng tới 10 thì hầu như yếu dần OD620nm dao động từ 0,41 tới 0,47. Như vậy pH ban đầu thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cả ba chủng là từ 7 – 8. 3.12. Nghiên cứu sử dụng bột đậu tương làm nguồn nguyên liệu thay thế  Từ môi trường cơ sở chúng tôi bổ sung bột đậu tương ở các nồng độ: 1, 2, 3, 4% và được cấy 1-2% chủng vi khuẩn rồi đưa đi lắc ở vận tốc 125 vòng/phút, nhiệt độ phòng, với thời gian là 36 giờ . Tiến hành đục lỗ 52 thạch rồi quan sát đo vòng phân giải của hai enzyme chúng tôi thu được kết quả như sau: Bảng 3.13: Ảnh hưởng của bột đậu tương lên khả năng sinh proteaza, amylaza của ba chủng Bs, Bm, BM Chủng vi khuẩn Nồng độ bột đậu tương (%) Hoạt tính enzyme (D-d)mm Proteaza Amylaza 1 21,5 13 2 20 13 3 26 14 Bs 4 21 13,5 1 6 6 2 8 6 3 16 12 Bm 4 11 7 1 13 8 2 12 8 3 14 8,5 BM 4 10 7,5 Từ bảng trên chúng tôi nhận thấy nồng độ bột đậu tương mà tại đó 3 chủng nghiên cứu cho hoạt tính enzyme cao nhất là 3% tức là 30 g/lít môi trường.  Trên môi trường cơ sở chúng tôi đã thay glucose bằng bột đậu tương 3% sau đo cho thêm CaCO3 ở các nồng độ khác nhau: 1, 2, 3 và 4% làm chất điều chỉnh pH. Giống được tiếp với tỉ lệ 1-2%, đưa đi lắc ở 125 vòng/phút trong 36 giờ. Sau đó tiến hành đục lỗ thạch rồi quan sát đo vòng phân giải của hai enzyme chúng tôi thu được kết quả như sau: 53 Bảng 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ CaCO3 đến khả năng sinh amylaza, proteaza trên môi trường có bột đậu tương Chủng vi khuẩn Nồng độ CaCO3 (%) Hoạt tính enzyme (D-d)mm Protease Amylase 0 26 14 1 18 16 2 26 15 3 25 19 Bs 4 20 14 0 16 12 1 18 10 2 18 10 3 22 14 Bm 4 11 11 0 14 8,5 1 23 8 2 25 8 3 21 12 BM 4 18 7,5 Qua 2 bảng 3.13 và 3.14 chúng tôi nhận thấy ở nồng độ CaCO3 2% thích hợp cho sự sinh proteaza của 2 chủng Bs và BM, nồng độ CaCO3 3% thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng Bm. Hoạt tính amylaza đạt cực đại ở nồng độ CaCO3 3% đối với cả 3 chủng Bs, Bm và BM. Hoạt tính 2 enzyme đều thể hiện cao hơn ở môi trường chỉ có bột đậu tương. Tuy vậy CaCO3 ở nồng độ cao sẽ ức chế quá trình sinh enzyme của cả 3 chủng. Cũng qua bảng trên chúng tôi nhận thấy chủng vi khuẩn Bs là có hoạt tính mạnh nhất, thích hợp nhất với bột đậu tương. 54 Bột đậu tương có hàm lượng protein chiếm khoảng 30 – 35% và có khoảng 40% là tinh bột. Vì vậy bột đậu tương đóng vai trò là chất cảm ứng của hai enzyme amylaza và proteaza. Kết quả thí nghiệm cho thấy trên môi trường có bột đậu tương thì sự sinh trưởng và biểu hiện hoạt tính 2 enzyme amylaza và proteaza là lớn nhất. Nuôi Bs, Bm và BM trên môi trường (thành phần dưới đây cho 1 lít môi trường) sẽ thu được cả hai enzyme amylaza và proteaza. Trong thực tế sản xuất công nghiệp chúng ta có thể dùng bột đậu tương làm nguồn nguyên liệu cơ bản để sản xuất enzyme. Bột đậu tương 30 g Peptone 5 g Cao men 2,5 g CaCO3 2% pH = 7 – 8 3.13. Nghiên cứu đồ thị tổng hợp động học của quá trình lên men Từ các nghiên cứu trên, chúng tôi tổng hợp về sự sinh trưởng, sinh enzyme proteaza và sự thay đổi pH của chủng Bs trên môi trường bột đậu tương có bổ sung CaCO3 55 Enzyme (mm) OD 620nm pH 30 2.0 8.0 1.9 7.8 25 1.8 7.6 1.7 7.4 20 1.6 7.2 1.5 7.0 15 1.4 6.8 1.3 6.6 10 1.2 6.4 1.1 6.2 5 1.0 6.0 0 Sau 24h sau 30h sau 36h : Hoạt tính enzyme ( D- d) mm : Sự sinh trưởng OD620nm : pH Hình 23: Đồ thị biến đổi pH, hoạt độ enzyme proteaza và mật độ tế bào của Bs trong môi trường bột đậu tương có CaCO3 56 Phần IV KẾT LUẬN 57 Qua thời gian thực tập tốt nghiệp, tôi đã cơ bản hoàn thành nội dung đề tài được giao. Kết quả cụ thể như sau: 1. Từ đất vườn phân lập qua trung gian là cỏ khô và khoai tây đã phân lập được 3 khuẩn lạc có hoạt tính enzyme amylase và protease. 2. Nghiên cứu hình thái tế bào, khuẩn lạc và một vài đặc điểm sinh học thấy 3 chủng này là: + Trực khuẩn, sinh bào tử, Gram dương, hiếu khí, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và sinh enzyme ngoại bào là 25 – 370C Chủng Bs – trực khuẩn cỏ khô có thể là Bacillus subtilis Chủng Bm – trực khuẩn cỏ khô có thể là Bacillus megaterium Chủng BM –trực khuẩn khoai tây có thể là Bacillus mensentericus 3. Nghiên cứu nuôi cấy 3 chủng này với các cơ chất cảm ứng khác nhau đều thấy: - Tinh bột và bột đậu tương là chất cảm ứng cho 3 chủng sinh amylase - Cazein và bột đậu tương là chất cảm ứng cho 3 chủng sinh protease. Trong môi trường có bổ sung CaCO3 đều thấy khả năng sinh protease của 3 chủng cao hơn so với không bổ sung CaCO3. Như vậy CaCO3 đóng vai trò điều chỉnh pH của môi trường - Protease thu được của 3 chủng Bs, Bm và BM đều thấy hoạt động ở vùng pH kiềm (9 -11). Với các kết quả thu được hoàn toàn làm cơ sở cho việc nghiên cứu sâu về phân loại và sinh tổng hợp enzyme của ba chủng này để có thể áp dụng vào sản xuất enzyme, sản xuất bột giặt, thủy phân bột cá, trong công nghiệp dày da hay bảo vệ môi trường 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu Tiếng Việt 1. Nguyễn Thành Đạt, thực hành vi sinh, 1990, NXB Nông Nghiệp 2.Lương Đức Phẩm. Chế phẩm sinh học dung trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản, 2007. NXB Nông nghiệp 3.Nguyễn Lân Dũng (Dịch). Thực hành vi sinh vật học, 1983. NXB Đại Học và trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. 4.Nguyễn Văn Mùi, Thực hành hóa sinh học, NXB Khoa học và kỹ thuật, 2001] 5.Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, NXB Giáo Dục, 2000 6. Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, Phạm Trân Châu Châu, Nguyễn Lân Dũng, enzyme vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội 7.Nguyễn Trọng Cẩn ( chủ biên), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, Công nghệ enzyme, NXB Nông nghiệp – Thành phố Hồ Chí Minh, 1998] 8. Lê Ngọc Tú (chủ biên), Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Diên, Hóa sinh công nghiệp, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, 2002. 9. Lương Đức Phẩm, Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp  Tài liệu tiếng Anh 10. Priest, F.G and Grigorova, R. (1991) Method for studying the ecology of endospore – forming bacteria. Method in microbiology 22, 565 – 591. Todar , K. Ph. D (2008) Bacillus and related endospore – forming bacteria. Todar’s online textbook ò bacteriology. 59 11. Rosovitz, M. J., Voskuil, M. I., Chambliss, G. H. (1998) Bacillus. In: A. Balows and B. I. Duerden (Eds), Systematic Bacteriology. Arnold Press, London: 709 – 720. 12. Schallemey, M., Singh, A. and Ward, O. P. (2004) Developments in the use of Bacillus species for industrial production. Can. J. Microbiol. 50, 1 - 17.  Trang web điện tử 13. 14. www.epa.gov/opptintra/biotech/fra/fra009htm. 15. 16. PHỤ LỤC Hình thể hiện hoạt tính amylase của Bm trên môi trường bột đậu tương + CaCO3 trong 36h Hình thể hiện hoạt tính protease của Bm trên môi trường bột đậu tương + CaCO3 trong 36h Hình thể hiện hoạt tính amylase của BM trên môi trường bột đậu tương + CaCO3 trong 36h Hình thể hiện hoạt tính protease của BM trên môi trường bột đậu tương + CaCO3 trong 36h Hình thể hiện hoạt tính amylase của Bs trên môi trường bột đậu tương + CaCO3 trong 36h Hình thể hiện hoạt tính amylase của Bs trên môi trường bột đậu tương + CaCO3 trong 36h Hình giữ giống của 3 chủng Bs, Bm và BM