Đề tài Nghiên cứu sugarcane yellow leaf virus gây bệnh vàng gân lá trên mía (yls) bằng kính hiển vi huỳnh quang và kỹ thuật rt-Pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** NGUYỄN MINH NAM NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************* NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR LUẬN VĂN KỸ SƢ Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN MINH NAM Niên khóa: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** RESEARCH ON SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS, THE CAUSAL AGENT OF YELLOW LEAF SYNDROME IN SACCHARUM BY FLUORESCENCE MICROCOPY AND RT-PCR METHOD Graduation thesis Major: Biotechnology Professor Student A.Professor. Dr. BUI CACH TUYEN NGUYEN MINH NAM Term: 2002 - 2006 Ho Chi Minh City 09/2006 LÔØI CAÛM TAÏ Con xin thành kính khắc ghi cù lao của cha mẹ, Ngƣời đã sinh thành, dƣỡng dục và hy sinh tất cả để cho anh em con đƣợc ăn học nên ngƣời. Con xin cảm ơn gia đình đã là chỗ dựa vững chắc cho con vững bƣớc vƣợt qua mọi khó khăn. Em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM, ban Chủ Nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện cho em thực hiện thành công khóa luận. PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn tất khóa luận này. TS. Bùi Minh Trí đã tận tình dạy bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. PGS. TS. Trần Thị Dân, TS. Nguyễn Ngọc Hải, ThS. Trần Nhật Phƣơng đã giúp đỡ em giải quyết những vƣớng mắc trong quá trình thực hiện khóa luận. Toàn thể Thầy, Cô đã trang bị cho em những kiến thức quí báu. TS. M. Irey (USDA) đã tận tình cung cấp trình tự primers và protocol RT- PCR cho em. TS. Tania (South African Sugarcane Research Institute) và TS. S. Schenck (HARC) đã tận tình cung cấp antiserum của ScYLV cho em. TS. Becky (itdna company) đã cung cấp cho em những tài liệu quí giá. Anh Hà Đình Tuấn và anh Thống ở Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, các anh ở trại giống Đức Huệ, Long An và các hộ dân ở xã Phú Lý, Vĩnh Cửu, Đồng Nai đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu. Các Thầy, Cô và anh chị tại Trung tâm Phân tích Hóa Sinh đã hết lòng giúp đỡ và cho em những kinh nghiệm quí báu để em thực hiện thành công khóa luận này. Các bạn lớp công nghệ sinh học 28 đã luôn ở bên mình, động viên và nhiệt tình giúp đỡ mình trong suốt thời gian mình học tập cũng nhƣ trong lúc mình thực hiện khóa luận này. Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 08 năm 2006 Nguyễn Minh Nam TÓM TẮT Nguyễn Minh Nam, Đại học Nông Lâm Tp HCM. Tháng 9 năm 2006. “NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR” đƣợc tiến hành tại Trung tâm Phân tích Hóa Sinh Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh; Trung tâm Công nghệ và Quản lý Môi trƣờng và Tài nguyên Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh; Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, Bình Dƣơng; xã Phú Lý, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai; xã Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An, xã Tân An, Thủ Dầu Một từ tháng 3/2006 đến tháng 8/2006. Triệu chứng vàng gân lá trên mía do sugarcane yellow leaf virus gây ra, đây là một tác nhân gây bệnh quan trọng. Bệnh này đã xảy ra ở nhiều vùng trồng mía trên thế giới. ScYLV tập trung trong bó mạch libe của cây. Triệu chứng của bệnh thƣờng xuất hiện ở cây trƣởng thành với biểu hiện vàng ở gân lá. Bệnh này có thể đƣợc chẩn đoán dựa vào biểu hiện triệu chứng, kỹ thuật RT-PCR, ELISA, TBIA, ISEM, kính hiển vi điện tử hoặc kính hiển vi huỳnh quang. Nội dung của đề tài bao gồm: - Phát hiện sự nhiễm ScYLV dựa vào triệu chứng. - Kiểm tra các bó mạch libe của cây có và không có biểu hiện triệu chứng vàng gân lá bằng kính hiển vi quang học và kính hiển vi huỳnh quang. - Chẩn đoán ScYLV bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi YLS111 và YLS462. Kết quả của đề tài: - Triệu chứng vàng gân lá trên mía đã xuất hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, Bình Dƣơng; xã Phú Lý, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai; xã Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An, xã Tân An, Thủ Dầu Một, Bình Dƣơng. - Đối với cây có biểu hiện triệu chứng thì bó mạch libe có sự phát huỳnh quang trong khi bó mạch của cây bình thƣờng thì không. - Xây dựng đƣợc qui trình RT-PCR có thể chẩn đoán ScYLV. SUMMARY The thesis entitled “RESEARCH ON SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS, THE CAUSAL AGENT OF YELLOW LEAF SYNDROME IN SACCHARUM BY FLUORESCENCE MICROCOPY AND RT-PCR METHOD”. This research was conducted from 3th, 2006 to 8th, 2006 in the laboratory of Biological and Chemical Analysis Center of Nong Lam University; Research Center for Environmental Technology and Nature Resource Management of Nong Lam University; and at Institute of Sugarcane Research of An Phu; Phu Ly village, Vinh Cuu district, Dong Nai province; My Thanh Tay village, Duc Hue district, Long An province, Tan An village, Thu Dau Mot town, Binh Duong province. Sugarcane yellow leaf syndrome is caused by sugarcane yellow leaf virus, being a pathogen of economic importance. The disease has been reported to occur in many sugarcane growing area worldwide. Sugarcane yellow leaf virus resides in the phloem of diseased canes. Symptoms of the disease generally appear in maturing plant as a yellowing of the leaf midrib. The disease can be diagnosed by symptoms, RT- PCR, ELISA, TBIA, ISEM, EM or fluorescence microcopy. The objectives of this research are as follows: - To identify ScYLV infecting plants by symptoms. - To examine the phloem of plant with symptom and symptom less plant by light microcopy and fluorescence microcopy. - To diagnose the ScYLV by RT-PCR with YLS111 and YLS462 primers. The results of this research are as follows: - Sugarcane yellow leaf syndrome has been present in sugarcane grown at Institute of Sugarcane Research of An Phu; Phu Ly village, Vinh Cuu district, Dong Nai province; My Thanh Tay village, Duc Hue district, Long An province, Tan An village, Thu Dau Mot town, Binh Duong province. - In plants expressing disease symptom, the vascular bundles presented fluorescence in the phloem while symtomless plants do not have fluorescence. - Finding out the RT-PCR process that can be used for ScYLV diagnosis. iv MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa LÔØI CAÛM TAÏ ........................................................................................................................ i TÓM TẮT .................................................................................................................................. ii MỤC LỤC ................................................................................................................................. iv DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................... vi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ ............................................................................. vii DANH SÁCH CÁC HÌNH ....................................................................................................... vii PHẦN 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................... 1 1.2 Mục Đích .................................................................................................................... 2 1.3 Yêu Cầu ...................................................................................................................... 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3 2.1 Tổng quan về cây mía ................................................................................................. 3 2.1.1 Về cây mía .......................................................................................................... 3 2.1.2 Một số bệnh do virus trên cây mía ..................................................................... 5 2.2 Bệnh vàng gân lá trên mía và sugarcane yellow leaf virus ........................................ 7 2.2.1 Bệnh vàng gân lá trên mía .................................................................................. 7 2.2.2 Sugarcane yellow leaf virus ................................................................................ 9 2.2.3 Ảnh hƣởng về kinh tế của bệnh vàng gân lá .................................................... 15 2.2.4 Những nghiên cứu về tính kháng ScYLV trên mía .......................................... 16 2.2.5 Tạo cây mía chuyển gene kháng ScYLV ......................................................... 16 2.2.6 Tạo cây mía sạch bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô .......................................... 17 2.2.7 Một số kỹ thuật trong chẩn đoán ScYLV ......................................................... 17 2.3 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới và ở việt nam ....................................... 25 2.3.1 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới ...................................................... 25 2.3.2 Những nghiên cứu về ScYLV ở Việt Nam ...................................................... 26 2.4 Kỹ thuật PCR và RT-PCR ........................................................................................ 27 2.4.1 PCR ................................................................................................................... 27 2.4.2 RT-PCR ............................................................................................................ 28 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 30 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................ 30 v 3.2 Phƣơng pháp lấy mẫu ............................................................................................... 30 3.3 Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ........................................................................ 31 3.3.1 Máy móc, thiết bị .............................................................................................. 31 3.3.2 Dụng cụ ............................................................................................................ 31 3.4 Hóa chất .................................................................................................................... 32 3.4.1 Hóa chất sử dụng trong RT- PCR ..................................................................... 32 3.4.2 Hóa chất sử dụng trong điện di ......................................................................... 32 3.5 Phƣơng pháp quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang ............................................ 33 3.6 Phƣơng pháp phát hiện bằng kỹ thuật RT-PCR ....................................................... 33 3.6.1 Qui Trình Ly Trích RNA .................................................................................. 33 3.6.2 Qui trình thực hiện phản ứng RT-PCR ............................................................. 35 3.6.3 Qui trình RT-PCR chỉnh sửa ............................................................................ 35 3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu ........................................................................................ 36 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 37 4.1 Các biểu hiện của triệu chứng vàng gân lá do ScYLV ............................................. 37 4.2 Kết quả chuẩn đoán dựa vào triệu chứng ................................................................. 39 4.2.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng ................................................... 39 4.2.2 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo địa phƣơng ................................................................... 40 4.2.3 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo nguồn gốc giống .......................................................... 42 4.3 Quan sát mạch dẫn bằng kính hiển vi huỳnh quang ................................................. 43 4.4 Kết quả RT-PCR dựa theo qui trình của M. Irey ...................................................... 46 4.5 Kết Quả RT-PCR ...................................................................................................... 46 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 48 5.1 Kết luận .................................................................................................................... 48 5.2 Đề nghị ..................................................................................................................... 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 50 vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT Bp: Base pair BYDV: Barley Yellow Dwarf Luteovirus cDNA: complementary DNA CP: Coat Protein DAS-ELISA: Double Antibody Sandswich - ELISA DBIA: Dot-Blot Immunoassay DEPC: Diethyl Pyrocarbonate DNA: Deoxyribonucleic Acid dNTP: Deoxyribonucleoside Triphosphate dsRNA: double stranded RNA ELISA: Enzyme - Linked Immunosorbent Assay EM: Electron Microscopy g: Gram ha: Hecta ISEM: Immunosorbent Electron Microscopy k Da: Kilo Dalton kg: Kilogram ml: Mililitre µl: Microlitre µm: Micrometre mm: Milimetre MP: Movement Protein mRNA: Messenger RNA NASBA: Nucleic Acid Sequence-Based Amplification nm: Nanometre ORF: Open Reading Frame PCR: Polymerase Chain Reaction PEMV: Pea enation mosaic virus PLRV: Potato leaf roll virus PTGS: Posttranscriptional Gene Silencing PVP: Polyvinylpyrrolidone RdRp: RNA dependent RNA polymerase RNA: Ribonucleic Acid RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SCBV: Sugarcane bacilliform virus ScYLV: Sugarcane Yellow Leaf Virus SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sunfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SSR: Single Sequence Repeat ssRNA: Single stranded Ribonucleic Acid TIBA: Tissue Blot Immunoassay UTR: Untranslated Region YLS: Yellow Leaf Syndrome vii DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng ........................................................... 39 Bảng 4.2. Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo địa phƣơng ....................................................... 40 Bảng 4.3. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giống .................................................................................................... 42 Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng ...................................................... 39 Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các địa phƣơng ................................................................ 41 Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo nguồn gốc giống ............................................................... 43 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Sự phân bố của ScYLV trên thế giới .......................................................................... 8 Hình 2.2. Sugarcane yellow leaf virus dƣới kính ....................................................................... 9 Hình 2.3. Rệp lá bắp. Rệp có cánh (A,B), rệp không cánh (C) trƣởng thành. ......................... 11 Hình 2.4. Biểu đồ mô tả bộ gene của Luteovirus thuộc nhóm phụ I và II ............................... 12 Hình 2.5. Cấu trúc kẹp tóc giả định trong bộ gene của ScYLV ............................................... 14 Hình 2.6. Các bó mạch gân lá đƣợc kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang.. ......................... 19 Hình 2.7. Vi ảnh điện tử của lát cắt siêu mỏng của tế bào kèm libe cây mía ........................... 20 Hình 2.8. Kết quả TIBA của vết in gân lá khỏe (trên) và lá bị nhiễm (dƣới) ........................... 21 Hình 2.9. Màng nitrocellulose đƣợc xử lý bằng kỹ thuật TBIA với huyết thanh ..................... 22 Hình 2.10. Kết quả immunoblotting (westren blotting) của protein ScYLV ........................... 22 Hình 2.11. Phân tử Beacon ....................................................................................................... 23 Hình.2.12. Nguyên tắc của phản ứng PCR ............................................................................... 27 Hình 2.13. Sơ đồ phản ứng RT-PCR ........................................................................................ 29 Hình.4.1. Lá biểu hiện triệu chứng vàng gân lá ....................................................................... 37 Hình 4.2 Triệu chứng vàng gân lá bắt đầu từ lá thứ 3 .............................................................. 37 Hình 4.3. Cây biểu hiện triệu chứng vàng gân lá. .................................................................... 38 Hình 4.4. Cánh đồng có triệu chứng vàng gân lá (A). Cánh đồng khỏe mạnh (B) ................. 38 Hình 4.5 Các bó mạch của gân lá đƣợc kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang. ..................... 44 Hình 4.6. Các bó mạch gân lá đƣợc quan sát bằng kính hiển vi quang học (100X) ................ 45 Hình 4.7. Sự phát huỳnh quang của tế bào do có phản ứng chết (200X) ................................. 45 Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR. ......................................................................... 46 Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR ......................................................................................... 47 iv PHẦN 1. MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ở nƣớc ta hiện nay mía là nguyên liệu duy nhất để chế biến ra đƣờng, nên mía là một cây trồng quan trọng trong cơ cấu cây thực phẩm. Ngoài ra, mía còn là cây có sản lƣợng cao (có thể đạt tới 200-250 tấn sinh khối/1ha/năm) và hiệu quả kinh tế cao nên mía là cây xóa đói giảm nghèo cho nông dân (Trần Văn Sỏi, 2003). Tuy nhiên trở ngại lớn trong quá trình canh tác cây mía là bệnh dịch, đặc biệt nhất là bệnh do virus. Trong đó, bệnh do Sugarcane yellow leaf virus (ScYLV) đang là tác nhân gây bệnh quan trọng về kinh tế ở nhiều nƣớc trên thế giới. Virus này đƣợc phát hiện và công bố ở hơn 30 nƣớc trên khắp thế giới nhƣ South Afica, Swaziland, Malawi và Zimbabwe (Bailey et al., 1996), Mauritius (Anon 1996, Saumtally and Moutia, 1997), USA và Australia (Borg et al., 1997), Brazil (Anon., 1995), Cuba (Arocha, Y., Gonzalez, L., Peralta, E. L., and Jones, 1999) (trích bởi Schenck, 2001), Ecuador (Freddy, 2006), … Sugarcane yellow leaf virus gây thiệt hại kinh tế lớn trên các vùng trồng mía, thiệt hại ƣớc tính khoảng 40-60% ở Brazil và hơn 20% ở các vùng khác. Việc chẩn đoán sự nhiễm virus và đƣa ra các biện pháp phòng trừ có ý nghĩa kinh tế rất lớn. Diện tích trồng mía ở nƣớc ta lớn, triệu chứng vàng lá do virus Sugarcane yellow leaf virus cũng đã xuất hiện ở nhiều nơi. Tuy vậy, hiện nay vẫn chƣa có một công trình nghiên cứu nào cụ thể đánh giá sự hiện diện và phân bố cũng nhƣ nguồn gốc của virus này ở nƣớc ta. Việc chẩn đoán và đánh giá tình hình, sự hiện diện nguồn gốc và phân bố của Sugarcane yellow leaf virus là rất cần thiết trong việc hạn chế và phòng ngừa thiệt hại do virus này gây ra tại Việt Nam. Với thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sugarcane yellow leaf virus gây bệnh vàng lá trên mía (YLS) bằng kính hiển vi huỳnh quang và kỹ thuật RT-PCR”. 2 Mục đích ­ Đánh giá tình trạng nhiễm virus ScYLV trên tập đoàn giống gốc và tập đoàn giống mới nhập nội từ Thái Lan tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dƣơng và các tỉnh Bình Dƣơng, Đồng Nai, Long An dựa vào triệu chứng đặc trƣng của bệnh vàng gân lá. ­ Kiểm tra thiết vật từ gân và bản lá mía bằng kính hiển vi huỳnh quang ở bƣớc sóng 510nm, từ đó thiết lập mối tƣơng quan giữa kết quả quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang và triệu chứng vàng gân lá trên mía. ­ Thực hiện quy trình RT-PCR để phát hiện virus ScYLV. Yêu cầu ­ Nắm vững các triệu chứng của bệnh vàng gân lá do ScYLV gây ra. ­ Phân biệt đƣợc sự khác nhau giữa các thiết vật có triệu chứng vàng gân lá và thiết vật không có biểu hiện triệu chứng vàng gân lá. ­ Nắm vững nguyên tắc và cách tiến hành phản ứng RT-PCR. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về cây mía 2.1.1 Về cây mía 2.1.1.1 Phân loại học Theo phân loại thực vật cây mía thuộc: Ngành: Spermatophyta Lớp: Monocotyledneae Họ: Gramineae Loại: Saccharum Trong loại Saccharum có năm loài: - Loài nhiệt đới (Saccharum officinarum L.) - Loài Trung Quốc (Saccharum sinence Roxb Emend. Jesw) - Loài Ấn Độ (Saccharum barberi Jesw) - Loài hoang dại thân nhỏ (Saccharum spontaneum L.) - Loài hoang dại thân to (Saccharum robustum Bround và Jesw) 2.1.1.2 Nguồn gốc a. Loài nhiệt đới (Saccharum officinarum L.) Số nhiễm sắc thể 2n = 80. Loài này có nguồn gốc từ các đảo phía nam Thái Bình Dƣơng (Niu Ghinê), chỉ có nguồn gốc trong mía trồng không thấy ở dạng hoang dại. b. Loài Trung Quốc (Saccharum sinence Roxb Emend. Jesw) Số nhiễm sắc thể 2n = 134. Loài này có nguồn gốc ở Trung Quốc, Miến Điện, Ấn Độ, miền bắc Việt Nam. c. Loài Ấn Độ (Saccharum barberi Jesw) Số nhiễm sắc thể 2n = 92. Loài này có nguồn gốc ở bắc Ấn Độ. d. Loài hoang dại thân nhỏ (Saccharum spontaneum L.) Số nhiễm sắc thể 2n = 112. Loài này mọc dã sinh từ sƣờn núi Himalaya đến vùng Nam Ấn Độ. Từ một nhóm thực vật nhỏ Saccharum spontaneum đã phát triển thành một quần thể rộng lớn bao gồm nhiều loại hình khác nhau. Grassl đã lập một bảng gồm 16 loại hình Saccharum spontaneum khác nhau. e. Loài hoang dại thân to (Saccharum robustum Bround và Jesw) 4 Số nhiễm sắc thể 2n = 84. Loài này mọc dã sinh ở vùng nhiệt đới, ở Niu Ghinê (Trần Văn Sỏi). 2.1.1.3 Vị trí kinh tế của cây mía Hiện nay ở nƣớc ta mía là nguyên liệu duy nhất để chế biến ra đƣờng, nên mía là một cây trồng quan trọng trong cơ cấu cây thực phẩm. Đƣờng là thức ăn lành tính dễ tiêu, giàu năng lƣợng. Một cân đƣờng cung cấp năng lƣợng tƣơng đƣơng với 0,5 kg mỡ; 50-60 kg rau quả. Đƣờng cung cấp 10% nhu cầu năng lƣợng của cộng đồng. Trên thế giới năng lƣợng do đƣờng cung cấp bằng 7% năng lƣợng do các loại ngũ cốc cung cấp (Trần Văn Sỏi, 2003) Đƣờng có thị trƣờng tiêu thụ ổn định do nhu cầu về đƣờng trong nƣớc ngày càng tăng cao. Đƣờng lại là mặt hàng chế biến bằng công nghệ hiện đại nên chất lƣợng ổn định, dễ dàng đạt tiêu chuẩn quốc tế, cho nên nếu sản xuất nhiều sẽ xuất khẩu ra bất cứ nƣớc nào trong khu vực. Vì vậy nên ngƣời trồng mía không có gì lo ngại về thị trƣờng tiêu thụ. Mía là cây xóa đói giảm nghèo cho nông dân trung du, miền núi, là cây có hiệu quả kinh tế cao. Do mía là cây hàng năm, thích hợp với nhiều loại đất, bộ rễ bám sâu nên có khả năng chịu hạn khá, có thể trồng trên đất đồi và trung du miền núi. Vì mía có khả năng lƣu gốc tới vụ sau nên đỡ công và giống trồng. Mía là cây có sản lƣợng cao (200-250 tấn sinh khối/1ha/năm). Nhờ những ƣu thế trên mà cây mía trở thành cây làm giàu cho nhiều gia đình, nhiều khu vực nhƣ Thanh Hóa, Nghệ An, Phú Yên, Bình Định, Quảng Ngãi, … Mía là cây năng lƣợng cuối thế kỷ XX và về sau. Do nguồn nhiên liệu địa khai ngày càng cạn kiệt trong khi nhu cầu năng lƣợng trên thế giới càng tăng nên việc tìm ra một nguồn nguyên liệu thay thế có ý nghĩa rất quan trọng. Nguồn năng lƣợng từ thực vật là hƣớng đƣợc nhiều quan tâm vì đây là nguồn năng lƣợng tái tạo đƣợc hàng năm không bao giờ cạn kiệt. Trong đó, cây mía đƣợc coi là cây năng lƣợng hàng đầu trong các loại thực vật có thể sản xuất năng lƣợng lỏng. Từ một tấn mía có thể sản xuất ra 35-50 lít cồn 960, có thể dùng làm nhiên liệu cho động cơ. Ở Brazil từ lâu ngƣời ta đã sản xuất cồn từ mía để thay thế xăng chạy ô tô vận tải. Mía là cây kiêm dụng, ngoài đƣờng, cellulose trong bã mía có thể làm giấy, làm gỗ ép thay cho một phần gỗ rừng. Mía là cây ngắn ngày lại là cây đặc biệt cao sản nên rất có nhiều triển vọng trong lĩnh vực này. 5 Mía với thành phần hóa học rất phong phú nên ngày càng đƣợc nhiều ngành công nghiệp quan tâm khai thác. Saccarose đƣợc ngành đƣờng khai thác để sản xuất đƣờng trắng. Cellulose đƣợc ngành giấy và ngành gỗ ép khai thác. Mật rỉ trong quá trình lên men, chƣng cất và các phƣơng pháp hóa học khác có thể sản xuất ra rƣợu các loại, cồn tinh khiết, acid lactic, acid nitric, acid glutamic, men thực phẩm, … 2.1.1.4 Sản xuất protein tái tổ hợp từ mía Việc sử dụng cây trồng nhƣ một nhà máy sinh học có năng suất cao đòi hỏi cả một hệ thống chuyển biến nạp và khả năng sản xuất, tích lũy ở mức độ cao các protein tái tổ hợp có giá trị kinh tế cao. Wang và cộng sự (2001) đã tạo ra cây mía chuyển gene tạo ra protein dƣợc liệu có giá trị cao là granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM_CSF). Trên một vài dòng mía đã tạo ra tới 0,03% protein tổng số giống GM-CSF. GM-CSF đƣợc sản xuất từ mía có hoạt tính tự nhiên đƣợc chỉ ra trong thử nghiệm sự tăng sinh tế bào xƣơng ngƣời. Dịch trích từ mía kích thích sự phân chia của tế bào tủy xƣơng (TF-1). 2.1.2 Một số bệnh do virus trên cây mía 2.1.2.1 Peanut Clump Furovirus Peanut Clump Furovirus (PCV) gây bệnh đốm đỏ trên lá mía đã đƣợc công bố đầu tiên bởi Baudin và Chatenet (1988). Biểu hiện triệu chứng do Peanut Clump Furovirus gây ra thƣờng biến đổi và phụ thuộc vào giống (Baudin và Chatenet, 1988; Baudin và cộng sự, 1994; Rott, 1996). Các triệu chứng thƣờng là xuất hiện những sọc vàng úa với những đốm vàng hay đỏ. Toàn bộ lá sẽ trở thành màu nâu hơi vàng (Braithwaite, 2001). 2.1.2.2 Sugarcane Bacilliform Badnavirus Công bố đầu tiên của dạng virus hình que trên mía là ở Cuba (Rodriguez-Lema và cộng sự, 1985). Sau đó, Lockhart và Autrey (1988) đã công bố rằng dòng Mex.57- 473 trồng ở Morocco và Hawaii và CP44-101 từ Morocco đã chứa virus hình que tƣơng tự banana streak virus (BSV) đƣợc tìm ra gần đó (Lockhart, 1986). Virus có tên là sugarcane bacilliform virus (SCBV) có quan hệ gần với BSV và chúng đƣợc chứng minh là cùng thuộc một loại virus (Lockhart và Olszewski, 1993). Triệu chứng của SCBV thì thƣờng biến đổi và không chắc chắn. Sự đồng nhiễm của SCBV và các virus khác đã đƣợc nhận thấy. Tất cả các dòng nhiễm với sugarcane mild mosaic virus đều nhiễm SCBV (Lockhart và cộng sự, 1992). 6 Ảnh hƣởng của SCBV với năng suất trên mía không đƣợc xác định rõ ràng. Sinh khối sinh ra ở giống mía CP63-588 bị nhiễm SCBV giảm đáng kể từ 23-31% trong khi sinh khối sinh ra tăng ở giống CP65-357 bị nhiễm SCBV. 2.1.2.3 Sugarcane Mild Mosaic Closterovirus Trong quá trình kiểm tra SCVB trên mía bằng kính hiển vi điện tử ngƣời ta đã thấy những dạng hạt dài khúc khuỷu ở Mauritius và Mỹ. Những hạt này trƣớc đây không đƣợc biết đến trên mía và xuất hiện tƣơng tự với Closterovirus. Virus này ban đầu có tên là sugarcane clostero-like virus, nhƣng bây giờ nó đƣợc gọi là sugarcane mild mosaic closterovirus (SCMV; Lockhart và cộng sự, 1992). 2.1.2.4 Ramu Streak Ramu streak đƣợc phát hiện đầu tiên ở vùng đất Ramu, Papua New Guinia vào giữa những năm 1980 nhƣng nó không đƣợc coi là vấn đề cho đến năm 1993 khi nó xuất hiện trên giống Casius (Magarey và cộng sự, 1996). Triệu chứng của Ramu streak tƣơng tự với bệnh sọc vàng trên mía. Ảnh hƣởng của bệnh lên năng suất thì không đƣợc biết đến. 2.1.2.5 Reovirus ở Nam Phi Một bệnh mới đã đƣợc tìm thấy ở Nam Phi năm 1994 (Bailey, 1996). Những nốt nhỏ xuất hiện trên bề mặt lá và bẹ lá nhƣng thƣờng thƣa thớt và không dễ nhận thấy. Bệnh này không biểu hiện ảnh hƣởng trên cây trƣởng thành. Những hạt virus hình cầu có thể đƣợc quan sát bởi kính hiển vi điện tử từ những nốt bệnh. Hạt virus này có chứa dsRNA và primer của RT-PCR đƣợc thiết kế cho Fiji disease virus (FDV) có thể đƣợc sử dụng để tạo ra sản phẩm PCR. Triệu chứng, kích thƣớc, hình dạng virus và bộ gene RNA sợi đôi (dsRNA) chứng tỏ rằng virus mới này tƣơng tự với FDV và thuộc nhóm Reovirus. 2.1.2.6 Fijivirus Nguyên nhân của bệnh Fiji trên mía là do họ Reoviridae. Bệnh này thƣờng xảy ra ở Australia. Nó đƣợc truyền bởi vector là Perkisiella sp. planthoppers. Bệnh này đƣợc phát hiện dựa vào triệu chứng, RT-PCR hoặc ELISA. 2.1.2.7 Sugarcane mosaic virus (SCMV) Đây là virus đƣợc phân bố rộng rãi, nhƣng sự đột phát thƣờng bị giới hạn ở những vùng lạnh. Sự mất mùa có thể lên tới trên 20%. Bệnh này có thể đƣợc phát hiện dựa vào triệu chứng hoặc kỹ thuật ELISA, PCR, RFLP. 7 2.2 Bệnh vàng gân lá trên mía và sugarcane yellow leaf virus 2.2.1 Bệnh vàng gân lá trên mía 2.2.1.1 Nguyên nhân Triệu chứng vàng gân lá đã đƣợc biết đến từ lâu với những tên gọi khác nhau nhƣ “Yellow wilt” ở châu Phi (Ricaud, 1968; Siddiqi, 1969; Rogers, 1970) và “autum decline” ở Brazil (Hughes, 1964) (trích bởi Lockhart và cộng sự, 2000). Triệu chứng này cũng đã đƣợc nhận thấy ở Hawaii trong những năm 1980 và sau đó là nhiều nƣớc khác trên khắp thế giới (Comstock và cộng sự, 2002; Izaguirre-Mayoral và cộng sự, 2002; Lockhart và cộng sự, 1996; Lockhart và Cronje, 2000; Vega và cộng sự, 1997; Viswanathan, 2002). Nhƣng đến những năm 1980 ngƣời ta mới biết rõ về nguyên nhân gây bệnh (Schenk và Hu, 1991; Comstock và cộng sự, 1994). Có hai tác nhân liên quan đến triệu chứng vàng lá trên mía. Một là Sugarcane Yellow Leaf Virus (ScYLV) (Lockhart và cộng sự, 1996; Vega và cộng sự, 1997; Scagliusi và Lockhart, 2000) và tác nhân còn lại là Sugarcane yellows phytoplasma (ScYP) (Cronjé và cộng sự, 1998). Tuy nhiên một vài báo cáo khác chỉ ra rằng triệu chứng tƣơng tự cũng có thể bị gây ra bởi côn trùng, stress sinh lý, thời tiết, một vài phản ứng chống stress và một vài yếu tố vô sinh khác (Bailey và cộng sự, 1996; Matsuoka và Meneghin,1999). 2.2.1.2 Sự phân bố địa lý Bệnh vàng gân lá do ScYLV hiện nay đƣợc báo cáo là hiện diện ở nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Argentina, Australia, Barbados, Brazil, Colombia, Cuba, Dominican Republic, El Salvador, Guadeloupe, Guatemala, Hawaii, India, Iran, Jamaica, Kenya, Martinique, Mexico, Morocco, Mozambique, Nicaragua, Peru, Réunion, Senegal, Nam Phi, Swaziland, Thailand, Uganda, Mỹ, Venezuela, Zambia, Zimbabwe, … (Lockhart và cộng sự, 2000) (hình 2.1). 8 Hình 2.1. Sự phân bố của ScYLV trên thế giới (Nguồn: Salem Saumtally và cộng sự) 2.2.1.3 Triệu chứng Triệu chứng đặc trƣng của bệnh vàng gân lá giống nhau ở tất cả mọi nơi. Gân lá màu vàng tƣơi, đặc biệt ở trên bề mặt và đỉnh của lá trở nên vàng, sau đó hoại tử. Hoại tử lan rộng xuống bản lá cho tới khi toàn bộ lá bị nhiễm. Thƣờng thì lá non nhất không có biểu hiện triệu chứng, nhƣng màu vàng xuất hiện ở những lá thứ tƣ hoặc thứ năm và những lá già hơn. Những cây non thƣờng không biểu hiện trên đồng ruộng mặc dù những cây non trong nhà kính đôi khi có những triệu chứng đặc trƣng dƣới những điều kiện stress (Schenck, 2001). Trong một vài trƣờng hợp thì mặt dƣới của gân lá trở nên vàng hơn lá già. Mặt trên của gân lá có thể vẫn giữ màu bình thƣờng (trắng hoặc trắng hơi xanh) hoặc có thể trở vàng, hồng hay hơi đỏ. Sự đổi màu của gân lá thƣờng xảy ra trong khi bản lá vẫn giữ màu xanh. Ở một số giống màu vàng của lá có thể ảnh hƣởng tới toàn bộ lá. Sự thay đổi sang màu vàng cũng có thể lan rộng ra bản lá và hoại tử bắt đầu từ chóp lá phát triển tới bản lá. Triệu chứng này thƣờng tạm thời và nhạt dần khi cây bắt đầu đƣợc chăm sóc tốt. Sự biểu hiện triệu chứng vàng gân lá trên mía rõ ràng hơn ở những cây trƣởng thành và những cây bị stress. Sự biểu hiện triệu chứng liên quan đến giống, nhiệt độ 9 lạnh hoặc yếu tố stress khác và cây bị nhiễm trên đồng thƣờng không có biểu hiện triệu chứng (Schenck và cộng sự, 2001). Đối với những cây có triệu chứng YLS thì brix cao hơn từ 2 đến 3 lần so với những cây khỏe mạnh. Vega và cộng sự (1997) đã nhận thấy sự tích lũy fenola trong mạch libe, điều đó chứng tỏ có sự rối loạn chức năng của mạch dẫn. Ở những vùng lá khác nhau thì sự giảm tổng lƣợng đƣờng, hàm lƣợng chlorophyl và sự vận chuyển đƣờng đã đƣợc nhận thấy giữa cây có triệu chứng và cây không có triệu chứng nhiễm với virus ScYLV. 2.2.2 Sugarcane yellow leaf virus 2.2.2.1 Virus ScYLV Sugarcane yellow leaf virus là một virus mới đƣợc mô tả gần đây, nó nhiễm vào mía và gây ra triệu chứng vàng gân lá (YLS) (Vega và cộng sự, 1997; Scagliusi và Lockhart, 2000). Hạt virus ScYLV có đƣờng kính từ 24-29 nm trong sodium phosphatungstate ở pH5 (hình 2.2). Nó có tỉ trọng là 1,30g/cm3 trong Cs2SO4 và chứa 5,8 kb ssRNA. Protein vỏ có trọng lƣợng 27 kDa và không chứa glycosylate. (Scagliusi và Lockhart, 2000). Hình 2.2. Sugarcane yellow leaf virus dƣới kính hiển vi điện tử (24-28nm), tỉ lệ thƣớc 100nm. (Nguồn: Scagliusi và Lockhart, 2000) 10 2.2.2.2 Huyết thanh học Kháng huyết thanh từ barley yellow dwarf lueovirus (BYDV) kiểu huyết thanh (serotype) PAV, MAV và RPV đã đƣợc kiểm tra cho phản ứng huyết thanh với mô mía bị nhiễm ScYLV (Vega và cộng sự, 1997). Kết quả cho thấy có mối quan hệ huyết thanh học giữa BYDV-PAV và ScYLV. Bằng việc in những vết cắt mô gân lá lên màng nitrocellulose và xử lý chúng với huyết thanh miễn dịch BYDV-PAV, phản ứng miễn dịch dƣơng tính đã đƣợc nhận thấy trong những tế bào libe của những bó mạch (Vega và cộng sự, 1997). Kết quả dƣơng tính chỉ nhận thấy ở những cây bị nhiễm với ScYLV, nhƣng không bao giờ thấy ở những cây khỏe mạnh đƣợc trồng bằng hạt trong nhà kính. Huyết thanh miễn dịch đặc hiệu cho ScYLV đƣợc Lockhart nghiên cứu từ virus đã đƣợc tinh sạch (Scagliusi và Lockhart, 2000). Hiện nay nó đã đƣợc sản xuất thành công từ những mẫu ở nhiều nơi để phát hiện ScYLV bằng cả kỹ thuật ELISA và TBIA (Schenck, 2001). 2.2.2.3 Sự truyền nhiễm của ScYLV Quá trình thử truyền mầm bệnh từ dịch trích của cây mía bị nhiễm với ScYLV vào cây khỏe mạnh và các cây thảo mộc khác thì không thành công (Borth và cộng sự, 1994; Lockhart và cộng sự, 1996 (trích bởi Schenck, 2001); Scagliusi và Lockhart, 2000). Một vài loài rệp ở trên mía đã đƣợc kiểm tra khả năng truyền virus và kết quả là rệp mía Melanaphis sacchari và rệp lá bắp Rhopalosiphum maidis (hình 2.3) là vector của ScYLV trong khi rệp vàng lá mía thì không (Angel và cộng sự, 2006; Scagliusi và Lockhart, 2000; Schenck và Lehrer, 2000). Virus này không bị truyền bởi những hạt thuần hay bởi phƣơng tiện cơ giới mà chỉ có thể lan rộng trên cánh đồng bởi hạt của những cây đã bị nhiễm hoặc bởi những vector (Schenck và cộng sự, 2001). Con rệp bắp (Rhopalosiphum maidis) thƣờng ở trên cây bắp và nó ít khi phá hoại trên cây mía. Theo Schenck và cộng sự (2001) rệp này cũng truyền ScYLV ở tỷ lệ thấp. Rệp ở rễ cây lúa (Rhopalosiphum rufiabdomilanis) đã truyền ScYLV từ cây lúa bị nhiễm ScYLV sang cây lúa không bị nhiễm nhƣng không truyền virus từ mía sang mía (Schenck và cộng sự, 2001). 11 Hình 2.3. Rệp lá bắp. Rệp có cánh (A,B), rệp không cánh (C) trƣởng thành. (Nguồn: http//:ipm_ncsu_edu-AG295-pics-corn_leaf_aphid_gif.htm) 2.2.2.4 Thời gian và không gian phân bố của ScYLV Ở Lousiana thời gian gia tăng nhanh nhất của ScYLV xảy ra vào cuối mùa thu và đầu mùa hè cùng với sự gia tăng và bắt đầu tàn phá của loài rệp mía Melanaphis sacchari (McAllister và cộng sự, 2006) Ở Hawaii YLS thƣờng xuất hiện nhất vào những tháng mùa hè do stress bởi nƣớc. Ở Florida triệu chứng này biểu hiện do hạn hán, úng nƣớc và lạnh vào mùa đông. Triệu chứng bắt đầu xuất hiện với những gân lá từ thứ 3 đến thứ 6 (tính từ ngọn xuống) trở nên vàng khi thời tiết bắt đầu trở lạnh vào tháng 10 và 11. Sau đó màu vàng lan ra bản lá và hoại tử bắt đầu từ đỉnh lá lan ra bản lá vào tháng 12 cho đến cuối mùa thu hoạch vào tháng 3. Từ tháng 1 đến tháng 3 toàn bộ cánh đồng trở thành màu vàng (Comstock và Miller, 2003). Borg (1997) đã báo cáo rằng YLS hiện diện rõ ràng nhất suốt những tháng lạnh ở Australia và cũng tƣơng tự ở Brazil. 2.2.2.5 Những kí chủ khác của ScYLV Các cây bắp, lúa, lúa mì, lúa mạch, yến mạch đƣợc lây nhiễm với ScYLV qua rệp đƣợc kiểm tra nhƣ là những kí chủ khác của ScYLV. Những cây này đƣợc trồng từ hạt trong các chậu và đƣợc chủng với những rệp mía có mang virus. Kết quả cho thấy các cây đều có thể bị nhiễm virus (lúa mì (wheat) 96,5%, yến mạch (oat) 94,6%, lúa 12 mạch (barley) 93,7%) nhƣng chỉ có một tỉ lệ thấp của cây lúa và bắp đƣợc kiểm tra là dƣơng tính (lúa (rice) 8,5%, bắp (corn) 10,5%) (Schenck và cộng sự, 2001). 2.2.2.6 Những nghiên cứu về bộ gene của ScYLV Dựa trên những phân tích trình tự nucleotide, ScYLV đƣợc xếp là một giống mới trong họ luteoviridae. Virus này cũng có những đặc tính của giống polerovirus, luteovirus và enamovirus (Moonan và cộng sự, 2000; Smith và cộng sự, 2000). Tuy nhiên, nó đƣợc mô tả rõ ràng là một loài khác vì những đặc tính sinh học độc nhất và sự khác biệt ở mức độ phân tử mà nó đƣợc xem là sự tái tổ hợp giữa các loài khác nhau (Moonan và cộng sự, 2000; Smith và cộng sự, 2000). Dựa vào trình tự và sự sắp xếp của các khung đọc mở (ORF), luteovirus đƣợc chia thành hai nhóm phụ (subgroups I và II). Trình tự bộ gene của ScYLV đã đƣợc chứng minh là thuộc bộ gene của nhóm phụ II (hình 2.4). Hình 2.4. Biểu đồ mô tả bộ gene của luteovirus thuộc nhóm phụ I và II (Nguồn: Schenck, 2001) Trình tự nucleotide hoàn chỉnh của bộ gene ScYLV đƣợc phân lập từ Ấn Độ đã đƣợc xác định. Bộ gene RNA này dài 5899 nucleotide bao gồm 6 khung đọc mở (ORF): ORF1 (72,5 kDa): mã hóa cho protein đa chức năng. ORF2 (64.4 kDa): mã hóa cho RNA polymerase không phụ thuộc RNA (RdRp). ORF3 (21.8 kDa): mã hóa cho protein vỏ (CP). ORF 4 (16.6 kDa): mã hóa cho protein di chuyển giả định p17. ORF5 ORF3 ORF1 ORF2 ORF4 ORF6 5’ 3’ Subgroup I ORF1 ORF4 ORF0 ORF2 ORF5 5’ 3’ Subgroup II 13 ORF5 (52.1 kDa): mã hóa cho yếu tố truyền aphid giả định. ORF0: chức năng chƣa biết. Sự so sánh protein vỏ và trình tự 17kDa cho thấy ScYLV có quan hệ gần với virus trong giống luteovirus. Dựa trên trình tự ở đầu 5’ của ScYLV thì thấy nó tƣơng tự với giống polerovirus, trong khi trình tự ở đầu 3’ thì gần với giống luteovirus. Đây là những mô tả đầu tiên về đặc điểm phân tử của ScYLV ở Ấn Độ (Gaur và cộng sự, 2003). Moonan và cộng sự (2000) đã giải trình tự bộ gene ScYLV. Dựa trên trình tự nucleotide mới của ScYLV và trình tự của luteovirus hiện tại, đồng thời sử dụng phƣơng pháp luận tiến hóa và phát sinh chủng loài để tìm vùng tƣơng đồng của bộ gene luteovirus. Kết quả cho thấy tỷ lệ thay thế các nucleotide và tạo ra loài mới của luteovirus là có ý nghĩa về phƣơng diện thống kê. Kết quả cũng chỉ ra rằng Pea enation mosaic virus-1 (PEMV-1), Soybean dwarf virus (SbDV), và ScYLV biểu hiện biến dị phát sinh chủng loài địa lý (spatial phylogenetic variation (SPV)) phù hợp với sự tái tổ hợp xảy ra giữa hai tổ tiên là luteovirus và polerovirus sau khi có sự phân li di truyền của hai nhóm tổ tiên này. Toàn bộ trình tự RNA gồm 5895 nucleotide của ScYLV đƣợc phân lập từ Florida (ScYLV-F) đã đƣợc giải trình tự bao gồm 6 ORF (Smith và cộng sự, 2000). Kết quả cho thấy, đầu 5’ thuộc vùng không dịch mã (UTR, untranslated region) bắt đầu với trình tự ACAAAA thì phù hợp với motif ở đầu 5’ của polerovirus. Bộ gene của ScYLV-F đƣợc sắp xếp giống nhƣ ở poleovirus. ORF0 của ScYLV-F bắt đầu ở codon AUG thứ nhất trong trình tự và nó mã hóa cho một protein 30,2 kDa. ORF1 của ScYLV-F mã hóa cho một protein 72,5 kDa tƣơng tự với gene tƣơng đƣơng ở trên bộ gene của polerovirus và Pea enation mosaic virus-1 (PEMV-1; enamovirus) cũng mã hóa cho một protease. ORF2 của SCYLV-F hầu nhƣ tƣơng đồng với những gene RNA polymerase không phụ thuộc RNA (RNA dependent RNA polymerase (RdRp)) của poleroviruses sobemoviruses, barnaviruses và PEMV-1. Đầu 5’ của ScYLV-F RdRp overlap trên khung đọc 1 ở nucleotide 460. Có một trình tự heptamer, 5’GGGAAAC3’ ở trên overlap ở vị trí 1753 và trình tự ở đầu 3’ của motif heptamer có thể là ở dạng kẹp tóc (pseudoknot) (hình 2.5). Các trình tự này ở trên overlap của ORF 1 và 2 thì đƣợc bảo 14 tồn trên bộ gene của polerovirus và PEMV-1 và cho phép khung đọc dịch chuyển ribosomal 1 từ gene ORF1 đến gene RdRP. Heptamer và pseudoknot có thể là có cùng vai trò trong bộ gene của ScYLV-F và vì thế mà ORF 1 và 2 của ScYLV-F có thể đƣợc dịch mã liền nhau, sự dịch chuyển khung đọc tạo ra protein dung hợp (fusion protein) 120,6 kDa. ORF3 hầu nhƣ tƣơng đồng với gene mã hóa protein vỏ (CP; 22 kDa) của BYDV-PAV. Tƣơng tự ORF4 cũng tƣơng đồng với gene mã hóa protein vận chuyển (MP) (Smith và cộng sự, 2000) của BYDV-PAV. Cũng nhƣ trên bộ gene của các luterovirid khác, gene mã hóa protein vận chuyển (ORF4) nằm hoàn toàn trong trình tự mã hóa ORF3, trong khung đọc 1. Đầu N của protein vỏ (CP) (ORF3) của ScYLV-F thì giàu arginine và gene CP của ScYLV-F kết thúc với một đột biến vô nghĩa, giống nhƣ tất cả các gene CP ở các luteovirid khác và codon này đƣợc theo sau bởi codon đầu tiên của gene mã hóa protein RT (read-through, đọc xuyên: kiểu phiên mã di truyền mà việc tổng hợp RNA của một operon lại bắt đầu từ khởi điểm operon khác) (ORF5). Trình tự quanh vùng đột biến vô nghĩa đƣợc bảo tồn cao (Smith và cộng sự, 2000). . Hình 2.5. Cấu trúc kẹp tóc giả định trong bộ gene của ScYLV (Nguồn: Smith và cộng sự, 2000) ORF0 của ScYLV mã hóa cho protein 30kDa có ít amino acid tƣơng đồng với các protein P0 của những polerovirus khác. Trong 3 protein P0 của polerovirus (PLRV, BWYV và CABYV) ảnh hƣởng đến sự tích lũy của virus cũng nhƣ sự kìm hãm của posttranscriptional gene silencing (PTGS). Sử dụng Nicotiana benthamiana 15 với cấu trúc GFP reporter, protein P0, và PTGS, Albert và cộng sự (2006) đã chỉ ra rằng protein P0 của SCYLV cũng im lặng ở vị trí PTGS bị gây ra bởi cấu trúc sense GFP (sGFP). Không giống nhƣ protein P0 của BWYV, PLRV và CABYV, protein P0 của SCYLV ức chế ảnh hƣởng của PTGS bởi sGFP nhƣng nó không đƣợc gây ra bởi cấu trúc inverted repeat GFP (irGFP). Phân tích chức năng protein P0 bằng cách xóa bỏ cấu trúc P0 của SCYLV cho thấy protein này có nhiều vùng cần thiết cho chức năng ức chế của protein này. Thấm lá với protein P0 của SCYLV, kết quả là xuất hiện những vết hoại tử ở trên những đốm đƣợc thấm, sự hủy bỏ hoạt tính ức chế cũng mất đi sự hoại tử, điều đó chứng tỏ những hoạt tính này có thể đƣợc liên kết. Những nghiên cứu về đa dạng di truyền gần đây đã thừa nhận sự tồn tại một vài kiểu gene của ScYLV. Để xác định và mô tả chính xác các kiểu gene của ScYLV, Abu và cộng sự (2006) đã giải trình tự toàn bộ bộ gene (gồm 6 ORF) của 8 ScYLV phân lập từ 6 vùng khác nhau (Brazil, China, Colombia, Cuba, Peru, và Reunion). Bốn kiểu gene của ScYLV (BRA ở Brazil, CUB ở Cuba, PER ở Peru và REU ở Reunion) đã đƣợc phát hiện dựa vào phân tích phát sinh chủng loài với trình tự bộ gene của 6 vùng này. Những cặp primer đặc hiệu đã đƣợc thiết kế để phát hiện từng kiểu gene của ScYLV bằng RT-PCR. Kết quả cho thấy một vài kiểu gene của ScYLV có thể cùng tồn tại trên một vùng địa lý hoặc trên cùng một cây (Abu Ahmad và cộng sự, 2006). 2.2.3 Ảnh hƣởng về kinh tế của bệnh vàng gân lá ScYLV là một tác nhân gây bệnh quan trọng về kinh tế ở Cauca Valley, Colombia. Trong năm 2004, tỉ lệ nhiễm virus này trên toàn bộ cánh đồng trồng mía nguyên liệu là 12,2% (S, J.C Angel và cộng sự, 2006). Ở Brazil virus này đã nhiễm 25% trên giống SP 71-6163 và 750 000 ha trên toàn bộ diện tích trồng mía (Vega và cộng sự, 1997). Giống SP 71-6163 mẫn cảm cao với ScYLV, ƣớc tính làm mất 40- 60% lƣợng đƣờng (Lockhart và cộng sự, 1996). ScYLV đã hiện diện trên toàn bộ các cánh đồng mía công nghiệp ở Lousiana (McAllister và cộng sự, 2006). Năng suất giảm 15 đến 20% cũng đã đƣợc báo cáo do ScYLV ở Louisiana (Grisham và cộng sự, 2002). Sự giảm năng suất (lƣợng đƣờng trên đơn vị diện tích) ở giống LCP 82-89 cao nhất ở vụ gốc thứ hai là 23% (Grisham). Ở Florida có ít nhất 65% diện tích trồng mía thƣơng mại bị nhiễm với ScYLV (Irey và cộng sự, 1997; ). Ở Nam Phi và Hawaii ảnh hƣởng của YLS trên mía đã làm giảm đáng kể hàm lƣợng phức hợp polysaccharide (gums) đƣợc tách chiết (Lockhart và cộng sự, 2000). 16 2.2.4 Những nghiên cứu về tính kháng ScYLV trên mía Marker phân tử liên kết với tính kháng đã đƣợc sử dụng để chọn lọc kiểu gene của những cá thể và có thể cung cấp công cụ để xác định tính kháng ở trên mía. Mục tiêu là tìm những quần thể có những cá thể kháng lại bệnh vàng lá. Kết quả là tìm thấy 39 dòng trong quần thể lai Green German x Ind 81-146 là không có bệnh SCYLV trong suốt quá trình thí nghiệm (Comstock và cộng sự, 2005). Comstock và cộng sự (2006) đã nghiên cứu về marker phân tử liên kết với tính kháng bằng cách sử dụng microsatellite primer. Mục đích là phát triển phƣơng pháp xác định các dòng kháng với ScYLV một cách nhanh chóng và chính xác. Với 216 microsatellite primer đã xác định đƣợc 12 cây nhiễm và 11 cây kháng từ quần thể 65 cây con lai từ Green German (nhiễm) và IND 81-146 (kháng). Trong số 216 microsatellite primer có 167 primer cho ra ít nhất 4 band. Kết quả đã chỉ ra rằng có 3 band đa hình microsatellite liên kết với tính kháng ScYLV. Phân tích kiểu gene trên 47 cây con cho thấy có 2 loci SSR liên kết với tính kháng nhƣng không liên kết với locus SSR khác. Trên một vài giống mía có khả năng kháng lại với ScYLV và tính kháng này có thể di truyền đƣợc (Schenck và Lehrer, 2001). Những nghiên cứu về tính kháng trên mía đã chỉ ra rằng các giống CC 84-75, CC 87-505, PR 61-632 mẫn cảm với ScYLV, nhƣng giống CC85-92 thì kháng tốt với ScYLV (Angel và cộng sự, 2006). Ở Hawaii các giống H 78-4153, H 78-3567, H 78-7750 và H87-4319 đƣợc báo cáo là kháng với ScYLV (Schenck và Lehrer, 2000). Các giống mía mới, Saccharum officinarum ít mẫn cảm (nhƣ là S. robustum. Saccharum spontaneum, S. sinensis và Erianthus sp.) thƣờng không có virus ở trên cánh đồng mía ở Maunawili, nó đƣợc cho là liên quan đến tính kháng (Schenck và cộng sự, 2001). 2.2.5 Tạo cây mía chuyển gene kháng ScYLV Giống mía kháng ScYLV có thể đƣợc tạo ra thông qua biến nạp. Sự bất hoạt gene đƣợc coi nhƣ một cơ chế phổ biến cho sự kháng của cây trồng đối với sự nhiễm của virus. Bất hoạt gene sau sao mã (posttranscriptional gene) đã đƣợc hƣớng tới trong cây mía bởi biến nạp với vùng không giải mã của ScYLV. Bộ gene của ScYLV và chức năng các protein của virus đã đƣợc biết đến (F. Moonan, 2000), vì thế chiến lƣợc tạo ra cây mía kháng ScYLV có thể dễ dàng. 17 Giống H62-4671 đã đƣợc biến nạp với một vùng trình tự DNA không dịch mã (non-traslatabe DNA sequence piece) của protein vỏ virus mà nó làm bất hoạt gene RNA của virus để chống lại sự nhiễm virus. Mía có một hệ thống bất hoạt gene rất hữu hiệu (Y. J. Zhu, 2003). Phôi phát sinh từ mô sẹo của giống lai CC 84-75 đƣợc bắn với plasmids pFM395 và pFM396 chứa một đoạn DNA mã hóa protein vỏ của ScYLV. Những cây đã biến nạp đƣợc ủ với ScYLV bởi Melanaphis sacchari. Sự nhiễm đƣợc kiểm tra sau một vài tháng bằng kỹ thuật TBIA và RT-PCR. Kết quả thu đƣợc 37 cây từ 66 cây đƣợc kiểm tra là âm tính với ScYLV (Rangel và cộng sự, 2005). 2.2.6 Tạo cây mía sạch bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô Có 3 phƣơng pháp để loại bỏ virus đƣợc sử dụng là xử lý nhiệt, nuôi cấy mô, xử lý bằng hóa chất. Tuy nhiên, xử lý nhiệt và hóa chất thì không có hiệu quả trong việc loại bỏ virus ScYLV (M. Chatenet và cộng sự, 2001). Có thể tạo cây sạch ScYLV bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô (M. Chatenet và cộng sự, 2001; Y. Parmessur và cộng sự, 2002). Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng là phƣơng pháp hiệu quả nhất trong việc sản xuất cây sạch virus và cũng là phƣơng pháp đƣợc chọn để loại bỏ virus khỏi cây bị nhiễm. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng có thể tạo ra 92% cây sạch virus, nhƣng chỉ đạt 29% khi nuôi cấy bằng chồi đỉnh (M. Chatenet và cộng sự, 2001). Tuy nhiên, theo Parmessur (2002) khi nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng chỉ tạo ra 64% cây sạch virus, chỉ có 6% khi nuôi cấy bằng chồi nách. Nhƣng khi nuôi cấy từ mô sẹo sẽ tạo ra 100% cây sạch virus (Y. Parmessur và cộng sự, 2002). 2.2.7 Một số kỹ thuật trong chẩn đoán ScYLV 2.2.7.1 Phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bằng cây chỉ thị Cây chỉ thị thực chất cũng là cây ký chủ của virus, nhƣng đặc biệt hơn là chúng mẫn cảm cao với virus và tạo ra các triệu chứng rất điển hình trên thân, lá, … Các triệu chứng này giúp ta chẩn đoán khá chính xác các bệnh do virus. Đối với virus, có 2 nhóm chỉ thị: nhóm chỉ thị theo bộ phận (necrotic) và nhóm chỉ thị theo hệ thống (systemic). Nhóm chỉ thị theo bộ phận là những cây chỉ thị mà khi ta truyền bệnh nhân tạo sẽ có vết chết cục bộ ngay trên bề mặt lá mà không di chuyển đến những bộ phận khác của cây. Ví dụ nhƣ cây cà độc dƣợc (Datura stramonium) khi bị nhiễm TMV sẽ xuất hiện những vết đốm chết hình tròn trên mặt lá sau khi lây bệnh từ 3 - 5 ngày trong điều kiện nhiệt độ 25 - 30oC. Nhóm chỉ thị theo hệ 18 thống là những cây chỉ thị mà khi ta truyền bệnh nhân tạo sẽ tạo sự chết hệ thống trên toàn cây (Vũ Triệu Mân và Lê Lƣơng Tề, 1998). 2.2.7.2 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng Triệu chứng bên ngoài: Các triệu chứng phổ biến là đốt cuối ngắn, vàng những lá cuối, mặt dƣới của gân lá trở nên vàng hơn lá già, hoại tử bắt đầu từ chóp lá, … Triệu chứng bên trong: Sự thay đổi tế bào và mô có thể quan sát qua kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử. Ngƣời ta còn quan sát những cấu trúc khác nhau do virus sản sinh ra, thƣờng là những thể vùi. 2.2.7.3 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng Brix kế Độ brix đƣợc đánh giá vào giai đoạn mía 10 tháng tuổi bằng Brix kế trên gân chính lá +1 và đƣợc chia thành 4 mức độ nhiễm bệnh khác nhau: ­ Không bị bệnh: không có triệu chứng, độ brix nhỏ hơn 7. ­ Nhiễm nhẹ: độ brix từ 7 đến 14. ­ Nhiễm trung bình: Nhìn mặt trên và mặt dƣới lá có màu vàng, độ brix lớn hơn 14, phiến lá có màu vàng lan ra từ gân chính. ­ Nhiễm nặng: toàn bộ phiến lá và gân lá chính có màu vàng, triệu chứng khô từ cổ lá xuống bẹ lá, toàn bộ cây trong bụi có triệu chứng bệnh, độ brix lớn hơn 14, bụi có thể nhổ lên dễ dàng (Hà Đình Tuấn, 2004). 2.2.7.4 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi huỳnh quang Những lát cắt tƣơi đƣợc cắt từ gân, bẹ lá và thân bởi dao lam đƣợc làm tiêu bản trên một giọt nƣớc cất hai lần trên lam kính và đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi quang học. Toàn bộ mô đƣợc nghiên cứu với sự chuyển từ ánh sáng trắng sang ánh sáng xanh bởi đèn huỳnh quang. Sự kiểm tra huỳnh quang với ánh sáng kích thích màu xanh đƣợc tiến hành thông qua một kính tách màu nhị sắc ở bƣớc sóng 510nm và một kính lọc màu vàng chặn lại tại bƣớc sóng 510nm. 19 Hình 2.6. Các bó mạch gân lá đƣợc kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang. (A) Chất huỳnh quang màu vàng xanh (đầu mũi tên) trong mạch libe với triệu chứng vàng gân lá. (B) Cây không có triệu chứng các bó mạch libe bình thƣờng (J. Vega và cộng sự, 1997). Kiểm tra những lát cắt từ cây có triệu chứng vàng gân lá bởi phƣơng pháp phát huỳnh quang đã phát hiện ra những bó mạch với chất phát huỳnh quang màu vàng xanh ở trong mạch libe (hình 2.6 A). Trong những cây không có biểu hiện triệu chứng thì hiếm khi xuất hiện màu huỳnh quang trong mạch libe (hình 2.6 B). 2.2.7.5 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử Những lát cắt cực mỏng từ lá, gân hoặc thân mía sau khi sử lý bằng hóa chất đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. Virus đƣợc tìm thấy ở dạng kết tụ vô định hình trong tế bào chất của tế bào kèm của mạch libe. Trong tế bào kèm, virus chỉ xuất hiện ở tế bào chất không thấy ở trong nhân hay các cơ quan tử khác của tế bào chất. Đƣờng kính của hạt virus từ 22 đến 24 nm. 20 Hình 2.7. Vi ảnh điện tử của lát cắt siêu mỏng của tế bào kèm libe cây mía (VP: virus particles, CW: cell wall, N: nucleus, tỷ lệ thƣớc 100nm). (Nguồn: Vega, 1997) 2.2.7.6 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật DAS-ELISA Kháng nguyên thu đƣợc (hạt virus tinh sạch) sẽ đƣợc tiêm vào thỏ New Zeland để thu globulin miễn dịch. Kháng thể sau khi sản xuất sẽ đƣợc sử dụng cho DBIA, TBIA, ISEM để phát hiện các mô bị nhiễm ScYLV (Angel và cộng sự, 2006). DAS-ELISA đƣợc thực hiện trên kháng nguyên từ lá mía và dịch nƣớc mía cho thấy kháng nguyên từ dịch nƣớc mía có chuẩn độ cao hơn kháng nguyên từ lá mía (R Viswanathan và M Balamuralikrishnan, 2004). 2.2.7.7 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng tissue blot immunoassay (TIBA) Cũng giống nhƣ ELISA, TIBA sử dụng kháng thể chống lại virus. Nhựa từ cây đƣợc chuyển lên một màng nylone hay nitrocellulose và virus đƣợc phát hiện nhờ vào mẫu dò đƣợc đánh dấu. Quy trình này không cần nhiều thao tác nhƣ ELISA, nhanh, nhạy, đơn giản (không cần dịch chiết của virus), không đắt tiền (chỉ cần số 21 lƣợng trang thiết bị tối thiểu), thích hợp cho khảo sát 1000 - 2000 mẫu trên ngày. Kit cũng đã sẵn có cho nhiều virus. Hình 2.8. Kết quả TIBA của vết in gân lá khỏe (trên) và lá bị nhiễm (dƣới) (Comstock và Gilbert) Sự nhiễm ScYLV đƣợc xác định bằng một kháng thể đặc hiệu cho ScYLV. Lá đƣợc cắt khỏi cây và bản lá đƣợc cắt khỏi gân lá trong một thời gian ngắn. Vị trí gốc của gân lá đƣợc cắt bằng dao mỏng. Miếng cắt gân lá đƣợc cố định trên màng nitrocellulose. Sau đó màng đƣợc rửa với huyết thanh sử dụng kháng thể đặc hiệu cho ScYLV đƣợc tạo ra bởi B. E. Lockhart, Đại học Minnesota (Minneapolis) (theo Comstock và Miller (2003)). Sau đó đƣợc phủ bởi cơ chất tạo màu. Kính hiển vi ba chiều đƣợc dùng để kiểm tra vết lá in. Vì ScYLV đƣợc xác định ở trong mạch libe nên mẫu dƣơng tính cho sự hiện diện của virus khi những bó mạch libe trong vết lá in có màu xanh (Comstock và Miller, 2003) (hình 2.8 và 2.9). 22 Hình 2.9. Màng nitrocellulose đƣợc xử lý bằng kỹ thuật TBIA với huyết thanh của BYDV-PAV. Kết tủa xuất hiện ở mạch libe của gân lá (A và B), lá (C), thân (D). Tỷ lệ thƣớc 200µm. (Nguồn: Vega, 1997) 2.2.7.8 Chẩn đoán ScYLV bằng kỹ thuật Immunoblotting (western blotting) Sau khi điện di protein trên SDS-PAGE, polypeptides đƣợc chuyển lên màng nitrocellulose để thực hiện Immunoblotting (western blotting). Màng đƣợc ngâm 2 phút trong 2% Tween 20 (v/v) và ủ qua đêm ở 40C với kháng thể sơ cấp (toàn bộ huyết thanh) đƣợc pha loãng với tỉ lệ 1:5000 trong TTBS chứa 1% gelatin. Những band protein đƣợc phát hiện dựa vào 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate và nitroblue tetrazolium (BCIP/NBT). Hạt virus ScYLV chứa protein 27 kDa, là một polypeptide đƣợc xác định bằng cách nhuộm với Coomassie blue (hình 2.11A). Protein 58, 27 và 17 kDA (6 band) đƣợc xác định bằng western blotting với kháng huyết thanh ScYLV (hình 2.11,lane1). Hình 2.10. Kết quả immunoblotting (westren blotting) của protein ScYLV (Nguồn: Scagliusi và Lockhart, 2000) 23 2.2.7.9 Real -Time PCR Sử dụng phân tử beacon (Tyagi và Kramer, 1996; Eun và Wong, 2000) trong chẩn đoán virus cho phép phát hiện nhanh, nhạy và đặc hiệu hơn các kỹ thuật khác. Kết hợp kỹ thuật phân tử beacon với sự khuếch đại dựa trên trình tự acid nucleotide (NASBA: nucleic acid sequence-based amplification, Kievits và cộng sự, 1991) cho phép đồng thời khuếch đại và phát hiện RNA của virus trong một tube kín, đƣợc gọi là AmpliDet RNA (Leone và cộng sự, 1998). NASBA là phƣơng pháp khuếch đại RNA đích của virus trong điều kiện đẳng nhiệt ở 410C sử dụng hai oligonucleotide primer đặc hiệu và enzyme AMV-reverse transcriptase (AMV-RT), RNase H và T7-RNA polymerase. Gần đây, AmpliDet RNA đã đƣợc sử dụng để xác định một số virus thực vật (Klerks và cộng sự, 2001; Leone và cộng sự, 1998; Szemes và cộng sự, 2002). AmpliDet RNA có độ nhạy cao và ổn định cho việc phát hiện những virus ở trong mô cây phức tạp nhƣ vỏ, chồi, củ và quả. Hơn nữa, AmpliDet RNA phát hiện đƣợc đồng thời nhiều virus riêng biệt trong cùng một tube (Klerks và cộng sự, 2001; Szemes và cộng sự, 2002). Hình 2.11. Phân tử Beacon (Nguồn: Phân tử beacon MB ScYLV đƣợc thiết kế để mang trình tự 6 nucleotide tự bổ sung với nhau ở đầu 5’ và đầu 3’. Trình tự 21 nucleoitde bổ sung cho sản phẩm NASBA đặc hiệu cho ScYLV đƣợc chọn để lai với vùng tƣơng tự nhƣ biotinylated probe BIO ScYLV. Phân tử beacon đƣợc kết hợp với 6-carboxyfluorescein (FAM; bị kích thích ở bƣớc sóng 494 nm, phát sáng ở bƣớc sóng 530 nm) và quencher 4-[4 - Vùng mang trình tự bổ sung với DNA đích 24 dimethylaminophenylazo]-benzoic acid (DABCYL) riêng biệt ở đầu 5’ và 3’. Đầu 6 nucleotide cấu trúc sợi đôi ở 410C sẽ kìm hãm sự phát quang khi không có sự bắt cặp với trình tự đích. Khi có mặt gene đích probe sẽ bắt cặp với gene đích đồng thời với sự phát huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh quang đƣợc đo ở bƣớc sóng 530nm sau mỗi 2 phút. Phƣơng pháp này có độ nhạy cao với ScYLV, có thể phát hiện ScYLV ở mật độ rất nhỏ 10fg (femtogram, 1fg = 10-15g). Phƣơng pháp cho phép phát hiện ScYLV sau khi pha loãng mẫu 1000 lần (Gonçalves và cộng sự, 2002). 2.2.7.10 Chẩn đoán ScYLV bằng kỹ thuật RT-PCR RT-PCR đƣợc thực hiện trên dịch trích mô bị nhiễm ScYLV với cặp primer Lu1 và Lu4 đặc hiệu cho nhóm virus luteovirus (Irey và cộng sự, 1997). Cặp primer Lu1 và Lu4 tạo ra sản phẩm có kích thƣớc 530bp đặc hiệu cho gene mã hóa protein vỏ của virus (Robertson và cộng sự, 1991 (trích bởi Schenck, 2001)). Những primer này đƣợc sử dụng để tách trình tự acid nucleotide của ScYLV mà nó đƣợc chứng minh rằng có khoảng 40% tƣơng đồng với trình tự PAV của kiểu huyết thanh BYDV. Từ trình tự của ScYLV đƣợc phân lập từ Florida, một cặp primer khác đã đƣợc tạo ra (YLS111 và YLS462), nó đặc hiệu cho ScYLV (Irey và cộng sự, 1997). Primer này khuếch đại gene mã hóa cho protein vỏ của ScYLV. Sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc 352bp. Ngày nay cặp primer này đƣợc sử dụng để phát hiện ScYLV ở các nơi nhƣ Brazil, Colombia, Taiwan, Mauritius và Mexico Florida, Hawaii, (Irey, thông tin cá nhân). Ngoài ra các cặp primer khác khuếch đại gene mã hóa protein vỏ cũng đƣợc sử dụng để phát hiện ScYLV nhƣ các cặp primer: ­ RT-PCR sense primer – P1f GCT AAC CGC TCA CGA AGG AAT GT (3660–3882bp). ­ RT-PCR antisense primer – P2r GAA GGG GGC CGG GAA GAC T (4091–4109 bp). ­ RT-PCR sense primer – P3f CAG GTG CAA TCG CAC TTG AAG TGG A (3997–4021bp). ­ RT-PCR antisense primer – P4r GAA TTG TCC TGC TAG GCT CGA (4179–4199bp). ­ NASBA sense primer – N2f CAG GTG CAA TCG CAC TTG AAG TGG A (3997–4022bp) (Gonçalves và cộng sự, 2002). 25 2.3 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới và ở việt nam 2.3.1 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới Triệu chứng vàng lá xuất hiện trên mía ở Hamakua thuộc bờ biển của đảo Hawaii năm 1989. Chúng đƣợc thấy ở trên những cánh đồng giống H65-7052 và nó không giống nhƣ triệu chứng của sự thiếu dinh dƣỡng. Sau đó triệu chứng này đã đƣợc tìm thấy ở tất cả các cánh đồng ở Hawaii (Schenck, 1990; trích bởi Schenck, 2001). Bệnh vàng gân lá gây ra bởi ScYLV là một bệnh quan trọng tiềm tàng đƣợc nhập vào Louisiana gần đây. Một cuộc khảo sát rộng để xác định sự phân bố của ScYLV cho thấy virus này đã hiện diện trên tất cả các vùng trồng mía công nghiệp ở Louisiana (McAllister, 2006). Ở Ecuador có 2 bệnh virus chính trên mía là bệnh vàng lá do SCYLV và bệnh khảm do Sugarcane mosaic virus (SCMV). Phạm vi tác động của bệnh vàng gân lá trên những cánh đồng thƣơng mại cao và bệnh này đã lan rộng trong cả nƣớc (Garcés và cộng sự, 2006). Ở Mauritius YLS đã đƣợc tìm thấy đầu tiên vào năm 1994 trên giống CP 72 1210. Tiếp sau đó triệu chứng này đã đƣợc tìm thấy ở một vài giống khác và sự hiện diện của ScYLV đã đƣợc xác định vào năm 1990 (S. M. Aljanabi và cộng sự, 2001). ScYLV đƣợc phát hiện đầu tiên ở Nam Phi năm 1997. ScYLV xuất hiện và lan rộng nhanh chóng trên những cánh đồng chọn lọc và lai tạo giống ở Pongola từ những cây bị nhiễm sang những cây mẫn cảm chƣa nhiễm khi chúng đƣợc trồng gần nhau. Ở Colombia ScYLV đã đƣợc phát hiện năm 1998. Nó đã nhiễm vào một vài giống thƣơng mại, đặc biệt là giống CC 84-75 đƣợc trồng phổ biến thứ hai trên các vùng trồng mía của nền công nghiệp mía Colombia. Vì sự mẫn cảm của hầu hết các giống lai và tính quan trọng của giống CC 84-75, triển vọng tạo ra những cây chuyển gene kháng lại ScYLV đã đƣợc nghiên cứu (Rangel và cộng sự, 2005). Tƣơng tự triệu chứng héo vàng cũng đƣợc nhận thấy ở trung tâm và đông châu Phi ở những năm 1960. Ở Brazil đã xuất hiện trên giống SP 71-6163 năm 1990 với diện tích 750000 ha. Hạt virus và kháng nguyên của ScYLV đã đƣợc xác định bởi EM, ISEM và DAS-ELISA trên các mẫu mô lá mía có triệu chứng YLS từ Australia, Brazil, Colombia, Mỹ, Guadeloupe, Malawi, Mauritius, Reunion Island, và Nam Phi. Kết quả 26 dƣơng tính với ScYLV ở tất cả các mẫu trên (Scagliusi và Lockhart, 2000). Chứng tỏ đã xuất hiện ScYLV ở tất cả các nƣớc trên. Toàn bộ bộ gene (gồm 6 ORF) của 8 ScYLV phân lập từ 6 vùng khác nhau (Brazil, China, Colombia, Cuba, Peru, và Reunion) đã đƣợc giải trình tự. Bốn kiểu gene của ScYLV (BRA ở Brazil, CUB ở Cuba, PER ở Peru và REU ở Reunion) đã đƣợc phát hiện dựa vào phân tích phát sinh chủng loài với trình tự bộ gene của 6 vùng này. Cặp primer đặc biệt đã đƣợc thiết kế để phát hiện từng kiểu gene của ScYLV bằng RT-PCR (Abu Ahmad và cộng sự, 2006). Ở Hawaii một vài kỹ thuật miễn dịch đã thành công trong việc chẩn đoán sự nhiễm của ScYLV dựa trên những kháng thể đặc hiệu. Mặc dù vậy quá trình tinh sạch virus từ cây bị nhiễm gặp phải khó khăn do virus bị hạn chế trong mạch libe và hiện diện với nồng độ thấp. Một lƣợng nhỏ protein của mía còn lại gây trở ngại cho độ đặc hiệu của kháng thể. Vì thế một kháng thể có hoạt tính và độ đặc hiệu cao đã đƣợc nghiên cứu và đƣợc sử dụng trong chẩn đoán mà không bị trở ngại bởi protein của mía và các luteovirus hay polerovirus (Wang, Schenck và Albert, 2006). ScYLV là tác nhân gây bệnh quan trọng về kinh tế ở Cauca Valley (Colombia). Trong suốt năm 2004, tỉ lệ nhiễm bệnh ScYLS trên các cánh đồng thƣơng mại là 12,2%. Sự hiện diện của các nòi ScYLS đã đƣợc xác định bằng kỹ thuật RT-PCR với primer o-FM359/323. Kết quả thu đƣợc là một band 1200bp đã đƣợc khuếch đại. Khi cắt sản phẩm này với enzyme cắt Sau 3AI thì thu đƣợc 3 band. Band 100bp và 200bp đƣợc phát hiện thì phù hợp với nòi ở Brazil và band 300bp là đặc thù của nòi Texas- Florida. Những mẫu xuất hiện đồng thời 3 band thì có thể là một nòi mới (Angel và cộng sự, 2006). Comstock và cộng sự (2005) đã sử dụng marker phân tử để xác định tính kháng ScYLV trên mía. 2.3.2 Những nghiên cứu về ScYLV ở Việt Nam Hà Đình Tuấn (2004) đã dựa vào triệu chứng và Brix kế để nghiên cứu về bệnh vàng gân lá. Kết quả cho thấy hầu hết các giống đƣợc nghiên cứu đều nhiễm bệnh vàng gân lá. Đây là nghiên cứu về bệnh vàng gân lá đầu tiên tại Việt Nam. 27 2.4 Kỹ thuật PCR và RT-PCR 2.4.1 PCR Kĩ thuật PCR PCR (Polymerase Chain Reaction- phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào 1985. Đây là một công cụ khá mới trong sinh học phân tử, đánh dấu một bƣớc tiến cực kì quan trọng và hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong thực tiễn cũng nhƣ nghiên cứu. Thực chất nó là một phƣơng pháp tạo dòng in vitro, nghĩa là cũng nhằm mục đích thu nhận một lƣợng lớn bản sao của một trình tự xác định (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). Hình.2.12. Nguyên tắc của phản ứng PCR Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi. Mồi (primer) là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Do đó nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đủ để thiết kế ADN đích 1 Biến tính (94o) 2 Bắt cặp (55-65o C) 3 Kéo dài (72o) 1 2 3 4 n 28 các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này bao gồm một mồi xuôi (sense primer hay forward primer) và một mồi ngƣợc (antisense primer hay reverse primer). Từ “xuôi” và “ngƣợc” phải hiểu là “xuôi” và “ngƣợc” so với chiều phiên mã của gen. PCR đƣợc thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 bƣớc sau: - Biến tính phân tử DNA (Denature). - Sự bắt cặp giữa mồi và mạch khuôn (Annealing). - Tổng hợp mạch mới (Extension). Ba bƣớc này hợp thành một chu kì và đƣợc lặp lại nhiều lần. Những phản ứng này đƣợc thực hiện nhờ một enzyme polymerase chịu nhiệt (chẳng hạn nhƣ Taq polymerase) và sự thay đổi chu kì nhiệt hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho quá trình biến tính và bắt cặp. 2.4.2 RT-PCR Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcriptase- PCR) thì tƣơng tự nhƣ kỹ thuật PCR, nó cho phép khuếch đại một lƣợng nhỏ RNA. Kỹ thuật này thƣờng đƣợc sử dụng để phát hiện RNA của virus. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là trƣớc tiên RNA sẽ đƣợc chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc (reverse trascriptase) (hình 2.13). Mồi sử dụng cho phƣơng pháp này có thể là mồi “ngƣợc” của phản ứng PCR ở giai đoạn sau hoặc cũng có thể là oligonucleotide T (để bắt cặp với các đuôi poly A của các mRNA) mà cũng có thể là các mồi hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) để bắt cặp với các trình tự ngắn trên RNA. Sau đó, cDNA sẽ đƣợc khuếch đại nhờ hoạt động của Taq polymerase. Ngoài ra, ngƣời ta cũng có thể sử dụng một enzyme chịu nhiệt khác là Tth polymerase. Sau khi tạo đƣợc nguồn cDNA từ mRNA, cDNA này sẽ đƣợc tiếp tục khuếch đại thông qua phản ứng PCR nhƣ trình bày ở phần trên. Kĩ thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lƣợng rất thấp không thể phát hiện bằng các phƣơng pháp thông thƣờng nhƣ Northern blot (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). 29 Hình 2.13. Sơ đồ phản ứng RT-PCR Khuôn RNA Sự gắn primer vào RNA để tổng hợp cDNA (primer có thể là ngẫu nhiên, oligo-dT hay mồi chuyên biệt cho gene). cDNA đƣợc tổng hợp bắt đầu từ vị trí của primer nhờ enzyme reverse trascriptase. Sợi cDNA đƣợc tạo thành. Khuôn RNA đƣợc loại bỏ nhờ Rnase H. cDNA đƣợc sử dụng để thực hiện PCR. Sự gắn của primer với cDNA. Sợi bổ sung của cDNA đƣợc tổng hợp nhờ taq polymerase. cDNA sợi đôi đƣợc hình thành. Ba bƣớc biến tính, bắt cặp, kéo dài đƣợc lặp lại nhiều lần. 30 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3 năm 2006 đến tháng 6 năm 2006. Địa điểm lấy mẫu ­ Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, Bến Cát, Bình Dƣơng. ­ Xã Tân An, thị xã Thủ Dầu Một, Bình Dƣơng. ­ Xã Phú Lý, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai. ­ Xã Mỹ Thạnh Tây, huyện Đức Huệ, tỉnh Long An. Nơi thực hiện thí nghiệm: Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh và Trung tâm Công nghệ và Quản lý Tài nguyên và Môi trƣờng Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Phƣơng pháp lấy mẫu Chúng tôi tiến hành lấy mẫu lá ở vị trí +2 (Hình 3.1). Mỗi mẫu lấy ở năm bụi khác nhau. Hình 3.1. Vị trí lá trên cây. Đối với tập đoàn giống mía gốc và giống mía mới nhập từ Thái Lan chúng tôi tiền hành lấy mỗi giống một mẫu. Đối với mía đƣợc nhân giống để sản xuất và mía nguyên liệu, số lƣợng mẫu đƣợc lấy tùy vào diện tích canh tác. Mẫu sau khi lấy đƣợc mã hóa, ghi nhãn và bảo quản cẩn thận (-200C) trong suốt quá trình phân tích. 31 3.3 Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 3.3.1 Máy móc, thiết bị - Máy cất nƣớc 1 lần, 2 lần (Anh). - Máy li tâm (Sigma, Hettich). - Tủ mát (nhiệt độ 2 - 8oC), tủ lạnh -20oC và -80oC (trữ hóa chất và mẫu) (Reetech, Brandt, Sanyo). - Tủ định ôn (cài đặt ở 37oC) (Memmert). - Bồn ủ nhiệt (Water bath) (Memmert). - Máy vortex (IKA Works). - Máy luân nhiệt (máy thực hiện phản ứng PCR) (Eppendorf). - Lò viba (Electrolux). - Cân phân tích. - Bộ nguồn và bồn điện di (Biorad). - Máy đọc gel (Biorad). - Kính hiển vi huỳnh quang (Olympus). - Kính hiển vi quang học (Olympus). - Máy chụp hình 4.0 (Olympus). - Màn hình Sony. 3.3.2 Dụng cụ - Cối, chày sứ dùng để nghiền mẫu. - Kéo. - Eppendorf 1,5 ml. - Eppendorf 0,2 ml. - Hộp đựng eppendorf. - Micropipette P1000. - Micropipette P100. - Đầu tip 1000 μl. - Đầu tip 100 μl. - Ống đong 20, 50, 100ml. - Khay đổ gel điện di. - Bồn chứa Ethium bromide (nhuộm gel). - Lame và lamelle. 32 3.4 Hóa chất 3.4.1 Hóa chất sử dụng trong RT- PCR Hóa chất dùng trong tách chiết RNA Sử dụng kit ly trích AurumTM Total RNA Mini Kit (Catalog #732-6820) do Bio Rad cung cấp gồm: - Dung dịch ly giải. - Dung dịch rửa nhẹ (5X). - Dung dịch rửa mạnh. - DNase I (ở dạng bột rắn, cần pha buffer trƣớc khi sử dụng). - Dung dịch pha loãng DNase. - Dung dịch pha loãng RNA. - β- mercaptoethanol 14,2 M (catalog #161-0710) (*). - Polyvinylpyrolidone- 40 (PVP), 2 % ( * ) . - Ethanol 100 % và 70 % (*). - Tris-base (pH 7,5, 10 mM) (*). - Nitơ lỏng (*). - NaOH 0,1M (*). - EDTA 1mM (*). - DEPC (Diethyl pyrocarbonate) (*). ( * ): Hóa chất đƣợc cung cấp riêng, không kèm theo kit. Hóa chất sử dụng tạo cDNA và PCR - Nƣớc không chứa nuclease. - iTaq buffer 10X (Biorad). - iTaq DNA polymerase (Biorad). - MgCl2 (50 mM) (Biorad). - dNTP mix (10 mM) (BioRad). - Primer: Hai primer YLS 462 và YLS 111 (trình tự primer đƣợc cung cấp bởi TS. M. Irey). YLS111: 5' - TCT CAC TTT CAC GGT TGA CG-3’ YLS462: 5' - GTC TCC ATT CCC TTT GTA CAG C-3’ 3.4.2 Hóa chất sử dụng trong điện di - Agarose. 33 - TAE 0,5X (Tris acetate 40 mM; EDTA 0,1 mM; pH 8). - Blue/Orange Loading dye 6X (Promega). - Ethidium bromide (nồng độ 5.10-3 % theo thể tích). - Ladder 100 bp (kích thƣớc 1000 bp), nồng độ gel tƣơng ứng là 1,5 %. 3.5 Phƣơng pháp quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang Gân lá và bản lá đƣợc cắt mỏng bằng dao lam mới. Sau đó, thiết vật đƣợc đặt trong một giọt nƣớc cất hai lần đã khử trùng trên lame. Đặt lamelle lên và quan sát các bó mạch libe ở các độ phóng đại 40X, 100X, 200X và 400X với ánh sáng đơn sắc màu xanh (blue) bƣớc sóng 510nm. Những bó mạch libe bị nhiễm virus sẽ phát huỳnh quang màu vàng xanh bởi ánh sáng kích thích 510nm. Những bó mạch bình thƣờng sẽ không phát huỳnh quang. 3.6 Phƣơng pháp phát hiện bằng kỹ thuật RT-PCR Kỹ thuật RT-PCR đƣợc thực hiện là hai bƣớc (two steps): gồm giai đoạn tổng hợp cDNA và giai đoạn khuếch đại cDNA. Virus đƣợc phát hiện dựa trên trình tự đoạn gene có kích thƣớc 352 bp mã hóa cho protein vỏ của virus ScYLV. Qui trình thực hiện gồm 3 giai đoạn: ­ Giai đoạn ly trích RNA đƣợc thực hiện bằng kit ly trích RNA. ­ Giai đoạn tổng hợp cDNA đƣợc thực hiện theo kit tổng hợp cDNA . ­ Phản ứng RT-PCR đƣợc thực hiện dựa trên protocol của TS. Michael Irey cung cấp. 3.6.1 Qui Trình Ly Trích RNA Quy trình gồm có 15 bƣớc nhƣ sau: 1. Cắt mẫu thành những miếng nhỏ (< 5 mm), nghiền mịn trong nitơ lỏng. Chú ý không để cho mẫu bị chảy nƣớc trong lúc nghiền. 2. Cho 60 mg mẫu đã nghiền vào tube 2 ml có nắp đậy (có sẵn trong kit). Hòa tan mẫu bằng dung dịch ly giải (lysis solution) (14µl PVP 2% + 700µl dung dịch ly giải cho mỗi mẫu). Tạo hỗn hợp dung dịch ly giải nhƣ sau: Hút 500 l -mercaptoethanol cho vào 50 ml dung dịch ly giải, hút 700 l dung dịch ly giải đã có - mercaptoethanol cho vào eppendorf mới, thêm 14 l PVP vào. 3. Cho 700 µl dịch ly trích mẫu (lysis solution) đã bỗ sung PVP 2% vào tube chứa mẫu và trộn đều bằng pipet từ 12 - 15 lần. 34 4. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng trong 3 phút ở 4oC. Sau đó hút dịch nổi sang tube 2 ml (có trong kit). 5. Cho 700 µl ethanol 70% vào tube chứa dịch nổi, trộn đều bằng pipet cho đến khi dịch không còn phân lớp. 6. Cho dịch hòa tan RNA (elution solution) vào bể điều nhiệt ở 70oC (chuẩn bị cho bƣớc 15). Cho RNA binding column vào tube 2 ml không có nắp đậy. 7. Hút 700 µl dịch mẫu cho vào RNA binding column. Ly tâm ở tốc độ 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới ra khỏi tube (thực hiện nhiều lần cho đến khi hết mẫu thì thôi). 8. Cho 80 ml ethanol 100% vào 20 ml dịch rửa nhẹ (low stringency). 9. Cho 700 µl dịch rửa nhẹ (low stringency) đã bổ sung ethanol 100% vào RNA binding column. Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới. 10. Pha DNase I với 250 µl Tris base pH = 7,5, trộn đều. 11. Pha 5 µl DNase I với 75 µl dịch pha loãng DNase (DNase delution solution) cho một mẫu ly trích trong tube 1,5 ml. Cho 80 µl dung dịch DNase vào RNA binding column. Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. 12. Loại phần dịch bên dƣới. 13. Thêm 700 µl dịch rửa mạnh (high stringency wash solution) vào RNA binding column. Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới. 14. Thêm 700 µl dịch rửa nhẹ (low stringency wash solution) vào RNA binding column. Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới. Ly tâm tiếp 60 giây với tốc độ 12000 vòng ở 4oC để loại hoàn toàn dịch rửa. 15. Cho RNA binding column vào tube 1,5 ml (có trong kit) có nắp đậy. Cho 80 µl dịch hòa tan RNA (elution solution) đã ủ ở 70oC vào RNA binding column, giữ ở nhiệt độ phòng trong 60 giây. Ly tâm 12000 vòng trong 2 phút ở 4oC để thu RNA tổng số. 35 RNA đem ủ ở 4oC để dùng sau. 3.6.2 Qui trình thực hiện phản ứng RT-PCR theo protocol của TS. M. Irey 3.6.2.1 Bƣớc chẩn bị mẫu YLS 462 primer (60 uM stock) 0,25 μl H2O 0,25 μl Mẫu 1,00 μl Ủ trong 5 phút sau đó làm lạnh nhanh trong đá. Ly tâm nhẹ. 3.6.2.2 Bƣớc RT MgCl2 (25 mM) 2,0 μl PCR buffer10X 1,0 μl dGTP (10 mM) 1,0 μl dCTP (10 mM) 1,0 μl dATP (10 mM) 1,0 μl dTTP (10 mM) 1,0 μl H2O 0,5 μl Rnase inhibitor (20 U/μl) 0,5 μl (Perkin Elmer) MulV Reverse transcriptase (50 U/μl) 0,5 μl (Perkin Elmer) Tổng thể tích 8,5 μl và thêm vào 1,5 μl hỗn hợp mẫu và primer Chu trình nhiệt của phản ứng RT: 15 phút ở 420 C, 5 phút ở 990 C - 1 chu kỳ. 3.6.2.3 Bƣớc PCR MgCl2 (25 mM) 4,00 μl 10X PCR buffer 4,00 μl H2O 31,50 μl Amplitaq DNA polymerase (5 U/μl) 0,25 μl (Perkin Elmer) YLS 111 primer (60 uM stock) 0,25 μl Tổng thể tích 40,00 μl thêm vào tube phản ứng RT. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94 0 C /1 phút, 540C /1 phút, 720C /20 phút – 1 chu kỳ. 94 0 C /1 phút, 540C /1 phút, 720C /2 phút -40 chu kỳ. 72 0 C 10 phút - 1 chu kỳ. 3.6.3 Qui trình RT-PCR chỉnh sửa 36 3.6.3.1 Qui trình tổng hợp cDNA Nƣớc không chứa nuclease 10 μl 5X iScript reaction mix 4 μl iScript reversetranscriptase 1 μl Mẫu RNA 5 μl Tổng thể tích phản ứng 20 μl Chu trình nhiệt của phản ứng: 25 0C /5 phút, 420C /30 phút, 850C /5 phút – 1 chu kỳ. Giữ ở 40C. 3.6.3.2 Qui trình PCR MgCl2 (50 mM) 2,00 μl 10X PCR buffer 5,00 μl dNTP (10mM) 1 μl H2O 39,50 μl cDNA mẫu 1 μl itaq DNA polymerase (5 U/μl) 0,25 μl (Biorad) YLS 462 primer (30 μM stock) 0,5 μl YLS 111 primer (30 μM stock) 0,5 μl Tổng thể tích 50,00 μl Chu trình nhiệt 94 0C /1 phút, 540C /1 phút, 720C /20 phút – 1 chu kỳ. 94 0C /1 phút, 540C /1 phút, 720C /2 phút - 40 chu kỳ. 72 0C 10 phút - 1 chu kỳ. 3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý bằng trắc nghiệm χ2 bởi phần mền Excel XP. 37 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Các biểu hiện của triệu chứng vàng gân lá do ScYLV Các biểu hiện của triệu chứng vàng gân lá do ScYLV là vàng ở gân lá cả mặt trên và mặt dƣới (hình 4.1). Hình.4.1. Lá biểu hiện triệu chứng vàng gân lá (dƣới) và lá không biểu hiện triệu chứng vàng gân lá (trên). (A) mặt trên của lá, (B) mặt dƣới của lá. (Hình chụp tại xã Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An ngày 19/03/2006). Hình 4.2 Triệu chứng vàng gân lá bắt đầu từ lá thứ 3 (Hình chụp tại xã Phú Lý, Vĩnh Cửu, Đồng Nai ngày 25/03/2006). Triệu chứng vàng gân lá xuất hiện bắt đầu từ lá thứ 3 ( hình 4.2) và những lá già hơn trên toàn cây và xuất hiện những vết hoại tử trên lá (Hình 4.3). A B 38 Triệu chứng này biểu hiện làm cho toàn bộ cánh đồng chuyển thành màu vàng (hình 4.4). Hình 4.3. (A) cây biểu hiện triệu chứng vàng gân lá. (B) cây không có triệu chứng vàng gân lá. (Hình chụp tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú ngày 14/03/2006). Hình 4.4. Cánh đồng có triệu chứng vàng gân lá (A). Cánh đồng khỏe mạnh (B) (Hình (A) chụp tại xã Mỹ Thạnh Tây ngày 19/03/2006, hình (B) chụp tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú ngày 14/03/2006). A B A B 39 Đây là những triệu chứng đặc trƣng gây ra bởi ScYLV. Các triệu chứng này không giống với biểu hiện của sự thiếu dinh dƣỡng. Triệu chứng này giống nhau ở tất cả mọi nơi (Schenck, 2001). Các triệu chứng trên là cơ sở ban đầu giúp chẩn đoán tình trạng nhiễm virus trên đồng ruộng. 4.2 Kết quả chẩn đoán dựa vào triệu chứng 4.2.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng đƣợc trình bày ở Bảng 4.1 và Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ biểu hiện triệu chứng vàng gân lá theo các giai đoạn sinh trƣởng có sự khác biệt lớn về phƣơng diện thống kê (P<<0.05). Tỷ lệ nhiễm bệnh gia tăng theo độ tuổi phát triển của cây. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Hà Đình Tuấn (2004) cho rằng bệnh vàng gân lá phát sinh – phát triển tăng theo các giai đoạn sinh trƣởng của cây mía và tỷ lệ này tăng nhanh sau giai đoạn cây đẻ nhánh. Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng Giai đoạn sinh trƣởng Không có triệu chứng (cây) Có triệu chứng (cây) Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) Đẻ nhánh 51 25 32,89 Đầu vƣơn lóng 26 14 35,00 Giữa vƣơn lóng 4 8 66,67 Thu hoạch 9 31 77,50 Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Đẻ nhánh Đầu vươn lóng Giữa vươn lóng Thu hoạch Tuổi Tỷ lệ (%) 40 Trong giai đoạn đẻ nhánh tỷ lệ nhiễm chỉ 32,89% nhƣng tới giai đoạn thu hoạch tỷ lệ này tăng lên tới 77,5%. Tuy nhiên, điều này không chứng tỏ rằng tỷ lệ nhiễm virus của cây ở giai đoạn đẻ nhánh là thấp. Trong quá trình điều tra cho thấy mía thƣờng đƣợc tái sinh từ gốc của vụ trƣớc. Do đó, virus sẽ đƣợc truyền từ gốc mía sang cây con. Tỷ lệ nhiễm bệnh trong giai đoạn đẻ nhánh thấp có thể là do giai đoạn này sự biểu hiện triệu chứng thấp. Kết quả chúng tôi thu đƣợc phù hợp với kết quả của Comstock và cộng sự (2003), Parmessur và cộng sự (2002) và Schenck (2001) cho rằng triệu chứng vàng gân lá biểu hiện rõ ràng và nhiều nhất ở giai đoạn cây trƣởng thành. 4.2.2 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo địa phƣơng Tỷ lệ nhiễm bệnh theo địa phƣơng đƣợc trình bày ở Bảng 4.1 và biểu đồ 4.2. Tỷ lệ biểu hiện triệu chứng vàng gân lá ở các vùng có sự khác biệt lớn (P<<0,05). Qua Bảng 4.2 và biểu đồ 4.2 chúng tôi nhận thấy tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá cao nhất ở cánh đồng Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An (77,5%). Sau đó là Tân An, Thủ Dầu Một (75%), An Phú (58,33%), Phú Lý, Vĩnh Cửu, Đồng Nai (35,56%), tập đoàn giống gốc tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú (29,03%), giống mới nhập từ Thái Lan (25,00%). Giống Thái Lan mới nhập có biểu hiện triệu chứng thấp là do giống này đã đƣợc kiểm dịch nghiêm ngặt và đƣợc trồng xung quanh nhà kính, cách biệt với các giống khác và đƣợc chăm sóc tốt. Tập đoàn giống gốc tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú biểu hiện triệu chứng thấp do giống ở đây đƣợc chăm sóc tốt. Mặt khác, mía tại đây đang trong giai đoạn đẻ nhánh nên triệu chứng cũng biểu hiện thấp. Bảng 4.2. Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo địa phƣơng Nguồn gốc Không có triệu chứng (cây) Có triệu chứng (cây) Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) Thái Lan 21 7 25,00 An Phú 5 7 58,33 Giống gốc 22 9 29,03 Tân An 4 8 66,67 Mỹ Thạnh 9 31 77,50 Phú Lý 29 16 35,56 41 Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các địa phƣơng 25.00 58.33 29.03 66.67 77.50 35.56 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 Thái Lan An Phú Giống gốc Tân An Mỹ Thạnh Phú Lý Vùng Tỷ lệ (%) Ở Phú Lý tỷ lệ có triệu chứng vàng gân lá cao hơn ở giống Thái Lan và tập đoàn giống gốc tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú mặc dù chúng cùng giai đoạn sinh trƣởng. Điều này có thể giải thích là do ở Phú Lý điều kiện chăm sóc không tốt. Hơn nữa, mía ở đây đƣợc tái sinh từ gốc của các vụ trƣớc nên nguy cơ truyền virus từ gốc sang cây con là rất cao. Điều này cũng làm cho tỷ lệ vàng gân lá ở đây cao hơn. Mặt khác, đất ở đây khô cứng có thể làm cây bị stress nên tỷ lệ vàng gân lá biểu hiện cao. Tỷ lệ triệu chứng vàng gân lá ở các mẫu từ Mỹ Thạnh Tây cao nhất là do mía ở đây đang trong giai đoạn thu hoạch. Đây là giai đoạn mà triệu chứng vàng gân lá biểu hiện cao nhất. Tỷ lệ vàng gân lá ở An Phú và Tân An cao cũng đƣợc giải thích tƣơng tự ở Mỹ Thạnh Tây. Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú là nơi tạo giống và cung cấp giống cho nhiều vùng sản xuất mía đƣờng khác trong cả nƣớc. Tuy nhiên, tập đoàn giống gốc tại đây đã xuất hiện triệu chứng vàng gân lá điều đó đồng nghĩa với việc đây có thể là nơi truyền bệnh sang các vùng khác qua con đƣờng giống. Qua điều tra cho thấy giống mới nhập từ Thái Lan mặc dù đã qua kiểm soát chặt chẽ song vẫn có sự hiện diện của triệu chứng vàng gân lá. Ở đây chúng tôi không thể khẳng định triệu chứng vàng gân lá trên tập đoàn giống này là do nhiễm virus 42 trƣớc khi nhập nội hay sau khi trồng tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú bởi vì giống này đƣợc nhập không có sự kiểm soát ScYLV. 4.2.3 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo nguồn gốc giống Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giống đƣợc trình bày ở Bảng 4.3 và biểu đồ 4.3. Tỷ lệ biểu hiện triệu chứng giữa các giống có sự khác biệt lớn (P<<0,05). Toàn bộ mẫu lấy từ giống R570 đƣợc nhập từ Pháp và giống Việt Nam gốc Mỹ DLM 24 đều có triệu chứng vàng gân lá (100%). Trong khi đó mẫu lấy từ giống RB 72454 nhập từ Braxin thì không có biểu hiện triệu chứng. Ngoài ra các giống khác đều có biểu hiện triệu chứng vàng gân lá. Trên các giống R570 và DLM 24 tỷ lệ nhiễm cao có thể là do các giống này mẫn cảm với ScYLV. Giống Thái Lan tỷ lệ nhiễm là 42,55%, trong số này tỷ lệ nhiễm rơi vào các giống nhập năm 1992, giống này đã đƣợc sản xuất đại trà trên các cánh đồng mía thƣơng mại ở nƣớc ta. Trong các giống mới nhập nội tỷ lệ nhiễm thấp hơn so với giống đang sản xuất đại trà (Bảng 4.2). Bảng 4.3. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giống Nguồn gốc Không có triệu chứng (cây) Có triệu chứng (cây) Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) Thái Lan 27 20 42,55 Ấn Độ 1 1 50,00 Việt Nam 6 22 78,57 Braxin 1 0 0,00 Cuba 35 12 25,53 Pháp 0 2 100,00 Australia 4 0 0,00 Hawaii 9 6 40,00 gốc Mỹ 0 1 100,00 Đài Loan 8 13 61,90 43 Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo nguồn gốc giống 42,55 50,00 78,57 0,00 25,53 100,00 0,00 40,00 100,00 61,90 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 Th ái La n Ấn Đ ộ Vi ệt Na m Br ax in Cu ba Ph áp Au str ali a Ha wa ii gố c M ỹ Đà i L oa n Nguồn gốc Tỷ lệ (%) Trên giống Comus nhập từ Australia chúng tôi không ghi nhận thấy triệu chứng vàng gân lá. Kết quả này phù hợp với kết quả trong nghiên cứu của Hà Đình Tuấn (2004). Có thể là do trên giống này có khả năng kháng lại ScYLV nên mặc dù giống này đƣợc trồng cạnh cánh đồng giống R570 (100% vàng gân lá) mà giống này vẫn không có biểu hiện triệu chứng. 4.3 Quan sát mạch dẫn bằng kính hiển vi huỳnh quang Chúng tôi tiến hành kiểm tra trên 150 mẫu gân lá bằng kính hiển vi huỳnh quang. Kết quả cho thấy chỉ những mẫu nào có biểu hiện triệu chứng của bệnh vàng gân lá thì bó mạch libe mới có khả năng tự phát huỳnh quang khi bị kích thích bởi ánh sáng xanh ở bƣớc sóng 510nm (Hình 4.5). Sự tự phát huỳnh quang của mạch libe có liên quan đến triệu chứng vàng gân lá (P = 0,379>0,05). Đối với những mẫu không có triệu chứng thì bó mạch libe không có sự tự phát huỳnh quang và không có khác biệt khi quan sát bởi kính hiển vi huỳnh quang và kính hiển vi quang học (Hình 4.5 và 4.6). Những hợp chất phenol có vai trò quan trọng trong quá trình tiêu diệt ký sinh gây bệnh của cây trồng. Phenol có vai trò tham gia vào quá trình suberin và lignin hóa để hình thành các mô cơ giới là một trong những nhân tố cản trở sự phát triển của ký sinh (Trần Kim Đồng và cộng sự, 1991). Sự phát huỳnh quang trên các bó mạch libe có thể là do sự tích tụ các hợp chất phenol trong các bó mạch khi bị virus tấn công. Sự phát huỳnh quang trong những bó 44 mạch libe cũng chứng tỏ rằng có sự rối loạn trong quá trình biến dƣỡng dẫn tới sự tích lũy hợp chất phenol (Vega, 1997). Tuy nhiên, hợp chất phenol bao gồm lignan, lignin, tanin, … để khẳng định hợp chất phenol nào có khả năng phát huỳnh quang thì cần phải nghiên cứu thêm. Đối với những lá có phản ứng chết sự tích tụ hợp chất phenol vẫn xảy ra. Tuy nhiên, khi quan sát chúng dƣới kính hiển vi huỳnh quang chúng tôi nhận thấy xung quanh bó mạch và vách các tế bào đều phát huỳnh quang nhƣng trong bó mạch libe không có sự phát huỳnh quang (Hình 4.7).. Hình 4.5 Các bó mạch của gân lá đƣợc kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang B A 45 (A) Cây mía có triệu chứng vàng gân lá bó mạch libe có chất phát huỳnh quang màu vàng xanh. (B) Cây mía bình thƣờng mạch libe bình thƣờng. Độ phóng đại 200X. (Hình chụp tại Trung tâm Công nghệ và Quản lý Tài nguyên và Môi trƣờng ngày 01/08/2006). Hình 4.6. Các bó mạch gân lá đƣợc quan sát bằng kính hiển vi quang học (100X) (Hình chụp tại Trung tâm Công nghệ và Quản lý Tài nguyên và Môi trƣờng ngày 01/08/2006). Hình 4.7. Sự phát huỳnh quang của tế bào do có phản ứng chết (200X) (Hình chụp tại Trung tâm Công nghệ và Quản lý Tài nguyên và Môi trƣờng ngày 01/08/2006). Sự tự phát huỳnh quang cũng xảy ra tƣơng tự đối với các virus khác chỉ tồn tại trong mạch libe nhƣ luteovirus, closterovirus và mycoplasma (Vega, 1997). Sự tự phát huỳnh quang xảy ra không giúp chúng tôi khẳng định chính xác rằng có sự hiện diện 46 của ScYLV, nhƣng kết quả này bƣớc đầu giúp chẩn đoán có sự hiện diện của ScYLV, giúp chúng tôi khẳng định đƣợc các mẫu trên có sự tấn công của virus. Để khẳng định chính xác sự hiện diện của ScYLV cần có những chẩn đoán về mặt phân tử bằng các kỹ thuật công nghệ sinh học nhƣ RT-PCR, ELISA, kính hiển vi điện tử, … Có thể sử dụng kính hiển vi huỳnh quang để chẩn đoán sự tấn công của ScYLV. 4.4 Kết quả RT-PCR dựa theo qui trình của M. Irey Chúng tôi tiến hành thay đổi qui trình do M. Irey cung cấp cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm. Kết quả thu đƣợc ở Hình 4.8 cho thấy khi thực hiện theo qui trình chỉnh sửa chúng tôi vẫn thu đƣợc sản phẩm mong muốn (352 bp) và đây là sản phẩm duy nhất. Điều này cho thấy qui trình phản ứng RT-PCR do chúng tôi chỉnh sửa có thể sử dụng để phát hiện ScYLV. Hai primer YLS111 và YLS462 đƣợc thiết kế bởi M. Irey để khuếch đại protein vỏ của virus vàng gân lá (ScYLV) không những cho phép phát hiện ScYLV ở các nƣớc khác (Florida, Hawaii, Brazil, Colombia, Taiwan, Mauritius và Mexico) mà còn có thể phát hiện đƣợc ScYLV xuất hiện tại Việt Nam. Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR (M: thang chuẩn kích thƣớc1kb, 1: sản phẩm PCR). 4.5 Kết Quả RT-PCR Sau khi ổn định qui trình cho phù hợp với phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành kiển tra đối với 9 mẫu đại diện. Kết quả ở Hình 4.9 cho thấy có 4 mẫu đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật RT-PCR cho kết quả dƣơng tính với cặp mồi YLS111 và YLS462. Các giống K84-200, ROC16, R570, DLM24 đều cho kết quả RT-PCR dƣơng tính. Đồng thời các mẫu này cũng đều có biểu hiện rõ ràng của bệnh vàng gân lá do ScYLV. Các giống Comus, ROC26, C2217, Ja6420, RB72454 không có biểu hiện triệu chứng vàng gân lá và âm tính với phản ứng RT-PCR. Điều này chứng tỏ rằng các 352bp M 1 47 triệu chứng vàng gân lá đã nêu ở mục 4.1 là các triệu chứng đặc trƣng cho bệnh vàng gân lá do ScYLV gây ra. Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR (Giếng 1: K84-200; giếng 2: R570; giếng 3: Comus; giếng 4: RB72454; giếng 5: ROC16; giếng 6: ROC26; giếng 7: C2217; giếng 8: DLM24; giếng 9: Ja6420; M: thang chuẩn kích thƣớc 1kb). Các giống âm tính có thể mang đặc tính kháng với ScYLV hoặc có thể là chƣa nhiễm với ScYLV tại thời điểm đƣợc kiểm tra. Khả năng các giống này chƣa nhiễm là rất thấp vì các giống này đƣợc trồng cạnh các giống đang nhiễm nên chúng dễ dàng bị nhiễm. Song khi đƣợc kiểm tra kết quả đều âm tính với các mẫu này. Điều này cho thấy có thể giả thiết các giống này mang đặc tính kháng là nhiều hơn. Kết quả RT-PCR này cũng là một trong những bằng chứng đầu tiên về mặt phân tử chứng tỏ ScYLV đã hiện diện tại Việt Nam. 352 bp 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 48 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo giai đoạn sinh trƣởng: Đẻ nhánh 32,89% Đầu vƣơn lóng 35,00% Giữa vƣơn lóng 66,67% Thu hoạch 77,50% Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo nguồn gốc giống: Thái Lan 42,55% Ấn Độ 50,00% Việt Nam 78,57% Braxin 0,00% Cuba 25,53% Pháp 100,00% Australia 0,00% Hawaii 40,00% Việt Nam gốc Mỹ 100,00% Đài Loan 61,90% Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo địa phƣơng: Giống mới nhập từ Thái Lan 25,00% An Phú 58,33% Tập đoàn giống gốc 29,03% Tân An 66,67% Mỹ Thạnh 77,50% Phú Lý 35,56% Kính hiển vi huỳnh quang có thể phát hiện những bó mạch libe bị tấn công bởi virus khi chúng bị kích thích bởi ánh sáng xanh (blue) ở bƣớc sóng 510nm. Có thể sử dụng kính hiển vi huỳnh quang để chẩn đoán sự nhiễm của virus. Qui trình RT-PCR chúng tôi thực hiện là qui trình có thể đƣợc sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của virus ScYLV. 49 Kết quả RT-PCR cho thấy các giống K84-200, ROC16, R570, DLM24 đều nhiễm với ScYLV. Các giống Comus, ROC26, C2217, Ja6420, RB72454 không phát hiện có nhiễm virus. Đây là bằng chứng đầu tiên về mặt phân tử chứng tỏ đã có sự hiện diện tại Việt Nam. 5.2 Đề nghị Đánh giá sự hiện diện của ScYLV ở diện rộng hơn bằng các kỹ thuật RT-PCR TBIA hoặc ELISA. Áp dụng qui trình RT-PCR chúng tôi thực hiện để chẩn đoán ScYLV. Nghiên cứu về hợp chất phenol có khả năng phát huỳnh quang tích tụ trong bó mạch libe của cây khi bị virus tấn công. Nghiên cứu sâu hơn về các giống chƣa phát hiện bệnh để tìm tính kháng. Giải trình tự sản phẩm RT-PCR để khẳng định và so sánh trình tự gene của ScYLV ở Việt Nam với nƣớc khác. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Tp HCM. Trang 270-282. 2. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 190-204. 3. Trần Kim Đồng, Nguyễn Quang Phổ, Lê Thị Hoa, 1991. Giáo trình sinh lý cây trồng. Nhà xuất bản đại học và giáo dục chuyên nghiệp, Hà Nội, 1991. Trang 190- 204. 4. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp tp HCM. Trang 87-96, 107-119. 5. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Tp HCM. Trang 38-46, 114-130, 160-166. 6. Vũ Triệu Mân, 2003. Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội. Trang 37-43, 56-95. 7. Vũ Triệu Mân, Lê Lƣơng Tề, 1998. Giáo trình bệnh cây nông nghiệp. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội. Trang 17-21, 220-232. 8. Trần Văn Sỏi, 2003. Cây mía. Nhà xuất bản Nghệ An. Trang 7-26. 9. Hà Đình Tuấn, 2004. Điều tra thành phần bệnh hại mía trên một số giống mía mới nhập nội và khảo sát diễn biến bệnh hại quan trọng ở vùng mía nguyên liệu miền Đông Nam Bộ. Luận văn thạc sĩ ngành nông học đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 10. Ahmad Y Abu, M Royer, L Costet, J-H Daugrois, J-M Lett, J.I Victoria and P Rott, 2006. Genotyping of Sugarcane yellow leaf virus in Colombia, Guadeloupe and Reunion. VIIIth ISSCT Pathology Workshop Petit-Bourg, Guadeloupe (FWI) 23 - 27 January 2006 Programme and Abstracts. 11. Henrik H Albert, Tichaona Mangwende, Ming-Li Wang, T. Erik Mirkov, 2003. Functional Analysis Of The P0 Protein Of Sugarcane Yellow Leaf Virus: A Suppressor Of Posttranscriptional Gene Silencing. Plant & Animal Genomes XIV Conference. Workshop: Intl. Consortium for Sugarcane Biotech. (ICSB) January 14-18, 2006. Town & Country Convention Center, San Diego, CA. 51 12. S. M. Aljanabi, Y. Parmessur, Y. Moutia, S. Saumtally and A. Dookun, 2001. Further evidence of the association of a phytoplasma and a virus with yellow leaf syndrome in sugarcane. Plant Pathology 50, p 628±636. 13. Angel S. J.C, Guzmán R. M. L, Angel S. F, Victoria K. J. I, 2006. Studies on the Sugarcane yellow leaf virus (SCYLV) in Colombia. VIIIth ISSCT Pathology Workshop Petit-Bourg, Guadeloupe (FWI) 23 - 27 January 2006 Programme and Abstracts. 14. Kathryn S. Braithwaite, 2003. New virus and virus – like diseases of sugarcane – an overview. Sugarcane pathology. Volume II: virus and phytoplasma diseases. Sugarcane Pathology: Virus and Phytoplasma Diseases v. 2 (G.P. b, R.E. Ford, M.Tǒsic and D.S. Teakle). Science Publishers, Inc: p 3-24. 15. Chatenet M., Delage C.,. Ripolles M, Irey M., Lockhart B. E. L, and Rott P., 2001. Detection of Sugarcane yellow leaf virus in quarantine and production of virus-free sugarcane by apical meristem culture. Plant Dis. 85: p1177-1180. 16. Comstock J. C. and. Gilbert R. A. Sugarcane Yellow Leaf Disease. University of Florida, IFAS extension. SS-AGR-256. 17. Comstock J. C. and Miller J. D., 2003. Incidence and spread of sugarcane yellow leaf virus in sugarcane clones in the cp-cultivar development program at Canal Point. Journal American Society of Sugarcane Technologists, Vol. 23, 2003, p71- 78. 18. Comstock J. C., Sood S., and McCorkle K., 2005. Characterization of Sugarcane Populations for Disease Reactions for Use in Molecular Marker Research. Agricultural absracts 2005 annual meeting. Journal American Society Sugar Cane Technologists, Vol. 25, 2005. [Abstracts]. 19. Comstock Jack C., Chaparro Jose X., Tai Peter Y. P., Serge Edme, Katherine McCorkle, Jim D. Miller, 2004. The Association Of Microsatellite Markers With Resistance To Sugarcane Yellow Leaf Virus. Workshop: Intl. Consortium for Sugarcane Biotech (ICSB). Plant & Animal Genomes XII Conference January 10- 14, 2004. Town & Country Convention Center San Diego, CA. 20. Cronjé C.P.R., 2004. Sugarcane viruses in sub-Saharan Africa. Plant virology in sub-Saharan Africa, p 492-497. 21. Cu Ramon, Manjunath K. L.,. Petersen Y,. Hiebert E and Davis M. J., 2004. Development of a Serological Diagnostic Probe to Detect the Sugarcane Yellow Leaf Luteovirus (SCYLV) Using Phage Display Technology. Journal American Society Sugar Cane Technologists, Vol. 24, 2004. [Abstracts]. 52 22. Edon Carine, Vaillant Jean, Sauvion Nicolas and Daugrois J.H., 2006. Spatiotemporal evolution of plant infection by SCYLV in a disease free plot. Toward modeling virus spread in tropical conditions. VIIIth ISSCT Pathology Workshop Petit-Bourg, Guadeloupe (FWI) 23 - 27 January 2006 Programme and Abstracts. 23. Garcés Freddy, Reyna Medina and Eloy Orellana, 2006. Transmission of Sugarcane yellow leaf virus and Sugarcane mosaic virus in Ecuador. VIIIth ISSCT Pathology Workshop Petit-Bourg, Guadeloupe (FWI) 23 - 27 January 2006 Programme and Abstracts. 24. Gaur R.K., Rao G.P., Maneesha Singh and Axel T. Lehrer, 2003. Sequence analysis of the entire RNA genome of sugarcane yellow leaf luteovirus of an Indian isolate BSPP Presidential Meeting 2003 (15 th – 18th December 2003) Plant Pathogen Genomics - From Sequence To Application Jubilee Campus, University of Nottingham, UK. 25. Goldstein C., Wang M-L. and Albert H., 2002. Production of recombinant protein in sugarcane and rice. Hawaii Agriculture Research center Annual report 2001- 2002. p10-11. 26. M.C. Gonçalves, M.M. Klerks,, M. Verbeek, J.Vega and J.F.J.M. van den Heuvel, 2002. The use of molecular beacons combined with NASBA for the sensitive detection of Sugarcane yellow leaf virus. European Journal of Plant Pathology 108: p401–407, 2002. Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands. 27. Lockhart Ben E., Cronjié C. Pieter R., Rott P., Bailey Roger A., Comstock Jack C., Barry J. Croft, A. Salem Saumtally, 2000. Yellow leaf syndrome. A guide to sugarcane diseases. CIRAD/ISSCT 28. McAllister C. D., Hoy J. W., and Reagan T. E., 2006. Temporal increase and spatial distribution of yellow leaf and sugarcane aphid infestations VIIIth ISSCT Pathology Workshop Petit-Bourg, Guadeloupe (FWI) 23 - 27 January 2006 Programme and Abstracts. 29. Moonan F., Molina J., and Mirkov T. E., 2000. Sugarcane yellow leaf virus: An emerging virus that has evolved by recombination between luteoviral and poleroviral ancestors. Virology 269: p156-171. Academic Press. 30. Parmessur Y., Aljanabi S., Saumtally S. and Dookun-Saumtally A., 2002. Sugarcane yellow leaf virus and sugarcane yellows phytoplasma: elimination by tissue culture. Plant Pathology. Volume 51 Page 561-566. 31. M. Paola Rangel, Lorena Gomez, Jorge I. Victoria, Fernando Angel, 2005. Transgenic plants of CC 84-75 resistant to the virus associated with the sugarcane yellow leaf disease. Silver jubilee congress Guatemala january 30 - february 4, 2005 abstracts of papers. International Society of Sugar Cane Technology. 53 32. Rassabya L.,. Girard J.-C, Lemaire O., Costet L., Irey M. S., Kodja H.,. Lockhart B. E. L and Rott P., 2004. Spread of Sugarcane yellow leaf virus in sugarcane plants and fields on the island of Réunion. Plant Pathology. Volume 53 Page 117-125. 1. Sambrook J. and Russell D. W, 2001. Molecular Cloning- A laboratory manual. Volume 1. Third edition. CSHL Press, New York. p 7.1 – 7.88. 33. Scagliusi Sandra Mansur and Lockhart B. E. L., 2000. Transmission, characterization, and serology of a luteovirus associated with yellow leaf syndrome of sugarcane. Phytopathology 90: p120-124. 34. Schenck S., Lehrer A.T., Wu K.K., 2001. Yellow Leaf Syndrome. Hawaii Agriculture Research Center, Pathology Report 68 February 2001. 35. Schenck Susan, 2001. Sugarcane yellow leaf syndrome: History and current concepts. Sugarcane pathology. Volume II: virus and phytoplasma diseases. Sugarcane Pathology: Virus and Phytoplasma Diseases v. 2 (G.P. Rao, R.E. Ford, M.Tǒsic and D.S. Teakle). Science Publishers, Inc: p24-35. 36. Smith Grant R., Borg Zara, Lockhart Ben E. L., Braithwaite Kathryn S. and Gibbs Mark J., 2000. Sugarcane yellow leaf virus: a novel member of the Luteoviridae that probably arose by inter-species recombination. Journal of General Virology (2000), 81, p1865–1869. Printed in Great Britain. 37. Vega J., Scagliusi S. M. M., Ulian E. C, 1997. Sugarcane yellow leaf disease in Brazil: evidence of the association with a luteovirus. Plant Disease Vol 81No. 1 p21 - 26. 38. Viswanathan R and Balamuralikrishnan M, 2004. Detection of sugarcane yellow leaf virus, the causal agent of yellow leaf syndrome in sugarcane by DAS-ELISA. Archives of Phytopathology and Plant Protection. Volume 37, Number 3 / August 2004, p169 – 176. Publisher: Taylor & Francis. [Abstract]. 39. Wang M-L., Schenck S. and Albert H., 2006. Antibody to a short peptide sequence detected Sugarcane yellow leaf virus isolates from several sources. VIIIth ISSCT Pathology Workshop Petit-Bourg, Guadeloupe (FWI) 23 - 27 January 2006 Programme and Abstracts. 40. Wang M-L., Ancheta S., Clayton J., Gold