Đề tài Nghiên cứu sản xuất sữa dừa hàm lượng béo cao

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU Sữa dừa (nước cốt dừa) là một hệ nhũ tương dầu trong nước, được trích ly từ cơm dừa nạo nhuyễn cĩ hoặc khơng bổ sung thêm nước. Sữa dừa sản xuất ở quy mơ cơng nghiệp là một dạng sản phẩm rất phổ biến ở các nước châu Á cĩ diện tích trồng dừa lớn như Phillipines, Malaysia, Thailand, Indonesia… Ở Việt Nam, những năm gần đây đã tập trung nghiên cứu, khai thác các sản phẩm làm từ dừa như nước dừa non đĩng lon, kẹo dừa, kem dừa, bơ dừa, cơm dừa nạo sấy, sữa dừa…Trên thị trường Việt Nam và thế giới hiện nay, các sản phẩm sữa dừa thương mại đều cĩ hàm lượng béo khơng vượt quá 35%wt (Ngơ Minh Hiếu, 2007). Nước ta cĩ nguồn tài nguyên dừa phong phú, tập trung ở các tỉnh như Bình Định, Bến Tre…với chất lượng dừa rất tốt. Vì vậy, chúng tơi đề xuất nghiên cứu sản xuất sữa dừa cĩ hàm lượng béo cao (50%wt béo) nhằm đa dạng hĩa sản phẩm và tiết kiệm chi phí trong quá trình bảo quản và vận chuyển sản phẩm. Năm 2006, Huỳnh Trung Việt đã nghiên cứu ứng dụng quá trình ly tâm nhằm tăng hàm lượng béo trong sữa dừa từ 32% wt béo tăng lên đến 50% wt béo. Năm 2007, Ngơ Minh Hiếu đã nghiên cứu chọn nhiệt độ và thời gian tiệt trùng thích hợp để kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm, chọn hàm lượng các chất phụ gia thích hợp để chống lại quá trình chống oxy hĩa chất béo và làm tăng độ bền của hệ nhũ tương. Dựa trên các kết quả thu được của các tác giả trên, chúng tơi tiếp tục nghiên cứu quy trình cơng nghệ sản xuất sữa dừa hàm lượng béo cao (50% béo), tập trung vào các vấn đề sau: Khảo sát chọn áp suất đồng hĩa sữa dừa. Xác định hàm lượng phụ gia để làm tăng độ bền của hệ nhũ tương. Khảo sát chọn hàm lượng chất chống vi sinh vật thích hợp để tăng thêm thời gian bảo quản sản phẩm. Xác định hiệu suất thu hồi sản phẩm của quy trình sản xuất và kiểm tra các chỉ tiêu hĩa lý, vi sinh của sản phẩm. Chúng tơi hy vọng rằng những kết quả thu được sẽ là cơ sở để gĩp phần triển khai cơng nghệ sản xuất sữa dừa hàm lượng béo cao vào điều kiện thực tế tại Việt Nam. CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu chung về dừa: [2], [38] Cây dừa (Cocos nucifera) là một lồi cây trong họ cau (Arecaceae). Nĩ cũng là thành viên duy nhất trong chi Cocos và là một loại cây lớn, thân đơn trục (nhiều khi gọi là nhĩm thân cau dừa) cĩ thể cao tới 30 m, với các lá đơn xẻ thùy lơng chim 1 lần, cuống và gân chính dài 4–6 m, các thùy với gân cấp 2 cĩ thể dài 60–90 cm. Cây dừa được xem là một loại cây cĩ giá trị kinh tế, mỗi cây trưởng thành cĩ khả năng cho 75 quả mỗi năm. Điều kiện tự nhiên Việt Nam thuận lợi cho việc phát triển cây dừa, nhất là từ vỹ tuyến 20 trở vào. Dừa cĩ thể sinh trưởng trên các loại đất khác nhau, nhưng phát triển tốt trên đất cát cĩ nhiễm mặn nhẹ. Diện tích trồng dừa của Việt Nam hiện nay vào khoảng 220.000 ha, tập trung chủ yếu ở các tỉnh ở miền Trung (Bình Định) và đồng bằng sơng Cửu Long (Bến Tre). Đối với quả dừa tươi, thành phần dinh dưỡng quan trọng nhất là nước dừa, cịn đối với quả dừa khơ, cơm dừa được xem là thành phần giàu giá trị dinh dưỡng và được sử dụng nhiều nhất. Thành phần hĩa học của cơm dừa theo USDA được cho ở bảng 1. Hình 1: Quả dừa khơ bổ đơi Giới thiệu chung về sữa dừa và cơng nghệ sản xuất sữa dừa: [31] Sữa dừa Sữa dừa là một dạng chất lỏng màu trắng sữa với thành phần hĩa học cĩ chứa nhiều chất như béo, protein, carbohydrate, khống…Hàm lượng chất béo trong sữa dừa thường được hiệu chỉnh tùy thuộc vào yêu cầu của từng địa phương và thường nằm trong khoảng 15 – 40% (Pichivittayakarn, 2006). Sữa dừa là một loại sản phẩm được sử dụng phổ biến ở quy mơ gia đình và quy mơ cơng nghiệp, đây là một nguyên liệu cần thiết để chế biến các mĩn ăn truyền thống ở các nước Châu Á, đặc biệt là Thái Lan, Malaysia,….(Pichivittayakarn, 2006). Ngồi ra, sữa dừa cịn là nguyên liệu sản xuất các sản phẩm như jam dừa, syrup dừa, “phơ mai” dừa, đậu hũ dừa (coconut tofu) và một số sản phẩm nước uống như “cocosoy milk”,…Năm 1990, các nhà nghiên cứu ở Philippines đã tạo ra dịng sản phẩm mới bằng cách phối trộn sữa gầy (skim cow’s milk) với sữa dừa. (Seow và Gwee, 1997). Sữa dừa tươi (fresh coconut milk) và sữa dừa sản xuất trong cơng nghiệp rất dễ bị hư hỏng do vi sinh vật. Ngồi ra, sự tách pha của hệ nhũ trong sữa làm cho sản phẩm bị phân lớp và khơng đồng nhất. Vì vậy, trong sản xuất sữa dừa thương mại, chúng ta sẽ bổ sung các chất nhũ hố đồng thời thực hiện quá trình đồng hĩa, đĩng lon và tiệt trùng nhằm kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm. Bảng 1: Thành phần hĩa học của cơm dừa (USDA, 1995) Thành phần Hàm lượng (tính trên 100g ăn được) Đơn vị Nước 46.99 g Năng lượng 354 Kcal Protein 3.33 g Lipid tổng (fat) 33.49 g Chất khống 0.97 g Carbohydrate 15.23 g Chất xơ 9.0 g Bảng 2: Thành phần hĩa học của sữa dừa theo USDA (1995) Thành phần Hàm lượng (tính trên 100g ăn được) Đơn vị Nước 53.90 g Năng lượng 33.0 Kcal Protein 3.63 g Lipid tổng (fat) 34.681 g Chất khống 1.15 g Carbohydrate 6.65 g Chất xơ 2.2 g Cơm dừa nạo nhuyễn Quy trình cơng nghệ sản xuất sữa dừa Trích ly Nước ấm Ép Bã Sữa dừa Sản phẩm Hình 2: Quy trình cơng nghệ sản xuất sữa dừa cĩ hàm lượng béo cao Lon Phụ gia Nước Bã Tiệt trùng Đĩng lon Đồng hố Phối trộn Gia nhiệt Ly tâm Lọc Thuyết minh một số cơng đoạn chính trong quy trình cơng nghệ Trích ly: Cơm dừa sau khi nạo nhuyễn được trích ly trong nước ấm 500C trong 10 phút. Tỷ lệ nước và dung mơi là 1:1 Ly tâm: Sau khi ép và lọc, sữa dừa được ly tâm để tăng hàm lượng chất béo. Theo kết quả nghiên cứu của Huỳnh Trung Việt (2006), để thu được sữa dừa hàm lượng béo 50%wt, lực ly tâm cần sử dụng khơng thấp hơn 880G (N). Phối trộn: Sau khi gia nhiệt, sữa dừa được phối trộn với các phụ gia như các chất nhũ hĩa, chất chống oxy hĩa, chất chống vi sinh vật và natri metabisulphite nhằm tránh sự tách pha của hệ nhũ, hạn chế quá trình oxy hĩa chất béo, kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm hạn chế sự sẫm màu trong quá trình tiệt trùng. Đồng hĩa: Quá trình đồng hĩa được thực hiện nhằm ổn định hệ nhũ tương, chống lại sự tách pha dưới tác dụng của trọng lực. Sau khi đồng hĩa, các hạt cầu béo được xé nhỏ và phân bố đều trong sữa dừa. Thiết bị thường sử dụng hiện nay là thiết bị đồng hĩa áp lực cao, hai cấp. Tiệt trùng: Quá trình tiệt trùng nhằm tiêu diệt vi sinh vật và enzyme cĩ trong sản phẩm, kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm. Theo nghiên cứu của Ngơ Minh Hiếu (2007), thơng số của quá trình tiệt trùng là 1200C, 30 phút. Quá trình tiệt trùng được thực hiện trong nồi hấp autoclave. Quá trình đồng hĩa [6] Giới thiệu chung Đồng hĩa là quá trình thường được sử dụng trong cơng nghiệp thực phẩm. Mục đích của quá trình này nhằm ổn định hệ nhũ tương trong thực phẩm, chống lại sự tách pha dưới tác dụng của trọng lực. Đồng hĩa được hiểu là quá trình xé nhỏ các hạt phân tán cĩ kích thước lớn tồn tại trong hệ nhũ tương thành những hạt cĩ kích thước đồng đều và nhỏ hơn. Nhũ tương là một hệ phân tán của hai chất lỏng khơng hịa tan được với nhau nhưng được trộn lẫn. Khi đĩ, một chất lỏng sẽ tồn tại dưới dạng hạt (được gọi là pha khơng liên tục, pha phân tán hoặc pha nội) trong lịng của chất lỏng cịn lại (được gọi là pha liên tục, pha khơng phân tán hoặc pha ngoại). Trong cơng nghiệp thực phẩm, các hệ nhũ tương thường gặp gồm hai chất lỏng đại diện: nước và dầu. Như vậy, ta sẽ cĩ hai dạng nhũ tương cơ bản: Nước trong dầu (water in oil – w/o) trong đĩ nước ở dạng pha phân tán cịn dầu ở dạng pha liên tục. Dầu trong nước (oil in water – o/w) trong đĩ dầu ở dạng pha phân tán cịn nước ở dạng pha liên tục. Hình 3: Hệ nhũ tương nước trong dầu (w/o) và dầu trong nước (o/w) Trong thực phẩm, ta cịn cĩ thể gặp một số hệ nhũ tương phức tạp khác như hệ nhũ tương nước trong dầu trong nước (water in oil in water – w/o/w), hay hệ nhũ tương dầu trong nước trong dầu (oil in water in oil – o/w/o)...(Hình 4). Nhìn về mặt nhiệt động lực học thì nhũ tương là một hệ khơng bền, do đĩ để tạo độ bền cho nhũ tương, ta cĩ thể cho thêm các phụ gia được gọi là chất nhũ hĩa và chất ổn định. Hình 4: Hệ nhũ tương nước trong dầu trong nước (w/o/w) Cơ sở khoa học của quá trình đồng hĩa Kỹ thuật đồng hĩa hệ nhũ tương bao gồm các phương pháp phá vỡ, làm giảm kích thước những hạt thuộc pha phân tán và phân bố đều chúng trong pha liên tục. Hiện nay cĩ rất nhiều phương pháp đồng hĩa được áp dụng trong thực phẩm như: phương pháp khuấy trộn, phương pháp đồng hĩa áp lực cao, đồng hĩa bằng nghiền keo, bằng siêu âm,…Bảng 3 dưới đây so sánh sơ lược về tính năng cũng như đặc điểm của các phương pháp đồng hĩa. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả đồng hĩa Hiện nay, đồng hĩa áp suất cao là phương pháp phổ biến nhất trong cơng nghệ thực phẩm. Trong phần tiếp theo, chúng tơi sẽ giới thiệu sự ảnh hưởng của một số yếu tố cơng nghệ quan trọng đến hiệu quả đồng hĩa bằng phương pháp sử dụng áp suất cao. Tỷ lệ phần trăm giữa thể tích pha phân tán và tổng thể tích hệ nhũ tương Nếu thể tích của pha phân tán chỉ chiếm một phần nhỏ so với thể tích của tồn hệ nhũ tương thì quá trình đồng hĩa sẽ được thực hiện dễ dàng và hệ nhũ tương thu được sẽ cĩ độ bền cao. Ngược lại, hệ nhũ tương với pha phân tán chiếm tỷ lệ cao thường khĩ đồng hĩa bằng các phương pháp thơng thường. Bên cạnh đĩ, các hạt của pha phân tán cĩ xu hướng dễ kết hợp lại với nhau để tạo thành các hạt lớn hơn, từ đĩ dẫn đến hiện tượng tách pha. Nhiệt độ Nhiệt độ của mẫu càng thấp thì quá trình đồng hĩa càng kém hiệu quả do một số chất béo chuyển sang dạng rắn. Ngược lại, nếu nhiệt độ quá cao, chi phí năng lượng cho quá trình sẽ gia tăng và các phản ứng hĩa học khơng cần thiết cĩ thể xảy ra làm ảnh hưởng đến chất lượng của hệ nhũ tương. Do đĩ, dựa vào thành phần hĩa học của hệ nhũ tương mà ta nên chọn nhiệt độ đồng hĩa cho thích hợp. Bảng 3: So sánh các phương pháp đồng hóa sử dụng để sản xuất hệ nhũ tương Phương pháp đồng hóa Kiểu hoạt động Kiểu dòng chảy chủ yếu Cường độ năng lượng E(J.m) Năng lượng (J.m) Kích thước hạt phân tán Độ nhớt mẫu Khuấy trộn cao tốc Mẻ hoặc liên tục TI, TV, LV Thấp đến cao 1010 Thấp 2m Thấp đến trung bình Nghiền keo Liên tục LV (TV) Thấp đến cao 1010 Trung bình 1m Trung bình đến cao Đồng hóa áp lực cao Liên tục TI, TV (CI) LV Vừa đến cao 1010 cao 0.1m Thấp đến trung bình Đầu dò siêu âm Mẻ hoặc liên tục CI Vừa đến cao 1010 Thấp 0.1m Thấp đến trung bình Tia siêu âm Liên tục CI Vừa đến cao 1010 Cao 1m Thấp đến trung bình Vi lỏng hóa Liên tục TI, TV Vừa đến cao 102.10 cao < 0.1m Thấp đến trung bình Kỹ thuật membrane Mẻ hoặc liên tục Phun Thấp đến Vừa <1010 Rất cao 0.3m Thấp đến trung bình Chú thích: TI: turbulent-inertial (quán tính - rối), TV: turbulent-viscous (rối- nhớt), LV: laminar-viscous (nhớt – tầng) và CI: cavitational (tạo bong bóng khí) Áp suất Áp suất đồng hĩa càng lớn, hiện tượng chảy rối và hiện tượng xâm thực khí sẽ càng dễ xuất hiện, kết quả là các hạt pha phân tán được tạo thành kích thước nhỏ và hệ nhũ tương sẽ cĩ độ bền cao. Tuy nhiên, nếu áp suất đồng hĩa quá lớn sẽ làm tăng chi phí cho quá trình, đồng thời cĩ thể phá vỡ lớp màng bảo vệ xung quanh những hạt phân tán làm cho quá trình tách pha càng dễ xảy ra hơn. Các nhà sản xuất cần xác định áp suất đồng hĩa thích hợp tùy theo thành phần hĩa học của hệ nhũ tương. Phụ gia ổn định nhũ tương và ức chế vi sinh vật trong cơng nghệ sản xuất sữa dừa Phụ gia ổn định nhũ tương: [20], [34], [37] Trong chế biến thực phẩm, để giúp cho quá trình đồng hĩa đạt hiệu quả cao và hệ nhũ tương thực phẩm khơng bị tách pha, người ta sử dụng các phụ gia cĩ chức năng đặc biệt với mục đích ổn định hệ nhũ tương. Các quy định hiện nay về danh mục phụ gia thực phẩm và liều lượng sử dụng phụ thuộc tình hình mỗi nước. Yêu cầu chung đối với nhĩm phụ gia ổn định hệ nhũ tương là khơng độc hại đối với sức khoẻ người tiêu dùng, ít bị biến đổi trong quá trình xử lý và bảo quản. Phụ gia ổn định nhũ tương cĩ thể được chia làm hai nhĩm chất chính: Chất nhũ hĩa: là các chất hoạt động bề mặt. Chất ổn định: là các chất cĩ chức năng tăng cường độ nhớt của pha liên tục, các chất loại này bao gồm chất làm đặc và chất tạo gel. 2.4.1.1. Chất nhũ hĩa Chất nhũ hĩa được chia làm hai nhĩm chính: chất hoạt động bề mặt (surfactans) và các polymer sinh học cĩ cấu trúc lưỡng cực (amphiphilic biopolymers). Hình 5: Phân loại chất nhũ hố theo cấu tạo phân tử Chất hoạt động bề mặt: Thuật ngữ “chất hoạt động bề mặt” được dùng để chỉ những phân tử nhỏ cĩ hoạt tính bề mặt. Cấu trúc phân tử của các chất này thường chứa hai nhĩm: nhĩm phân cực (ưa nước) và nhĩm khơng phân cực (ưa dầu). Đầu ưa nước cĩ thể là các anion (các muối của các acid béo, các muối stearyl lactylate, DATEM, CITREM), các cation (muối quaternary ammonium), ion lưỡng cực (lecithin) hoặc khơng phải là ion (monoglyceride, Tweens, Polysorbates, Spans, ACETEM, LACTEM). Đuơi kỵ nước gồm một hay nhiều mạch hydrocarbon, mỗi mạch thường chứa từ 10 – 20 nguyên tử carbon. Các mạch hydrocarbon này cĩ thể là mạch thẳng hoặc mạch nhánh, mạch hở, mạch vịng, mạch no hoặc mạch khơng no. Trong hệ nhũ tương, các chất nhũ hĩa được phân bố tại vị trí bề mặt tiếp xúc giữa hai pha: đầu phân cực sẽ nằm trong pha nước - hướng về pha nước và đầu khơng phân cực sẽ nằm trong pha dầu, hướng về pha dầu (hình 6). Với cách phân bố như trên, các chất nhũ hĩa sẽ hình thành nên một lớp bảo vệ xung quanh các hạt phân tán, giúp cho hệ nhũ tương được bền vững. Hình 6: Sự phân bố các chất nhũ hố trong dung dịch Tổ chức phân tử của chất hoạt động bề mặt trong dung dịch: Theo Jonsson và cộng sự (1998), ở một nồng độ tương đối thấp, các chất hoạt động bề mặt tồn tại trong dung dịch khi entropy của hỗn hợp lớn hơn lực hút giữa các phân tử chất hoạt động bề mặt. Tuy nhiên, khi nồng độ của các chất hoạt động bề mặt vượt qua một giá trị tới hạn nào đĩ thì khi đĩ, chúng cĩ thể tự kết hợp lại với nhau và chuyển sang những cấu trúc ổn định hơn về mặt nhiệt động. Một số cấu trúc ổn định hơn như: mixen (micelles), cấu trúc lớp kép (bilayers), cấu trúc mixen đảo (reverse micelles), cấu trúc mụn nước (vesicles), mixen khơng cĩ cấu trúc hình cầu (nonspherical micelles) (Hình 7) Nồng độ mà tại đĩ các chất bề mặt tồn tại ở dạng mixen được gọi là nồng độ giới hạn tạo mixen (critical micelle concentration – CMC). Giá trị CMC của một dung dịch phụ thuộc vào cấu trúc hố học, thành phần dung dịch của chúng và một số điều kiện khác. Giá trị CMC cĩ khuynh hướng giảm khi tăng tính kị nước của chất hoạt động bề mặt (bằng cách tăng chiều dài đuơi hydrocarbon) hay nĩi cách khác là giảm tính ưa nước (bằng cách giảm bớt các nhĩm ion). Hình 7: Một số kiểu cấu trúc tiêu biểu hình thành từ sự tập hợp của các chất hoạt động bề mặt. Giá trị cân bằng ưa nước ưa béo: ( Hydrophile – lipophile balance; HLB) HLB là một khái niệm dùng để phân loại các chất hoạt động bề mặt dựa vào giá trị cân bằng ưa nước – ưa béo của chúng. HLB là tỷ số giữa phần trăm khối lượng các nhĩm ưa nước và phân trăm khối lượng các nhĩm ưa béo trong phân tử. Ngày nay, chỉ số HLB được sử dụng rộng rãi để phân loại các chất hoạt động bề mặt (Hasenhuetti và Hartel, 1997). Một phân tử cĩ chỉ số HLB cao sẽ cĩ tỷ lệ giữa nhĩm ưa nước và nhĩm ưa béo cao và ngược lại. Mỗi chất hoạt động bề mặt cĩ một chỉ số HLB khác nhau. Giá trị HLB đĩng vai trị quan trọng trong việc lựa chọn chất hoạt động bề mặt phù hợp cho một hệ nhũ tương. Theo Davis (1994), giá trị HLB của một chất được tính theo cơng thức sau: HLB = 7 +( chỉ số nhóm ưa nước) - (chỉ số nhóm kỵ nước ) Trong đĩ mỗi nhĩm ưa nước hay ưa béo cĩ một chỉ số riêng của nĩ, các chỉ số này được xác định bằng thực nghiệm. Chỉ số các nhĩm ưa nước và kỵ nước (Stauffer, 1999) được cho ở bảng 5: Bảng 4: Chỉ số nhĩm của các nhĩm ưa nước và kỵ nước Nhĩm ưa nước Chỉ số nhĩm Nhĩm ưa béo Chỉ số nhĩm - SO4- Na+ 38.7 - CH - 0.475 - COOH H+ 21.2 - CH2 - 0.475 Tertiary amine 9.4 - CH3 - 0.475 Sorbitan ester 6.8 - CH = 0.475 Glyceryl ester 5.25 -COOH 2.1 -OH 1.9 -O- 1.3 -(CH2-CH2-O-) 0.33 Giá trị HLB của một chất hoạt động bề mặt giúp ta biết được nĩ sẽ dễ hồ tan trong dầu hay hồ tan trong nước, từ đĩ cĩ thể sử dụng cho những kiểu nhũ tương phù hợp. Giá trị HLB thường được dao động từ 1 – 20. Nếu chất hoạt động bề mặt cĩ HLB từ 3 – 6 thì chúng được sử dụng để ổn định hệ nhũ tương nước trong dầu (w/o). Ngược lại, nếu giá trị của HLB từ 8 – 18 thì chúng sẽ ổn định các hệ nhũ tương dầu trong nước (o/w). Bảng 5: Chỉ số HLB và ứng dụng cho các hệ nhũ tương thực phẩm (Friberg, 2000) Chỉ số HLB Ứng dụng 3 – 6 Hệ nhũ tương w/o 7 – 9 Chất làm ướt (wetting agents) 8 – 18 Nhũ tương o/w 13 – 15 Chất tẩy (detergent) 15 – 18 Chất hồ tan (solubilizer) Một số trường hợp ngoại lệ: Một chất hoạt động bề mặt cĩ HLB nằm trong khoảng từ 6 – 8 thì chúng khơng rơi vào hai trường hợp trên. Các chất hoạt động bề mặt được gọi là tác nhân làm ướt. Một chất hoạt động bề mặt cĩ HLB 18 thì cĩ hoạt tính bề mặt thấp, vì chúng rất kị nước hoặc rất ưa nước. Trong những trường hợp này, người ta sẽ sử dụng kết hợp các chất nhũ hĩa để tăng cường khả năng làm ổn định hệ nhũ tương thực phẩm. Chỉ số HLB của một số chất hoạt động bề mặt thường được sử dụng trong thực phẩm được trình bày trong bảng 6. Một trong những hạn chế của khái niệm HLB là khơng đề cập đến sự ảnh hưởng của nhiệt độ hay những yếu tố khác đến sự thay đổi của tính năng nhũ hĩa của các chất hoạt động bề mặt. Nghĩa là một chất hoạt động bề mặt cĩ thể dùng để ổn định hệ nhũ tương này nhưng ở nhiệt độ khác thì nĩ được dùng để ổn định hệ nhũ tương khác, mặc dù chúng cĩ cùng cấu tạo hĩa học. Ngồi ra, chỉ số HLB tối ưu của một chất hoạt động bề mặt dùng để ổn định hệ nhũ tương cịn phụ thuộc vào loại dầu được sử dụng. Vì vậy, cần xác định bằng thực nghiệm chỉ số HLB tối ưu cho từng loại dầu khác nhau. Một số chất hoạt động bề mặt thường được sử dụng Monoglyceride Từ năm 1930 đến nay, mono-diglycerides được sử dụng làm chất nhũ hĩa. Lần đầu tiên thì mono-diglycerides được sử dụng trong sản xuất magarine. Thuật ngữ monoglycerides thường dùng để chỉ các chất hoạt động bề mặt được sản xuất từ các acid béo và glycerol. Tuy nhiên, trong cơng nghiệp hố chất, để thu được các monoglycerides người ta trộn hỗn hợp triglycerides với glycerol, ở nhiệt độ 200 – 2600C với xúc tác là kiềm. Trên thị trường, sản phẩm monoglyceride cĩ độ dài mạch carbon và độ khơng no khác nhau. Nhìn chung, đây là chất hoạt động bề mặt với chỉ số HLB tương đối thấp (2-5). Cấu trúc phân tử của monoglyceride được trình bày ở hình 8. Bảng 6: Chỉ số HLB của một số chất hoạt động hố học thường dùng trong thực phẩm Chất hoạt động bề mặt HLB Sodium lauryl sulfate 40 Sodium stearoyl lactylate 22 Potassium oleate 20 Sucrose monoester 20 Sodium oleate 18 Polyoxyethylene (20) sorbitan monopalmitate 15.6 Polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate 15.0 Sucrose monolaurate 15.0 Polyoxyethylene (20) sorbitan monostearate 14.9 Decaglycerol monooleate 14 Decaglycerol monostearate 14 Ethoxylated monoglyceride 13 Decaglycerol dioleate 12 Polyoxyethylene (20) sorbitan tristearate 11 Polyoxyethylene (20) sorbitan trioleate 10.5 Hexaglycerol dioleate 9 Sorbitan monolaurate 8.6 DATEM 8 Soy lecithin 8 Decaglycerol hexaoleate 7 Triglycerol monostearate 7 Sorbitan monopalmitate 6.7 Glycerol monolaurate 5.2 Calcium stearoyl lactylate 5.1 Sucrose trimester 5 Sorbitan monostearate 4.7 Propylene glycol monolaurate 4.5 Sorbitan monooleate 4.3 Glycerol monostearate 3.8 Glycerol monooleate 3.4 Propylebe glycol monostearate 3.4 Sorbitan tristearate 2.1 Sorbitan trioleate 1.8 Glycerol dioleate 1.8 ACETEM 1.5 Oleic acid 1.0 Hình 8: Cấu trúc phân tử của monoglyceride Ester của polyol với các monoglyceride Các nhĩm hydroxyl tự do trong monoglycerides cĩ thể bị ester hố với các acid hữu cơ như acid acetic, acid lactic, acid citric, acid succinic, diacetyl tartaric,…tạo thành các ester của monoglycerides hay là dẫn xuất ưa nước hay kỵ nước của monoglycerides. Các chất hoạt động bề mặt này bao gồm: Ester của acid acetic với monoglycerides – ACTEM, (E 472a) Ester của acid lactic với monoglycerides – LACTEM, (E 472b) Ester của diacetyl tartaric với monoglycerides – DATEM, (E 472d) Ester của acid succinic với monoglycerides – SMG, (E 472e) LACTEMM SMG DATEM Hình 9: Công thức phân tử của LACTEM, DATEM và SMG Các chất hoạt động bề mặt thuộc nhĩm này ở dạng lỏng hoặc rắn, màu từ trắng đến vàng nhạt Ester của polyol với các acid béo Một dạng ester khác của chất hoạt động bề mặt là ester của polyol với acid béo. Các polyol cĩ thể là: polyglycerol, propylene glycol, sorbitan, polyoxyethylene sorbitan và sucrose; các acid béo cĩ mạch carbon từ 12 – 18, cĩ thể chứa nối đơi (chưa bão hồ). Hình 10: Công thức cấu tạo của triglycerol monostearate (PGE) và sorbitol monostearate (SMS) Tính hịa tan và những đặc tính chức năng của ester của polyol với acid béo phụ thuộc vào kích thước các nhĩm ưa nước và kỵ nước trong phân tử: Những chất hoạt động bề mặt thuộc dạng này trong phân tử cĩ đầu polyol lớn (cĩ chứa nhiều nhĩm – OH) thì cĩ giá trị HLB cao. Những chất thuộc dạng này với đầu polyol nhỏ (cĩ chứa ít nhĩm -OH) sẽ cĩ giá trị HLB thấp. Tỷ lệ ưa nước và kỵ nước trong phân tử cĩ thể thay đổi được bằng việc thay đổi kích thước nhĩm polyol. Các ester của sorbitan với các acid béo thường được sử dụng làm chất bề mặt khơng ion, hịa tan tốt trong dầu, tên thương mại là “Span TM”. Trong khi các ester của polyoxyethylene sorbitan với các acid béo lại được sử dụng làm chất bề mặt dạng khơng ion, hịa tan tốt trong nước và cĩ tên thương mại là “TweenTM” hay “Polysorbate TM”. Hai chất thuộc dạng này thường được sử dụng kết hợp để tăng cường tính ổn định của hệ nhũ tương. Polymer sinh học cĩ cấu trúc lưỡng cực (amphiphilic biopolymers) Giới thiệu chung: Các biopolymer được sử dụng trong thực phẩm là các protein và polysaccharides. Protein được tạo thành từ các monomer là amino acid, cịn polysaccharide được cấu tạo từ các monosaccharide. Tính năng của các biopolymer như độ tan, hoạt tính bề mặt, khả năng tạo gel, tạo đặc…phụ thuộc vào đặc tính phân tử của các monomer như kích thước, khối lượng và trật tự sắp xếp của các monomer. Các monomer cĩ kiểu cấu tạo rất đa dạng về tính cực như: ion, khơng ion, lưỡng cực. Cả hai loại protein và polysaccharide đều cĩ chứa một số lượng lớn monomer (từ 20 – 20000), các monomer này liên kết đồng hĩa trị với nhau và chúng cĩ thể xoay theo một gĩc bất kỳ, vì vậy, các biopolymer cĩ rất nhiều cấu trúc khác nhau trong dung dịch. Trong thực tế, chúng thường tồn tại ở hình dạng sao cho năng lượng tự do đạt cực tiểu. Hình dạng này phụ thuộc vào các tương tác kị nước, tương tác tĩnh điện, liên kết Hydro, liên kết Van der Waals, entropy… Hình dáng đặc trưng của các polymer sinh học tồn tại trong dung dịch với ba dạng cơ bản sau: dạng ngẫu nhiên (Flexible Random – coli Biopolymer), dạng cuộn thẳng (Rigit Linear Biopolymer) và dạng cầu (Compact Globular Biopolymer) như hình 11. Trong đĩ dạng cầu cĩ cấu trúc khá cứng chắc trong khi dạng cuộn thẳng cĩ cấu trúc mở rộng cịn dạng ngẫu nhiên thì cĩ cấu trúc linh hoạt cao. Trong phân tử, polysaccharide cịn cĩ thể phân nhánh trong khi protein thì khơng. Nĩi chung, hình dạng của các polymer trong dung dịch rất phức tạp, cĩ thể ở một số vùng thì dạng cầu, vùng khác thì dạng ngẫu nhiên, vùng khác thì dạng cuộn thẳng. Tuy nhiên, hình dạng này cĩ thể thay đổi nếu chịu sự tác động của nhiều yếu tố như: pH, nhiệt độ, ion, các thành phần trong dung dịch…Tĩm lại, hình dạng, trạng thái, sự kết hợp là các yếu tố quyết định những thuộc tính chức năng của các polymer sinh học. Chính vì vậy mà các nhà khoa học thường quan tâm đến đặc trưng phân tử của các polymer sinh học trong hệ nhũ tương. Dạng ngẫu nhiên Dạng cuộn thẳng Dạng cầu Hình 11: Hình dạng đặc trưng của các polimer sinh học có cấu trúc lưỡng cực Hoạt tính bề mặt và khả năng làm bền hệ nhũ tương: Thơng thường, các polymer sinh học phải phân tán và tan trong dung dịch và sau đĩ thực hiện chức năng nhũ hĩa (McClements, 2002). Sự solvat hĩa các biopolymer là cần thiết trước khi đồng hĩa để hình thành hệ nhũ tương. Quá trình này bao gồm một số giai đoạn như: phân tán, thấm ướt, hịa tan, trương nở… Sau khi biopolymer được hịa tan, cần đảm bảo điều kiện mơi trường để hạn chế sự hợp giọt trong suốt quá trình đồng hĩa hoặc sau khi hệ nhũ tương được tạo thành, ví dụ khi sử dụng protein để ổn định hệ nhũ tương, nếu nồng độ muối cao hoặc giá trị pH của hệ gần với điểm đẳng điện của protein thì lực đẩy tĩnh điện giữa các hạt phân tán khơng đủ mạnh để chống sự hợp giọt. Hoạt tính bề mặt của nhiều biopolymer phụ thuộc vào tỉ lệ các vùng ưa nước và ưa béo trong phân tử. Khi biopolymer hấp phụ lên bề mặt của hai pha dầu - nước thì các nhĩm ưa dầu sẽ nằm trong pha dầu, nhĩm ưa nước thì được định vị trong pha nước. Cách phân bố như trên gĩp phần làm giảm bề mặt tiếp xúc giữa các phân tử dầu và nước tại mặt tiếp xúc giữa hai pha, do đĩ làm giảm sức căng bề mặt, hình thành một lớp màng bảo vệ, chống lại sự hợp giọt. Hình dạng các polymer và thuộc tính hĩa lý của lớp màng bảo vệ phụ thuộc vào cấu trúc phân tử và các tương tác của chúng. Các biopolymer cĩ cấu trúc lưỡng cực dạng ngẫu nhiên và dạng cuộn thẳng phân bố một cách linh hoạt giữa bề mặt pha dầu, pha nước và các vùng tự do, tạo nên màng bảo vệ cĩ cấu trúc dày và hệ nhũ tương ở đây sẽ cĩ độ nhớt thấp; trong khi đĩ, các cấu trúc dạng cầu phân bố và sắp xếp kém linh hoạt hơn, tạo nên các màng bảo vệ xung quanh các giọt nhỏ cĩ cấu trúc mỏng và hệ nhũ tương được tạo thành sẽ cĩ độ nhớt cao. Điều này cĩ thể giải thích là do các màng bảo vệ các giọt cầu béo hình thành bởi protein hình cầu bền vững hơn so với màng tạo bởi protein của hai dạng cịn lại Các phần kỵ nước Nước Dạng cầu Các phần kỵ nước Dạng ngẫu nhiên Dầu Hình 12: Cấu trúc của các màng bảo vệ các giọt nhỏ phụ thuộc vào cấu trúc phân tử và các tương tác của các polymer sinh học Một số biopolymer thường được sử dụng làm phụ gia ổn định hệ nhũ tương trong thực phẩm Protein sữa [6], [13] Một số loại protein từ sữa được dùng làm chất nhũ hĩa trong thực phẩm như một số loại thức uống, kem, nước sốt…Cĩ thể chia chất nhũ hĩa từ protein sữa làm hai nhĩm chính là casein (chiếm khoảng 80% wt) và whey protein (chiếm khoảng 20% wt). Casein cĩ thể thu được bằng cách đơng tụ sữa cịn whey protein là sản phẩm được thu nhận từ quá trình tách huyết thanh trong sản xuất phơ mai. Sự kết tủa casein cĩ thể thu được bằng cách điều chỉnh pH gần điểm đẳng điện (~ 4,6) của casein hay bằng cách xử lý với enzyme rennet. Enzyme này sẽ cắt phần ưa nước của kappa casein, cĩ vai trị ổn định các mixen casein. Nếu kết tủa bằng acid thì casein và whey thu được gọi là “acid casein” và “acid whey”, cịn nếu kết tủa sử dụng enzyme thì casein và whey protein gọi là “rennet casein” và “sweet whey”. Các chất nhũ hĩa cĩ nguồn gốc từ sữa được sử dụng trong thực phẩm bao gồm sữa nguyên (whole milk), casein và whey proteins. Trên thị trường, các dạng chế phẩm này được bán dưới dạng bột gồm hai dạng protein concentrate (25 – 80% protein) và protein isolate ( >90% protein), cĩ màu kem nhạt hoặc màu trắng và cĩ mùi nhẹ. Tuy nhiên, các sản phẩm dạng này thường cĩ giá thành cao nên thường chỉ được sử dụng trong nghiên cứu. Cĩ 4 kiểu protein chính trong casein: (~44%), (~11%), (~32%) và (~11%) (Bylund, 1995). Nhìn chung, những phân tử protein này cĩ cấu trúc tương đối ngẫu nhiên và linh hoạt. Phân tử casein cũng chứa những vùng khơng phân cực và những vùng tích điện cao. Các yếu tố này đĩng vai trị chính trong việc xác định cấu trúc phân tử và thuộc tính chức năng của chúng trong thực phẩm. Ở trạng thái tự nhiên, casein tồn tại dưới dạng mixen và cĩ đường kính từ 50 – 250 nm, một phần liên kết với nhau bằng liên kết ion (chẳng hạn như calcium phosphate). Một số tên casein thương mại bao gồm: sodium caseinate, calcium caseinate, acid casein, rennet casein. Khi dùng casein để ổn định hệ nhũ tương, tại các giá trị pH từ 3,3 – 5,3 và nồng độ muối cao, casein sẽ mất hoạt tính nhũ hĩa (Srinivasan et al., 2000). Casein bền nhiệt hơn là whey protein. Whey protein cũng là hỗn hợp của nhiều protein. Trong đĩ các thành phần đáng lưu ý là: -lactoglobulin (~55%), a-lactalbumin (~24%), serum albumin (~5%) và immunoglobulin (~15%). Thơng thường -lactoglobulin quyết định đặc tính chức năng của whey protein vì nĩ thành phần tương đối lớn và cĩ những thuộc tính hĩa lý đặc biệt. Khi sử dụng whey protein để làm ổn định hệ nhũ tương thì cần lưu ý những nồng độ muối cao, giá trị pH ~ 45,5 và ở các nhiệt độ cao thì hoạt tính nhũ hĩa whey protein sẽ mất. Protein thực vật Đậu và ngũ cốc chứa một số protein cĩ khả năng ổn định hệ nhũ tương. Trong đĩ protein cĩ nguồn gốc từ đậu nành được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi, chế phẩm làm ổn định hệ nhũ tương cĩ nguồn gốc từ đậu nành là protein isolate. Protein từ thịt cá Cá và thịt chứa một số lượng lớn protein cĩ khả năng làm ổn định hệ nhũ tương như gelatin, myosin, actomyosin, actin và một vài loại protein cơ tương. Tuy nhiên, ngồi gelatin thì khả năng nhũ hĩa của các protein cơ khơng được cao. Tinh bột biến tính Tinh bột tự nhiên cĩ thuộc tính hoạt động bề mặt rất thấp. Người ta cĩ thể sản xuất tinh bột biến tính bằng các phương pháp hĩa học, gắn thêm các nhĩm kỵ nước dọc theo mạch của chúng. Khi đĩ khả năng hoạt động bề mặt của tinh bột sẽ tăng lên nhiều. Người ta thường sử dụng nhất là dẫn xuất octenyl succinate của tinh bột ngơ sáp (waxy-maize). Chúng bao gồm các nhĩm amylopectin đã được gắn thêm các nhĩm khơng cực. Khi sử dụng chúng làm chất nhũ hĩa thì các nhĩm khơng cực sẽ định hướng về pha dầu và các nhĩm ưa nước dọc theo mạch sẽ định hướng về pha nước và chống lại sự kết tụ của các giọt phân tán. Các hệ nhũ tương được ổn định bởi tinh bột biến tính thì bền trong một khoảng pH rộng từ 3 – 9, nồng độ ion cao (0 – 25 mM CaCl2) và khoảng nhiệt độ từ 30 – 900C. Các tinh bột biến tính được sử dụng rộng rãi trong cơng nghiệp đồ uống. 2.4.1.2. Chất ổn định: các chất ổn định cĩ bản chất là các chất keo ưa nước. Các chất loại này bao gồm protein và polyssaccharide. Tính cơng nghệ của các chất keo ưa nước là cĩ khả năng tạo đặc và tạo gel nên chúng được sử dụng làm bền và làm ổn định cấu trúc của các loại thực phẩm. Một số loại keo ưa nước được dùng trong thực phẩm được cho ở bảng 7: Bảng 7: Các loại chất ổn định thường dùng trong thực phẩm Nguồn gốc Các loại keo Thực vật Từ thực vật: cellulose, pectin, tinh bột Nhựa cây: gum arabic, gum karaya, gum ghatti, gum tragacanth Hạt: guar gum, locust bean gum, tara gum Động vật Gelatin, caseinate, whey protein, chitosan Vi sinh vật Xanhthan gum, curdlan, dextran, gellan gum, cellulose Tảo Tảo đỏ: agar, carrageenan Tảo nâu: alginate a. Chất tạo đặc (thickening agents) Đặc tính tạo đặc được thể hiện qua khả năng làm tăng độ nhớt của pha liên tục trong các hệ nhũ tương w/o (Mckenna, 2003). Khả năng này làm thay đổi cấu trúc và chỉ tiêu cảm quan của thực phẩm. Các chất tạo đặc tồn tại trong thực phẩm ở dạng những phân tử mở rộng hay những tổng thể phân tử được hydrate hĩa. Khả năng tăng cường tính nhớt phụ thuộc vào phân tử lượng, sự phân nhánh, hình dáng và tính linh động của các phân tử. b. Chất tạo gel (gelling agents) Một số keo ưa nước được sử dụng như là một thành phần chức năng trong các nhũ tương thực phẩm, vì khả năng hình thành gel trong pha nước của các sản phẩm. Sự hình thành gel trong thực phẩm tạo nên cấu trúc và thuộc tính cảm quan đặc biệt cho thực phẩm và quan trọng là chống lại khả năng hợp giọt của các phân tử. Một hệ gel tạo bởi biopolymer gồm các biopolymer liên kết với nhau tạo thành một mạng khơng gian ba chiều nhốt các phân tử nước. Thuộc tính tạo gel phụ thuộc vào kiểu cấu trúc và những tương tác của các chất tạo gel. Cĩ nhiều phương pháp để tạo gel như thay đổi nhiệt độ, pH, lực ion, sử dụng các chất làm biến tính hoặc các chất giúp tạo liên kết ngang. Các biopolymer cĩ thể tạo liên kết ngang với nhau bằng các liên kết đồng hĩa trị, liên kết cầu muối, liên kết hydro, liên kết Van der Waals. Các hệ gel trong thực phẩm cĩ thể chia làm hai loại, gel cĩ cấu trúc dạng hạt (particulate gel) và gel cĩ cấu trúc dạng sợi (filamentous gel). Về mặt quang học, gel cĩ cấu trúc dạng hạt thì khơng trong suốt do nĩ cĩ các phần tử cĩ kích thước lớn cĩ khả năng chắn sáng mạnh. Trái lại, gel cĩ cấu trúc dạng sợi thì trong suốt và cĩ khả năng giữ nước tốt. Các loại gel cĩ cấu trúc dạng hạt thường gặp là whey protein, protein đậu nành, protein trứng…Các loại gel cĩ cấu trúc dạng sợi thường gặp là gelatin, pectin, agar. Một số chất tạo đặc và tạo gel thường gặp trong thực phẩm * Xanhthan gum: [29], Xanhthan gum là một loại polysaccharide ngoại bào được tổng hợp bởi lồi Xanthomonas campestris. Trong nước lạnh, xanhthan gum cĩ thể hịa tan được dễ dàng hình thành nên một dung dịch cĩ độ nhớt cao ở nồng độ rất thấp (khoảng 1%w/w). Vì vậy, xanhthan gum cĩ tính chất như một chất tạo độ nhớt cho hầu hết các dạng thực phẩm dạng lỏng và được gọi là “chất giả dẻo” (pseudoplastic). Xanhthan gum cĩ thể được coi là một dẫn xuất của cellulose. Trọng lượng phân tử của xanhthan gum > 106 Da. Cấu trúc của xanhthan gum được trình bày trong hình 13. Mạch xanhthan gum chứa các liên kết 1,4 của b-glucopyranose. Cứ cách một gốc đường, tại vị trí C3 của đường glucose tiếp theo lại gắn một đoạn mạch nhánh trisacchride cĩ cấu trúc b-D-GlcpA(1-2)-a-D-Manp. Gốc đường mannose nối với mạch chính bị acetyl hĩa ở C6, cịn khoảng 50% đường mannose ở đầu cuối của đoạn mạch nhánh này liên kết với pyruvate thành 4,6-O-(1-carboxyethylidene)-D-mannopyranose. So với các loại biopolymer khác, dung dịch xanhthan gum cĩ độ nhớt rất bền trong một giới hạn nhiệt độ và pH rộng. Bên cạnh đĩ, dung dịch này cĩ khả năng chống lại một số tác dụng phân cắt của enzyme. Xanhthan gum khi kết hợp với các loại gum khác ở nồng độ nhỏ (từ 0.05 – 1%) cĩ thể gia tăng khả năng tạo độ nhớt. Hình 13: Cơng thức phân tử xanhthan gum * Carboxymethylcellulose (CMC) CMC là dẫn xuất của cellulose với acid chloroacetic. Cellulose là một polymer tạo nên từ các đơn phân là phân tử đường b-D-glucose bởi các liên kết b-1,4-glucoside. Thơng thường, CMC cĩ thể tan trong cả nước nĩng cũng như nước lạnh tạo nên một dung dịch trong suốt, khơng màu và khơng cĩ mùi rõ rệt. Cũng như các dẫn xuất của cellulose khác, độ nhớt của dung dịch CMC cũng phụ thuộc vào chỉ số DP (mức độ polymer hĩa). Vì CMC tồn tại ở dạng ion trong dung dịch nên độ hịa tan và độ nhớt của CMC phụ thuộc nhiều vào pH. CMC là một ion polymer nên nĩ cĩ thể tạo phức với protein hịa tan (casein hay soy protein) hoặc xung quanh điểm đẳng điện của protein. Như trên đã nĩi, độ nhớt của CMC phụ thuộc chủ yếu vào pH, tuy nhiên, nĩ cũng phụ thuộc vào thành phần và nồng độ của protein, nồng độ và kiểu CMC. Tại pH 6, CMC cĩ thể phản ứng ở nhiệt độ lạnh với protein trong sữa tạo thành phức chất và cĩ thể loại bỏ như kết tủa. Nếu 3 < pH < 5, phức chất CMC – protein bền, ổn định (hình 14). Hỗn hợp chứa CMC và casein khá nhạy cảm, phức chất bền nhiệt và độ nhớt giảm khi được đun nĩng. Hình 14: Đơn vị cấu trúc lý tưởng của Gum là dẫn xuất của cellulose Các phụ gia chống vi sinh vật [7], [12] Phụ gia chống vi sinh vật là chế phẩm làm tăng tính an tồn và làm tăng độ bền của thực phẩm trước vi sinh vật (khơng kể một số gia vị truyền thống đã sử dụng trong thực phẩm cĩ chức năng khác, nhưng cũng cĩ tác dụng bảo quản chống vi sinh vật như giấm, đường, cồn, muối,…). Việc lựa chọn một phụ gia chống vi sinh vật cần phải quan tâm đến những yếu tố sau: Cần hiểu biết về phạm vi hoạt động của chất chống vi sinh vật cần sử dụng. Tính chất vật lý và tính chất hĩa học của thực phẩm và chất chống vi sinh vật như: pKa, tính tan của chất chống vi sinh vật, pH của thực phẩm. Điều kiện bảo quản thực phẩm và các quá trình chế biến phải được tính tốn để đảm bảo chức năng chống vi sinh vật của phụ gia cần sử dụng. Phụ gia chống vi sinh vật phổ biến hiện nay là acid benzoic và muối benzoat: Acid benzoic trong tự nhiên được tìm thấy trong các loại thực vật như dâu (cranberry), mận, quế, đinh hương…đã từ lâu được sử dụng như một chất ức chế vi sinh vật thực phẩm. Acid benzoic tồn tại dạng tinh thể bền, khơng mùi, màu trắng. Natri benzoat tan tốt trong nước (66,0g/100ml ở 200C) và ethanol (0,81g/100ml ở 150C). Vì khả năng tan trong nước của acid benzoic thấp hơn nhiều so với natri benzoat nên người ta thường sử dụng natri benzoat trong nhiều thực phẩm. Chức năng chính của acid benzoic và natri benzoat là chống vi khuẩn. Hầu hết các loại nấm men và nấm mốc sẽ bị ức chế ở nồng độ 0,05 – 0,1% trong khi nồng độ để ức chế vi khuẩn là 0,01 – 0,02%. Phạm vi ứng dụng của acid benzoic và natri benzoat được cho cụ thể ở bảng 8. Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật của acid benzoic và natri benzoat hiện nay cũng chưa được nghiên cứu đầy đủ. Một số nghiên cứu cho rằng acid benzoic ức chế quá trình tổng hợp acid amin của nấm mốc và vi khuẩn. Benzoat cũng cĩ khả năng ức chế enzyme trong tế bào của vi khuẩn như những enzyme cần thiết trong chu trình tạo acid lactic, enzyme a-ketoglutarate và succinate dehydrogenase trong chu trình citric. Benzoat cĩ khả năng ức chế hoạt tính của enzyme trimethylamine-N-oxide reductase của Escherichia coli, ức chế quá trình tạo aflatoxin của Aspergillus flavus. Ngồi acid benzoic và muối benzoat, các nhà sản xuất thực phẩm cĩ thể sử dụng những phụ gia chống vi sinh vật khác như acid sorbic và muối sorbate, các acid hữu cơ như acid citric, acid acetic, acid lactic,… Bảng 8: Khả năng ức chế vi sinh vật của natri benzoic và natri benzoat Vi sinh vật pH Liều lượng (ppm) 1. Vi khuẩn Bacillus receus E. coli Lactobacillus Micrococcus sp Pseudomonas sp 6,3 5,2 – 5,6 4,3 – 6,0 5,5 – 5,6 6,0 500 50 – 120 300 – 1800 50 – 100 200 - 480 2. Nấm men: Dabaryonyceshansenii Zygoaccharomyces Saccharomyces bayanus Zygoaccharomyces bailic 4,8 4,8 4,0 4,8 500 100 330 4500 3. Nấm mốc: Aspergillus Penicillium citrinum Penicillium glaucam Mucor racemosus Phizopus nigricans 3,0 – 3,5 5,0 5,0 5,0 5,0 200-300 2000 400 – 500 30 – 120 CHƯƠNG 3 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Cơm dừa Dừa sử dụng trong nghiên cứu này thuộc giống dừa Ta (Cocus nucifera L.), độ tuổi từ 11 – 12 tháng, được hái từ nhà vườn thuộc huyện Mỏ Cày, tỉnh Bến Tre. Cơm dừa được sử dụng trong quá trình thí nghiệm cĩ màu trắng sáng, được gọt sạch lớp vỏ nâu bên ngồi và nghiền nhỏ đến kích thước 1,5 – 3 mm. Cơm dừa cĩ mùi đặc trưng của dừa, khơng cĩ mùi lạ như mùi ơi, thiêu, mùi mốc hay mùi dầu dừa Hố chất sử dụng: Hố chất sử dụng trong nghiên cứu này được trình bày trong bảng 9 Bảng 9: Các hố chất sử dụng trong quá trình nghiên cứu Tên hố chất Chức năng Nhà cung cấp Xanthan gum Tăng độ nhớt Cơng ty EAC Tween 80 Tạo nhũ Sở Cơng nghiệp TP.HCM CMC Tăng độ nhớt Cơng ty EAC BHT Chống oxy hố chất béo Cơng ty Golden Hope Nhà Bè Natri metabisulphite Hạn chế sự sẫm màu Cơng ty Ngọc Sơn Natri benzoat Chống vi sinh vật Cơng ty Ngọc Sơn Phương pháp nghiên cứu Mục đích nghiên cứu Mục đích của nghiên cứu này nhằm chọn ra áp suất đồng hĩa và hàm lượng các chất nhũ hĩa thích hợp để tránh hiện tượng tách pha trong sữa dừa. Ngồi ra, chúng tơi cũng khảo sát chọn hàm lượng chất chống vi sinh vật thích hợp nhằm kéo dài thời gian bảo quản sữa dừa và xác định hiệu suất thu hồi sản phẩm của tồn bộ quy trình sản xuất. Sơ đồ nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng của chất chống vi sinh vật đến thời gian bảo quản sản phẩm Tính hiệu suất của quy trình sản xuất và Kiểm tra chỉ tiêu vi sinh, chỉ tiêu hĩa lý của sản phẩm Chọn các thơng số cơng nghệ cho quy trình tạo sản phẩm sữa dừa trong phịng thí nghiệm Khảo sát ảnh hưởng của áp suất đồng hĩa đến độ bền của hệ nhũ trong sản phẩm Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng các chất nhũ hĩa sử dụng đến độ bền của hệ nhũ tương của sản phẩm Kết luận và kiến nghị Hình 15: Sơ đồ nghiên cứu 3.2.2.1 Chọn các thơng số cơng nghệ cho quy trình tạo sản phẩm sữa dừa trong phịng thí nghiệm Trong quá trình thực hiện thí nghiệm, chúng tơi sử dụng kết quả thu được trong nghiên cứu của Vũ Chí Hải (2005), Huỳnh Trung Việt (2006) và Ngơ Minh Hiếu (2007). Các mẫu thí nghiệm được thực hiện theo quy trình như hình 2, sử dụng các thơng số sau: * Quá trình trích ly sữa dừa (Vũ Chí Hải, 2005): Tỉ lệ cơm dừa : dung mơi (nước) : 1 : 1 (w/w) Nhiệt độ trích ly : 500C Thời gian trích ly : 10 phút * Quá trình ly tâm tách béo (Huỳnh Trung Việt, 2006): Lực ly tâm sử dụng để thu được sữa dừa cĩ hàm lượng béo 50 % wt khơng thấp hơn 880G (N) * Quá trình gia nhiệt - phối trộn phụ gia: Sữa dừa sau khi ly tâm tách béo được gia nhiệt đến nhiệt độ 800C và phối trộn phụ gia. Quá trình phối trộn được thực hiên bằng thiết bị khuấy cơ tốc độ cao Heidolph Diax 900 do hãng Heidolph (Đức) sản xuất tốc độ quay là 15200 rpm và thời gian khuấy là 3 phút. Một số phụ gia được chọn với hàm lượng như sau (Ngơ Minh Hiếu, 2007). Chất chống oxy hố BHT với hàm lượng 0.025% (w/w) Chất chống biến nâu trong quá trình tiệt trùng: Natri metabisulphite với hàm lượng 0.005% (w/w) * Quá trình tiệt trùng: Sữa dừa sau đồng hố áp lực cao được đĩng lon kim loại và tiệt trùng ở nhiệt độ 1200C – 30 phút (Ngơ Minh Hiếu, 2007) Khảo sát ảnh hưởng của áp suất đồng hĩa đến độ bền của hệ nhũ trong sản phẩm: Trong phần này, chúng tơi tiến hành thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm cổ điển. Hàm mục tiêu của quá trình khảo sát là chỉ số Nizo của sản phẩm đã qua quá trình đồng hĩa áp lực cao. Chúng tơi cố định hàm lượng các chất nhũ hĩa, thay đổi áp suất đồng hĩa và tiến hành đo chỉ số Nizo của sữa dừa sau quá trình đồng hĩa. Từ đĩ, chúng tơi chọn ra áp lực đồng hĩa thích hợp. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng các chất nhũ hĩa đến độ bền của hệ nhũ trong sản phẩm: Ứng với áp suất đồng hĩa đã chọn ở trên, chúng tơi lần lượt thay đổi tỷ lệ hàm lượng các chất nhũ hĩa trong giới giạn cho phép của Bộ Y tế và tiến hành đo chỉ số Nizo của sữa dừa sau quá trình đồng hĩa. Căn cứ vào hàm mục tiêu là chỉ số Nizo của sản phẩm, chúng tơi chọn ra tỷ lệ thích hợp của các phụ gia nhũ hố. Khảo sát ảnh hưởng của chất chống vi sinh vật đến thời gian bảo quản của sản phẩm: Trong phần này, chúng tơi bổ sung phụ gia chống vi sinh vật là natri benzoat (theo tiêu chuẩn của CODEX cho sản phẩm sữa dừa) với các liều lượng khác nhau. Dựa vào hàm mục tiêu là tổng số vi khuẩn hiếu khí, chúng tơi tiến hành kiểm tra các mẫu sau quá trình làm hư gia tốc và chọn ra hàm lượng chất chống vi sinh vật thích hợp. Xác định hiệu suất thu hồi sản phẩm của quy trình sản xuất và kiểm tra chỉ tiêu hĩa lý, vi sinh của sản phẩm: Trong phần này, chúng tơi tiến hành thực hiện tồn bộ các quá trình trong quy trình cơng nghệ sản xuất sữa dừa ở quy mơ phịng thí nghiệm với các thơng số đã tìm được. Chúng tơi xác định hiệu suất thu hồi sản phẩm trong tồn bộ quy trình. Mẫu sữa dừa được gửi đến Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiêm (2 – Nguyễn Văn Thủ) và Viện Pasteur (162 Pasteur) để kiểm các chỉ tiêu hĩa lý và vi sinh. Các thiết bị sử dụng và các phương pháp phân tích Các thiết bị sử dụng Máy ly tâm lỏng - lỏng: Do hãng EDIBON (Đan Mạch) sản xuất, tốc độ tối đa 20000rpm. Đường kính rotor 10 cm. Máy ly tâm lắng: do hãng Hettich Zentrifugen (Đức) sản xuất. Tốc độ tối đa 10000 rpm Máy xác định chỉ số Nizo: Do Việt Nam sản xuất. Tốc độ quay 1000 rpm Máy đồng hĩa cơ Heidolph Diax 900: Do hãng Heidolph (Đức) sản xuất. Tốc độ quay của motor từ 8000 – 26000 rpm. Máy đồng hĩa áp lực cao: Do hãng APV (Đan Mạch) sản xuất. Áp lực đồng hĩa tối đa là 1000 bar Thiết bị tiệt trùng autoclave: Do hãng Huxley (Đài Loan) sản xuất. Nhiệt độ tối đa 1370C. Các phương pháp phân tích Phương pháp xác định hàm lượng chất béo Adam – Rose – Gottlieb [10] Nguyên tắc Trích ly lipid trong mẫu phân tích bằng diethyl ether và petroleum ether trong mơi trường NH3 và cồn. Làm bay hơi hết ether, cân lipid và từ đĩ xác định hàm lượng lipid trong mẫu phân tích. Phương pháp xác định chỉ số Nizo [6] Nguyên tắc Chỉ số Nizo được dùng để xác định hiệu quả của quá trình đồng hĩa. Nguyên tắc của phương pháp là thực hiện quá trình phân riêng hai pha dầu và nước trong hệ nhũ tương bằng cách sử dụng lực ly tâm. Xác định lượng chất béo cĩ trong 25ml mẫu đem phân tích và 20 ml ở phần đáy của mẫu sau quá trình ly tâm. Chỉ số Nizo là tỷ lệ giữa hàm lượng chất béo trong 20ml ở đáy ống ly tâm so với hàm lượng chất béo trong 25 ml mẫu ban đầu. Chỉ số Nizo càng cao thì hệ nhũ tương càng ổn định và ngược lại. Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí [5] Nguyên tắc: Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa, đếm khuẩn lạc trên mơi trường thạch sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 30 ± 10C trong thời gian từ 48 – 72 giờ. Số lượng vi khuẩn hiếu khí trong 1g hay 1 ml mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính từ số khuẩn lạc đếm được từ các hộp nuơi cấy theo các độ đậm pha lỗng. Phương pháp phân tích cảm quan Kiểm tra cảm quan các mẫu thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp phân tích mơ tả (descriptive analysis techniques). Phương pháp phân tích thống kê: [8] Các kết quả thí nghiệm được kiểm tra liệu cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa giữa chúng hay khơng thơng qua phương pháp phân tích ANOVA một chiều với độ tin cậy là 95% (p < 0.05). CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát ảnh hưởng áp suất đồng hố đến sự ổn định của hệ nhũ tương. Trong thí nghiệm này, chúng tơi lần lượt sử dụng áp lực là 100, 150, 200, 250, 300 bar trong quá trình đồng hố mẫu sữa dừa. Tất cả các mẫu sữa dừa đều được bổ sung hỗn hợp phụ gia với thành phần như sau (tính theo khối lượng nguyên liệu) Xanthan gum : 0,30% CMC : 0,30% Tween 80 : 0,30% BHT : 0,025% Sau quá trình tiệt trùng, cấu trúc của hệ nhũ tương bị biến đổi. Do đĩ, sau khi thực hiện xong quá trình đồng hố, chúng tơi rĩt mẫu vào bao bì kim loại, tiệt trùng (1200C, 30 phút) rồi sau đĩ mới lấy mẫu đem đi phân tích chỉ số Nizo và xác định độ nhớt. Các mẫu thí nghiệm trên đều được thực hiện với 3 lần lặp lại để cĩ thể kiểm định thống kê. Kết quả thí nghiệm xác định chỉ số Nizo được trình bày trong bảng 10 và hình 16. Bảng 10: Chỉ số Nizo của các mẫu được đồng hĩa ở các áp suất khác nhau Áp suất đồng hố (bar) Chỉ số Nizo Chỉ số Nizo trung bình 100 97.4 97.2 97.8 97.5a 150 97.5 97.6 98.0 97.7a 200 98.1 98.1 97.8 98.0a 250 98.3 98.4 98.6 98.4b 300 98.5 98.8 98.1 98.5b a, b: Các giá trị cĩ cùng chữ viết phía trên thì khơng khác nhau cĩ nghĩa với p < 0,05 Hình 16: Chỉ số Nizo của mẫu sữa dừa ứng với các giá trị áp lực đồng hĩa khác nhau Xét về mặt lý thuyết, khi tăng áp lực đồng hĩa sẽ làm giảm kích thước của các hạt cầu béo, phân bố chúng đều hơn trong dung dịch và ngăn cản sự hợp giọt, làm tăng khả năng ổn định về mặt vật lý và hĩa lý của sản phẩm. Ngược lại, áp lực đồng hĩa thấp sẽ khơng đủ năng lượng để cĩ thể phá vỡ các chùm béo (Floury, 2000). Tuy nhiên, dựa vào bảng 10, chúng ta cĩ thể thấy rằng sự khác biệt về chỉ số Nizo của các mẫu thí nghiệm là rất nhỏ, nghĩa là hiệu quả đồng hĩa ở các giá trị áp suất đã khảo sát là như nhau. Nguyên nhân cĩ lẽ là do độ nhớt của sữa dừa khá cao nên giá trị lực ly tâm sử dụng theo phương pháp Nizo(1000rpm/phút) khơng đủ mạnh để phân tách thành phần béo cĩ trong mẫu sữa dừa trong quá trình ly tâm. Cũng theo Floury (2000), hệ nhũ tương thu được khi đồng hĩa với áp suất thấp thì thể hiện tích chất của dịng chảy Newton (Newtonian flow behavior) với độ nhớt thấp do khơng cĩ sự tương tác giữa các phần tử. Khi áp lực đồng hĩa tăng lên, độ nhớt của hệ nhũ sau đồng hĩa cũng tăng, điều này được giải thích là do cĩ sự tương tác mạnh giữa các phần tử trong hệ nhũ. Hơn nữa, nghiên cứu của Vitali và cộng sự (1985) đã cho rằng do cĩ hàm lượng chất béo cao, sữa dừa thể hiện tính chất của một chất “giả dẻo” (pseudoplastic) ở nhiệt độ 15 – 500C. Simuang và cộng sự (2004) cũng đưa ra một kết luận tương tự khi làm thí nghiệm với sữa dừa cĩ hàm lượng béo từ 15 – 30% ở nhiệt độ 70 – 900C. Theo McClements (2002), một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến sự tách pha của hệ nhũ tương đĩ là độ nhớt vì nĩ ảnh hưởng đến sự tách pha do trọng lực của hệ nhũ. Chúng tơi cũng tiến hành đo độ nhớt của các mẫu sữa dừa sau khi đồng hĩa. Kết quả của thí nghiệm đo độ nhớt được trình bày trong bảng 11 và hình 17. Dựa vào đồ thị hình 17, chúng ta cĩ thể thấy rằng khi tăng áp suất đồng hĩa từ 100 bar đến 300 bar thì độ nhớt của sữa dừa cũng tăng theo. Tuy nhiên, khi áp suất tăng cao hơn 200bar thì mức độ tăng độ nhớt của sữa dừa là khơng lớn. Theo lý thuyết, độ nhớt càng cao thì khả năng tách pha càng khĩ xảy ra. Do đĩ chúng tơi đề xuất chọn áp suất đồng hĩa sử dụng cho sữa dừa là 200bar. Bảng 11: Ảnh hưởng của áp suất đồng hố đến độ nhớt của sản phẩm Áp suất đồng hố (bar) Độ nhớt (cP) Độ nhớt trung bình (cP) 100 16100 16028 16240 16123a 150 16530 16550 16490 16523b 200 17095 17100 17090 17095c 250 17150 17200 17125 17158d 300 17180 17200 17170 17183d a, b, c, d: Các giá trị cĩ cùng chữ viết thì khơng khác nhau cĩ nghĩa với p < 0,05 Hình 17: Độ nhớt của mẫu sữa dừa sau đồng hĩa ở các giá trị áp suất khác nhau Theo Bergenstahl và Claesson (1990), trong các yếu tố ảnh hưởng đến sự ổn định của hệ nhũ tương thực phẩm như: hàm lượng béo, kích thước các hạt béo, các chất nhũ hĩa sử dụng, hàm lượng các chất nhũ hĩa so với hàm lượng béo…thì yếu tố kích thước các hạt cầu béo đĩng một vai trị quan trọng nhất trong việc ổn định hệ nhũ. Các hạt cầu béo cĩ kích thước lớn hơn thì sẽ cĩ khả năng hợp giọt nhanh hơn so với các hạt cĩ kích thước nhỏ (Jena, 2005). Để thấy rõ sự giảm kích thước của các hạt cầu béo sau quá trình đồng hĩa, chúng tơi tiến hành lấy mẫu chụp hình bằng kính hiển vi quang học Horiba LB 550 tại Phịng thí nghiệm cơng nghệ Nano – Đại học Quốc gia TPHCM. Chúng tơi khảo sát 3 mẫu: + Mẫu sữa dừa sau quá trình ly tâm để đạt được hàm lượng béo khơng thấp hơn 50% + Mẫu sữa dừa sau giai đoạn khuấy cơ (Tốc độ khuấy 15200 rpm và thời gian khuấy là 3 phút) + Mẫu sữa dừa sau giai đoạn đồng hố áp lực cao (áp suất 200 bar) Kết quả thu được như sau: Đối với mẫu sữa dừa sau ly tâm, chưa qua đồng hĩa (Hình 18 a,b), chúng ta thấy rằng các hạt cầu béo cĩ kích thước khơng đồng đều nhau. Cĩ hạt cĩ kích thước rất lớn, ngược lại cĩ hạt cĩ kích thước rất nhỏ. Chúng cĩ nhiều hình dạng khác nhau như hình cầu, hình oval, hình ống thon dài. Đối với mẫu sữa dừa sau giai đoạn khuấy trộn tốc độ cao, chúng ta thấy rằng các hạt cầu béo đã cĩ kích thước giảm đi so với mẫu sau ly tâm ban đầu. Ngồi ra, quá trình khuấy cịn giúp phối trộn các phụ gia và phân bố chúng đều trong dung dịch. Trên hình 19 a, ta thấy hầu hết các hạt cầu béo đã được bao bọc xung quanh 1 lớp màng bởi các chất nhũ hố. Tuy nhiên, do hàm lượng béo trong sữa dừa cao (hơn 50%) nên quá trình khuấy trộn chưa đủ để phân bố đều các phụ gia trong dung dịch nên cũng cĩ những vùng chất béo chưa được bao phủ bởi các chất nhũ hĩa (Hình 19 b). Sau quá trình đồng hĩa áp lực cao với áp suất 200bar, chúng ta cĩ thể nhận thấy sự khác biệt rõ ràng về kích thước của các hạt cầu béo so với hai mẫu trên (hình 20a,b). Trong quá trình đồng hĩa, các hạt cầu béo cĩ kích thước lớn bị xé nhỏ bởi lực cắt mạnh (high shear force), tạo nên các hạt cầu béo cĩ kích thước đồng đều và nhỏ hơn nhiều so với hạt béo ban đầu. Peamprasart (2006) cũng cho những nhận xét tương tự khi khảo sát hệ nhũ tương sữa dừa cĩ 30% béo. So với mẫu chỉ qua khuấy trộn, các hạt béo của mẫu sau khi đồng hĩa áp lực cao cĩ kích thước nhỏ hơn, được phân bố đều hơn trong dung dịch và hầu hết các hạt béo đã được bao bởi các chất nhũ hĩa, giúp ổn định hệ nhũ, chống lại quá trình hợp giọt và tách pha. Hình 18a: Mẫu sữa sừa sau khi ly tâm để tăng hàm lượng béo (phĩng đại 400 lần) Hình 18b: Mẫu sữa sừa sau khi ly tâm để tăng hàm lượng béo (phĩng đại 400 lần) Hạt béo được bao xung quanh 1 lớp màng phụ gia Hình 19a: Sữa dừa sau khi phối trộn phụ gia (x 400) Hạt béo chưa được bao xung quanh 1 lớp màng phụ gia Hình 19b: Sữa dừa sau khi phối trộn phụ gia (x 400) Hình 20 a: Sữa dừa sau khi đồng hĩa áp lực cao 200bar (x 400) Hình 20 b: Sữa dừa sau khi đồng hĩa áp lực cao 200bar (x 400) Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng phụ gia đến sự ổn định của hệ nhũ tương Trong thí nghiệm này, chúng tơi cố định tổng hàm lượng Tween 80 và CMC là 0,6% (Hàm lượng này nằm trong giới hạn cho phép của Bộ Y tế). Chúng tơi thực hiện thí nghiệm với 7 mẫu sữa dừa, tỷ lệ khối lượng hai phụ gia Tween 80/ CMC lần lượt là: 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 2/1; 3/1; 4/1 Chúng tơi cố định các thơng số cịn lại như sau: Hàm lượng các chất phụ gia khác ( tính theo % khối lượng nguyên liệu): Xanthan gum : 0,3% BHT : 0,025% Áp lực đồng hĩa 200 bar Chế độ tiệt trùng: 1200C – 30 phút Tất cả các mẫu thí nghiệm trên đều được thực hiện với 3 lần lặp lại để cĩ thể kiểm định thống kê Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 12, hình 21: Bảng 12: Ảnh hưởng của hàm lượng phụ gia đến sự ổn định của hệ nhũ Tỷ lệ Tween 80/CMC Chỉ số Nizo Chỉ số Nizo trung bình 4/1 99.54 99.44 99.40 99.46a 3/1 99.43 99.50 99.41 99.45a 2/1 99.52 99.39 99.44 99.45a 1/1 99.45 99.42 99.40 99.42a 1/2 99.38 99.41 99.40 99.40a 1/3 99.38 99.40 99.39 99.39a 1/4 99.39 99.36 99.37 99.37a a: các giá trị cĩ cùng chữ viết phía trên thì khơng khác nhau cĩ nghĩa với p < 0,05 Hình 21: Chỉ số Nizo của mẫu sữa dừa ứng với các tỷ lệ Tween 80 và CMC khác nhau Kết quả kiểm nghiệm thống kê cho thấy khơng cĩ sự khác biệt giữa các kết quả thu được. Như chúng tơi đã trình bày ở trên, do độ nhớt của sữa dừa khá cao (các mẫu đều cĩ độ nhớt nằm trong khoảng từ 17500 đến 17680) nên giá trị lực ly tâm được quy định theo phương pháp Nizo khơng đủ lớn để phân tách phần béo cĩ trong mẫu sữa dừa trong quá trình ly tâm. Chỉ số Nizo cao cho phép khẳng định về độ bền của hệ nhũ tương của sản phẩm trong quá trình bảo quản. Sau khi tiệt trùng các mẫu vừa nêu trên và quan sát, chúng tơi nhận thấy rằng, ở các mẫu cĩ hàm lượng CMC cao (Tỉ lệ Tween 80/CMC là 1/3 và 1/4) thì cấu trúc của sản phẩm khơng tốt, sữa dừa sau tiệt trùng khơng cịn giữ cấu trúc paste, sệt như các mẫu khác mà lại cĩ cấu trúc dạng gel. Theo Kuhnhold (2004), CMC là chất tạo đặc nhưng với hàm lượng cao thì CMC cĩ khả năng tạo gel. Các mẫu cịn lại đều cĩ cấu trúc dạng paste sệt. Do vậy, chúng tơi loại bỏ mẫu cĩ hàm lượng CMC cao là hai mẫu cĩ tỷ lệ phụ gia Tween 80/CMC là 1/3 và 1/4. Xét về mặt giá thành thì Tween 80 mắc hơn nhiều so với CMC. Giá tham khảo do cơng ty trách nhiệm hữu hạn Trường Phát cung cấp là Tween 80: 650.000đ/kg; CMC: 40.000đ/kg (hố chất cơng nghiệp). Nếu tính trên 1 kg sản phẩm, với các tỷ lệ hai phụ gia được khảo sát như trên, chi phí của hai phụ gia sử dụng sẽ như sau: Bảng 13: Chi phí của hai phụ gia Tween 80 và CMC (tính cho 1 kg sản phẩm) Tỷ lệ Tween 80/CMC (w/w) Hàm lượng Tween 80 (g) trong 1kg sản phẩm Hàm lượng CMC (g) trong 1 kg sản phẩm Thành tiền (Đồng) 1/1 3 3 2070 2/1 4 2 2680 3/1 4.5 1.5 2985 4/1 4.8 1.2 3168 1/2 2 4 1460 1/3 1.5 4.5 1155 1/4 1.2 4.8 972 Dựa vào các kết quả thu được ở trên, chúng ta cĩ thể thấy rằng đối với mẫu cĩ hàm lượng Tween 80 cao thì giá thành sẽ tăng lên đáng kể. Vì vậy, chúng tơi đề xuất chọn tỷ lệ giữa hai phụ gia Tween 80 và CMC là 1:2 (w/w) Sử dụng natri benzoate để ức chế hệ vi sinh vật trong sữa dừa: Theo Seow và Gwee (1997), sữa dừa tự nhiên bị hư hỏng nhanh chĩng do vi sinh vật, ngay cả khi được bảo quản ở nhiệt độ lạnh. Thời gian cần thiết cho sự nhân đơi một thế hệ vi khuẩn trong sữa dừa giảm từ 232 phút ở 100C cịn 44 phút ở 300C (Fernandez, 1970). Sữa dừa là một mơi trường giàu chất dinh dưỡng cho các vi sinh vật phát triển. Thơng thường, các vi sinh vật nhiễm từ nguyên liệu, từ dụng cụ chứa thiết bị chế biến hay từ mơi trường sản xuất. Những loại vi khuẩn thường gặp bao gồm các giống như Bacillus, Achromobacter, Microbacterium, Micrococcus, Brevibacterium, Penicillium, Geotricum, Mucor, Fusarium, Saccharomyces spp. Sữa dừa nếu thanh trùng ở nhiệt độ 720C – 20 phút chỉ cĩ thể bảo quản được trong vịng 5 ngày ở nhiệt độ 40C, cịn với sữa dừa đĩng lon và tiệt trùng ở 1210C, chúng ta cĩ thể bảo quản sản phẩm ở điều kiện thường trong thời gian lâu hơn. Theo tiêu chuẩn Codex về sữa dừa (Codex stan 240), để tăng cường thời gian bảo quản sản phẩm, chúng ta cĩ thể cho chất chống vi sinh vật là natri benzoat với hàm lượng tối đa là 0,1%. Trên cơ sở đĩ, chúng tơi lần lượt tiến hành thí nghiệm với 3 mẫu sữa dừa, thay đổi hàm lượng phụ gia chống vi sinh vật natri benzoat là 0%, 0,05% và 0,1%. Mẫu sữa dừa được đựng trong bao bì kim loại với dung tích là 150ml. Chúng tơi cố định các thơng số cịn lại như sau: Hàm lượng các chất phụ gia khác( tính theo % khối lượng nguyên liệu): CMC : 0,4% Tween 80 : 0,2% Xanthan gum : 0,3% BHT : 0,025% Natri metabisulphite : 0,005% Áp lực đồng hĩa 200 bar Chế độ tiệt trùng: 1200C – 30 phút Tất cả các mẫu thí nghiệm trên đều được thực hiện với 3 lần lặp lại để cĩ thể kiểm định thống kê. Sau khi tiệt trùng, các mẫu sản phẩm được làm hư gia tốc bằng cách ủ trong điều kiện nhiệt độ 370C và độ ẩm khơng khí 99%. Kết quả kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí được trình bày trong bảng 14 và hình 22. Bảng 14: Tổng số vi khuẩn hiếu khí của các mẫu sừa dừa sau 7, 14, 21 và 28 ngày làm hư gia tốc. Thời gian làm hư gia tốc Hàm lượng Natri benzoat (%) TPC (cfu/ml) TPC trung bình (cfu/ml) 7 ngày 0 0.05 0.1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1a < 1a <1a 14 ngày 0 0.05 0.1 2.1x102 2.0x102 2.0x102 1.4x102 1.6x102 1.4x102 1.0x102 1.1x102 1.1x102 2.0x102 b 1.5x102 c 1.1x102 d 21 ngày 0 0.05 0.1 8.6x103 8.5x103 8.6x103 5.0x103 5.0x103 5.1x103 2.3x103 2.3x103 2.3x103 8.6x103 e 5.0x103 f 2.3x103 g a, b, c, d, e, f, g: các giá trị cĩ cùng chữ viết phía trên thì khơng khác nhau cĩ ý nghĩa với p < 0,05. Hình 22: Ảnh hưởng lượng natri benzoat đến tổng số vi khuẩn hiếu khí trong các mẫu sừa dừa sau 7, 14 và 21 ngày làm hư gia tốc. Theo Ngơ Minh Hiếu (2007), tổng số vi khuẩn hiếu khí của mẫu sữa dừa được tiệt trùng ở 1200C – 30 phút, khơng bổ sung Natri Benzoat sau 21 ngày làm hư gia tốc là 8,8x103 cfu/ml. Kết quả chúng tơi thu được đối với mẫu sữa dừa khơng bổ sung Natri benzoat sau 21 ngày làm hư gia tốc là 8.6x103cfu/ml, tương tự như kết quả của nghiên cứu trên. Kết quả kiểm tra vi sinh cho thấy sau 14 ngày làm hư gia tốc, cĩ sự khác biệt về tổng số vi khuẩn hiếu khí trong các mẫu sữa dừa. Theo tiêu chuẩn vi sinh về sữa dừa của APCC (Asian and Pacific Coconut Community), tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1 ml sữa dừa là 5x104 cfu. Bảng 17 cho thấy tổng số vi khuẩn hiếu khí của cả 3 mẫu sữa dừa sau 21 ngày làm hư gia tốc đều đạt yêu cầu. Về mặt cảm quan, các mẫu đều cĩ màu trắng, khơng cĩ hiện tượng nổi bọt và khơng cĩ mùi ơi, mùi lạ. Tuy nhiên, việc bổ sung natri benzoat đã làm giảm tổng số vi khuẩn hiếu khí xuất hiện trong các mẫu. Lượng natri benzoat bổ sung càng nhiều thì tổng số vi khuẩn hiếu khí xuất hiện trong sữa dừa sau 21 ngày làm hư gia tốc sẽ càng ít. Nếu sau 3 tuần làm hư gia tốc, sản phẩm cĩ hàm lượng vi sinh vật vẫn nằm trong giới hạn cho phép, chúng tơi cĩ thể kết luận là thời gian bảo quản sản phẩm ở điều kiện thược sẽ khơng thấp hơn 6 tháng Chúng tơi đề xuất chọn hàm lượng chất chống vi sinh vật natri benzoat sử dụng cho sữa dừa là 0,05%. Xác định hiệu suất thu hồi của quy trình và các chỉ tiêu hố lý và vi sinh của sữa dừa: Chúng tơi thực hiện tồn bộ quy trình như hình 2 và xác định hiệu suất thu hồi sản phẩm của quy trình sản xuất sau khi tiến hành xác định hàm lượng bán thành phẩm, hàm lượng chất khơ và hàm lượng béo sau từng quá trình trong quy trình. Thí nghiệm được thực hiện 3 lần. Kết quả chúng tơi thu được như sau Bảng 15: Lượng bán thành phẩm, chất béo và chất khơ sau mỗi quá trình trong quy trình sản xuất: Quá trình Khối lượng (g) Hàm lượng chất khơ (g) Hàm lượng béo (g) Nguyên liệu cơm dừa 1000 474,3 266 Nước 1000 0 0 Trích ly 1235,5 290,3 222,4 Ly tâm 420 270,0 218,4 Phối trộn phụ gia 424 275,3 218,0 Đồng hĩa áp lực cao 415,5 269,7 213,6 Sản phẩm 415,5 269,7 213,6 Từ bảng 15, chúng tơi tính hiệu suất thu hồi béo của tồn bộ quy trình bằng cách lấy tỷ số giữa hàm lượng béo trong sản phẩm so với hàm lượng béo trong nguyên liệu ban đầu, kết quả thu được hiệu suất thu hồi béolà: 80,3% (so với tổng chất béo cĩ trong nguyên liệu). Trong quy trình sản xuất, hàm lượng béo bị hao hụt chủ yếu là do quá trình trích ly và ép. Hiệu suất thu hồi chất khơ của tồn bộ quy trình đạt 56,86% (tỷ số giữa hàm lượng chất khơ cĩ trong sản phẩm so với hàm lượng chất khơ cĩ trong nguyên liệu). Tổn thất chất khơ chủ yếu xảy ra trong quá trình ly tâm để tăng hàm lượng béo trong sữa dừa. Tuy nhiên, nếu tính theo lượng chất khơ hịa tan sau khi đã ép lấy sữa dừa thì hiệu suất trích ly đạt tương đối cao: 93% (tỷ số giữa hàm lượng chất khơ trong sản phẩm so với hàm lượng chất khơ trong sữa dừa sau khi trích ly). Hao hụt qua từng quá trình trong quy trình sản xuất sữa dừa được trình bày trong hình 23. Như vậy từ 1 tấn cơm dừa cĩ độ ẩm 52.57%, hàm lượng béo 26,6% sẽ cho chúng ta 415,5 kg sản phẩm sữa dừa với hàm lượng béo đạt 52%, độ ẩm 35,1%. Các chỉ tiêu khác được trình bày ở phần sau đây. Nước (1m3) Cơm dừa (1 tấn) Bã Trích ly, ép Tổn thất chất khơ: 38.8% Tổn thất chất béo: 16.4% Ly tâm Tổn thất 66% khối lượng Phối trộn phụ gia Tăng 0.95% khối lượng Đồng hố Tổn thất 2% khối lượng Tiệt trùng Tổn thất 0% khối lượng Sản phẩm Hình 23: Hao hụt thơng qua các quá trình của quy trình sản xuất Chỉ tiêu vi sinh Bảng 16: Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh của mẫu sữa dừa Tên chỉ tiêu Quy định của APCC Kết quả kiểm tra Tổng vi khuẩn hiếu khí 5x104 cfu/ml Khơng phát hiện E. coli Khơng phát hiện trong 1ml mẫu Khơng phát hiện trong 1ml mẫu Vibrio cholerae Khơng phát hiện trên 25g mẫu Khơng phát hiện trên 25g mẫu Salmonella Khơng phát hiện trên 25g mẫu Khơng phát hiện trên 25g mẫu Listeria monocytogens Khơng phát hiện trên 25g mẫu Khơng phát hiện trên 25g mẫu Enteroccoci 10 cfu trên 1g mẫu Khơng phát hiện trên 1g mẫu Chỉ tiêu hĩa lý Bảng 17: Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu hĩa lý của mẫu sữa dừa Tên chỉ tiêu Quy định của TCVN và Tiêu chuẩn CODEX Stand A-2-1973 Kết quả kiểm tra Hàm lượng béo > 50% 58% Carbohydrate > 5% 19% Cu < 0,05 mg/kg Khơng phát hiện As < 0,5 mg/l Khơng phát hiện Cd < 1 mg/l Khơng phát hiện Hg < 0,05 mg/l Khơng phát hiện Như vậy, kết quả kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh mẫu sữa dừa của chúng tơi cũng phù hợp với các quy định đã được đặt ra. CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ các kết quả nghiên cứu được ở trên, chúng tơi đề xuất một số thơng số kỹ thuật sử dụng cho quy trình sản xuất sữa dừa cĩ hàm lượng béo cao như sau: * Hàm lượng phụ gia (tính theo % khối lượng nguyên liệu) Xanhthan gum : 0,3% CMC : 0,4% Tween 80 : 0,2% BHT : 0,025% Natri metabisulphite : 0,005% Natri benzoat : 0,05% * Áp suất đồng hĩa: 200 bar * Chế độ tiệt trùng: 1200C – 30 phút 5.2. KIẾN NGHỊ Do thời gian thực hiện luận văn cĩ hạn nên nội dung nghiên cứu trong luận văn này chưa thật phong phú. Chúng tơi xin đề nghị các hướng nghiên cứu tiếp theo của đề tài này gồm các nội dung sau Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đồng hĩa đến độ bền hệ nhũ tương trong sản phẩm. Tối ưu hĩa các thơng số của quá trình trong quy trình sản xuất bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế, Quy định danh mục các chất phụ gia được phép sử dụng trong thực phẩm, Hà Nội, 2001, 136 tr. Hồng Văn Đức, Cây dừa, NXB Nơng nghiệp Hà Nội, 1991 Vũ Chí Hải, Nghiên cứu sản xuất bột sữa dừa hịa tan, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Bách khoa TpHCM, 2006. Ngơ Minh Hiếu, Nghiên cứu sản xuất sữa dừa hàm lượng béo cao, Luận văn tốt nghiệp Đại học, Đại học Bách khoa TPHCM, 2007, 79 tr. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương, Thực tập vi sinh vật học thực phẩm, NXB Đại học Quốc gia TPHCM, 2006, 296 tr. Lê Văn Việt Mẫn, Cơng nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa và thức uống – Tập 1 – Cơng nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa, NXB Đại học Quốc gia TPHCM, 2004, 296 tr. Tơn Nữ Minh Nguyệt, Bài giảng mơn học Hĩa học thực phẩm, Đại học Bách khoa TPHCM, 2004 Nguyễn Văn Tuấn, Phân tích số liệu bằng R - Bài giảng mơn Tin học trong hĩa học Thực phẩm, 2004. Huỳnh Trung Việt, Nghiên cứu sản xuất sữa dừa hàm lượng béo cao, Luận văn tốt nghiệp Đại học, Đại hoc Bách khoa TPHCM, 2006, 72 tr. AOAC (Association of Official Analytical Chemists), Official methods of analysis of AOAC (16th edition), 1996. Bergenstahl, B. A., & Claesson, P. M, Surface forces in emulsions. In K. Larsson & S. E. Friberg (Eds.), Food emulsions (pp. 41–96). New York: Marcel Dekker Inc, 1990. Branen, A.Larry và cộng sự, Food additives, Marcel Dekker Inc., New York and Basel, 2001, 375p Bylund, G., Dairy processing handbook, Tetra-Pak processing systems AB publisher, Lund, 1995, 436p Chiewchan, N. và cộng sự, Effect of homogenizing pressure and sterilizing condition on quality of canned high fat coconut milk, journal of Food Engineering, vol 73, issue 1, 2006, p. 38 – 44. Codex Stand 240, Codex Standard for aqueous coconut products – coconut milk and coconut cream, 2003, 4p Codex Stand A-2-1973, Codex Standard for milk fat products, 2006, 3p Davis, H.T, Factors determining emulsion type: Hydrophile-lipophile balance and beyond. Colloids and surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 91, 1994, p 9- 24. Fernandez, W.L., và cộng sự, Bihourly bacterial plate count of gata (coconut milk) stored for 24h at 300, 200 and 100, Philippine Agriculturist, vol 54, p 202 - 209. Floury, J. và cộng sự, Effect of high – pressure homogenization on droplet size distributions and rheological properties of model oil-in-water emulsions, Innovative Food Science & Emerging Technology 1, 2000, p. 127 – 134. Friberg, S., Larsson, K., Sjoblom, J., Food emulsions, 4th edition. Marcel Dekker, New York, 2000, 624p. Gwee, C.N., New technologies open the passage into new usage of coconut milk products, Food Science and Technology in Industrial Development, vol 1, 1988, p 157 - 162. Hasenhuettl, G.L., Hartel, R.W, Food emusifiers and their Application, Chapman and Hall, New York, 1997, 302p. Jena, S., Modeling of partical size distribution of sonicated coconut milk emulsion: Effect of emulsifiers and sonocation time, Food Research International, Vol 39, 2006, p 606 – 611. Jonsson, B. và cộng sự, Surfactants and Polymers in Aqueous Solution, 2nd, John Wiley & Sons, Chichester, 1998. Kühnhold, V., Development of an in vivo bioassay to identify sugar beet resistance to the stem nematode Ditylenchus dipsaci, Brill Academic Publishers, Vol 8, 2006, p 641 -645. McClements, D.J, Modulation of globular protein functionality by weakly interacting cosolvents, Critical reviews in Food Science, Vol 42, issue 5, 2002, p. 417-471 McKenna, B.M., Texture in food, Vol 1: Semi – Solid Foods. CRC Press, Boca Raton, 2003, 448p Peamprasart, T., Chiewchan, N., Effect of fat content and preheat treatment on the apparent viscosity of coconut milk after homogenization, Journal of Food Engineering, vol 77, issue 3, 2006, p 653 – 658. Philips, G.O, Handbook of hydrocolloid, CRC Press, Cambridge, England, 2000, 450p Pichivittayakarn, W. và cộng sự, Effects og fluid flowrate on coconut milk fouling at pasteurization temperature (700C – 74,50C), Songklanakarin J. Sci. Techol., Vol 28, issue 6, 2006, p.1275 – 1288. Simuang, J., và cộng sự, Effect of heat treatment and fat content on flow properties of coconut milk, Journal Food Enginerr, vol 64, 2004, p 193 – 197. Seow, C.C., Gwee, C.N., Review: Coconut milk: chemistry and technology, International Journal of Foof Science and Technology, Vol 32, 1997, p. 189 – 201. Srinivasan, M. và cộng sự, The effect of sodium chloride on the formation and stability of sodium caseinate emulsion, Food Hydrocolloids, Vol 14, 2000, p 498-507 Stauffer, C.E, Emusifiers, Eagen Press Handbook, St. Paul, MN, 1999, 102p Vitali, A.A, và cộng sự, Rheological behavior of coconut milk, Journal Food Engineer, Proc. App., vol 1, 1985, p33-38 Waisundara, V.I, Effect of pre - treatments of fresh coconut kernels on some of the quality attributes of coconut extracted, Food Chemistry, vol 101, 2007, p771 – 777. Xu, W. và cộng sự, Fat particle structure and stability of food emulsions, Journal of Food Science, vol 63, issue 2, p183-188 www.wikipedia.com PHỤ LỤC Các phương pháp phân tích Phương pháp xác định hàm lượng chất béo Adam – Rose – Gottlieb Nguyên tắc Trích ly lipid trong mẫu phân tích bằng diethyl ether và petroleum ether trong mơi trường NH3 và cồn. Làm bay hơi hết ether, cần lipid và từ đĩ xác định hàm lượng lipid trong sản xuất. Dụng cụ và thiết bị Dụng cụ: Ống ly tâm 50ml, đĩa petri, pipette 10 ml. Thiết bị: cân phân tích chính xác 0,0001g; tủ sấy; máy ly tâm lắng. Hố chất Dung dịch cồn – NH3, với thành phần như sau: Cồn ethylic 900 : 208,5 ml NH3 đậm đặc : 7,5 ml Nước cất : 250 ml Diethyl ether, nhiệt độ sơi 34 – 350C, khơng chứa peroxide. Petroleum ether, nhiệt độ sơi 30 – 600C. Các hố chất sử dụng phải khơng để lại vết sau khi bay hơi Tiến hành thí nghiệm Cho vào ống ly tâm các thành phần sau: Mẫu sữa dừa : 10 g Dung dịch cồn – NH3 : 10 ml Diethyl ether : 11 ml Petroleum ether : 10 ml Lắc đều hỗn hợp trên rồi đem ly tâm 5500 rpm – 15 phút. Hỗn hợp sau khi ly tâm sẽ chia làm hai lớp. Tách lấy lớp ether bên trên cho vào đĩa petri đã sấy khơ và biết trước khối lượng. Tráng lại ống ly tâm bằng petroleum ether. Để đĩa petri bốc hơi hết ether ở nhiệt độ thường rồi cho vào tủ sấy 1050C. Sấy đĩa petri cho đến khối lượng khơng đổi và đem cân. Tính kết quả Hàm lượng béo tổng trong mẫu sữa dừa X (%) được xác định theo cơng thức sau: Trong đĩ: M1: Khối lượng đĩa petri (g) M2: Khối lượng đĩa petri và mẫu sau khi trích ly lipid và sấy khơ (g) M: Khối lượng mẫu đem phân tích (g) (M= 10g) Phương pháp xác định chỉ số Nizo Nguyên tắc Chỉ số Nizo là một chỉ số dùng để xác định hiệu quả của quá trình đồng hố. Nguyên tắc của phương pháp là xác định tốc độ phân lớp hai pha dầu và nước trong hệ nhũ tương bằng cách sử dụng lực ly tâm. Xác định lượng chất béo cĩ trong 25ml mẫu đem phân tích và 20 ml mẫu ở phần đáy của mẫu sau khi đam ly tâm. Từ đĩ ta xác định được chỉ số Nizo. Chỉ số Nizo càng cao thì hệ nhũ tương càng ổn định và ngược lại. Thiết bị, dụng cụ Máy ly tâm xác định chỉ số Nizo: tốc độ quay là 1000 rpm, bán kính trục là 250mm Ống ly tâm Cách tiến hành: Lấy 25 ml mẫu sữa dừa đem ly tâm với tốc độ 1000 rpm trong thời gian 30 phút ở 400C. Tách 20 ml mẫu thu được ở phần đáy ống ly tâm để xác định hàm lượng béo theo phương pháp 3.3.2.1 Tính kết quả Chỉ số Nizo được tính theo cơng thức sau: Trong đĩ X1: hàm lượng chất béo trong 20 ml ở đáy ống sau khi ly tâm (%) X2: hàm lượng chất béo trong 25 ml mẫu ban đầu (%) Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí Nguyên tắc: Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa, đếm khuẩn lạc trên mơi trường thạch sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 30 ± 10C trong thời gian từ 48 – 72 giờ. Số lượng vi khuẩn hiếu khí trong 1g hay 1 ml mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính từ số khuẩn lạc đếm được từ các hộp nuơi cấy theo các độ đậm pha lỗng. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu Mẫu cần được lấy đặc trưng. Lượng mẫu tối thiểu dùng để pha lỗng khơng ít hơn 1 ml đối với sản phẩm lỏng và 10 ± 0,1 g đối với các sản phẩm khác. Thiết bị và dụng cụ Hộp petri đường kính 90 – 100 mm; micropipette; becher 500 ml, erlen 250 ml, ống nghiệm Nồi cách thuỷ điều nhiệt, nồi hấp autoclave, tủ sấy, tủ ấm, máy pH kế. Hố chất và mơi trường Sử dụng mơi trường thạch trypton glucose cĩ các thành phần như sau Trypton : 5g Cao men : 2,5g Glucose : 1g Thạch : 15 – 20g Nước cất : 1000 ml Cách pha chế mơi trường: đun nhỏ lửa, khuấy đều để hồ tan các chất đến khi sơi. Để nguội mơi trường đến 55 ± 50C, điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt trùng pH = 7,0 ± 0,2. Rĩt vào các erlen lượng mơi trường khơng quá ½ dung tích bình. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 1210C – 15 phút. Nếu mơi trường sử dụng ngay thì để nguội đến 45 ± 10C ở nồi cách thuỷ. Nếu chưa sử dụng thì cần bảo quản ở nơi khơ ráo, trong bĩng tối với nhiệt độ từ 0 – 50C khơng quá 3 ngày. Trước khi nuơi cấy đun cách thủy cho mơi trường nĩng chảy và để nguội đến 45 ± 10C. Các bước nuơi cấy Pha lỗng mẫu:Tiến hành pha lỗng mẫu cho đến khi cĩ được độ đậm pha lỗng cần thiết đủ đếm được số khuẩn lạc trên hộp theo dự tính. Đổ hộp Đối với mẫu kiểm nghiệm phải nuơi cấy ít nhất ba độ đậm, mỗi độ đậm dùng 3 hộp petri. Lấy 1ml sản phẩm lỏng hoặc dung dịch pha lỗng ở những độ đậm khác nhau cho vào giữa từng hộp petri. Rĩt vào mỗi hộp 12 – 15 ml mơi trường thạch trypton glucose, trộn đảo đều dung dịch mẫu và mơi trường. Để các hộp thạch đơng tự nhiên trên bề mặt ngang. Ủ ấm: Khi thạch đã đơng, lật sấp các hộp petri và để vào tủ ấm ở nhiệt độ 30 ± 10C từ 48 – 72 giờ. Sau 48 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các hộp đã nuơi cấy. Sau 72 giờ, tính kết quả chính thức. Tính kết quả Chọn tất cả các hộp petri cĩ từ 25 đến 250 khuẩn lạc để tính kết quả. Số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri cĩ độ pha lỗng khác nhau cần thiết phải tuân thủ theo một quy luật hợp lý: độ pha lỗng càng cao thì số khuẩn lạc đếm được trên hộp petri phải càng ít. Nếu kết quả khơng hợp lý, cần thực hiện lại các thí nghiệm. Tính N khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí cho 1 g hoặc 1 ml sản phẩm như sau: Trường hợp 1: chỉ cĩ 1 hộp petri cĩ số khuẩn lạc dao động trong khoảng 25 -250. Tất các các hộp cịn lại cĩ số khuẩn lạc nằm ngồi khoảng trên. Khi đĩ, ta chọn hệ số pha lỗng tương ứng với hộp petri cĩ số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 – 250 để tính kết quả. Cơng thức tính: Trong đĩ: C1, C2: số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp petri ở độ pha lỗng đã chọn d: hệ số pha lỗng mẫu Trường hợp 2: chỉ cĩ 1 độ pha lỗng với 2 hộp petri cĩ số khuẩn lạc dao động từ 25 – 250. Tất cả các hộp petri ở các độ pha lỗng khác đều cĩ số khuẩn lạc nằm ngồi khoảng trên. Khi đĩ ta sẽ chọn độ pha lỗng nĩi trên để tính kết quả Cơng thức tính: Trong đĩ: C1, C2: số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp petri ở độ pha lỗng đã chọn d: hệ số pha lỗng mẫu Trường hợp 3: Ở hai độ pha lỗng liên tiếp, các hộp petri cĩ số khuẩn lạc dao động từ 25 đến 250. Khi đĩ ta phải tính kết quả cho từng độ pha lỗng Cơng thức tính: Trong đĩ: C: số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn n1, n2: số hộp petri ở hai độ pha lỗng liên tiếp đã chọn thứ nhất và thứ hai d: hệ số pha lỗng của độ pha lỗng thứ nhất Trường hợp 4: Tất cả các hộp petri đều cĩ số khuẩn lạc nhỏ hơn 25. Khi đĩ, ta sẽ chọn độ pha lỗng thấp nhất để tính kết quả. Trường hợp 5: Tất cả các hộp petri đều cĩ số khuẩn lạc lớn hơn 250. Khi đĩ ta sẽ chọn hệ số pha lỗng cao nhất để tính kết quả. Trường hợp 6: khơng cĩ khuẩn lạc nào mọc trên tất cả các hộp petri. Khi đĩ, ta sẽ ghi kết quả là ít hơn (1 x 1/d) khuẩn lạc. Chú ý: Tất cả các kết quả đều được làm trịn, chỉ giữ lại hai số cĩ ý nghĩa và biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 x 10n.