Đề tài Nghiên cứu quá trình lên men lactic từ mật rỉ đường

1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, nƣớc ta có nhiều nhà máy đƣờng tạo ra một sản lƣợng lớn về đƣờng kết tinh. Bên cạnh đó một lƣợng không nhỏ mật rỉ đƣờng mà các nhà máy này thải ra làm ô nhiễm môi trƣờng. Với những ứng dụng Công nghệ Sinh học đã sử dụng những phế liệu mật rỉ để lên men tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị nhƣ L-lysine, acid citric, acid glutamic.v.v. và đặc biệt là acid lactic đƣợc quan tâm nhiều trong những năm gần đây. Nhu cầu cung cấp acid lactic ngày càng nhiều, bởi vì chúng đƣợc ứng dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực nhƣ bảo quản và chế biến thực phẩm, trong y học, môi trƣờng (acid polylactic thay thế các loại sản phẩm nhựa PE, PP, đĩa CD, bịch nilon), mỹ phẩm.v.v. Tổng thị trƣờng thế giới về acid lactic 86.000 tấn vào năm 2001, 500.000 tấn vào năm 2010. Ở Việt Nam: vào năm 2006, đại diện công ti dƣợc IIdong (Hàn Quốc) xuất khẩu một số lƣợng lớn chế phẩm acid lactic sang hãng MERAP phân phối dƣợc ở Việt Nam với giá trị hợp đồng 3,7 triệu USD [38], [39], [40]. Xuất phát từ tình hình thực tế trên, đƣợc sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ Sinh học trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM. Dƣới sự hƣớng dẫn của Thầy Nguyễn Đức Lƣợng trƣờng Đại học Bách Khoa và Thầy Phan Vĩnh Hƣng Trƣờng Cao đẳng Công nghiệp Thực Phẩm TP.HCM. Chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu quá trình lên men lactic từ mật rỉ đường”. 1.2. Mục đích của đề tài Chọn vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic nhiều nhất để sản xuất acid lactic. 1.3. Yêu cầu - Phân lập vi khuẩn lactic - Tuyển chọn các khuẩn lạc có khả năng lên men lactic - Khảo sát các điều kiện tối ƣu cho quá trình lên men - So sánh sự tạo acid tổng của các khuẩn lạc - Sản xuất acid lactic từ mật rỉ 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về acid lactic Acid lactic, 2-hydroxypropionic acid (CH3CHOHCOOH) là acid tồn tại rộng rãi trong tự nhiên, đƣợc tìm thấy ở ngƣời, động vật, thực vật và vi sinh vật. Đƣợc phát hiện vào năm 1780 do nhà hóa học Thụy Điển Sheele ở trong sữa chua. Acid lactic đƣợc chấp nhận là sản phẩm của một quá trình lên men vào năm 1847 [2], [25], [32]. Trong cấu tạo phân tử của acid lactic có một carbon bất đối xứng nên chúng có hai đồng phân quang học: D - acid lactic và L - acid lactic. Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái. Do đó tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác nhau. Loại L - acid lactic ở dạng tinh thể. Chúng có khả năng tan trong nƣớc, tan trong cồn, tan trong eter, không tan trong CHCl3, nhiệt độ nóng chảy 28 o C [9]. L - acid lactic đƣợc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dƣợc phẩm. Hầu hết các sinh vật lên men lactic đồng hình đều tạo ra đƣợc các dạng đồng phân quang học [32]. Loại D - acid lactic là dạng tinh thể, tan trong nƣớc tan trong cồn. Nhiệt độ nóng chảy 28o C. Nếu D - acid lactic và L - acid lactic có trong một hỗn hợp theo tỉ lệ 50/50 ngƣời ta gọi là hỗn hợp Raxemic. Trong quá trình lên men không khi nào có một hỗn hợp có tỉ lệ lý tƣởng này mà chỉ có đƣợc hỗn hợp này khi tiến hành tổng hợp hữu cơ. DL - acid lactic có khả năng tan trong nƣớc, trong cồn, không tan trong CHCl3 [9]. 2.2. Vi sinh vật trong lên men lactic Vi khuẩn lactic có thể đƣợc phân lập từ các cây trồng trên thế giới bao gồm hạt trái cây và rau [24]. Các loài Lactobacillus còn tìm thấy ở dạ dày, ruột non, ruột già và âm đạo [21]. 3 Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dƣơng, không sinh bào tử, tỉ lệ G+C thấp, cầu khuẩn hay hình que. Chúng sản xuất ra acid lactic nhƣ là sản phẩm lên men chính. Chúng không có enzyme catalase mặc dù catalase giả có thể đƣợc tìm thấy trong những trƣờng hợp rất hiếm vì vậy không phân giải oxi già. Các thành viên của nhóm này thiếu cytochrome. Tất cả các vi khuẩn lactic phát triển trong điều kiện kị khí. Tuy nhiên, không giống nhƣ những vi khuẩn kị khí, hầu hết các vi khuẩn acid lactic không nhạy cảm với oxi và cũng có thể phát triển tốt trong điều kiện có mặt oxi cũng nhƣ không có mặt oxi. Vì thế chúng là vi khuẩn kị khí tùy ý (Madigan et al. 2000) [30]. Sự phân chia vi khuẩn lactic dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của carbohydrate, các loài Lactobacillus có thể phân chia thành 3 nhóm [23], [19]. - Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc có fructose-1,6-diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhƣng không có phosphoketolase. Chúng lên men đƣợc hexose để tạo acid lactic nhƣng không lên men đƣợc pentose.) - Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý (có FDP aldolase và cảm ứng phosphoketolase. Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose đƣợc chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acid acetic). - Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc (Có phosphoketolase nhƣng không có FDP aldolase, quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình). 4 Bảng 2.1. Phân loại Lactobacillus (Sharpe, 1981; Kandler và Weiss, 1986) Đặc đểm Nhóm I Nhóm II Nhóm III Lên men pentose Tạo CO2 từ glucose Tạo CO2 từ gluconate Sự hiện diện FDP aldolase Sự hiện diện phosphoketolase - - - + - + - + a + + b + + + a - + Một vài đại diện L. acidophilus L. delbrueckii L. helveticus L. salivarius L. casei L. curvatus L. plantarum L. sake L. brevis L. buchneri L. fermentum L. reuteri a: Khi lên men b: Cảm ứng khi có pentose Một đặc điểm quan trọng dùng để phân biệt các giống vi khuẩn acid lactic là sự lên men glucose dƣới các điều kiện chuẩn nhƣ: nồng độ glucose và các yếu tố tăng trƣởng (các tiền chất acid amin, vitamin và acid nucleic) thì không giới hạn và giới hạn sử dụng oxi. Dƣới những điều kiện này, vi khuẩn acid lactic có thể phân thành hai nhóm: lên men lactic đồng hình thì chuyển hầu hết lƣợng glucose để tạo thành acid lactic và lên men lactic dị hình thì glucose lên men tạo thành acid lactic, ethanol, acid acetic và CO2. Thật ra việc kiểm tra sản phẩm khí từ glucose sẽ phân biệt đƣợc giữa hai nhóm này (Sharpe, 1979). 2.2.1. Vi khuẩn lactic dị hình Khi tiến hành lên men các dung dịch đƣờng, các vi khuẩn lactic dị hình thƣờng tạo ra lƣợng acid lactic không lớn lắm. Ngoài acid lactic chúng còn tạo ra hàng loạt các sản phẩm khác nhƣ acid acetic, ethanol, CO2 [3], [9]. Một số loài vi khuẩn lactic dị hình đƣợc nghiên cứu nhƣ sau: - Lactobacillus pasteurianus Trực khuẩn, gram dƣơng, kích thƣớc rộng 0,5 – 1 μm; dài 7,0 – 35 μm. Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẽ, không di động. Có khả năng lên men đƣợc, glucose, fructose, galactose, maltose, saccharose, mannitol, dextrin. Trong quá trình lên men 5 tạo một số sản phẩm nhƣ CO2, alcohol, acid lactic, acid acetic. Nhiệt độ thích hợp 29 - 33 o C, pH thích hợp 8 [9]. - Lactobacillus brevis Thuộc trực khuẩn, gram dƣơng, không có khả năng di động, kích thƣớc rộng 0,7 - 1,0 μm, dài 2,0 - 4,0 μm. Trong thiên nhiên chúng liên kết với nhau thành chuỗi. Trong quá trình phát triển, chúng có thể sử dụng lactat canxi nhƣ nguồn cung cấp cacbon. Chúng có khả năng lên men các loại đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose, maltose. Chúng hiếm khi lên men mannitol, glycerol, dextrin, và tinh bột. Chúng không hóa lỏng gelatin [18]. - Lactobacillus lycopessici Trực khuẩn, gram dƣơng, trong thiên nhiên chúng tồn tại từng đôi một, có khả năng tạo bào tử. Trong quá trình lên men đƣờng, chúng tạo ra cồn, acid lactic, acid acetic và CO2 . - Streptococcus cumoris Thuộc loài cầu khuẩn, trong thiên nhiên chúng tồn tại thành từng chuỗi rất dài. Thuộc gram dƣơng, nhiệt độ thích hợp phát triển là 30o C, không phát triển ở nồng độ NaCl 4 %. Khi lên men đƣờng tạo ra acid acetic, diacetyl, CO2. Chúng có khả năng tạo ra những chất kháng khuẩn . - Streptolacticus lactic Thuộc chồi cầu khuẩn, gram dƣơng, nhiệt độ phát triển từ 10 – 45o C, có khả năng chịu đƣợc nồng độ NaCl 4 %. Khi lên men đƣờng glucose, maltose, lactose, xylose, saccharose, mannitol, tạo ra acid lactic, acid acetic, diacetyl, CO2. Chúng không có khả năng lên men đƣợc glycerol, sorbitol . - Streptococcus faecalis Chúng tạo thành chuỗi tế bào hình cầu, gram dƣơng. Nhiệt độ tối ƣu 37o C, nhiệt độ sinh trƣởng 10 - 45o C, có thể phát triển duới hoặc 5o C, hiếm khi phát triển ở 50o C. Có khả năng sống sót ở 62,8o C trong 30 phút. Phát triển ở pH 9,6. Chịu đƣợc nồng độ NaCl 2 %, 4 % và 6,5 %. Có khả năng lên men đƣờng glucose, maltose, lactose và luôn luôn lên men mannitol; có hoặc không thể lên men sucrose, glycerol, sorbitol [18]. 6 2.2.2. Vi khuẩn lactic đồng hình Khi tiến hành lên men các dung dịch đƣờng thì vi khuẩn lactic đồng hình thƣờng tạo ra acid lactic là chủ yếu [3], [9]. Một số loài vi khuẩn lactic điển hình đƣợc nghiên cứu kỹ nhƣ sau: - Lactobacillus acidophilus Lần đầu tiên đƣợc phân lập bởi Moro (1900) đƣợc phân lập từ phân của trẻ sơ sinh đã qua phẩu thuật và bê mới đẻ . Có dạng hình que, chịu nhiệt, quá trình lên men tạo ra 2,2 % acid lactic [4], [17]. Chúng có kích thƣớc rộng 0,6 - 0,9 μm, dài 1,5 - 6,0 μm. Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẽ. Đôi khi chúng tạo thành những chuỗi ngắn. Trên môi trƣờng gelatin: chúng không phát triển ở 20o C, không có khả năng hóa lỏng. Trên môi trƣờng khoai tây thì không phát triển. Chúng thuộc nhóm vi khuẩn gram dƣơng và không di động. Chúng có khả năng lên men đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose, maltose, lactose, để tạo acid lactic. Chúng không có khả năng lên men glycerol, mannitol, sorbitol. Không thể phát triển đƣợc trong môi trƣờng không có carbohydrate. Nhiệt độ tối ƣu 37o C. Nó phát triển từ 20 - 22o C. Nhiệt độ phát triển tối đa 43 - 48o C [18]. - Lactobacillus bulgaricus Chúng đƣợc tìm ra do Mesnhicov ở sữa chua Bungari [14]. Thuộc loại trực khuẩn có kích thƣớc rất dài, liên kết với nhau tạo thành chuỗi, gram dƣơng. Chúng không có khả năng di động, có khả năng lên men các loại đƣờng nhƣ glucose, lactose, galactose. Có thể hoặc không thể lên men fructose, maltose và sucrose. không lên men đƣợc xylose, mannitol, dextrin. Chúng không có khả năng tạo ra nitrit từ nitrate [9]. Quá trình lên men tạo 3,7 % acid lactic [14]. Trên môi trƣờng khoai tây, có khuẩn lạc trắng vàng [18]. pH thích hợp cho sự phát triển là pH = 5,2 - 5,6 [7]. Nhiệt độ tối ƣu 45 - 50 o C. Tối thiểu 22o C [20]. Trong sản xuất qui mô lớn, chúng thƣờng đƣợc chọn để lên men Whey để tạo acid lactic, sau đó dùng Ca(OH)2 để trung hòa lƣợng acid lactic tạo thành. Nhiệt độ lên men 43o C, với nhiệt độ này đủ để ức chế các vi sinh vật gây nhiễm mà không ức chế L. bulgaricus [22]. - Lactobacillus bifidus Trực khuẩn rất nhỏ, kích thƣớc trung bình khoảng 4 μm, không có khả năng di động, thuộc gram dƣơng. Chúng có thể đứng riêng lẽ, cặp và chuỗi ngắn. Có khả năng 7 lên men đƣợc các loại đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose, saccharose, dextrin, tinh bột và maltose [18]. - Lactobacillus casei Vi khuẩn đƣợc phân lập từ sữa, sản phẩm của sữa, ủ xylo- thức ăn xanh dùng trong chăn nuôi, vi khuẩn dạng hình que, kích thƣớc 0,7 - 1,1 μm; 2,0 - 4,0 μm, trực khuẩn nhỏ thƣờng gặp ở dạng chuỗi dài hay chuỗi ngắn [4]. Chúng thuộc gram dƣơng, không có khả năng lên men đƣợc các loại đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose, maltose, lactose và mannitol; có hoặc không thể lên men sucrose. Nhiệt độ phát triển tối ƣu là 30o C, thấp nhất 10o C. Tối đa 37 - 40o C và vài chủng có thể 45o C. Quá trình lên men tạo khoảng 1,5 % acid lactic [18]. - Lactobacillus causaciccus Trực khuẩn ngắn, không có khả năng di động, gram dƣơng. Chúng có khả năng lên men các loại đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose, maltose, lactose, mannitol. Nhiệt độ phát triển tối ƣu là 48 - 55o C [9]. - Lactobacillus delbrueckii Thƣờng gặp chúng trên hạt đại mạch [14]. Vi khuẩn chịu nhiệt, đƣợc tìm thấy ở các loài hạt ngũ cốc và tinh bột, đây là một giống vi khuẩn có khả năng đồng hóa đƣợc tinh bột. Trực khuẩn dài, kích thƣớc 0,5 - 0,8 μm; 2,0 - 9,0 μm, không di động, gram dƣơng. Quá trình lên men tạo 2,5 % acid lactic. Chúng có khả năng lên men đƣợc glucose, fructose, maltose, sucrose, galactose và dextrin. Chúng không có khả năng lên men xylose, lactose, tinh bột, mannitol. Nhiệt độ tối ƣu 45o C [9], [18]. -Lactobacillus leichmannii Trực khuẩn gram dƣơng. Kích thƣớc tế bào 0,6 – 2 μm. Vi khuẩn này có khả năng tạo thành chuỗi ngắn, không di động, gram dƣơng. Nhiệt độ tối ƣu 36o C. Tối đa 40 - 46 o C. Chúng không có khả năng tạo nitrit từ nitrate. Có khả năng lên men glucose, fructose, maltose, saccharose. Trong môi trƣờng khoai tây chúng tạo 1,3 % acid lactic [18]. - Lactobacillus helveticcus Thuộc trực khuẩn có kích thƣớc 0,7 - 0,9 μm; 2,0 - 6,0 μm. Trong thiên nhiên chúng có thể tồn tại riêng từng tế bào, cũng có thể tồn tại thành từng chuỗi tế bào. Nhiệt độ phát triển 40 - 42o C. Chúng có khả năng lên men đƣợc glucose, fructose, galactose, maltose và lactose [9]. 8 - Lactobacillus thermophillus Trực khuẩn, gram dƣơng, kích thƣớc tế bào 0,5 - 3,0 μm, không có khả năng di động. Lên men đƣợc glucose, lactose, sucrose, tinh bột và dạng glycerol. Không tạo acid từ mannitol. Lên men đƣợc fructose, galactose, maltose và dextrin. Không tạo nitrit từ nitrate. Nhiệt độ tối ƣu 50 - 62,8o C. Nhiệt độ tối thiểu 30o C, nhiệt độ tối đa 65 o C. Điểm nhiệt độ chết khoảng 71o C trong 30 phút [18]. - Lactobacillus plantanrum Trực khuẩn, gram dƣơng, kích thƣớc tế bào 0,7 - 1,0 μm; 3,0 - 8,0 μm. Nhiệt độ tối ƣu 30o C. Tối thiểu 10o C, tối đa 40o C. Điểm nhiệt độ chết từ 65 - 75o C trong 15 phút. Có khả năng chịu nồng độ NaCl 5,5 %. Chúng có khả năng lên men glucose, fructose, galactose, sucrose, maltose và lactose. Tinh bột thì không lên men. Không tạo đƣợc nitrit từ nitrate [18]. - Lactobacillus sporogenes Thuộc giống Lactobacillus dựa trên các đặc tính bởi Nakayama và Yanoshi (1967). Chúng thuộc Gram dƣơng, có khả năng sinh bào tử, có dạng hình que, kích thƣớc 3 – 5 μm, thuộc vi khuẩn hiếu khí, là vi khuẩn lactic đồng hình sản xuất ra axít lactic L(+) - (dextrorotraytory), phát triển ở nhiệt độ dao động từ 35 - 50o C, pH tối ƣu dao động từ 5,5 - 6,5, phản ứng với catalase dƣơng tính. Tạo acid từ glucose, galactose, fructose, maltose và sucrose. Không có thủy phân tinh bột hoặc casein, không hóa lỏng gelatin. phản ứng indol âm tính và không tạo khí [31]. 2.3. Cơ chế tạo ra acid lactic [20] Kluyver chia vi khuẩn lactic thành 2 nhóm dựa vào sản phẩm cuối của quá trình chuyển hóa glucose. Quá trình này tạo acid lactic là sản phẩm chính từ lên men glucose đƣợc gọi là lên men đồng hình. Số lƣợng acid lactic đồng hình thu đƣợc nhiều hơn lactic dị hình khoảng 2 lần. Vi khuẩn lactic dị hình lên men từ hexose tạo số lƣợng mole lactat, CO2 và ethanol bằng nhau. 9 Bảng 2.2 Vi khuẩn lên men lactic đồng hình và dị hình [20] Lên men đồng hình Lên men dị hình Sinh vật Dạng lactat % G+C Sinh vật Dạng lactat % G+C Lactobacillus Lactobacillus L. acidophilus DL 36,7 L. brevis DL 42,7 - 46,4 L. bulgaricus D(-) 50,3 L. buchneri DL 44,8 L. casei L(+) 46,4 L. cellobiosus DL 53 L. coryniformis DL 45 L. coprophilus DL 41,0 L. curvatus DL 43,9 L. fermentum DL 53,4 L. delbrueckii D(-) 50 L. hilgardii DL 40,3 L. helveticus DL 39,3 L. sanfrancisco DL 38,1 - 39,7 L. jugurti DL 36,5-39,0 L. trichoides DL 42,7 L. jensenii D(-) 36,1 L. fructivorans DL 38 - 41 L. lactis D(-) 50,3 L. pontis DL 53 - 56 L. leichmannii D(-) 50,8 Leuconostoc L. plantarum DL 45 L.cremoris D(-) 39 - 42 L. salivarius L(+) 34,7 L.dextranicum D(-) 38 - 39 Pediococcus L.lactis D(-) 43 - 44 P.acidilactici DL 44,0 L.mesenteroides D(-) 39 - 42 P.cerevisiae DL L.gelidum D(-) 37 P.pentosaceus DL 38 L.carnosum D(-) 39 Streptococcus Carnobaterium S.bovis D(-) 38 – 42 C.divergens 33,0 - 36,4 S.thermophilus D(-) 40 C.mobile 35,5 - 37,2 Lactococcus C.gallinarum 34,3 - 36,4 L.lactis subsp. lactis D(-) 38,4 - 38,6 C.piscicola 33,7 - 36,4 L.lactissubsp.cremoris D(-) 38,0 - 40,0 Weissella L.lactissubsp.hordniae 35,2 W.confusa DL 44,5 - 45,0 L.garvieae 38,3 - 38,7 W.hellenica D(-) 37 - 47 L.plantarum 36,9 - 38,1 W.halotolerans DL 45 L.raffinolactis 40,0 - 43 W.kandler DL 39 Vagococcus W.minor DL 44 V.fluvialis 33,6 W.paramesenteroides D(-) 38 - 39 V.salmoninarum 36,0 - 36,5 W.viridescens DL 43 Oenococcus O.oeni DL 38 - 42 10 2.3.1. Vi khuẩn lactic dị hình [9] Tất cả các vi khuẩn lactic dị hình thƣờng thiếu hai loại enzym quan trọng đó là aldolase và hexose isomerase. Do đó trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, chúng thƣờng đƣợc tiến hành theo con đƣờng hexose monophosphate hay gọi là con đƣờng pentose phosphate (PP ) . Quá trình chuyển hóa đƣờng đƣợc trình bày nhƣ sau: 2.3.2.Vi khuẩn lactic đồng hình Quá trình lên men lactic đồng hình nhờ có enzyme aldolase và hexose isomerase nhƣng thiếu phosphoketolase. Chúng sử dụng con đƣờng Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) để tạo 2 phân tử lactat từ 1 phân tử glucose [9], [19], [20]. Quá trình chuyển hóa đƣợc trình bày nhƣ sau: 11 12 2.4. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 2.4.1. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic có nhu cầu về dinh dƣỡng rất phức tạp, không một đại diện nào thuộc nhóm này có thể phát triển đƣợc chỉ có chứa glucose và NH4 +. Đa số trong chúng cần hàng loạt vitamin (lactoflavin, tiamin, acid pantotenic, acid nicotinic, acid folic, biotin) và các acid amin. Vì thế ngƣời ta thƣờng nuôi cấy chúng trên các môi trƣờng phức tạp chứa một số lƣợng tƣơng đối lớn cao nấm men, dịch cà chua hoặc thậm chí máu. Một số loài vi khuẩn lactic có những nhu cầu về yếu tố tăng trƣởng chính xác hơn động vật hữu nhũ [25]. 2.4.1.1. Nhu cầu dinh dưỡng carbon Vi khuẩn lactic có thể sử dụng đƣợc nhiều carbohydrate nhƣ glucose, fructose, maltose, saccharose…các nguồn carbon này dùng để cung cấp năng lƣợng và tham gia vào hầu hết các cấu trúc của tế bào. Vì vậy đây là nguồn thức ăn có ý nghĩa hàng đầu đối với sự sống của tế bào vi sinh vật [13]. Nguồn carbon tốt nhất là các loại đƣờng và ở mức độ nhỏ các đƣờng chứa nhóm rƣợu, còn polysaccharide thì thực chất không thể lên men. Tốc độ lên men các loại mono-, di- và oligosaccharide khác nhau đến mức có thể dùng tiêu chuẩn này để có thể phân biệt giữa các loài [2]. 2.4.1.2. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Đa số vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp đƣợc các hợp chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ, chỉ có một số loài có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất nitơ hữu cơ từ nguồn vô cơ. Vì vậy, để đảm bảo sự phát triển của mình, vi khuẩn lactic phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trƣờng. Tuy nhiên, để sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng thì ngoài nitơ dƣới dạng hỗn hợp các acid amin, vi khuẩn lactic còn cần những cơ chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ nhƣ: cao thịt, cao nấm men, pepton, casein…[13]. Bảng 2.3 Các acid amin cần thiết cho vi khuẩn lactic [34] L-Alanine Glycine L-Proline D-Alanine L-Histidine L-Serine L-Arginine L-Isoleucine L-Threonine L-Acid aspartic L-Leucine L-Tryptophan L-Cysteine L-Lysine L-Tyrosine L-Acid glutamic L-Phenylalanine L-Valine 13 2.4.1.3. Nhu cầu về vitamin Vi khuẩn lactic rất cần vitamin cho sự phát triển và các vitamin này đóng vai trò là coenzym trong quá trình trao đổi chất của chúng. Rất ít vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp đƣợc vitamin, phần lớn chúng cần nhiều loại vitamin nhƣ: riboflavin, tiamin, biotin. Bảng 2.4 Các vitamin và các yếu tố có liên quan đến sự phát triển của vi khuẩn lactic [34] Yếu tố phát triển Các sinh vật đại diện mà đòi các hợp chất cho sự phát triển p-Acid aminobenzoic Lactobacillus plantarum Lactobacillus arabinosus Biotin Lactobacillus plantarum Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis Acid folic (Acid pteroylglutamic) Lactobacillus casei Streptococcus faecalis Acid folinic (acid leucovorin, 5-Formyl- 5,6,7,8-tetrahydropteroylglutamic) Leuconostoc citrovorum Acid lipoic (Acid thioctic, yếu tố thay thế acetat, protogen) Lactobacillus casei Streptococcus lactis Acid nicotinic Lactobacillus arabinosus Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis Acid pantothenic Lactobacillus casei Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis Pantetheine hoặc pantethine Lactobacillus acidophilus Lactobacillus bulgaricus Riboflavin Lactobacillus casei Streptococcus lactis Thiamine Lactobacillus fermenti Streptococcus lactis Pyridoxal Lactobacillus casei Pyridoxamin Streptococcus faecalis Pyridoxamin phosphat Lactobacillus acidophilus Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus lactis Vitamin B12 Lactobacillus lactis Lactobacillus leichmannii 14 2.4.1.4. Nhu cầu về các chất hữu cơ Ngoài các nguồn dinh dƣỡng trên, vi khuẩn lactic còn có nhu cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ khác cần cho sự phát triển của chúng nhƣ purine, pyrimidine. Acid hữu cơ nhƣ acid acetic và nhiều acid hữu cơ không bay hơi khác. Tween 80 là một dẫn xuất của acid oleic, là một loại acid hữu cơ quan trọng có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của hầu hết các loại vi khuẩn lactic. Ngoài ra các acid béo cũng ảnh hƣởng lên sinh trƣởng của các vi khuẩn lactic nhƣng cơ chế còn chƣa đƣợc biết rõ [2]. 2.4.1.5. Nhu cầu các muối vô cơ Để đảm bảo cho sự sinh trƣởng và phát triển, vi khuẩn lactic cần rất nhiều các hợp chất vô cơ. Phosphat là loại muối quan trọng nhất mà các vi khuẩn lactic yêu cầu. Các muối amôn không thể đƣợc dùng làm nguồn nitơ duy nhất song hình nhƣ chúng gây một ảnh hƣởng nhất định lên sự chuyển hóa một số acid amin. Đối với Lactobacillus thì Mn2+, Fe2+, Mg2+ có tác dụng tích cực lên sự phát triển và sinh ra acid lactic [13]. Sự vắng mặt glucose thì Mg2+ không ảnh hƣởng đến sự ổn định của Lactobacillus delbrueckii nhƣng khi có glucose thì nó làm ổn định quá trình thủy phân (Rees và Pirt, 1979). Cơ chế của sự ổn định này chƣa đƣợc xác định, nhƣng tất cả các các trình tự thủy phân của kinase xem Mg2+ nhƣ là đồng nhân tố. Sự đòi hỏi Mg2+ bởi Lactobacillus delbrueckii không thể thay thế bằng Mn2+ [23]. 2.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men Trong nghiên cứu vi khuẩn lactic thì thƣờng sử dụng môi trƣờng: MRS (de Man, Rogosa and Sharpe), môi trƣờng cà chua, môi trƣờng cao nấm men, môi trƣờng rau cải, môi trƣờng cà chua - Tween 80, môi trƣờng nấm men - glucose, môi trƣờng nhũ thanh, môi trƣờng sữa. Tùy theo từng loại và thành phần môi trƣờng mà áp dụng phƣơng pháp xử lý cho thích hợp. Thiết bị lên men dùng để lên men trong phòng thí nghiệm là bình erlen hoặc fermentor cỡ nhỏ có gắn các thiết bị kiểm soát các thông số có liên quan. Dù ta sử dụng môi trƣờng, thiết bị lên men nào cũng phải đảm bảo điều kiện vô trùng, công đoạn này quyết định hiệu quả của quá trình lên men. 2.4.2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dƣỡng. Nguồn năng lƣợng cần thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lƣợng do trao đổi chất với môi trƣờng bên ngoài. Để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trƣờng dinh dƣỡng làm nguồn carbon 15 (chủ yếu là đƣờng lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khoáng và các nguyên tố vi lƣợng. Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh dƣỡng trên với liều lƣợng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên men. 2.4.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng nhất ảnh hƣởng tới sinh trƣởng. Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng manh. 2.4.2.3. Ảnh hưởng của pH môi trường Mỗi loài vi sinh vật thích hợp với một giới hạn pH nhất định của môi trƣờng nuôi cấy. Với vi khuẩn lên men lactic đồng hình, pH môi trƣờng thƣờng không ảnh hƣởng đến các sản phẩm đặc trƣng của quá trình lên men, còn đối với vi khuẩn lactic dị hình, pH môi trƣờng có ảnh hƣởng đến việc tạo thành các sản phẩm lên men. Khi pH môi trƣờng cao thì sản phẩm tạo ra chủ yếu là acid lactic, còn khi pH môi trƣờng thấp thì ngoài acid lactic còn có thêm acid acetic và nhiều sản phẩm phụ khác. Acid mới tạo thành phải đƣợc trung hòa liên tục. Để lên men nhanh và trọn vẹn, phạm vi pH tối ƣu phải nằm giữa 5,5 và 6,0. Lên men bị ức chế mạnh ở pH = 5 và sẽ dừng lại ở các pH dƣới 5 [2]. Khi acid lactic đƣợc hình thành và nồng độ tăng dần trong quá trình lên men thì pH sẽ giảm và nồng độ acid lactic đạt khoảng 2,2% sẽ ức chế vi khuẩn lactic [15]. 2.4.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ acid Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi khuẩn lactic tạo nên. Các vi khuẩn này chịu đƣợc acid, tuy nhiên với lƣợng acid tích lũy trong môi trƣờng ngày càng một nhiều sẽ ức chế chúng. Để giúp vi khuẩn lactic phát triển bình thƣờng không bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng tạo ra ức chế, ngƣời ta cho vào môi trƣờng các chất đệm thích hợp với một lƣợng đủ để trung hòa lƣợng acid sinh ra thông thƣờng chất đệm này là CaCO3. 2.4.2.5. Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men Trong quá trình lên men tạo sinh khối thƣờng dựa trên cơ sở nuôi cấy một chủng thuần khiết, vì vậy việc đảm bảo cho tất cả các quá trình nuôi cấy từ giữ giống trong ống nghiệm, nhân giống trong bình erlen…đều phải đảm bảo vô trùng tuyệt đối. Hệ vi sinh vật tạp mhiễm, thƣờng ảnh hƣởng xấu đến quá trình lên men ở những mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành các sản phẩm lên men. 16 2.5. Ứng dụng của vi khuẩn lactic và acid lactic Vi khuẩn lactic và acid lactic ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ trong bảo quản và chế biến thực phẩm, y học, môi trƣờng, mỹ phẩm.v.v. Nhƣng nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm… 2.5.1. Trong bảo quản và chế biến thực phẩm [17] [19] Vi khuẩn lactic đƣợc sử dụng để lên men thu nhận acid lactic. Acid lactic sản xuất công nghiệp đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Do vị chua dễ chịu và có đặc tính bảo quản, một lƣợng lớn acid lactic đƣợc sử dụng trong công nghiệp thực phẩm. Acid lactic đƣợc sử dụng nhƣ là một chất gia vị đối với các loại đồ uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt, sirô. Ngoài ra, acid lactic còn đƣợc dùng để acid hóa rƣợu vang và hoa quả nghèo acid, acid hóa dịch đƣờng hóa trong công nghiệp sản xuất rƣợu mạnh và để sản xuất bột chua trong ngành bánh mì. - Ứng dụng để sản xuất dƣa chua Quá trình muối chua rau, quả chính là quá trình hoạt động sống của vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic. Trong quá trình phát triển của chúng, trong rau quả, khi lên men sẽ tạo ra acid lactic và acid acetic cùng một số loạt acid hữu cơ khác. Các acid hữu cơ này làm giảm pH của dịch, chống lại hiện tƣợng gây thối rau, quả. Mặt khác nhờ có lƣợng acid hữu cơ đƣợc tạo thành sẽ làm tăng hƣơng vị của khối ủ chua rau, quả là quá trình vừa mang ý nghĩa chế biến vừa mang ý nghĩa bảo quản [9]. - Ứng dụng để làm chua quả Trƣớc đây, ngƣời ta thƣờng sử dụng acid acetic để ngâm chua quả. Sau này ngƣời ta sử dụng acid lactic để ngâm chua quả. Phƣơng pháp thay thế này tỏ ra hiệu quả vì chúng ít làm thay đổi màu tự nhiên của quả và vẫn đảm bảo chất lƣợng quả ngâm chua. - Ứng dụng trong sản xuất tƣơng Sản xuất tƣơng theo phƣơng pháp của miền Bắc (Việt Nam) có giai đoạn ngả nƣớc đậu sau khi rang. Quá trình ngả nƣớc đậu xảy ra nhiều phản ứng sinh hóa khác nhau, trong đó có quá trình lên men lactic tạo pH thích hợp cho sản phẩm và làm tăng hƣơng vị cho sản phẩm. 17 - Ứng dụng trong sản xuất đậu phụ Trong sản xuất đậu phụ có giai đoạn kết tủa protein của đậu. Phƣơng pháp truyền thống thƣờng làm là dùng nƣớc chua (chứa vi khuẩn lactic) để tạo kết tủa (nhờ pH giảm đến điểm đẳng điện của protein đậu nành). - Ứng dụng để sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa Trong sản xuất các loại sữa chua đều có sử dụng quá trình lên men lactic. Nhờ có quá trình chuyển hóa đƣờng thành acid lactic mà casein đƣợc kết tủa và tạo cho sản phẩm hƣơng vị đặc trƣng. Hippocrates, ngƣời đƣợc xem là cha đẻ của ngành y đã cho rằng “Whey”, loại nƣớc xuất hiện khi tách bơ ra khỏi sữa chính là một dạng huyết thanh của sữa. Trong “Whey” chiếm khoảng 4,5% đƣờng sữa. Trong ruột chất đƣờng này biến thành acid lactic, một chất hỗ trợ cho loại vi khuẩn lành mạnh trong ruột phát triển [28]. - Ứng dụng để ủ thức ăn gia súc Về nguyên tắc, ủ các loại cỏ và lá cây làm thực phẩm gia súc cũng giống nhƣ công nghệ sản xuất dƣa chua. Quá trình lên men lactic xảy ra làm gia tăng giá trị dinh dƣỡng và khả năng bảo quản cỏ, lá cây cho gia súc. 2.5.2. Trong y học - Ứng dụng vi khuẩn lactic để chữa bệnh đƣờng ruột Thực ra việc ứng dụng này đã đƣợc Việt Nam ứng dụng từ lâu. Khi ngƣời ta bị tiêu chảy, thầy thuốc khuyên hàng ngày uống 1 - 2 chén nƣớc dƣa chua. Phƣơng pháp này tỏ ra rất hiệu nghiệm trong điều kiện ngành dƣợc chƣa phát triển. Dựa vào hiệu quả sử dụng vi khuẩn lactic trong việc chữa trị tiêu chảy, Pháp đã sản xuất và đƣa ra thị trƣờng từ hàng chục năm nay một sản phẩm mang tên là Biolactyl. Sản phẩm này chuyên trị tiêu chảy bằng nhiều vi khuẩn lactic. - Ứng dụng acid lactic theo phƣơng pháp chữa vi lƣợng đồng cân (homeopathy) Trong quá trình vận động của cơ thể, mô cơ hoạt động mạnh và trong một thời gian dài sẽ gây hiện tƣợng mệt mỏi. Hiện tƣợng mệt mỏi này xuất hiện do các phản ứng sinh hóa xảy ra trong mô cơ, tạo acid lactic. Các thầy thuốc đã tạo ra một vị thuốc bao gồm acid lactic kết hợp với cây kim sa có khả năng giúp cơ thể không còn mệt mỏi và có khả năng làm việc và hoạt động liên tục trong thời gian dài. 18 - Ứng dụng acid lactic trong phẫu thuật chỉnh hình Trong phẫu thuật chỉnh hình, ngƣời ta thƣờng sử dụng loại vật liệu có tên là purasorb. Purasorb là một hợp chất cao phân tử đƣợc sản xuất từ acid lactic. Thành phần của purasorb bao gồm: lactides, glycolide, polylactides, polyglycolide, lactide/glycolide copolyme. Purasorb đƣợc sử dụng nhƣ những định ghim, gắn phần xƣơng lại với nhau; khi xƣơng định hình, purasorb sẽ tự tiêu hủy [9]. Một loại thanh dẫn có thể mang 20 lớp thuốc khác nhau vừa đƣợc các chuyên gia Singapore sáng chế. Đây là loại thanh dẫn tự tiêu đầu tiên trên thế giới giúp ngƣời bệnh tim mau chóng bình phục đồng thời giảm thiểu nguy cơ nhiễm trùng và phát bệnh trở lại. Các nhà phát minh thuộc Đại học Công nghệ Nanyang cho rằng, với loại thanh dẫn này, bác sĩ có thể kết hợp nhiều loại thuốc phù hợp với từng loại bệnh trạng của từng ngƣời để tăng hiệu quả điều trị. Khi đƣợc đƣa vào cơ thể, thanh dẫn sẽ nhả thuốc vào từng thời điểm khác nhau kéo dài trong nhiều tháng. Khi hết thuốc nó sẽ tự hủy hoàn toàn. Thanh dẫn đƣợc chế tạo bằng PLA và PLGA, khi vào cơ thể sẽ chuyển hóa thành acid lactic và có thể hấp thụ vào máu. Không chỉ đƣợc sử dụng trong động mạch vành tim, loại thanh dẫn tự hủy này có thể đƣợc cấy trong não, phôi, đƣờng niệu hoặc bất kì cơ quan nào bị nghẽn mạch máu. Đƣợc biết, các loại thanh dẫn hiện nay đều làm bằng kim loại và chỉ mang đƣợc một loại thuốc duy nhất, có thể gây tụ huyết khối và làm mạch máu tắc nghẽn trở lại [26]. - Ứng dụng acid lactic trong nha khoa [9], [22] Trong nha khoa có hai chế phẩm đƣợc sử dụng nhiều đó là Puramex và puracal. Puramex bao gồm các thành phần sau: amulinium lactat, Fe-lactat (đƣợc sử dụng để điều trị thiếu máu), Mg-lactat, Mn-lactat, Zn-lactat còn puracal chỉ có lactat canxi. Các chế phẩm này thƣờng làm răng khỏe hơn. - Ứng dụng để sản xuất vật liệu sinh học (Biomaterials) Các nhà khoa học đang nghiên cứu tạo ra những vật liệu sinh học dùng trong y học bằng các copolyme của acid lactic. Các copolyme này có tính năng rất giống những bộ khung xƣơng động vật. Hƣớng này đang đƣợc nghiên cứu và ngƣời ta hy vọng trong tƣơng lai nó sẽ đƣợc ứng dụng nhiều. - Ứng dụng trong sản xuất các loại sữa và bột giàu canxi Ngƣời ta thƣờng bổ sung lactat canxi vào thành phần sữa bột dinh dƣỡng, bánh ngọt, bánh nƣớng để tăng lƣợng canxi cho cơ thể [9]. Thiếu calci lại ảnh hƣởng đến 19 hoạt động của cơ tim, tới sự tạo huyết và đông máu, là nguyên nhân của bệnh còi xƣơng ở trẻ em và giòn xƣơng xốp xƣơng ở ngƣời già [27]. 2.5.3. Trong môi trường Các phòng thí nghiệm đang nghiên cứu loại chất dẻo mới thay thế cho chất dẻo củ khó phân hủy. Chất dẻo mới này là một loại polyme đƣợc gọi là poly acid lactic (PLA). Đó là sản phẩm tạo ra từ phản ứng trùng hợp acid lactic. Ngƣời ta hy vọng trong tƣơng lai nó sẽ thay thế chất dẻo đƣợc sản xuất từ dầu mỏ vì tính chất dễ phân hủy của nó có ý nghĩa rất lớn trong bảo vệ môi trƣờng [9]. 2.5.4. Trong mỹ phẩm [9][22] Các loại lactat kim loại (chẳng hạng nhƣ lactat natri) đƣợc sử dụng trong thành phần của một số mỹ phẩm chăm sóc da nhƣ punosal và của hãng mỹ phẩm Punac. Mỹ phẩm này có tác dụng chống lại các vi sinh vật có trên bề mặt da, làm ẩm và làm sáng da [9]. 2.6. Sản xuất acid lactic 2.6.1. Mật rỉ đường [1], [8], [12] Là phế liệu chứa nhiều đƣờng không kết tinh trong sản xuất đƣờng từ mía hoặc củ cải đƣờng. Thông thƣờng tỉ lệ rỉ đƣờng trong sản xuất đƣờng mía chiếm khoảng 3 – 5 % trọng lƣợng mía. Tùy thuộc vào giống mía, điều kiện trồng trọt, công nghệ sản xuất đƣờng.v.v. Thành phần rỉ đƣờng dao động nhƣ sau: Nƣớc chiếm 15 – 20 %; chất khô chiếm 80 – 85 %. Trong chất khô có 60 % là đƣờng (40 % là đƣờng saccharose và 20 % là fructose và glucose) và 40 % chất khô còn lại là chất không phải là đƣờng (phi đƣờng). Trong thành phần phi đƣờng có khoảng 30 – 32 % hợp chất hữu cơ và 6 – 10 % hợp chất vô cơ. Trong hợp chất vô cơ, theo Mắc-Dinit, gồm có K2O: 3,5 %; Fe2O3: 0,2 %; MgO: 0,1 %; sulfat: 1,6 %; CaO: 1,5 %; SiO2: 0,5 %; P2O5: 0,5 %; Clorit: 0,4 %. Trong những hợp chất hữu cơ gồm có hợp chất có chứa nitơ và không chứa nitơ ở dạng amin nhƣ: acid aspactic, acid glutamic, leuxin, isoleuxin [2]. Ngoài ra trong rỉ đƣờng có một số vitamin (tính theo μ/g mật rỉ đƣờng ) nhƣ sau: 20 Bảng 2.5 Thành phần vitamin trong rỉ đƣờng Các vitamin Số lƣợng (μg/g) Thiamin Riboflavin Acid nicotinic Acid folic Pyridoxin Biotin Acid pantotenic 8,3 2,5 21,0 0,038 6,5 12,0 21,4 2.6.2. Qui trình sản xuất acid lactic [14] Acid lactic tinh thể Mật rỉ Xử lý Lên men Trung hòa Lactat canxi Lọc Dung dịch acid lactic Vi khuẩn CaCO3 H2SO4 Kết tinh Cô đặc 21 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1. Thời gian Thời gian tiến hành từ ngày 14/04/2005 đến ngày 15/09/2005 3.1.2. Địa điểm Thí nghiệm đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Chăn nuôi Thú y và Trung tâm phân tích Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.HCM. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn có khả năng tạo acid lactic 3.2.2. Vật liệu nghiên cứu - Chế phẩm Biolactyl của Pháp - Chế phẩm Antibio của Hàn Quốc - Đại mạch của trƣờng Cao đẳng Công nghiệp Thực Phẩm Tp. HCM 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm - Thiết bị: tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ sấy, kính hiển vi, cân điện tử, máy đo pH, máy li tâm, máy đo OD, nồi hấp áp suất, tủ lạnh, máy cất nƣớc và bếp điện. - Dụng cụ: ống eppendorf, erlen, cốc, bình định mức, ống đong, đĩa petri, ống nghiệm, buret, phễu chiết, pipet và pipetman. 3.2.4. Môi trường nuôi cấy - Môi trƣờng MRS broth (de Man, Rogosa and Sharpe broth) [36] - Môi trƣờng MRS agar (de Man, Rogosa and Sharpe agar) - Môi trƣờng YGC agar (Yeast extract Glucose Calcium carbonat) [37] - Môi trƣờng thử khả năng lên men đƣờng [11] - Môi trƣờng thạch nitrate bán lỏng - Môi trƣờng thử khả năng phân giải gelatin - Môi trƣờng thạch bán lỏng di động - Môi trƣờng thử khả năng sinh indol Thành phần và tỉ lệ môi trƣờng nuôi cấy đƣợc trình bày ở mục 1 phần phụ lục. 22 3.2.5.Thuốc nhuộm và thuốc thử - Dung dịch thuốc nhuộm Bromocresol Purple 0,2% [11] - Thuốc nhuộm Gram [11] - Thuốc thử uphenmen [11] - Thuốc thử DNS [10] - Thuốc thử và hóa chất dùng chuẩn độ Thành phần và tỉ lệ của thuốc nhuộm và thuốc thử đƣợc trình bày ở mục 2 phần phụ lục. 3.3. Phương pháp thí nghiệm 3.3.1. Phân lập và sơ chọn giống 3.3.1.1. Quan sát đại thể - Môi trƣờng MRS agar và YGC agar + Nguyên tắc: dựa vào đặc tính sinh acid của các khuẩn lạc. Giống phân lập trên môi trƣờng YGC agar, CaCO3 sẽ bị tan khi tác dụng với acid tạo nên vòng trong suốt quanh khuẩn lạc. + Thực hiện * Pha loãng mẫu trong nƣớc cất vô trùng với các độ pha loãng khác nhau. * Trãi đều 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng lên môi trƣờng MRS agar. Nuôi cấy ở nhiệt độ 37o C và theo dõi sự phát triển khuẩn lạc sau 48 giờ. * Chọn những khuẩn lạc mọc riêng lẻ, cấy ria trên môi trƣờng YGC agar. Nuôi cấy ở nhiệt độ 37o C. Sau 48 giờ, chọn các khuẩn lạc sinh acid nhờ vào vòng trong suốt xuất hiện quanh khuẩn lạc. Vòng trong suốt càng lớn chứng tỏ lƣợng acid sinh ra càng nhiều. - Môi trƣờng MRS broth Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trƣờng MRS dịch thể. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 37o C. Ghi nhận các đặc điểm sinh trƣởng trong 24 giờ. 3.3.1.2. Quan sát vi thể Hình thái: Nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào ở vật kính x100 [5] (Xem ở mục 3.2 phần phụ lục). 3.3.2. Chọn giống có khả năng sinh acid lactic [6], [11], [31] - Thực hiện + Cấy vi khuẩn đã phân lập đƣợc vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trƣờng MRS dịch thể. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 37o C trong 24 giờ. + Li tâm thu dịch trong. 23 + Lấy 5 ml dịch cho vào ống nghiệm, thêm 3 ml thuốc thử uphenmen. Quan sát sự đổi màu. Tiến hành đồng thời 2 ống đối chứng: + Ống 1: 5 ml môi trƣờng MRS (không nuôi vi khuẩn) thêm 3 ml thuốc thử uphenmen. + Ống 2: 5 ml acid lactic tinh khiết, thêm 3 ml thuốc thử uphenmen. 3.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng [11] - Nguyên tắc: Hàm lƣợng acid trong dịch lên men có thể định lƣợng đƣợc bằng dung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi màu của dung dịch thuốc thử phenolphtalein. - Thực hiện: ( xem ở mục 3.1 phần phụ lục) 3.3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng và đặc điểm sinh hóa 3.3.4.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng - Ảnh hƣởng pH Điều chỉnh pH môi trƣờng bằng CH3COOH và NaOH sao cho pH ban đầu là : 4, 5, 6, 7 (pH sau khi khử trùng ). Lấy 10 % giống cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có 10 % mật rỉ và 0,5 % cao nấm men). Nuôi cấy ở 37o C. Sau 24 giờ, xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch nuôi cấy tƣơng ứng với các độ pH khác nhau. Chọn pH thích hợp cho sự tích lũy acid của các khuẩn lạc. - Ảnh hƣởng nhiệt độ Sau khi chọn đƣợc pH thích hợp cho các khuẩn lạc, khảo sát ở nhiệt độ phòng, 37o C, 45 o C, 50 o C. Lấy 10 % giống cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có 10 % mật rỉ và 0,5 % nấm men). Sau 24 giờ, xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dich nuôi cấy tƣơng ứng. - Ảnh hƣởng tỉ lệ mật rỉ Chọn đƣợc pH, nhiệt độ thích hợp cho các khuẩn lạc. Khảo sát tỉ lệ mật rỉ: 5 %, 10 %, 15 %, 20 %. Lấy 10 % giống cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có tỉ lệ mật rỉ nhƣ trên và 0,5 % nấm men). Sau 24 giờ, xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch nuôi cấy tƣơng ứng. - Ảnh hƣởng tỉ lệ giống Chọn đƣợc pH, nhiệt độ, tỉ lệ mật rỉ. Khảo sát tỉ lệ giống: 5 %, 10 %, 15 %, 20 %. Lấy tỉ lệ giống nhƣ trên cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có tỉ lệ mật rỉ đã chọn và 0,5 % nấm men). Sau 24 giờ, xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch nuôi cấy tƣơng ứng. - Ảnh hƣởng thời gian Chọn đƣợc pH, nhiệt độ, tỉ lệ mật rỉ, tỉ lệ giống. Lấy tỉ lệ giống đã chọn cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có mật rỉ đã chọn và 0,5 % nấm men). Đem khảo sát ở các thời 24 điểm 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ. Xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch nuôi cấy tƣơng ứng. 3.3.4.2. Đặc điểm sinh hóa - Thử phản ứng catalase - Kiểm tra khả năng sinh indol - Xem khả năng di động - Khả năng khử nitrate - Khả năng phân giải gelatin - Khả năng đông vón sữa - Khả năng lên men nguồn carbohydrate Cách tiến hành các phản ứng sinh hóa (xem mục 3.5 phần phụ lục) 3.3.5. So sánh về sự tạo acid tổng của các khuẩn lạc: A, B, D - Môi trƣờng cấp 1 Với các điều kiện đã khảo sát nhƣ pH, nhiệt độ tối ƣu cho từng khuẩn lạc. Cho 10 % giống vào 10 ml môi trƣờng MRS (môi trƣờng cấp 1) đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ. - Môi trƣờng cấp 2 Cho 10 % giống từ môi trƣờng cấp 1 vào 50 ml môi trƣờng gồm 5 ml mật rỉ và 45 ml MRS (gọi là môi trƣờng cấp 2). Đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng trong 24 giờ. - Môi trƣờng sản xuất Cho 10 % giống từ môi trƣờng cấp 2 vào 50 ml môi trƣờng gồm 45 ml mật rỉ và 5 ml MRS (môi trƣờng sản xuất). Đem ủ các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ. 3.3.6. Sản xuất acid lactic từ mật rỉ 3.3.6.1. Định lượng đường khử [10] + Nguyên tắc: Có một vài tác nhân đƣợc sử dụng để định lƣợng đƣờng nhờ các đặc tính khử của đƣờng. 3,5 - dinitrosalicylic acid (DNS) có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3 - amino - 5 - nitrosalicylic có màu đỏ cam. + Thực hiện: (xem mục 3.3 phần phụ lục) 3.3.6.2. Định lượng vi sinh vật [16] - Xác định mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc Cách tiến hành: (xem mục 3.4 phần phụ lục) - Thiết lập mối tƣơng quan giữa mật độ tế bào và OD 610 nm của dịch huyền phù tế bào. 25 + Nguyên tắc của máy đo mật độ quang: vi sinh vật trong môi trƣờng nuôi cấy có thể vừa hấp thu hoặc vừa phân tán ánh sáng làm cho ánh sáng truyền suốt bị giảm. Nhƣ vậy, số lƣợng ánh sáng đƣợc hấp thu hoặc phân tán có quan hệ tỉ lệ thuận với số lƣợng vi sinh vật trong dịch nuôi cấy. + Tƣơng quan giữa mật độ tế bào và OD 610 nm : Để hạn chế thao tác đếm số tế bào mỗi khi lấy mẫu, mật độ tế bào sẽ đƣợc suy ra từ độ đục của dịch nuôi cấy bằng cách dựa vào đồ thị tƣơng quan giữa mật độ tế bào và độ đục của dịch huyền phù ở các OD khác nhau khi đo ở bƣớc sóng 610 nm. + Thực hiện * Pha loãng dịch nuôi cấy vi khuẩn sau 24 giờ sao cho thu đƣợc dịch huyền phù có các giá trị OD = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. * Đếm số lƣợng tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc tƣơng ứng với 5 giá trị OD = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Suy ra mật độ tế bào trong 1 ml dịch huyền phù. * Dựng đồ thị tƣơng quan tuyến tính giữa log mật độ tế bào (trục y) và độ đục của dịch huyền phù ở các OD khác nhau (trục x). 3.3.6.3. Qui trình sản xuất Mật rỉ Xử lý Lên men Trung hòa Lactat canxi Lọc Dung dịch H2SO4 Vi khuẩn CaCO3 H2SO4 Dung dịch acid lactic Than hoạt tính 26 - Chuẩn bị môi trƣờng lên men Trƣớc tiên phải xử lý mật rỉ: Mật rỉ đem pha loãng tỉ lệ 1 : 3, cho H2SO4 vào với tỉ lệ 3,5 ml H2SO4 trong 1000 ml mật rỉ. Khuấy liên tục trong 1giờ, sau đó để lắng thu đƣợc phần dịch và pha loãng dung dịch xuống phù hợp với tỉ lệ mật rỉ đã chọn, cho 0,5 % cao nấm men vào (điều chỉnh pH sau khi khử trùng bằng pH tối ƣu của khuẩn lạc đem sản xuất acid lactic). - Giai đoạn lên men + Chuẩn bị giống để lên men * Giống cấp 1 Với các điều kiện đã khảo sát nhƣ pH, nhiệt độ tối ƣu cho từng khuẩn lạc. Cho 10 % giống vào 10 ml môi trƣờng MRS (môi trƣờng cấp 1) đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ. * Giống cấp 2 Cho 10 % giống từ môi trƣờng cấp 1 vào 50 ml môi trƣờng gồm 5 ml mật rỉ và 45 ml MRS (gọi là môi trƣờng cấp 2). Đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng trong 24 giờ. * Giống sản xuất Cho 10 % giống từ môi trƣờng cấp 2 vào 50 ml môi trƣờng gồm 45 ml mật rỉ và 5 ml MRS (môi trƣờng sản xuất). Đem ủ các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ. + Cho 10 % giống sản xuất vào môi trƣờng chuẩn bị lên men, tiến hành lên men ở pH, nhiệt độ tối ƣu trong thời gian 7 ngày. - Giai đoạn tạo lactat canxi Trong thời gian lên men, lƣợng acid tạo ra liên tục nên ta phải trung hòa bằng CaCO3 để cho pH ổn định cho khuẩn lạc đó. Sau khi kết thúc quá trình lên men, loại bỏ dịch trên, thu đƣợc phần lactat canxi. Đem trung hòa lƣợng lactat canxi bằng H2SO4 , thu đƣợc phần dịch, đem lọc bằng than hoạt tính thu đƣợc dung dịch acid lactic. 27 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập và sơ chọn giống 4.1.1. Quan sát đại thể 4.1.1.1. Môi trường MRS agar và YGC agar Từ các nguồn: Biolactyl, Antibio, Đại mạch, quá trình phân lập và làm thuần đƣợc 3 dạng khuẩn lạc sinh acid. Ký hiệu A, B, D. Khuẩn lạc A phân lập từ Antibio, khuẩn lạc B từ Biolactyl và khuẩn lạc D từ Đại mạch. Các khuẩn lạc trên đƣợc phân biệt dựa vào sự khác nhau về hình dạng và kích thƣớc của khuẩn lạc. - Trên môi trƣờng MRS agar + Khuẩn lạc A: Đƣợc ủ 48 giờ ở 37o C đặc điểm khuẩn lạc nhƣ sau: màu trắng sữa, bóng ƣớt, bề mặt phẳng, hơi nhô lên, đƣờng kính khuẩn lạc 1,1 mm. Hình 4. 1: Hình dạng khuẩn lạc A + Khuẩn lạc B: Đƣợc ủ 48 giờ ở 50o C đặc điểm khuẩn lạc nhƣ sau: tròn, bề mặt khuẩn lạc hơi lồi, láng bóng, vun tròn và mép khuẩn lạc có bề phẳng và nhẵn bóng, đƣờng kính khuẩn lạc 1,4 mm. Hình 4. 2: Hình dạng khuẩn lạc B 28 + Khuẩn lạc D: Đƣợc ủ 48 giờ ở 37o C đặc điểm khuẩn lạc nhƣ sau: tròn, màu trắng sữa, bóng ƣớt, đƣờng kính khuẩn lạc 0,5 mm. Hình 4. 3: Hình dạng khuẩn lạc D - Trên môi trƣờng YGC agar Khả năng tạo acid làm tan CaCO3 của 3 khuẩn lạc nhƣ sau: Hình 4. 4: Khả năng làm tan CaCO3 của khuẩn lạc A Hình 4. 5: Khả năng làm tan CaCO3 của khuẩn lạc B Hình 4. 6: Khả năng làm tan CaCO3 của khuẩn lạc D 29 Từ hình 4.4, 4.5 và 4.6 chúng tôi thấy khuẩn lạc A có vòng trong suốt rộng nhất, kế đến khuẩn lạc D, cuối cùng khuẩn lạc B. Do khuẩn lạc A, B và D có khả năng chuyển hóa đƣờng thành acid nên phân giải CaCO3 trong môi trƣờng tạo nên vòng trong suốt. Vòng trong suốt càng lớn chứng tỏ lƣợng acid sinh ra càng nhiều. 4.1.1.2. Môi trường MRS broth Sau khi nuôi vi khuẩn trên môi trƣờng MRS dịch thể chúng tôi thu đƣợc kết quả sau: Hình 4. 7: Khả năng phát triển trong môi trƣờng MRS dịch thể của các khuẩn lạc A, B và D. Từ hình 4.7 chúng tôi thấy: Khuẩn lạc A: Làm đục môi trƣờng, lắng nhiều sinh khối ở đáy, không tạo váng. Khuẩn lạc B: Làm đục môi trƣờng, lắng ít sinh khối ở đáy, không tạo váng. Khuẩn lạc D: Làm đục môi trƣờng, lắng rất ít sinh khối ở đáy, không tạo váng. Do khuẩn lạc A thích nghi nhanh trên môi trƣờng MRS, phát triển tốt cho nên tạo sinh khối nhiều hơn khuẩn lạc B và D. 4.1.2. Quan sát vi thể Sau khi tiến hành nhuộm Gram của các khuẩn lạc A, B và D chúng tôi thu đƣợc kết quả sau: Hình 4. 8: Nhuộm Gram của khuẩn lạc A, xem ở vật kính x 100 30 + Khuẩn lạc B: Tế bào hình que, tạo chuỗi dài, Gram dƣơng, không sinh bào tử Hình 4. 9: Nhuộm Gram của khuẩn lạc B, xem ở vật kính x 100 + Khuẩn lạc D: Tế bào hình cầu, đơn hoặc đôi, Gram dƣơng, không sinh bào tử. Hình 4. 10: Nhuộm Gram của khuẩn lạc D, xem ở vật kính x 100 4.2. Chọn giống có khả năng sinh acid lactic Sau khi tiến hành định tính acid lactic bằng thuốc thử uphenmen chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Hình 4. 11: Khả năng sinh acid lactic, làm đổi màu thuốc thử uphenmen Từ hình 4.11 chúng tôi thấy màu của khuẩn lạc A, B và D giống với màu của acid lactic tinh khiết, khác với màu của môi trƣờng là do cả 3 khuẩn lạc đều có khả năng tạo acid lactic, khi kết hợp với thuốc thử uphenmen thì chuyển từ màu xanh dƣơng đậm sang vàng. 31 4.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng và đặc điểm sinh hóa 4.3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo acid tổng Sau khi khảo sát các điều kiện pH, nhiệt độ, tỉ lệ mật rỉ, tỉ lệ giống, thời gian. Chúng tôi thu đƣợc một số kết quả sau: 4.3.1.1. Ảnh hưởng của pH lên sự tạo acid tổng Bảng 4. 1: Ảnh hƣởng của pH lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc A Các yếu tố pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % + Cao nấm men 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 4 37 10 10 24 1,53 5 37 10 10 24 2,88 6 37 10 10 24 10,17 7 37 10 10 24 9,36 Qua bảng 4.1 chúng tôi thấy khuẩn lạc A tạo acid tổng nhiều nhất ở pH = 6 nên chọn tối ƣu cho khuẩn lạc A. Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của pH lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc B Các yếu tố pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % + Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 4 45 10 10 24 1,08 5 45 10 10 24 1,98 6 45 10 10 24 7,65 7 45 10 10 24 5,67 Qua bảng 4.2 chúng tôi thấy acid tổng tạo nhiều nhất ở pH = 6 nên chọn pH tối ƣu cho khuẩn lạc B. Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của pH lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc D Các yếu tố pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % + Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 4 37 10 10 24 2,25 5 37 10 10 24 13,59 6 37 10 10 24 12,51 7 37 10 10 24 9,45 32 Từ bảng 4.3 chúng tôi thấy ở pH = 5 lƣợng acid tổng nhiều nhất nên chọn pH tối ƣu cho khuẩn lạc D pH = 5. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 A B D Chủng Ac id tổ ng (g /l) pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 Biểu đồ 4.1Ảnh hƣởng pH lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc: A, B và D 4.3.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tạo acid tổng Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc A Các yếu tố Nhiệt độ (o C) pH Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) (t o) Phòng 6 10 10 24 7,29 37 6 10 10 24 14,04 45 6 10 10 24 9,36 50 6 10 10 24 1,37 Qua bảng 4.4 lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất ở 37o C nên chọn nhiệt độ tối ƣu cho khuẩn lạc A: 37o C. Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc B Các yếu tố Nhiệt độ (o C) pH Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) (t o) Phòng 6 10 10 24 2,07 37 6 10 10 24 4,59 45 6 10 10 24 7,83 50 6 10 10 24 6,3 33 Từ bảng 4.5 chúng tôi thấy ở nhiệt độ 45o C thì lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất nên chọn nhiệt độ tối ƣu cho khuẩn lạc B: nhiệt độ 45o C. Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc D Các yếu tố Nhiệt độ (o C) pH Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) (t o) Phòng 5 10 10 24 9,72 37 5 10 10 24 14,13 45 5 10 10 24 1,08 50 5 10 10 24 0,81 Từ bảng 4.6 chúng tôi thấy lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất ở 37o C nên chọn nhiệt độ tối ƣu cho khuẩn lạc D. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 A B D Chủng A ci d tổ ng (g /l) Độ phòng 37 độ C 45 độ C 50 độ C Biểu đồ 4.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên sự tạo acid tổng của các khuẩn lạc A, B và D 4.3.1.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ mật rỉ lên sự tạo acid tổng Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của tỉ lệ mật rỉ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc A Các yếu tố Môi trƣờng (10 ml) pH Nhiệt độ (o C) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 5 %mật rỉ + 0,5 % cao nấm men 6 37 10 24 7,11 10 %mật rỉ +0,5 % cao nấm men 6 37 10 24 16,65 15 %mật rỉ +0,5 % cao nấm men 6 37 10 24 14,22 20 %mât rỉ +0,5 % cao nấm men 6 37 10 24 11,16 34 Qua bảng 4.7 chúng tôi thấy lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất ở tỉ lệ mật rỉ 10 % nên chọn tỉ lệ này phù hợp cho quá trình lên men của khuẩn lạc A. Bảng 4.8: Ảnh hƣởng của tỉ lệ mật rỉ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc B Các yếu tố Môi trƣờng (10 ml) pH Nhiệt độ ( o C) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 5 % mật rỉ + 0,5 % cao nấm men 6 45 10 24 4,23 10 % mật rỉ +0,5 % cao nấm men 6 45 10 24 6,84 15 % mật rỉ +0,5 % cao nấm men 6 45 10 24 3,15 20 % mật rỉ + 0,5 % cao nấm men 6 45 10 24 2,52 Qua bảng 4.8 chúng tôi thấy lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất ở tỉ lệ mật rỉ 10 % nên chọn tỉ lệ này phù hợp cho quá trình lên men của khuẩn lạc B. Bảng 4.9: Ảnh hƣởng của tỉ lệ mật rỉ lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc D Các yếu tố Môi trƣờng (10 ml) pH Nhiệt độ ( o C) Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 5 % mật rỉ +0,5 % cao nấm men 5 37 10 24 7,47 10 % mật rỉ + 0,5 % cao nấm men 5 37 10 24 12,6 15 % mật rỉ + 0,5 % cao nấm men 5 37 10 24 9,72 20 % mật rỉ +0,5 % cao nấm men 5 37 10 24 8,64 Qua bảng 4.9 chúng tôi thấy ở tỉ lệ mật rỉ 10 % thì lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất nên chọn tỉ lệ này phù hợp cho quá trình lên men cho khuẩn lạc D. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 A B D Chủng Ac id tổ ng (g /l) Mật rỉ 5 % Mật rỉ 10 % Mật rỉ 15 % Mật rỉ 20 % Biểu đồ 4.3 Ảnh hƣởng mật rỉ lên sự tạo acid tổng từ các khuẩn lạc A, B và D 35 4.3.1.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống lên sự tạo acid tổng Bảng 4.10: Ảnh hƣởng của tỉ lệ giống lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc A Các yếu tố Tỉ lệ giống (%) pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 5 6 37 10 24 9,45 10 6 37 10 24 13,23 15 6 37 10 24 14,76 20 6 37 10 24 14,94 Qua bảng 4.10 chúng tôi thấy acid tổng tạo nhiều nhất ở tỉ lệ giống 20 %. Tuy nhiên, với lƣợng giống nhiều sẽ tốn kém cho nên chúng tôi quyết định chọn tỉ lệ giống 10 % phù hợp cho quá trình lên men của khuẩn lạc A Bảng 4.11: Ảnh hƣởng của tỉ lệ giống lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc B Các yếu tố Tỉ lệ giống (%) pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 5 6 45 10 24 3,69 10 6 45 10 24 6,57 15 6 45 10 24 7,38 20 6 45 10 24 7,47 Qua bảng 4.11 chúng tôi thấy ở tỉ lệ giống 20 % lƣợng acid tổng nhiều nhất. Tuy nhiên, về kinh tế chúng tôi quyết định chọn tỉ lệ giống 10 % phù hợp cho quá trình lên men. Bảng 4.12: Ảnh hƣởng của tỉ lệ giống lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc D Các yếu tố Tỉ lệ giống (%) pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) 5 5 37 10 24 8,01 10 5 37 10 24 14,13 15 5 37 10 24 16,02 20 5 37 10 24 16,29 36 Qua bảng 4.12 chúng tôi thấy lƣợng acid tổng tạo nhiều nhất ở tỉ lệ giống 20 %. Tuy nhiên, về kinh tế thì tốn kém nên chúng tôi quyết định chọn tỉ lệ giống 10 % phù hợp cho quá trình lên men. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 A B D Chủng A ci d tổ ng (g /l) Giống 5 % Giống 10 % Giống 15 % Giống 20 % Biểu đồ 4.4 Ảnh hƣởng tỉ lệ giống lên sự tạo acid tổng của các khuẩn lạc A, B và D 4.3.1.5. Ảnh hưởng của thời gian lên sự tạo acid tổng Bảng 4.13: Ảnh hƣởng của thời gian lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc A Các yếu tố Thời gian (giờ) pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Acid tổng (g/l) 12 6 37 10 10 1,62 24 6 37 10 10 13,14 36 6 37 10 10 14,58 48 6 37 10 10 14,85 Qua bảng 4.13 chúng tôi thấy khuẩn lạc A ở 12 giờ acid tổng tạo thành ít, tạo acid tổng mạnh ở thời gian 24 giờ. Ở thời gian 36 giờ và 48 giờ lƣợng acid tổng tạo thành không tăng nhiều, có thể ở thời điểm này bắt đầu ở tỉ lệ cân bằng (pha ổn định), không có sự gia tăng mật độ của tế bào do tốc độ tăng trƣởng bằng tốc độ tế bào chết đi. Ở pha này, các chất dinh dƣỡng bị cạn kiệt trong khi các sản phẩm biến dƣỡng ức chế tăng trƣởng lại đƣợc tích lũy, nên acid tổng tạo thành yếu dần. 37 Bảng 4.14: Ảnh hƣởng của thời gian lên sự tạo acid tổng của khuẩn lạc B Các yếu tố Thời gian (giờ) pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Acid tổng (g/l) 12 6 45 10 10 1,35 24 6 45 10 10 7,47 36 6 45 10 10 8,64 48 6 45 10 10 8,73 Qua bảng 4.14 chúng tôi thấy khuẩn lạc B ở 12 giờ lƣợng acid tổng tạo ra rất thấp. Chỉ tạo nhiều ở 24 giờ . Ở thời điểm 36 giờ và 48 giờ acid tổng tạo thành tăng không nhiều. Chứng tỏ ở các thời điểm này bắt đầu đạt trạng thái cân bằng. Bảng 4.15: Ảnh hƣởng của thời gian lên sự tạo acid tổng Các yếu tố Thời gian (giờ) pH Nhiệt độ ( o C) Mật rỉ: 10 % +Cao nấm men: 0,5 % (ml) Tỉ lệ giống (%) Acid tổng (g/l) 12 5 37 10 10 3,78 24 5 37 10 10 14,04 36 5 37 10 10 16,2 48 5 37 10 10 16,83 Qua bảng 4.15 chúng tôi thấy khuẩn lạc D ở 12 giờ lƣợng acid tổng tạo ra thấp, tạo nhiều ở 24 giờ, còn 36 giờ và 48 giờ lƣợng acid tổng tạo thành không tăng nhiều. Chứng tỏ ở thời điểm này bắt đầu vào pha cân bằng. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 A B D Chủng Ac id tổ ng (g /l) 12 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ Biểu đồ 4.5 Ảnh hƣởng thời gian lên sự tạo acid tổng bởi các khuẩn lạc A, B và D 38 4.3.2. Đặc điểm sinh hóa Qua quá trình thử nghiệm các phản ứng sinh hóa chúng tôi thu đƣợc một số kết quả sau: - Khả năng đông vón sữa: Bảng 4.16: Khả năng tạo acid tổng từ sữa của các khuẩn lạc: A, B, D Các yếu tố Các khuẩn lạc pH Nhiệt độ (o C) Môi trƣờng sữa : ml Tỉ lệ giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) A 6 37 10 10 24 23,04 B 6 45 10 10 24 25,65 D 5 37 10 10 24 15,39 0 5 10 15 20 25 30 A B D Chủng Ac id tổ ng (g /l) Biểu đồ 4.6. So sánh khả năng tạo acid tổng trên môi trƣờng sữa bởi các khuẩn lạc A, B và D Qua biểu đồ 4.6 chúng tôi thấy khuẩn lạc B lên men sữa tạo acid tổng nhiều nhất, kế đến khuẩn lạc A và cuối cùng khuẩn lạc D. Chứng tỏ khuẩn lạc B phù hợp với môi trƣờng sữa nhất, kế đến khuẩn lạc A và cuối cùng khuẩn lạc D. Chúng tôi thấy cả 3 khuẩn lạc đều có khả năng đông vón sữa. Khả năng đông vón: do các khuẩn lạc A, B và D đều có khả năng lên men đƣờng tạo thành các loại acid hữu cơ (trong đó lƣợng acid lactic nhiều nhất). Chính các acid hữu cơ này càng đƣợc tích lũy càng làm tăng nhanh quá trình tách canxi ra khỏi casein, khi lƣợng acid hữu cơ đủ nhiều, tạo pH đến điểm đẳng điện của casein thì sữa bị vón cục trở lại. 39 - Khả năng lên men các nguồn carbohydrate khác nhau Sau khi tiến hành thử phản ứng lên men đƣờng chúng tôi thu đƣợc một số kết quả sau: Hình 4. 12: Khả năng lên men các nguồn carbohydrate khác nhau của khuẩn lạc A Qua hình 4.12 chúng tôi thấy khuẩn lạc A có vật liệu di truyền tổng hợp nên các enzyme đồng hóa các loại đƣờng glucose, fructose, lactose, saccharose và maltose tạo acid nên làm môi trƣờng có chất chỉ thị phenol red từ màu đỏ chuyển sang vàng. Đối với các ống nghiệm chứa các loại đƣờng còn lại môi trƣờng vẫn còn màu của chất chỉ thị phenol red, do nó không có vật liệu di truyền tổng hợp các enzyme phân giải các loại đƣờng này. Kết quả trên phù hợp với Kulp và Rettger (trích dẫn bởi B. S. Robert, 1948). Hình 4. 13: Khả năng lên men các nguồn carbohydrate khác nhau của khuẩn lạc B Qua hình 4.13 chúng tôi thấy các ống nghiệm có chứa đƣờng glucose, fructose, lactose và saccharose chuyển thành màu vàng. Chứng tỏ khuẩn lạc B có vật liệu di truyền tổng hợp nên các enzyme biến đổi các loại đƣờng này tạo thành acid nên từ môi trƣờng chứa chất chỉ thị phenol red màu đỏ chuyển vàng. Đối với các loại đƣờng còn lại nó không có khả năng đồng hóa nên có màu đỏ. Kết quả trên phù hợp với Gigoroff và Cohendy (trích dẫn bởi B. S. Robert, 1948). 40 Hình 4. 14: Khả năng lên men các nguồn carbohydrate khác nhau của khuẩn lạc D Qua hình 4.14 chúng tôi thấy khuẩn lạc D có vật liệu di truyền tổng hợp các enzyme có khả năng chuyển hóa các loại đƣờng glucose, fructose, lactose và maltose thành acid, nên từ môi trƣờng có chất chỉ thị phenol red (màu đỏ) chuyển sang vàng. Đối với các ống nghiệm có chứa các loại đƣờng còn lại vẫn không thay đổi màu, do không có enzyme đồng hóa các loại đƣờng này. Kết quả trên phù hợp với (B. S. Robert, 1948). Bảng 4.17: Bảng tóm tắt các đặc tính của các khuẩn lạc A, B, D Khuẩn lạc Đặc điểm A B D Gram + + + Khả năng sinh bào tử - - - Khả năng sinh hơi - - - Khả năng di động - - - Khả năng khử nitrate - - - Khả năng phân giải gelatin - - + Phản ứng indole - - - Khả năng đông vón sữa + + + Khả năng phân giải carbohydrate Glucose + + + Fructose + + + Maltose + - + Lactose + + + Saccharose + + - Mannitol - - - Sorbitol - - - Dextrin - - - Glycerol - - - 41 Qua các khảo sát về một số đặc điểm để phân loại của các khuẩn lạc mà chúng tôi phân lập đƣợc, chúng tôi chỉ xác định đƣợc loài của 2 khuẩn lạc A, B mà phân lập từ chế phẩm, đối với khuẩn lạc D phân lập từ Đại mạch, vì không có điều kiện nên chỉ xác định tới giống. - Khuẩn lạc A + Họ: Lactobacillaceae + Tộc: Lactobacilleae + Giống: Lactobacillus + Loài: Lactobacillus acidophilus - Khuẩn lạc B + Họ: Lactobacillaceae + Tộc: Lactobacilleae + Giống: Lactobacillus + Loài: Lactobacillus bulgaricus - Khuẩn lạc D + Họ: Lactobacillaceae + Tộc: Streptococceae + Giống: Diplococcus 4.4. So sánh về sự tạo acid tổng của L. acidophilus, L. bulgaricus và giống Diplococcus Từ việc khảo sát các điều kiện tối ƣu cho 3 khuẩn lạc chúng tôi tiếp tục so sánh trên 3 môi trƣờng cấp 1, cấp 2 và môi trƣờng sản xuất chúng tôi thu đƣợc một số kết quả sau: - Môi trƣờng cấp 1 Bảng 4.18: So sánh lƣợng acid tổng đƣợc tạo bởi L. acidophilus, L. bulgaricus và Diplococcus. Các yếu tố Các khuẩn lạc pH Nhiệt độ ( o C) Môi trƣờng cấp 1 (ml) Giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) L. acidophilus 6 37 10 MRS 10 24 10,41 L. bulgaricus 6 45 10 MRS 10 24 7,8 Diplococcus 5 37 10 MRS 10 24 13,26 42 Qua bảng 4.18 chúng tôi thấy lƣợng acid tổng đƣợc tạo ra bởi Diplococcus nhiều nhất, kế đến L. acidophilus và cuối cùng là L. bulgaricus - Môi trƣờng cấp 2 Bảng 4.19: So sánh lƣợng acid tổng đƣợc tạo ra bởi L. acidophilus, L. bulgaricus và Diplococcus Các yếu tố Các khuẩn lạc pH Nhiệt độ ( o C) Môi trƣờng cấp 2 (50 ml) Giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) L. acidophilus 6 37 45 MRS+ 5 mật rỉ 10 24 12,24 L. bulgaricus 6 45 45 MRS+ 5 mật rỉ 10 24 6,75 Diplococcus 5 37 45 MRS + 5 mật rỉ 10 24 13,02 Qua bảng 4.19 chúng tôi thấy lƣợng acid tổng đƣợc tạo bởi Diplococcus nhiều nhất, kế đến L. acidophilus và cuối cùng là L. bulgaricus. - Môi trƣờng sản xuất Bảng 4.20: So sánh lƣợng acid tổng đƣợc tạo ra bởi L. acidophilus, L. bulgaricus và Diplococcus Các yếu tố Các khuẩn lạc pH Nhiệt độ (oC) Môi trƣờng sản xuất (50 ml) Giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) L. acidophilus 6 37 5 MRS + 45 mật rỉ 10 24 22,2 L. bulgaricus 6 45 5 MRS + 45 mật rỉ 10 24 5,28 Diplococcus 5 37 5 MRS +45 mật rỉ 10 24 23,5 Từ bảng 4.20 chúng tôi thấy lƣợng acid tổng tạo bởi Diplococcus nhiều nhất, rồi tới L. acidophilus và cuối cùng là L. bulgaricus. 43 0 5 10 15 20 25 Cấp 1 Cấp 2 Sản xuất Môi trƣờng Ac id tổ ng ( g/ l ) L. acidophilus L. bulgaricus Diplococcus Biểu đồ: 4.7. So sánh lƣợng acid tổng tạo thành của 3 khuẩn lạc trên 3 môi trƣờng Qua biểu đồ 4.7 chúng tôi thấy Diplococcus tạo acid tổng nhiều nhất trên cả 3 môi trƣờng, tới L. acidophilus và cuối cùng L. bulgaricus. L. bulgaricus tạo acid tổng giảm dần từ môi trƣờng cấp 1 cho đến môi trƣờng sản xuất, môi trƣờng có chứa mật rỉ càng nhiều thì khả năng tạo acid tổng càng giảm, nên môi trƣờng mật rỉ không phù hợp, có thể môi trƣờng sữa phù hợp cho L. bulgaricus tạo acid hơn. Diplococcus tạo acid tổng nhiều nhất, tuy nhiên chƣa định danh đƣợc loài của nó nên không chọn để sản xuất acid lactic. L. acidophilus tạo acid tổng tăng nhiều từ môi trƣờng cấp 1 cho đến môi trƣờng sản xuất. Lƣợng acid tổng tạo thành cao hơn L. bulgaricus rất nhiều và chỉ thấp so với Diplococcus với số lƣợng nhỏ, hơn thế nó là vi khuẩn lactic đồng hình tạo acid lactic là chủ yếu từ quá trình lên men đƣờng. Chúng tôi thấy L. acidophilus phù hợp để lên men lactic nên chọn để sản xuất acid lactic. 4.5. Sản xuất acid lactic từ mật rỉ 4.5.1 Xác định đường khử - Thực hiện nhƣ phần phƣơng pháp, chúng tôi dựng đƣợc đồ thị tƣơng quan giữa nồng độ đƣờng và độ hấp thu OD 540 nm. 44 Bảng 4.21: Nồng độ glucose tƣơng ứng OD 540 nm Nồng độ glucose (mg/ml) OD 540 nm 0 0 0,1 0,172 0,2 0,475 0,3 0,791 0,4 1,037 0,5 1,308 Từ kết quả trên ta có đồ thị nhƣ sau: y=-0,0936+2,834x 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Nồng độ glucose (mg/ml) O D 5 40 n m Đồ thị 4. 1: Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa OD 540 nm và nồng độ glucose (mg/ml) - Dựa vào đồ thị chúng tôi đo đƣợc hàm lƣợng đƣờng khử của các mẫu nhƣ sau: + Mẫu mật rỉ chƣa xử lý có đƣờng khử: 176 mg/ml + Mẫu mật rỉ đã xử lý bằng H2SO4 có đƣờng khử : 244 mg/ml + Mẫu sau lên men có đƣờng khử : 198 mg/ml Lƣợng đƣờng khử trong mật rỉ ban đầu là 176 mg/ml. Sau khi xử lý mật rỉ lƣợng đƣờng khử là 244 mg/ml. Lƣợng đƣờng khử tăng là do H2SO4 biến đƣờng saccharose thành đƣờng glucose và fructose. Sau khi lên men lƣợng đƣờng khử còn 198 mg/ml. R 2 = 0,998 45 4.5.2. Định lượng vi sinh vật Các bƣớc tiến hành nhƣ phần phƣơng pháp, chúng tôi dựng đƣợc đƣờng chuẩn tƣơng quan giữa mật độ tế bào và độ hấp thu ở bƣớc sóng 610 nm. Bảng 4.22: Mật độ tế bào tƣơng ứng với OD 610 nm của khuẩn lạc L. acidophilus OD 610 nm Mật độ tế bào (N/ml) Log (N/ml) 0 0x10 6 0 0,1 32,2x10 6 7,508 0,2 61,9x10 6 7,792 0,3 110,4x10 6 8,043 0,4 175,7x10 6 8,245 0,5 321,9x10 6 8,508 Từ kết quả trên ta có đồ thị nhƣ sau: y=7,2833+2,453x 7,4 7,5 7,6 7,7 ,8 7,9 8 8,1 8,2 8,3 8,4 8,5 8,6 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 OD 610 nm Lo g (N /m l) Đồ thị 4.2: Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa OD 610 nm và mật độ tế bào của khuẩn lạc L. acidophilus. - Dựa vào đồ thị ta xác định đƣợc số lƣợng vi sinh vật + Số lƣợng vi sinh vật trƣớc khi lên men : 2877,5 x 106 tế bào/ml + Số lƣợng vi sinh vật sau khi lên men : 40,25 x 106 tế bào/ml R 2 = 0,997 46 - Tiến hành lên men Hình 4.15: Quá trình lên men lactic + Kết quả của quá trình lên men lactic từ mât rỉ đƣờng Lƣợng đƣờng khử cho vào lên men: 244 g/l, lƣợng đƣờng khử sau khi lên men: 198 g/l. Vậy hiệu suất chuyển hóa đƣờng khử: 18,85 %. Lƣợng giống cho vào lên men: 2877,5 x 10 6 tế bào/ml, lƣợng giống sau khi lên men: 40,25 x 106 tế bào/ml. Hiệu suất chuyển hóa đƣờng khử thấp và số lƣợng giống giảm do thiết bị lên men không có cánh khuấy làm cho quá trình trao đổi chất giữa L. acidophilus và đƣờng diễn ra chậm và bị ức chế nên L. acidophilus dễ tiến đến phase suy tàn và lƣợng đƣờng còn lại nhiều. Sau khi lên men thu đƣợc lƣợng acid lactic: 9,7 g. Lƣợng acid lactic thu đƣợc thấp do không có cánh khuấy làm giảm tiếp xúc giữa chất dinh dƣỡng và tế bào vi sinh vật. Cho nên khả năng trao đổi chất xảy ra chậm nên lƣợng acid lactic tạo thấp. Theo sơ đồ chuyển hóa acid lactic từ 1 phân tử glucose hoặc fructose chuyển hóa theo con đƣờng EMP cho ra 2 phân tử acid lactic, 180 g đƣờng glucose hoặc fructose tạo ra 180 g acid lactic vậy 46 g đƣờng glucose hoặc fructose chuyển hóa thành 46 g acid lactic. Hiệu suất chuyển hóa thành acid lactic: 21,1 %. Theo (Hui H. Y và ctv, 1994) cho rằng vi khuẩn lactic đồng hình chuyển hóa đƣờng tạo thành 90 % acid lactic. Lƣợng acid lactic thu đƣợc và hiệu suất của nó cao có thể do thiết bị lên men tốt (thiết bị có cánh khuấy) hay giống có chất lƣợng cao và thiết bị tách acid lactic bằng phƣơng pháp hiện đại. Nên quá trình trao đổi chất giữa vi sinh vật và cơ chất diễn ra mạnh hơn, bên cạnh đó chất lƣợng giống tốt làm cho quá trình lên men diễn ra nhanh hơn và cho năng suất cao hơn. Trong quá trình tách acid lactic, nếu tách acid lactic bằng thiết bị hiện đại thì giảm hao hụt acid lactic. 47 Đối với hiệu suất acid lactic của chúng tôi thu đƣợc thấp hơn của tác giả trên do thiết bị lên men không có cánh khuấy làm hạn chế khả năng tiếp xúc giữa L. acidophilus và cơ chất nên lƣợng acid lactic thu đƣợc thấp và có thể do quá trình tách và lọc acid lactic không đƣợc tốt nên lƣợng acid lactic thu đƣợc bị hao hụt. 48 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ các kết quả thu đƣợc chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau: - Phân lập và định danh đƣợc 3 dạng khuẩn lạc: L. acidophilus, L. bulgaricus và Diplococcus từ Antibio, Biolactyl và Đại mạch. - Đã khảo sát các điều kiện tối ƣu cho: + L. acidophilus: nhiệt độ tối ƣu 37o C, pH tối ƣu = 6, tỉ lệ mật rỉ = 10 %, tỉ lệ giống = 10 % và thời gian 24 giờ. + L. bulgaricus: nhiệt độ tối ƣu 45o C, pH tối ƣu = 6, tỉ lệ mật rỉ = 10 %, tỉ lệ giống = 10 % và thời gian 24 giờ. + Diplococcus: nhiệt độ tối ƣu 37o C, pH tối ƣu = 5, tỉ lệ mật rỉ = 10 %, tỉ lệ giống = 10 % và thời gian 24 giờ. - Diplococcus tạo acid tổng nhiều nhất, kế đến L. acidophilus và cuối cùng là L. bulgaricus trên 3 môi trƣờng cấp 1, cấp 2 và sản xuất. - Chọn L. acidophilus sản xuất acid lactic. 5.2. Đề nghị - Phân lập thêm nhiều khuẩn lạc tự nhiên để tuyển chọn các chủng vi khuẩn tạo acid lactic nhiều để phục vụ cho qui mô công nghiệp - Thiết kế bồn lên men mang tính qui mô công nghiệp - Hƣớng ứng dụng của sản phẩm acid lactic thu đƣợc: + Bảo quản và chế biến thực phẩm (dùng sản xuất dƣa chua, ủ chua rau quả, sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa.v.v.) + Y học (trong phẩu thuật chỉnh hình, trong nha khoa.v.v.) + Mỹ phẩm + Môi trƣờng 49 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Bùi Ái, 2003. Công nghệ lên men ứng dụng trong công nghệ thực phẩm. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh, trang 9-11. 2. Kiều Hữu Anh, 1999. Giáo trình vi sinh vật công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, trang 113-118. 3. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến và Phạm Văn Ty, 2000. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Giáo Dục, trang 141-160, 221-229. 4. Nguyễn Thị Nam Định, 2000. Phân lập-nhân giống vi khuẩn lactic từ dưa chua dùng cho sản phẩm lên men. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Thực phẩm, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, trang 5-8. 5. Vƣơng Thị Việt Hoa, 2002-2003. Thực tập vi sinh đại cương. Tủ sách Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh, trang 7-14, 39-49. 6. Dƣ Lý Thùy Hƣơng, 2000. Chọn và khảo sát vài đặc tính của vi khuẩn lactic để muối chua nấm rơm, măng, đậu. Luận văn thạc sĩ khoa học chuyên ngành vi sinh, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.Hồ Chí Minh, trang 13-17. 7. Lý Thành Kiệt và Huỳnh Văn Thuận, 2002. Bước đầu nghiên cứu phân lập và nhân giống hai khuẩn lạc vi khuẩn lactic streptococcus thermophilus và Lactobacillus bulgaricus để cung cấp giống cho chế biến yogurt ở quy mô nhỏ. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Thực phẩm, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh, trang 7-8. 8. Nguyễn Đức Lƣợng, 2001. Công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh, trang 278-280. 9. Nguyễn Đức Lƣợng, 2002. Công nghệ vi sinh, tập 2, Vi sinh vật học công nghiệp. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh, trang 322-336. 10. Nguyễn Đức Lƣợng và Cao Cƣờng, 2003. Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 1, thí nghiệm Hóa sinh. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh, trang 33-34. 11. Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền và Nguyễn Ánh Tuyết, 2003. Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 2, thí nghiệm Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh, trang 72-73, 414-434, 450-461. 12. Nguyễn Đức Lƣợng và Nguyễn Thị Thùy Dƣơng, 2003. Công nghệ sinh học môi trường, tập 2, Xử lý chất thải hữu cơ. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh, trang 195-209. 50 13. Bùi Thị Ngọc Phƣơng và Lê Thị Thủy, 2003. Thử nghiệm sản xuất bột giống vi khuẩn lactic streptococcus thermophilus và Lactobacillus bulgaricus dùng trong chế biến yaourt. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Thực phẩm, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh, trang 6-10. 14. Lê Xuân Phƣơng, 2001. Vi sinh vật công nghiệp. Nhà xuất bản Xây dựng, trang 157-161. 15. Trần Minh Tâm, 2000. Công nghệ vi sinh ứng dụng. Nhà xuất bản Nông nghiệp, trang 111-115. 16. Trần Linh Thƣớc, Nguyễn Đức Hoàng, Phan Thị Phƣợng Trang và Phạm Thị Hồng Tƣơi, 2001. Thực tập vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh, trang 52-56. 17.Lê Thị Hồng Tuyết, 2004. Nghiên cứu Bacteriocin sản xuất bởi Lactobacillus acidophilus NRRL B-2092. Luận văn thạc sĩ chuyên ngành vi sinh, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.Hồ Chí Minh, trang 4-9. TIẾNG ANH 18. Breed S. Robert, Murray D. G. E, and Hitchens Parker. A, 1948. Bergey ’ s manual determinative bacteriology. Sixth edition, The Williams &Wilkins Company. p. 305- 331, 349-361. 19. Hui H. Y, and Khachatourians G. George, 1994. Food Biotechnology Microorganisms. p. 249-254. 20. Jay M. James, 1996. Modern Food Microbiology. Fifth edition, ITP International Thomson Publishing. p.131-145. 21. Klein Harley Prescott, 1996. Microbiology. Third Edition, volumne two. p.124- 126. 22. Pelczar J. Michael, Chan E. C. S. Jr, and Krieg R. Noel, 1993. Microbiology concepts and applications. p. 873-874. 23. Salminen Seppo, 1961. Lactic Acid Bacteria, microbiology and functional Aspects. p. 4-15, 22-29. 24. Somogyi P. L, Ramaswamy S. H, and Hui H. Y, 1958. Biology, Principles and Applications. 25. Stanier Y. Roger, Doudoroff Michael, and Adelberg A. Edward, 1957. The Microbial World. p. 225-229. 51 Tài liệu trên mạng internet 26. ( -->) 27. 28. VACS Tạp chí Thế giới Phụ nữ. 29. --> Báo Ngƣời Lao Động - Tin thế giới <META content="text/html; 30. Sippy Kaur. Lactic acid fermentation 2001/Sippy/mikro400/sippy.htm 31. 32. Niju Narayanan, Pradip K. Roychoudhury, Aradhana Srivastava * , 2004. L(+) lactic acid fermentation and its product polymerization. Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458, 2004, vol. 17. 33. Niju Narayanan, Pradip K. Roychoudhury, Aradhana Srivastava * . Isolation of adh mutant of Lactobacillus rhamnosus for production of L(+) lactic acid. Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458, 2004, vol. 7. --> Full Text - Isolation of adh mutant of Lactobacillus rhamnosus for production of L(+) Lactic acid 34. Ralph P. Tittsler, Carl S. Pederson, Esmond E. Snell, David Hendlin, and Charles F. Niven, Jr. Symposium on the Lactic acid Bacteria 1 . Bublished by the American Society for Microbiology.1952 December, v 16(4): 227-260. 180749 --> symposium on the lactic acid bacteria bacteria1 <META http-equiv=Content-Type content="text/html 35. --> Ralph P. Tittsler, Carl S. Pederson, Esmond E. Snell, David Hendlin, and Charles F. Niven, Jr, 1952. symposium on the lactic acid bacteria 1 36. 52 37. 38. --> 39. --> 40. --> [Report] Global Fermentation Ingredients Market Research, Trends, Analysis <META content=text/html. 53 PHỤ LỤC 1. Thành phần một số loại môi trường 1.1. Môi trường MRS Broth (de Man, Rogosa and Sharpe Broth) [36] Pepton 10 g Cao thịt 10 g Cao nấm men 5 g Glucose 20 g Tween 80 1 g K2HPO4 2 g Sodium acetate 5 g Amonium citrate 2 g MgSO4.7H2O 0,2 g MnSO4.H2O 0,05 g Nƣớc cất 1000 ml Khử trùng ở 121o C trong 15 phút. Điều chỉnh pH = 6,2 - 6,5 1.2. Môi trường MRS agar (de Man, Rogosa and Sharpe agar) Từ môi trƣờng MRS Broth có bổ sung 2 % agar. Khử trùng ở 121o C trong 15 phút. 1.3. Môi trường YGC agar (Yeast extract Glucose Calcium carbonat) [37] Cao nấm men 10 g Glucose 20 g CaCO3 20 g Agar 15 g Nƣớc cất 1000 ml 1.4. Môi trường thử khả năng lên men đường [11] Pepton 10 g NaCl 5 g Cao thịt 1 g Phenol red (7,2 ml dung dịch phenol red 0,25 %): 0,018 g Nƣớc cất 1000 ml 54 Hòa tan 10g carbohydrate cho vào môi trƣờng dịch thể cơ bản này. Lấy từng thể tích 2,5 ml cho vào các ống nghiệm có chứa ống durham lật ngƣợc với ống nghiệm. Hấp tiệt trùng trong 10 phút ở 118o C. pH cuối = 7,4 ± 2 1.5. Môi trường thạch nitrate bán lỏng Cao thịt 3 g Pepton bột 5 g KNO3 1 g Nƣớc cất 1000 ml Điều chỉnh pH sau khi hấp: 6,8 - 7,2 1.6. Môi trường thử khả năng phân giải gelatin Môi trƣờng NB tổng hợp 10 g 10 % gelatin Nƣớc cất 1000 ml Điều chỉnh pH sau khi hấp: 6,8 - 7,2 1.7. Môi trường thạch bán lỏng di động Môi trƣờng NB tổng hợp 13 g Agar 5 g Nƣớc cất 1000 ml pH = 7,2 1.8. Môi trường thử khả năng sinh indol Môi trƣờng Nutrient Broth (NB) Cao thịt 5 g Pepton 10 g NaCl 5 g Nƣớc cất 1000 ml pH = 7,0 ± 0,2 2. Thuốc nhuộm và thuốc thử 2.1. Dung dịch thuốc nhuộm Bromocresol Purple 0,2% [11] Thuốc nhuộm tím bromocresol Purple 0,2 g Nƣớc cất (vô khuẩn) 100 ml Hòa tan 0,2 g thuốc nhuộm trong nƣớc cất và pha loãng đến 100 ml. 55 2.2. Thuốc nhuộm Gram [11] - Tím kết tinh Hucker + Dung dịch A Crystal violet (chất nhuộm chiếm 90 %) 2 g Ethanol 95 % 20 ml + Dung dịch B Ammonium oxalate 0,8 g Nƣớc cất 80 ml Trộn các dung dịch A và B lại với nhau. Bảo quản 24 giờ rồi lọc qua giấy lọc thô. Gram’s iodine: Iodine 1 g KI 2 g Nƣớc cất 300 ml Cho KI vào cối, thêm iodine và nghiền bằng chày trong 5 - 10 giây. Thêm 1 ml nƣớc rồi nghiền. Cho dung dịch này vào lọ, rửa cối và chày với lƣợng nƣớc đủ để đạt thể tích 300 ml. - Hucker’s counterstain (dung dịch sẵn) Safranin O 2,5 g Ethanol 95% 100 ml Thêm 10 ml dung dịch sẵn vào 90 ml nƣớc cất. 2.3. Thuốc thử Griess [5] Griess A Acid sulfanilic: Hòa tan 0,5 g acid sulfanilic vào 30 ml acid acetic bổ sung thêm 100 ml nƣớc cất, đem lọc. Dung dịch đƣợc bảo quản trong 1 tháng. Griess B α-naphtylamin: Hòa tan 0,1 g α-naphtylamin trong 100 ml nƣớc cất đun sôi. Để nguội rồi bổ sung thêm 30 ml acid acetic, đem lọc. Bảo quản trong 1 tuần 2.4. Thuốc thử uphenmen [11] Phenol 5 % 10 ml FeCl3 5 % 2 ml Nƣớc cất 25 ml 2.5. Thuốc thử DNS [10] 56 - Sodium potassium tartrate (hòa tan 300 g muối này vào 500 ml nƣớc). - 3,5-dinitrosalicylic acid: Hòa tan 10 g DNS vào 200 ml dung dịch NaOH 2 M. - Dinitrosalicylic dùng cho phản ứng:Trộn (1) và (2), thêm nƣớc cất cho đủ 1 lít. 2.6. Thuốc thử và hóa chất dùng chuẩn độ NaOH 0,1 N, phenolphtalein 1 % 3. Các phương pháp thực hiện 3.1. Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng Thực hiện: Định lƣợng acid lactic bằng dung dịch NaOH 0,1 N với chất chỉ thị phenolphtalein 1 %: cho vào bình tam giác dung tích 100 ml: 10 ml dịch lên men vi khuẩn, thêm vào 2 - 3 giọt phenolphtalein và 20 ml nƣớc cất trung tính. Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1 N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền vững. Thực hiện mẫu đối chứng là dung dịch chƣa lên men. Hàm lƣợng acid tổng (∑ a g/l) qui về acid lactic (xem nhƣ acid lactic là acid chủ yếu đƣợc tích lũy trong dịch lên men) là: ∑a =(Vt-V0) x 0,1 x 90/10 =(Vt-V0) x 0,9 Trong đó: Vt: Số ml dung dịch NaOH dùng trung hòa 10 ml dịch lên men; V0 : Số ml dung dịch NaOH dùng trung hòa 10 ml dịch đối chứng (dịch chƣa lên men). 3.2. Phương pháp nhuộm Gram - Dàn mỏng vi khuẩn thành vết bôi, để khô trong không khí - Cố định nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn (tránh làm nóng quá) - Nhuộm tiêu bản bằng crystal violet (tím kết tinh) trong 1 phút - Nhuộm lugol trong 1 phút - Rửa nƣớc - Tẩy bằng cồn trong khoảng 30 giây (hoặc để nghiêng tiêu bản, nhỏ từng giọt cồn cho đến khi thấy màu vừa hết trong các giọt nƣớc chảy ra) - Rửa nƣớc - Nhuộm bổ sung trong 10 - 30 giây bằng phẩm safranin hay fuschin - Rửa nƣớc - Làm khô, soi kính với vật kính dầu 57 Kết quả: vi khuẩn bắt màu tím là Gram dƣơng (G+). Vi khuẩn có màu hồng là Gram âm (G-). 3.3. Phương pháp xác định đường khử - Hút 3 ml dung dịch mẫu có chứa đƣờng vào một ống nghiệm. - Thêm vào 1 ml thuốc thử DNS. - Chuẩn bị ống thử không bằng cách thêm 1 ml thuốc thử DNS vào 3 ml nƣớc cất. - Dùng một miếng nilon sạch bịt kín đầu ống nghiệm, đặc vào nồi nƣớc đang sôi trong 5 phút. - Làm lạnh về nhiệt độ phòng và đo độ hấp thụ OD ở bƣớc sóng 540 nm. Dùng ống thử không để chuẩn độ truyền suốt về 100 %. - Dựa vào đƣờng chuẩn suy ra nồng độ đƣờng có trong dung dịch. Dựng đồ thị chuẩn + Cân chính xác 1 g glucose (dạng khô không ngậm nƣớc) hòa tan thành 200 ml với nƣớc. Sử dụng bình định mức. + Hút lần lƣợc 1, 2, 3, 4 và 5 ml dung dịch đƣờng này vào 5 bình định mức 50 ml. Thêm nƣớc cho đến vạch định mức. + Các dung dịch đƣờng mới pha này có nồng độ glucose lần lƣợc là 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 mg/ml. + Thực hiện phản ứng nhƣ trên . + Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên giữa nồng độ đƣờng và độ hấp thu OD 540 nm. 3.4. Phương pháp đếm khuẩn lạc - Tiến hành pha loãng bậc 10 liên tiếp mỗi huyền phù có độ đục xác định thành các độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7 nhƣ sau: + Chuẩn bị các ống eppendorf vô trùng chứa 0,9 ml NaCl 0,85% vô trùng đƣợc đánh số từ -1 đến -7. + Dùng pipetman và đầu tip 0,1 ml vô trùng hút 0,1 ml huyền phù tế bào vào ống - 1. Đậy nắp eppendorf, lắc kỹ. Nhƣ vậy ống -1 chứa huyền phù tế bào có độ pha loãng là 10 -1 . + Tiếp theo, dùng pipetman và đầu tip 0,1 ml vô trùng hút 0,1 ml huyền phù tế bào của ống -1 cho vào ống -2. Đậy nắp Eppendorf, lắc kỷ. Khi đó ống -2 chứa huyền phù tế bào có độ pha loãng là 10-2. + Thực hiện tƣơng tự để có các huyền phù tế bào với các độ pha loãng 10-2 - 10-7. 58 + Ứng với các huyền phù đƣợc pha loãng từ huyền phù ban đầu có OD 610 nm là 0,1 (hoặc xấp xỉ 0,1), dùng pipetman và đầu tip 0,1 ml vô trùng hút 0,1 ml các huyền phù có độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7 tuần tự vào 3 hộp petri môi trƣờng MRS agar đƣợc ghi chú độ pha loãng và mẫu huyền phù ban đầu (OD 610 nm 0,1). + Thực hiện tƣơng tự cho các mẫu huỵền phù ban đầu có OD 610 nm là 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. + Thao tác vô trùng dùng que cấy trang trải đều dịch chứa tế bào lên bề mặt môi trƣờng. Để khô, ủ 37oC trong 24 giờ. - Tính mật độ tế bào tƣơng ứng với các độ đục khác nhau. + Đếm số khuẩn lạc xuất hiện ở mỗi hộp petri. Sử dụng số liệu của độ pha loãng sao cho có 20 - 300 khuẩn lạc/hộp. Tính số tế bào (N) có trong 1 ml huyền phù ở mỗi độ đục từ số liệu của mỗi độ pha loãng nhƣ sau: Ndi= A x 10 x di (tế bào/ ml mẫu) A: Số khuẩn lạc đếm đƣợc trên đĩa. d: Số lần pha loãng i. + Tính mật độ tế bào trung bình ứng với mỗi độ đục từ các số liệu Ndi 3.5. Một số đặc điểm sinh hóa 3.5.1. Thử phản ứng catalase - Cách tiến hành: Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn, phết lên giữa lame kính sạch và khô, sau đó nhỏ H2O2 30 % lên vết vi khuẩn. Đọc kết quả khoảng 15 giây. - Kết quả + Catalase dƣơng tính: Có hiện tƣợng sủi bọt + Catalase âm tính : Không có hiện tƣợng sủi bọt. 3.5.2. Kiểm tra khả năng sinh indol - Cách tiến hành: Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trƣờng NB nuôi cấy ở 37 o C trong 24 giờ, sau đó nhỏ vài giọt thuốc thử Kowac’s vào môi trƣờng. - Kết quả + Phản ứng dƣơng tính: Lớp mặt môi trƣờng có màu đỏ. + Phản ứng âm tính: Lớp mặt có màu vàng. 3.5.3. Xem khả năng di động 59 - Cách tiến hành: Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn và cấy nhẹ nhàng từ trên xuống dƣới môi trƣờng NB (cách ống nghiệm khoảng 1 cm thì dừng lại) cho vào tủ ấm ở 37o C trong 24 giờ. - Kết quả: + Phản ứng dƣơng tính vi khuẩn mọc lan ra khỏi đƣờng cấy + Phản ứng âm tính vi khuẩn chỉ mọc trên đƣờng cấy 3.5.4. Khả năng khử nitrate - Cách tiến hành: Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn cấy sau vào trong môi trƣờng thạch nitrate bán lỏng, nuôi ở 37o C trong 24 giờ, nhỏ vào môi trƣờng 2 - 3 giọt Griess A, sau đó nhỏ tiếp 2 - 3 giọt Griess B. - Kết quả + Phản ứng dƣơng tính chuyển sang màu hồng + Phản ứng âm tính không đổi màu 3.5.5. Khả năng phân giải gelatin - Cách tiến hành: Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trƣờng canh NB đã có bổ sung 10 % gelatin, nuôi ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó để ống nghiệm vào ngăn mát tủ lạnh. - Kết quả: + Phản ứng dƣơng tính ở nhiệt độ < 20oC gelatin vẫn lỏng. + Phản ứng âm tính ở nhiệt độ < 20oC gelatin đông đặc 3.5.6. Khả năng đông tụ sữa - Cách tiến hành: Lấy 10 % giống vi khuẩn cho vào 10 ml sữa, ủ ở nhiệt độ 37o C trong 24 giờ. - Kết quả + Phản ứng dƣơng tính có đông vón + Phản ứng âm tính không có đông vón 3.5.7.Khả năng lên men nguồn carbohydrate - Khả năng đồng hóa và lên men các nguồn carbohydrate của vi khuẩn thƣờng không giống nhau. Đây là một trong những đặc tính quan trọng dùng để định danh vi 60 khuẩn. Sự khác nhau về khả năng sử dụng các nguồn thức ăn này phản ánh sự khác nhau về vật liệu di truyền của vi khuẩn qua việc tạo thành enzyme giúp cho quá trình đồng hóa thức ăn. - Pha chế môi trƣờng chứa các nguồn carbohydrate khác nhau: glucose, fructose, maltose, lactose, saccharose, mannitol, sorbitol, dextrin, glycerol với chỉ thị phenol red. - Cách tiến hành Cấy từng loại vi khuẩn vào các ống nghiêm chứa những môi trƣờng có các nguồn carbohydrate này. Nuôi cấy 4 ngày ở nhiệt độ 37o C. Môi trƣờng trƣớc khi cấy có màu đỏ. Sau khi nuôi cấy môi trƣờng ngả sang vàng tức là pH thay đổi nghiêng về phía acid, chứng tỏ sự lên men bởi vi khuẩn lactic đã xảy ra.