Đề tài Nghiên cứu phân lập và tác dụng gây độc của gossypol từ hạt bông (gossypium barbadense l.) trên một số dòng tế bào ung thư

Mở đầu Ung thư là căn bệnh gây tử vong hàng đầu hiện nay ở Việt Nam. Theo thống kê của Hội Ung thư TP. Hồ Chí Minh, hàng năm Việt Nam có khoảng 200.000 bệnh nhân ung thư mắc mới với khoảng 150.000 bênh nhân tử vong vì căn bệnh này, trong đó thường gặp nhất là ung thư phổi, ung thư gan, ung thư dạ dày ở nam giới ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư phổi ở nữ giới. Phần lớn bệnh nhân được phát hiện đã ở giai đoạn muộn, tỷ lệ chữa khỏi bệnh thấp, chi phí điều trị bệnh cao và kéo dài. Các thuốc ung thư thế hệ mới thường có giá thành cao nên ít bệnh nhân có điều kiện tiếp cận trong khi các thuốc hoá trị liệu cổ điển mặc dù có giá thành hạ nhưng nhiều tác dụng phụ. Gossypol là một hợp chất polyphenol được tìm thấy trong hạt của các loài thuộc chi bông Gossypium, họ Malvaceae. Gossypol đã được biết điến với rất nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như tác dụng chống ôxy hoá, tránh thai nam, chống ký sinh trùng, chống HIV và chống ung thư. Gần đây, gossypol đã thu hút sự chú ý của các nhà khoa học với vai trò là một chất “mimetic BH3” (bắt chước BH3) trong tự nhiên, có khả năng ức chế các protein anti-apoptosis thuộc họ Bcl-2. Các protein này thường được biểu hiện quá mức ở một số loại tế bào ung thư, làm cho các tế bào ung thư không chết theo chương trình (apoptosis), trở nên kháng thuốc hoặc kém nhạy cảm với các thuốc hoá trị liệu. Gossypol (cũng như một số thuốc đang được thử nghiệm trên lâm sàng khác như ABT-263, obatoclax (GX15-070) có tác dụng ức chế các protein anti-apoptosis từ đó giúp cho các tế bào ung thư có thể chết theo chương trình, giảm sự kháng thuốc hoặc giúp cho các tế bào ung thư trở lên nhạy cảm hơn với các thuốc hoá trị liệu. Gossypol có 2 đồng phân quang học là (-)-gossypol và (+)-gossypol, trong đó (-)-gossypol được xem là có nhiều hoạt tính sinh học mạnh hơn (+)-gossypol như tác dụng chống ung thư, tránh thai nam, chống HIV. Hiện nay, (-)-gossypol là thuốc đầu tiên được sử dụng theo đường uống tác dụng đến đích Bcl-2 đang được thử nghiệm trên lâm sàng pha II tại Mỹ. Ở nước ta, bông vải là loại cây công nghiệp được trồng phổ biến, chủ yếu để cung cấp xơ bông phục vụ cho ngành công nghiệp dệt may. Hiện nay, diện tích bông vải được trồng tại Việt Nam ước đạt 8.500 ha, dự kiến đến năm 2020 diện tích bông vải tại Việt Nam lên đến 76.000 ha. Mặc dù nguồn nguyên liệu dồi dào và có nhiều tác dụng sinh dược học có giá trị nhưng gossypol từ hạt bông vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu ở nước ta đặc biệt là từ loài Gossypium barbadense L, thường được biết đến là loài có hàm lượng gossypol cao và có chứa nhiều (-)-gossypol, dạng đồng phân có hoạt tính sinh học mạnh hơn. Xuất phát từ thực tế nêu trên chúng tôi thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC CỦA GOSSYPOL TỪ HẠT BÔNG (GOSSYPIUM BARBADENSE L.) TRÊN MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ” Đề tài được thực hiện với những mục tiêu như sau: - Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và tinh chế gossypol từ hạt bông Gossypium barbadense L. - Nghiên cứu phương pháp tách đồng phân (-)-gossypol và (+)-gossypol từ hỗn hợp gossypol racemic. - Nghiên cứu độc tính tế bào của các sản phẩm (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol đã phân lập được trên 3 dòng tế bào ung thư người. Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Chi Gossypium 1.1.1. Vài nét về cây bông hải đảo (Gossypium barbadense L.) và chi Gossypium Bông hải đảo (Gossypium barbadense L.) thuộc chi bông Gossypium, là loại cây ưa sáng, thích hợp với điều kiện khô hạn. Cây bụi cao 2-3 m. Thân cành có lông, màu tím, điểm chấm đen. Lá mọc so le hình tim rộng, 3-5 thuỳ hình trứng hoặc bầu dục, thuỳ giữa dài, thuỳ bên to. Hoa màu vàng nhạt, cuống hoa có màu đen, tiểu đài có 3 lá bắc hoặc nhiều hơn, hình trứng rộng, đài hình chén, có tuyến, tràng dài hơn tiểu đài. Quả nang hình bầu dục, hạt hình trứng nhọn, màu vàng nhạt, sợi trắng rất dễ rụng. Mùa hoa quả từ tháng 6 đến tháng 10 [4]. Hình 1.1. Bông hải đảo (Gossypium barbadense L.) Chi Bông, Gossypium thuộc họ Malvaceae, bao gồm 39-40 loài khác nhau, trong đó các loài có giá trị thương phẩm được trồng phổ biến trên thế giới bao gồm: G. hirsutum, G. barbadense, G. arboreum và G. herbaceum. Ở Việt Nam, có 5 loài thuộc chi bông là G. hirsutum, G. barbadense, G. arboreum và G. herbaceum và G. acuminatum [1]. Cây bông là loại cây duy nhất trong tự nhiên được sử dụng vừa làm thực phẩm, vừa để cung cấp sợi. Cây bông được trồng ở vùng nhiệt đới hay á nhiệt đới ở khắp nơi trên thế giới. Trong liên vụ 2003-2004, sản lượng sợi bông trên toàn thế giới ước đạt 88 triệu kiện, trong đó đứng đầu là Trung Quốc, tiếp theo là Mỹ, Ấn Độ và Pakistan chiếm xấp xỉ 3/4 sản lượng bông của toàn thể giới [71]. Hạt bông là một trong các loại hạt có hàm lượng dinh dưỡng cao, chứa từ 16-24% protein và từ 13-24% dầu trong tổng khối lượng nhân hạt. Cùng với sợi bông thì dầu và các protein từ hạt bông là hai sản phẩm chủ yếu từ cây bông. Dầu ép từ hạt bông sau khi loại bỏ gossypol được dùng làm dầu ăn, dùng trong công nghiệp đồ hộp hoặc làm xà phòng. Dầu hạt bông gồm các acid béo không no (acid oleic 40-50%, linoleic 25-30%), các acid béo no (acid palmatic, stearic 20-25%). Hiện nay, trong nhóm các sản phẩm dầu từ hạt trên thế giới, dầu hạt bông đứng vị trí thứ 3 (50 triệu tấn) sau dầu đậu nành (242 triệu tấn) và dầu hạt cải (52 triệu tấn) [72]. Khô dầu hạt bông có hàm lượng protein cao (40-42%) được sử dụng làm thức ăn gia súc hay làm phân bón. Trong hạt bông còn có các flavonoid là các glucoside của quercetol và kaempferol và chất màu gossypol [4]. Ở Việt Nam, cây bông là cây công nghiệp quan trọng đã được nhà nước đưa vào chương trình phát triển chiến lược để hướng tới phục vụ cho ngành công nghiệp dệt may. Hiện nay, diện tích trồng bông tại Việt Nam tập trung chủ yếu ở Tây Nguyên (42%), vùng duyên hải miền Trung (33%), miền Bắc (20%) và Đông Nam bộ (5%). Diện tích trồng cây bông vải của nước ta liên vụ 2009-2010 ước đạt 8.500 ha, sản lượng hạt bông thu được ước đạt 10.000 tấn và sản lượng xơ bông ước đạt 3.500-3.700 tấn. Tuy nhiên, với sản lượng xơ bông nêu trên chỉ đáp ứng được khoảng 2% nhu cầu của ngành công nghiệp diệt may. Hiện nay, diện tích trồng cây bông vải nước ta vẫn đang được tiếp tục mở rộng, ước tính đến năm 2020 diện tích trồng bông tại Việt Nam sẽ tăng lên 76.000 ha [72]. 1.1.2. Sự tồn tại của gossypol trong chi Gossypium Gossypol là một hợp chất polyphenol đã được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh dược học có giá trị như tác dụng tránh thai, chống ung thư, chống virus ,... Trong hạt bông, gossypol tồn tại chủ yếu trong các tuyến chất mầu bên trong nhân. Hình 1.2 là lát cắt ngang của hạt bông cho thấy các tuyến chất mầu này phân bố dày đặc bên trong nhân hạt, kích thước của các tuyến này trong khoảng 50-100 µm. Gossypol chiếm 90% lượng sắc tố trong các tuyến, chiến khoảng 39-50% tổng khối lượng của tuyến và thông thường chiếm khoảng 0,4-1,7% khối lượng của nhân hạt [23]. Hình 1.2. Lát cắt ngang của hạt bông với các tuyến chất mầu Ngoài hạt bông, gossypol còn được tìm thấy bên trong một số bộ phận khác của cây bông như vỏ rễ của cây, lá, vỏ hạt và hoa. Mặt khác, hàm lượng gossypol cũng dao động lớn, phụ thuộc vào từng loài, giống bông, điều kiện khí hậu, đất đai của từng vùng, lượng nước và phân bón sử dụng. G. barbadense được biết đến là loài có hàm lượng gossypol cao, hàm lượng gossypol tổng số trong hạt của loài này trong khoảng 0,3-3,4% [42]. Do có hoạt tính sinh dược học khác biệt nên tỷ lệ hai đồng phân quang học (+)- và (-)-gossypol trong hạt của các loài bông khác nhau đã được nghiên cứu nhiều. Tỷ lệ (+)-gossypol : (-)-gossypol đã được báo cáo là rất khác nhau trong các giống và loài bông thương phẩm, dao động từ 95 : 5 đến 31 : 69, nhưng thông thường tỷ lệ này là 3 : 2 trong G. hirsutum trong khi ở G. barbadense là 2 : 3 . Tỷ lệ (+)- và (-)-gossypol trong G. arboreum (77 : 23), G. barbadense (44 : 56) và G. herbaceum (68 : 32) [25]. Cass và cộng sự đã báo cáo tỷ lệ (+)- và (-)-gossypol trong G. mustelinum (57 : 43 và 65 : 35), G. herbaceum (63 : 37) và giống lai giữa G. herbaceum và G. hirsutum (48 : 52) [11]. Tỷ lệ (+)- và (-)-gossypol trong một giống bông nhất định gần như không thay đổi dưới tác động của môi trường. Nghiên cứu trên một số lượng lớn các giống G. hirsutum và G. barbadense thương mại cho thấy rằng với một giống cây trồng nhất định, môi trường có tác động đến lượng gossypol tổng số trong hạt nhưng không ảnh hưởng đến tỷ lệ (+)- và (-)-gossypol [52]. Hơn nữa, tỷ lệ (+)- và (-)-gossypol vẫn không đổi trong một cây nhất định bất chấp hạt đó được lấy từ quả thu hái từ đầu hay cuối vụ hoặc hạt từ quả đó ở gốc hay đỉnh của cây. 1.2. Đặc tính của gossypol 1.2.1. Đặc tính lý hoá học của gossypol Gossypol (1,1’6,6’,7,7’-hexahydroxy-5,5’-di-isopropyl-3,3’-dimethyl-(2,2’-binaphthalene)-8,8’-dicarboxaldehyde) là một hợp chất polyphenol mầu vàng, được tìm thấy chủ yếu trong các loài thuộc chi bông Gossypium họ Malvaceae. Ngoài ra, gossypol còn được tìm thấy trong vỏ và hoa của cây nhiệt đới Thespesia populinea, một loại cây phổ biến ở Châu Phi, Châu Á và các đảo ở Thái Bình Dương. Gossypol có cấu tạo gồm 2 khung naphtalene đối xứng, mỗi khung chứa 3 nhóm -OH và 1 nhóm -CHO (Hình 1.3). Hình 1.3. Cấu tạo của gossypol Do có chứa các nhóm phân cực (6 nhóm hydroxyl và 2 nhóm aldehyde) nên gossypol tan trong nhiều dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, isopropanol, dioxane, diethyl ether, acetone, ethyl acetate, chloroform, carbon tetrachloride, phenol, pyridine, naphthalene nóng chảy, và dầu thực vật nóng. Nó ít tan trong glycerine, cyclohexane, benzene, gasoline và ete dầu. Tuy nhiên do sự có mặt của 2 nhóm dialkylnaphthalene làm cho nó không tan trong nước. Điểm chảy của tinh thể gossypol tinh sạch phụ thuộc vào dung môi dùng để kết tinh nó. Gossypol kết tinh trong diethyl ether có điểm chảy là 184ºC, trong chloroform có điểm chảy là 199ºC, trong ligroin có điểm chảy là 214ºC [27]. Gossypol tồn tại ở hai dạng đồng phân quang học là R hay (-)-gossypol và S hay (+)-gossypol do sự giới hạn khả năng quay của cầu liên kết 2, 2’-binaphthyl (Hình 1.4). Cả hai dạng đồng phân này đều có nhiều trong hạt bông tuy nhiên tỷ lệ của chúng là khác nhau tùy theo từng giống và loài. Ví dụ trong các giống bông Gossypium barbadense, (-)-gossypol thường chiến ưu thế, trong khi đó đồng phân (+)-gossypol lại chiếm ưu thế hơn trong Gossypium hirsutum. Hình 1.4. Các dạng đồng phân quang học của gossypol Hoạt tính sinh dược học của (-)-gossypol và (+)-gossypol khác nhau nên độ bền của các đồng phân quang học này rất được quan tâm nghiên cứu. Jaroszewski đã tiến hành thí nghiệm racemic hoá (+)-gossypol bằng nhiệt độ, sử dụng hệ dung môi nước : dioxane (1 : 3). Kết quả cho thấy không có quá trình racemic hoá xảy ra sau khi gia nhiệt kéo dài (15 giờ) ở 90ºC [25]. Do (-)-gossypol không thể trực tiếp phân lập từ nguồn nguyên liệu thực vật nên các phương pháp phân lập (-)-gossypol tinh khiết quang học được phát triển dựa trên phương pháp kết tinh [49] hay sắc ký các hỗn hợp racemic của gossypol sau khi đã tạo dẫn xuất diastereoisomer của gossypol, đặc biệt là dẫn xuất bazơ Schiff [26]. Gossypol tồn tại ở 3 dạng tautomeric khác nhau là: aldehyde, ketone và hemiacetal trong các dung môi khác nhau (Hình 1.5). Trong các hệ dung môi thông dụng, gossypol tồn tại chủ yếu ở dạng ketone, nhưng trong các loại dung môi trơ như chloroform, acetone, dioxane hay trong điều kiện acid, gossypol tồn tại chủ yếu ở dạng aldehyde. Trong các dung môi phân cực như dimethyl sulfoxide (DMSO) trong môi trường kiềm, gossypol tồn tại ở trạng thái cân bằng giữa các dạng hemiacetal, dạng aldehyde và dạng ketone. Vì vậy, gossypol thường được hòa tan trong DMSO khi nghiên cứu hoạt tính sinh học, khi đó các dạng tautomeric của gossypol có thể cùng đóng góp vào hoạt tính sinh học của nó. Hình 1.5. Các dạng đồng phân tautomer của gossypol Marchlewski, người đầu tiên phân lập gossypol acetic acid (G-AA) cho thấy gossypol dễ bị ôxy hoá trong dung dịch kiềm, có mầu đỏ sáng với dung dịch H2SO4 đậm đặc, mầu xanh đậm trong FeCl3. Tính chất hoá học của gossypol chủ yếu là do các nhóm carbonyl, hydroxyl cũng như là cấu trúc cồng kềnh của khung binaphthlene quyết định. Gossypol có thể phản ứng với các hợp chất khác để tạo thành gossypol liên kết (bound gossypol). Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, phần lớn gossypol tồn tại ở dạng basơ Schiff bởi phản ứng giữa nhóm aldehyde của gossypol với nhóm amino của các protein trong quá trình chế biến hạt bông. Bên cạnh đó, gossypol có thể tạo phức càng cua với sắt trong các sản phẩm từ hạt bông để tạo thành phức kim loại không tan, nó cũng có thể bị ôxy hóa hoặc tạo thành dạng gossypol polymer. Các nhóm –OH phenol của gossypol có thể phản ứng với các acid carboxylic và các phenol khác trong hạt bông để tạo thành các este hoặc ether tương ứng [27]. 1.2.2. Đặc tính sinh dược học của gossypol 1.2.2.1. Tác dụng tránh thai cho nam Gossypol đã được nghiên cứu sâu với vai trò là một thuốc tránh thai trên các mô hình in vivo bao gồm chuột cống, chuột nhắt, khỉ, chuột đồng, thỏ, bò và cả trên người. Khi cho uống G-AA với liều 5-10 mg/kg thể trọng trong vòng 12 tuần thì gây vô sinh trên chuột đực. Trên thỏ đực, với liều từ 1,25-10 mg/kg thể trọng/ngày trong vòng 5-14 tuần làm giảm khả năng di động của tinh trùng nhưng không làm giảm số lượng tinh trùng. Khi cho khỉ đực trưởng thành uống G-AA với liều 5 hay 10 mg/kg thể trọng trong vòng 6 tháng cho thấy nồng độ và khả năng di động của tinh trùng giảm, mặc dù không có sự khác biệt về nồng độ testosterone trong máu [49]. Nghiên cứu cho thấy (-)-gossypol có hoạt tính tránh thai manh hơn (+)-gossypol. Sử dụng (+)-gossypol với liều 30 mg/kg theo đường uống trong vòng 14 ngày không những không có hoạt tính tránh thai mà còn gây độc trên chuột cống đực. Trong khi đó, (-)-gossypol với liều 30 mg/kg thể trọng theo đường uống trong vòng 7 ngày thể hiện rõ hoạt tính tránh thai trên chuột cống đực [61]. Thử nghiệm lâm sàng trên 10.000 người đàn ông tình nguyện Trung Quốc vào năm 1978, liều 20 mg/ngày, trong 75 ngày, sau đó với liều duy trì 50 mg/tuần cho thấy chỉ có một số ít trường hợp (0,75%) bị tăng kali huyết, và 10% số đàn ông dùng gossypol trên 1 năm không phục hồi được quá trình tạo tinh trùng. Một thử nghiệm quốc tế khác trên 151 đàn ông Brazil, Nigeria, Kenya và Trung Quốc cho thấy, khi dùng 15 mg gossypol/ngày trong 12 đến 16 tuần, sau đó dùng liều 7,5-10 mg/ngày trong vòng 40 tuần không gây triệu chứng tăng kali huyết và quá trình tạo tinh trùng được phục hồi sau khi dừng sử dụng gossypol [14]. 1.2.2.2. Hoạt tính chống virus, vi sinh vật và động vật nguyên sinh Lin và cộng sự (1989) đã báo cáo gossypol ức chế quá trình tái bản của virus HIV loại 1 (HIV-1) và ông nhận thấy rằng (-)-gossypol (IC50 = 5,2 µM) ức chế mạnh hơn (+)-gossypol (IC50 = 50,7 µM) [33]. Bên cạnh đó, gossypol cũng cho thấy khả năng chống lại các loại virus khác bao gồm virus herpes simplex loại 2 (HSV-2), virus cúm, và á cúm [57]. Đặc tính chống vi sinh vật của gossypol cũng đã được nghiên cứu. Gossypol có hoạt tính kháng nấm với giá trị LD50 khoảng từ 20-100 ppm và có tác dụng ức chế mạnh các vi sinh vật bao gồm bào tử trong không khí, lactobacilli và một số nấm. Vadehra và cộng sự (1985) đã nghiên cứu tác động của gossypol lên sự sinh trưởng của một số loại vi khuẩn, sự hình thành và nảy mầm của bào tử Bacillus cereus. Các tác giả đã nhận thấy rằng gossypol có tác dụng kháng các vi khuẩn gram dương (ví dụ: Streptococus spp, Bacillus spp, Staphylococus aureus) mạnh hơn so với các vi khuẩn gram âm như Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp, Shigela spp và Escherichia coli. Nhóm nghiên cứu cũng nhận thấy các loại nấm như Saccharomyces cereviseae, S. uvarum, S. diasticu cũng nhạy cảm với gossypol, sự sinh trưởng của chúng bị ức chế hoàn toàn ở nồng độ 50 ppm gossypol [55]. Bệnh sốt rét ở người thường được gây ra bởi sự lây nhiễm của các ký sinh trùng như Plasmodium falciparum, P. malariae, P. ovale và P. vivax. Hàng năm có khoảng 350-500 triệu trường hợp lây nhiễm với hơn 1 triệu người chết vì bệnh sốt rét. Gossypol cho thấy khả năng kháng ký sinh trùng sốt rét P. falciparum với giá trị IC50 trong khoảng 7 đến 28 µM. Một số dẫn xuất của nó cũng cho thấy khả năng kháng ký sinh trùng sốt rét (IC50 trong khoảng 12 đến 83 µM), trong đó tác dụng mạnh nhất là dẫn xuất 1,1’ nitrile gossylic của nó với IC50 là 13 µM trên P. falciparum [44]. Hoạt tính chống sốt rét của gossypol và dẫn xuất thông qua sự ức chế LDH, một enzyme quan trọng nhất trong chu trình sống kỵ khí của P. falciparum. Nghiên cứu trên Entamobea histolytica cũng cho thấy gossypol có khả năng ức chế alcohol dehydrogenase và các malic enzyme, (-)-gossypol có hoạt tính mạnh hơn gossypol racemic và (+)-gossypol. (-)-Gossypol có hoạt tính ức chế malic enzyme mạnh hơn 3,6 và 13 lần so với gossypol racemic và (+)-gossypol. Tác dụng ức chế alcohol dehydrogenase của (-)-gossypol mạnh gấp 1,9 và 2,9 lần so với gossypol racemic và (+)-gossypol [45]. Gossypol cũng đã được báo cáo là có khả năng ức chế Trypanosome, một ký sinh trùng gây bệnh mãn tính được gọi là ốm ngủ (sleeping sickness) với IC50 khoảng 7,8 ppm sau 24 h xử lý với gossypol. Trên T. crizi gossypol ức chế các oxidoreductase như alpha-hydroxyacid và malate dehydrogenase, các enzyme liên kết với NAD và glutamate dehydrogenase, malic enzyme, glucose-6-phosphate dehydrogenase, các enzyme phụ thuộc vào NADP [16]. Theo đó, cơ chế chống ký sinh trùng của gossypol có thể là sự ức chế chọn lọc các enzyme thiết yếu của ký sinh trùng. 1.2.2.3. Hoạt tính chống ôxy hoá Giống như nhiều hợp chất phenolic khác như coumaric acid, gallic acid, quercetin, myricetin, catechin, gallocatechin, gossypol cũng là một chất chống ôxy hoá tự nhiên hiệu quả. Ví dụ, gossypol có khả năng bảo vệ caroten chống lại các peroxide béo in vitro. Các sản phẩm từ hạt bông chứa gossypol có khả năng ức chế quá trình phân huỷ và ôi của carotene in vitro. Gossypol cũng có thể đóng vai trò là chất chống ôxy hoá bảo vệ caroten in vivo. Gossypol có khả năng ức chế quá trình peroxy hoá các vi thể gan chuột khi ủ với ferric/ascorbate (IC50 < 0,1 µM) [28]. Gossypol còn có tác dụng làm bền dầu biodiesel hạt bông. Với nồng độ 0,1% gossypol, chỉ số bền với quá trình ôxy hoá (oxidation stability indices) của dầu biodiesel hạt bông tăng từ 4,15 h lên đến 17,2 h ở 110ºC [18]. Hoạt tính chống ôxy hoá của các dẫn xuất bazơ Schiff của gossypol như gossypol-urê, gossypol-benzene-thiol và gossypol glycineindicate cũng có hoạt tính chống ôxy hoá tương đương với gossypol. Ngược lại, khi thay đổi các nhóm –OH phenol của gossypol lại làm giảm hoạt tính chống ôxy hoá, khả năng thu dọn gốc tự do, lực khử và khả năng ngăn cản sự phá huỷ ADN của gossypol. [64, 65]. Điều này đã chứng tỏ rằng các nhóm hydroxyl đóng vai trò quyết định hoạt tính chống ôxy hoá của gossypol. Ví dụ, 6-methoxy gossypol có hoạt tính thu dọn gốc tự do tương tự như 6, 6’-dimethoxy gossypol, trong khi đó gossypol có hoạt tính thu dọn gốc tự do mạnh hơn các dẫn xuất methyl hoá của nó. Tác dụng của gossypol và các dẫn xuất methyl hoá của nó chống lại sự phá huỷ ADN gây bởi tia cực tím và hydrogen peroxyde cũng phù hợp với tác dụng chống ôxy hoá của chúng. Điều này đã chỉ ra rằng tác dụng bảo vệ ADN của gossypol một phần nào đó là do quá trình dập tắt các gốc tự do, từ đó làm giảm bớt stress ôxy hoá. Trong một nghiên cứu trước đây cũng chứng minh gossypol có tác dụng phụ thuộc theo liều, bảo vệ ADN plasmid siêu xoắn khỏi bị phá huỷ dưới tác động của Fe3+/ascorbate [30]. 1.2.2.4. Tác dụng chống ung thư Tác dụng chống ung thư của gossypol lần đầu tiên được Tuszinsky và Cossu phát hiện vào năm 1984. Họ đã tiến hành nghiên cứu tác động của gossypol lên sự sinh trưởng của một số dòng tế bào ung thư của người như melanoma (WM9, WM56, WM164), ung thư biểu mô ruột kết (SW407, SW1084, SW1116), dòng erythroleukemia (K562), adenocarcioma (HT3) và trên dòng nguyên bào sợi bình thường của phổi phôi thai (WI38). Kết quả cho thấy các dòng tế bào melanoma và ung thư biểu mô ruột kết của người nhạy cảm với gossypol nhất, với giá trị IC50 vào khoảng 5 µM. Trong khi đó các dòng tế bào ung thư khác và dòng nguyên bào sợi bình thường chỉ nhạy cảm với gossypol ở nồng độ trên 20 µM. Mặc dù gossypol có độc tính tế bào cao trên môi trường nuôi cấy nhưng liều gây chết của nó lại khá cao (LD50 = 2400 mg/kg) trên chuột cống, điều này đã chỉ ra rằng gossypol có độc tính thấp in vivo trên các mô bình thường. Với độc tính thấp của gossypol trên in vivo cùng với tác dụng đặc hiệu của nó trên một số dòng tế bào ung thư làm cho gossypol rất có tiềm năng làm thuốc điều trị ung thư [53]. Kể từ đó đã có rất nhiều báo cáo về tác dụng chống ung thư in vitro của gossypol trên các tế bào ung thư khác nhau như ung thư buồng trứng (IC50 từ 1,5-3,8 µM) [66], ung thư tiền liệt tuyến (IC50 = 10 µM) [68], ung thư vú ( MCF-7, IC50 = 3,4-24 µM) [7, 24, 64], ung thư dạ con (IC50 = 2,9-14 µM) [29], ung thư tuyến thượng thận (IC50 = 1,3-2,9 µM) [29], ung thư phần tuỷ tuyến giáp (IC50 = 18,9 µM) [29], ung thư phổi (IC50 = 0,5 µM trên A549 và 30 µM trên H69) [13, 51], ung thư ruột (IC50 =17 µM) [64], ung thư máu (IC50 = 8,3-15 µM) [51, 38], ung thư tụy (IC50 = 3 µM) [7], ung thư da tế bào hình vảy (IC50 = 2,5-10 µM) [40] và melanoma (IC50 = 2,4-5 µM) [24]. Ở Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Đăng Quân và cộng sự cho thấy hỗn hợp gossypol racemic phân lập từ hạt bông Gossypium hirsutum trrồng tại Việt Nam có tác dụng ức chế phân bào trên hai dòng tế bào ung thư người là dòng tế bào ung thư cơ RD (Rhabdomyosarcoma) và dòng tế bào ung thư biểu bì HEp2 (Epidermoid carcinoma). Tuy nhiên các tác giả không đưa ra giá trị IC50 của hỗn hợp gossypol racemic trên 2 dòng tế bào được khảo sát [3]. Một số nghiên cứu đã chứng minh (-)-gossypol có độc tính tế bào mạnh hơn so với (±)-gossypol và (+)-gossypol. Nghiên cứu cho thấy (-)-gossypol có độc tính tế bào mạnh hơn 2-14 lần so với (+)-gossypol trên các dòng tế bào người [7]. Đặc biệt hoạt tính chống ung thư của (-)-gossypol cũng đã được so sánh với các thuốc thường dùng để điều trị cho bênh nhân melanoma, ung thư phổi và ung thư máu. (-)-Gossypol có hoạt tính cao hơn cisplatine, melphalan, dacarbazine trên 2 dòng melanoma, cisplatine và daunorubicin trên dòng ung thư phổi, (-)-gossypol cũng có hoạt tính mạnh hơn hydroxyure và busulphan trên một số dòng ung thư máu [50]. Gossypol cũng có tác dụng chống lại các dòng tế bào ung thư kháng với các thuốc chống ung thư đã được sử dụng trên lâm sàng như adriamycin, vinblastine, cisplatine [24]. Điều đáng lưu ý là (-)-gossypol thể hiện độc tính tế bào một cách chọn lọc được thể hiện bằng liều gây độc của nó trên các dòng tế bào thường cao hơn so với các dòng tế bào ung thư. (-)-Gossypol có hoạt tính chống tăng sinh gấp 5-10 lần trên các dòng tế bào ung thư khi so sánh với các tế bào gan bình thường trên môi trường nuôi cấy [6]. Trong nghiên cứu của Oliver và cộng sự, (-)-gossypol ức chế sự sinh trưởng của 10 dòng tế bào ung thư biểu mô hình vảy ở đầu và cổ với IC50 trong khoảng 2.5-10 µM, trong khi đó giá trị này trên nguyên bào sợi bình thường cao gấp 2-10 lần và trên keratinocyte cao gấp 2-3 lần [41]. Cơ chế gây độc tế bào của gossypol cũng đã được nghiên cứu. Gossypol đã được biết đến từ những năm 1990 với vai trò là một chất ức chế các enzyme trong tế bào chất và ty thể có liên quan đến quá trình tạo năng lượng của tế bào [58], ức chế các enzyme liên quan đến quá trình tái bản và sửa chữa ADN bao gồm ADN-polymerase α, topoisomerase II và làm cản trở quá trình tổng hợp ADN. Với nồng độ 10 µM, gossypol đã được báo cáo là đã có tác dụng ức chế quá trình tổng hợp ADN bằng cách cản trở checkpoint G1/S trên MCF-7 sau 24 h [32]. Gossypol có thể điều hoà chu trình tế bào bằng cách điều biến protein điều khiển chu trình tế bào Rb và cyclin D1 và quá trình phosphoryl hoá Rb. Xử lý tế bào Ramos với gossypol không chỉ gây dừng chu trình tế bào ở pha G0/G1 mà còn làm tăng quá trình apoptosis và ức chế sinh trưởng của tế bào gây ra bởi etoposide (VP-16), doxorubicin hydrocloride (ADM), vincristine (VCR), và paclitaxel (Taxol) [31]. Gossypol cũng đã được chứng minh là gây ra apoptosis trên nhiều dòng tế bào ung thư như các tế bào ung thư ruột kết [67], ung thư máu [17], ung thư tiền liệt tuyến [67], ung thư bàng quang [34]. Trong các nghiên cứu này, tác dụng gây apoptosis của gossypol đã được chứng minh thông qua sự điều hoà biểu hiện các thành viên trong họ protein Bcl-2, một họ protein ở màng ngoài ty thể, có vai trò quan trọng trong quá trình hoạt hoá các caspase. Trên dòng tế bào ung thư bàng quang là UM-UC2 (dòng nhạy cảm với thuốc) và UM-UC9 (dòng kháng thuốc), (-)-gossypol làm giảm biểu hiện của các protein anti-apoptosis trong họ Bcl-2 là Bcl-2, Bcl-xL và Mcl-1, thường được biểu hiện cao trong các dòng tế bào ung thư kháng thuốc và làm tăng biểu hiện của các protein pro-apoptosis trong họ này như Bim, Puma. Do đó (-)-gossypol làm cho các dòng tế bào ung thư bàng quang đã kháng với các thuốc hoá trị liệu như carboplatin, gemcitabine và paclitaxel trở nên nhạy cảm trở lại [34]. (-)-Gosssypol cũng đã được chứng minh là đã đánh bại được sự kháng apoptosis do sự biểu hiện quá mức của Bcl-2 và Bcl-xL trên tế bào ung thư máu Jurkat T. Apoptosis gây bởi (-)-gossypol có liên quan đến sự hoạt hoá Bak và giải phóng cytochrome c từ ty thể, điều này cho thấy rằng cơ chế apoptosis này liên thông qua con đường ty thể. Hơn nữa việc xử lý (-)-gossypol trên ty thể tinh sạch từ các tế bào có biểu hiện quá mức Bcl-2 thì kết quả cũng cho thấy có sự giải phóng cytochrome c, chứng tỏ có sự tác động trực tiếp lên Bcl-2 có mặt trên màng ngoài của ty thể [41]. Nghiên cứu gần đây đã chứng minh (-)-gossypol hoạt động như một chất bắt chước domain BH3 (mimetic BH3), liên kết với các domain BH3 của các thành viên anti-apototic trong họ Bcl-2 như Bcl-2, Bcl-xL, từ đó gây ra apoptosis [59] Một nghiên cứu trên in vivo đã cho thấy (-)-gossypol làm tăng cường hoạt tính chống ung thư khi chiếu xạ tia X, tác dụng này theo cơ chế ức chế cả hai protein anti-aposis Bcl-2/Bcl-xL [63]. Sử dụng kết hợp docetaxel và (-)-gossypol làm tăng cường hoạt tính chống ung thư tiền liệt tuyến PC-3 của docetaxel cả in vitro và in vivo (mô hình xenograft trên chuột nhắt). Tác dụng chống ung thư của (-)-gossypol thông qua sự ức chế protein anti-apoptosis Bcl-xL cùng với sự tăng cường biểu hiện các protein pro-apoptosis là Noxa và Puma [37]. Đặc biệt, đã có nhiều thử nghiệm lâm sàng về tác dụng chống ung thư của gossypol trong những năm gần đây. Một trong những thử nghiệm lâm sàng đầu tiên vào năm 1993 sử dụng gossypol theo đường uống với liều 30-70 mg trên 21 bệnh nhân ung thư thượng thận di căn, 30% trong số bệnh nhân này có phản ứng tốt với liệu pháp, trong đó có 3 bệnh nhân giảm trên 50% kích thước khối u sau 6 tuần điều trị [19]. Một thử nghiệm lâm sàng khác, pha I/II, trên 20 phụ nữ bị mắc ung thư vú di căn với liều 30-50 mg gossypol/ngày theo đường uống cho thấy có 1 bệnh nhân ít đáp ứng với thuốc, 2 bệnh nhân giảm trên 50% các marker ung thư trong huyết thanh. Các tác dụng phụ bao gồm buồn nôn, mệt mỏi, thay đổi vị giác, tiêu chảy. Độc tính trên da đã giới hạn liều sử dụng gossypol, liều dung nạp tối đa là 40 mg/ngày [56]. AT-101 là đồng phân (-)-gossypol đã được công ty dược Ascente Therapeutics thử nghiệm lâm sàng pha I trên bệnh nhân ung thư để xác định liều dung nạp tối đa và phác đồ điều trị của thuốc này khi sử dụng đơn lẻ [46]. Thử nghiệm lâm sàng pha I để đánh giá thuốc khi sử dụng phối hợp với cisplatine và etoposite trên bệnh nhân ung thư phổi tế bào nhỏ (SCLC) cũng đang được tiến hành [69]. Một thử nghiệm lâm sàng khác ở pha I/II cũng đang được tiến hành tại Mỹ trên bênh nhân ung thư tiền liệt tuyến. Hai mươi ba bệnh nhân nam bị mắc ung thư tiền liệt tuyến mới sử dụng hoá trị liệu nhưng có PSA (Prostate-Specific-Antigen) tăng được uống 30 mg (-)-gossypol trong 21 ngày trong chu trình điều trị 28 ngày, sau 20-24 tuần điều trị cho thấy giảm chỉ số PSA trong một số trường hợp. 5 trong số 23 bệnh nhân không thể tiếp tục sử dụng thuốc do tác dụng phụ trên đường ruột. Gần đây nhất, ngày 28 tháng 10 năm 2009, (-)-gossypol được thử nghiệm lâm sàng pha I/II dùng phối hợp với Lenalidomide trong điều trị bệnh bạch cầu lympho bào mãn tính (CLL) trên 45 bệnh nhân [69]. Tóm lại, gossypol là một hợp chất polyphenol trong tự nhiên có rất nhiều hoạt tính sinh dược học giá trị như tác dụng tránh thai cho nam, chống virus, chống vi sinh vật và động vật nguyên sinh, chống oxi hóa và chống ung thư. Trong đó, (-)-gossypol đã cho thấy có nhiều hoạt tính sinh học mạnh hơn hẳn (+)-gossypol như hoạt tính tránh thai, chống HIV và chống ung thư. Với tác dụng gây apoptosis trên nhiều dòng tế bào ung thư, đặc biệt là tác dụng trên cả các dòng tế bào đã kháng với các thuốc hóa trị liệu hay xạ trị, (-)-gossypol cũng đã chứng tỏ tác dụng tốt trên lâm sàng nên hứa hẹn sẽ trở thành một thuốc mới góp phần điều trị bệnh ung thư. 1.3. Bệnh ung thư 1.3.1. Ung thư là gì? Ung thư là quá trình sinh trưởng bất bình thường của các tế bào gây ra bởi những biến đổi phức tạp trong biểu hiện gene dẫn đến làm mất cân bằng giữa quá trình tăng sinh và quá trình chết của tế bào và cuối cùng phát triển thành một quần thể tế bào có thể xâm chiếm các mô và di căn đến các vị trí khác, gây bệnh và nếu không điều trị thì sẽ làm chết vật chủ. Trên quan điểm của lâm sàng, ung thư là một nhóm lớn các bệnh, có lẽ khoảng hai trăm bệnh, đa dạng theo độ tuổi mắc bệnh, tốc độ phát triển, trạng thái biệt hoá của tế bào, triệu trứng, khả năng xâm lấn, di căn, phản ứng với cách điều trị và chẩn đoán. Trên quan điểm của sinh học phân tử và tế bào, ung thư có thể là một số lượng nhỏ các căn bệnh gây bởi những khiếm khuyết trong chức năng của tế bào ở mức độ phân tử do những biến đổi thông thường trong các gene của tế bào. Cuối cùng, ung thư là một bệnh với những bất thường trong biểu hiện gene. Có một số cơ chế làm biến đổi biểu hiện gene. Các cơ chế này có thể xảy ra theo con đường tác động trực tiếp đến ADN như đột biến gene, hoán vị gen, khuyếch đại gen, mất gene hay theo cơ chế bất thường trong phiên mã và dịch mã. Toàn bộ kết quả này làm mất cân bằng giữa quá trình tái bản của tế bào và quá trình chết của tế bào trong quần thể tế bào ung thư dẫn đến sự phát triển của mô khối u [46]. 1.3.2. Tình hình phát triển bệnh ung thư trong nước và trên thế giới Ung thư là một trong những nguyên nhân gây chết hàng đầu ở các nước phương Tây. Ở Mỹ và một số nước Châu Âu, ung thư là nguyên nhân gây chết thứ 2 đứng sau bệnh tim mạch. Riêng ở Mỹ, kể từ năm 1999, số người chết ở độ tuổi dưới 85 vì bệnh ung thư đã vượt qua bệnh tim. Ở Mỹ, hàng năm có hơn 1,3 triệu ca ung thư mắc mới, trong đó không kể có trên 1 triệu ca hàng năm. Mức độ nguy hiểm cao nhất trong các bệnh ung thư là ung thư phổi, ung thư ruột kết, ung thư trực tràng, ung thư vú và ung thư tiền liệt tuyến. Hàng năm có hơn 570 nghìn người chết bởi ung thư tại Mỹ [46]. Tại Việt Nam, ung thư là căn bệnh gây tử vong hàng đầu. Theo thống kê, hàng năm Việt Nam có khoảng 200.000 người mắc bệnh ung thư và 150.000 bênh nhân tử vong vì căn bệnh này. Chỉ tính riêng tại TPHCM, mỗi năm có khoảng 5.500-6.000 ca ung thư mới, trong đó thường gặp nhất là ung thư phổi, gan, dạ dày ở nam giới; ung thư vú, cổ tử cung, phổi ở nữ giới [73].  1.3.3. Sơ lược về các thuốc điều trị ung thư Cùng với phương pháp điều trị tại chỗ như phẫu thuật và xạ trị phương pháp điều trị toàn thân bằng hoá trị liệu đã góp phần quan trọng vào điều trị và chăm sóc bệnh nhân ung thư. Các thuốc chống ung thư đang được sử dụng trong hoá trị liệu hiện nay có thể chia thành các nhóm như sau: - Nhóm chống chuyển hoá: Các thuốc thuộc nhóm này tác động vào quá trình chuyển hoá các chất có nhân pyrimidine và purine. Ví dụ, 5-fluorouracil ức chế sinh tổng hợp vòng purine, ức chế methyl hoá acid deoxyurydylic thành acid thymidylic. Methotrexate ức chế men khử dihydrofolate reductase cần thiết cho việc tạo các folate khử vốn là các gốc methyl trong tổng hợp thymidine… - Nhóm alkyl hoá, mutard nitơ: Các nhóm alkyl hóa có trong cấu trúc phân tử sẽ gắn vào nhóm ái điện tử trong ADN tạo ra các liên kết chéo giữa 2 chuỗi ADN và các liên kết ngang giữa các bazơ nitơ gần nhau làm ức chế hoạt động của ADN. Trong nhóm thuốc này có thể kể đến cisplatine, cyclophosphamide…. - Nhóm các thuốc tác động đến tubulin: Trong nhóm này có thể kể đến như docetaxel, paclitaxel (từ cây thông đỏ Taxus wallichiana Zucc.) và vinblastine, vincristine (từ dừa cạn Catharanthus roseus); - Nhóm các thuốc có tác động ức chế enzyme topoisomerase: Topoisomerase là enzyme cần thiết cho việc tháo xoắn của ADN cần thiêt cho quá trình phân chia của tế bao. Trong nhóm này có thể kể đến etoposide (dẫn xuất của podophyllotoxin từ Podophyllum peltatu) có tác dụng ức chế enzyme topoisomerase II. - Điều trị ung thư theo hướng đích (Targeted cancer therapy): Liệu pháp này sử dụng các loại thuốc ngăn sự phát triển và lan rộng của tế bào ung thư bằng cách cản trở các phân tử đặc hiệu liên quan đến quá trình sinh ung thư và phát triển khối u. Các liệu pháp điều trị ung thư theo hướng đích là phương pháp hiệu quả hơn các thuốc điều trị truyền thống và ít gây độc trên các tế bào thường hơn. Trong liệu pháp này có thể kể đến như sử dụng các kháng thể đơn dòng và các độc tố miễn dịch đặc hiệu, các chất chống tạo mạch máu mới nuôi khối u, các chất chống proteasome như bortezomide, các thuốc ức chế Bcl-2 gây apoptosis như genasene,... Hầu hết các thuốc điều trị ung thư hướng đích hiện nay mới đang được thử nghiệm tiền lâm sàng, một số đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng và một số khác đã được FDA đồng ý đưa vào điều trị. Điều trị ung thư hướng đích có thể sử dụng đơn lẻ, kết hợp với nhau hoặc kết hợp với các thuốc hóa trị liệu khác [2, 46] 1.3.4. Chất ức chế protein anti-apoptosis họ Bcl-2 và tiềm năng trong liệu pháp điều trị ung thư - Họ protein Bcl-2 và con đường apoptosis: Apoptosis là một cơ chế “chết theo chương trình của tế bào” làm cho các sinh vật đa bào có thể điểu khiển được số lượng tế bào trong các mô và loại bỏ các tế bào không cần thiết hay đã bị lão hoá trong quá trình phát triển của cơ quan. Apoptosis được xảy ra bởi quá trình hoạt hoá liên tiếp các cysteine protease trong họ caspase theo cả hai con đường. Con đường bên ngoài là hoạt hoá caspase-8 (caspase 10 trên người) xảy ra khi quá trình trimer hoá thụ thể cái chết (death receptor) trên màng tế bào. Con đường bên trong (còn được gọi là con đường ty thể hay con đướng stress) hoạt hoá caspase-9 bởi protein Apaf-1 khi cytochrome c được giải phóng ra khỏi ty thể phản ứng với các stress khác nhau như mất các cytokine và sai hỏng trong ADN. Các caspase khởi đầu (initiator caspase) này có thể phân cắt và hoạt hóa các caspase thi hành (effector caspase) (caspase-3, caspase-6 và caspase-7), gián tiếp làm phá huỷ tế bào bằng cách phân cắt hàng loạt các protein thiết yếu của tế bào [58]. Hình 1.6 mô tả quá trình apoptosis thông qua con đường ty thể gây ra bởi hóa trị liệu hoặc tia xạ. Hình 1.6. Apoptosis thông qua con đường ty thể [35] Con đường bên trong được kiểm soát bởi họ protein Bcl-2, thông qua sự điều khiển tính nguyên vẹn của màng ngoài ty thể. Các protein thuộc họ Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) có thể phân làm 3 nhóm: Các protein anti-apoptotic (pro-survival): chúng có trình tự tương đồng tại các domain BH1, BH2, BH3 và BH4 (BH = Bcl-2 homology), ví dụ như các Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1 và ở người là Bcl-B. Các protein pro-apoptotic: chúng có trình tự tương đồng tại các domain BH1, BH2 và BH3. Ví dụ như Bax và Bak và ít được nghiên cứu hơn là Bok. - Các protein BH3-only: là các pro-apoptotic nhưng chỉ có trình tự tương đồng ở domain BH3 bao gồm Bim, Bad, Bid, Bik, Bmf, Puma, Noxa và Hrk. Khi tiếp nhận được tín hiệu cái chết, Bax và Bak có thể tạo thành dạng oligomer trên màng ngoài ty thể, giải phóng cytochrome c và hoạt hoá caspase, trong khi đó các protein anti-apoptosis lại ngăn cản quá trình giải phóng này bằng cách cản trở sự hoạt hóa Bax và Bak. Các protein BH3-only đóng vai trò khởi động cái chết của tế bào, hoạt tính của chúng đựơc kiểm soát chặt chẽ bởi các cơ chế phiên mã và sau phiên mã. Khi được hoạt hoá bởi tín hiệu stress, các protein BH3-only liên kết đặc hiệu vào bên trong rãnh kỵ nước của các protein anti-apoptosis họ Bcl-2. Chính sự kết cặp này dẫn đến làm hoạt hoá Bax/ Bak [58]. - Tiềm năng của một số chất ức chế protein anti-apoptosis họ Bcl-2 làm thuốc điều trị ung thư Những sai sót trong quá trình apoptosis thường xảy ra trong nhiều loại khối u ác tính trong đó thường do có sự biểu biện quá mức của họ protein Bcl-2, chủ yếu là Bcl-2 và Bcl-xL. Sự biểu hiện quá mức của các protein này ngăn cản apoptosis thông qua con đường ty thể, góp phần vào quá trình kháng với liệu pháp hoá học và xạ trị của tế bào ung thư. Do đó, các chất bắt chước domain BH3, có khả năng liên kết với 1 hay nhiều protein anti-apoptosis trong họ Bcl-2, phát động quá trình apoptosis, rất có tiềm năng trở thành thuốc chống ung thư đặc biệt là để chống lại tính kháng với liệu pháp hoá học và xạ trị của các tế bào ung thư. Một nghiên cứu dựa trên cấu trúc của các protein họ Bcl-2 đã thiết kế ra phân tử ABT-737, có khả năng liên kết mạnh với domain liên kết với BH3 (ái lực cỡ nM) của Bcl-2. Bcl-xL và Bcl-w nhưng không liên kết với Mcl-1, A1. ABT-737 đã được chứng minh là có tác dụng trên nhiều loại tế bào ung thư lympho B, ung thư máu lympho bào mãn tính (CLL) cũng như là dòng tế bào ung thư phổi tế bào nhỏ. Đặc biệt, nó có tác dụng ức chế hiệu quả các tế bào ung thư phổi trên chuột (mô hình xenografts) với ít tác dụng phụ. Nó cũng gây chết tế bào ung thư bạch cầu cấp tính (AML) nhưng lại không làm chết tế bào máu bình thường in vitro và ức chế ung thư máu trên mô hình xenografts mà không gây tác dụng phụ. ABT-737 và A-385358-chất ức chế Bcl-xL đặc hiệu đã được chứng minh là làm cho tế bào ung thư trở lên nhạy hơn với các thuốc hoá trị liệu khác như dexamethasone, vincristine, và L-asparagine [5]. Obatoclax (GX15-070), đây là một dẫn xuất indol bipyrrol của prodiginine trong vi khuẩn được phát triển bởi hãng dược phẩm Gemin X Biotechnology (Canada), có đặc tính bắt chước BH3. Khác với ABT-737, obatoclax có khả năng ức chế không những Bcl-2 mà còn có khả năng ức chế cả Mcl-1. Obatoclax gây apoptosis trên các dòng tế bào ung thư máu, ung thứ vú và thậm trí trên cả các dòng tế bào đã kháng với các thuốc khác như melphalan, ABT-737 hoặc bortezomib. Đã có nghiên cứu cho thấy rằng obatoclax liên kết với Bcl-w, Bcl-xL và Mcl-1 tái tổ hợp và làm phá vỡ mối tương tác Mcl-1/Bak trong tế bào [35]. Hinh 1.7. Mô hình liên kết giữa Bcl-2 với (-)-gossypol và Bim Nhờ vào quá trình sàng lọc dựa trên cơ sở dữ liệu cấu trúc phân tử để xác định các phân tử liên kết với rãnh liên kết với BH3 của Bcl-2 và Bcl-xL, Shaomeng Wang đã phát hiện (-)-gossypol có ái lực khá cao với Bcl-2 và Bcl-xL. (-)-Gossypol có giá trị Ki lần lượt là 320 nM và 480 nM với Bcl-2 và Bcl-xL. (-)-Gossypol cũng liên kết với Mcl-1, là một protein anti-apoptosis khác trong họ này với giá trị Ki là 180 nM. Để hiểu rõ về cơ sở cấu trúc của (-)-gossypol liên kết với Bcl-2, dựa vào việc mô hình hoá trên máy tính họ đã tiến hành gắn (-)-gossypol vào rãnh liên kết với BH3 trong Bcl-2. Dựa trên sự mô hình hoá này đã xác định (-)-gossypol tạo nên mạng lưới liên kết hydro với Arg 146 và Asn 143 trong Bcl-2 thông qua nhóm aldehyde và nhóm hydroxyl lân cận trên vòng naphthalene bên phải. Nó bắt chước mạng lưới liên kết hydro tạo bởi Asp 99 và Asn 102 trong Bim và Arg 146 và Asn 143 trong Bcl-2. Nhóm isopropyl trong cùng vòng naphthalene này gắn vào hốc kỵ nước trong Bcl-2, phần nào bắt chước Phe 101 trong Bim. Phần bên phải của (-)-gossypol tương tác chủ yếu với Bcl-2 thông qua tương tác kỵ nước, bắt chước Ile 97 trong Bim (Hình 1.7) [59]. Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Nguyên liệu thực vật và các dòng tế bào ung thư Hạt của của các giống khác nhau thuộc hai loài bông G. barbadense và G. hirsutum đã được cán loại xơ do Thạc sĩ Trần Văn Tâm, Phòng di truyền và chọn giống, Viện Nghiên cứu và phát triển cây bông, Nha Hố, Ninh Thuận cung cấp. Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan; LU-1 (Human lung carcinoma) – ung thư phổi và MCF-7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú. 2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu - Các hóa chất và dung môi dùng cho tổng hợp, tinh chế, đo các loại phổ và thử độc tính tế bào (MTT assay) được mua của hãng Merck hoặc Sigma. Vincristine được cung cấp bởi Tiến sỹ Trần Bạch Dương-Viện Hóa Công nghiệp. Các dung môi dùng cho chiết xuất là dung môi tinh khiết của Trung Quốc. - Các thiết bị nghiên cứu chính được sử dụng gồm: Xác định độ ẩm trên máy Precisa HA60 - Viện Dược liệu Máy quang phổ tử ngoại Cary 1E (Varian) - Viện Dược liệu. Máy đo điểm nóng chảy: SMP3 (Stuart) - Viện Dược liệu Máy quang phổ hồng ngoại Impact 410 Nicolet - Viện Hoá học. Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy) được đo trên máy Shimadzu LC-MS 2010 EV - Khoa Hóa học - Đại học Quốc Gia Hà Nội. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR) được đo trên máy Bruker AM500-FT-NMR - Viện Hóa học. Máy phân cực kế Electronic Polarimeter-P3001 - Viện Dược liệu. Máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) của hãng Agilent 1200 (Mỹ) - Trường Đại học Dược Hà Nội. Các thiết bị để nuôi cấy và phân tích độc tính tế bào gồm có: Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170), tủ cấy sinh học an toàn cấp II, máy li tâm (Universal 320R), kính hiển vi ngược (Zeizz), tủ lạnh sâu -250C đến -800C. Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ), máy quang phổ (Genios Tecan) - Viện Hóa học. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp chiết xuất Quy trình chiết gossypol từ hạt bông được tiến hành dựa theo phương pháp của Carruth được cải tiến [8]. Hạt bông G. barbadense (giống HD139) sau khi đã cán loại xơ bông được phơi khô, nghiền nhỏ và phân tách nhân ra khỏi lớp vỏ bên ngoài. Bột nhân thu được sau đó được xác định độ ẩm trên máy Precisa HA60. Phần nhân hạt thu được dưới dạng bột được bảo quản ở nhiệt độ -180C cho tới khi được sử dụng để nghiên cứu tách gossypol. Bột nhân hạt bông được chiết qua ete dầu (nhiệt độ sôi 30-600C) để loại các tạp chất kém phân cực và sau đó tiếp tục được chiết bằng diethyl ether. Các quá trình này đều được tiến hành trên máy chiết soxhlet. Phần dịch chiết ete dầu và diethyl ether (DEE) được bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết tương ứng. 2.2.2. Phương pháp định tính gossypol Phần chiết ete dầu và cao chiết diethyl ether (cao chiết DEE) được định tính gossypol bằng 2 phương pháp: Phương pháp quang phổ tử ngoại và phương pháp sắc ký lớp mỏng. 2.2.2.1. Phương pháp quang phổ tử ngoại (UV-Vis) Gossypol trong cloroform có phổ tử ngoại với 4 đỉnh hấp thụ là: 243, 278, 289 và 365 nm. Trong đó đỉnh 365 nm là đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm aldehyde tự do. Phần chiết ete dầu và DEE được hoà trong chloroform ở nồng độ thích hợp và đo phổ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng từ 200-500 nm trên máy UV- Visible Spectrophotometer Cary 1E (Varian). 2.2.2.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng Dịch chiết được tiến hành sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn GF254 (Merck), khai triển bằng hệ dung môi: n-hexan/ethyl acetate/acetic acid = 9/1/0,4. Bản mỏng sau khi sấy khô cho bay hết dung môi được nhuộm bằng thuốc thử H2SO4 20% trong EtOH hơ nóng trên bếp điện để hiện mầu. Tiến hành tương tự với thuốc thử FeCl3 5%. Gossypol phản ứng với thuốc thử H2SO4 cho mầu đỏ và phản ứng với thuốc thử FeCl3 cho mầu xanh đậm trên bản mỏng quan sát dưới ánh sáng thường. 2.2.3. Phương pháp tinh chế gossypol 2.2.3.1. Phương pháp tinh chế gossypol bằng sắc ký cột Cao chiết DEE được tiến hành phân lập trên cột sắc ký với chất hấp phụ là silica gel pha thuận cỡ hạt 0,04-0,063 mm (Merck) với khối lượng gấp 30 lần khối lượng mẫu cần phân tách. Hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp n-hexane/EtOAc/acetic acid với độ phân cực tăng dần (100/0/1 – 80/20/1). Tốc độ dòng được điều chỉnh ở 5 ml/phút. Quá trình chạy cột được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng và được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn GF254 (Merck) với hệ dung môi khai triển là n-hexane/ethyl acetate/acetic acid = 9/1/0,4, hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 20% trong EtOH. Các phân đoạn có các chất cùng Rf được gộp lại với nhau rồi bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm trong điều kiện tránh ánh sáng. Sản phẩm thu được sau đó được kết tinh lại dưới dạng G-AA trong dung môi DEE và acetic acid băng. 2.2.3.2. Kết tinh gossypol từ cao chiết diethyl ether của hạt bông Gossypol được kết tinh dưới dạng gossypol acetic acid (G-AA) trong dung môi DEE và acetic acid băng. Quá trình kết tinh được tiến hành trong bình cầu dung tích 100 ml. Phương pháp chung là cao chiết DEE từ 100 g hạt bông (chuẩn bị theo phương pháp đã được mô tả ở mục 2.2.1) được hoà tan trong một thể tích DEE xác định (khoảng 6 ml cho 100 g hạt), dung dịch thu được sau đó được thêm acetic acid băng. Ngay sau đó bình cầu được đậy kín và đặt trong điều kiện tránh ánh sáng để ngăn cản quá trình ôxy hoá. Sau 24 h, lọc dung dịch bằng phễu lọc hút chân không, rửa tinh thể G-AA bằng ete dầu (300C -600C) cho đến khi dịch rửa không còn mầu. Sấy sản phẩm trong 24 h ở nhiệt độ phòng trong tủ sấy chân không rồi cân bằng cân phân tích. Các sản phẩm sau đó được xác định độ tinh sạch bằng phương pháp quang phổ tử ngoại ở bước sóng 365 nm. Trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến quá trình kết tinh G-AA như: nhiệt độ kết tinh (nhiệt độ phòng và 4ºC), tỷ lệ DEE/acetic acid và nồng độ của cao chiết DEE (thể tích DEE được dùng để kết tinh). Mỗi điều kiện kết tinh đều được lặp lại 3 lần để lấy kết quả là giá trị trung bình và sai số tương ứng. Phân tích số liệu sử dụng tiêu chuẩn t-test của Student. Giá trị P<0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê. 2.2.3.3. Xác định độ tinh khiết của gossypol acetic acid Sản phẩm G-AA trong quá trình nghiên cứu tinh chế gossypol bằng phương pháp kết tinh được được xác định độ tinh khiết bằng quang phổ tử ngoại dựa theo phương pháp được xây dựng bởi Guangfeng Jia và cộng sự [21]. - Xây dựng đường chuẩn: 50 mg G-AA đối chiếu được đưa vào bình định mức 100 ml và định mức đến 100 ml bằng chloroform để thu được dung dịch gốc với nồng độ 0,5 mg/ml (m/v). Tiếp theo, lấy 50, 100, 150, 200, 250 µl dung dịch gốc ở trên bằng micropipette đưa vào bình định mức 5 ml và định mức lần lượt thành các dung dịch có nồng độ 5, 10, 15, 20, 25 µg/ml bằng chloroform. Các dung dịch chuẩn thu được sau đó được đo cường độ hấp thụ ở bước sóng 365 nm trên máy quang phổ UV-Visible Spectrophotometer Cary 1E (Varian), đo lặp lại 3 lần. Qua đó, chúng tôi xây dựng được đường chuẩn có phương trình là: y = 0,0403x + 0,0395 (R2=0,0085) với x là nồng độ G-AA (µg/ml), y là cường độ hấp thụ ở bước sóng 365 nm. - Đánh giá độ tinh khiết của mẫu: Độ khiết của sản phẩm G-AA thu được trong quá trình kết tinh từ cao DEE được xác định bằng phương pháp UV dựa theo phương trình đường chuẩn được xây dựng ở trên. Dung dịch mẫu thử được chuẩn bị ở nồng độ vào khoảng 15 µg/ml G-AA trong CHCl3. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 365 nm. Độ tinh sạch của sản phẩm G-AA được tính là tỷ lệ giữa nồng độ của G-AA tinh khiết khi được xác định theo đường chuẩn và nồng độ của mẫu thử. Hình 2.1. Đường chuẩn G-AA bằng phương pháp UV 2.2.3.4. Tinh sạch sản phẩm G-AA Sản phẩm G-AA thô kết tinh từ cao DEE được tinh chế lại để làm tăng độ tinh khiết. G-AA thô được hoà trong DEE (tỷ lệ 1 : 7, w/v), lọc qua phễu lọc hút chân không và sau đó acetic acid băng (1/3 thể tích DEE) được thêm vào. Dung dịch này sau đó được đậy kín, tránh ánh sáng ở điều kiện nhiệt độ phòng. Sau 6 h, sản phẩm G-AA thu được bằng cách lọc qua phễu lọc hút chân không, rửa bằng ete dầu (30-60ºC) cho đến khi dịch ete dầu không mầu. Sản phẩm được sấy trong máy sấy chân không 24 h ở nhiệt độ phòng. Quá trình kết tinh này được lặp lại 3 lần. Trong các lần kết tinh thứ 2 và thứ 3, công đoạn lọc đầu tiên có thể được bỏ qua. Sản phẩm cuối cùng được xác định điểm chảy, phổ tử ngoại, MS và kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC. 2.2.4. Xác định cấu trúc hóa học Cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các phương pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng hợp chất mà người ta sử dụng những phương pháp cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất người ta còn phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hóa hóa học, kết hợp với các phương pháp sắc ký so sánh. Ở đây, gossypol và các đồng phân hoặc dẫn xuất của nó đều đã biết nên có thể dễ dàng so sánh với các dữ liệu đã công bố. Cấu trúc hoá học của gossypol và các đồng phân hoặc dẫn xuất của nó được xác định bằng các phương pháp phân tích hiện đại như: Máy đo điểm chảy, máy đo phổ tử ngoại, máy đo phổ hồng ngoại, máy đo phổ khối lượng, máy đo cộng hưởng từ hạt nhân 1H, và 13C, máy đo độ quay cực, máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và so sánh với dữ liệu đã công bố. 2.2.5. Tách đồng phân quang học từ hỗn hợp racemic Tách hai đồng phân này bằng phương pháp tạo dẫn xuất với amine bất đối L-phenylalaninol dựa theo phương pháp đã được mô tả bởi Sampatk D. S. [53]. 2.2.5.1. Điều chế bazơ Schiff gossypol-L-phenylalaninol dienamine (±)-G-AA (0,406 g; 0,70 mmol) được đưa vào bình cầu dung tích 25 ml. Thêm vào đó lần lượt 6 ml acetonitrile và L-phenylalaninol (0,233 g, 1,54 mmol). Hỗn hợp này được khuấy ở nhiệt độ phòng trong điều kiện tránh ánh sáng và trong môi trường khí nitơ. Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển n-hexane/EtOAc = 7/3. Sau khi phản ứng kết thúc (gossypol phản ứng hết), hỗn hợp này được chuyển vào bình chiết quả lê và thêm vào đó 50 ml nước cất và chiết bằng 50 ml DCM. Quá trình chiết này được lặp lại 3 lần. Gộp các dịch chiết DCM rồi làm khan bằng Na2SO4 khan. Lọc bỏ Na2SO4 qua giấy lọc, phần dịch chiết DCM sau đó được cất loại dung môi bằng máy cất quay dưới áp suất giảm thu được sản phẩm là hỗn hợp hai đồng phân diastereomer bazơ Schiff của gossypol. 2.2.5.2. Phân tách (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine và (+)-gossypol-L- phenylalaninol dienamine Hỗn hợp đồng phân diastereomer (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine và (+)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine được phân tách trên cột sắc ký sử dụng chất hấp phụ silica gel pha thường cỡ hạt 0,04-0,063 mm. Hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp n-hexan/EtOAc có độ phân cực tăng dần (100/0 – 40/60). Quá trình được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng tráng sẵn GF254 (Merck) với hệ dung môi khai triển là n-hexane/ethyl acetate = 5/5, soi bản mỏng trên máy soi UV (CAMAG) tại bước sóng 254 nm. Các phân đoạn có các vết có Rf giống nhau được gộp lại và thu hồi dung môi dưới áp suất giảm. Các phân đoạn chứa chất tinh sạch (1 vết trên SKLM) được đem kiểm tra sơ bộ cấu trúc bằng phương pháp phổ khối lượng và đo độ quay cực. 2.2.5.3. Điều chế (-)-gossypol và (+)-gossypol (-)-Gossypol-L-phenylalaninol dienamine (0,315 g; 0,40 mmol) được đưa vào bình cầu dung tích 25 ml. Thêm vào đó lần lượt 15 ml DEE, 3 ml acetic acid và 0,5 ml HCl đặc (37%). Hỗn hợp này được đun hồi lưu trong điều kiện tránh ánh sáng và trong môi trường khí nitơ. Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển là n-hexan/EtOAc = 5/5. Sau khi phản ứng kết thúc (chất đầu phản ứng hết), hỗn hợp này được làm nguội về nhiệt độ phòng, chuyển vào bình chiết quả lê và chiết loại tạp chất bằng nước cất. Quá trình chiết này được lặp lại 3 lần (cho đến khi pH = 7). Pha nước sau đó được gộp và chiết lại bằng DEE. Các phân đoạn DEE được gộp lại và làm khan bằng Na2SO4 khan, cất loại dung môi bằng máy cất quay dưới áp suất giảm. Sản phẩm thô chứa (-)-gossypol được tinh chế bằng sắc ký cột. Sử dụng sắc ký cột để tinh chế (-)-gossypol, chất hấp phụ là silica gel pha thường (cỡ hạt 0,04-0,063 mm) với khối lượng silica gel sử dụng gấp 30 lần khối lượng mẫu cần tinh chế. Sử dụng hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp n-hexan/EtOAc/acetic acid có độ phân cực tăng dần (100/0/1 – 80/20/1). Quá trình chạy cột được theo dõi bằng SKLM với bản mỏng tráng sẵn GF254 (Merck), khai triển bằng hệ dung môi: n-hexan/EtOAc/acetic acid = 9/1/0,4, hiện màu bằng dung dịch H2SO4 20% trong EtOH sau đó đốt trên bếp điện. Các phân đoạn chứa (-)-gossypol sạch (1 vết trên SKLM) được gộp lại, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và có thể kết tinh lại dưới dạng G-AA trong hỗn hợp DEE/acetic acid băng. Sản phẩm (-)-gossypol hoặc sản phẩm (-)-G-AA sau khi kết tinh được sấy trong tủ sấy chân không 24 h và bảo quản ở nhiệt độ -18ºC. Quá trình điều chế (+)-gossypol từ (+)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine được tiến hành tương tự như với (-)-gossypol. Sản phẩm (+)-gossypol, (-)-gossypol đã qua tinh chế được khẳng định cấu trúc bằng phương pháp phổ tử ngoại, MNR, phổ khối, xác định góc quay cực, điểm chảy, xác định độ tinh sạch bằng HPLC. 2.2.6. Phương pháp HPLC đánh giá độ tinh sạch của sản phẩm (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol Các mẫu (±)-gossypol, (-)-gossypol, (+)-gossypol được hòa tan trong dung môi acetonitrile, lọc qua màng lọc 0,45mM, hòa loàng đến nồng độ thích hợp sau đó được chuyển vào trong máy phân tích HPLC Điều kiện phân tích HPLC như sau: Máy sắc ký lỏng cao áp của hãng Agilent 1200 (Mỹ), cột sắc ký Inertsil ODS-3 (C18), cỡ hạt 5 µm (Nhật), kích thước cột 4,6 x 250 mm. Quá trình dò được thực hiện bằng detector UV khoảng bước sóng 220-500 nm. Pha động là hỗn hợp 85/15 của acetonitrile và đệm phosphate pH = 3 (10 mM KH2PO4, sau đó chỉnh về pH = 3 bằng H3PO4 đậm đặc). Tốc độ dòng được điều chỉnh ở 1 ml/phút. Thời gian chạy là 12 phút. Quá trình sắc ký được theo dõi bằng phổ tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm. 2.2.7. Xác định tỷ lệ (+)- và (-)-gossypol trong hạt bông Tỷ lệ (+)- và (-)-gossypol trong hạt bông được xác định dựa theo phương pháp của Stipanovic và cộng sự [52]. Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo bazơ Schiff là dẫn xuất của gossypol trong hạt bông với amin bậc 1 bất đối là (R)-(-)-2-amino-1-propanol (D-alaninol). Sản phẩm phản ứng là các bazơ Schiff, là các đồng phân diastereomer có thể phân tách trên HPLC, trong khi các đồng phân quang học là (-)-gossypol và (+)-gossypol không thể tách ra khỏi nhau trên HPLC trong cùng điều kiện. Dựa theo tỷ lệ diện tích pic của 2 đồng phân diastereomer là (-)-gossypol–(R)-2-amino-1-propanol và (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol trên HPLC có thể xác định được tỷ lệ của (+)-gossypol và (-)-gossypol tương ứng. - Chuẩn bị hỗn hợp thuốc thử (R)-(-)-2-amino-1-propanol Dùng pipet lấy chính xác 2 ml (R)-(-)-2-amino-1-propanol (Sigma-Aldrich, tinh khiết 98%, d = 0,963 g/ml) vào bình định mức 100 ml, thêm 10 ml acetic acid băng, dùng acetonitrile định mức đến 100 ml. Thuốc thử được bảo quản trong bình tối mầu ở 4ºC và được đưa về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. - Chuẩn bị mẫu (-)-gossypol-(R)-(-)-2-amino-1-propanol và (+)-gossypol-(R)-(-)-2-amino-1-propanol đối chiếu: (-)-Gossypol và (+)-gossypol đã tinh sạch bằng phương pháp trên được sử dụng làm chất đối chiếu. Cân khoảng 1 mg (-)-gossypol vào ống nghiệm loại 10 ml. Thêm vào đó 5 ml hỗn hợp thuốc thử (R)-2-amino-1-propanol đã được chuẩn bị ở trên vào ống nghiệm chứa (-)-gossypol. Các ống nghiệm này sau đó được bịt kín bằng nút nhựa, lắc đều và ủ trong bể ổn nhiệt ở 70ºC trong 30 phút. Sau khi làm nguội về nhiệt độ phòng, hỗn hợp này được lọc qua màng lọc 0,45 µM, pha loãng đến nồng độ khoảng 10-15 µg/ml trước khi phân tích bằng HPLC. Tiến hành tương tự với (+)-gossypol để tạo dẫn xuất (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol. Căn cứ vào thời gian lưu và phổ tử ngoại của (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol và (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol để xác định vị trí pic tương ứng của chúng trong mẫu hạt trên HPLC. Chuẩn bị tương tự đối với mẫu đối chiếu là hỗn hợp (±)-gossypol ([a]D ≈ 00) để xác định tỷ lệ diện tích pic của các đồng phân diastereomer (-)-gossypol–(R)-2-amino-1-propanol và (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol trên HPLC - Chuẩn bị mẫu hạt bông để phân tích HPLC: Hạt bông của các giống nghiên cứu được tách loại vỏ, phần nhân được nghiền thành bột đồng nhất bằng chày và cối sứ. Cân khoảng 2-3 mg bột nhân hạt bông vào ống nghiệm 5 ml, thêm vào đó 2 ml hỗn hợp thuốc thử (R)-2-amino-1-propanol. Các ống nghiệm này sau đó được bịt kín bằng nút nhựa và ủ trong bể ổn nhiệt trong vòng 30 phút ở 70ºC. Hỗn hợp sau đó được vortex và ly tâm. Phần dịch trong được lọc qua màng lọc 0,45 µm, hòa loãng đến nồng độ thích hợp bằng acetonitrile và được chuyển sang phân tích trên máy HPLC với điều kiện chạy theo mục 2.2.6. 2.2.8. Độc tính tế bào của gossypol 2.2.8.1. Nuôi cấy tế bào Dòng tế bào Hep-G2 và MCF-7 được nuôi cấy trong trong môi trường Rothwell Park Memorial Institue 1640 (RPMI 1640) có bổ xung thêm 10% huyết thanh phôi bò (Foetal Bovine serum, FBS) và 2 mM L-glutamine. Dòng tế bào LU-1 được nuôi cấy trong môi trường Dulbecco’s Modified Eagle’s (DMEM) có bổ xung thêm 10% FBS 2 mM L-glutamine. Các dòng tế bào này được nuôi cấy ở 37ºC, 5% CO2, độ ẩm 98% trong điều kiện vô trùng tuyệt đối. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính. 2.2.8.2. Phương pháp MTT Độc tính tế bào của gossypol và các đồng phân quang học của nó trên các dòng tế bào ung thư được xác định bằng phương pháp MTT (MTT assay). Phương pháp MTT được tiến hành dựa trên phản ứng khử của MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, một tetrazole) có mầu vàng thành formazan có mầu tím trong ty thể của tế bào sống. Phản ứng khử này chỉ xảy ra chỉ khi các enzyme reductase trong ty thể hoạt động và do đó sự thay đổi này liên quan trực tiếp đến số lượng tế bào sống. Khi so sánh lượng formazan mầu tím được tạo thành từ các tế bào đã được xử lý với một chất thử với lượng formazan tạo thành từ các tế bào đối chứng không được xử lý thì có thể suy ra tác động gây chết tế bào của chất thử thông qua việc xây dựng một đường cong phụ thuộc theo liều dùng [48]. Cấy 200 ml dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 với dòng Hep-G2 và MCF-7, môi trường DMEM với các mẫu thử trên dòng LU-1. Các tế bào được nuôi ổn định sau 24 h ở 370C, 5% CO2. Các mẫu thử: gossypol racemic, (+)-gossypol, (-)-gossypol và mẫu đối chứng dương là vincristine được pha trong DMSO. Pha loãng các mẫu thử tạo thành dãy các nồng độ khác nhau trong môi trường nuôi cấy tương ứng. Các dung dịch mẫu thử sau đó được thêm dung dịch tế bào sao cho nồng độ pha loãng cuối cùng đạt 0,5; 1; 5; 10; 20; 30 µM với (±)-gossypol và (-)-gossypol; nồng độ đạt 0,5; 1; 5; 10; 20; 30; 40; 60 µM với (+)-gossypol và nồng độ đạt 0,5; 5; 50; 500 nM với vincristine. Mẫu đối chứng không được bổ xung thuốc thử. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Các tế bào được ủ ở 370C, 5% CO2. Sau 72 h, môi trường nuôi cấy tế bào được loại bỏ và thêm vào mỗi giếng 50 ml MTT (1 mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh). Sau khi ủ ở 370C trong 4 giờ, dung dịch MTT được loại bỏ và thêm vào mỗi giếng 100 ml DMSO. Lắc đều, đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN. Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào được tính theo công thức: % ức chế = (OD đối chứng – OD mẫu)/OD đối chứng. Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve. Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập gossypol từ hạt bông 3.1.1. Chiết xuất gossypol từ hạt bông Hạt bông Gossypium barbadense L., giống HD139, được nghiền bằng máy xay và rây ở các cỡ lần lượt 1 mm và 0,2 mm để tách phần nhân hạt ra khỏi phần vỏ và xơ bông. Sau quá trình này chúng tôi thu được nhân hạt bông dưới dạng bột mầu trắng xám (độ ẩm 7,9%) với các tuyến chất mầu có thể quan sát được bằng mắt thường. Khối lượng nhân thu được bằng 62,6% tổng khối lượng hạt. 100 g nhân hạt bông HD139 được chiết trong 300 ml ete dầu (nhiệt độ sôi 300C-600C) ở nhiệt độ 60ºC trên bếp cách thủy bằng máy soxhlet cho đến khi dịch chiết ete dầu trở nên không mầu. Điều này đạt được sau khoảng 24 h chiết. Cuối giai đoạn này, bột hạt bông được lấy ra, làm khô trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết ete dầu được thu hồi để lấy dung môi trên máy cất quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 40ºC đến tối đa, thu được 23,5 g dầu mầu nâu. Bột nhân hạt bông sau khi đã được chiết loại dầu được tiếp tục chiết bằng 300 ml DEE ở nhiệt độ 40ºC trong 24 h trên máy soxhlet. Dịch chiết DEE được lọc, thu hồi dung môi trên máy cất quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ phòng, thu được 2,07 g cao chiết DEE mầu nâu. Cao chiết DEE được định tính sự có mặt của gossypol bằng phương pháp phổ tử ngoại và SKLM. Kết quả cho thấy, phổ tử ngoại của phần cao chiết DEE có hình dạng và cực đại hấp thụ tại 368 nm, phù hợp với hình dạng và cực đại hấp thụ của gossypol đã được công bố trước đó (365 nm) [17]. Mặt khác, kết quả SKLM cao chiết DEE hệ dung môi: n-hexan/ethyl acetate/acetic acid = 9/1/0,4 cho 4 vết chính trong đó chỉ 1 vết (Rf=0,67) có mầu đỏ với thuốc thử H2SO4 20% trong EtOH và mầu xanh đậm với thuốc thử là FeCl3. Từ kết quả trên chúng tôi bước đầu khẳng định rằng trong dịch chiết DEE có chứa gossypol với Rf = 0,67 Ete dầu (300C-600C) là một dung môi kém phân cực, do đó được dùng để loại các tạp chất kém phân cực trong nhân hạt bông trong đó chủ yếu là dầu béo đã được xác định là chiếm khoảng từ 13-24% trong nhân hạt bông. Để chứng minh gossypol không bị mất đi trong quá trình loại tạp bằng ete dầu, chúng tôi tiến hành định tính gossypol trong phần dịch chiết ete dầu bằng phổ tử ngoại (đo trong CHCl3). Phổ tử ngoại của dịch chiết ete dầu không thấy đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 365 nm hay ở các bước sóng lân cận (đỉnh đặc trưng cho nhóm -CHO của gossypol). Điều này đã khẳng định tính đúng đắn khi lựa chọn ete dầu để loại tạp chất. Cao DEE sau đó được tách lấy gossypol bằng sắc ký cột hoặc bằng kết tinh. Sơ đồ quy trình chiết xuất và tinh chế gossypol được trình bày trong hình 3.1. Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất và tinh chế G-AA bằng phương pháp kết tinh 3.1.2. Tinh chế gossypol bằng sắc ký cột silica gel Từ kết quả định tính gossypol trong cao chiết DEE bằng sắc ký bản mỏng (mục 3.1.1) cho thấy gossypol cho một vết đậm ở Rf = 0,67 và có sự phân tách với vết lân cận Rf = 0,72 do đó chúng tôi nhận thấy có thể tinh chế gossypol bằng sắc ký cột silica gel để bước đầu xác định cấu trúc và dùng làm chất đối chiếu cho các thử nghiệm về sau. a b Hình 3.2. Sắc ký đồ cao DEE (a) và gossypol tinh sạch Rf = 0,67 (b) phân lập từ hạt bông G. barbadense L. HD139. Bản mỏng tráng sẵn GF254 (Merck), hệ dung môi : n-hexan/ethyl acetate/acetic acid = 9/1/0,4, hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 20%. Do gossypol có các nhóm –OH phenol có khả năng tạo thành các liên kết hydro với các nhóm –OH trên chất hấp phụ silica gel gây ra hiện tượng gossypol kéo dài trên cột trong quá trình rửa giải. Để tránh hiện tượng này, dung môi rửa giải đã được thêm vào một lượng nhỏ acetic acid (1%), vừa có tác dụng tránh sự kéo dài của gossypol trên cột, vừa có thể có tác dụng làm bền gossypol. Từ 2,07 g cao chiết DEE của hạt bông HD139 khi tiến hành sắc ký qua cột sillica gel (60 g silica gel), hệ dung môi rửa giải được sử dụng là n-hexan/ethyl acetate/acetic acid với độ phân cực tăng dần: 100/0/1-80/20/1, cuối cùng chúng tôi thu được 0,558 g chất rắn mầu vàng. Sản phẩm được kết tinh dưới dạng G-AA bằng cách hoà tan lại trong 5 ml DEE sau đó thêm 1,7 ml acetic acid băng. Sau 24 h, sản phẩm kết tinh được lọc bằng phễu lọc hút chân không, rửa bằng 3 x 5 ml ete dầu, sấy khô trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 250C trong 24 h thu được 0,45 g chất rắn mầu vàng là G-AA. Các số liệu về điểm chảy, phổ UV, IR và phổ cộng hưởng từ hạt nhân của sản phẩm thu được trùng với các dữ liệu đã công bố của G-AA [21]. Hình 3.3. Phổ tử ngoại của G-AA từ hạt bông G. barbadense L. G-AA có 3 đỉnh hấp thụ cực đại ở 242, 288 và 364 nm (đo trong CHCl3) Điểm chảy: 178-180ºC UV (lmax, CHCl3): 242, 288, 364 nm (Hình 3.3) [α]D = + 140 (c = 0,25; CHCl3) IR (KBr, cm-1): ν = 3514, 3436 (-OH), 2943, 2886 (-COOH), 1708 (C=O), 1615, 1579 (C=C), 1444, 1381, 1339, 1270 (CAr-O), 1171, 1061, 911, 948, 776. (Phụ lục 1) 1H NMR: d = 15,21 (s, 2H, -OH); 11,15 (s, 2H, -CHO); 7,79 (s, 2H, -Ar-H); 6,45 (br s, 2H, -OH); 5,74 (s, 2H, -OH); 3,91 (s, 2H, -CH(CH3)2); 2,16 (s, 6H, -Ar-CH3); 2,09 (s, 3H, -CH3 acetic acid); 1,56 (d, J = 7Hz, 12H, -CH(CH3)2) ppm. (Phụ lục 2) 13C NMR: d = 199,4 (-CHO); 175,2; 156,2; 150,4; 143,6; 134,1; 133,7; 129,8; 118,2; 115,7; 114,7; 111,9; 27,9 (-CH(CH3)2); 20,4; 20,3 ppm. (Phụ lục 3) Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC của G-AA tinh chế bằng sắc ký cột và kết tinh lại trong DEE/acetic acid băng. G-AA cho một pic có thời gian lưu 7,94 phút, diện tích pic S>98% (254 nm). Kết quả phân tích trên HPLC (Hình 3.4, Phụ lục 4) cho thấy sản phẩm G-AA đã phân lập được bằng phương pháp sắc ký cột chỉ cho duy nhất 1 pic có thời gian lưu là 7,9 phút ở bước sóng 254 nm. Cùng với các số liệu về điểm chảy, phổ khối, phổ tử ngoại, NMR, kết quả này đã chứng tỏ sản phẩm G-AA mà chúng tôi đã phân lập được có độ tinh khiết rất cao (theo diện tích pic HPLC ở bước sóng 254 nm). Do đó sản phẩm G-AA này được chúng tôi sử dụng làm chất đối chiếu để định tính, định lượng các sản phẩm gossypol hoặc G-AA sau này. Sản phẩm thu được là hỗn hợp racemic vì có [α]D = + 140 (c 0,25; CHCl3). Tuy nhiên, trên SKLM chỉ có 1 vết duy nhất (Rf = 0,67) và trên HPLC chỉ có 1 píc duy nhất tại t = 7,9 phút. Do đó có thể kết luận rằng rất khó phân tách cũng như định tính hay định lượng các đồng phân (-)-gossypol và (+)-gossypol trong hỗn hợp (±)-gossypol bằng các phương pháp SKLM và HPLC một cách trực tiếp. 3.1.3. Tinh chế gossypol bằng phương pháp kết tinh Gossypol dễ dàng bị ôxi hoá trong không khí nên nó thường được chuyển về dạng G-AA bền hơn. Sản phẩm G-AA khá bền, nó đã được chứng minh là vẫn đạt độ tinh khiết trên 98% sau 30 năm bảo quản ở nhiệt độ -60C [22]. G-AA là phức hợp gồm 1 phân tử của gossypol và 1 phân tử acetic acid được liên kết với nhau bởi liên kết hydro. Kết tinh gossypol dưới dạng G-AA cũng là một phương pháp thường được sử dụng khi phân lập gossypol từ hạt bông và một số sản phẩm trong quá trình tinh chế dầu bông [16, 39]. Trong các nghiên cứu trên, G-AA được phân lập bằng phương pháp kết tinh cho hiệu suất và độ tinh khiết cao mà không cần thông qua phương pháp sắc ký. Phương pháp tinh chế gossypol bằng phương pháp sắc ký cột silica gel (Mục 3.1.2) là bước nghiên cứu đầu tiên giúp chúng tôi thu được sản phẩm gossypol tinh khiết, sử dụng làm chất đối chiếu cho các nghiên cứu về sau. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu phương pháp kết tinh trực tiếp G-AA từ cao chiết DEE từ hạt bông G. barbadense HD139 nhằm tìm ra được điều kiện tinh chế gossypol đơn giản với hiệu suất cao. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, thể tích DEE và tỷ lệ acetic acid băng/DEE đến quá trình kết tinh gossypol dưới dạng G-AA. Để chuẩn bị cho quá trình trên, chúng tôi tiến hành chiết 3 kg bột hạt bông theo phương pháp được mô tả trong mục 2.2.1, thu được 60 g cao DEE. Để đảm bảo sự đồng nhất của mẫu, cao chiết DEE từ 3 kg bột hạt bông được hoà tan trong 3 lít dung môi CHCl3. Dung dịch này sau đó được chia đều thành 30 mẫu có thể tích bằng nhau. Các mẫu sau khi thu hồi CHCl3 đến kiệt dưới áp suất giảm thu được cao chiết với khối lượng 2,0 ±0,1 g/mẫu tương ứng với khối lượng cao chiết từ 100 g bột hạt bông. Các mẫu cao này được sử dụng để nghiên cứu quá trình kết tinh. 3.1.3.1. Khảo sát nhiệt độ kết tinh Chúng tôi tiến hành khảo sát tác động của nhiệt độ đến quá trình kết tinh ở 2 điều kiện: Nhiệt độ phòng (20-25ºC) và 4ºC (trong tủ lạnh). Ban đầu chúng tôi thực hiện kết tinh cao chiết DEE từ 100 g bột nhân hạt bông trong 6 ml DEE, sau đó thêm từ từ 2 ml acetic acid băng (tỷ lệ acetic acid/diethyl ete = 1/3). Hỗn hợp được đặt trong tủ lạnh ở 4ºC hay nhiệt độ phòng (20-25º). Kết quả được trình bày trên bảng 3.1. Kết quả bảng 3.1 cho thấy khối lượng G-AA thu được ở nhiệt độ thấp 40C cao hơn khi kết tinh ở nhiệt độ phòng nhưng sản phẩm thu được ở 40C lại kém tinh khiết hơn ở nhiệt độ phòng. Tuy nhiên sự khác nhau này không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Mặt khác, chúng tôi cũng nhận thấy không có khác biệt trong độ tinh khiết của sản phẩm khi kết tinh ở các nhiệt độ khác nhau. Lượng G-AA trung bình thu được cao hơn khi kết tinh ở 4ºC so với ở nhiệt độ phòng nhưng sự khác nhau này không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình kết tinh G-AA Thông số 6 ml DEE/2 ml acetic acid băng Nhiệt độ phòng 4ºC Khối lượng G-AA thô (g) 0,50±0,02 0,52±0,02 Độ tinh khiết (%) 78,3±1,5 76,3±1,1 Khối lượng G-AA thực (g) 0,39±0,02 0,40±0,01 Ghi chú: Các giá trị được biểu thị dưới dạng: giá trị trung bình ± sai số Kết tinh trong điều kiện nhiệt độ thấp là phương pháp được các tác giả trước đây sử dụng để tinh chế gossypol [39]. Tuy nhiên, kết quả ở đây cho thấy khi kết tinh trong điều kiện nhiệt độ phòng, hiệu suất kết tinh cũng như độ tinh khiết của sản phẩm không thua kém so với khi kết tinh ở nhiệt độ thấp (4ºC). Khi nghiên cứu quá trình kết tinh G-AA từ soap stock (một phụ phẩm trong quá trình tinh chế dầu bông), Michael Dowd và cộng sự cũng nhận thấy kết tinh ở 4ºC hay 50ºC đều không làm tăng hiệu suất của quá trình kết tinh [16]. Kết quả này có ý nghĩa quan trọng, đặc biệt là khi đưa vào sản xuất ở quy mô lớn. Do đó, các thí nghiệm nghiên cứu kết tinh về sau đều được tiến hành ở nhiệt độ phòng. 3.1.3.2. Khảo sát thể tích DEE và tỷ lệ acetic acid băng/DEE Để nghiên cứu các yếu tố này, cao DEE được hoà tan lại trong một thể tích nhất định DEE (3, 6 và 9 ml). Sau đó, acetic acid băng được thêm vào dung dịch với tỷ lệ acetic acid băng/DEE = 1/3 và 1/5. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2. Theo đó, độ tinh khiết của sản phẩm G-AA khi kết tinh trong các điều kiện khác nhau khác biệt không có ý nghĩa (P>0,05). Điều này cho thấy độ tinh sạch của sản phẩm ít chịu ảnh hưởng bởi thể tích DEE và lượng acetic acid thêm vào. Trong khi đó, khối lượng gossypol tuyệt đối thu được lại dao động khá lớn (0,30-0,43 g). Có thể nhận thấy khối lượng G-AA kết tinh được càng nhiều khi nồng độ cao DEE càng đặc, tương ứng với lượng dung môi DEE sử dụng càng ít. Khối lượng sản phẩm G-AA tuyệt đối thu được nhiều nhiều nhất (0,43 g và 0,42 g) khi lượng DEE được sử dụng là ít nhất (3 ml) cho dù lượng acetic acid băng được thêm vào theo tỷ lệ tương ứng là 1/5 hay 1/3. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thể tích DEE và tỷ lệ acetic acid băng/DEE đến quá trình kết tinh G-AA AcOH băng/ DEE (v/v) Thông số Thể tích DEE 3 ml 6 ml 9 ml 1/5 Khối lượng G-AA thô (g) 0,57±0,02 0,47±0,02 0,37±0,02 Độ tinh khiết (%) 76,1±1,6 78±2,0 79,2±2,3 Khối lượng G-AA thực (g) 0,43±0,02 0,37±0,02 0,30±0,02 1/3 Khối lượng G-AA thô (g) 0,56 ±0,02 0,50±0,02 0,47±0,03 Độ tinh khiết (%) 75,5±1,5 78,3±1,5 78,3±1,5 Khối lượng G-AA thực (g) 0,42±0,01 0,39±0,02 0,37±0,02 Ghi chú: Các giá trị được biểu thị dưới dạng: giá trị trung bình ± sai số Lượng acetic acid cũng tác động đến khối lượng sản phẩm G-AA kết tinh từ dung dịch theo xu hướng lượng sản phẩm thu được tăng lên khi lượng acetic acid sử dụng nhiều hơn (1/3). Sự khác biệt này thể hiện rõ rệt nhất khi kết tinh trong dung dịch loãng (sử dụng 9 ml DEE, P0,05). Từ các kết quả nêu trên, chúng tôi đã tìm được kiện kết tinh G-AA từ cao chiết DEE với hiệu xuất cao như sau: cao chiết DEE từ 100 g bột hạt bông (G. barbadense L., HD139) được hòa trong 3 ml DEE, thêm 0,6 ml acetic acid (tương ứng 1/5 thể tích DEE) trong điều kiện nhiệt độ phòng và tránh ánh sáng. Kết quả này rất có ý nghĩa, đặc biệt là khi nâng quy trình tinh chế gossypol lên quy mô lớn. 3.1.3.3. Kết tinh lại sản phẩm G-AA thô Sản phẩm G-AA thô (sản phẩm kết tinh lần 1) được kết tinh lại nhiều lần để thu được các sản phẩm G-AA tinh khiết. 10 g sản phẩm G-AA thô từ quá trình nghiên cứu kết tinh nêu trên sau khi kết tinh lần 2 thu được 7,1 g (hiệu suất 71%), kết tinh lại lần 3 thu được 6,2 g (hiệu suất 87%), kết tinh lại lần 4 thu được 5,6 g G-AA tinh khiết có mầu vàng sáng (hiệu suất 90%, độ tinh khiết > 98% theo diện tích pic HPLC). Như vây, hiệu suất của cả quá trình tinh chế (3 lần kết tinh lại) từ sản phẩm G-AA thô là 56% . Sản phẩm gossypol acetic acid tinh sạch cho một vết duy nhất có Rf = 0,67 trên SKLM silica gel GF254 với hệ dung môi khai triển n-hexane/ethyl acetate/acetic acid = 9/1/0,4; có điểm chảy 178-180ºC và phổ UV (lmax, CHCl3): 242, 288, 363 nm phù hợp với các số liệu đã thông báo trước đây của G-AA. Kết quả phân tích trên HPLC cũng cho thấy sản phẩm có độ tinh khiết rất cao, sắc ký đồ ở bước sóng 254 nm cho một pic duy nhất có thời gian lưu là 7,9 phút. Sản phẩm thu được từ phương pháp kết tinh có độ tinh khiết tương đương với sản phẩm được tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột trên silica gel (HPLC tính theo diện tích pic ở bước sóng 254 nm). Như vậy, chúng tôi đã chiết xuất và tinh chế thành công G-AA từ giống hạt bông HD139 thuộc loài Gossypium barbadense.L. Theo phương pháp chiết soxhlet, khi chúng tôi nâng quy mô lên 1 kg nhân hạt/mẻ chỉ cần 3 lít dung môi mỗi loại. Từ kết quả của quá trình tối ưu hóa điều kiện kết tinh, gossypol từ cao chiết DEE được kết tinh dưới dạng G-AA trong 30 ml DEE và 5 ml acetic acid, thu được 5,67 g sản phẩm G-AA kết tinh lần 1. Sản phẩm G-AA này sau quá trình tinh chế bằng cách kết tinh lại theo phương pháp nêu trên, cuối cùng chúng tôi thu được 3,2 g G-AA tinh khiết (>98% tính theo diện tích pic HPLC). Theo đó hiệu suất của cả quá trình phân lập G-AA từ nhân hạt bông là 0,32%. Phương pháp chiết soxhlet được chúng tôi sử dụng đã cho phép chiết được gossypol với thể tích dung môi ete dầu và DEE ít hơn nhiều so với việc áp dụng phương pháp của Carruth. Theo Nguyễn Kim Phi Phụng và cộng sự, để chiết 1,5 kg bột nhân hạt bông G. hirsutum theo phương pháp Carruth cần tới 15 lít ete dầu và 12 lít DEE trong các thiết bị chiết lớn. Mặt khác, để kết tinh G-AA, các tác giả này cần phải sử dụng tới 500 ml DEE và 400 ml acetic acid ở nhiệt độ thấp (trong tủ lạnh). Hiệu suất của quá trình kết tinh G-AA mà tác giả trên thu được là 0,45% G-AA kết tinh lần 1 và 0,28% sản phẩm G-AA kết tinh lần 3 [39]. Như vậy, quy trình phân lập gossypol từ hạt bông G. barbadense HD139 mà chúng tôi đã tìm ra khá đơn giản và tiết kiệm hóa chất mà vẫn cho hiệu suất cao. Mặt khác, quy trình này khi được áp dụng để phân lập gossypol từ hạt của một số giống khác của loài G. barbadense, cũng thu được kết quả khả quan. Cụ thể, từ 100 g bột hạt bông của 2 giống HD108 và HD208 sau quá trình phân lập theo quy trình nêu trên chúng tôi cũng thu được G-AA tinh sạch (sản phẩm kết tinh lần thứ 4) với hiệu suất tương ứng là 0,28% và 0,32%. 3.2. Tách đồng phân quang học (-)-gossypol và (+)-gossypol từ (±)-gossypol Như đã biết, gossypol tồn tại dưới dạng 2 đồng phân atropisomer là (+)-gossypol và (-)-gossypol. Hai đồng phân này có tác dụng sinh học khác nhau, nên việc phân tách hai đồng phân quang học này hiện đang thu hút sự quan tâm của nhiều tác giả trên thế giới. Ở trong nước, chúng tôi chưa thấy có tài liệu nào công bố về việc tách đồng phân quang học (+)-gossypol và (-)-gossypol. Do vậy, trong công trình này chúng tôi tiến hành một số khảo sát ban đầu về việc tách (+)-gossypol và (-)-gossypol từ hỗn hợp racemic phục vụ cho các nghiên cứu về tác dụng sinh học của các đồng phân này cũng như hỗn hợp racemic của chúng về sau. Như trên đã thấy, việc tách trực tiếp hai đồng phân quang học này bằng các phương pháp sắc ký (SKLM điều chế, sắc ký cột, HPLC điều chế) với chất mang thông thường là không thể thực hiện được. Phương pháp HPLC sử dụng cột nhồi là chất mang bất đối đã được sử dụng nhưng có giá thành rất cao, không phù hợp ở Việt Nam và không khả thi ở quy mô lớn [10]. Do đó chúng tôi tiến hành tách hai đồng phân này bằng phương pháp tạo dẫn xuất với amine bất đối là L-phenylalaninol được chúng tôi cải tiến từ phương pháp đã được mô tả bởi Sampatk D. S. [47]. Toàn bộ quá trình tách hai đồng phân (+)- và (-)-gossypol từ hỗn hợp (±)-gossypol mà chúng tôi thực hiện được tóm tắt trong hình 3.5. Hình 3.5. Sơ đồ tách đồng phân quang học (+)- và (-)-gossypol từ (±)-gossypol 3.2.1. Điều chế (±)-gossypol-L-phenylananinol dienamine Do gossypol có 2 nhóm aldehyde có khả năng phản ứng hầu như toàn lượng với các amine bậc 1 để tạo thành các bazơ Schiff tương ứng, chúng tôi đã sử dụng phương pháp tạo bazơ Schiff với amine bất đối là L-phenylalaninol (hay (S)-phenylalaninol) để tách riêng 2 đồng phân (+)-gossypol và (-)-gossypol từ hỗn hợp (±)-gossypol. Sơ đồ phản ứng: Hình 3.6. Phản ứng tổng hợp (±)-gossypol-L-phenylananinol dienamine (±)-G-AA (0,406 g; 0,70 mmol) được đưa vào bình cầu dung tích 25 ml. Thêm vào lần lượt 6 ml acetonitrile và L-phenylalaninol (0,233 g, 1,54 mmol). Hỗn hợp phản ứng được khuấy bằng que khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong điều kiện tránh ánh sáng và trong môi trường khí nitơ. Sau mỗi 0,5 h, một lượng nhỏ dung dịch phản ứng được lấy ra và kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng trên bản mỏng silica gel tráng sẵn GF254 với hệ dung môi khai triển là n-hexan/EtOAc = 6/4. Sau 30 phút, hỗn hợp phản ứng cho 4 vết, trong đó căn cứ vào Rf cho thấy chất đầu gossypol đã phản ứng hết. Tại các thời điểm 1 h; 1,5 h; 2 h; 2,5 h hỗn hợp phản ứng cho 4 vết trên sắc ký lớp mỏng. Đến thời điểm 3 h, trên sắc ký đồ chỉ còn 2 vết với Rf = 0,58 và Rf = 0,20. Kéo dài phản ứng thêm 0,5 h nữa sắc ký đồ vẫn không thay đổi. Dừng phản ứng. Hỗn hợp này được chuyển vào bình chiết quả lê, thêm 50 ml nước cất và chiết với 50 ml DCM. Quá trình chiết với DCM được lặp lại 3 lần, pha hữu cơ được gộp lại và rửa bằng nước để loại bỏ amine dư, làm khan bằng Na2SO4 và thu hồi dung môi dưới áp suất giảm. Kết quả chúng tôi thu được 0,549 g sản phẩm thô dưới dạng chất rắn mầu vàng nâu. Sản phẩm phản ứng gồm 2 vết có Rf cách xa nhau tương ứng với 2 base Schiff là đồng phân diastereomer của nhau là (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine và (+)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine được chúng tôi phân tách và tinh sạch bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel. Kết quả chúng tôi thu được 0,263 g sản phẩm (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine (hiệu suất 95%, [α]D = - 7000 (c 0,1, CHCl3)) và 0,231 g (+)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine (hiệu suất 83,9%, [α]D = + 2700 (c 0,037, CHCl3)). Sản phẩm được kiểm tra lại bằng phổ khối (negative): [M-H]- (ESI) = 783,4 (Phụ lục 5) Như vậy, sử dụng amine bất đối L-phenylalaninol, hiệu suất phản ứng tạo bazơ Schiff chúng tôi thu được gần như toàn lượng (99,6%). Điều quan trọng hơn là do sự khác biệt lớn về độ phân cực (Rf = 0,58 và Rf = 0,20) nên hai đồng phân diastereomer này có thể phân tách rất tốt bằng sắc ký cột sillica gel. Theo đó, tính cả giai đoạn phản ứng tạo bazơ Schiff và phân tách qua cột, hiệu suất thu hồi (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine đạt 95% và đối với (+)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine là 83,9% khi hỗn hợp ban đầu là gossypol racemic. Đây là cơ sở để chúng tôi có thể điều chế các đồng phân gossypol tinh khiết quang học với hiệu suất cao. 3.2.2. Điều chế (-)-gossypol và (+)-gossypol Bằng cách thuỷ phân các dẫn xuất bazơ Schiff tinh khiết quang học chúng tôi thu được sản phẩm (-)-gossypol và (+)-gossypol tinh khiết tương ứng. 3.2.2.1. Điều chế (-)-gossypol Hình 3.7. Phản ứng thủy phân bazơ Schiff (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine Phản ứng điều chế (-)-gossypol được thực hiên theo sơ đồ ở hình 3.7. (-)-Gossypol-L-phenylalaninol dienamine (0,315 g, 0,40 mmol) được đưa vào bình cầu dung tích 25 ml. Thêm vào đó lần lượt 15 ml DEE, 3 ml acetic acid và 0,5 ml HCl đặc (37%). Hỗn hợp này được đun hồi lưu trong điều kiện tránh ánh sáng và môi trường khí nitơ. Kết quả theo dõi tiến triển của phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy, sau 30 phút phản ứng, sắc ký đồ cho 3 vết, trong đó căn cứ vào chất đối chiếu gossypol và chất đầu (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine chúng tôi có thể xác định 1 vết là gossypol (Rf = 0,67) đã được tạo thành và chất đầu chưa phản ứng hết (Rf = 0,58) cùng với chất trung gian (Rf = 0,65). Sau 1 h; 1,5 h; 2 h; 2,5 h phản ứng, dựa trên mức độ đậm nhạt của các vêt trên sắc ký lớp mỏng chúng tôi nhận thấy lượng sản phẩm gossypol tăng lên cùng với sự giảm dần của chất đầu và chất trung gian. Chúng tôi dự đoán rằng chất trung gian (Rf = 0,65) là sản phẩm thuỷ phân 1 trong 2 nhóm base Schiff của chất đầu. Sau 3 h phản ứng, sắc ký đồ cho thấy chất đầu cũng như sản phẩm trung gian đã phản ứng hết, trên bản mỏng chỉ xuất hiện duy nhất 1 vết của (-)-gossypol. Dừng phản ứng. Sau khi xử lý phản ứng, chúng tôi thu được 0,415 g sản phẩm thô dưới dạng chất rắn mầu nâu vàng. Đây là sản phẩm (-)-gossypol chưa tinh sạch, do đó chúng tôi tinh chế lại bằng phương pháp sắc ký cột. Sau quá trình tinh chế chúng tôi thu được 0,180 g (-)-gossypol dưới dạng chất rắn mầu vàng. Hiệu suất tách (-)-gossypol từ base Schiff sau 2 giai đoạn thuỷ phân và sắc ký cột là 86,5% và cho toàn bộ quá trình phân tách từ hỗn hợp racemic gossypol là 82,1%. Một số thông số của sản phẩm (-)-gossypol: [α]D = - 3680 (c = 0,311; CHCl3) (lit. [a]D - 363,6 (c 0,2; CH3OH) [32] Điểm chảy : 176-1790C. IR (KBr, cm-1): ν = 3504, 3362 (-OH), 2937, 2873 (-COOH), 1715 (C=O), 1615 (C=C), 1441, 1338, 1294 (CAr-O), 1167, 1052, 839, 770, 611. (Phụ lục 6) 1H MNR (500 MHz, CDCl3): d = 14,72 (s, 2H, -OH); 11,04 (s, 2H, -CHO); 7,73 (s, 2H, -Ar-H); 6,48 (s, 2H, -OH); 6,29 (s, 2H, -OH); 3,86 (s, 2H, -CH(CH3)2); 2,13 (s, 3H, -Ar-CH3); 2,15 (s, 3H, -CH3); 1,52 (d, J= 7,5 Hz; 12H, -CH(CH3)2) ppm. (Phụ lục 7) 13C MNR (500 MHz, CDCl3): d = 199,2; 155,8; 150,7; 143,1; 134,3; 133,9; 129,6; 117,9; 116,5; 114,8; 111,7; 27,9; 20,4; 20,3 ppm. (Phụ lục 8) Phổ khối (ESI-MS) (negative): [M-H]- = 517,08. (Phụ lục 9) 3.2.2.2. Điều chế (+)-gossypol Điều chế (+)-gossypol dựa trên phản ứng thuỷ phân bazơ Schiff tương ứng là (+)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine. Phản ứng thuỷ phân được tiến hành trong môi trường acid HCl và acetic acid với các điều kiện tương tự như phản ứng thuỷ phân dẫn xuất (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine để điều chế (-)-gossypol. Cụ thể như sau: (+)-Gossypol-L-phenylalaninol dienamine (0,285 g; 0,36 mmol) được đưa vào bình cầu dung tích 25 ml. Thêm vào 10,6 ml diethyl ether, 1,5 ml acetic acid và 0,45 ml HCl đặc (37%). Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu trong điều kiện tránh ánh sáng và trong môi trường khí nitơ. Theo dõi sự tiến triển của phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển là n-hexane/EtOAc = 6/4 (soi UV 254 nm). Sau 30 phút phản ứng, sắc ký đồ cho 3 vết, trong đó 1 vết là (+)-gossypol (Rf = 0,67) đã được tạo thành và chất đầu chưa phản ứng hết (Rf = 0,20), chất trung gian là sản phẩm thuỷ phân 1 nhóm enamine của bazơ Schiff (Rf = 0,43). Sau 1 h; 1,5 h; 2 h; 2,5 h phản ứng, dựa trên sắc ký lớp mỏng chúng tôi nhận thấy phản ứng tiến triển theo hướng lượng sản phẩm (+)-gossypol tăng lên cùng với sự giảm dần lượng chất đầu và chất trung gian. Sau 3 h phản ứng, sắc ký đồ cho thấy chất đầu cũng như sản phẩm trung gian đã phản ứng hết, bản mỏng chỉ xuất hiện duy nhất tương ứng với (+)-gossypol. Dừng phản ứng. Phản ứng sau khi dừng được xử lý tương tự như phản ứng thuỷ phân bazơ Schiff của (-)-gossypol, cuối cùng chúng tôi thu được 0,407 g (+)-gossypol thô dưới dạng chất rắn mầu nâu. Sau quá trình tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel chúng tôi thu được 0,150 g (+)-gossypol dưới dạng chất rắn mầu vàng. Hiệu suất tách (+)-gossypol từ base Schiff sau 2 giai đoạn thuỷ phân và sắc ký cột là 79,5% và hiệu suất của cả quá trình phân tách từ hỗn hợp gossypol racemic là 66,7%. Một số thông số của sản phẩm (+)-gossypol: [α]D= +3290 (c 0,19; CHCl3) (lit. [a]D + 3480 (c 0,05; CH3OH) [32] Điểm chảy :175-177ºC UV (lmax; CHCl3): 242, 288, 364 nm. IR (KBr, cm-1): ν = 3506, 3429 (-OH), 2971, 2886 (-COOH), 1710, 1752 (C=O), 1617 (C=C), 1442, 1339, 1295 (CAr-O), 1172, 1065, 845, 774, 644, 480. (Phụ lục 10) 1H NMR (500 MHz, CDCl3): d = 14,93 (s, 2H, -OH); 11,08 (s, 2H, -CHO); 7,76 (s, 2H, -Ar-H); 6,34 (s, 2H, -OH); 6,16 (s, 2H, -OH); 3,88 (br s, 2H, -CH(CH3)2); 2,15 (s, 6H, -Ar-CH3); 1,54 (s, 12H, -CH(CH3)2) ppm. (Phụ lục 11) 13C MNR (500 MHz, CDCl3): d = 199,3; 155,9; 150,6; 143,3; 134,2; 133,8; 129,7; 117,5; 116,1; 114,7; 111,7; 27,9; 20,3; 20,2 ppm. (Phụ lục 12) 3.2.3. Đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm (+)-gossypol và (-)-gossypol Việc đánh giá chất lượng, bao gồm độ tinh khiết hóa học và độ tinh khiết quang học, của các sản phẩm (+)-gossypol và (-)-gossypol tách được giúp sơ bộ đánh giá được hiệu quả của phương pháp tách và phương pháp tinh chế hai đồng phân quang học này từ hỗn hợp racemic. Phương pháp thông dụng để đánh giá độ tinh khiết hóa học (định lượng) và độ tinh khiết quang học của (-)-gossypol đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới. Tuy nhiên, chúng tôi chưa tìm thấy nghiên cứu nào ở Việt Nam về vấn đề này. Đặc biệt, qua tham khảo tài liệu, chúng tôi chưa thấy công trình nào của Việt Nam nghiên cứu đánh giá độ tinh khiết quang học của một đồng phân quang học (xác định lượng thừa enantiomer - enantiomeric excess hay ee). Phương pháp HPLC là phương pháp hiện đại, có độ chính xác cao và khá phổ biến ở Việt Nam nên được chúng tôi chọn lựa áp dụng. Phương pháp này đã được Robert D. Stipanovic và cộng sự xây dựng để định lượng tỷ lệ các đồng phân (-)-gossypol và (+)-gossypol trong hạt bông [51]. Ưu điểm của phương pháp là có độ chính xác cao, có thể áp dụng rộng rãi mà không đòi hỏi cột sắc ký bất đối (chiral column) đắt tiền. 3.2.3.1. Đánh giá độ tinh khiết hóa học của (-)-gossypol và (+)-gossypol Độ tinh khiết của sản phẩm (-)-gossypol mà chúng tôi đã phân tách được đánh giá bằng phương pháp HPLC. Do không có chất chuẩn (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol nên bước đầu chúng tôi đánh giá độ tinh khiết tương đối của các sản phẩm thông qua diện tích pic trên HPLC. Kết quả phân tích trên HPLC cho thấy ở bước sóng 254 nm, sản phẩm (-)-gossypol cho một pic chính có thời gian lưu là 7,95 phút (91% tổng diện tích pic) và 2 pic phụ khác có diện tích rất nhỏ. Căn cứ thêm trên phổ tử ngoại của chất ứng với pic này (trên HPLC) cũng như thời gian lưu của sản phẩm (±)-gossypol (7,94 phút) trong cùng một điều kiện chạy máy, có thể khẳng định píc có thời gian lưu 7,95 phút là tương ứng với sản phẩm (-)-gossypol và có độ tinh khiết hoá học là trên 91% tính theo phần trăm diện tích pic đo ở bước sóng 254 nm (Hình 3.8, Phụ lục 13). Hình 3.8. Sắc ký đồ HPLC của (-)-gossypol. (-)-Gossypol có thời gian lưu t=7,95 phút, phần trăm diện tích pic là S=91% (254 nm). Hình 3.9. Sắc ký đồ HPLC của (+)-gossypol. (-)-Gossypol có thời gian lưu t=7,92 phút, phần trăm diện tích pic là S=79,2% (254 nm). Sản phẩm (+)-gossypol được đem phân tích trên HPLC, với cùng điều kiện như khi phân tích (±)-gosspol và (-)-gossypol. Kết quả phân tích trên HPLC cho thấy sản phẩm này cho 5 pic trong đó có 1 pic có diện tích lớn nhất chiếm 79,2% với thời gian lưu là 7,92 phút, trùng với thời gian lưu của (±)-gossypol (7,94 phút) và của (-)-gossypol (7,95 phút) (Hình 3.9, Phụ lục 14). Kết hợp với dữ liệu phổ tử ngoại của chất ứng với pic này, chúng tôi khẳng định đây là (+)-gossypol. Các pic còn lại là tạp chất lẫn trong sản phẩm. Tuy độ tinh khiết của (+)-gossypol chỉ đạt 79,2% nhưng trong khuôn khổ của luận văn chúng tôi không tiếp tục tinh chế (+)-gossypol có độ tinh khiết cao hơn. Hiện nay đồng phân (+)-gossypol cũng không phải là đối tượng được các nhà nghiên cứu quan tâm nhiều như đồng phân (-)-gossypol. 3.2.3.2. Đánh giá độ tinh khiết quang học của (-)-gossypol và (+)-gossypol Độ tinh khiết quang học của sản phẩm là một trong số các chỉ tiêu quan trọng nhất để đánh giá hiệu quả của phương pháp phân tách đồng phân quang học và cũng là để đánh giá chất lượng sản phẩm. Dựa vào giá trị độ quay cực có thể đánh giá được phần nào độ tinh khiết quang học của sản phẩm. Sản phẩm (-)-gossypol chúng tôi đã điều chế được có [α]D = -3680 (c 0,311; CHCl3), được đánh giá là có độ tinh khiết quang học rất cao dựa trên tài liệu tham khảo, [a]D = - 363,6 (c 0,2; CH3OH) [32]. Tuy nhiên, để khẳng định thêm chúng tôi sử dụng phương pháp HPLC để đánh giá thông qua dẫn xuất bazơ Schiff của sản phẩm (-) -gossypol với amine bất đối (R)-(-)-2-amino-1-propanol theo phương pháp của Robert D. Stipanovic và cộng sự [51]. Hình 3.10. Phản ứng tổng hợp (±)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol Kết quả phân tích trên HPLC cho thấy dẫn xuất bazơ Schiff của (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol cho một pic chính (86% diện tích các pic ở 254 nm) có thời gian lưu là 8,17 phút (Hình 3.11, Phụ lục 15). Trong khi đó, dẫn xuất (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol cho một pic chính (67% tổng diện tích pic ở 254 nm) có thời gian lưu tương ứng là 4,83 phút (Hình 3.12, Phụ lục 16). Mặt khác, trên sắc ký đồ HPLC của sản phẩm (-)-gossypol, tại thời gian lưu 4,83 phút (thời gian lưu đặc trưng của (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol) chỉ thấy một pic rất nhỏ (<1%), chứng tỏ sản phẩm (-)-gossypol phân lập được chỉ lẫn một lượng rất nhỏ (+)-gossypol. Do đó, bước đầu có thể khẳng định sản phẩm (-)-gossypol phân tách được có độ tinh khiết quang học khá cao được thể hiện bằng diện tích các pic của bazơ Schiff tương ứng trên HPLC. Tương tự, trên sắc ký đồ HPLC sản phẩm tạo base Schiff của (+)-gossypol, tại thời gian lưu 8,17 phút (thời gian lưu đặc trưng của (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol), chỉ thấy một pic rất nhỏ (<1%), chúng tỏ sản phẩm (+)-gossypol mà chúng tôi phân lập được chỉ lẫn một lượng rất nhỏ (-)-gossypol. Do đó, bước đầu có thể khẳng định sản phẩm (+)-gossypol phân tách được cũng có độ tinh khiết quang học khá cao. Điều này còn chứng tỏ hiệu quả của quá trình phân tách hai đồng phân diastereomer tương ứng của nó qua sắc ký cột và hơn nữa là nó đã chứng tỏ rằng không có quá trình racemic hoá của (-)-gossypol trong quá trình phân lập (trong môi trường acid khi thuỷ phân bazơ Schiff hay trong quá trình tinh chế qua sắc ký cột sillica gel). Hình 3.11. Sắc ký đồ HPLC của bazơ Schiff (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol. (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol có t=8,17 phút, S=86% (254 nm) Hình 3.12. Sắc ký đồ HPLC của bazơ Schiff (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol. (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol có t=4,83 phút, S=67% (254 nm) Kết quả phân tích trên HPLC cho thấy cả 2 đồng phân (-)-gossyol và (+)-gossyol tách được đều có độ tinh khiết quang học khá cao, tuy nhiên sản phẩm (-) -gossypol có độ tinh khiết hóa học cao hơn (chiếm 91% tổng diện tích pic), trong khi đó sản phẩm (+)-gossypol có độ tinh khiết hóa học thấp hơn (79,2%). Điều này khá phù hợp với giá trị độ quay cực của các sản phẩm này, [α]D = + 3270 với (+)-gossyol và [α]D = - 3680 đối với (-)-gossyol. Đã có nhiều nghiên cứu phân tách các đồng phân quang học gossypol thông qua việc tạo bazơ Schiff với các amine bất đối. Đồng phân quang học (+)- và (-)-gossypol từ hỗn hợp (±) gossypol có thể được phân tách khi sử dụng (-)-norepinephrine hoặc (-)-epinephrine. Tuy nhiên sản phẩm bazơ Schiff của gossypol với các amine này lại kém tan trong các dung môi hữu cơ hơn là sản phẩm bazơ Schiff của gossypol với L-phenylalaninol. Hơn nữa, có thể xảy ra quá trình racemic hóa ở các amine này khi nguyên tử cacbon bất đối xứng liền kề với nhóm aldimine trong cấu trúc của bazơ Schiff [47]. L-phenylalanine methyl ester cũng đã được Matlin A. và cộng sự sử dụng để phân tách các đồng phân quang học của gossypol. Các đồng phân diastereomer bazơ Schiff tạo thành của gossypol với amine này được phân tách bằng sắc ký cột. Tuy nhiên, hiệu suất phân tách chúng qua cột lại rất thấp (60% và 15% tương ứng với dẫn xuất bazơ Schiff của (-)-gossypol và (+)-gossypol) do sự kéo dài đuôi của dẫn xuất bazơ Schiff (-)-gossypol trong quá trình chạy cột [36]. Oliver C. L. và cộng sự, khi sử dụng L-phenylalanyl methyl ester đã tách được (-)-gossypol và (+)-gossypol với hiệu suất chỉ 30-40% [40]. Sampatk D. S. và cộng sự đã sử dụng L-phenylalaninol để phân tách đồng phân quang học gossypol. Tuy nhiên, (±)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine được các tác giả phân tách bằng cách sử dụng HPLC với cột pha đảo C18 rồi thủy phân bằng HCl. Phương pháp này có hiệu quả cao, có thể thu được các đồng phân với độ tinh khiết quang học cao ([α]D: +373" (c 0.468, CHC13) và [α]D: +373" (c 0.468, CHC13) tương ứng với (+)-gossypol và (-)-gossypol) và hiệu suất khoảng 50-60% [47]. Nhưng phải sử dụng thiết bị hiện đại là HPLC nên chi phí cao và khó tiến hành ở quy mô lớn. Dựa trên kết quả của nghiên cứu trên, chúng tôi đã sử dụng L-phenylalaninol để tạo base Schiff tương ứng. (±)-Gossypol-L-phenylalaninol dienamine tạo thành được chúng tôi phân tách với hiệu xuất cao (95% với (-)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine và đạt 83,9% đối với (+)-gossypol-L-phenylalaninol dienamine) mà không sử dụng phương pháp HPLC với cột pha đảo mà chỉ bằng phương pháp sắc ký cột trên silica gel pha thường. Tính cả giai đoạn thủy phân các bazơ Schiff, toàn bộ quá trình phân tách này chúng tôi thu được với hiệu suât khá cao (66,7% với (+)-gossypol và 82,1% với (-)-gossypol). 3.3. Tỷ lệ (-)-gossyopol/(+)-gossypol trong một số giống bông ở Việt Nam Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, điều kiện môi trường có thể ảnh hưởng đến khối lượng hạt và hàm lượng gossypol tổng số nhưng không làm ảnh hưởng đến tỷ lệ giữa (-)-gossypol và (+)-gossypol. (-)-Gossypol đã được chứng minh là có các hoạt tính sinh học như chống ung thư, hoạt tính tránh thai nam mạnh hơn và ít tác dụng phụ hơn (+)-gossypol. Tỷ lệ giữa đồng phân (-)-gossypol và (+)-gossypol rất đa dạng trong các giống và các loài bông khác nhau. Nhưng cho đến nay chưa có công trình nào được công bố về tỷ lệ các đồng phân (-)-gossypol và (+)-gossypol trong các loài và giống bông của Việt Nam. Do đó, từ các sản phẩm (-)-gossypol và (+)-gossypol đã phân lập được, chúng tôi sử dụng nó với vai trò làm chất đối chiếu để sơ bộ xác định tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol trong hạt của một số giống bông thuộc 2 loài bông được trồng phổ biến hiện nay ở Việt Nam là G. barbadense và G. hirsutum bằng phương pháp HPLC. Phương pháp này cũng đã được Stipanovic R. D. và cộng sự sử dụng để đánh giá tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol trong hạt của các loài bông khác nhau [52]. Nguyên tắc chung là tạo dẫn xuất của hỗn hợp (±)-gossypol trong hạt bông với amine bất đối (R)-2-amino-1-propanol để tạo thành các bazơ Schiff (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol và (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol. Sau đó, các đồng phân diastereomer này được phân tích trên HPLC. Tuy nhiên, trong hạt bông còn có nhiều chất khác nữa, nên ngoài 2 pic của 2 bazơ Schiff nói trên còn có các pic khác. Từ kết quả phân tích độ tinh khiết quang học của các sản phẩm (-)-gossypol và (+)-gossypol, chúng tôi đã xác định được thời gian lưu của (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol và của (+)-gossypol-L-2-amino-1-propanol tương ứng là 4,83 phút và 8,17 phút. Do đó, ở cùng điều kiện chạy HPLC, căn cứ theo thời gian lưu cùng với dữ liệu phổ tử ngoại có thể xác định được vị trí pic của hai chất này trong sắc ký đồ HPLC của hạt bông. Bên cạnh đó, chúng tôi chọn hỗn hợp (±)-gossypol của mẫu hạt bông G. barbadense HD139 ([a]D ≈ 00) làm chất đối chiếu, có tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol ≈ 50/50 để kiểm tra tỷ lệ diện tích pic tương ứng trên HPLC. Thực hiện tạo dẫn xuất bazơ Schiff với amine bất đối (R)-2-amino-1-propanol rồi phân tích bằng HPLC chúng tôi thu được 2 píc chính tương ứng với các dẫn xuất (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol và (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol có thời gian lưu tương ứng là 4,82 phút và 8,13 phút và có tỷ lệ diện tích pic tương ứng lần lượt là 33,01% và 33,09% (Hình 3.13, Phụ lục 17). Như vậy có thể nhận thấy rằng tỷ lệ diện tích pic trên HPLC của các bazơ Schiff (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol và (-)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol tương ứng với tỷ lệ các đồng phân (+)-gossypol và (-)-gossypol trong hỗn hợp của nó. Từ kết quả này, chúng tôi có thể đánh giá tỷ lệ các đồng phân quang học (+)-gossypol và (-)-gossypol trong hạt bông thông qua việc xác định tỷ lệ diện tích pic của các bazơ Schiff tương ứng bằng HPLC. Hình 3.13. Sắc ký đồ HPLC của bazơ Schiff (±)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol. (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol có t=4,82 phút, S=33,01%, (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol có t=8,15 phút, S=33,09% (254 nm). Bảng 3.3 là kết quả đánh giá tỷ lệ giữa hai đồng phân quang học (-)-gossypol và (+)-gossypol trong hạt bông của 4 giống bông thuộc loài G. barbadense và 1 giống bông thuộc loài G. hirsutum bằng phương pháp HPLC. Bảng 3.3. Tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol trong một số giống bông ở Việt Nam Loài Giống Tỷ lệ nhân/hạt (%) (-)-Gossypol/(+)-Gossypol G. barbadense HD129 63,1±1,2 51,4: 48.6 HD208 62,5 ±1,7 57,8: 42,2 HD138 58,3 ± 2,0 52,3: 47,7 HD139 62,6 ±1,5 50,3: 49,7 G. hirsutum VN01-2 60,2 ±1,2 39,7: 60,3 Ghi chú: Các giá trị được biểu thị dưới dạng: giá trị trung bình ± sai số Bảng 3.3 cho thấy tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol rất khác nhau trong các loài và các giống bông của cùng một loài. Trong số các giống bông nghiên cứu, mức độ dao động này trong khoảng từ (39,7: 60,3) đến (57,8: 42,2). Các giống thuộc loài G. barbadense có tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol đều trên 50%, giống HD208 có tỷ lệ cao nhất (57,8: 42,2) tức là hàm lượng (-)-gossypol gấp 1,4 lần so với (+)-gossypol. Trái lại, (-)-gossypol có hàm lượng thấp hơn nhiều so với (+)-gossypol (tỷ lệ 39,7 : 60,3) trong giống bông VN01-2 thuộc loài Gossypium hirsutum (Hình 3.14, Phụ lục 18, 19). Từ bảng kết quả cũng cho thấy tỷ lệ nhân hạt bông trên tổng khối lượng hạt của các giống trên cả hai loài đều xấp xỉ 60%, không có sự khác biệt lớn trong số các giống nghiên cứu thuộc 2 loài trên. Kết quả phân tích tỉ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol trong hạt của 2 loài G. barbadense và G. hirsutum ở Việt Nam phù hợp với những kết quả mà một số tác giả khác đã công bố trước đây trên 2 loài này. Rober D. Stipanovic xác định (-)-gossypol trong loài G. barnadense trong khoảng 44,7-58,4%, và trong G. hirsutim là 2,6-38% [52]. Hình 3.14. Sắc ký đồ HPLC xác định tỷ lệ (-)-gossypol/(+)-gossypol trong hạt bông HD208 và VN01-2. (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol có t=4,8 phút, (+)-gossypol-(R)-2-amino-1-propanol có t=8,1 phút (254 nm). 3.4. Tác dụng gây độc của gossypol trên tế bào ung thư Các sản phẩm (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol được chúng tôi nghiên cứu tác dụng ức chế sự sinh trưởng hay gây độc trên các dòng tế bào ung thư người bằng phương pháp MTT. Thử nghiệm này được chúng tôi sử dụng để đánh giá tác dụng gây độc tế bào của các chất tinh khiết điều chế được, so sánh tác dụng của chúng với nhau để làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn về sau. Các dòng tế bào được chúng tôi lựa chọn nghiên cứu là các dòng tế bào đại diện cho các loại ung thư phổ biến ở Việt Nam như ung thư vú (MCF-7), ung thư phổi (LU-1) và ung thư gan (Hep-G2). Các thử nghiệm được tiến hành song song với mẫu đối chứng không có thuốc thử và mẫu đối chứng dương vincristine ở các nồng độ từ 0,1 nM đến 500 nM sau 72 h trên 3 dòng tế bào MCF-7, LU-1 và Hep-G2 thu được các giá trị IC50 tương ứng là 80,4 nM, 93,1 nM và 5,0 nM. 3.4.1. Tác dụng của (±)-gossypol, (+)-gossypol và (-)-gossypol trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 (±)-Gossypol và (-)-gossypol được thử ở các nồng độ từ 0,5 đến 30 µM, (+)-gossypol được thử tại các nồng độ từ 0,5 µM đến 60 µM trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 sau 72 h. Kết quả cho thấy (±)-gossypol và (-)-gossypol đều có tác dụng gây độc trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 phụ thuộc theo liều trong khoảng nồng độ đã thử (Hình 3.15). (±)-Gossypol và (-)-gossypol có tác dụng ức chế mạnh với IC50 lần lượt là 6,2 và 4,0 µM. Ngược lại, khi các tế bào MCF-7 được xử lý với (+)-gossypol tại các nồng độ 10 và 20 µM, không quan sát thấy sự ức chế quá trình sinh trưởng của tế bào sau 72 h. Giá trị IC50 của (+)-gossypol trên dòng tế bào MCF-7 sau 72 giờ là 30,2 µM. Kết quả này cho thấy (-)-gossypol có tác dụng gây độc tế bào mạnh hơn (±)-gossypol khoảng 1,5 lần và mạnh hơn (+)-gossypol khoảng 7 lần. Hình 3.15. Tác dụng của (±)-gossypol, (-)-gossypol và (+)-gossypol trên dòng tế bào MCF-7 sau 72 h Đối chứng (-)-Gossyp