Đề tài Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp. )

1 1 Phần 1. Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề Từ lâu hoa Lan đã được tôn vinh là “Mỹ Nữ Sơn Lâm” của các loài hoa, đây không chỉ là một loại hoa vương giả có vẻ đẹp lộng lẫy, mê hồn mà còn tượng trưng cho bản tính hướng thiện của con người. Trong dân gian, đã lưu truyền nhiều câu chuyện có liên quan đến loài hoa này. Người đầu tiên ca ngợi hoa Lan là đức Khổng Phu Tử (Trung Quốc - 551 B.C), ví hoa Lan là loài hoa quân tử...Và trước đó nữa, vua Thần Nông (Trung Quốc - 2800 B.C) đã dùng hoa Lan trị bệnh như là một liều thuốc tiên, nên từ đó dân gian đã âm thầm gọi hoa Lan là vua của các loài hoa... Tương truyền nước ta cũng có kể rằng: khi vua Trần Nhân Tông rời kinh thành về Yên Tử, Quảng Ninh trong đêm ngủ mộng Ngài thấy có người đến yết kiến và dâng tặng một giò hoa rất đẹp. Sáng ra, nghi nghi hoặc hoặc hoặc nhà vua đi sâu vào trong núi thì bắt gặp tại một khe sâu có một loài hoa lạ, đẹp và vô cùng thuần khiết. Đời sau người ta gọi loài hoa này là lan Trần mộng (giấc mộng của vua Trần) để chỉ điển tích rũ sạch bụi trần bước vào cõi thiền thuần khiết của Ngài. Do đó, thú chơi Lan mang một ý nghĩa rất đặc biệt, bởi khi chăm Lan người ta không chỉ chăm chút cái đẹp cho hoa mà còn đang dưỡng một cái Tâm trong sáng cho mình. Ngày nay, chúng ta có thể thấy hoa lan ở khắp mọi nơi và dễ bị choáng ngợp trước vẻ đẹp quyến rũ, biến hóa muôn màu muôn vẻ của các loài lan như Cattleya, Hồ Điệp , Dendrobium, Mokara, Vanda, Cymbidium, Oncidium.... Hoa lan được ưa chuộng phải chăng bởi đó là biểu tượng của niềm khát khao cuộc sống phong lưu và hạnh phúc bền bỉ. Hoa lan là một món quà của tạo hóa, nó không chỉ là một loài hoa đẹp có giá trị về mặt tinh thần mà còn có giá trị kinh tế cao và hiện đang có thị trường tiêu thụ mạnh trong nước cũng như xuất khẩu. Tại khu vực Đông Nam Á ngành hoa lan phát triển rất mạnh, Thái Lan là nước xuất khẩu lan nhiều nhất thế giới (có đến 1.000 giống hoa lan), tại Malaysia thì chính 2 phủ đã qui hoạch hẳn 300 ha đất ở Johor và giao cho Hiệp hội hoa lan tổ chức thành khu “Trung Tâm Sản Xuất Hoa Cảnh Xuất Khẩu”, ngành trồng hoa lan ở Đài Loan cũng đang tăng nhanh tốc độ từ 15-20%, đạt doanh thu hằng năm hơn 9,3 tỷ đài tệ. Ở Việt Nam, nghề trồng Lan phát triển chậm hơn các nước rất nhiều. Việc trồng lan trên địa bàn TP.HCM lâu nay chủ yếu là do tự phát nên diện tích trồng còn nhỏ và trình độ tay nghề nông dân chưa đồng đều, ngoài ra người trồng lan vẫn chưa chủ động được nguồn giống, vì vậy việc trồng lan rất khó khăn, đặc biệt là trồng lan Hồ Điệp. Loại lan này trồng rất khó và phải đầu tư lớn, từ việc cung cấp dưỡng chất và giữ ẩm cho cây đến thiết bị nhà ươm, chăm sóc… đều phải nhập ngoại và chịu thuế khá cao. Đặc biệt, sau 2 năm trở đi cây mới cho thu hoạch thì có thể lúc đó thị trường đã bão hòa, lợi nhuận thu được không tương xứng với vốn và công sức bỏ ra. Theo tình hình đó đã có nhiều công trình nghiên cứu nuôi cấy in vitro lan Hồ Điệp nhằm tạo ra nguồn hoa mới ổn định. Từ nuôi cấy mô, nguồn gene từ các dòng lan sưu tập sẽ được lưu giữ lại để nâng cao chất lượng giống, đồng thời tổ chức nhân nhanh để cung cấp cho nhu cầu thị trường trong và ngoài nước. Tuy đã có một số thành tựu đáng kể nhưng thực tế vẫn còn nhiều hạn chế như chất lượng giống không đồng đều và không thể thực hiện trên quy mô lớn. Dựa vào thực tế đã nêu trên, với đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp. )”, chúng tôi mong muốn góp một phần vào nền công nghiệp sản xuất hoa lan Hồ Điệp. Trong đề tài này, lan Hồ Điệp được sản xuất bằng phương pháp nhân giống in vitro tốc độ cao tạo cây giống có đặc điểm về kiểu gen và kiểu hình đồng nhất với nguồn mẫu ban đầu. Từ đó, có thể cho ra đời nhiều giống cây hoa lan Hồ Điệp mới có chất lượng tốt để ngày càng đáp ứng được nhu cầu của những người yêu hoa Lan. Hiện nay trên thế giới, các công trình nghiên cứu về phôi soma đã đạt được những thành công nhất định trên thực vật hai lá mầm, trong khi ở những cây một lá mầm vẫn còn gặp nhiều khó khăn. Vì những ứng dụng tốt đẹp mà phôi soma có thể mang lại, trong đề tài này chúng tôi thử nghiệm một phương pháp tạo phôi soma trên cây hoa lan Hồ Điệp sao cho việc tạo phôi soma trở nên thật đơn giản và hiệu quả. Từ kết quả thu nhận được trong việc tạo phôi soma cây lan Hồ Điệp, chúng tôi đi xa hơn nữa, bằng cách sử dụng các phôi soma ấy để tạo hạt nhân tạo. Công nghệ hạt 3 nhân tạo là phương pháp tạo một dạng hạt mô phỏng hạt tự nhiên, có một phôi sinh dưỡng hoặc "chồi ngủ" được bọc trong một lớp dung dịch alginate (một chất có tác dụng tạo lớp vỏ cứng bên ngoài cho mầm hạt) có chứa chất dinh dưỡng, phôi này sau đó nảy mầm thành cây con hoàn chỉnh. Đây là một vấn đề đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm trong ứng dụng bảo quản phôi vô tính, chất mầm thực vật dài hạn. Đồng thời mở ra một hướng mới cho việc sử dụng những hạt vô tính thay cho các hạt hữu tính có khả năng nẩy mầm thấp và không đồng loạt. Khi thực hiện đề tài này, chúng tôi hy vọng sẽ mang đến những hiểu biết mới về quá trình hình thành phôi vô tính trên cây lan Hồ Điệp nói riêng và hoa lan nói chung, đồng thời đem lại những ứng dụng thiết thực cho ngành nuôi cấy mô thực vật tại Việt Nam. 1.2 Mục đích và yêu cầu 1.2.1 Mục đích - Tìm hiểu vai trò tác động của chất điều hòa sinh trưởng lên sự hình thành mô sẹo cũng như phát sinh phôi soma của cây lan Hồ Điệp. - Tạo hạt nhân tạo có ý nghĩa trong công tác duy trì nguồn mẫu, nguồn gen thực vật quí hiếm trong một thời gian dài phục vụ cho những mục đích sử dụng khác trong tương lai. - Làm cơ sở cho việc kiểm chứng sự khác nhau giữa cây hoa lan Hồ Điệp in vitro có nguồn gốc từ phôi soma với cây hoa lan Hồ Điệp từ các nguồn mô khác. - Làm cơ sở để nghiên cứu tiếp khả năng tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma của các loại cây thân thảo một lá mầm khác. 1.2.2 Yêu cầu - Tạo được cây hoa lan Hồ Điệp có đặc điểm về kiểu gen và kiểu hình đồng nhất với nguồn mẫu ban đầu. Từ đó, có thể tạo ra số lượng lớn cây con có chất lượng tốt, đồng thời làm giảm giá thành cây con. - Hình thành quy trình nhân giống vô tính in vitro và tạo hạt nhân tạo cây hoa lan Hồ Điệp, để góp phần nghiên cứu giải quyết nhu cầu giống phục vụ cho việc tiêu thụ hoa trong nước và xuất khẩu. 4 Phần 2 Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu về cây lan Hồ Điệp Cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) là loại cây đơn trục sống biểu sinh, thuộc : Ngành : Hạt kín (Angiospermae). Lớp : Một lá mầm (Monocotyledoneae). Bộ : Lan (Orchidales). Họ : Phong lan (Orchidaceae). Cây phong lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện khí hậu Việt Nam. Hồ Điệp có hoa đẹp, đa dạng, màu sắc phong phú lại lâu tàn, trung bình trên mỗi phát hoa có từ 7 – 15 hoa, thời gian hoa tươi trên cây kéo dài từ 3 – 4 tháng. Đó là tính chất hơn hẳn của phong lan Hồ Điệp so với các loại phong lan khác, giúp cho lan Hồ Điệp có giá trị kinh tế cao ở trong nước cũng như ở nước ngoài. Khả năng tự sinh cây lan con trong thiên nhiên rất thấp. Thông thường để tạo số lượng lớn cây con của giống lan này, người ta dùng phương pháp gieo hạt trong nuôi cấy in vitro. Tuy nhiên những cây con mọc từ hạt thường tăng trưởng không đồng đều, lâu trổ hoa, các đặc điểm của hoa không thuần nhất. Nhân giống bằng con đường tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma có thể khắc phục các nhược điểm trên. 2.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố Cây phong lan Hồ Điệp có nguồn gốc ở Tây Nam Châu Á, trải rộng trên những vùng núi cao ở Trung Quốc và Tây Tạng đến Châu Úc, trên vùng kinh tuyến bao gồm giữa Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương. Người ta còn gặp giống này ở Sumatra, Bornéo, Célèbes, Nouvelle Calédonie (Marry Noble, 1971). Đây là những cây sống biểu sinh, trên những cây cao trong rừng dầy có ẩm độ cao hoặc rất gần đất, trên những cây nhỡ (arbuter), hay sống bám trên những hốc đá, hay trên những đám rêu dày, một vài loài sống ở vùng ven biển. Lan Hồ Điệp ít thích hợp với nắng hơn so với những loại phong lan có giả hành. Nhiệt độ thích hợp cho sự 5 tăng trưởng và phát triển là 15oC – 38oC và giống này thường sống ở cao độ 200m- 400m (William và Kramer, 1983). Tên Phalaenopsis có nguồn gốc từ Phalaina (phalène) và d’Opsis (apparence), được Blume (nhà thực vật học người Hà Lan) đặt vào năm 1852 khi ông khám phá một loài lan đặc biệt có hoa giống cánh bướm, đó là Phalaenopsis amabilis. Đa số các tác giả đều đồng ý xếp chi Hồ Điệp có một nhụy, kiểu phát hoa bên và có cấu tạo đơn trục. Trong chi này có khoảng 70 loài, được phân bố trong những vùng và khu vực khác nhau. Các loài này thường xuyên lai chéo với nhau, do đó phả hệ của những cây nhận được cũng rất phức tạp. Thế hệ con cháu của chúng cũng không thuần nhất. Tuy nhiên sự lai tạo đưa đến một lợi ích lớn để cung cấp những cá thể luôn đổi mới và những đặc tính quyến rũ của hoa (Perlz, 1974). 2.1.2 Vị trí lan Hồ Điệp trên thị trường So với đa số các loại lan trên thị trường hiện nay, thì lan Hồ Điệp nổi bật hơn, bởi các đặc tính của hoa đa dạng, màu sắc phong phú, hoa lâu tàn, trung bình hoa tươi trên cành có thể kéo dài từ 3-4 tháng (Broly, 1982). Trục phát hoa dài, đường kính to, mang nhiều hoa to, trung bình 7-15 hoa, do đó rất thuận lợi cho việc trang trí, và có thể cắt cành xuất khẩu, chuyên chở xa mà không ảnh hưởng đến chất lượng hoa. Hồ Điệp có giá trị kinh tế cao hơn một số giống lan khác. Nếu biết dùng biện pháp kỹ thuật để thúc đẩy việc ra hoa sớm thì sẽ có lợi nhiều trong việc kinh doanh. 6 Hình 2.1 Một số loại lan Hồ Điệp phổ biến. 7 2.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.1 Khái niệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay còn gọi là nuôi cấy in vitro là công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành công nghệ sinh học. Nhờ áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần so với tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất. Hơn nữa dựa vào kĩ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nhiều giống cây trồng quí hiếm để phục tráng giống cây trồng. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật vô trùng được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống. 2.2.2 Lịch sử phát triển Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleiden và Schwann đề xướng học thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi sinh vật phức tạp đều gồm nhiều sinh vật nhỏ, các tế bào hợp thành, các tế bào phân chia mang thông tin di truyền chứa trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh và là những đơn vị độc lập từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể. Năm 1902, Haberlandt đề xướng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào, nghĩa là mỗi tế bào đều mang đầy đủ thông tin di truyền của cá thể. Ông tiến hành trên cây họ hòa thỏa (cây một lá mầm) một lọai cây khó thực hiện và ông bị thất bại. Năm 1922, Kote (học trò Haberlandt) và Robbins (nhà khoa học người Mỹ) đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt và nuôi cấy được đỉnh sinh trưởng tách ra từ đầu rễ của một loại cây thuộc họ hòa thảo tạo ra hệ rễ nhỏ và có cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm lại và ngừng hẳn mặc dù tác giả đã chuyển sang môi trường mới. Năm 1934, White đã nuôi cấy thành công đầu rễ cây cà chua (Lycopersicum esculentum). 8 Năm 1937, Gautheret và Nobecout đã tạo ra và duy trì được sự sinh trưởng mô sẹo cây cà rốt trong một thời gian dài trong môi trường thạch cứng. Năm 1941, Overbeck đã chứng minh được vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy phôi họ cà. Trong thời gian này chất hích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công. Và năm 1948 Steward đã xác định được tác dụng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo cây cà rốt Năm 1955, người ta tìm ra tác dụng kích thích phân bào của kinetin.Sau đó các chất cytokinine khác như BAP, 2 IP, Zeatin cũng được phát hiện. Năm 1957, SKoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu về ty lệ giữa kinetin/auxin đối với sự hình thành các cơ quan từ mô sẹo trên cây thuốc lá. Từ năm 1954, đến năm1959 kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơnđã được phát triển, các tác giả đã gieo tế bào đơn và nuôi cấy tạo được cây hoàn chỉnh. Năm 1966, Guha và Mahheswari nuôi cấy thành công tế bào đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược. Năm1967, Bougin và Nistsh tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc lá. 2.2.3 Ứng dụng Năm 1986, một số lượng lớn cây trồng sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô đã được tiêu thụ tên thị trường thương mại với hàng chục triệu dollar. Kỹ thuật này thể hiện một số ưu điểm đã được ứng dụng: - Nhân giống vô tính với tốc độ nhanh. - Tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh. - Cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến. - Sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn. - Lai xa. - Lai tế bào soma và tạo dòng protoplast. - Gây biến tính thực vật qua hấp thụ DNA và ngoại lai. - Cố định nitrogen. - Cải thiện hiệu quả của quang tổng hợp. - Bảo quản nguồn gen quý. 9 2.2.4 Các phương pháp nuôi cấy in vitro  Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Mẫu cấy bao gồm: đỉnh sinh dưỡng, chồi đỉnh, chồi bên, có kích thước khoảng 0.58 - 1 cm. Đây là phương pháp dễ dàng nhất, mẫu sau khi vô trùng và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp cho loại cây đó thì sau một thời gian nuôi cấy tạo thành một hay nhiều chồi. Sau đó, nuôi cấy trong môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thì sẽ tạo thành nhiều chồi, rễ, tạo thành cây hoàn chỉnh.  Nuôi cấy mô sẹo Mẫu cấy là những tế bào đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra trong môi trường giàu auxin thì mô sẹo được hình thành. Mô sẹo là những tế bào vô tổ chức có màu trắng. Khối mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong môi trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo. Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với những cây không có khả năng nuôi cấy từ đỉnh sinh trưởng. cây tái sinh từ mô sẹo có nhiều chồi hơn so với cây tái sinh từ đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma của phương pháp này rất cao.  Phương pháp nuôi cấy tế bào đơn Những khối sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng, đặt trong máy lắc thì khối sẹo dứơi tác dụng cơ học và hóa học sẽ tách ra nhiều tế bào đơn lẻ gọi là tế bào đơn. Những tế bào đơn này nuôi cấy trong môi trường đặc biệt thì sẽ tăng sinh khối. Sau một thời gian nuôi cấy trong môi trường lỏng tế bào đơn tách ra và đặt trải trong môi trường thạch thì sẽ phát sinh thành những tế bào mô sẹo. Những tế bào mô sẹo này được nuôi cấy trong môi trường cytokinin/auxin thích hợp thì sẽ tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Trong chọn giống cây trồng người ta dựa vào phương pháp này để tạo ra giống mới bằng cách đột biến tế bào đơn bằng hóa chất hay phóng xạ.  Nuôi cấy protoplast- chuyển gen Protoplast (tế bào trần ), thực chất là tế bào đơn được tách vỏ cellulose, có sức sống và duy trì chức năng sẵn có. Protoplast có thể tái sinh trực tiếp từ thân, lá, rễ bằng cơ học, hoặc từ những tế bào đơn sẵn có. Trong môi trường thích hợp các protoplast 10 có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Trong chọn giống cây trồng người ta sử dụng phương pháp này để cải tiến giống cây trồng bằng cách cho dung hợp protoplast ở 2 protoplast cùng loài hoặc khác loài. Protoplast có khả năng hấp thu tế bào ngoại lai để cải thiện đặc tính của một số loại cây trồng mà không thông qua các phương pháp chuyển gen khác.  Nuôi cấy tế bào đơn bội Hạt phấn của cây trồng được nuôi cấy trong môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo, những mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh có bộ nhiễm sắc thể n gọi là cây đơn bội. Trong nuôi cấy mô thực vật người ta sử dụng những mô sẹo này xử lý colchicin để tạo thành cây đa bội. 2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng trong nuôi cấy in vitro 2.3.1 Chất điều hoà sinh trưởng Chất sinh trưởng thực vật hay còn gọi là chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển, làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở những nồng độ rất thấp. Chúng không phải là các chất dinh dưỡng hay các sinh tố dùng trong thực vật. Một số chất điều hoà sinh trưởng thường dùng: (1) Auxin Auxin là một nhóm các chất được tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu rễ, được vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trưởng của tế bào. 11 Các phản ứng auxin và sự tăng trưởng có liên quan với vô số quá trình sinh lý và trao đổi chất khác và mối quan hệ nhân quả giữa auxin, ARN và chuyển hóa protein không phải hoàn toàn rõ ràng. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với việc xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào, điều này xảy ra chỉ một vài phút sau khi xử lý. Một đặc trưng quan trọng là vách tế bào, là một vị trí quan trọng chịu sự tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Torry và csv, 1981). Auxin làm giảm pH do kích thích sự bài xuất proton H+, pH hoạt hóa các enzym tác động nới lỏng vách tế bào và enzym tổng hợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình giản nở tế bào (Roger Prat, 1993). Auxin hoạt hóa sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử (protein, xenluloza, pectin, …) và ngăn cản sự phân giải chúng (Grodzinxki, 1981). (2) Cytokinin Đây là chất hoạt hóa sự phân chia tế bào (Mitsuhashi và csv, 1969; Mai Trần Ngọc Tiếng, 1989), đồng thời làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein (Vũ Văn Vụ và csv, 1993). Cytokinin được sử dụng khá nhiều trong kỹ thuật nuôi cấy mô, những chất thường được dùng là Kinetin và BA (Benzyl Adenin). Cytokinin phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nẩy mầm, làm tăng sự nở hoa. Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo sinh trưởng (cals) trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bứu ở các cây gỗ lâu năm (Nester và csv, 1985; Taiz L. và csv, 1991). Cytokinin kích thích sự tổng hợp mới enzym Rubisco (Ribulozo-1,5-biphotphat cacboxylaza/oxygenaza) hoặc ở mức sao chép (làm tăng hoạt tính ARN-polymeraza) hoặc ở mức dịch mã (thành lập các polyriboxom) (Parthier, 1985). Ảnh hưởng của Cytokinin thấy rõ khi phối hợp sử dụng với auxin (Meredith và csv, 1970). Skoog và csv (1948) ghi nhận lượng benzyl amino purine cao có tác dụng kích thích sự tạo chồi, đồng thời ức chế sự phân hóa tạo rễ. 12  Thidiazuron [1-phenyl-3-(1,2,3-thidiazol-5-yl)urea] [TDZ] Thidiazuron [1-phenyl-3-(1,2,3-thidiazol-5-yl)urea] là một hóa chất tổng hợp dạng tinh thể thường tan trong ethanol và ít tan trong nước. Vào những năm 1970, TDZ được sử dụng như một thương phẩm làm rụng lá phục vụ cho quá trình thu hoạch bông vải. Đến gần đây, nó được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô do có hoạt tính cytokinin và auxin mạnh hơn hẳn các cytokinin và auxin cơ bản thông dụng khác. Về cấu trúc, phân tử TDZ khác hẳn các auxin và các cytokinin dạng adenin với hai nhóm chức năng khác nhau: phenyl và thidiazol. TDZ sẽ bị giảm hoạt tính khi bị thay thế bất kỳ một trong hai nhóm này bằng các vòng thơm khác (Murthy và csv, 1998). Đối với cây in vitro, TDZ được thấy là có khả năng thay thế cả cytokinin và auxin hoặc kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau để kích hoạt các quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô. - Tạo mô sẹo: thông thường auxin được dùng để cảm ứng sự phân chia tế bào và tăng trưởng mô sẹo. TDZ cũng có khả năng cảm ứng tạo mô sẹo ở nhiều hệ thống nuôi cấy khác nhau với tốc độ tăng sinh tế bào cao hơn nhiều các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác, có khi lên đến 30 lần. Tuy nhiên mô sẹo thường hấp thu TDZ ít hơn các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác, có lẽ do hoạt tính của TDZ khá cao. Không có nhiều tài liệu nói về dạng mô sẹo tạo bởi TDZ, ngoài một số tài liệu cho rằng TDZ có khuynh hướng tạo mô sẹo xanh với những tế bào kích thước nhỏ, xếp chặt chẽ. - Tạo chồi: có khá nhiều loại cây được tạo chồi bằng TDZ, đặc biệt hiệu quả trên nhiều giống cây thân gỗ, ví dụ như Bạch đàn (Chen và csv, 1995). TDZ kích thích tạo chồi trực tiếp khi nuôi cấy tế bào lớp mỏng, ví dụ trên cây đậu Phaseolus vulgaris L. (Bui và csv, 2000). TDZ thúc đẩy sự biệt hóa các trung tâm tăng trưởng, làm giảm 13 sự ngủ của các đỉnh sinh trưởng ngọn, dẫn đến sự hình thành chồi bên và chồi bất định trực tiếp từ mô cấy. - TDZ được sử dụng trong quá trình tạo chồi (đặc biệt ở cây thân gỗ) với nồng độ rất cao. Điển hình như báo cáo tạo phôi trên cây măng cụt bằng nồng độ TDZ lên đến 2,25mM (Te-Chato và Lim, 1999) - Sinh phôi: Người ta thấy rằng TDZ, có thể thay thế cho auxin hoặc tổ hợp auxin và cytokinin trong sự hình thành phôi ở nhiều loài cây khác nhau như thuốc lá (Gill và Saxena, 1993), đậu xanh (Murthy và csv, 1995), cây phong lữ (Visser và csv, 1992), neem (Murthy và Saxena, 1998), cacao (Li và csv, 1998), … thường là với tỷ lệ sinh phôi cao hơn so với các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác. Do tính chất này của TDZ, nên ngoài hoạt tính của cytokinin đã được đề cập nhiều, người ta cho rằng, TDZ có ảnh hưởng đến quá trình biến dưỡng auxin. Victor và csv (1999) đã cũng cố cho giả thiết này bằng một khảo sát so sánh hoạt tính phát sinh hình thái của BAP và TDZ trên cây đậu phộng, ghi nhận sự khác biệt trong hoạt tính là TDZ có khả năng sinh phôi vô tính, trong BAP không có khả năng này. - Nuôi cấy protoplast: TDZ kết hợp với auxin (NAA; 2,4-D; NOA) được sử dụng trong giai đoạn hình thành vách tế bào xung quanh protoplast, khởi đầu cho sự phân chia tế bào (Chupeau và csv, 1993; Reustle và csv, 1995) và trong giai đoạn tiếp theo tái sinh từ mô sẹo có nguồn gốc protoplast (Lenzner và csv, 1995). Nhiều báo cáo khác nhau cho thấy, TDZ ở nồng độ thấp có hiệu quả cao hơn hẳn so với các cytokinin khác. - Tạo chồi ngoài vườn ươm : Ngoài các tác dụng sinh chồi in vitro, TDZ còn có tác dụng kích thích tạo chồi trên cây khi được phun hoặc xử lý vào đất trong vườn ươm, chủ yếu là tạo chồi bất định từ rễ hoặc phần dưới thấp của cây. Đi cùng với những ưu điểm trên, nhược điểm của TDZ cũng được ghi nhận, bao gồm : thủy tinh hóa chồi tái sinh (Debergh và csv, 1992; Briggs và csv, 1988; Causineu và Donnelly, 1991); biến dị hình dạng lá (van Niewkerk và csv, 1986; Cambecedes và csv, 1991); chồi chặt và ngắn (Fasolo và csv, 1989; Meyer và van Staden, 1988); sự khó khăn trong việc kéo dài và ra rễ chồi tái sinh. 14 2.3.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon Trong môi trường nuôi cấy, các mô không có khả năng tự dưỡng do không quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài, do vậy cần cung cấp đường để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối. Các loại đường thường được sử dụng là sucrose, d-glucose, d- fructose (Doods và Roberts, 1987). Sucrose là nguồn carbon được sử rụng rộng rãi nhất cho các loại cây, nồng độ sucrose thay đổi từ 2%-12% hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống và tuổi phôi cấy. 2.3.3 Ảnh hưởng của nước dừa Nước dừa (CW-coconut water) thêm vào môi trường với lượng thích hợp sẽ kích thích sự phát triển của chồi bên cũng như sự hình thành cây con (Urata và Iwanaga, 1965; Scully, 1966; Tanaka và Sakanishi, 1978). Từ việc sử dụng CW, nhiều mô thực vật được nghiền tách dịch chiết và bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phát triển phôi như nội nhũ bắp, chà là, chuối, mầm đậu, mầm lúa mì, nước chiết cà chua … nhưng thông thường các dịch chiết chỉ có tác dụng trên các loài cây trồng không cùng nguồn gốc (Trần Văn Minh, 2002). Hoạt tính của CW khác BAP, tuy nhiên có thể thay thế được BAP. Van Overbeek và csv (1941) cho thấy CW kích thích sự phân chia tế bào của mô cây cà độc dược (Datura solanaceae) trong môi trường nuôi cấy. Theo Vũ Văn Vụ và csv (1993), trong CW khá giàu các hợp chất nitơ dạng khử như các acid amin, ngoài ra trong CW còn chứa các hormon sinh trưởng như cytokinine. Theo sự phân tích thành phần dinh dưỡng của Tổ chức Y tế Thế giới, thì trong CW có chứa protein, cacbohydrat, canxi, sắt và một số vitamin như thiamin, riboflavin, niacin, acid ascorbic và đường. 2.3.4 Ảnh hưởng của than hoạt tính Phải có những thực nghiệm xác định nồng độ than hoạt tính thích hợp cho quá trình nuôi cấy. Than hoạt tính thêm vào môi trường kích thích sự phát triển phôi của cây bắp, jujube và đu đủ. 15 2.3.5 Ảnh hưởng của độ pH và Agar pH của môi trường nuôi cấy thường ở khoảng 6, thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát triển của mô (Nguyễn Văn Uyển, 1993 và Bùi Bá Bổng, 1995). Các mô thực vật đều được cấy trên môi trường agar. Agar thường được sử dụng ở nồng độ 6-10 g/lít, nồng độ agar tốt nhất cho sự phát triển của mô cấy là 8g/lít (Ribeiro và csv, 2000). 2.3.6 Ảnh hưởng của các điều kiện vật lý Ánh sáng cần thiết cho sự phát sinh hình thái của mô cấy. Trong tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng chỉ cần trong khoảng 1.000 lux. Nhưng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu sáng ở cường độ cao từ 3.000-10.000 lux để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng có khả năng quang hợp. Dưới cường độ ánh sáng cao, cây lùn và có màu xanh hơi giảm nhưng có tỷ lệ sống sót cao khi chuyển sang môi trường đất. Chưa có nhiều nghiên cứu về chế độ sáng trong môi trường cấy mô, nhưng thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày của bóng đèn néon huỳnh quang là thích hợp cho sự phát triển mô cấy của nhiều loài. Cấy phôi thường không sử dụng ánh sáng đèn. Theo Scozzoli và Pasini, 1992; Pinto và csv, 1994, cấy phôi đào nên để trong tối 14 ngày. Tương tự, ở cây bơ nên để 21 ngày trong tối ở nhiệt độ 210C (Lano và csv, 1995). Ngoài ra, để mô cấy phát triển tốt thì môi trường nuôi cấy phải thông thoáng và có nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy thường được giữ ở 25-28oC (Nguyễn Văn Uyển, 1993). 16 2.3 Nuôi cấy phát sinh mô sẹo 2.4.1 Sự hình thành mô sẹo Hình 2.2 Mô sẹo lan Hồ Điệp Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, có hình dạng không nhất định, do không có lớp nhu mô. Mô sẹo được hình thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm tế bào nhu mô và thành phần tế bào rây (Esau, 1977). Mô sẹo hình thành ở hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt (Street, 1969). Điều quan trọng được nhận thấy ở đặc tính của mô sẹo là mô sẹo phát triển không theo quy luật nhưng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi hoặc phôi để có thể hình thành cây hoàn chỉnh. Đặc điểm sinh trưởng của mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo, thành phần môi trường nuôi cấy, và điều kiện nuôi cấy. Sự hình thành mô sẹo chia ra 3 giai đoạn : phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào và biệt hóa. - Trong pha phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. - Tế bào đi vào giai đoạn phân chia tăng sinh khối. - Tế bào đi vào quá trình biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa tế bào và sự xuất hiện các con đường trao đổi chất dẫn đến sự sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học (Trần Văn Minh, 2003). Mô sẹo thường có màu vàng trắng, xanh hay màu sắc tố 17 anthocyanin. Sự biệt hóa của tế bào hình thành những chất liệu cấu tạo nhu mô các loại, các tế bào rây… hơn nữa hình thành vùng mô phân sinh, trung tâm của sự tạo nên chồi và rễ. Nhiều nhà khoa học cho rằng, mô sẹo được tạo ra từ những mô hay cơ quan có chứa diệp lục có khả năng quang tự dưỡng (Street, 1969). Hildebrandt và csv. (1963) cho rằng, mô sẹo có chứa diệp lục phụ thuộc vào lượng đường bổ sung trong môi trường và cường độ ánh sáng. Có nhiều yếu tố ảnh đến khả năng quang tự dưỡng của những tế bào có chứa diệp lục (tế bào có màu xanh) như : cường độ ánh sáng mạnh, ánh sáng màu xang cần thiết cho sự biệt hóa diệp lục và sự hình thành các enzym, đường thấp, auxin thấp, CO2 cao, và tăng hàm lượng phosphate (Barz và Husemann, 1982), và những tế bào quang tự dưỡng này có khả năng cố định 14CO2 bằng chu trình Calvin mặc dù có sự xuất hiện của các acid hữu cơ 4 carbon (Yamada và csv, 1982). Một vấn đề quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo là sự biến tính tế bào. Sự biến tính này xảy ra do : độ già của mẫu, sự thay đổi tế bào chất của nhân, tế bào đa bội thể có số lượng DNA cao, thời gian duy trì nuôi cấy mô sẹo, điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường nhất là hormon ( Trần Văn Minh, 2003). Để tạo mô sẹo trong môi trường nuôi cấy có bổ sung chất sinh trưởng, đôi khi có dịch chiết (Trần Văn Minh, 2003). Phụ thuộc vào từng loại mô nuôi cấy mà chất sinh trưởng thêm vào có khác nhau (Trần Văn Minh, 2003). Chất hormon thường tổ hợp thành 4 nhóm : (1) Auxin. (2) Cytokinin. (3) Auxin + Cytokinin. (4) Dịch Chiết. Sau khi mô sẹo hình thành, mô sẹo được cấy chuyền. Môi trường cấy chuyền cũng giống như môi trường tạo mô sẹo nhưng chất sinh trưởng được giảm nồng độ. Kích thước tách mô sẹo nhỏ vừa phải để tế bào phát triển mạnh nhất, thường cụm mô sẹo có trọng lượng là 20-100mg, thời gian giữa hai lần cấy chuyền là 20-30 ngày phụ thuộc vào từng loại mô sẹo. Trong quá trình phát triển mô sẹo thường xuất hiện 2 loại tế bào : (1) Loại tế bào xốp, có không bào to, nhân nhỏ và tế bào chất loãng. 18 (2) Loại tế bào chặt, có không bào nhỏ, nhân to và tế bào chất đậm đặc. Mô sẹo cấy chuyền càng nhiều lần thì khả năng tái sinh càng giảm. Ngoài ra, nếu sau thời gian dài không cấy chuyền thì mô sẹo sẽ hoá nâu và chết. Hình 2.3 Mô sẹo hoá nâu 2.4.2 Sự phát triển của tế bào mô sẹo Giống thực vật cổ điển được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh cơ quan là thuốc lá (Skoog và Miller, 1957). Bước đầu tiên trong nghiên cứu tái sinh là tạo mô sẹo. Mô nuôi cấy cho thấy tiêu biểu của sự phân chia tế bào, những chức năng đặc biệt của tế bào, và sự hình thành cơ quan như cấu trúc của hệ thống mạch dẫn. Sự hình thành mô sẹo từ mô nuôi cấy cho thấy có sự phân chia tế bào, những tế bào ít có tính chuyên biệt và mất khả năng hình thành cấu trúc cơ quan (Trần Văn Minh, 2003). Khi cấy chuyền mô sẹo trên môi trường agar, tế bào mô sẹo phát triển theo hình chữ S. Có 5 pha trong sự phát triển mô sẹo : (1) pha Lag : tế bào chuẩn bị phân chia. (2) pha Exponential : tốc độ phân chia tế bào cao nhất. (3) pha Linear : tế bào phân chia chậm lại và phát triển kích thước. (4) pha Deceleration : tốc độ phân chia và kéo dài tế bào giảm. (5) pha Stationary: số lượng và kích thước tế bào ổn định. Sự phát triển của mô sẹo có thể đo được trọng lượng tươi. Đo trọng lượng khô cho thấy chính xác hơn trọng lượng tươi, nhưng đòi hỏi mẫu phải đồng nhất. Đo đếm sự phân bào nguyên nhiễm. 19 2.3.6.1 Sự tái sinh chồi từ mô sẹo Theo Thomas và Davey (1975) (trích dẫn bởi Trần Văn Minh, 2003) sự hình thành chồi từ mô sẹo được kích thích bởi : - Các chất sinh trưởng đưa vào môi trường. - Chất được sản sinh ra trong nuôi cấy mô sẹo. - Các chất có chứa sẵn trong mẫu nuôi cấy. Khả năng hình thành chồi từ mô sẹo phụ thuộc vào số lần cấy chuyền mà các chất có trong mẫu không có khả năng tổng hợp trong thời gian dài (Gautheret,1959) và sự hình thành tế bào xốp (Trần Văn Minh, 2003). Hình 2.4 Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ mô sẹo Sự hình thành chồi được điều khiển bằng hóa chất (Skoog, 1944). Theo Trần Thanh Vân và Trinh (1978) sự hình thành chồi được điều khiển bằng : - Tỷ lệ ctytokinin /auxin từ 10-100. - Carbohydrate như sucrose và các chất hữu cơ như casein hydrolysate. - Điều kiện nuôi cấy. - Dịch chiết. Tạo rễ cần auxin, đường, khoáng, nhiệt độ, ánh sáng… (Gautheret, 1959). Adenine sulfate có tác dụng cản trở auxin. GA3 cản trở sinh tổng hợp và tích lũy hạt tinh bột, cần thiết trong hình thành chồi. 20 2.4 Phôi vô tính 2.5.1 Lịch sử nghiên cứu Bắt đầu từ 1958, Street và Reinert đã mô tả sự hình thành phôi vô tính từ các tế bào đơn của cà rốt. Sau đó, vào 1977, Murashige đưa ra ý kiến tạo phôi vô tính có thể trở thành biện pháp vi nhân giống. và tiếp tục cho đến nay thì công nghệ phôi vô tính được xem là rất có triển vọng cho nông nghiệp thế kỷ 21. Hình 2.5 Phôi vô tính lan Hồ Điệp 2.5.2 Khái niệm về phôi vô tính Phôi vô tính hay phôi soma là các thể nhân giống (propagule) có cực tính bắt nguồn từ các tế bào dinh dưỡng, bao gồm cả phần mô phân sinh ngọn và mô phân sinh gốc, do đó có thể hình thành chồi và rễ. Không giống như các tế bào eukaryote, hầu hết tế bào thực vật đều có khả năng phát triển thành phôi dưới những diều kiện nhất định. Williams và Maheswaran (1986) đã cho rằng phôi vô tính có thể được hình thành từ một tế bào đơn hay từ cả một cụm tế bào phôi. tiến trình này khác với những quá trình tự nhiên khác và được gọi là quá trình hình thành phôi vô tính. Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính ở hình thái và sinh lí nhưng không có quá trình tái tổ hợp di truyền do phôi vô tính không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái. Do đó tất cả những cây con tái sinh bằng con đường này thì có vật chất di truyền giống hệt các tế bào sinh dưỡng đã sinh ra chúng (Nguyễn Văn Uyển, 1992). Đặc tính này của phôi sinh dưỡng không những cho phép thực hiện sự 21 nhân giống vô tính mà còn tạo ra những thay đổi chuyên biệt và trực tiếp để đưa các tính chất mong muốn vào các cá thể bằng việc chèn thêm những trình tự gen cố định vào tế bào sinh dưỡng. (Saiprasad, 2001). Giống như các tế bào của mô phân sinh, các tế bào sinh phôi có các đặc tính cơ bản như sau: tế bào nhỏ, có cùng một đường kính, có hoạt động biến dưỡng rất mạnh mẽ, có cường độ tổng hợp ribonucleic acid rất cao, có tế bào chất đậm đặc, không bào rất nhỏ, nhân to, dễ nhận thấy, hạch nhân rất to và sậm màu, đặc biệt là các tế bào này có một lượng lớn các ribosom, ty thể, lưới nội chất nhỏ và có vách rất dày (Ammirato, 1987; Emons, 1994; Raghvan, 1983; Thorpe, 1988). 2.5.3 Sự phát sinh hình thái của phôi vô tính Tất cả các phôi vô tính đều có cấu trúc lưỡng cực, gồm có mô phân sinh của cả chồi và rễ, do đó có thể hình thành một cây hoàn chỉnh trong nuôi cấy in vitro. Sự phát sinh hình thái ở phôi vô tính rất giống so với phôi hữu tính. những phôi phát triển bình thường sẽ trải qua những giai đoạn phát triển riêng biệt như: hình cầu, hình tim, hình thủy lôi và hình lá mầm.  Cơ chế phát sinh phôi soma Những quan sát chi tiết về quá trình phát sinh phôi phát hiện có 4 pha : 0, 1, 2 và 3, được nhận thấy trong giai đoạn đầu của tiến trình phát sinh phôi trong hệ thống nuôi cấy nói trên (Fujimura và Komamine, 1979). Ở pha 0, những tế bào đơn (giai đoạn 0) hình thành những cụm tế bào có khả năng phát sinh phôi (giai đoạn 1) trên môi trường có auxin. Trong suốt giai đoạn này, những cụm tế bào hình thành từ những tế bào đơn có khả năng tạo phôi khi môi trường nuôi cấy không có auxin, để hình thành những cụm tế bào giai đoạn 1. Sau đó, pha 1 xuất hiện khi cấy chuyển những cụm tế bào giai đoạn 1 qua môi trường không có auxin. Trong suốt pha 1, những cụm tế bào tăng sinh chậm và dường như không biệt hóa. Sau pha 1 sự phân bào xuất hiện nhanh trên một phần của những cụm tế bào, dẫn đến việc hình thành những tế bào phôi hình cầu. Pha này được gọi là pha 2. 22 Pha tiếp theo sau, pha 3, cây con in vitro phát triển từ những phôi hình cầu qua phôi hình tim và phôi hình thủy lôi. Hình 2.6 Các giai đoạn phát sinh phôi vô tính  Các kiểu phát sinh phôi soma Sự phát sinh phôi soma bất định Các phôi vô tính có thể phát triển từ các tế bào hay các mô sẹo có liên quan của một số loài thực vật nhiệt đới, các phôi bất định này có thể được tạo trực tiếp từ tế bào đơn trên bề mặt của phôi non hoặc gián tiếp từ bề mặt của phôi non này. Phương pháp này được sử dụng trong chương trình di truyền cải tạo giống, chẳng hạn như cứu các phôi bị chết non do lai tạo. Sự phát sinh đa phôi vô tính Hiện tượng này xảy ra khi nuôi cấy các noãn non của thực vật hạt trần. Các khối mô có khả năng tạo phôi cao khi được cấy chuyền sang môi trường mới sẽ phát triển và tăng trưởng thành phôi. Mô có khả năng phát triển thành phôi có thể được phân biệt với mô không có khả năng phát triển thành phôi do màu trắng của phôi và hoá đỏ khi nhuộm bằng acetocarmine. Dưới ánh đèn tử ngoại các tế bào phôi có thể phát huỳnh quang màu xanh lá cây. Sự phát sinh phôi soma do cảm ứng Hiện tượng này do sự nuôi cấy lỏng các tế bào và mô sẹo sau khi các mô này chịu các xử lý đặc biệt đem lại sự cảm ứng khả năng tạo phôi. Người ta đã thực hiện nhiều nghiên cứu trên nhiều loại thực vật ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau để quan sát khả năng tạo thành mô sẹo. 23 2.5.4 Những nhân tố ảnh hưởng đến sự hình thành phôi vô tính Việc cảm ứng tạo phôi vô tính là một trong những công việc khá mới mẻ và rất khó khăn. Để đạt được hiệu quả cao và thành công, việc tìm hiểu các điều kiện sinh lý, hóa học tác động đến sự hình thành phôi là một công việc rất quan trọng.  Mẫu cấy Mỗi loại mẫu cấy có những khả năng cảm ứng tạo phôi khác nhau. Sự lựa chọn mẫu cấy rất khắc khe, ví dụ, nhiều loài một lá mầm đòi hỏi mẫu cấy phải ở một giai đoạn cụ thể nào đó của hợp tử phôi non thì mới hình thành mô sẹo từ đó tạo phôi vô tính. Những bộ phận thích hợp được sử dụng để nuôi cấy tạo phôi Asparagus officinalis, Lilium như chồi đỉnh, cuống lá, lóng thân, mầm, phôi chưa trưởng thành, còn những bộ phận khác thì hiệu quả tạo phôi rất thấp (Hisato Kunitake, 1998).  Môi trường nuôi cấy Gần 70% nghiên cứu thành công đều nhờ vào sử dụng môi trường MS với hàm lượng muối khoáng cơ bản (Ammirato, 1983; Litz và Gray, 1992; Thorpe, 1988). Lý do vì môi trường này có chứa hàm lượng muối nitrat và ammonia cao. Tỉ lệ giữa muối nitrat và ammonia trong môi trường rất quan trọng trong việc cảm ứng tạo phôi (Niedz, 1993, 1994). Polyamine trong môi trường dinh dưỡng có hiệu quả kích thích đến việc hình thành phôi vô tính (Minocha và Minocha, 1995). Những chất hữu cơ khác như nước dừa, casein thủy phân, tinh chất mạch nha (malt extract)… ở những nồng độ khác nhau cũng được sử dụng và đã cho thấy có nhiều ảnh hưởng đến cảm ứng tạo phôi ở một số loài thực vật. Bên cạnh đó cũng đã có những đề nghị về vai trò của nitrogen, amino acid, amid, cũng như của kali, photphat đến sự hình thành phôi( Tisserat và cộng sự, 1979; Ammirato, 1983).  Nguồn cacbohydrate Sucrose là một nguồn cacbon chính trong môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên trong một vài trường hợp, galactose (Cabasson và cộng sự, 1997), lactose (Jumin và Nato, 1995), maltose (Dhir và Yavada, 1995), glucose và fructose (Canhoto và Cruz, 1994) 24 và manitol (Kunitake và cộng sự, 1991) khi kết hợp với sucrose đã đẩy mạnh sự cảm ứng tạo phôi cũng như sự phát sinh hình thái bình thường của phôi.  Chất điều hòa tăng trưởng Chất điều hòa tăng trưởng được chia làm 5 nhóm chính là auxin, cytokinin, acid abscisic, gibberellin, ethylen. Các chất điều hòa tăng trưởng là tối cần thiết cho việc cảm ứng tạo phôi và mỗi chất điều hòa tăng trưởng thì lại có những tác dụng lên việc tạo phôi khác nhau trên những loài thực vật khác nhau và ở những nồng độ khác nhau. Quá trình cảm ứng hình thành phôi vô tính ở những loài thực vật khác nhau cho thấy có 3 kiểu ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng đối với phôi: 1) Sự hiện diện của chất điều hòa tăng trưởng là cần thiết trong tất cả các giai đoạn phát triển cuả phôi 2) Chất điều hòa tăng trưởng cần thiết trong giai đoạn cảm ứng, tuy nhiên, sang đến giai đoạn phát triển cao hơn thì các chất điều hòa này cẩn phải được loại bỏ 3) Sự hình thành phôi vô tính chỉ xuất hiện khi có sự có mặt của chất điều hòa tăng trưởng, nhưng khi phôi vô tính phát triển sau giai đoạn hình cầu thì sự có mặt của chất điều hòa không còn tác dụng nữa. Chất điều hòa tăng trưởng là auxin, thường là 2,4-D và NAA được sử dụng trong hơn 50% và 25% trường hợp cảm ứng tạo phôi (Evans và cộng sự, 1983; Litz và Gray, 1992). Có những sự khác biệt ở mức tế bào và mức độ phôi trong hoạt động phân chia tế bào của các tế bào phôi vô tính và tế bào mô sẹo, cũng như là những sự khác biệt trong sự phát triển hình thái của phôi vô tính được cảm ứng trên những chất auxin khác nhau ( Rodrigeuz và Wetztein, 1998). Auxin được chứng tỏ cho thấy có một tác dụng tích cực khi được sử dụng kết hợp với cytokinin và TDZ. Tuy nhiên ở nồng độ auxin cao thường hạn chế sự phát triển của phôi vô tính trong những giai đoạn đầu tiên của sự phát triển phôi. Cytokinin cũng có những tác dụng tương đối lên sự hình thành phôi, nhưng nó không có những tác dụng đáng kể. Mặc dù vậy, sự kết hợp của cả auxin và cytokinin cho thấy nhiều thuận lợi để đạt được hiệu quả cảm ứng phôi tối đa trên một số loài (Cruz và cộng sự, 1990; Nishi, 1997). Tuy nhiên hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu sự 25 dụng TDZ, chất điều hòa tăng trưởng thuộc nhóm cytokinin, nhằm mục đích cảm ứng tạo phôi vô tính ở một số thực vật hai lá mầm (Murthy và cộng sự, 1998). Vì vậy trong những năm gần đây việc sử dụng TDZ đã trở nên phổ biến. Môi trường không có hormone thường được sử dụng cho sự phát triển của phôi vô tính từ dạng hình cầu cho tới khi phát triển thành cây con. Đôi khi, những nồng độ thấp của hormone trong môi trường cần cho sự biểu hiện hoặc trong môi trường cần cho sự phát triển thì có thể có lợi, thậm chí là bắt buộc phải có, tùy theo loài, để kích thích sự phát triển bình thường của phôi. Tóm lại, để cảm ứng tạo một cấu trúc lưỡng cực cần phải có tín hiệu của một loại hormone. Ngược lại, để cảm ứng tạo cơ quan thì phải có hai tín hiệu hormone khác nhau: đầu tiên là tạo chồi, sau đó tạo rễ, sử dụng hai môi trường khác nhau. Để những tế bào phôi phát triển bình thường thành những cây con thì cần một môi trường khác, có hoặc không có hormone.  Thời gian xử lý Khoảng thời gian mẫu cấy được xử lý với chất điều hòa tăng trưởng là một nhân tố quan trọng trong việc cảm ứng cũng như hình thành phôi vô tính một cách bình thường. Khi mẫu cấy được chuyển sang môi trường không có nhân tố tăng trưởng, một khoảng thời gian tối thiểu là 8 ngày rất cần thiết cho việc cảm ứng hình thành phôi với một hiệu quả rất cao mà không cần quan tâm đến dạng chất điều hòa tăng trưởng đã sử dụng.  Sự tương quan gữa độ tuổi của mẫu cấy và sucrose Thường thì độ tuổi (Wetzstein và cộng sự, 1989) hay giai đoạn phát triển của mẫu cấy (Karunaratne và cộng sự, 1991) là một nhân tố quan trọng trong cảm ứng tạo phôi. Do đó, sự phát triển tối đa hay độ tuổi sinh lý của mẫu cấy là một nhân tố chủ yếu trongcảm ứng tạo phôi có hiệu quả ở một số loài thực vật. Hơn nữa, nguồn dinh dưỡng cơ bản cần thiết (sucrose/cacbonhydrate) cho các loại mô thì khác nhau đáng kể tùy vào độ tuồi phát triển (Monnier, 1990). Bên cạnh đó, sự ảnh hưởng của các chất kích thích tăng trưởng khác nhau đến các loại mô khác nhau thì phụ thuộc nhiều vào nồgn độ sucrose có trong môi trường nuôi cấy (Thompson và Thorpe, 1987). Một 26 nồng độ sucrose cao (4-6%) được bổ sung ở giai đoạn cảm ứng và phát triển của phôi thì rất có lợi cho việc tạo phôi ở một số loài thực vật.  Nồng độ của môi trường Nồng độ của các thành phần trong môi trường cơ bản có ảnh hưởng đến việc cảm ứng tạo phôi vô tính. Hầu hết các nghiên cứu tạo phôi trên môi trường MS đều cho hiệu quả tạo phôi cao. Nồng độ môi trường càng loãng thì khả năng tạo phôi càng kém.  Trạng thái vật lý của môi trường Sự tạo thành phôi vô tính thường được cảm ứng trên môi trường bán rắn. Tuy nhiên, trạng thái của môi trường (bán rắn hay lỏng) thì rất quan trọng trong việc duy trì và làm tăng cường sự phát triển của phôi vô tính. Sự cảm ứng tạo phôi vô tính của Gossypium klotzschiapum trên môi trường MS lỏng có bổ sung vitamin B, có chứa các chất điều hòa tăng trưởng cho thấy đạt hiệu quả cao (Yuqiang Sun và cộng sự, 2003). Ở Lilium longiflorum, kết quả tương tự cũng được phát hiện (Tribulato và cộng sự, 1997; Duong Tan Nhut và cộng sự, 2002).  Kiểu gen Một vấn đề thường gặp trong cảm ứng tạo phôi nữa là sự phụ thuộc rất lớn vào loại cây trồng và kiểu gen. Kiểu gen có một ảnh hưởng to lớn trong việc cảm ứng tạo phôi của hầu hết các loài thực vật. Không phải tất cả các thực vật đều có khả năng cảm ứng tạo phôi. Đối với những cây tự thụ phấn, những giống cây khác nhau thì khả năng phát sinh phôi vô tính cũng có thể khác nhau. Đã có các thí nghiệm khác nhau tiến hành trên các loài có kiểu gen khác nhau để khảo sát khả năng hình thành phôi vô tính. Chẳng hạn như ở cây Asparagus, người ta đã quan sát khả năng tạo phôi vô tính trên các giống có kiểu gen khác nhau (Hisato và Masahiro, 1998). Delbreil và Julien (1994) đã mô tả những khác biệt quan sát được từ tần suất tạo phôi từ chồi dỉnh của 12 giống Asparagus có các kiểu gen khác nhau. Những khác biệt về tần suất hình thành phôi ở các loài đa bội ( lưỡng bội, tứ bội) cũng đã được phát hiện ( Kunitake và cộng sự, 1992). Haensch và cộng sự (1996) đã quan 27 sát khả năng hình thành phôi vô tính và tái sinh cây ở những giống Lilium có kiểu gen khác nhau.  Cường độ chiếu sáng Các nhân tố khác trong môi trường nuôi cấy như là cường độ ánh sáng cũng có ảnh hưởng đến việc cảm ừng tạo thành phôi vô tính. Các nghiên cứu cũng đã baó cáo về những ảnh hưởng khác nhau của chế độ sáng và tối. Nhìn chung, chế độ tối đã cho thấy có những ảnh hưởng tốt hơn trong giai đoạn cảm ứng. Ở một số loài thực vật, sự cảm ứng cần có những điều kiện ủ trong tối. Những điều kiện trong tối có thể được tạo bằng cách bao môi trường nuôi cấy bằng những tấm nhôm mỏng hoặc đặt chúng trong hộp carton. Những nghiện cứu tạo phôi vô tính ở loài Gossypium kltzschianum và L.longiflorum đạt được kết quả tốt khi nuôi cấy trong tối (Yuqiang Sun và cộng sự, 2003; Tribulato, 1997). 2.5.5 Những vấn đề thường gặp trong quá trình phát sinh phôi vô tính Một vài vấn đề thường gặp trong quá trình phát sinh phôi vô tính ở vài loại thực vật là sự xuất hiện những phôi dị thường. Các lá mầm có thể bị xoắn lại, mô phân sinh chồi có thể có hình dạng không bình thường hoặc có thể thiếu. Những trường hợp này cần phải có những thao tác phụ để thúc đẩy sự xuất hiện bình thường và sự phát triển của phôi bằng cách sử dụng nồng độ từ thấp đến vừa phải các chất điều hòa tăng trưởng trong môi trường, sử dụng acid abscisic hoặc những cách xử lý thẩm lọc cao, hay bằng những phương pháp vật lý khác như sự sấy khô (Ammirato, 1983; Parrott, 1988). Những thực vật được tái sinh từ nuôi cấy mô sẹo và huyền phù tế bào có thể bị biến dị về hình thái hoặc biến dị ở phần sinh dưỡng. Tuy nhiên, những trường hợp đó ít xuất hiện ở những cây được tái sinh bởi sự phát sinh phôi vô tính hơn là những cây được tái sinh từ sự phát sinh cơ quan (Ammirato, 1987; Reisch, 1983). Nếu những cây được sử dụng với mục đích nhân lên, thì việc kiểm tra lại kiểu di truyền là rất quan trọng bằng cách tiến hành kiểm tra độ hữu thụ và chỉ số di truyền cho nhửng đặc điểm tiêu biểu. Nếu những cây được sử dụng với mục đích sản xuất thì những kiểu biến dị nên được bỏ đi. 28 Hình 2.7 Phôi có hình dạng dị thƣờng Một điều đáng chú ý nữa là sự phát sinh phôi vô tính và sự phát sinh cơ quan thì không loại trừ nhau. Ví dụ, cỏ ba lá có thể được tái sinh từ phôi vô tính (Phillips và Collins, 1984). Tuy nhiên khi nuôi cấy trên môi trường thuận lợi cho sự phát triển chồi thì cũng tạo ra phôi vô tính, sau đó nuôi cấy trên môi trường thuận lợi cho sự nhân lên của chồi thì đã tạo ra nhiều cây tái sinh hơn so với khi nuôi cấy bình thường. Vì vậy những phương pháp làm cho phát sinh phôi và làm tái sinh cơ quan được kết hợp để làm tối ưu hóa khả năng tái sinh cây. Thật thú vị khi trên cùng môi trường thuận lợi cho sự phát triển sinh cực chồi của những phôi vô tính cũng là môi trường thích hợp để tái sinh những hợp tử phôi lai khác loài. Từ đó cho thấy đã có một vài đặc điểm tương tự giữa phôi hợp tử và phôi vô tính 2.5.6 Ứng dụng của việc tạo phôi vô tính Phôi vô tính giúp cho công tác vi nhân giống và sản xuất với số lượng lớn thực vật bằng bioreactor, và đồng thời mở ra một hướng mới trong công nghệ tạo hạt nhân tạo. phôi vô tính còn là nguyên liệu cho việc chuyển gen ở thực vật, công nghệ nuôi cấy tế bào trần. Áp dụng công nghệ đông lạnh phôi vô tính là một phương pháp rất hiệu quả trong việc bảo quản phôi mầm trong một thời gian dài. Quá trình tạo thành phôi vô tính còn giúp ích cho việc nghiên cứu tính toàn thể, cũng như tìm hiểu cơ chế biệt hóa ở tế bào thực vật. Việc tạo thành công phôi vô tính ở một số loài thực vật, cả hạt trần lẫn hạt kín, cây một lá mầm và hai lá mầm, đã mở ra nhiều triển vọng mới cho 29 nền công nghệ sinh học thực vật, tuy nhiên đây là một công việc khó khăn và khá mới mẻ. Hình 2.8 Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ phôi 2.5.7 Một số thành tựu tạo phôi vô tính Phôi vô tính đã được nghiên cứu trên hơn 130 loài, bao gồm các loài ngũ cốc, các loài cỏ, cây họ đậu và các cây có quả hình nón (Ammirato, 1983; Wann,1988). Trong đó, việc nghiên cứu tạo phôi Lan cũng rất được các nhà khoa học quan tâm.  Tạo phôi thông qua nuôi cấy protocorm lan Hồ Điệp (Jen Tsung Chen và Wei Chin Chang, Đài Loan): Jen-Tsung Chen và Wei-Chin Chang là 2 nhà nghiên cứu lan nổi tiếng ở châu Á. Hai ông tiến hành nuôi cấy Protocorm lan Hồ Điệp trên môi trường ½ MS không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng. Sau 45 ngày nuôi cấy, 28.1% mẫu cấy hình thành phôi, trung bình 1 mẫu hình thành 1 phôi. Khi nuôi cấy thử nghiệm Protocorm lan Hồ Điệp trên môi trường MS bổ sung TDZ (0.45M, 4.54M, 13.62M), hai ông thấy rằng TDZ có ảnh hưởng trực tiếp đến sự hình thành phôi vô tính. Trong đó, môi trường bổ sung TDZ nồng độ 13.62M cho hiệu quả tạo phôi cao nhất: gần 100% mẫu protocorm hình thành phôi (45NSC). Trung bình 30 13.5 phôi/mẫu cấy… Ngược lại, khi bổ sung thêm NAA (nồng độ 0.54M và 57.37M) sẽ ức chế sự tạo phôi.  Phƣơng pháp nuôi cấy tạo phôi lan Hồ Điệp từ cuống hoa (Ken Tokuhara và Masahiro, Nhật Bản) Theo báo cáo của hai nhà khoa học người Nhật này, khi nuôi cấy mẫu cuống hoa trên môi trường New Dogashima (NDM) có chứa (NAA 0,5µM + BA 4,4µM + sucrose 29,2 mM) thì mô sẹo phát sinh phôi (embryo callus) sẽ được tạo thành sau 7 tháng nuôi cấy, với tỉ lệ 73% mẫu cấy hình thành embryo callus.  Tác động của điều kiện nuôi cấy và cơ quan nuôi cấy lên sự hình thành phôi soma lan Oncidium (Jen-Tsung Chen và Wei-Chin Chang): Theo báo cáo của tác giả, sự hình thành phôi có liên quan đến vị trí mẫu cấy: những mảnh có vị trí ở phía đầu lá có khả năng tạo phôi cao hơn là ở những vị trí khác và môi trường tốt nhất cho việc tạo phôi lan Oncidium là: môi trường 1/2MS (chứa 85mg/l KH2PO4) bổ sung 10-20 g/l sucrose, 170mg/l NaH2PO4 và 0,5 mg/l peptone.  Phƣơng pháp nuôi cấy tạo phôi lan Hồ Điệp từ mô sẹo (Nguyễn Bá Hùng , Hồng Ngọc Trâm, 2005). Phôi vô tính sẽ hình thành khi nuôi cấy mô sẹo trên môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/l + BA 2 mg/l + đường 30g/l sau 11 tuần nuôi cấy. 31 2.6 Công nghệ tạo hạt nhân tạo 2.6.6 Khái niệm về hạt nhân tạo Hình 2.9 Hạt nhân tạo 32 Hạt tổng hợp hay hạt nhân tạo là một thuật ngữ được dùng để nói đến các phôi vô tính hoặc các thể nhân giống khác được bao lấy bởi một lớp gel mang chất dinh dưỡng, giúp cho việc bảo quản trong thời gian dài, vận chuyển trở nên dễ dàng hơn. Khái niệm được đưa ra lần đầu tiên bởi Murashige vào năm 1978. Công nghệ hạt nhân tạo sử dụng phôi vô tính có vai trò rất quan trọng trong việc trồng trọt ở những loài thực vật : (1) Không tạo được hạt (2) Hạt được tạo thành với một số lượng thấp (3) Khả năng hạt sống sót thấp (4) Việc nhân giống thực vật khó khăn và chất mầm không thể bảo quản được. 2.6.2 Mục đích của sự ra đời công nghệ hạt nhân tạo Sự biểu hiện thành công của việc tái sinh cây thông qua sự hình thành phôi vô tính ở một vài loài thực vật đã mở ra một phạm vi ứng dụng mới đó là tạo hạt nhân tạo nhằm tạo một hệ thống vận chuyển dễ dàng cho việc gieo trực tiếp phôi lên đất trồng. Khả năng tái sinh cây của một số loài thực vật từ phôi vô tính và sự thích hợp khí hậu sau đó của cây là một trong những yếu tố khó khăn nhất nhằm đạt đến thành công trong việc tạo hạt này. Phôi vô tính được tạo thành in vitro thiếu một vỏ bao ngoài và có khuynh hướng nẩy mầm ngay tức khắc (nếu phôi đã trưởng thành) dưới những điều kiện tối ưu hoặc có thể chuyển vào trạng thái thụ động nếu bị thiếu nước (Litz và Gray, 1992). Ngược lại phôi hợp tử với vỏ bao bên ngoài có một khả năng chịu hạn rất cao (Senaratna và csv, 1990, 1995; Teng và Hor, 1997). Do đó, cần có một hệ thống để cảm ứng phôi vô tính sao cho nó hoạt động giống phôi hợp tử, và từ đó có thể chịu đựng được những tổn hại ở mức tối thiểu. 33 2.6.3 Qui trình tạo hạt nhân tạo Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu tạo hạt nhân tạo  Với nguyên liệu là chồi (shootbud) Dùng dao cắt những chồi (shootbud) có kích thước 2-3 mm từ cây nuôi cấy in vitro.  Với nguyên liệu là phôi vô tính Dùng dao tách rời các phôi hình tim. 34 Bước 2. Dùng pince cấy gắp các phôi/chồi cho vào môi trường tạo vỏ alginate. Bước 3 Dùng pipette 10ml hút môi trường alginate có chứa chồi/phôi nhỏ vào dung dịch CaCl2.2H2O 100mM trong 15 phút. Somatic embryos formed from cultured plant parts are ideal for artificial seed production. Bước 4. Dùng pince gắp hạt vào đĩa petri có chứa nước cất vô trùng để làm sạch lượng CaCl2.H2O còn sót lại. Bước 5. Cấy hạt nhân tạo vào môi trường nuôi cấy (MS không bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng). 35 2.6.4 Các nhân tố cần thiết trong việc tổng hợp hạt nhân tạo Quá trình tổng hợp hạt nhân tạo từ phôi vô tính là một công việc được thực hiện với nhiều bước nhưng ít tốn kém. Để việc tổng hợp hạt thành công thì đòi hỏi một yêu cầu cơ bản đó là phải có một số lượng lớn các phôi vô tính chất lượng cao, có sức sống tốt, và các phôi này phải phát triển đồng bộ. Yêu cầu về một chất lượng tốt toàn diện của các phôi vô tính là yếu tố quan trọng hơn cả để đạt được tần suất biến đổi từ phôi đến cây con cao. Quá trình làm vỏ bọc cho phôi chỉ quan trọng trong sự vận chuyển phôi, nó không phải là một nhân tố làm giới hạn sự phát triển của hạt nhân tạo. Có rất nhiều tác nhân tạo gel được sử dụng làm vỏ bọc cho phôi. Đó có thể là agar, alginate, polyco 2133 (Bordon Co.), carboxyl methyl cellulose, carrageenan, gelrite (Kelko. Co.), guargum, sodium pectate, tragacanth gum, dextran, xanthan gum … những hợp chất này sẽ đông lại thành gel khi được cho vào môi trường có chất điện phân thích hợp như đồng sulphate, calcium chloride hoặc ammonium chloride nhờ vào những liên kết ion. Phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để tạo vỏ bọc cho phôi đó là sử dụng sodium alginate (Bajaj, 1995; Jeon và csv, 1986; Redenbaugh và csv, 1993). Alginate được sử dụng nhiều do nó có những đặc tính rất thuận lợi như tính dính vừa phải, không gây độc cho phôi sinh dưỡng, có các đặc tính tương hợp sinh học, khả năng tạo thành gel nhanh, rẻ tiền, để được lâu, độ cứng của gel vừa phải để có thể vừa tạo thuận lợi cho sự hô hấp của phôi và vừa bảo vệ được phôi khỏi những tổn thương bên ngoài. 2.6.5 Nguyên tắc và điều kiện khi tạo vỏ bọc bằng chất nền alginate sodium Alginate, chất hữu cơ mạch thẳng, kỵ nước, muối của acid alginic, là một polyuronic bao gồm -D-mannuronate (M) và mảnh bên C5 -L-guluronate (G) (Aoyagi và csv, 1998). 36 Nguyên tắc chính trong quá trình tạo vỏ bọc alginate đó là sodium alginate chứa phôi sẽ tạo thành từng hạt nhỏ, tròn và cứng khi nhỏ vào trong hỗn hợp NaCl2.2H2O nhờ vào sự trao đổi ion giữa ion Na + có trong hỗn hợp sodium alginate với Ca2+ có trong hỗn hợp CaCl2.2H2O. Vỏ bọc cứng nhiều hay ít là phụ thuộc vào số lượng ion Na+ trao đổi với ion Ca2+. Do đó nồng độ của hai tác nhân tạo gel, sodium alginate và CaCl2.2H2O, và thời gian cho việc tạo liên kết ion phải thật tối ưu để có thể tạo thành vỏ bọc ở một độ cứng thích hợp nhất. Không như phôi hợp tử, phôi vô tính thiếu lớp nội nhũ chứa chất dinh dưỡng bên ngoài nuôi phôi, do đó bằng việc thêm vào chất nền gel những chất dinh dưỡng, chất điều hòa tăng trưởng, carbohydrate sẽ tạo một nội nhũ nhân tạo thích hợp tối đa cho tăng trưởng và sống sót của phôi (Gray, 1990; Gray và Purohit, 1991; Redenbaugh và Walker, 1990). Ngoài ra nhằm tránh cho phôi bị mất nước, hay các tổn thương cơ học, tăng sức đề kháng cho phôi người ta có thể thêm vào chất nền gel chất kháng sinh, thuốc trừ nấm, trừ sâu, vi sinh vật. Mặc dù việc tạo hạt nhân tạo từ cách bọc phôi vô tính bằng sodium alginate cho thấy có một số thành công nhất định trong việc tái sinh cây con, vẫn còn nhiều vấn đề khó khăn khi sử dụng vỏ bao alginate này, chất dinh dưỡng có thể bị mất đi khỏi vỏ bao (Redenbaugh và csv, 1987), sự trao đổi khí kém (Redenbaugh và csv, 1993)… Đã có một số đề nghị cho rằng, việc thêm vào than hoạt tính sẽ giúp nâng cao khả năng sống sót, phát triển của phôi vô tính hơn. Nguyên nhân là do than hoạt tính tăng cường khả năng hô hấp của phôi, và nó giữ lại những chất dinh dưỡng nhiều hơn trong vỏ bọc, phóng thích chúng rất chậm dùng cho sự phát triển của phôi. 37 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Các thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Công nghệ Sinh học của Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Thời gian thí nghiệm từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005. 3.2 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu  Dụng cụ Tủ cấy, nồi hấp vô trùng, máy lắc, bình tam giác dung tích 300 ml, đĩa inox và các dụng cụ khác. Dụng cụ nuôi cấy được hấp khử trùng ở 1,2 atm, 121oC trong 25 phút.  Mẫu cấy PLB (protocorm like body) cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) in vitro.  Môi trường nuôi cấy Các thí nghiệm được thực hiện trên 2 môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) và VW (Vacin và Went, 1949). Môi trường được bổ sung các chất kích thích sinh trưởng như BAP, 2,4D, TDZ, và các chất khác (khoai tây, nước dừa, đường, than hoạt tính) tùy theo mỗi nghiệm thức thí nghiệm. pH môi trường 5,7. Thể tích môi trường là 70ml/bình tam giác. Bột sodium alginate, agar được dùng tạo gel và dung dịch CaCl2.2H2O 100mM giúp tạo vỏ cứng cho hạt. Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở điều kiện áp suất 1,2 atm, nhiệt độ 121 0C trong 20 phút.  Điều kiện nuôi cấy Phòng dưỡng cây có nhiệt độ 250C± 20C, thời gian chiếu sáng 16 giờ, cường độ chiếu sáng 2.500 lux, ẩm độ 75-80%. 38 3.2.2 Phương pháp 3.2.2.1 Thiết kế thí nghiệm Thực hiện 5 thí nghiệm theo các giai đoạn sau : - Giai đoạn 1 : tạo mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro. - Giai đoạn 2 : tạo phôi soma từ mô sẹo của cây lan Hồ Điệp in vitro. - Giai đoạn 3 : tạo cây lan Hồ Điệp in vitro hoàn chỉnh từ phôi soma. - Giai đoạn 4 : tạo hạt nhân tạo từ phôi soma và tạo cây hoàn chỉnh từ hạt nhân tạo. Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Mỗi nghiệm thức cấy 3 bình tam giác, mỗi bình cấy 5 mẫu.  Tổng số mẫu cấy ở mỗi thí nghiệm: 45 mẫu. 39  Các thí nghiệm tạo mô sẹo từ PLB (protocorm like body) Thí nghiệm 1 : Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro Thí nghiệm gồm 13 nghiệm thức Nghiệm thức Môi trƣờng Nồng độ (mg/l) 2,4-D BAP 1.1(đối chứng) VW 0 0 1.2 VW 0,01 0 1.3 VW 0,1 0 1.4 VW 1 0 1.5 VW 0 0,01 1.6 VW 0 0,1 1.7 VW 0 1 1.8 VW 0,1 0,01 1.9 VW 0.1 0.1 1.10 VW 0.1 1 1.11 VW 1 0.01 1.12 VW 1 0.1 1.13 VW 1 1 Các chất khác agar (8,6g/l) + sucrose (40g/l) + nước dừa (200ml/l) + than (1g/l) 40 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức: Nghiệm thức Môi trƣờng Nồng độ Đƣờng (mg/l) Nƣớc dừa (ml/l) 2.1(đối chứng) VW 0 0 2.2 VW 20 100 2.3 VW 20 150 2.4 VW 20 200 2.5 VW 40 100 2.6 VW 40 150 2.7 VW 40 200 2.8 VW 60 200 2.9 VW 80 200 Các chất khác 2,4-D (0,1 mg/l) + BAP (0.01 mg/l) + agar (8,6 g/l) + than(1 g/l) 41  Thí nghiệm phát sinh phôi soma từ mô sẹo Thí nghiệm 3 : Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng TDZ trong điều kiện môi trường đặc, lỏng lắc đến khả năng hình thành phôi soma từ mô sẹo của cây lan Hồ Điệp in vitro Bước 1: Tăng sinh khối mô sẹo Thí nghiệm 3a : môi trường đặc, Thí nghiệm 3b : môi trường lỏng và lắc (100 vòng/phút), Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức: Nghiệm thức Môi trƣờng Nồng độ của TDZ (mg/l) 3.1(đối chứng) VW 0 3.2 VW 0,1 3.3 VW 1,0 3.4 VW 2,0 3.5 VW 3,0 Các chất khác : đường (40 g/l) + nước dừa (200g/l) Có hay không có bổ sung agar (8,6g/l) tùy vào thí nghiệm Bước 2: Phát sinh phôi soma Mô sẹo thu được từ thí nghiệm 3 được tách thành những cụm nhỏ và cấy chuyền sang môi trường đặc ½ VW. 42  Thí nghiệm tái sinh chồi từ phôi soma Thí nghiệm 4 : Ảnh hưởng của các loại môi trường đến quá trình tái sinh cây lan Hồ Điệp in vitro từ phôi soma Thí nghiệm gồm 8 nghiệm thức Nghiệm thức Môi trƣờng Hàm lƣợng (g/l) Khoai tây Than 4.1(đối chứng) MS 0 0 4.2 MS 30 0 4.3 MS 30 1 4.4 ½MS 30 1 4.5 VW 0 0 4.6 VW 30 0 4.7 VW 30 1 4.8 ½VW 30 1 Chất khác : đường (30g/l) + agar (8,6g/l) 43  Thí nghiệm tạo hạt nhân tạo Thí nghiệm 5 : Ảnh hưởng của môi trường tạo vỏ hạt đến sự tái sinh cây con từ hạt nhân tạo Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức Nghiệm thức Môi trƣờng Hàm lƣợng sodium alginate (g/l) 5.1(đối chứng) MS 30 5.2 1/2MS 30 5.3 1/5MS 30 5.4 VW 30 5.5 1/2VW 30 5.6 1/5VW 30 Các chất khác : agar (8,6g/l) + đường (30g/l) Dùng dao phẩu thuật tách rời các phôi hình tim. Dùng pince cấy gắp các phôi cho vào môi trường tạo vỏ alginate. Dùng pipette hút môi trường alginate có chứa phôi nhỏ vào dung dịch CaCl2.2H2O 100mM. Sau 15 phút dùng pince cấy gắp hạt vào đĩa petri có nước cất vô trùng. Rửa hạt bằng nước cất vô trùng làm sạch lượng CaCl2.2H2O còn sót lại bên ngoài vỏ hạt. Sau khi thực hiện xong giai đoạn tạo vỏ hạt nhân tạo, hạt được cấy vào môi trường nuôi cấy (MS không bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng). Quan sát khả năng tái sinh thành cây con của hạt. 44 3.2.2.2 Chỉ tiêu theo dõi  Thí nghiệm tạo mô sẹo từ PLB _Thời gian hình thành mô sẹo (NSC): tính từ ngày cấy chuyền đến khi có 50% mẫu cấy xuất hiện mô sẹo. _Màu sắc của mô sẹo. _Độ cứng của mô sẹo. _% mẫu cấy hình thành mô sẹo: (Số mẫu hình thành mô sẹo / Số mẫu cấy)*100 _% mẫu cấy hình thành mô sẹo+PLB: (Số mẫu vừa hình thành mô sẹo vừa hình thành PLB/ Số mẫu cấy) *100. _% mẫu cấy hình thành PLB: (Số mẫu hình thành PLB / Số mẫu cấy) *100. _% mẫu không phản ứng+mẫu chết: (Số mẫu không phản ứng và số mẫu chết/ Số mẫu cấy) *100.  Thí nghiệm phát sinh phôi soma từ mô sẹo _Hệ số tạo phôi: Số phôi tạo ra / Số mẫu cấy.  Thí nghiệm tái sinh cây con từ phôi soma _Tỉ lệ mẫu chết (%): (Số mẫu chết / Số mẫu cấy)*100. _Hệ số nhân chồi: Số chồi tạo ra / Số mẫu cấy. _Số lá /chồi: Tổng số lá / Tổng số chồi. _Số rễ /chồi: Tổng số rễ / Tổng số chồi. _Chiều dài lá (mm). _Chiều dài rễ (mm).  Thí nghiệm tạo hạt nhân tạo _Tỉ lệ nảy mầm: (Số hạt nảy mầm / Số hạt được cấy)*100.  Các chỉ tiêu được theo dõi 1 tuần/lần.  Số mẫu cấy ở mỗi thí nghiệm: 45 mẫu. 3.2.2.3 Xử lý số liệu Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Statgraphics 7.0 và Excel. 45 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN  Các thí nghiệm tạo mô sẹo từ PLB (protocorm like body) Thí nghiệm 1 : Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) 2,4-D là chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin, còn BA là chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin. Sự kết hợp giữa 2 chất này ở một tỉ lệ thích hợp sẽ giúp cho mẫu cấy có hiệu quả tạo mô sẹo rất cao. Bảng 4.1 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến thời gian hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro Nghiệm thức 2,4D (mg/l) BA (mg/l) Thời gian hình thành mô sẹo (NSC) Màu sắc của mô sẹo Độ cứng của mô sẹo 1 (ĐC) 0 0 19.88 Trắng xanh Xốp 2 0,01 0 20.88 Trắng xanh Xốp 3 0,1 0 20.55 Trắng xanh Xốp 4 1 0 20.55 Trắng xanh Xốp 5 0 0.01 19.66 Vàng xanh Chắc 6 0 0.1 19.77 Vàng xanh Chắc 7 0 1 20.00 Vàng xanh Chắc 8 0,1 0.01 20.22 Vàng xanh Chắc 9 0.1 0.1 19.44 Vàng xanh Chắc 10 0.1 1 20.44 Vàng xanh Chắc 11 1 0.01 20.44 Trắng xanh Xốp 12 1 0.1 21.00 Trắng xanh Xốp 13 1 1 20.44 Vàng xanh Chắc 46  Nhận xét: Kết quả cho thấy thời gian hình thành mô sẹo ở nghiệm thức 9 (môi trường VW bổ sung thêm 0.1 mg/l 2,4-D và 0.1 mg/l BA) là sớm nhất: 19.44 NSC. Tuy nhiên không có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các nghiệm thức. Về mặt hình thái của mô sẹo, chúng tôi nhận thấy:  Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D cao hơn BA thì mô sẹo có màu trắng xốp, dễ vỡ.  Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D thấp hơn BA thì mô sẹo thường có màu vàng xanh và khá chắc. Mô sẹo trắng xốp Mô sẹo vàng xanh Hình 4.1 Màu sắc của mô sẹo 47 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) Nghiệm thức 2,4D (mg/l) BA (mg/l) %mẫu cấy hình thành mô sẹo %mẫu cấy hình thành mô sẹo + PLB %mẫu hình thành PLB %mẫu không phản ứng+mẫu chết 1 (ĐC) 0 0 24.44 H 15.55 C 33.33 A 26.68 E 2 0,01 0 46.67 E 13.33 D 8.89 DE 31.11 D 3 0,1 0 53.33 D 15.56 C 6.67 EF 24.44 E 4 1 0 68.89 B 11.11 E 8.89 DE 11.11 G 5 0 0.01 62.22 C 15.56 C 15.56 B 6.67 H 6 0 0.1 48.89 E 22.22 A 11.11 CD 17.78 F 7 0 1 48.89 E 13.33 D 4.44 F 33.34 CD 8 0,1 0.01 80.00 A 8.89 F 6.67 EF 4.44 H 9 0.1 0.1 53.33 D 6.67 G 8.89 DE 31.11 D 10 0.1 1 42.22 F 11.11 E 8.89 DE 37.78 B 11 1 0.01 46.67 E 20.00 B 13.33 BC 20.00 F 12 1 0.1 35.56 G 13.33 D 15.56 B 35.55 BC 13 1 1 22.22 H 6.67 G 6.67 EF 64.45 A CV(%) 4,05 7.7 20 9.7  Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.  Nhận xét: Sau khoảng thời gian từ 30 – 45 ngày sau khi cấy, sự đáp ứng của mẫu cấy với các loại môi trường đã có sự khác biệt rõ ràng. Nghiệm thức 1 (đối chứng) có tỉ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo thấp, vì ở môi trường không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng, PLB có khuynh hướng tăng sinh tạo thêm nhiều PLB mới. 48 Riêng nghiệm thức 13 có tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo cũng rất thấp, mẫu cấy phát triển yếu nên tỉ lệ mẫu chết và không phản ứng khá cao (64.45%). Ở nghiệm thức 8 (2,4-D=0.1mg/l kết hợp BA=0.01mg/l) là môi trường có tỉ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo lớn nhất: 80% và đây cũng là môi trường có tỉ lệ mẫu chết và không phản ứng ít nhất (4.44%).  Kết luận sơ bộ Ở nghiệm thức đối chứng, PLB cũng có khả năng tạo mô sẹo nhưng còn thấp, chủ yếu là tăng sinh PLB hoặc mẫu không phản ứng. Nghiệm thức 8 đạt tỉ lệ tạo mô sẹo cao nhất và tỉ lệ mẫu chết thấp nhất nên thích hợp để tạo mô sẹo lan Hồ Điệp từ PLB. Nghiệm thức 5 chứng tỏ việc sử dụng kết hợp 2,4-D và BA ở nồng độ cao cùng lúc đã gây ức chế quá trình phát triển của mẫu cấy PLB lan Hồ Điệp. Qua kết quả thu nhận được ở thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy:  Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D cao hơn BA thì từ protocorm sẽ phát triển thành mô sẹo nhiều hơn và mô sẹo có màu trắng xốp, dễ vỡ.  Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D thấp hơn BA thì khả năng hình thành mô sẹo sẽ thấp, còn khả năng tăng sinh protocorm và tái sinh chồi tăng lên. Do đó mô sẹo thường có màu vàng xanh và khá chắc.  Ở môi trường mà tỉ lệ 2,4-D và BA quá cao thì mẫu rất dễ chết, khả năng tạo mô sẹo thấp. 49 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) Đường đóng vai trò rất quan trọng trong nuôi cấy mô, đây là nguồn cung cấp carbohydrate chủ yếu, giúp cho cây có khả năng sinh trưởng trong điều kiện in vitro. Bên cạnh đó, nước dừa cũng được sử dụng khá phổ biến do nước dừa có chứa Myo- Inositol, Riboflavin, Axit folic…có tác dụng cung cấp chất dinh dưỡng cho mẫu cấy trong quá trình tạo mô sẹo cũng như tái sinh cây. Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến thời gian hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro Nghiệm thức Đƣờng (g/l) Nƣớc dừa (ml/l) Thời gian hình thành mô sẹo (NSC) 1 (ĐC) 0 0 0.00 B 2 20 100 21.11 A 3 20 150 20.89 A 4 20 200 19.89 A 5 40 100 21.11 A 6 40 150 20.22 A 7 40 200 20.22 A 8 60 200 20.56 A 9 80 200 20.22 A CV(%) 13.8  Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.  Nhận xét: Nghiệm thức 4 có thời gian hình thành mô sẹo sớm nhất, có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với nghiệm thức đối chứng do ở nghiệm thức này không có sự xuất hiện mô sẹo. Bên cạnh đó, nghiệm thức 4 lại không có sự sai khác về mặt thống kê so với các nghiệm thức còn lại (trừ nghiệm thức đối chứng). 50 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) Nghiệm thức Đƣờng (g/l) Nƣớc dừa (ml/l) %mẫu cấy hình thành mô sẹo %mẫu cấy hình thành mô sẹo + PLB %mẫu hình thành PLB %mẫu không phản ứng+mẫu chết 1 (ĐC) 0 0 0.00 F 0.00 G 71.11 A 28.89 A 2 20 100 60.00 C 15.56 B 11.11 C 13.33 D 3 20 150 55.56 D 17.78 A 8.89 CD 17.78 C 4 20 200 48.89 E 11.11 C 22.22 B 17.78 C 5 40 100 64.44 BC 8.89 D 8.89 CD 17.78 C 6 40 150 55.56 D 11.11 C 8.89 CD 24.44 B 7 40 200 80.00 A 8.89 D 6.67 D 4.44 E 8 60 200 62.22 BC 6.67 E 2.22 B 28.89 A 9 80 200 66.67 B 4.44 F 2.22 B 26.67 AB CV(%) 4,9 12.3 6.8 10  Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.  Nhận xét: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro, 40 ngày sau cấy chúng tôi nhận thấy, trừ nghiệm thức đối chứng, các nghiệm thức còn lại đều xuất hiện mô sẹo. Mô sẹo ban đầu có màu trắng vàng xốp, sau đó chuyển sang màu vàng xanh và chắc. Trong đó, nghiệm thức 7 (VW bổ sung 40g/l đường và 200ml/l nước dừa) có tỉ lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo cao nhất: 80% mẫu, có sự khác biệt rất có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng: không có mẫu nào hình thành mô sẹo. Ngoài ra, nghiệm thức đối chứng còn có tỉ lệ mẫu không phản ứng và mẫu chết cao nhất (28.89%). Ngược lại, nghiệm thức 7 có tỉ lệ mẫu chết thấp nhất (4.44%). 51  Kết luận sơ bộ Về khả năng tạo mô sẹo, khi ta thay đổi nồng độ đường (0-80g/l) và nước dừa (0-200 ml/l) thì tỉ lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo cũng thay đổi. Chứng tỏ nồng độ đường và nước dừa có ảnh hưởng lớn đến khả năng tạo mô sẹo của protocorm lan Hồ Điệp, có tác dụng kích thích khả năng tạo mô sẹo khi tăng nồng độ. Trong đó môi trường VW bổ sung 40g/l đường và 200ml/l nước dừa cho tỉ lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo cao nhất (80% mẫu) nên được khuyến khích sử dụng. 52  Các thí nghiệm phát sinh phôi soma từ mô sẹo Thí nghiệm 3 : Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng TDZ trong điều kiện môi trường đặc, lỏng lắc đến khả năng hình thành phôi soma từ mô sẹo của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) TDZ là chất kích thích sinh trưởng đặc biệt thuộc nhóm cytokinin. Ngoài tính chất tạo chồi của một cytokinin, nó còn có khả năng tăng sinh mô sẹo của một auxin, hoặc được dùng thay thế cho auxin hoặc tổ hợp auxin và cyokinin trong sự hình thành phôi ở nhiều loài cây khác nhau. Qua đó, thí nghiệm sử dụng TDZ trong sự hình thành phôi soma từ mô sẹo của cây lan Hồ Điệp in vitro được tiến hành qua 2 bước như sau:  Bước 1. Tăng sinh mô sẹo (45NSC) Thí nghiệm 3a : Nuôi cấy trên môi trường đặc Sau khoảng thời gian 30-45 ngày sau khi cấy, chúng tôi quan sát thấy mô sẹo nuôi cấy trên môi trường đặc phát triển tốt, sinh khối tăng nhanh và sự phát triển của mô sẹo ở các nghiệm thức khá đều nhau. Trong đó, phần lớn sinh khối tạo thành là mô sẹo, chỉ có một số ít là các cấu trúc giống phôi. Do đó, môi trường đặc chỉ thích hợp cho việc cảm ứng sự phát triển của mô sẹo. Hình 4.2 Mô sẹo lan Hồ Điệp trên môi trường đặc TDZ 2mg/l. 53 Thí nghiệm 3b : Nuôi cấy trên môi trường lỏng và lắc (100 vòng/phút) Khi nuôi cấy mô sẹo trong môi trường lỏng lắc chúng tôi quan sát thấy lượng sinh khối tạo ra ít hơn so với nuôi cấy trên môi trường đặc, phần lớn có màu tối và khá chắc. Trong đó nghiệm thức 4 với nồng độ TDZ 2mg/l có lượng sinh khối cao nhất và màu sáng hơn các môi trường còn lại, đặc biệt xuất hiện một số mô sẹo có màu xanh. Hình 4.3 Mô sẹo lan Hồ Điệp trên môi trường TDZ lỏng lắc.  Bước 2: Phát sinh phôi soma (45NSC). Mô sẹo thu được từ thí nghiệm 3 được tách thành những cụm nhỏ và cấy chuyền sang môi trường ½ VW. Sau 45 ngày nuôi cấy chúng tôi nhận thấy xuất hiện nhiều các cấu trúc giống phôi trên bề mặt embryo callus (sinh khối thu được ở bước 1). Quan sát dưới kính hiển vi soi nổi thì chúng ta có thể thấy rằng các dạng này có hình thái tương tự như hình thái phôi vô tính, cũng trãi qua tất cả các giai đoạn phát triển: hình cầu, hình tim, hình thuỷ lôi, hình lá mầm. Kết luận rằng đây chính là phôi vô tính của lan Hồ Điệp (phalaenopsis.sp) TDZ 1mg/l TDZ 2mg/l 54 Phôi hình cầu Phôi hình tim Phôi hình thuỷ lôi Phôi hình lá mầm Hình 4.4 Các giai đoạn phát sinh phôi ở lan Hồ Điệp Sự phát sinh phôi vô tính này có sự khác nhau đáng kể giữa các mẫu cấy chuyền từ những bình nuôi cấy ở thí nghiệm 3.  Mô sẹo từ các bình nuôi cấy đặc ở thí nghiệm 3a ban đầu tiếp tục gia tăng sinh khối, chỉ có 1 số ít phôi vô tính xuất hiện.  Mô sẹo từ các bình nuôi cấy lỏng lắc ở thí nghiệm 3b có kết cấu khá chắc và tạo ra lượng phôi vô tính khá nhiều. 55 Bảng 4.5 Số phôi được tạo ra khi cấy chuyền mô sẹo từ thí nghiệm 3a và 3b sang môi trường đặc 1/2VW CV(%) 23 18,3  Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.  Nhận xét: Kết quả thí nghiệm cho thấy hiệu quả tạo phôi ở những mẫu cấy được cảm ứng trên môi trường TDZ lỏng lắc ở thí nghiệm 3b cao hơn hẳn so với những mẫu cấy được cảm ứng trên môi trường TDZ đặc ở thí nghiệm 3a. Trong đó, số phôi hình thành nhiều nhất (39,67 phôi) là ở những mẫu cấy được cảm ứng trên môi trường lỏng lắc với nồng độ TDZ 2mg/l. Trong khi nghiệm thức đối chứng không có phôi nào được tạo ra. Biểu đồ 4.1 Thí nghiệm gia tăng sự phát sinh phôi Nghiệm thức Nồng độ của TDZ (mg/l) Số phôi/mẫu cấy từ môi trƣờng đặc (3a) Số phôi /mẫu cấy từ môi trƣờng lỏng lắc (3b) 3.1 0 0.00 D 0.00 E 3.2 0,1 2.67 C 4.33 D 3.3 1,0 4.33 BC 12.67 C 3.4 2,0 10.67 A 39.67 A 3.5 3,0 5.67 B 20.00 B 56 TDZ 0mg/l (đối chứng) TDZ 2mg/l Hình 4.5 Phôi được tạo ra khi cấy chuyền mô sẹo từ thí nghiệm 3a sang môi trường đặc 1/2VW. TDZ 0,1mg/l TDZ 1mg/l TDZ 2mg/l TDZ 3mg/l Hình 4.6 Phôi được tạo ra khi cấy chuyền mô sẹo từ thí nghiệm 3b sang môi trường đặc 1/2VW. 57  Kết luận sơ bộ: Vậy, việc thêm vào môi trường nuôi cấy TDZ nồng độ 2mg/l là thích hợp nhất cho việc cảm ứng tạo phôi vô tính trên lan Hồ Điệp. Thêm vào đó, giai đoạn nuôi cấy mô sẹo trong điều kiện lỏng lắc là rất cần thiết cho việc cảm ứng phôi vô tính hình thành nhiều hơn và dễ nhận biết hơn. Môi trường nuôi cấy đặc ban đầu cũng tạo được phôi vô tính, tuy nhiên tỉ lệ phôi tạo thành không cao nên phương pháp này không cho được kết quả tốt nhất. 58  Thí nghiệm tái sinh chồi từ phôi soma Thí nghiệm 4 : Ảnh hưởng của các loại môi trường đến quá trình tái sinh cây lan Hồ Điệp in vitro từ phôi soma Khi tiến hành nuôi cấy tái sinh cây, người ta thường bổ sung vào môi trường rất nhiều chất dinh dưỡng. Trong đó, khoai tây được sử dụng khá phổ biến, bổ sung khoai tây vào môi trường nuôi cấy giúp cây in vitro tăng trưởng tốt. Bên cạnh đó, chồi lan khi phát triển thường tiết ra hợp chất phenol gây độc cho mẫu cấy. Do đó trong nuôi cấy người ta còn bổ sung thêm than hoạt tính để hấp thu bớt độc tố do mẫu cấy tiết ra. Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường có hoặc không có bổ sung khoai tây và than đến quá trình tái sinh cây từ phôi soma lan Hồ Điệp, 75 NSC chúng tôi thu được kết quả như sau: Bảng 4.6 Sự phát sinh hình thái của phôi soma ở các loại môi trường (75NSC) Nghiệm thức Xuất hiện mô sẹo Xuất hiện protocorm Xuất hiện chồi Xuất hiện rễ chồi MS X X MS+30g Khoai tây X X X MS+30g Khoai tây+1g Than X X X ½ MS+30g Khoai tây+1g Than X X X VW X X X VW+30g Khoai tây X X X VW+30g Khoai tây+1g Than X X X ½ VW+30g Khoai tây+1g Than X X  Ở môi trường MS không tạo chồi mà lại xuất hiện một ít protocorm + mô sẹo.  Ở môi trường MS+30g khoai tây có xuất hiện chồi và cả protocorm + mô sẹo.  Ở môi trường MS+30g khoai tây+1g Than có xuất hiện chồi nhiều hơn nhưng chủ yếu là protocorm và 1 ít mô sẹo.  Ở môi trường ½ MS+30g khoai tây+1g Than xuất hiện chồi nhiều hơn và 1 ít protocorm. 59  Ở môi trường VW có xuất hiện 1 ít chồi nhưng chủ yếu là mô sẹo + protocorm.  Ở môi trường VW+30g khoai tây xuất hiện chồi nhiều hơn, đặt biệt một số chồi đã mọc rễ.  Ở môi trường VW+30g khoai tây+1g Than xuất hiện chồi nhiều nhất và có rất nhiều chồi đã mọc rễ.  Ở môi trường ½ VW+30g khoai tây+1g Than xuất hiện chồi cũng khá nhiều. 4.1 Ảnh hƣởng của các loại môi trƣờng đến tỉ lệ mẫu chết và hệ số nhân chồi của phôi soma lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh cây. Bảng 4.7 Ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy đến tỉ lệ mẫu chết và hệ số nhân chồi cây lan Hồ Điệp in vitro từ phôi soma 75 NSC.  Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05. Nghiệm thức Số mẫu cấy Số mẫu chết Số chồi hình thành Tỉ lệ mẫu chết (%) Hệ số nhân chồi MS 45 11 0 26.67 A 0,00 E MS+30g khoai tây 45 12 35 24.45 A 0,78 E MS+30g khoai tây+1g than 45 0 65 4.45 BC 1,44 E ½ MS+30g khoai tây+1g than 45 0 405 2.22 BC 9,00 B VW 45 0 20 6.67 B 0,44 E VW+30g khoai tây 45 0 135 2.22 BC 3,00 D VW+30g khoai tây+1g than 45 0 510 0 C 11,34 A ½ VW+30g khoai tây+1g than 45 0 240 0 C 5,33 C CV(%) 32 21,2 60  Nhận xét: 4.1.1 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến tỉ lệ mẫu chết của phôi soma lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh cây. Kết quả cho thấy tỉ lệ mẫu chết ở 2 môi trường là MS và MS+30g khoai tây là cao nhất với tỉ lệ khoảng 26.7%. Mẫu chết có thể là do 1 số phôi yếu không thích ứng được với môi trường cơ bản MS không bổ sung nhiều các chất dinh dưỡng. Ở các môi trường còn lại mẫu vẫn phát triển bình thường thành chồi hoặc tạo protocorm hay mô sẹo, chỉ có một số ít tỉ lệ mẫu bị chết (2.22 – 6,67%). 4.1.2 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến hệ số nhân chồi của phôi soma lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh cây Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, hệ số nhân là điều được quan tâm nhất bởi vì hệ số nhân càng cao thì số lượng cây sẽ càng nhiều. Môi trường MS không bổ sung khoai tây và than có hệ số nhân thấp nhất: không có chồi lan nào được tái sinh mà chỉ xuất hiện protocorm và mô sẹo, môi trường VW cũng có hệ số nhân rất thấp (0,44). Ngược lại, ở môi trường VW + 30g khoai tây + 1g than cho hệ số nhân cao nhất (11,34. Điều này cho thấy việc kết hợp sử dụng khoai tây và than trong nuôi cấy tái sinh lan Hồ Điệp sẽ cho kết quả cao hơn là khi không sử dụng. Biểu đồ 4.2 Hệ số nhân chồi của phôi soma lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh cây. 61 4.2 Ảnh hƣởng của các loại môi trƣờng đến các chỉ tiêu hình thái của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma Bang 4.8 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến các chỉ tiêu hình thái của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma.  Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.  Nhận xét: 4.2.1 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến số lá và chiều dài lá của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma Trong tất cả các môi trường, môi trường VW bổ sung thêm khoai tây và than hoạt tính có số lá trung bình ở mỗi chồi lan nhiều nhất (1,38). Bên cạnh đó, ở môi trường này thì chiều dài lá trung bình của chồi tái sinh cũng là dài nhất (8mm). Nghiệm thức số lá / chồi số rễ/chồi Chiều dài lá (mm) Chiều dài rễ (mm) MS 0,00 D 0,00 B 0,00 G 0,00 B MS+30g Khoai tây 1,00C 0,00B 0.5 0,00B MS+30g Khoai tây+1g Than 1,00C 0,00B 1.00F 0,00B ½ MS+30g Khoai tây+1g Than 1,23B 0,00B 0,83F 0,00B VW 1,00 C 0,00 B 4,67 C 0,00 B VW+30g Khoai tây 1,23B 0,24A 5,00B 3,67A VW+30g Khoai tây+1g Than 1,38A 0,22B 8.00A 4,00A ½ VW+30g Khoai tây+1g Than 1,27B 0,00B 3,33D 0,00B CV(%) 3,4 27 25,6 41.2 62 Nhận xét tổng quát kết quả thí nghiệm ta thấy rằng khi nuôi cấy trên môi trường VW thì sẽ đạt được số lượng lá cao hơn và lá có độ dài hơn hẳn khi nuôi cấy trên môi trường MS. Biểu đồ 4.3 Số lá và chiều dài lá của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma 4.2.2 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến số rễ và chiều dài rễ của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma. Sau 75 ngày nuôi cấy, ở các môi trường phần lớn xuất hiện chồi nhưng rễ chỉ xuất hiện khi nuôi cấy trên môi trường VW có bổ sung khoai tây và môi trường VW bổ sung khoai tây và than. Trong đó, ở môi trường VW bổ sung khoai tây thì số rễ xuất hiện nhiều hơn: 0,24 so với 0,22 (biểu đồ 3.4). Tuy nhiên chiều dài rễ trung bình khi nuôi cấy ở môi trường VW bổ sung khoai tây và than thì dài hơn chiều dài rễ trung bình khi nuôi cấy ở môi trường VW chỉ bổ sung khoai tây: 4 so với 3,67(biểu đồ 3.5). Qua đó thấy rằng khi nuôi cấy tái sinh Hồ Điệp từ phôi trên môi trường VW thì sự cảm ứng tạo rễ dễ xảy ra hơn là khi nuôi cấy trên môi trường MS. 63 Biểu đồ 4.4 Số rễ và chiều dài rễ của lan Hồ Điệp trong nuôi cấy tái sinh chồi từ phôi soma  Kết luận sơ bộ: Nghiệm thức đối chứng (MS và VW), phôi soma không có khuynh hướng tái sinh chồi mà chủ yếu là tăng sinh protocorm. Môi trường VW + 30g Khoai tây + 1g Than có hệ số nhân chồi cao nhất, đồng thời cũng là môi trường có các chỉ tiêu số lá, chiều dài lá, chiều dài rễ cao nhất và có chỉ tiêu số rễ cao thứ 2 trong các môi trường thí nghiệm. Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy nuôi cấy tái sinh Hồ Điệp trên môi trường VW cho kết quả tốt hơn so với nuôi cấy trên môi trường MS. Trong đó môi trường VW bổ sung 30g Khoai tây và 1g Than là môi trường thích hợp nhất cho việc nuôi cấy tái sinh lan Hồ Điệp từ phôi soma. 64 MS MS+30g khoai tây MS+30g khoai tây+1g Than ½ MS+30g khoai tây+1g Than VW VW+30g Khoai tây VW+30g Khoai tây+1 g Than ½ VW+30g Khoai tây+1 g Than Hình 4.7 Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ phôi soma 75 NSC 65  Thí nghiệm tạo hạt nhân tạo Thí nghiệm 5 : Ảnh hưởng của môi trường tạo vỏ hạt đến sự tái sinh cây con từ hạt nhân tạo (60 NSC) Trong công nghệ tạo hạt nhân tạo, điều quan trọng nhất chính là việc chọn môi trường thích hợp để làm vỏ hạt. Môi trường đó phải cung cấp đủ chất dinh dưỡng cho phôi trong thời gian dài khi lưu trữ hạt cũng như giúp phôi phát triển nảy mầm thành cây con khi chúng ta cần hạt nẩy mầm. Bảng 4.9 Tỉ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo Nghiệm thức Tỉ lệ nảy mầm (%) MS 44.44 D ½ MS 77.78A 1/5MS 37.78 E VW 55.56 C ½ VW 71.11B 1/5VW 37.78 E CV (%) 4.89  Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.  Nhận xét: Kết quả thí nghiệm thấy môi trường 1/2MS là môi trường thích hợp nhất cho việc tạo vỏ hạt, tỉ lệ nảy mầm khi sử dụng môi trường này là 77.78%, rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với các môi trường còn lại. Do đó, việc tạo hạt nhân tạo của phôi vô tính trên môi trường vỏ bao là ½ MS sẽ tiết kiệm chi phí hơn khi sử dụng môi trường MS hoặc VW mà vẫn giữ cho phôi khoẻ và hạt dễ nảy mầm hơn. 66 Hình 4.8 Hạt nhân tạo lan Hồ Điệp trên môi trường nảy mầm Hình 4.9 Quá trình nảy mầm của hạt nhân tạo lan Hồ Điệp. 0 NSC 30 NSC 40 NSC 50 NSC 60 NSC 70 NSC 67 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua quá trình nghiên cứu tìm hiểu kỹ thuật phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:  Nuôi cấy phát sinh mô sẹo từ protocorm trên môi trường VW có bổ sung 2,4-D 0.1mg/l + BA 0.01mg/l + nước dừa 200ml/l + đường 40g/l cho khả năng tạo mô sẹo cao nhất: 80% mẫu cấy hình thành mô sẹo (45NSC).  Môi trường thích hợp nhất cho việc tạo phôi là nuôi cấy mô sẹo trong môi trường VW bổ sung TDZ 2mg/l ở điều kiện lỏng lắc (45NSC), sau đó cấy chuyền sang môi trường đặc 1/2VW. Trung bình có 39.67 phôi/mẫu cấy (45NSC)  Môi trường thích hợp nhất cho việc tái sinh lan Hồ Điệp từ phôi là VW+30g khoai tây+1g than, với hệ số nhân chồi 11.34, số lá trung bình 1.38/chồi, số rễ trung bình 0.22/chồi, chiều dài lá trung bình 8mm, chiều dài rễ trung bình 4mm (75NSC)  Môi trường thích hợp nhất để làm vỏ bao hạt nhân tạo ở lan Hồ Điệp là môi trường 1/2MS, với tỉ lệ nảy mầm cao nhất: 77,78% (60NSC) 5.2 Đề nghị Cần tiếp tục hoàn thiện mô hình tạo phôi vô tính lan Hồ Điệp bằng một số phương pháp như:  Thử nghiệm nuôi cấy phát sinh mô sẹo từ mẫu lá hoặc thân lan Hồ Điệp ở các môi trường và nồng độ auxin, cytokinin khác nhau nhằm đạt khả năng tạo mô sẹo nhiều hơn trong thời gian ngắn hơn.  Thử nghiệm nuôi cấy mô sẹo trên các môi trường khác nhau với nồng độ TDZ khác nhau, hoặc bổ sung thêm NAA (như đã từng được thực hiện trên cây chuối, hoa lily…) để tìm ra môi trường cảm ứng tạo phôi hiệu quả hơn 68  Thử nghiệm tái sinh lan Hồ Điệp từ phôi trên các môi trường nuôi cấy khác bổ sung thêm các chất kích thích tố tăng trưởng như BA kết hợp với 2,4-D nhằm tạo ra nhiều cây con lan hơn, khoẻ mạnh hơn và trong thời gian ngắn hơn.  Thử nghiệm các môi trường tạo vỏ bao hạt nhân tạo khác để tìm ra môi trường tối ưu nhất.  Nghiên cứu, thử nghiệm các phương pháp bảo quản hạt nhân tạo như bảo quản hạt trong Nitơ lỏng nhằm phục vụ cho việc giữ giống.  Mở rộng công nghệ phát sinh phôi và tạo hạt nhân tạo đến các giống lan có giá trị kinh tế khác 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Trang Việt, 1989. Tìm hiểu và áp dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật để kiểm soát hiện tượng rụng bông và trái non tiêu Piper nigrum L. Luận án Phó tiến sĩ Khoa học. Trường Đại học Tổng hợp TP. Hồ Chí Minh. 2. Klein R.M. và Klein D.T., 1974. Phương pháp nghiên cứu thực vật. Tập II (Nguyễn Như Thanh, Phạm Hồng Thái dịch). Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 3. Mai Trần Ngọc Tiếng, 1989. Giáo trình lý thuyết cơ sở sinh lý thực vật. Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh. 4. Nguyễn Văn Uyển, 1989. Các chất sinh trưởng trong nông nghiệp. Nhà xuất bản TP. Hồ Chí Minh. 5. Trần Văn Minh, 2003. Công nghệ tế bào thực vật. Giáo trình cao học – nghiên cứu sinh. Viện sinh học nhiệt đới. Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia. 6. Vũ Văn Vụ, Hoàng Đức Cự và csv, 1993. Sinh lý thực vật. Giáo trình cao học Nông nghiệp Sinh học. Viện KHKTNNMN Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 7. Broly H, 1982. Contribution a la multiplication clonale des Orchidées : Phalaenopsis, Paphiopedilum et Cymbidium. Thèse Docteur Ingenieur en Biologie et Physiologie végétale. Université de sciences et techniques de Lille. 8. Chatfield, J.M.; Amstrong, D.J., 1986. Regulation of cytokinin oxidase activity in callus tissue of Phaseolus vulgaris L. c.v great Northern. Plant Physiol. 80:493-499. 9. De Vries J.T, 1953. On the flowering of Phalaenopsis schilleranna. Rchb. Ann. Bogor. 1 : 61-76. 70 10. Fujimura T. and Komamine A., 1975. Effects of various growth regulators on the embryogenesis in carrot cell suspension culture. Plant Sci. Lett. 5:359-364. 11. Fujimura T. and Komamine A., 1979. Synchronization of somatic embryogenesis in carrot cell suspension culture. Plant Physiol. 64:162-164. 12. Gill, R.; Saxena, P.K., 1993. Somatic embryogenesis in Nicotiana tabacum L.: induction by TDZ of direct embryo differentiation from cultured leaf discs. Plant Cell Rep. 12:154-159. 13. Grossmann K, 1991. Induction of leaf abscission in cotton is a common effect of urea and adenin type cytokinins. Plant Physiol. 95:234-237. 14. Halle F, 1978. Les modèles architecturaux chez les arbres tropicaux, une approche graphique. Colloque Elaboration et Justification des modèles en Biologie. Paris, Ecole normale. 17pp. 15. Halle R, 1978. Recherches sur la nurtition minérale des tissus végétaux cultivés in vitro. Ann. Sci. Nat. Biol. Vég.. 14, 1-223. 16. Hare, P.D.; Staden, J., 1994. Inhibitory effect of TDZ on the activity of cytokinin oxidase isolated from soybean callus. Plant Cell Physiol. 35:1121-1125. 17. Hildebrandt, A.C; Wilmar, J.C.; Johns, H.; Riker, A.J., 1963. Growth of edible chlorophyllous plant tissue in vitro. Am.J.Bot. 50:248-254. 18. Li Z; Traore, A.; Maximova, S; Guiltinan M. J., 1998. Somatic embryogenesis and plant regeneration from floral explants of cacao (Theobroma cacao L.) using thidiazuron. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 34:293-299. 19. Halperin W. and Wetherell, 1964. Adventive embryony in tissue cultures of the wild carrot Daucus carota. Am. J. Bot. 51:274-283. 20. Lu, C., 1993. The use of thidiazuron in tissue culture. In vitro cell. Dev. Biol. 29:92-96. 71 PHỤ LỤC THÍ NGHIỆM 1. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng 2,4-D và BAP đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro Thời gian tạo mô sẹo Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 8.035523 12 .6696269 .512 .8878 Within groups 34.000000 26 1.3076923 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 42.035523 38 Table of means -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 19.890000 .5773503 .6602253 18.930149 20.849851 2 3 20.890000 .5773503 .6602253 19.930149 21.849851 3 3 20.560000 1.0000000 .6602253 19.600149 21.519851 4 3 20.560000 .5773503 .6602253 19.600149 21.519851 5 3 19.670000 .0000000 .6602253 18.710149 20.629851 6 3 19.780000 .5773503 .6602253 18.820149 20.739851 7 3 20.000000 .0000000 .6602253 19.040149 20.959851 8 3 20.220000 1.1547005 .6602253 19.260149 21.179851 9 3 19.440000 .5773503 .6602253 18.480149 20.399851 10 3 20.440000 .0000000 .6602253 19.480149 21.399851 11 3 20.440000 1.1547005 .6602253 19.480149 21.399851 12 3 21.000000 .5773503 .6602253 20.040149 21.959851 13 3 20.440000 .0000000 .6602253 19.480149 21.399851 -------------------------------------------------------------------------------- Total 39 20.256154 .1831135 .1831135 19.989939 20.522369 Multiple range analysis -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 9 3 19.440000 X 5 3 19.670000 X 6 3 19.780000 X 1 3 19.890000 X 7 3 20.000000 X 8 3 20.220000 X 10 3 20.440000 X 11 3 20.440000 X 13 3 20.440000 X 3 3 20.560000 X 4 3 20.560000 X 2 3 20.890000 X 12 3 21.000000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits * denotes a statistically significant difference. 72 % mẫu cấy hình thành mô sẹo Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 9377.0647 12 781.42206 200.167 .0000 Within groups 101.5000 26 3.90385 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 9478.5647 38 0 missing value(s) have been excluded. Table of means -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 24.440000 .0577350 1.1407375 22.781570 26.098430 2 3 46.670000 .3464102 1.1407375 45.011570 48.328430 3 3 53.330000 1.1547005 1.1407375 51.671570 54.988430 4 3 68.890000 1.1547005 1.1407375 67.231570 70.548430 5 3 62.220000 .1154701 1.1407375 60.561570 63.878430 6 3 48.890000 1.1547005 1.1407375 47.231570 50.548430 7 3 48.890000 .5773503 1.1407375 47.231570 50.548430 8 3 80.000000 2.3094011 1.1407375 78.341570 81.658430 9 3 53.330000 .1732051 1.1407375 51.671570 54.988430 10 3 42.220000 1.1547005 1.1407375 40.561570 43.878430 11 3 46.670000 2.3094011 1.1407375 45.011570 48.328430 12 3 35.560000 .2886751 1.1407375 33.901570 37.218430 13 3 22.220000 .5773503 1.1407375 20.561570 23.878430 -------------------------------------------------------------------------------- Total 39 48.717692 .3163837 .3163837 48.257726 49.177658 Multiple range analysis -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 13 3 22.220000 X 1 3 24.440000 X 12 3 35.560000 X 10 3 42.220000 X 11 3 46.670000 X 2 3 46.670000 X 6 3 48.890000 X 7 3 48.890000 X 3 3 53.330000 X 9 3 53.330000 X 5 3 62.220000 X 4 3 68.890000 X 8 3 80.000000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits * denotes a statistically significant difference. 73 % mẫu cấy hình thành mô sẹo + PLB Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 770.03003 12 64.169169 60.802 .0000 Within groups 27.44000 26 1.055385 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 797.47003 38 0 missing value(s) have been excluded. Table of means -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 15.550000 .2886751 .5931230 14.687704 16.412296 2 3 13.330000 .1732051 .5931230 12.467704 14.192296 3 3 15.560000 .5773503 .5931230 14.697704 16.422296 4 3 11.110000 1.1547005 .5931230 10.247704 11.972296 5 3 15.560000 .5773503 .5931230 14.697704 16.422296 6 3 22.220000 .5773503 .5931230 21.357704 23.082296 7 3 13.330000 1.1547005 .5931230 12.467704 14.192296 8 3 8.890000 .1154701 .5931230 8.027704 9.752296 9 3 6.670000 .0000000 .5931230 5.807704 7.532296 10 3 11.110000 .5773503 .5931230 10.247704 11.972296 11 3 20.000000 .2886751 .5931230 19.137704 20.862296 12 3 13.330000 .1732051 .5931230 12.467704 14.192296 13 3 6.670000 .5773503 .5931230 5.807704 7.532296 -------------------------------------------------------------------------------- Total 39 13.333077 .1645027 .1645027 13.093919 13.572235 Multiple range analysis -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 9 3 6.670000 X 13 3 6.670000 X 8 3 8.890000 X 4 3 11.110000 X 10 3 11.110000 X 2 3 13.330000 X 7 3 13.330000 X 12 3 13.330000 X 1 3 15.550000 X 3 3 15.560000 X 5 3 15.560000 X 11 3 20.000000 X 6 3 22.220000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits * denotes a statistically significant difference. 74 % mẫu cấy hình thành PLB Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 1988.7243 12 165.72703 30.454 .0000 Within groups 141.4867 26 5.44179 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 2130.2110 38 0 missing value(s) have been excluded. Table of means -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 1 3 33.330000 1.7320508 1.3468228 31.371958 35.288042 2 3 8.890000 1.7320508 1.3468228 6.931958 10.848042 3 3 6.670000 1.7320508 1.3468228 4.711958 8.628042 4 3 8.890000 .5773503 1.3468228 6.931958 10.848042 5 3 15.893333 1.4529663 1.3468228 13.935291 17.851375 6 3 11.110000 1.1547005 1.3468228 9.151958 13.068042 7 3 4.440000 .2309401 1.3468228 2.481958 6.398042 8 3 6.670000 .5773503 1.3468228 4.711958 8.628042 9 3 8.890000 1.1547005 1.3468228 6.931958 10.848042 10 3 8.890000 1.7320508 1.3468228 6.931958 10.848042 11 3 13.330000 1.7320508 1.3468228 11.371958 15.288042 12 3 15.560000 .2886751 1.3468228 13.601958 17.518042 13 3 6.670000 1.7320508 1.3468228 4.711958 8.628042 -------------------------------------------------------------------------------- Total 39 11.479487