Đề tài Nghiên cứu khả năng gây bệnh cho chuột ở các chủng salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm, thực phẩm

1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Salmonella là một trong những nguyên nhân gây ra các bệnh ngộ độc thực phẩm cho người trên diện rộng và luôn là mối đe dọa cho sức khỏe cộng đồng. Vi sinh vật này phân bố rộng rãi trong đất, nước, gia súc, thực phẩm… trong đó thịt và các sản phẩm gia cầm là các nguồn bệnh quan trọng. Các báo cáo của Ủy Ban Châu Âu năm 1995 xác định rằng các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm, đặc biệt là Salmonella và Campylobacter là vấn đề quan trọng cho sức khỏe cộng đồng. Vì tính chất rất nguy hiểm của Salmonella, tất cả các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của các nước trên thế giới đều xếp Salmonella vào nhóm không được phép có mặt. Hiện nay, khoảng 2500 kiểu huyết thanh về Salmonella đã được xác định. Qua các nghiên cứu cho thấy không phải tất cả các chủng mà chỉ có một số ít có khả năng gây bệnh. Nếu có phương pháp phân biệt được các dòng Salmonella gây bệnh với các dòng lành tính thì sẽ tạo thuận lợi hơn trong việc mua bán và trao đổi hàng hóa thực phẩm giữa các nước. Đồng thời việc phân biệt các dòng trên còn giúp ích nhiều trong việc điều tra và kiểm soát dịch bệnh do vi khuẩn này gây ra. Do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của Th.S Nguyễn Tiến Dũng, TS. Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CHO CHUỘT Ở CÁC CHỦNG SALMONELLA CÓ NGUỒN GỐC TỪ BỆNH PHẨM, THỰC PHẨM”. 1.2. Mục đích Nghiên cứu khả năng gây bệnh của các chủng Salmonella có nguồn gốc bệnh phẩm và thực phẩm. 1.3. Nội dung Khảo sát khả năng gây bệnh, gây chết ở chuột do các chủng Salmonella. Khảo sát khả năng xâm nhiễm của các chủng Salmonella vào gan và lách chuột. Nghiên cứu khả năng xâm nhiễm của các chủng Salmonella vào các cơ quan thuộc hệ tiêu hóa chuột gồm: dạ dày, gan, lách, ruột non và ruột già. Khảo sát khả năng tái xâm nhiễm của các chủng Salmonella vào các cơ quan thuộc hệ tiêu hóa chuột. 2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ SALMONELLA 2.1.1. Đặc điểm sinh vật học 2.1.1.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo Salmonella là một trong 32 giống của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae do Salmon và Smit phân lập ra đầu tiên vào năm 1885 từ lợn mắc bệnh dịch tả. Salmonella là vi khuẩn gram âm, dạng hình que, hai đầu tròn, có kích thước khoảng 0,4 - 0,6 x 1,0 - 3,0 m, không hình thành giáp mô và nha bào [1, 6, 25, 31]. Hình 2.1. Vi khuẩn Salmonella [23] Phần lớn vi khuẩn thuộc giống Salmonella có thể di động nhờ vào những tiên mao, mỗi vi khuẩn có từ 7 đến 12 tiên mao chung quanh thân, trừ S. gallinarum và S. pullorum không có lông nên không di động [6, 11, 35]. 2.1.1.2. Tính chất nuôi cấy Salmonella là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi nhưng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, chúng có thể sống ở nhiệt độ từ 5 – 46oC và pH từ 3,7 - 9,5 nhưng phát triển tốt nhất ở 37oC và pH từ 6,8 - 7,2. Salmonella dễ phát triển trên các môi trường dinh dưỡng thông thường khi nuôi cấy trong khoảng 24 giờ, nhưng trên môi trường thạch BSA (Bismuth Sulfite Agar) thì phải nuôi cấy trong 48 giờ [1, 3, 6, 11]. Trên môi trường canh sau khi nuôi cấy Salmonella từ 5 - 6 giờ thì làm đục nhẹ môi trường, sau 18 giờ làm đục đều, nếu nuôi cấy lâu hơn 24 giờ thì môi trường có lắng cặn. 3 Trên môi trường thạch thường vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng S (Smooth) tròn, lồi, trơn láng, bờ đều, thường không màu hay màu trắng xám. Đôi khi tạo khuẩn lạc dạng R (Rough), kích thước khuẩn lạc thường trong khoảng 2 – 4 mm. Trên môi trường thạch Macconkey vi khuẩn Salmonella mọc thành những khuẩn lạc tròn, đường kính 2 – 3 mm, trong suốt, không màu, sáng, nhẵn bóng và hơi lồi ở giữa. Trên môi trường thạch SS (Shigella – Salmonella Agar) Salmonella hình thành những khuẩn lạc tròn, bóng không màu hay có màu hồng và có tâm đen ở giữa. Trên môi trường thạch XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar) Salmonella cho khuẩn lạc trong suốt, không màu hay có màu hơi nhuốm đỏ đôi khi có tâm đen, thường xuất hiện vùng đỏ hồng xung quanh khi khuẩn lạc Salmonella phát triển mạnh. Trên môi trường thạch BPLS (Brilliant Green Phenol Red Lactose Agar) Salmonella cho khuẩn lạc tròn, màu trắng hồng, môi trường xung quanh đỏ hồng. Trên môi trường thạch BSA (Bismuth Sulphite Agar) Salmonella cho khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thường có ánh kim bao quanh [3, 6, 12, 25, 34]. 2.1.1.3. Sức đề kháng Salmonella bị tiêu diệt ở nhiệt độ 50oC trong 1 giờ, 70oC trong 15 phút, 100oC trong 5 phút. Chúng có thể sống sót trong môi trường thạch ở nhiệt độ -10oC trong 115 ngày, sống từ 4 - 8 tháng trong thịt ướp muối với tỷ lệ 29% ở nhiệt độ 6 – 12oC. Trong xác động vật chết, đất bùn, cát khô, trong nước đóng băng Salmonella tồn tại khoảng 2 - 3 tháng, trong nước tự nhiên chúng có thể sống 1 - 2 tháng. Ánh sáng mặt trời chiếu thẳng có thể diệt vi khuẩn trong nước trong sau 5 giờ, trong nước đục sau 9 giờ. Salmonella bị diệt bởi clorua thủy ngân 1%, formol 0,5%, acid fenic 3% trong 15 - 20 phút [6, 11]. 2.1.1.4. Đặc tính sinh hóa Salmonella có những biểu hiện đặc tính sinh hóa chủ yếu như Bảng 2.1, dựa vào các đặc điểm này mà người ta có thể định hướng phân biệt với các vi khuẩn đường ruột khác [3, 6]. 4 Bảng 2.1. Các biểu hiện sinh hóa của Salmonella Phản ứng sinh hóa Biểu hiện Maltose + Glucose + Lactose - H2S +/- Gas + Lysine decarboxylase + Citrate - Ure - Nitrate + Indol - Voges Proskauer - Chú thích: (-) âm tính, (+)dương tính 2.1.1.5. Đặc điểm biến dị di truyền Trong khi nuôi cấy Salmonella, đặc biệt là nuôi cấy lâu ngày trong môi trường tổng hợp thì Salmonella có thể biến dị về khuẩn lạc và kháng nguyên. Các biến dị thường gặp là: [11, 17] Biến dị S - R: Vi khuẩn mới phân lập có khuẩn lạc dạng S trơn, bóng láng, bờ đều, có kháng nguyên O đặc hiệu. Qua một thời gian nuôi cấy, vi khuẩn phát sinh biến dị, khuẩn lạc có thể trở nên nhám, xù xì, gồ ghề, người ta gọi đó là dạng R, khi biến thành dạng này thì kháng nguyên O không còn đặc hiệu nữa. Biến dị O - H: Trong khi nuôi cấy dưới ảnh hưởng của một số hóa chất trong môi trường như acid fenic… vi khuẩn có thể bị biến dị vì mất lông, do đó chúng sẽ không di động được khi chỉ còn kháng nguyên O. Biến dị của kháng nguyên H: Vi khuẩn có lông có thể biến dị từ phase 1 sang phase 2, có nghĩa là biến dị từ phase đặc hiệu sang phase không đặc hiệu. 2.1.2. Đặc điểm phân loại Dựa vào sự lai giữa DNA - DNA, Bergey’s (1994) đã chia giống Salmonella thành 2 loài cơ bản là Salmonella enterica (hay còn gọi là S. cholerasuis) và S. bongori [10, 25, 33]. 5 S. bongori là một loài hiếm, trong khi đó S. enterica thì phân bố rộng khắp mọi nơi trên thế giới và phổ vật chủ của chúng rất rộng. Loài S. enterica được chia thành 6 loài phụ sau: S. enterica enterica hay còn gọi là S. enterica I S. enterica salamae hay còn gọi là S. enterica II S. enterica arizonae hay còn gọi là S. enterica IIIa S. enterica diarizonae hay còn gọi là S. enterica IIIb S. enterica houtenae hay còn gọi là S. enterica IV S. enterica indica hay còn gọi là S. enterica VI Loài phụ S. enterica I chiếm khoảng 99% trong số các dòng phân lập được, chúng được tìm thấy ở hầu hết các động vật máu nóng. Các loài phụ khác hầu như chỉ phân lập được ở các động vật máu lạnh và trong môi trường. Loài S. bongori hay còn gọi là Salmonella V Các loài phụ của Salmonella được phân biệt dựa trên các đặc điểm sinh hóa ở Bảng 2.2. Bảng 2.2. Đặc tính sinh hóa của các loài phụ thuộc Salmonella Đặc điểm sinh hóa Nhóm phụ I II IIIa IIIb IV V VI ONPG 1 Lactose Dulcitol Malonate Gelatine KCN - - + - - - - - + + + - + + - - - - + (+) 2 - + + - - - - - + + + - + - - + D 3 + D 3 - + - 1 O-Nitrophenyl- -D-Glucoside, 2 Không sử dụng nhưng nếu kéo dài thời gian nuôi cấy thì chúng có thể sử dụng, 3 Một số kiểu huyết thanh trong nhóm có thể sử dụng. 2.1.3. Phân loại dựa theo cấu trúc kháng nguyên Hiện nay, ngoài phương pháp căn cứ vào những đặc tính sinh hóa để phân loại Salmonella, việc dựa vào cấu trúc kháng nguyên để xác định các kiểu huyết thanh Salmonella cũng được sử dụng khá phổ biến. Mỗi dòng Salmonella được xác định chủ yếu thông qua 3 loại kháng nguyên sau: 6 Hình 2.2. Vị trí các loại kháng nguyên trên Salmonella Kháng nguyên O (kháng nguyên màng tế bào, somatic): nằm trên màng của vi khuẩn và được phóng thích vào môi trường nuôi cấy. Kháng nguyên này đặc trưng bởi cấu trúc lypopolysaccharide - protein. Loại kháng nguyên này được coi là nội độc tố của vi khuẩn, có tác dụng ngăn cản bạch huyết cầu đi qua mao mạch và làm thay đổi tạm thời sự thẩm thấu của mao quản. Kháng nguyên này bền đối với nhiệt, chúng không bị phân hủy ở nhiệt độ 100oC trong 2 giờ. Chúng bị phân hủy trong môi trường acid tạo ra 2 thành phần cơ bản: [3, 28] Phần 1 là lipide, có cấu trúc tương tự như ở tất cả các loài vi khuẩn thuộc đường ruột khác, phần này qui định khả năng gây độc của vi khuẩn và được gọi là nội độc tố. Phần 2 là phần có nguồn gốc từ polysaccharide, gồm các nhóm hydro nằm ngoài, được dùng để phân biệt các kiểu huyết thanh của Salmonella. Nhóm polysaccharide ở bên trong có chức năng phân biệt các dạng khuẩn lạc. Do có sự khác nhau giữa các loài Salmonella về phương diện cấu tạo kháng nguyên O nên người ta đã chia Salmonella thành 34 nhóm có ký hiệu như sau: A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1 … E4, F, G1, G2, X, Y, Z, 49, 50. Mỗi nhóm huyết thanh học gồm một số loài vi khuẩn có kháng nguyên O cấu tạo bởi một số thành phần nhất định. Ví dụ trong nhóm A, S. paratyphi A, kháng nguyên O gồm 3 thành phần (I), II, XII trong đó thành phần I có thể có hoặc không, thành phần II là thành phần đặc biệt không thể thiếu dùng để phân biệt về mặt huyết thanh học với các nhóm khác. Kháng nguyên H (kháng nguyên lông, flagella): có bản chất là protein rất kém bền vững so với kháng nguyên O, bị phá hủy ở 70oC hay dưới tác dụng của cồn, các enzyme phá hủy protein, nhưng không bị ảnh hưởng bởi formol 0,5%. Kháng nguyên Pili 7 H không có tác dụng gây bệnh, không tạo miễn dịch. Salmonella chứa 2 nhóm kháng nguyên H, chúng được mã hóa bởi 2 gen khác nhau nhưng có liên quan mật thiết với nhau, tại cùng thời điểm chỉ có 1 trong 2 gen được biểu hiện thành hai nhóm kháng nguyên gọi là phase 1 và phase 2. Phase 1, phase đặc hiệu, bao gồm 28 loại kháng nguyên lông biểu thị bằng chữ La Tinh: a, b, c,…z. Phase 2, phase không đặc hiệu, nhiều dòng Salmonella chứa cùng một loại kháng nguyên, gồm 6 loại biểu thị bằng số Ả Rập 1, 2, 3… hay chữ La Tinh e, n, x… Kháng thể kháng kháng nguyên H gây ngưng kết vi khuẩn bởi các lông roi. Sự ngưng kết này sẽ tạo thành những mảng kết tụ, chúng có thể bị tách bởi các yếu tố có khả năng cắt lông roi của vi khuẩn [3, 11, 28]. Kháng nguyên Vi (kháng nguyên vỏ, capsule): Bọc ngoài kháng nguyên O gọi là kháng nguyên bề mặt có liên quan mật thiết với endotoxin. Kháng nguyên Vi của Salmonella bị biến đổi ở nhiệt độ 100oC trong 15 phút hoặc tác dụng với cồn 90%, nhưng chúng ổn định trong formol 0,5%. Kháng nguyên này thường được tìm thấy trên 3 chủng: S. typhi, S. paratyphi C và S. dublin, chúng không tham gia vào việc gây bệnh. Ngày nay, người ta có khuynh hướng không đặt tên cho các chủng Salmonella nữa mà các chủng này được biểu thị thông qua kháng nguyên O và H, một số có thêm kháng nguyên Vi. Theo hệ thống phân loại của Kaufman - White thì hiện nay có hơn 2500 kiểu huyết thanh của Salmonella đã được xác định. Mỗi kiểu huyết thanh được xác định theo một công thức gọi là công thức kiểu kháng nguyên. Đối với những kiểu huyết thanh thuộc loài phụ I thì thường đặt theo tên, ví dụ S. enteritidis, S. typhi… Căn cứ vào các kiểu cấu trúc kháng nguyên, chủ yếu dựa vào kháng nguyên O thì S. enterica I được chia thành 9 nhóm: A, B, C1, C2, D, E1, E4, F, G. Trong đó, Salmonella nhóm E thường gây bệnh nhẹ với các triệu chứng như sốt, tiêu chảy, tỷ lệ bệnh diễn biến và tử vong thấp. Salmonella nhóm B và C thì gây bệnh với tỷ lệ cao và tỷ lệ chết tùy thuộc vào chủng và số lượng vi khuẩn xâm nhập vào. Thường thì bé sơ sinh có tỷ lệ bệnh và tử vong cao hơn so với các lứa tuổi khác do mất nước và các chất điện phân [3, 25, 29, 33, 35]. 8 Bảng 2.3. Cấu trúc kháng nguyên của một vài Salmonella thƣờng gặp [Jay, 2000] Nhóm Loài/kiểu huyết thanh Kháng nguyên O Kháng nguyên H Phase 1 Phase 2 A B C1 C2 D E1 S. paratyphi A S. schottmuelleri S. typhimurium S. hirschfeldii S. choleraesuis S. oranienburg S. montevideo S. newport S. typhi S. enteritidis S. gallinarum S. anatum 1, 2, 12 1, 4, (5), 12 1, 4, (5), 12 6, 7, (Vi) 6, 7 6, 7 6, 7 6, 8 9, 12, (Vi) 1, 9, 12 1, 9, 12 3, 10 a b i c (c) m, t g, m, s (p) e, h d g, m - e, h (1, 5) 1, 2 1, 2 1, 5 1, 5 - (1, 2, 7) 1, 2 - (1, 7) - 1, 6 Ghi chú: - sự có mặt của yếu tố đó là do sự đảo ngược phage, ( ) có thể vắng mặt. 2.1.4. Phân loại theo mục đích miễn dịch học Về dịch tễ học, Salmonella được chia thành 3 nhóm: [29, 32] Nhóm chỉ nhiễm trên người: Gồm các kiểu huyết thanh S. typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi C. Chúng là tác nhân gây sốt thương hàn và phó thương hàn. Sốt thương hàn có thời gian ủ bệnh dài, thân nhiệt tăng cao và thường tỷ lệ tử vong cao. S. typhi được phân lập từ máu, thỉnh thoảng từ phân và nước tiểu bệnh nhân có vấn đề về đường ruột. Triệu chứng của bệnh phó thương hàn thì nhẹ hơn thương hàn. Nhóm gây bệnh trên thú: Gồm các kiểu huyết thanh S. gallinarum (gia cầm), S. dublin (bò), S. abortus-equi (ngựa), S. abortus-ovis (cừu), S. choleraesuis (heo). Nhóm không kí chủ đặc hiệu: gây bệnh trên người và thú, thường tìm thấy trong thức ăn. Để có biểu hiện bệnh thì mật độ vi khuẩn đưa vào cơ thể phải đạt khoảng 107- 10 9 CFU/g. 9 2.1.5. Phân loại độc tố: Salmonella có 2 loại nội độc tố: [7, 27, 32, 33] 2.1.5.1. Độc tố LT (Heat- labile toxin) Được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1975 do Koupal và Deibel. Môi trường được tìm thấy tốt nhất để sản xuất ra độc tố này là BHI (Brain Heart Infusion Broth) có chứa 2% casamino acid. Những yếu tố dinh dưỡng như glycerol, biotin và Mn2+ làm tăng khả năng tạo ra độc tố này. Đồng thời, độc tố này tạo ra nhiều hơn ở phase ổn định của quá trình tăng trưởng, thích hợp trong khoảng pH 6 - 7 hoặc cao hơn, nhiệt độ 37 0C và đặc biệt phải thông khí. Độc tố LT không bền với nhiệt ở 100oC, có trọng lượng phân tử khoảng 110 kDa, và điểm đẳng điện vào khoảng 4,3 - 4,8. Cơ chế tác động: độc tố LT hoạt hóa men adenylcylase trong tế bào, làm gia tăng c-AMP (cycle-adenosin-5-monophotphate). c-AMP kích thích tăng tiết bicarbonate ra khỏi tế bào ruột đồng thời ức chế Na+ vào bên trong tế bào ruột. Kết quả cuối cùng là gây tiêu chảy, mất nước, gây xung huyết và mụn loét. 2.1.5.2. Độc tố ST (Heat- stable toxin) Vào năm 1962, các nhà nghiên cứu của Châu Âu đã chỉ ra hoạt tính của độc tố ST ly trích từ Salmonella. Độc tố này hoạt động trong khoảng pH 6 - 9, bị phá hủy khi xử lý với trypsin và protease. Độc tố này bền với nhiệt, mất hoạt tính ở 121oC trong 15 phút, trọng lượng phân tử khoảng 32 kDa. Cơ chế tác động tương tự như LT nhưng ST hoạt hóa men guanyl cyclase làm tăng c-GMP (Guanyl-cyclase monophotphate) trong tế bào dẫn đến nước tập trung vào ruột non sau 18 - 24 giờ và dẫn đến tiêu chảy. 2.1.6. Dịch tễ học 2.1.6.1. Tác nhân truyền bệnh Salmonella hiện diện khắp nơi trong tự nhiên. Thực phẩm Salmonella thường hiện điện trong các sản phẩm có nguồn gốc từ thịt gia súc, gia cầm. Ngoài ra, Salmonella còn hiện diện trong trứng, sữa, sản phẩm thủy sản như trai ốc sống trong nước bẩn… Thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật ít khi là nguồn gây ngộ độc Salmonella trừ những rau quả ăn sống như rau diếp, cà chua… nếu bón phân tươi hoặc rửa bằng nước bẩn thì sẽ rất nguy hiểm. Kem, nước đá làm bằng nước bẩn cũng có thể 10 truyền bệnh. Phân người bệnh hoặc người lành mang vi khuẩn mãn tính có thể làm bẩn nguồn nước, thức ăn… [ 8, 12, 13, 18, 25, 31]. 2.1.6.2. Động vật cảm thụ Salmonella có thể phân lập được trên các loại gia súc như heo, bò…, gia cầm như gà, chim, vịt…, thú thí nghiệm như chuột bạch, thỏ, chuột lang. Bệnh từ heo có thể lây sang bò, chó, người. Heo là ổ chứa tự nhiên quan trọng, do đó ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng. Bệnh thường xảy ra trên con cái hơn là con đực [7, 10]. 2.1.6.3. Nơi chứa mầm bệnh Máu, phủ tạng đặc biệt là gan, lách, các chất tiết, phân đều chứa vi khuẩn trong thể bại huyết cấp tính. Một số trường hợp thú khỏe mang mầm bệnh, tỷ lệ này biến đổi tùy theo điều kiện, phương thức chăn nuôi. Trong trường hợp này, Salmonella sống hoại sinh ở ruột, hạch ruột, túi mật, phân, hạch hầu … Bằng thực nghiệm các nhà khoa học đã chứng minh rằng S. typhimurium hiện diện với tỷ lệ 93,5% ở hạch amygdale, 71% ở manh tràng, 55% hạch bạch huyết hàm dưới và 45% hạch bạch huyết van hồi tràng ở những heo giết mổ vào tuần thứ 20 - 28 sau khi nhiễm. Một số tìm thấy trong dịch tiết đường sinh dục, dịch hoàn [3, 10, 14]. 2.1.6.4. Đƣờng xâm nhập Salmonella xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua đường tiêu hóa thông qua thức ăn, nước uống bị ô nhiễm, dụng cụ chăm sóc, vận chuyển… Đôi khi chúng xâm nhiễm qua đường hô hấp, qua đường sinh dục như qua con, trứng hoặc qua đường tiêm phúc mạc dưới da [10]. 2.1.6.5. Sự đề kháng của vật chủ với bệnh do Salmonella a. Rào cản của cơ thể ký chủ Hệ tiêu hóa là một hệ thống bao gồm các cơ quan tiêu hóa như miệng, họng, thực quản, dạ dày, ruột non, ruột già, trực tràng và hậu môn. Sau khi cơ thể ký chủ ăn phải thức ăn bị nhiễm Salmonella, để xâm nhiễm vào bên trong và gây bệnh, vi khuẩn Salmonella phải sống sót và vượt qua những rào cản tự bảo vệ của ký chủ. Rào cản đối với những Salmonella có ký chủ chuyên biệt hay không thì đều rất tích cực [3, 4, 9, 19, 29]. Đối với ký chủ không chuyên biệt: Khả năng chống lại sự định cư và xâm nhiễm của Salmonella vào các cơ quan của cơ thể ký chủ tương đối khác nhau. 11 Dạ dày: Thường có pH dưới 3,5, đây là môi trường gây chết nhiều vi sinh vật. Salmonella được ăn vào số lượng của chúng sẽ giảm bớt tại dạ dày, vì thế còn một ít hay không còn Salmonella nào vào tới ruột non. Ruột non: Sự chuyển động của ruột non ngăn cản quá trình gắn của mầm bệnh vào các thụ quan trên bề mặt tế bào biểu mô và loại thải những Salmonella được ăn vào một cách nhanh chóng. Hệ vi sinh vật trong ruột non, chủ yếu là hệ vi sinh vật kỵ khí chiếm 99,9%. Các vi sinh vật trong ống tiêu hóa phóng thích ra những acid béo chuỗi ngắn và một số hợp chất để trung hòa với độc tố của Salmonella. Chúng cạnh tranh về mặt dinh dưỡng và vị trí gắn đặc hiệu của mầm bệnh từ đó ngăn cản sự xâm nhiễm mầm bệnh qua thành ruột. Các nhân tố khác: Tình trạng dinh dưỡng, tình trạng sức khỏe, lactoferin, lysozyme… cũng tham gia vào quá trình bảo vệ cơ thể tránh sự tấn công của Salmonella sau khi chúng được đưa vào cơ thể. Với những Salmonella có ký chủ chuyên biệt thì ngoài những rào cản trên còn có phản ứng viêm, kháng thể của cơ thể nói chung và sức đề kháng có tính di truyền đối với sự xâm nhiễm của vi sinh vật [28, 32]. Bảng 2.4. Những rào cản của cơ thể ký chủ chống lại sự xâm nhiễm của Salmonella [29] Cơ quan phòng vệ Nhân tố phòng vệ Dạ dày Tính acid trong dạ dày Tốc độ tiêu hóa thức ăn trong dạ dày Ruột non Sự chuyển động của nhu động ruột Hệ vi sinh vật đường ruột Dịch nhầy Các nhân tố di truyền kháng sự xâm nhiễm của vi sinh vật Các nhân tố khác Tình trạng dinh dưỡng Sự tiết kháng thể Lactoferin Lysozyme Khi những rào cản trong ký chủ này bị giảm hay mất tác dụng, ký chủ trở nên dễ bị Salmonella tấn công. Những yếu tố tạo cho ký chủ có tính nhạy cao đối với Salmonella thì được thể hiện ở Bảng 2.5. 12 Thí dụ, người bị AIDS thì khả năng miễn dịch của cơ thể bị giảm dẫn đến cơ thể rất dễ bị nhiễm Salmonella. Khi cơ thể sử dụng kháng thể thường xuyên thì khả năng Salmonella kháng lại các loại kháng sinh cũng rất lớn. Bảng 2.5. Những yếu tố làm tăng tính nhạy của ký chủ với Salmonella [28, 30] Cơ quan hoặc yếu tố Nhân tố Dạ dày Kém phát triển Dạ dày bị giải phẫu Ruột Dùng kháng sinh Giải phẫu dạ dày- ruột Bệnh viêm ruột một cách tự phát Vấn đề về máu Bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm và những bệnh về huyết cầu tố Miễn dịch cơ thể bị suy giảm Ung thư, bệnh bạch cầu, ung thư mô bạch huyết Những thuốc ức chế miễn dịch, AIDS… b. Sự phát sinh bệnh Tần suất bị mắc bệnh sau khi cơ thể ký chủ hấp thụ Salmonella còn tùy thuộc vào số lượng và độc lực vi khuẩn xâm nhiễm cũng như cơ địa ký chủ. Để xâm nhập vào cơ thể thì Salmonella phải vượt qua hàng rào bảo vệ và tế bào biểu mô trên bề mặt niêm mạc. Để có thể gây bệnh, Salmonella phải thay đổi để phù hợp với môi trường xung quanh và thích nghi với các tác nhân phòng vệ thông qua việc phối hợp biểu hiện các gen. Cùng với những thay đổi để thích nghi với các tác nhân phòng vệ của ký chủ, chúng cũng phải hoạt hóa được cơ chế gây độc chuyên biệt nhằm chống lại, lẫn tránh, thậm chí điều khiển một cách có hệ thống toàn bộ hệ miễn dịch của cơ thể [28]. Quá trình xâm nhiễm của Salmonella được bắt đầu khi bệnh nhân tiêu thụ thức ăn hay nước uống bị nhiễm khuẩn. Sau khi sống sót qua dạ dày, Salmonella tập trung ở đoạn ruột hồi và ruột kết. Tại phần cuối của ruột non, chúng kích hoạt biểu mô ruột, tăng lượng vi sinh ở biểu mô và tại những nang lympho. Quá trình gắn vi khuẩn vào biểu mô ruột được thực hiện nhờ các loại khuẩn mao trên tế bào vi khuẩn [28]. 13 Hình 2.3. Các vị trí Salmonella có thể biểu hiện bệnh [28] Những nghiên cứu ở mức hiển vi cho thấy các chủng Salmonella xâm chiếm vào các tế bào biểu mô thông qua quá trình nhập bào. Sau khi vi khuẩn gắn vào đỉnh các lông tiếp xúc trên bề mặt tế bào biểu mô thì có sắp xếp lại bộ khung tế bào trong cơ thể ký chủ, làm phá vỡ các lông tiếp xúc này và cảm ứng việc tạo nên các lằn gợn trên màng bao quanh vi khuẩn trong một nang lớn. Các nang mang Salmonella được đưa vào cơ thể thông qua quá trình nhập bào. Bằng kỹ thuật công nghệ sinh học hiện đại, người ta đã chứng minh những nhiễm sắc thể và plasmid tham gia kiểm soát quá trình nhân lên và xâm nhiễm này. Sự xâm nhập của vi khuẩn thông qua quá trình nhập bào đòi hỏi phải có sự tổng hợp nhiều loại protein tế bào như CdtA, CdtB, CdtC có hoạt tính như enzyme, chúng phá hủy DNA làm cho những tế bào ký chủ ngừng hoạt động [10, 21]. Ngoài việc Salmonella xâm nhiễm vào tế bào biểu mô gây ra tình trạng viêm ruột còn cảm ứng tế bào biểu mô tiết các tín hiệu làm di chuyển các bạch cầu trung tính vào bên trong lớp lumen [10]. 1. Lối vào 2. Sự phát tán của vi khuẩn (Bệnh thương hàn) 4. Con đường loại thải (Tình trạng túi mật mang vi khuẩn) 3. Bệnh Dạ dày- ruột Tiêu chảy 14 Vi sinh vật được hấp thu bởi ký chủ Dạ dày Xâm chiếm vào ruột (ruột hồi và manh tràng) Xâm chiếm vào dịch nhầy cytotoxin Phản ứng viêm +/- Sự lở loét Tổng hợp prostagladin Enterotoxin Cytokine Hoạt hóa adenylate cyclase (AMP vòng) Gây tiết nước (ở ruột non, ruột già) Gây tiêu chảy. Sơ đồ 2.1. Cơ chế gây bệnh của Salmonella gây ra phản ứng viêm ruột non và tiêu chảy [17, 28] Sau khi xâm chiếm vào các tế bào biểu mô ruột, vi khuẩn Salmonella nhân lên trong tế bào và lan rộng xuống các hạch bạch huyết ở màng treo ruột, một số đi khắp cơ thể theo hệ thống tuần hoàn. Salmonella được giữ lại bởi những tế bào lưới nội mô, đây là nơi sẽ khuếch tán vi sinh vật. Tuy nhiên, tùy vào kiểu huyết thanh Salmonella và sự phòng vệ của ký chủ, một vài Salmonella xâm nhiễm vào gan, lách, túi mật, xương, màng não và những cơ quan khác. Một lượng lớn Salmonella bị tiêu diệt tại những vị trí ở ngoài ruột [3, 28]. 15 Hình 2.4. Sự xâm nhiễm của Salmonella vào tế bào biểu mô ruột [28] Sau khi xâm chiếm vào ruột, Salmonella thường gây ra phản ứng viêm nặng, phản ứng này có thể gây ra sự lở loét. Vi khuẩn Salmonella có thể tạo ra độc tố cytotoxin nhằm ngăn chặn quá trình tổng hợp protein của cơ thể ký chủ. Độc tố cytotoxin có góp phần trong việc tạo ra phản ứng viêm và lở loét thì không được biết rõ. Tuy nhiên, sự xâm chiếm vào dịch nhầy là nguyên nhân làm cho những tế bào biểu mô tổng hợp và phóng thích những cytokine khác nhau gồm: IL-1, IL-6, IL-8, TNF-2, IFN-U, MCP-1 và GM-CSF. Các chất này đã gây ra phản ứng viêm và gây hại cho ruột, những triệu chứng viêm thông thường như phát sốt, ớn lạnh, đau bụng, bệnh bạch cầu và tiêu chảy [28]. Cơ chế về phản ứng viêm dạ dày- ruột và tiêu chảy xảy ra khi những chủng Salmonella xuyên qua được lớp niêm mạc ruột. Tiêu chảy là sự bài tiết chất lỏng và những chất điện phân ở ruột non và ruột già. Salmonella xuyên qua những tế bào biểu mô ruột nhưng không giống với Shigella và E. coli, chúng vẫn bị giữ lại bên trong thể thực bào. Vì thế, phạm vi của gian bào được mở rộng và sự lở loét ở những biểu mô là Sự gắn bám Những tế bào biểu mô của ruột non Sự xâm nhập Lớp lumen Nhân lên Lớp lamina propria Tiêu chảy Tiết ra nước và chất điện phân Bị thực bào bởi bạch cầu trung tính và những đại thực bào Sự phát tán có hệ thống Lối vào Salmonella Xâm nhập vào mô sâu Sự tiêu hóa bởi lysozyme Sự gắn bá tế à iể c a r t Sự xâm nhập Lớp lumen Nhân lên Lớp lamina propria Tiêu chảy Gây tiết nước và chất điện phân Bị thực bào bởi bạch cầu trung tính và những đại thực bào Sự phát tán có hệ thống 16 rất nhỏ. Salmonella vượt qua khỏi ranh giới của những tế bào biểu mô để vào lớp lamina propria. Sự xâm chiếm vào niêm mạc ruột diễn ra bởi sự hoạt hóa adenylate cyclase, kết quả là làm tăng lượng c-AMP gây ra hiện tượng bài tiết. Cơ chế thì không được hiểu rõ nhưng có liên quan đến việc tạo ra prostaglandin hoặc những thành phần gây ra phản ứng viêm. Thêm vào đó, những dòng Salmonella tạo ra một hoặc nhiều hợp chất tương tự như enterotoxin gây bài tiết ở ruột [28]. Tóm lại, để Salmonella có thể xâm nhiễm vào bên trong và gây độc cho vật chủ thì vi khuẩn phải mang những gen độc giúp cho nó thể hiện tính độc trong vật chủ. Các gen gây bệnh thường có hàm lượng G+C khác biệt so với các vùng còn lại trên nhiễm sắc thể vi khuẩn, các gen này thường xen giữa các gen có tính bảo tồn cao. Một vài gen được biết là có liên quan đến sự bám dính và xâm chiếm như viz., sef1, pef2, spv3 và inv4. Những gen giúp Salmonella sống sót trong cơ thể ký chủ là mgtC5 hoặc gây bệnh cho ký chủ là viz., sop, stn7, pipA, B, D8… [14, 25, 26, 28, 29]. 2.2. TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG VÀ BIỆN PHÁP PHÕNG NGỪA 2.2.1. Triệu chứng lâm sàng Bệnh do Salmonella thường gây ra 3 triệu chứng chính sau: [9, 16, 18, 26, 34] Viêm dạ dày- ruột Được gây ra bởi nhiều kiểu huyết thanh Salmonella khác nhau. Các kiểu huyết thanh gây bệnh đường ruột thường gặp là S. typhimurium và S. enteritidis. Nguồn truyền nhiễm thường là các thức ăn nhiễm khuẩn, chủ yếu là các thức ăn đã qua chế biến. Thời kỳ ủ bệnh của giai đoạn viêm dạ dày- ruột do Salmonella tùy thuộc vào liều vi khuẩn. Triệu chứng thường bắt đầu từ 6 - 48 giờ sau khi ăn phải thức ăn hoặc nước uống bị nhiễm các Salmonella trên với mật độ từ 107- 1010 CFU/g. Các biểu hiện lâm sàng là buồn nôn, tiêu chảy và đau bụng. Đồng thời bệnh nhân thường bị chứng đau cơ và đau đầu, nhưng biểu hiện chính của bệnh là bị tiêu chảy, sốt 38 – 39oC và cảm thấy lạnh. Tối thiểu 2/3 bệnh nhân bị đau thắt ở vùng bụng. Hầu hết các bệnh nhân đều tự khỏi trong vòng 2 - 7 ngày. Nhiễm trùng máu Chủ yếu gây ra do S. cholerasuis. Bệnh nhiễm trùng máu do Salmonella thường xuất hiện ở giai đoạn giữa của quá trình nhiễm Salmonella vào người bệnh. Salmonella xâm nhập vào hệ tuần hoàn của ký chủ nhưng không gây viêm đường ruột vì chúng không khu trú trong túi mật, không trở về ruột sau khi đã vào máu và không thể phân 17 lập Salmonella từ phân của bệnh nhân. Salmonella có hạn chế trong đường ruột hay phổ biến trong đường máu có lẽ phụ thuộc vào sức đề kháng của bệnh nhân và tính độc của Salmonella. Nhưng một khi các tế bào vi khuẩn này nhiễm vào máu, chúng gia tăng nhiều lần trong các đại thực bào, rồi xâm nhập vào các cơ quan khác như xương, màng não. Biểu hiện của bệnh rất nghiêm trọng như gây ra sỏi phổi, viêm màng não và thường có tỷ lệ tử vong rất cao. Sốt thương hàn Bệnh chỉ biểu hiện ở người, chủ yếu do S. typhi, S. paratyphi và một số kiểu huyết thanh khác. Thời kỳ ủ bệnh thường không có triệu chứng lâm sàng nhất định, từ 10 - 14 ngày đầu có thể thay đổi tùy thuộc vào số lượng vi khuẩn. Thời kỳ này tương ứng với giai đoạn Salmonella vào cơ thể qua miệng cùng thức ăn và nước. Sau khi vượt qua được môi trường acid trong dạ dày, một số vi khuẩn vào ruột non, chúng xâm nhập vào các tế bào biểu mô của thành ruột rồi di chuyển tới lớp lamina propria để sinh sản ở đó. Lúc này, vi khuẩn sẽ xâm nhiễm qua các hạch bạch huyết ở màng treo ruột để vào máu và bị bắt giữ bởi các đại thực bào. Nhưng các tế bào Salmonella bên trong đại thực bào không bị tiêu diệt, trái lại chúng vẫn phát triển và nhân lên bên trong các tế bào này. Sau cùng, chúng phá vỡ các đại thực bào, lan truyền khắp cơ thể và tập trung lại ở hệ lưới nội mô như tủy xương, gan, lách, mật và cả đường tiết niệu. Kết quả là Salmonella có thể giải phóng ra ngoài cơ thể bằng đường phân, cả bằng nước tiểu và sữa. Bệnh thương hàn không có triệu chứng lâm sàng cố định. Thời kỳ khởi phát chỉ có những triệu chứng lâm sàng thông thường như nhức đầu, đau bụng, sốt: sốt càng cao khi tác nhân gây độc càng tích tụ nhiều trong máu. Thời kỳ toàn phát thì sốt là triệu chứng quan trọng, kèm theo đó là các dấu hiệu nhiễm trùng độc, vẻ mặt vô cảm, môi khô, má đỏ, tiêu chảy xen kẽ với táo bón và các tình trạng khác như vàng mắt, vàng da… Khi các tế bào Salmonella bị tiêu diệt, chúng phóng thích nội độc tố gây nhiễm độc máu. Tỷ lệ tử vong khi mắc bệnh vào khoảng 10% nhưng nếu sử dụng kháng sinh thích hợp thì tỷ lệ này có thể giảm xuống còn 1%. Khi không bị tử vong, bệnh nhân sẽ chuyển sang thời kỳ lui bệnh như hạ sốt nhanh và chuyển sang thời gian hồi phục kéo dài. Vi khuẩn Salmonella lúc này vẫn còn tồn tại trong tủy xương, gan và thận. 18 2.2.2. Biện pháp phòng ngừa Đối với gia súc Biện pháp quan trọng hàng đầu là chống bệnh do Salmonella trên thú, sau đó tuân thủ những nguyên tắc vệ sinh như nuôi dưỡng trong điều kiện sạch sẽ. Kiểm tra sức khỏe thú trước khi giết mổ, cho thú nhịn ăn 12 giờ trước khi giết mổ. Tách phủ tạng cẩn thận để tránh vấy nhiễm. Đối với thực phẩm Tránh sự vấy nhiễm Salmonella từ người và động vật bị bệnh thương hàn, côn trùng hoặc động vật mang trùng. Ngăn ngừa sự phát triển của Salmonella bằng cách bảo quản lạnh ở nhiệt thích hợp hoặc các phương pháp khác. Đối với thực phẩm công nghiệp và thương nghiệp Áp dụng các biện pháp quản lý chất lượng trong sản xuất, bảo quản, vận chuyển, phân phối… Định kỳ khám sức khỏe những người thao tác trực tiếp trên thực phẩm. Đồng thời tuyên truyền giáo dục cho người tiêu thụ phải lưu ý và tuân thủ nguyên tắc vệ sinh. Việc phối hợp tốt giữa y khoa – thú y chắc chắn sẽ giảm bớt số trường hợp ngộ độc do Salmonella. Tuy nhiên cũng cần lưu ý đến những thú hoang đã là ổ chứa Salmonella [9, 10, 17, 21, 30]. 2.3. Mối tƣơng quan giữa các chủng Salmonella từ bệnh phẩm và Salmonella trong môi trƣờng và trong thực phẩm Người ta cho rằng, vi khuẩn Salmonella là một trong những vi sinh vật đường ruột gây bệnh quan trọng nhất nên hầu hết các tiêu chuẩn vi sinh thực phẩm đều không cho phép có vi khuẩn Salmonella trong thành phẩm. Quy định này trên thực tế đã trở thành một rào cản thương mại gây nhiều trở ngại trong việc trao đổi hàng hóa thực phẩm giữa các quốc gia trên thế giới. Điểm chú ý là có phải toàn bộ các chủng Salmonella đều có khả năng gây bệnh? [3, 5, 8] Trong một cuộc khảo sát ở Tây Ban Nha của Baudart et al., 2000 cho thấy các chủng Salmonella phân lập từ các mẫu bệnh được lấy từ những bệnh nhân bị ngộ độc thực phẩm thường gặp là S. enteritidis (85,9%), S. typhimurium (7,06%), S. virchow, S. muenchen (2,36%), còn lại là S. azterca, S. bredeney, S. agona, S. infantis, S. goldcoast, S. muenster, S. london [3]. Theo Ủy ban An toàn thực phẩm Pháp (AFSSA) 19 thì 11 kiểu huyết thanh trên đã chiếm 80% các chủng Salmonella phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm [5]. Trong khi đó, sự hiện diện của Salmonella trong môi trường và trong thực phẩm là rất cao, chúng phân bố ở mọi nơi khắp thế giới. Theo nhiều cuộc điều tra ở Anh, Mỹ cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella trong phân khoảng 9 – 14,4%, manh tràng nhiễm 44,8%, hạch màng treo ruột 27%, xúc xích 28 – 29,7% và thịt heo tươi nhiễm 4,15% [15]. Salmonella hiện diện trong 65% mẫu nước được phân lập ở dọc theo Peavine Creek ở Decatur [3]. Trong một cuộc khảo sát sự hiện diện của Salmonella tại các sông ở Địa Trung Hải, các nhà nghiên cứu cũng phân lập được hơn 574 chủng Salmonella thuộc hơn 40 kiểu huyết thanh khác nhau [5]. Tại Việt Nam, trong cuộc điều tra về sự ô nhiễm Salmonella trong thực phẩm trên thị trường Hà Nội, kết quả cho thấy: tỷ lệ nhiễm Salmonella trong thịt lợn vào khoảng 33,33%, thịt bò khoảng 40%, thịt gà khoảng 39,29% và giò sống khoảng 46,67% [13]. Theo Nguyễn Thị Oanh và Tiêu Quang An (2003), tỷ lệ nhiễm Salmonella ở trâu, bò tại Đắc Lắc vào khoảng 45,36% và 41,25% [9]. Tại hội thảo 2004 về vệ sinh an toàn thực phẩm, chi cục Thú y Tp.HCM cho biết kết quả xét nghiệm năm 2003 với 299 mẫu thịt tươi tại các chợ cho thấy khoảng 18% nhiễm Salmonella [20]. Các tỷ lệ nhiễm Salmonella trong môi trường và thực phẩm cao như trên cho thấy khả năng hiện diện Salmonella trong thành phẩm chế biến có ít hay nhiều là không tránh khỏi. Tuy nhiên, vấn đề đặt ra có phải tất cả Salmonella hiện diện trong thực phẩm, môi trường đều gây nguy hại cho người. Theo AFSSA, số kiểu huyết thanh Salmonella phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm chỉ chiếm dưới 4,4% số kiểu huyết thanh phân lập được từ môi trường [5]. Đồng thời, các nghiên cứu của Reilly et al., 1992 tại xứ Wales và Australia cho thấy S. weltevreden là kiểu huyết thanh thường xuyên phát hiện trong các hồ nuôi tôm nhưng kết quả thống kê của CDC Hoa Kỳ cho thấy kiểu huyết thanh này rất hiếm khi được phân lập từ mẫu bệnh phẩm của người [5]. Điều đó có nghĩa là khả năng gây bệnh của các kiểu huyết thanh này là rất thấp. Một nghiên cứu khác, xác định độc lực trên chuột của các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm và thực phẩm cho thấy 20/20 chủng có nguồn gốc từ thực phẩm đều không có khả năng gây bệnh và gây chết cho chuột [3, 5]. Như vậy, chúng ta có thể nói rằng chỉ có một số ít trong khoảng 2500 kiểu huyết thanh Salmonella thì có khả năng gây bệnh. 20 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN Thời gian thực hiện: từ tháng 3/2005 – 7/2005. Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện tại Trạm xá Thú Y- Khoa Chăn Nuôi Thú Y và Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Môi trường- Khoa Công Nghệ Môi Trường- Trường ĐH Nông Lâm TP. HCM. 3.2. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ - Đĩa petri - Ống nghiệm - Erlen các loại - Ống đong các loại - Becher các loại - Pipetman các loại 100 µl, 1000 µl - Pipet 10 ml - Đèn cồn - Que cấy vòng, thẳng, trang - Bao PE vô trùng - Khay mổ - Kéo mổ - Kẹp gắp - Máy lắc - Tủ ấm - Tủ sấy - Cân 3.3. HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƢỜNG 3.3.1. Hóa chất - NaCl 0,85% vô trùng - Cồn 60 – 70o - Nước cất. 3.3.2. Môi trƣờng - Môi trường BHI (Brain Heart Infusion Broth): Dùng để phục hồi và tăng sinh các chủng Salmonella trong quá trình nghiên cứu. Thành phần môi trường gồm: Dịch não bê 200g, Dịch tim bê 250g, Proteose peptone 10g, NaCl 5g, Na2HPO4 2,5g, Dextrose 2g, Nước cất 1lít. - Môi trường TSA (Trypticase Soy Agar): Môi trường thạch dùng để giữ giống. Thành phần môi trường gồm: Tripticase peptone 15g, Phytone peptone 5g, NaCl 5g, Agar 15g, Nước cất 1lít. 21 - Môi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar): Môi trường dùng để định lượng Salmonella. Thành phần môi trường gồm: Cao nấm men 3g, L- lysine 5g, Xylose 3,75g, Lactose 7,5g, Sucrose 7,5g, Sodium desoxycholate 2,5g, Ferric ammonium citrate 0,8g, NaCl 5g, Agar 15g, Phenol red 0,08g, Nước cất 1lít. Môi trường XLD tổng hợp được pha chế trong nước cất vô trùng, đun sôi cho tan đều, để nguội đến 50 – 60oC và sau đó đổ vào đĩa petri. Tất cả các môi trường trên (trừ XLD) đều được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. 3.4. NGUYÊN VẬT LIỆU 3.4.1. Chủng vi sinh vật Bảng 3.1. Các chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu STT CHỦNG NGUỒN GỐC NGUỒN PHÂN LẬP 1 Salmonella enteritidis 99.303 Viện Pasteur (1) Bệnh phẩm người 2 S.enteritidis 02.158 Viện Pasteur Bệnh phẩm heo 3 S. typhimurium Viện Pasteur Bệnh phẩm heo 4 S.typhimurium 02.157 Viện Pasteur Bệnh phẩm heo 5 Salmonella SP 1b TT.CL,ATVS 4 (2) Thịt heo 6 Salmonella SP 2a TT.CL,ATVS 4 Thịt heo 7 Salmonella SP1a TT.CL,ATVS 4 Thịt heo 8 Salmonella SB 10 TT.CL,ATVS 4 Thịt bò 9 Salmonella SB11 TT. CL,ATVS 4 Thịt bò 10 Salmonella Ô13 CNSHMT (3) Ốc 11 Salmonella B34 CNSHMT Thịt bò 12 Salmonella M14 CNSHMT Mực 13 Salmonella VTr11 CNSHMT Vỏ trứng 14 Salmonella H51 CNSHMT Thịt heo (1) Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh, (2) Trung Tâm Chất lượng, An toàn vệ sinh và Thú y thủy sản vùng 4, TP. Hồ Chí Minh, (3) Phòng Công Nghệ Sinh Học Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. 22 3.4.2. Chuột Thuộc loài chuột bạch Mus musculus trọng lượng khoảng 18 – 20 g, được mua tại Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. Chuột thí nghiệm khỏe mạnh, sạch bệnh. 3.5. PHƢƠNG PHÁP Nguyên tắc chung: Mọi thao tác thí nghiệm phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng. Mọi dụng cụ thí nghiệm, môi trường dinh dưỡng phải được vô trùng trước khi sử dụng. 3.5.1. Phƣơng pháp pha loãng vi sinh vật Chủng vi khuẩn được hoạt hóa trên môi trường BHI, ủ ở 37oC trong khoảng 18 – 24 giờ. Hút 1 ml dịch sau tăng sinh cho vào ống nghiệm chứa 9 ml NaCl vô trùng để được độ pha loãng 10-1, lắc đều, hút 1 ml từ nồng độ này cho vào một ống nghiệm khác chứa 9 ml NaCl để được độ pha loãng 10-2, cứ tiếp tục tương tự ta được các độ pha loãng tiếp theo. Các thí nghiệm trong nghiên cứu này sử dụng đến độ pha loãng 10 -8 . 3.5.2. Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào bằng cách đếm khuẩn lạc Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn sau khi pha loãng cho vào đĩa môi trường XLD đã được chuẩn bị trước. Dùng que tam giác trải đều dịch trên môi trường. Mỗi độ pha loãng được trải ít nhất trên 2 đĩa. Ủ ở 37oC trong 18 - 24 giờ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25 – 250 khuẩn lạc để tính kết quả. Số lượng vi sinh vật trong 1 ml mẫu được tính theo công thức sau: [2, 3, 4] Trong đó: C: Số lượng Salmonella trong 1 ml mẫu (CFU/ml) N: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: Số lượng đĩa được đếm tại độ pha loãng thứ i Vi: Thể tích dịch mẫu cấy vào trong một đĩa fi: Độ pha loãng tương ứng. N n1 x V1 x f1 + … + ni x Vi x fi (cfu/ml) C = 23 3.5.3. Phƣơng pháp gây nhiễm trên chuột Khử trùng sạch bề mặt khu vực tiến hành gây nhiễm bằng cồn. Người tiến hành gây nhiễm phải đeo găng tay cao su. Chuẩn bị một cái khay sạch. Dùng xy-lanh hút lượng dịch vi khuẩn cần cho chuột uống. Cách gây nhiễm vi khuẩn vào chuột qua đường miệng được tiến hành như sau: Đặt chuột bò trên bề mặt lồng, tay phải nắm lấy đuôi, ngón tay trỏ và ngón tay cái bên trái nắm lấy hai tai và gáy chuột, ngón tay út trái kẹp lấy đuôi của chuột. Lật ngửa chuột lên và để theo chiều thẳng đứng. Tay phải lấy xy-lanh có dịch vi khuẩn và cho chuột uống. Thao tác được tiến hành nhẹ nhàng để tránh làm tổn thương chuột. Chuột sau khi được gây nhiễm, theo dõi biểu hiện bệnh hằng ngày. Quá trình theo dõi được thực hiện liên tục trong 14 ngày. 3.5.4. Phƣơng pháp khảo sát sự hiện diện của Salmonella trong gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già Chuột bị chết sau khi gây nhiễm hoặc sau thời gian theo dõi được tiến hành giải phẫu để xác định sự hiện diện của Salmonella trong gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già. Cách tiến hành: Sau khi chuột chết, dùng kim ghim bốn chân của chuột trên mảnh cao su được đặt trên khay mổ. Dùng kéo cắt da theo đường thẳng dọc theo chiều dài chuột và mở ra hai bên. Dùng kéo vô khuẩn để mở cơ hoành và lật ra hai bên để quan sát nội tạng, gan, lách. Cắt lấy gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già cho một bao PE vô trùng. Cho một thể tích xác định nước muối NaCl 0,85% tùy theo khối lượng gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già thu được vào bao PE. Dùng vật nặng có bề mặt nhẵn để nghiền nát các bộ phận đó. Toàn bộ dịch trong bao PE được cho vào bình tam giác vô trùng có nắp đậy (mỗi bộ phận được cho vào những bình khác nhau), bình này được lắc trên máy lắc khoảng 1 giờ. Dịch đồng nhất sau khi lắc được đem trải đều trên môi trường XLD để định lượng mật độ Salmonella trong gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già. 24 Hình 3.1. Dụng cụ mổ chuột Hình 3.2. Các bộ phận dạ dày, gan, lách, ruột non và ruột già trong đĩa a. b. Hình 3.3. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trƣờng XLD a. Môi trƣờng trƣớc khi cấy; b. Khuẩn lạc đặc trƣng của Salmonella trên XLD 25 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KHẢ NĂNG GÂY BỆNH, GÂY CHẾT Ở CHUỘT DO CÁC CHỦNG SALMONELLA 4.1.1. Khả năng gây bệnh và gây chết chuột do các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm Thí nghiệm được tiến hành trên 4 chủng Salmonella được phân lập từ các nguồn bệnh phẩm nhận từ Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. Các chủng Salmonella được gây nhiễm vào chuột qua đường miệng sau khi được phục hồi trên môi trường BHI trong 18 – 24 giờ ở 37oC, theo dõi diễn biến bệnh lý ở chuột gây nhiễm trong thời gian 14 ngày. Mỗi chủng được gây nhiễm trên 4 chuột, mỗi chuột gây nhiễm 0,3 ml canh khuẩn, mật độ vi sinh vật trong canh khuẩn đã được xác định trước bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Kết quả thí nghiệm thu được sau 14 ngày gây nhiễm được thể hiện ở Bảng 4.1. Bảng 4.1. Kết quả thí nghiệm khả năng gây bệnh, gây chết cho chuột ở các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm STT Chủng Mật độ gây nhiễm (CFU/ml) Biểu hiện bệnh Số lƣợng chuột chết Thời gian gây chết 1 S.enteritidis 99.303 2,8 x 10 9 + 1/2 4 ngày 2,5 x 10 8 - 0/2 > 14 ngày 2 S.enteritidis 02.158 1,4 x 10 8 + 0/2 > 14 ngày 9,0 x 10 7 - 0/2 > 14 ngày 3 S. typhimurium 1,5 x 10 8 + 0/2 > 14 ngày 1,3 x 10 8 + 0/2 > 14 ngày 4 S. typhimurium 02.157 1,4 x 10 7 + 0/2 > 14 ngày 1,8 x 10 8 + 0/2 > 14 ngày Ghi chú: (+): có biểu hiện bệnh, (-): không biểu hiện bệnh 26 Kết quả ở Bảng 4.1 cho thấy hầu hết các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm đều có khả năng gây bệnh cho chuột. Nhưng chỉ có chủng S. enteritidis 99.303 có nguồn gốc từ bệnh phẩm người là chủng duy nhất có khả năng gây chết 1/2 chuột thí nghiệm sau 4 ngày gây nhiễm. Mật độ để Salmonella gây nhiễm vào chuột ở chủng S. enteritidis 99.303 là rất cao, khoảng 2,8 x 109 CFU/ml. Các chủng bệnh phẩm còn lại không có khả năng gây chết chuột nhưng hầu như đều làm cho chuột bệnh. Biểu hiện bệnh của chuột là xù lông, biếng ăn, gầy và ít chuyển động. Đối với chủng S. enteritidis 99.303 và chủng S. enteritidis 02.158 với mật độ gây nhiễm tương ứng là 2,5 x 108 CFU/ml và 9,0 x 107 CFU/ml thì biểu hiện bệnh lý của chuột không rõ ràng. So sánh với các nghiên cứu khác về khả năng gây bệnh, gây chết chuột ở các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm trên thì trong khảo sát này cho thấy mật độ gây bệnh gây chết chuột cao hơn rất nhiều so với các khảo sát trước đó. Theo Lu và cộng sự (1999), mật độ gây chết 50% chuột thí nghiệm của các chủng S. enteritidis và S. typhimurium trung bình vào khoảng 104 – 105 tế bào, một số chủng có độc lực mạnh có khả năng gây chết chuột với mật độ dưới 100 tế bào [3]. Theo Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự (2004), các chủng S. enteritidis 99.303 và S. enteritidis 02.158 đều có khả năng gây chết chuột sau 14 ngày gây nhiễm, với mật độ gây nhiễm tương ứng là 9,5 x 10 7 CFU/ml và 2,4 x 108 CFU/ml [5]. Trong khảo sát này, có sự khác biệt như vậy có thể do các lý do sau: (1) Các chủng Salmonella bị giảm hay mất độc lực do quá trình bảo quản và cấy chuyền nhiều lần, (2) Các chủng phân lập từ các nguồn khác nhau nên có độc lực khác nhau… 4.1.2. Khả năng gây bệnh, gây chết ở chuột do các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm Đối với các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm thì cũng được tiến hành thí nghiệm tương tự như trong các chủng từ bệnh phẩm trên. Thí nghiệm được tiến hành trên 10 chủng có nguồn gốc từ những mẫu thực phẩm khác nhau. Kết quả thí nghiệm thu được sau 14 ngày gây nhiễm được thể hiện ở Bảng 4.2. 27 Bảng 4.2. Khả năng gây bệnh, gây chết chuột ở các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm Kết quả ở Bảng 4.2 cho thấy, trong số các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm thì chỉ có 2/10 chủng là có khả năng gây bệnh cho chuột nhưng có biểu hiện nhẹ, không có khả năng gây chết chuột, mật độ gây nhiễm khoảng 4,8 x 108 – 5,9 x 10 10 CFU/ml. Các chủng còn lại sau khi gây nhiễm vào chuột, qua theo dõi trong suốt quá trình thí nghiệm cho thấy các chuột này đều không có biểu hiện bệnh hay giảm cân. Trái lại, các chuột sau khi gây nhiễm này đều khỏe mạnh, nhanh nhẹn và tăng trọng sau 14 ngày gây nhiễm. 4.1.3. So sánh khả năng gây bệnh gây chết ở chuột giữa các chủng Salmonella từ bệnh phẩm và từ thực phẩm Kết hợp kết quả được thể hiện trên Bảng 4.1 và Bảng 4.2 cho thấy có sự khác biệt rõ ràng về khả năng gây bệnh gây chết chuột ở những chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. Các chủng Salmonella từ bệnh phẩm thì có độc lực cao như có thể gây bệnh, gây chết chuột sau 14 ngày gây nhiễm. Những chuột không chết trong khoảng thời gian này thì đều có biểu hiện bệnh như xù lông, giảm cân… Ngược lại, các chủng Salmonella từ thực phẩm thì chỉ có 2/10 chủng là có khả năng gây bệnh chuột nhưng với biểu hiện nhẹ, còn 8 chủng còn lại đều không có khả năng STT Chủng Mật độ gây nhiễm (CFU/ml) Biểu hiện bệnh Số lƣợng chuột chết Thời gian gây chết 1 Salmonella SP 1b 1,1 x 10 8 - 0/2 / 2 Salmonella SP 2a 6,6 x 10 10 - 0/2 / 3 Salmonella SP 1a 4,8 x 10 9 - 0/2 / 4 Salmonella SB 10 5,9 x 10 10 + 0/2 > 14 ngày 5 Salmonella SB11 2,5 x 10 8 - 0/2 / 6 Salmonella Ô13 1,5 x 109 - 0/2 / 7 Salmonella B34 2,4 x 10 11 - 0/2 / 8 Salmonella M14 1,5 x 10 8 - 0/2 / 9 Salmonella VTr11 5,7 x 10 7 - 0/2 / 10 Salmonella H51 4,8 x 10 8 + 0/2 > 14 ngày 28 gây bệnh, gây chết chuột. Từ đó, có thể kết luận rằng độc lực của các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm thấp hơn nhiều so với các chủng Salmonella có nguồn gốc bệnh phẩm. Chuột bệnh Chuột khỏe mạnh Hình 4.1. Biểu hiện ở chuột bệnh và chuột khỏe mạnh 4.2. KHẢ NĂNG XÂM NHIỄM VÀO GAN VÀ LÁCH CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA 4.2.1. Khả năng xâm nhiễm vào gan và lách chuột của các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm Khảo sát cũng được tiến hành ở 4 chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm. Chuột sau khi gây nhiễm được theo dõi các biểu hiện bệnh lý, các chuột chết hoặc sau khi theo dõi 14 ngày được mổ để tách các phủ tạng gan và lách. Xác định mật độ Salmonella trong gan và lách bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường XLD. Kết quả thí nghiệm được thể hiện trên Bảng 4.3. 29 Bảng 4.3. Mật độ xâm nhiễm vào gan và lách chuột của các Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm Chủng Mật độ gây nhiễm (CFU/ml) Chuột Mật độ Salmonella (CFU/g) Trong gan Trong lách S. enteritidis 99.303 2,8 x 10 9 Chết 8,2 x 105 2,1 x 106 Bệnh 2,5 x 102 5,2 x 102 2,5 x 10 8 Khỏe mạnh 0 0 Khỏe mạnh 0 0 S. enteritidis 02.158 1,4 x 10 8 Bệnh 5,3 x 102 3,6 x 102 Bệnh 2,1 x 104 3,2 x 103 9,0 x 10 7 Khỏe mạnh 1,8 x 101 0 Khỏe mạnh 0 0 S. typhimurium 1,5 x10 8 Bệnh 8,9 x 101 1,2 x 102 Bệnh 2,1 x 104 3,2 x 103 1,3 x 10 8 Bệnh 4,7 x 102 5,5 x 101 Bệnh 9,5 x 103 4,4 x 103 S. typhimurium 02.157 1,8 x 10 8 Bệnh 1,3 x 103 2,0 x 103 Bệnh 2,2 x 102 3,0 x 102 1,4 x 10 7 Khỏe mạnh 0 0 Khỏe mạnh 0 0 Kết quả Bảng 4.3 cho thấy 4 chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm đều có khả năng xâm nhiễm vào gan hoặc lách hoặc cả hai cơ quan chuột. Ngoại trừ, chủng S. enteritidis 99.303 và S. typhimurium 02.157 với mật độ gây nhiễm tương ứng là 2,5 x 108 CFU/ml và 1,4 x 107 CFU/ml thì không có khả năng xâm nhiễm vào gan, lách, đồng thời biểu hiện bệnh lý ở chuột của các chủng này cũng không rõ ràng nhưng nếu mật độ gây nhiễm cao hơn thì có thể xâm nhiễm vào gan, lách với mật độ cao. Ở chủng S. enteritidis 99.303 có khả năng gây chết chuột, mật độ Salmonella hiện diện trong gan là 8,2 x 105 CFU/g và trong lách là 2,1 x 106 CFU/g. Kết quả cũng cho thấy rằng để gây chết chuột trước 14 ngày, mật độ gây nhiễm vào phải lớn hơn 109 30 CFU/ml, và Salmonella hiện diện trong gan, lách với mật độ cao từ 105 – 106 CFU/g. Các chủng còn lại vẫn cho thấy có khả năng xâm nhiễm vào gan, lách nhưng với mật độ thấp nên không làm chết chuột. 4.2.2. Mật độ xâm nhiễm vào gan và lách chuột của các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm Thí nghiệm khảo sát khả năng xâm nhiễm vào gan và lách của các chủng Salmonella từ thực phẩm cũng tiến hành tương tự như chủng từ bệnh phẩm. Khảo sát được thực hiện trên 10 chủng Salmonella, kết quả được thể hiện ở Bảng 4.4. Bảng 4.4. Mật độ xâm nhiễm vào gan và lách chuột ở các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm Chủng Mật độ Salmonella gây nhiễm (CFU/ml) Biểu hiện ở chuột Mật độ Salmonella (CFU/g) Gan Lách Samonella SP 1b 1,1 x 10 8 Khỏe mạnh 3,3 x 102 4,0 x 102 Khỏe mạnh 0 0 Salmonella SP 1a 6,6 x 10 10 Khỏe mạnh 0 0 Khỏe mạnh 0 0 Salmonella SP 2a 4,8 x 10 9 Khỏe mạnh 0 0 Khỏe mạnh 0 0 Salmonella SB 10 5,9 x 10 10 Bệnh 4,9 x 103 8,1 x 103 Khỏe mạnh 0 0 Salmonella SB 11 2,5 x 10 8 Khỏe mạnh 0 0 Khỏe mạnh 6,1 x 101 8,5 x 101 Salmonella Ô13 1,5 x 109 Khỏe mạnh 0 0 Khỏe mạnh 0 0 Salmonella B34 2,4 x 10 11 Khỏe mạnh 0 0 Khỏe mạnh 0 0 Salmonella M14 1,5 x 10 8 Khỏe mạnh 8,3 x 101 0 Khỏe mạnh 8,3 x 101 0 Salmonella VTr11 5,7 x 10 7 Khỏe mạnh 0 0 Khỏe mạnh 0 0 Salmonella H51 4,8 x 10 8 Bệnh 5,7 x 103 2,2 x 104 Khỏe mạnh 1,4 x 102 2,0 x 102 31 Kết quả trên Bảng 4.4, cho thấy trong 10 chủng Salmonella phân lập từ thực phẩm thì có 5 chủng không có khả năng xâm nhiễm vào gan và lách chuột sau khi bị gây nhiễm, 5 chủng còn lại thì có khả năng xâm nhiễm vào gan hay lách nhưng với mật độ thấp, từ 1,0 x 101 – 1,0 x 104 CFU/g. Trong 14 ngày theo dõi chuột sau khi gây nhiễm cũng không thấy có sự biểu hiện bệnh lý, ngoại trừ Samonella SB 10 và H51. Chủng Salmonella SB 10 và H51 có khả năng gây bệnh chuột, với mật độ xâm nhiễm vào gan và lách là từ 1,0 x 103 – 1,1 x 104 CFU/g. Như vậy, các chủng Salmonella phân lập từ thực phẩm không có khả năng gây bệnh hay có khả năng gây bệnh nhưng với biểu hiện bệnh tương đối nhẹ như có xù lông nhưng không bị giảm cân sau 14 ngày theo dõi. 4.2.3. So sánh khả năng xâm nhiễm vào gan và lách giữa các chủng Salmonella từ bệnh phẩm và từ thực phẩm Qua kết quả ở Bảng 4.3 và Bảng 4.4, cho thấy có sự khác biệt rất rõ ràng về khả năng gây bệnh gây chết và xâm nhiễm vào các cơ quan nội tạng gan và lách chuột giữa các chủng Salmonella phân lập từ bệnh phẩm và thực phẩm. Tất cả các chủng Salmonella từ bệnh phẩm đều có khả năng xâm nhiễm vào cả gan và lách chuột, ngoại trừ hai chủng S. enteritidis 99.303 và chủng S. typhimurium 02.157 với mật độ gây nhiễm thấp không đủ để gây bệnh chuột là không có khả năng xâm nhiễm vào gan và lách. Nhưng nếu tăng mật độ gây nhiễm lên thì chúng có thể gây bệnh và xâm nhiễm vào gan và lách chuột với mật độ cao. Trong khi đó, các chủng Salmonella từ thực phẩm, trừ 2 chủng Salmonella SB 10 và H51 có khả năng gây bệnh chuột, 8 chủng còn lại không có khả năng xâm nhiễm hay xâm nhiễm được vào gan hay lách nhưng với mật độ thấp từ 83 – 250 CFU/g. Từ đó ta có thể kết luận rằng, các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm thì có khả năng xâm nhiễm và gây bệnh mạnh hơn các chủng có nguồn gốc từ thực phẩm. Qua kết quả thí nghiệm này cũng cho phép kết luận rằng độc lực của các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm rất thấp, thậm chí một số chủng không biểu hiện độc lực khi gây nhiễm vào chuột thí nghiệm. 32 4.3. KHẢ NĂNG XÂM NHIỄM SALMONELLA VÀO CÁC CƠ QUAN CỦA HỆ TIÊU HÓA CHUỘT 4.3.1. Khả năng xâm nhiễm vào các cơ quan của hệ tiêu hóa chuột ở chủng Salmonella khi nuôi cấy trên môi trƣờng nhân tạo 4.3.1.1. Khả năng xâm nhiễm vào các cơ quan thuộc hệ tiêu hóa chuột của chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm Các đối tượng được khảo sát trong nghiên cứu này gồm: dạ dày, ruột non, ruột già, gan và lách chuột. Thí nghiệm này được thực hiện nhằm mục đích nghiên cứu khả năng chống lại các rào cản của cơ thể vật chủ của Salmonella sau khi chúng được đưa vào cơ thể chuột bằng con đường tiêu hóa. Chủng được chọn trong khảo sát này là S. enteritidis 99.303 có nguồn gốc từ bệnh phẩm người do Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh cung cấp. Sở dĩ chủng này được chọn vì chúng có độc lực cao nhất trong số các chủng đã khảo sát ở trên. Thí nghiệm cũng được thực hiện với đối chứng là những chuột không gây nhiễm Salmonella. Kết quả khảo sát trên đối chứng cho thấy không phát hiện được Salmonella trong các cơ quan đã khảo sát. Kết quả khảo sát ở các chuột bị gây nhiễm được thể hiện ở Bảng 4.5 và Biểu đồ 4.1. Bảng 4.5. Mật độ xâm nhiễm vào các cơ quan thuộc hệ tiêu hóa chuột đối với chủng S. enteritidis 99.303 Mật độ nhiễm (CFU/ml) Thời gian sau khi nhiễm Mật độ Salmonella (CFU/g) Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già 1,2 x 10 9 15 phút 4,6 x 103 8,9 x 103 2,9 x 104 0 0 2 giờ 8,9 x 103 1,5 x 104 2,7 x 103 0 0 2 ngày 1,9 x 102 4,0 x 102 0 0 0 4 ngày 3,1 x 103 1,4 x 103 6,0 x 102 8,3 x 101 0 6 ngày 1,4 x 103 3,7 x 103 0 2,8 x 102 0 8 ngày 3,9 x 104 2,9 x 105 9,9 x 101 0 0 9 ngày 2,3 x 103 9,7 x 103 0 0 0 11 ngày 2,4 x 103 8,7 x 103 0 0 0 13 ngày 7,5 x103 6,6 x 104 2,5 x 102 0 0 14 ngày 1,1 x 103 9,5 x 103 0 0 0 33 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 15' 2h 2 4 6 8 9 11 13 14 NGÀY M Ậ T Đ Ộ X Â M N H IỄ M (l og N ) Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già Biểu đồ 4.1. Biểu diễn khả năng xâm nhiễm của S. enteritidis 99.303 vào các cơ quan của hệ tiêu hóa Kết quả ở Bảng 4.5 và Biểu đồ 4.1 cho thấy chủng S. enteritidis 99.303 có khả năng xâm nhiễm vào gan và lách tương đối sớm, chỉ sau 15 phút gây nhiễm đã phát hiện được Salmonella trong các cơ quan này, mật độ xâm nhiễm tương đối cao, từ 4,6 x 10 3 – 8,9 x 103 CFU/g và chúng duy trì trong suốt 14 ngày sau khi xâm nhiễm. Mật độ duy trì trong gan và lách trung bình trong khoảng từ 102 - 105 CFU/g. Ở dạ dày mật độ Salmonella được tìm thấy cao nhất trong khoảng 2 giờ sau khi xâm nhiễm và chúng giảm dần theo thời gian. Đến ngày thứ 13 thì mật độ Salmonella ở dạ dày còn lại cao nhất là 250 CFU/g. Ở ruột non chỉ tìm thấy Salmonella ở ngày thứ 4 - 6 sau khi gây nhiễm. Mật độ Salmonella được tìm thấy ở cơ quan này trong khoảng 80 – 280 CFU/g, sau đó chúng bị đào thải hoàn toàn ra khỏi ống tiêu hóa. Chúng tôi hoàn toàn không tìm thấy Salmonella bám vào trong thành ruột già trong suốt 14 ngày khảo sát. 4.3.1.2. Khả năng xâm nhiễm vào các cơ quan thuộc hệ tiêu hóa chuột của chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm Thí nghiệm cũng được tiến hành tương tự với chủng bệnh phẩm. Chủng được chọn trong thí nghiệm này là Salmonella SP1a. Sở dĩ chọn chủng này để đại diện cho nhóm Salmonella không có khả năng biểu hiện bệnh trên chuột. Kết quả khảo sát được thể hiện trên Bảng 4.6 và Biểu đồ 4.2. 34 Bảng 4.6. Mật độ xâm nhiễm vào các cơ quan thuộc hệ tiêu hóa chuột của chủng Salmonella SP1a Mật độ gây nhiễm (CFU/ml) Thời gian sau gây nhiễm Mật độ Salmonella (CFU/g) Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già 1,7 x 10 10 15 phút 5,5 x 102 6,8 x 103 8,8 x 103 0 0 2 giờ 8,3 x 101 4,0 x 103 4,0 x 103 0 0 2 ngày 0 0 1,0 x 102 0 0 3 ngày 2,2 x 103 2,2 x 103 0 0 0 4 ngày 0 0 4,4 x 102 0 0 5 ngày 2,4 x 103 2,8 x 103 0 2,1 x 102 0 7 ngày 0 1,5 x 102 0 0 0 8 ngày 0 0 0 0 0 10 ngày 0 0 0 0 0 12 ngày 0 0 0 0 0 14 ngày 0 0 0 0 0 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3 0 3,50 4,00 15' 2h 2 3 4 5 7 8 10 12 14 NGÀY M ẬT Đ Ộ X ÂM N H IỄ M (l og N) Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già Biểu đồ 4.2. Biểu diễn khả năng xâm nhiễm của Salmonella SP1a vào các cơ quan thuộc hệ tiêu hóa 35 Kết quả ở Bảng 4.6 và Biểu đồ 4.2 cho thấy Salmonella SP1a được tìm thấy trong gan và lách ở giai đoạn rất sớm sau 15 phút gây nhiễm và chúng duy trì trong các cơ quan này đến ngày thứ 7, sau đó chúng bị đào thải hoàn toàn ra ngoài cơ thể. Ở dạ dày, vi sinh vật này được tìm thấy đến ngày thứ 4 với mật độ 440 CFU/g. Ở ruột non, chúng được tìm thấy ở ngày thứ 6. Riêng ở ruột già không tìm thấy vi sinh vật này sau 14 ngày gây nhiễm. Kết quả thí nghiệm này cho thấy chủng Salmonella SP1a có nguồn gốc thực phẩm cũng có khả năng xâm nhiễm vào các nội tạng gan và lách chuột nhưng chúng không có khả năng biểu hiện bệnh vì độc lực kém, chỉ sau 7 ngày xâm nhiễm chúng đã bị cơ thể chuột loại thải hoàn toàn ra ngoài cơ thể. Kết quả thí nghiệm này cũng giải thích tại sao sau 14 ngày theo dõi sau khi gây nhiễm lại không phát hiện được Salmonella này trong gan và lách chuột như kết quả ở mục 4.1.2 và 4.2.2. 4.3.1.3. So sánh khả năng xâm nhiễm vào các cơ quan thuộc hệ tiêu hóa chuột giữa chủng bệnh phẩm và chủng từ thực phẩm So sánh giữa hai kết quả ở mục 4.3.1.1 và 4.3.1.2 cho thấy chủng S. enteritidis 99.303 có nguồn gốc từ bệnh phẩm có khả năng xâm nhiễm vào gan, lách cao hơn và thời gian tồn tại cũng lâu hơn so với chủng Salmonella SP1a có nguồn gốc từ thực phẩm. Chủng từ bệnh phẩm S. enteritidis 99.303 có thể tồn tại sau 14 ngày trong gan và lách chuột, mật độ của chúng trong các cơ quan này vẫn chưa có chiều hướng giảm. Trong khi đó chủng từ thực phẩm Salmonella SP1a sau 8 ngày đã bị loại thải hoàn toàn ra khỏi các cơ quan này. Còn tại ruột non và ruột già thì cả chủng có nguồn gốc từ bệnh phẩm hay thực phẩm đều không có khả năng xâm nhiễm hay có xâm nhiễm nhưng với mật độ rất thấp và hầu như chúng không tồn tại lâu trong ống tiêu hóa. Ngoài ra các kết quả trên cũng cho ta thấy dường như không có mối liên hệ giữa tính gây bệnh với khả năng xâm nhiễm vào các cơ quan thuộc ống tiêu hóa của Salmonella. 4.3.2. Khả năng tái xâm nhiễm của các chủng Salmonella Mục đích của thí nghiệm này là nghiên cứu sự thay đổi độc lực sau khi Salmonella đã qua quá trình xâm nhiễm vào vật chủ. 4.3.2.1. Khả năng tái nhiễm vào các cơ quan của hệ tiêu hóa chuột ở chủng Salmonella từ bệnh phẩm Chủng S. enteritidis 99.303 được gây nhiễm vào cơ thể chuột, nuôi chuột bị nhiễm trong khoảng 4 - 5 ngày. Dịch gan của chuột bị nhiễm được xác định mật độ 36 Salmonella và được sử dụng để gây nhiễm trở lại vào chuột khỏe mạnh. Thí nghiệm được tái gây nhiễm vào 4 chuột, mổ chuột theo từng khoảng thời gian, quan sát từng cơ quan của hệ tiêu hóa và định lượng mật độ Salmonella trong các cơ quan này. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 4.7. Bảng 4.7. Mật độ S. enteritidis 99.303 trong dịch gan tái xâm nhiễm vào các cơ quan của hệ tiêu hóa theo thời gian Mật độ gây nhiễm (CFU/ml) Thời gian sau khi nhiễm Mật độ Salmonella (CFU/g) Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già 1,9 x 10 3 3 ngày 0 0 6,3 x 102 0 0 6 ngày 3,3 x 102 4,5 x 102 1,4 x 102 4,4 x 102 0 10 ngày 2,0 x 103 5,2 x 103 2,1 x 102 7,2 x 102 58 x 102 14 ngày 3,9 x 102 3,5 x 102 8,0 x 101 4,1 x 102 8,0 x 101 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 3 6 10 14 NGÀY M Ậ T Đ Ộ X Â M N H IỄ M ( lo gN ) Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già Biểu đồ 4.3. Khả năng tái xâm nhiễm của chủng S. enteritidis 99.303 từ dịch gan vào hệ tiêu hóa chuột Kết quả ở Bảng 4.7 và Biểu đồ 4.3 cho thấy chủng S. enteritidis 99.303 có khả năng tái xâm nhiễm xuyên qua ống tiêu hóa khi mật độ gây nhiễm thấp, chỉ 1,9 x 103 37 CFU/g từ dịch gan chuột. Sau khi tái xâm nhiễm chúng có khả năng duy trì trong dạ dày đến 14 ngày. Sau 6 ngày có thể tìm thấy vi sinh vật này nhiễm trong khắp các cơ quan đã khảo sát như gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già. Chúng không bị đào thải trong suốt 14 ngày theo dõi. Mật độ chúng nhiễm vào các cơ quan này cao hơn so với khi nuôi cấy trong môi trường nhân tạo BHI. Mật độ Salmonella tái nhiễm trong gan và lách cao hơn với mật độ tế bào gây nhiễm vào ban đầu, chứng tỏ Salmonella đã tăng trưởng lên sau khi xâm nhiễm vào các cơ quan này. Từ các kết quả trên có thể kết luận rằng chủng S. enteritidis 99.303 khi phát triển trong môi trường in vivo có khả năng xâm nhiễm và gây bệnh mạnh hơn so với khi nuôi cấy chúng trên môi trường nhân tạo (in vitro). Nói cách khác là độc lực của nó đã được tăng lên khi chúng được một lần sống sót và thích nghi với các các điều kiện chống cự của cơ thể vật chủ. Hiện tượng này có thể là do: (1) Chủng Salmonella đã thích nghi với khả năng xâm nhiễm, (2) Môi trường in vivo đã hoạt hóa các gen gây độc ở Salmonella trong khi các gen này bị kìm hãm khi nuôi cấy chúng trong môi trường nhân tạo, (3) Chủng S. enteritidis 99.303 gốc có độc lực đã giảm do thời gian bảo quản và cấy chuyền nhiều lần. 4.3.2.2. Khả năng tái xâm nhiễm vào hệ tiêu hóa chuột của chủng Salmonella từ thực phẩm Cách tiến hành thí nghiệm tương tự như chủng Salmonella từ bệnh phẩm. Chủng Salmonella từ thực phẩm được dùng trong khảo sát là Salmonella SP1a. Chủng Salmonella này cũng được cho xâm nhiễm vào chuột, nuôi chuột bị nhiễm sau 3 – 4 ngày, dịch gan chuột bị nhiễm được định lượng Salmonella và được tái gây nhiễm vào chuột . Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 4.8 và Biểu đồ 4.4. Bảng 4.8. Mật độ Salmonella SP1a tái xâm nhiễm vào hệ tiêu hóa chuột theo thời gian Mật độ gây nhiễm (CFU/ml) Thời gian sau khi nhiễm Mật độ Salmonella (CFU/g) Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già 5,5 x 10 3 3 ngày 0 0 2,0 x 102 0 0 6 ngày 5,5 x 101 1,5 x 102 90 0 0 9 ngày 4,2 x 103 9,8 x 103 0 0 0 12 ngày 0 0 0 0 0 38 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 3 6 9 12 NGÀY M Ậ T Đ Ộ X Â M N H IỄ M ( lo gN ) Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già Biểu đồ 4.4. Khả năng tái xâm nhiễm của chủng Salmonella SP1a từ dịch gan vào hệ tiêu hóa Qua kết quả thể hiện ở Bảng 4.8 và Biểu đồ 4.4 cho thấy chủng Salmonella SP1a có khả năng tái nhiễm thì có khả năng sống sót trong dạ dày đến ngày thứ 6 và duy trì trong gan và lách đến ngày thứ 9. Mật độ nhiễm vào gan vào lách cao hơn so với khi nuôi cấy chúng trong môi trường nhân tạo BHI, thậm chí cao hơn mật độ tế bào đã nhiễm ban đầu. Như vậy, chúng đã có khả năng tăng trưởng bệnh trong các cơ quan này. Song chúng vẫn không được tìm thấy trong ruột non và ruột già. Qua 12 ngày, Salmonella xâm nhiễm trong các cơ quan này bị đào thải hoàn toàn. Về biểu hiện bệnh lý, mặc dù Salmonella được tái nhiễm vào gan và lách mạnh hơn so với ban đầu nhưng vẫn không có khả năng biểu hiện bệnh ở chuột. Qua kết quả này cho thấy rằng, mặc dù chủng Salmonella SP1a đã được trải qua sự thích nghi trong môi trường vật chủ (in vivo) nhưng độc lực của chúng cũng rất kém, chúng vẫn bị hệ thống phòng vệ của vật chủ loại bỏ khỏi cơ thể. 4.3.2.3. So sánh khả năng tái xâm nhiễm vào hệ tiêu hóa chuột của S. enteritidis 99.303 và Salmonella SP1a Căn cứ vào kết quả ở Bảng 4.7 và Bảng 4.8 cho thấy chủng S. enteritidis 99.303 có khả năng xâm nhiễm vào toàn bộ các bộ phận ta khảo sát như gan, lách, dạ 39 dày, ruột non và ruột già với mật độ tương đối cao so với mật độ tế bào đã nhiễm vào ban đầu. Trong khi đó, chủng Salmonella SP1a chỉ có thể nhiễm vào gan, lách và không có khả năng bám vào thành ruột non, ruột già. Ở dạ dày, chủng S. enteritidis 99.303 từ bệnh phẩm có thời gian tồn tại lâu hơn so với chủng Salmonella SP1a từ thực phẩm. Sau 12 ngày gây nhiễm, chủng Salmonella SP1a bị đào thải hoàn toàn. Trong khi đó chủng S. enteritidis 99.303 vẫn duy trì được mật độ xâm nhiễm cao trong các cơ quan của hệ tiêu hóa chuột. Các kết quả trên cho thấy cả 2 chủng Salmonella từ bệnh phẩm và thực phẩm sau khi tái nhiễm đều có khả năng xâm nhiễm vào gan và lách mạnh hơn so với ban đầu khi nuôi cấy trên môi trường nhân tạo BHI. Từ đó có thể kết luận rằng các chủng Salmonella có nguồn gốc từ môi trường in vivo có khả năng xâm nhiễm và thích nghi mạnh hơn so với khi phân lập từ môi trường in vitro. 4.4. SỰ TÁC ĐỘNG CỦA MÔI TRƢỜNG XUNG QUANH ĐẾN CÁC KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Để khẳng định Salmonella nhiễm và gây bệnh cho chuột có nguồn gốc từ sự gây nhiễm, không có sự nhiễm bẩn từ các yếu tố bên ngoài, trong các lô thí nghiệm chúng tôi đều tiến hành phân tích Salmonella trong thức ăn và nước uống của chuột. Bên cạnh đó, trong mỗi lô thí nghiệm đều có chuột dùng làm đối chứng âm, là chuột được cho uống nước đã hấp vô trùng thay cho dịch vi khuẩn. Chuột dùng làm đối chứng âm được nuôi cách biệt với các chuột được gây nhiễm, các điều kiện và khảo sát đều được thực hiện tương tự như lô thí nghiệm. Kết quả cho thấy các yếu tố bên ngoài như thức ăn, nước uống, môi trường nuôi chuột đều không bị nhiễm Salmonella. Các chuột trong lô đối chứng âm đều không có dấu hiệu bệnh lý, chúng vẫn khỏe mạnh, nhanh nhẹn và tăng trọng. Kết quả khảo sát ở các cơ quan của hệ tiêu hóa như gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già cũng cho thấy không có sự hiện diện của Salmonella. Qua kết quả trên, chúng ta có thể loại bỏ khả năng xâm nhiễm Salmonella do các yếu tố bên ngoài như thức ăn, nước uống, môi trường xung quanh. 40 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN Những nghiên cứu đã thực hiện như trên là bước đầu so sánh sự khác nhau về khả năng xâm nhiễm, gây bệnh và gây chết chuột của các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. Từ kết quả đã nhận được cho phép chúng tôi rút ra những kết luận như sau: - Có sự khác biệt rõ rệt về khả năng xâm nhiễm, gây bệnh và gây chết giữa các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. 4/4 chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm có khả năng gây bệnh và gây chết chuột. Trong khi đó ở 10 chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm thì có 2/10 chủng có khả năng gây bệnh còn 8/10 chủng là không có khả năng gây bệnh, không có chủng nào có khả năng gây chết chuột. Như vậy các chủng Salmonella từ bệnh phẩm có độc lực mạnh hơn chủng từ thực phẩm. - Có sự khác biệt về khả năng xâm nhiễm vào gan và lách của chuột ở các chủng Salmonella từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. 4/4 chủng từ bệnh phẩm đều có khả năng xâm nhiễm vào cả gan và lách chuột. 5/10 chủng từ thực phẩm mới có khả năng xâm nhiễm vào. Hầu như không có sự khác biệt về khả năng xâm nhiễm vào dạ dày, ruột non và ruột già giữa các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. - Các chủng Salmonella nuôi cấy trong môi trường tổng hợp nhân tạo có khả năng xâm nhiễm và gây bệnh kém hơn so với khi chủng đã qua giai đoạn sinh trưởng ở môi trường tự nhiên trong nội tạng của chuột. 5.2. ĐỀ NGHỊ Nếu nghiên cứu này được thực hiện tiếp tục, chúng tôi đề nghị được tiến hành với các nội dung sau: - Nghiên cứu thời gian Salmonella bị đào thải hoàn toàn ra khỏi cơ thể chuột nếu chủng đó không gây bệnh và chưa đủ liều gây chết chuột. - Tiến hành khảo sát các chủng Salmonella với số lượng lớn hơn, đặc biệt là các chủng Salmonella từ thực phẩm và môi trường. 41 - Nghiên cứu sự khác biệt di truyền, sự biểu hiện của các gen tham gia trong quá trình xâm nhiễm và gây bệnh ở các chủng Salmonella từ bệnh phẩm và Salmonella từ thực phẩm, môi trường. 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Mai Chí Cần, 2002. Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E. coli, Salmonella và nấm phổi trên gà một ngày tuổi. Khóa luận tốt nghiệp Bác sỹ Thú y, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 2. Đỗ Trung Cứ, Trần Thị Hạnh và Nguyễn Quang Tuyên, 2001. Kết quả phân lập và xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella spp. gây bệnh phó thương hàn lợn ở một số tỉnh miền núi phía Bắc. Khoa học kỹ thuật Thú y, 8 (3): 10 – 19. 3. Nguyễn Hoàng Dũng, 2004. Bước đầu nghiên cứu so sánh khả năng gây bệnh của các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm và bệnh phẩm. Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh. 4. Nguyễn Tiến Dũng, 2002. Phát hiện phân biệt Salmonella spp., Salmonella enterica I trong thủy sản, nước tự nhiên. Luận văn Thạc sĩ khoa học chuyên ngành Vi sinh, Đại học Khoa học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh. 5. Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Hoàng Dũng và Trần Linh Thước, 2005. Nghiên cứu độc lực trên chuột của các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2 (2): 157-168. 6. Vương Thị Việt Hoa, 2002. Giáo trình thực tập vi sinh thực phẩm. Khoa Công Nghệ Thực Phẩm - Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 7. Đinh Nam Lâm, 1999. Nghiên cứu vi khuẩn học tình hình nhiễm Salmonella trên vịt. Luận án Thạc sĩ khoa học Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh. 8. Dương Thanh Liêm và Dương Thị Lê Hà, 2003. Dinh dưỡng và sức khỏe vệ sinh an toàn thực phẩm. Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. 9. Nguyễn Thị Oanh và Phùng Quốc Chướng, 2003. Tình hình ô nhiễm Salmonella và một số đặc tính gây bệnh của Salmonella phân lập trên trâu bò tại Đak Lak. Khoa học kỹ thuật Thú y, 10 (2): 26 – 32. 10. Trần Thanh Phong, 1996. Bệnh truyền nhiễm do vi trùng trên heo. Tủ sách trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 11. Nguyễn Vĩnh Phước, 1977. Vi sinh vật học thú y. Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. 12. Trần Linh Thước, 2002. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. Nhà xuất bản giáo dục, TP. Hồ Chí Minh. 43 13. Võ Thị Bích Thủy, Trần Thị Hạnh và Lưu Quỳnh Hương, 2002. Tình trạng ô nhiễm Salmonella trong thực phẩm nguồn gốc động vật trên địa bàn Hà Nội. Khoa học kỹ thuật Thú y, 9 (1): 18 - 23. 14. Nguyễn Phùng Tiến, Bùi Minh Đức và Nguyễn Văn Dịp, 2003. Kỹ thuật kiểm tra và chỉ tiêu đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 15. Nguyễn Ngọc Tuân, 2002. Vệ sinh thịt. Nhà xuất bản nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. 16. Bộ Y tế, 2001. Vi sinh vật y học. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 17. Trần Cẩm Vân, 2002. Giáo trình vi sinh học môi trường. Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội. TÀI LIỆU TỪ MẠNG INTERNET 18. Centers for Disease Control. Salmonellosis. USA, September 2004 19. Centers for Disease Control. How can I prevent Salmonella infection?. USA, 1996. 20. Chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm: vẫn rất đáng lo ngại! Submit%3AcboInputMethod=0 21. Haghjoo E, Galan JE. Salmonella typhi encodes a functional cytolethal distending toxin that is delivered into host cells by a bacterial-internalization pathway. Section of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine, New Haven, CT 06536, USA, March 2004. uids=10531212&dopt=Abstract 22. Hands Hedrich. The laboratory mouse. Institute for Laboratory Animal Science, Hanover Medical School, Germany, Jun 2005. 23. Houston CW, Koo FC, Peterson JW. Characterization of Salmonella toxin released by mitomycin C-treated cells. American Society for microbiology, may 1981. uids=6788702&dopt=Abstract 24. Intestinal Bacteria- Salmonella 44 25. Kenneth Todar . Salmonella and Salmonellosis. University of Wisconsin- Madison Department of Bacteriology, 2005. 26. Lu S, Manges AR, Xu Y, Fang FC, Riley LW. Analysis of virulence of clinical isolates of Salmonella enteritidis in vivo and in vitro. November, 1999. ”Ma nges+AR” 27. Malik P, Sharma VD, Thapliyal DC. Partial purification and characterization of Salmonella cytotoxin. University of Agriculture and Technology, India. 861639&dopt=Abstract 28.Murugkar HV, Rahman H, Dutta PK. Distribution of virulence genes in Salmonella serovars isolated from man & animals. Indian Joural o Medical Research, Feb 2003. 28. Ralph A. Giannella. Salmonella. Walter Reed Army Institute of Research, Washington, USA. Medmicro Chapter 21.htm 29. Rosalyn Carson-DeWitt MD. Salmonella food poisoning. CDC, USA, December, 2002 30. Wallace H. Andrews and Thomas S. Hammack. Salmonella spp. Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins Handbook, January 1992. ebam/bam-5.html TIẾNG ANH 31. Daniel P. S., John D. S., and J. Vivian Wells, 1987. Basic & Clinical Immunology. Prentice-Hall International, Inc, USA. p. 555. 32. Jay J. M., 2000. Modern food Microbiology. An Arpen publication, Maryland. p. 511 - 528. 33. Quinn P. J., Carter M. E., Markey B. K., and Carter G. R. Clinical veterinary microbiology. p. 226 - 234. 34. William B., Robert M. L., and John W. R., 1968. The enteric Bacilli - The Salmonella group. The pathogenic microorganisms. W.B Saunders Company, USA. p. 495 – 513.