Đề tài Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây cà chua (Lycopersicum esculentum L.) phục vụ chuyển gen

Mở Đầu Đặt vấn đề Cà chua là nguồn thực phẩm quan trọng trong đời sống thường ngày của con người. Đây là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, dễ trồng, vốn chi phí ban đầu thấp, có thể mở rộng sản xuất ở hầu khắp các vùng sinh thái khác nhau. Nhu cầu tiêu thụ cà chua ở nước ta rất lớn và nhu cầu này ngày càng tăng vì cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao, trong cà chua có chứa nhiều loại vitamin như A, B, C, B2, PP, K,…và các chất khoáng như Ca, Fe, P, S, Na, K, Mg và đường. Mặt khác, cà chua là loại thực phẩm dễ chế biến và sử dụng, có thể dùng ăn tươi, nấu, chế biến thành cà chua khô, cà chua bột, tương cà chua,…Bên cạnh đó, cà chua còn là mặt hàng xuất khẩu có nhiều triển vọng vì sản phẩm cà chua ở nước ta được thu hoạch vào đúng thời điểm nhiều nước không trồng được trong mùa đông lạnh [15]. Tuy nhiên, năng suất và chất lượng cà chua phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố. Bởi cà chua là loại cây rất dễ bị sâu bệnh phá hại, đặc biệt là những bệnh do nấm, vi khuẩn, virus. Chúng gây hại từ giai đoạn cây con trong vườn ươm, giai đoạn trồng ngoài sản xuất cho đến khi thu hoạch [16]. Do đó làm giảm năng suất đồng thời người trồng phải sử dụng rất nhiều loại thuốc phòng trừ sâu bệnh với liều lượng cao hơn khuyến cáo rất nhiều lần, vì thế chúng thường gây độc cho người tiêu dùng do dư lượng trong sản phẩm. Bên cạnh đó, với năng suất trung bình 14 tấn/1 ha, sản lượng hàng năm trên cả nước là 100 ngàn tấn mới chỉ đảm bảo cho bình quân đầu người trên cả nước hơn 1 kg sản phẩm một năm. Mặt khác, do vùng trồng cà chua và thời gian thu hoạch thường tập trung nên sản phẩm có nơi có lúc thừa, giá bán quá rẻ, dập nát và hư hỏng khi vận chuyển và bảo quản,... [15]. Vì vậy, việc tạo ra những giống cà chua có khả năng kháng sâu bệnh, nâng cao năng suất, chất lượng là rất cần thiết. Trước đây, muốn tạo ra được một giống cây mới, người ta đã phải mất rất nhiều năm bằng cách lai tạo, chọn lọc qua nhiều thế hệ, tuy nhiên không phải lúc nào cũng tạo ra được giống cây mang được các đặc tính như mong muốn. Nhưng ngày nay, công nghệ gen đã giúp cho việc chuyển gen ưu việt vào việc lai tạo giống mới trong nông nghiệp được tiến hành một cách nhanh chóng và dễ dàng hơn [13]. Tuy nhiên, một trong những yếu tố quan trọng hàng đầu dẫn tới sự thành công của công tác chọn tạo giống cây trồng nói chung và chuyển gen vào thực vật nói riêng là việc xây dựng hệ thống tái sinh có hiệu quả cao [14]. Chính vì vậy chúng tôi quyết định tiến hành"Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây cà chua (Lycopersicum esculentum L.) phục vụ chuyển gen" nhằm khảo sát khả năng tái sinh in vitro cây cà chua từ thân mầm để phục vụ cho việc chuyển gen sau này. 2. Nội dung nghiên cứu. - Tìm hiểu ảnh hưởng cuả một số chất kích thích sinh trưởng lên khả năng nảy mầm của hạt. - Tìm hiểu khả năng tái sinh cây từ thân mầm. Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Sinh học - Khoa KHTN & XH - ĐHTN. Chương 1. Tổng Quan Tài Liệu 1.1. Giới thiệu chung về cây cà chua 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại Cà chua có nguồn gốc ở Peru, Bolivia, Ecuado. Trước khi tìm ra châu Mỹ thì cà chua đã được trồng ở Peru và Mehico. Những loài cà chua hoang dại gần gũi với loài cà chua trồng ngày nay vẫn tìm thấy ở dọc theo dãy núi Andes (Peru), đảo Galapagos (Ecuado) và Bolivia. Các nhà vườn đã trồng, thuần dưỡng những giống cà chua quả nhỏ và dạng hoang dại. Những giống và loài hoang dại này được mang từ nơi xuất xứ đến Trung Mỹ, rồi đến Mehico [2]. Đến đầu thế kỷ XVIII, các giống cà chua đã trở nên phong phú và đa dạng, nhiều vùng đã trồng cà chua làm thực phẩm. Vào thế kỷ XIX (1830) quả cà chua đã trở thành loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn thường ngày. Cuối thế kỷ XIX, trên 200 dòng, giống cà chua được giới thiệu một cách rộng rãi trên thế giới [2]. Cà chua thuộc họ cà (Solanaceae), bộ cà (Solanales), phân lớp bạc hà (Lamiidae), lớp ngọc lan (Magnoliopsida), có tên khoa học là Lycopersicum esculentum L., cà chua còn có nhiều tên gọi khác nhau như Lycopersicum esculentum Mill, L. lycopersicum, S. lycopersicon, L. kort...[15]. Từ lâu có nhiều tác giả nghiên cứu về phân loại cà chua và lập thành hệ thống phân loại theo quan điểm riêng của mình. Theo H.J.Muller (1940) thì loài cà chua trồng hiện nay thuộc chi phụ Eulycopersion C.H.Muller. Tác giả phân loại chi phụ này thành 7 loài, loài cà chua trồng hiện nay (Lycopersicon esculentum L.) thuộc loài thứ nhất [2]. Theo L.B.Lihner Nonnecke (1989) thì L.esculentum là loài cà chua trồng có 4 biến chủng sau. + L. esculentum var. Commune là giống cà chua thông thường. Hầu hết những giống cà chua trồng đều thuộc biến chủng này. Đặc điểm là thân, lá rậm rạp, sum suê, quả có khối lượng trung bình lớn. + L. esculentum var. Grandifolium. Lá của biến chủng này to, giống lá khoai tây, mặt lá rộng và láng bóng, số lá trên cây ít. + L. esculentum var. Validum. Cà chua anh đào, cây đứng, mập. + L. esculentum var. Pyriforme. Cà chua hình quả lê. Tất cả các loài cà chua đều có số nhiễm sắc thể 2n = 24. 1.1.2. Đặc điểm sinh học Cà chua là loại thân thảo, sống theo mùa, ưa khí hậu ấm áp và ánh sáng đầy đủ. Có ánh sáng cây mới sinh trưởng và phát triển tốt. Cà chua sinh trưởng và phát triển thích hợp trong điều kiện nhiệt độ trung bình từ 22oC -26oC. Nếu nhiệt độ trên 35oC cây cà chua ngừng sinh trưởng, khi nhiệt độ xuống dưới 10oC cà chua không ra hoa. Mặc dù được xếp vào nhóm cây tương đối chịu hạn song cà chua cũng là cây ưa nước, cà chua cần một lượng nước lớn cho suốt quá trình sinh trưởng, phát triển nên cà chua cần phải được tưới nhiều nước, nếu để ruộng trồng cà chua lúc thừa lúc thiếu nước sẽ làm cho quả dễ bị nứt. Vào thời gian ra hoa nếu thiếu nước sẽ làm cho hoa được hình thành ít, dễ bị rụng quả [12]. Cà chua có thân tròn, phân nhánh nhiều, cao 0.6 - 1m, toàn thân có lông mềm và lông tuyến, đặc tính của cây cà chua là bò lan ra xung quanh hoặc mọc thành bụi. Lá kép lông chim phân thuỳ, số lượng thuỳ không cố định. Lá chét hình trứng thuôn dài 7-12cm, rộng 2-5 cm, đầu nhọn hoặc tù, gốc lệch, mép khía, răng thô, cuống dài 2-3cm [6]. Hoa màu vàng, mọc thành chùm ở kẽ lá, mỗi chùm 5-8 hoa hoặc nhiều hơn. Khi gặp những điều kiện bất lợi như quá lạnh, quá nóng, quá khô hạn, quá ẩm ướt hoặc thiếu dinh dưỡng, sâu bệnh gây hại,...thì sẽ làm cho hoa và quả dễ bị rụng. Thường người ta sử dụng chất kích thích sinh trưởng 2,4D để ngăn cản hiện tượng này [3]. Quả cà chua có hình tròn hoặc hơi dẹt, cũng có giống quả hình trứng, hình quả lê,... Khi quả chín, tuỳ thuộc vào đặc điểm của giống mà có màu sắc khác nhau như màu đỏ, màu vàng, màu vàng hồng,... Chất màu chủ yếu của cà chua là carotinoit, chlorophyll, theo mức độ chín, lượng chlorophyll giảm, lượng carotinoit tăng. Trong quả cà chua có chứa thịt quả, chất dịch chua ngọt và nhiều hạt dẹt hình thận [6]. Lớp thịt càng dày, buồng đựng hạt càng bé, chất lượng quả càng cao. ở độ chín hoàn toàn, lượng vitamin C và carotinoit đạt tỷ lệ cao nhất, lượng acid giảm, lượng đường tăng, thịt quả có vị ngọt hơn lúc còn xanh. Lượng protopectin giảm làm cho vỏ dễ tách ra và quả bị mềm. Dựa vào đặc điểm hình thái của quả mà người ta phân loại cà chua thành các nhóm khác nhau. ở nước ta, các giống cà chua đang được trồng chủ yếu thuộc ba nhóm chính là nhóm cà chua múi, nhóm cà chua hồng và nhóm cà chua bi (hay còn gọi là cà chua ta hoặc cà chua kiu) [15]. - Cà chua múi: Quả to, nhiều ngăn tạo thành múi. Quả có vị chua, nhiều hạt, ăn không ngon, nhưng cây mọc khoẻ, sai quả, chống chịu sâu bệnh tốt. Giống điển hình là cà chua múi Hải Phòng. - Cà chua hồng: Là loại cà chua được trồng phổ biến hiện nay. Quả có hình dạng như quả hồng, không có múi hoặc múi không rõ. Chất lượng ăn tươi cũng như lúc chế biến và nấu ăn cao do thịt quả đặc, nhiều bột, lượng đường cao. Phần lớn trong nhóm này là các giống được lai tạo, chọn lọc trong nước và một số giống nhập nội. Một số giống thường được trồng là PT18, HT7, HT14, VT3, HP1, MV1,... - Cà chua bi: Là giống địa phưong, gặp rải rác ở các vùng núi cao và ven biển miền trung, chúng có lượng acid cao, hạt nhiều, năng suất thấp do quả bé nhưng khả năng chống chịu tốt nên được sử dụng làm vật liệu tạo giống. Gần đây, nhiều vùng trong nước đã trồng các giống cà chua quả nhỏ nhập nội. Những giống này cho năng suất và chất lượng tốt, được sử dụng chủ yếu như một loại quả sau bữa ăn. Các giống có màu sắc và hình dáng rất đa dạng [23]. 1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng Cà chua là cây rau có giá trị kinh tế cao, được trồng rộng rãi trên thế giới. Cà chua có thể cho năng suất cao, sinh trưởng nhanh, bảo quản được tương đối dài hơn so với các loại rau khác, quả có khả năng vận chuyển được thuận lợi và đi xa [3]. Vì vậy trồng cà chua đã thực sự mang lai hiệu quả kinh tế cao. Theo FAO (1999), hiện có tới 158 nước trồng cà chua. Diện tích cà chua trên thế giới là 3 254 000 ha, năng suất là 27.77 tấn/ha, sản lượng 90.36 triệu tấn. Một số nước có năng suất cà chua cao trên 100 tấn/ha như Hà Lan (425 tấn/ha), Thụy Sĩ (383 tấn/ha), Thụy Điển (327 tấn/ha), Na Uy (291 tấn/ha), Ailen (201 tấn/ha),...[2]. Cà chua là loại rau cho hiệu quả kinh tế cao và là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của nhiều nước. ở Mỹ (1997) tổng giá trị xuất khẩu một hecta cà chua cao hơn 4 lần so với lúa nước, 20 lần so với lúa mỳ [2]. ở Việt Nam, lịch sử trồng cà chua mới chỉ hơn 100 năm nay. Trong những năm gần đây ở nước ta diện tích trồng cà chua đang ngày một tăng. Điều kiện thiên nhiên, khí hậu và đất đai nước ta rất thích hợp cho cà chua sinh trưởng và phát triển. Vì vậy trên khắp nước ta từ bắc tới nam hầu hết đâu cũng trồng đuợc cà chua [3]. Diện tích trồng cà chua hàng năm khoảng 10 000 ha [15]. Cà chua là cây rau quan trọng của nhiều vùng chuyên canh, là cây trồng sau lúa mùa sớm cho hiệu quả kinh tế cao. Cà chua được trồng chủ yếu ở vùng đồng bằng sông hồng và trung du bắc bộ. ở Miền Nam có Đà Lạt (Lâm Đồng) là nơi sản xuất cà chua cho năng suất cao. Song trong cả nước chưa có vùng sản xuất lớn, cà chua đang được trồng rải rác ở nhiều nơi. Đây cũng là khó khăn trong việc quy hoặch vùng sản xuất cà chua cho mục đích xuất khẩu và chế biến. Quả cà chua có giá trị dinh dưỡng rất cao, thành phần dinh dưỡng gồm glucid, protein, P, Ca, caroten, Fe, các vitamin B1, B2, PP, C [6]. Vitamin C trong quả cà chua khi nấu chín vẫn giữ được phần lớn khối lượng, chỉ bị bay hơi tương đối ít vì trong quả cà chua có các acid xitric và acid táo là những loại acid vừa có tác dụng bảo vệ vitamin C vừa có tác dụng tiêu được các chất béo [3]. Cà chua chín cây có chất lượng tốt hơn so với cà chua chín trong thời gian bảo quản. Đặc biệt, quả cà chua cú chứa hàm lượng lycopen khỏ cao. Lycopen hoạt động như chất chống oxy húa cực mạnh trong cơ thể, chống lại tỏc hại của cỏc gốc tự do, khụi phục những tế bào bị tổn hại, tiờu diệt những phõn tử thoỏi húa, kiềm chế quỏ trỡnh oxy húa của DNA do đú cà chua cú tỏc dụng tốt đối với nhiều bệnh như: ung thư, tim mạch, chống lóo húa,… Do có thành phần dinh dưỡng phong phú nên cà chua đã trở thành món ăn thông dụng của nhiều nước trên 150 năm nay và là cây rau ăn quả được trồng rộng rãi khắp các châu lục [2]. Cà chua cũng là loại rau có nhiều cách sử dụng. Có thể dùng quả tươi, trộn salat, nước giải khát, xào nấu,...hoặc được chế biến thành nhiều loại sản phẩm khác nhau như: cà chua cô đặc, nước quả, nước sốt, tương, cà chua đóng hộp,...[19]. Cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao nhưng ở một số vùng ở nước ta nó còn giữ giá trị thấp trong cơ cấu cây trồng. Hiện nay, các nghiên cứu trên đối tượng này chỉ dừng lại ở việc sử dụng hệ thống cây trồng hoàn chỉnh [13]. Sử dụng những tiến bộ trong lĩnh vực nuôi cấy mô và tế bào đã thiết lập một công cụ hữu ích cho việc nghiên cứu và tạo thành công cây cà chua chuyển gen nhằm nâng cao năng suất, chất lượng của cà chua. 1.2. Công nghệ tế bào thực vật trong cải tạo giống cây trồng 1.2.1. Hệ thống nuôi cấy mô tế bào thực vật Hệ thống nuôi cấy mô tế bào thực vật được hoàn thiện và phát triển mạnh từ những năm 60 của thế kỷ XX khi tìm ra môi trường nuôi cấy chuẩn và đặc biệt sử dụng các chất hormone sinh trưởng như auxin, gibberillin, cytokinin,...để kích thích sự phân bào và tăng trưởng tế bào cũng như tạo thành các mô và tái sinh cây toàn vẹn từ tế bào được nuôi cấy[1]. Ngày nay người ta có thể nuôi cấy bất kỳ cơ quan nào của cây (chồi, lá, thân, rễ, hoa,...) để tạo thành mô sẹo và từ đó điều khiển cho tế bào biệt hoá thành các mô khác nhau (rễ, thân, lá,...) và tái sinh thành cây trưởng thành. Trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thì môi trường dinh dưỡng để duy trì sự sống cho tế bào là rất quan trọng. Môi trường bao gồm các thành phần đa lượng như: NH4, NO3, SO4, Ca, Cl, K, Na,...Các chất vi lượng như: Fe, Mg, Mn, Zn, I, Bo, Mo, Cu, ... Ngoài ra còn phải bổ sung đường vào môi trường nuôi cấy vì cây nuôi cấy không hoàn toàn tự dưỡng [27]. Đường được sử dụng làm nguồn cacbon chủ yếu cung cấp năng lượng trong nuôi cấy, đồng thời đóng vai trò duy trì áp suất thẩm thấu cho môi trường nuôi cấy [25]. Các đường thường dùng trong nuôi cấy là đường glucose, hoặc sucrose. Cho đến nay, có rất nhiều môi trường dinh dưỡng khoáng được tìm ra như môi trường MS (1962), môi trường Knop (1974), môi trường Linsmainer và Skoog (1963), môi trường Gamborg (1968), môi trường VW (Vacine Went),... Trong đó môi trường MS là phù hợp nhất đối với đa số các loài thực vật [24]. Tuy nhiên, không phải loài nào cũng phù hợp với môi trường MS như cẩm chướng (Dianthus spp), hương nhu (Ocmum gratissmum) chỉ sinh trưởng được khi lượng khoáng giảm một nửa [26]. Ngoài chất dinh dưỡng thì các hormone sinh trưởng cũng đóng vai trò hết sức quan trọng trong định hướng cho quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy [4]. Bên cạnh đó phải kể đến vai trò của các yếu tố ngoại cảnh như thời gian, độ chiếu sáng, nhiệt độ, độ pH, ...Chúng gây ảnh hưởng lên sự sinh trưởng và tái sinh của tế bào, mô sẹo và cây con [1]. 1.2.1.1. Cơ sở của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên cơ sở khoa học là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt đề xuất năm 1902: “Mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”. Khả năng đó gọi là tính toàn năng của tế bào thực vật [4]. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hoá đều mang toàn bộ thông tin di truyền của cơ thể. Chính vì vậy, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi một tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Để thực hiện được điều này tế bào thực vật phải trải qua hai quá trình là phản biệt hoá và tái biệt hoá [11]. - Phản biệt hoá là giai đoạn đưa tế bào từ trạng thái đã biệt hoá trở lại trạng thái chưa biệt hoá. Quá trình này biến tế bào đã biệt hoá thành những tế bào có hình thức giống như những tế bào ở đỉnh sinh trưởng (tế bào mầm phôi). Chúng có đặc điểm là tế bào chất đậm đặc, không bào nhỏ li ti hoặc không có, nhân to, kích thước tế bào lớn. Những tế bào như vậy coi như đã được phản biệt hoá xong và trong những điều kiện nuôi cấy nhất định chúng sẽ phát triển thành cơ thể mới. - Tái biệt hoá là giai đoạn đưa tế bào đã phản biệt hoá phát triển thành cây hoàn chỉnh. Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào đã biệt hoá tham gia hình thành nên các tế bào phôi và hai loại tế bào khác là tế bào trung gian và tế bào khổng lồ có không bào rất lớn. Trong đó, chỉ có tế bào phôi và tế bào trung gian là phân chia còn các tế bào khổng lồ thì chết dần. Khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh chỉ có ở trong các tế bào phôi, nhưng nếu trong quần thể không có các tế bào khổng lồ thì các tế bào phôi không thể phát sinh thành cơ thể mới được mà chỉ những quần thể nuôi cấy có đủ các loại tế bào khác nhau mới có khả năng tái sinh [11]. Sự tái biệt hoá và phản biệt hoá là quá trình hoạt hoá và ức chế hoạt động của các gen. Trong một giai đoạn nhất định của cây, một số gen nào đó đang ở trong trạng thái ức chế không hoạt động được hoạt hoá để cho ra một tính trạng biểu hiện mới. Ngược lại, một số gen lại bị ức chế đình chỉ hoạt động. Quá trình hoạt hoá, ức chế diễn ra theo một chương trình đã được lập sẵn trong cấu trúc hệ gen của tế bào, giúp cho sự sinh trưởng, phát triển của cơ thể thực vật được hài hoà. Sự hoạt động hài hoà của của các tế bào và mô cơ quan còn phụ thuộc vào tế bào nằm trong khối mô, cơ quan của cơ thể. Khi tách riêng từng tế bào hoặc làm giảm kích thước khối mô sẽ tạo điều kiện cho việc hoạt hoá các gen của tế bào [4]. 1.2.1.2. Một số yếu tố ảnh hưởng lên quá trình nuôi cấy mô tế bào + ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy. Chúng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro. Hiệu quả tác động của các chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ sử dụng, hoạt tính vốn có của chất điều hoà sinh trưởng, loại mẫu nuôi cấy,...[20]. Các chất điều hoà sinh trưởng bao gồm hai nhóm chính là auxin và cytokinin. Tỉ lệ, hàm lượng hai nhóm chất điều hoà sinh trưởng này trong môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ định hướng cho sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy khác nhau[5]. - Nhóm auxin: Được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính. Một số loại auxin thường dùng trong nuôi cấy: IAA ( Indole acetic acid); IBA (Indole butyric acid); 2.4-D (2.4 - Dichlorophenoxy acetic acid) ; α-NAA (α-Naphthalene acetic acid). Các auxin đều có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp, phạm vi sử dụng từ 0.1 - 1mg tuỳ theo mục đích và vật liệu nuôi cấy. Auxin được thêm vào sẽ kết hợp với các auxin nội sinh để điều khiển chiều hướng và cường độ các quá trình sinh trưởng [18] .Tuỳ theo loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy... mà tác động sinh lý của auxin là kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hoá sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo [20]. - Nhóm cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro. Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sinh trưởng của mô sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy. Vì thế, trong giai đoạn đầu của phát sinh phôi soma, sự có mặt auxin là cần thiết nhưng trong giai đoạn sau của phôi phải được nuôi cấy trên môi trường có cytokinin để biệt hoá chồi [21]. Một số loại cytokinin thường dùng trong nuôi cấy: zeatin; kinetin; BAP,…Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin dao động từ 0.1-2.0mg/l. ở những nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Ngược lại, ở nồng độ thấp hơn, cytokinin biểu hiện hiệu quả kích thích kém, dẫn đến sự tạo chồi và sinh trưởng của chồi giảm. Trong nuôi cấy có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, hoặc không cần cả hai. Còn đa số các trường hợp phải sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin ở những tổ hợp tỉ lệ khác nhau [20]. Theo Bhojwani(1980) ở một số loài, môi trường nuôi cấy chỉ có một loại cytokinin cũng cho hệ số tạo chồi cực đại. Với các cây ngũ cốc sự phối hợp của hai hay nhiều loại cytokinin cho kết quả tốt hơn khi sử dụng cytokinin riêng rẽ. Tuy nhiên, muốn có tương quan sinh trưởng tối ưu thì phải có cân bằng hormone thích hợp. Sự biệt hoá cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác động qua lại giữa hai nhóm auxin và cytokinin. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích sự tạo thành rễ, ngược lại sẽ đẩy mạnh sự biệt hoá chồi, còn nếu tỷ lệ đó là trung bình thì mô sẹo được hình thành. Đó là nguyên tắc chung, còn phản ứng của các loại mô là không giống nhau [25]. Vì thế mỗi loại mô ở từng giai đoạn sinh trưởng khác nhau thì tổ hợp nồng độ giữa auxin và cytokinin là rất quan trọng. Ngoài hai nhóm chính là auxin và cytokinin, trong nuôi cấy người ta còn sử dụng thêm các chất điều hoà sinh trưởng khác như GA (thông dụng nhất là GA3), ABA, etylen,…Sự có mặt của GA3 trong môi trường nuôi cấy sẽ tăng cường quá trình vươn thân của chồi và tạo cây hoàn chỉnh ở một số loài thực vật. Tuy nhiên đối với một số đối tượng thì việc bổ sung GA3 là không cần thiết vì nó ảnh hưởng xấu đến sự hình thành chồi bất định, sự tạo rễ và phát sinh phôi. ABA chỉ được sử dụng trong nuôi cấy nhằm kìm hãm sự sinh trưởng của chồi, tham gia bảo quản lương thực và quỹ gen in vitro. ở một số trường hợp ABA có tác dụng thúc đẩy sự tạo rễ như trong nuôi cấy khoai lang, cà chua, đậu tương,…Trong nuôi cấy phôi, việc bổ sung ABA vào môi trường nuôi cấy là cần thiết vì ABA giúp phôi chống lại sự khô hoá [25]. + ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy lên khả năng tái sinh cây Mẫu dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan bộ phận của cây: Chồi ngọn, chồi bên, phiến lá, cuống lá,…Các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá mầm,…); Các cơ quan dự trữ (củ, căn hành,…). Tuỳ theo sự tiếp xúc với môi trường mà các mẫu thực vật có chứa ít hay nhiều mầm bệnh (vi khuẩn, nấm). Các cấu trúc thực vật được bao kín (lá mầm, phôi, mô thịt trong quả,…) thường không chứa hoặc có ít vi sinh vật. Ngược lại các mô và cơ quan thực vật tiếp xúc trực tiếp với đất, nước như rễ, thân ngầm, củ thường có lượng vi sinh vật rất cao và rất khó loại bỏ hoàn toàn chúng khỏi nguồn mẫu. Các loài cây khác nhau có hiệu quả nuôi cấy khác nhau. Thông thường thực vật hai lá mầm có khả năng tái sinh cao hơn thực vật một lá mầm. Thậm chí tuy mang cùng một lượng thông tin di truyền như nhau nhưng các cấu trúc mô khác nhau trên một cây có thể cho các kết quả phát sinh hình thái khác nhau, với khả năng tạo chồi, rễ hay mô sẹo,…[24]. Vì vậy, để chọn mẫu cấy cho phù hợp, phải căn cứ vào trạng thái sinh lý hay tuổi của mẫu. Mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện và môi trường nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt là trong nuôi cấy mô sẹo, phôi. Ngoài ra mô non trẻ mới được hình thành, sinh trưởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn [20]. Để đạt được hiệu quả tái sinh cao, khi lấy mẫu phải chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển cần thiết. Thông thường người ta lấy mẫu mô ở đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách rồi đến đỉnh chồi hoa và có thể là đoạn thân non, hoặc mảnh lá non. Đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách dùng để nhân nhanh nhiều loại cây trồng như: dứa, khoai tây, thuốc lá, cà chua, hoa cúc, hoa hồng,…Đỉnh chồi hoa để nhân nhanh suplơ. Mảnh lá mầm để nhanh họ bầu bí,…Sử dụng chồi non của hạt nảy mầm cũng dễ dàng nhân nhanh nhiều loại cây trồng [5]. Bên cạnh đó, chất lượng của mẫu cấy phụ thuộc vào chất lượng của cây cho mẫu, thường người ta lấy mẫu từ những cây có những đặc điểm ưu việt cần quan tâm: Sinh trưởng, phát triển mạnh, chống chịu tốt với các điều kiện bất lợi (hạn, lạnh, mặn,…) hoặc sâu bệnh, cho sản lượng và chất lượng ngon của quả, hạt,… Tuỳ thuộc vào mục đích và khả năng nuôi cấy mà người ta chọn mẫu cho phù hợp: Để phục vụ cho nhân giống vô tính thường chọn chồi ngọn, chồi bên (chồi muộn). Nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy phôi có thể sử dụng lá mầm, trụ mầm, thân, lá, phôi,…Để thu cây đơn bội phục vụ cho lai tạo giống: Dùng bao phấn và hạt phấn cho nuôi cấy. Bên cạnh đó, nguồn gốc, tuổi sinh lý của mẫu cấy cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của mô. Các mảnh nuôi cấy càng nhỏ thì tỉ lệ sống càng thấp và các mô có nguồn gốc từ chồi đỉnh có khả năng sinh trưởng tốt hơn các mô có nguồn gốc từ chồi nách [25]. Tuy vậy, nguyên tắc căn bản là mẫu cấy phải chứa các tế bào sống từ các mô non có các tế bào đang phân chia mạnh chiếm tỷ lệ lớn, nhất là dễ tạo mô sẹo. Mẫu cấy phải được khử trùng trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy. Nếu mẫu lấy từ hạt, cần phải khử trùng bề mặt và gieo hạt vào điều kiện vô trùng để mọc thành cây và lấy mẫu. Nếu mẫu lấy trực tiếp từ cây tươi, cần phải được xử lý để thu được mẫu sạch bệnh. Nồng độ và thời gian xử lý tuỳ theo loại mẫu. 1.2.1.3. ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học. Nhờ áp dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh, mô sẹo,… con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên. Do đó sẽ tạo ra hàng loạt các cá thể đồng nhất về mặt di truyền từ một cá thể ban đầu với hệ số nhân giống cao ở quy mô công nghiệp, chính vì vậy nó được ứng dụng để nhân nhanh các giống cây trồng có giá trị kinh tế cao hoặc khó nhân giống bằng các phương pháp thông thuờng khác. Hơn nữa dựa vào kỹ thuật nuôi cấy để duy trì và bảo quản được nhiều giống cây trồng quý hiếm hoặc có thể loại bỏ các mầm bệnh (phục chế giống) [21]. Hiện nay hàng loạt cây giống như cây lương thực, cây thực phẩm, cây dược liệu, cây hoa, cây ăn trái, cây rừng,… đang được sản xuất trên quy mô công nghiệp bằng công nghệ vi nhân giống. Công nghệ vi nhân giống có ý nghĩa kinh tế cao, nhất là đối với các cây sinh sản chậm (cây rừng, cây gỗ, cây ăn trái, cây dược liệu) hoặc đối với cây cần cung cấp số lượng cây giống nhiều trong thời gian ngắn như các cây hoa (hoa hồng, phong lan,…). Hơn nữa, chỉ thông qua kỹ thuật vi nhân giống mới có thể tạo được các giống cây thuần, cây lai, cây chuyển gen đồng đều về chất lượng, về tính chịu bệnh,…hoặc mang các đặc tính đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng [8]. Mặt khác, sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần (protoplast) để chuyển các gen mong muốn vào cây trồng tạo ra những tế bào lai khác loài mang đặc tính di truyền của cả bố và mẹ, đây là phương pháp hiệu quả nhất để tạo ra cây lai xoma, cho phép thu được tổ hợp lai mong muốn, phương pháp này đã khắc phục được những hạn chế cố hữu mà phương pháp lai hữu tính không thực hiện được. Bên cạnh đó các nhà nghiên cứu còn thu nhận các chất trao đổi thứ cấp từ tế bào nuôi cấy dẫn đến một sự ổn định và độc lập hơn, ít lệ thuộc vào sản xuất của thực vật ngoài tự nhiên [21]. Đồng thời nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phương pháp nghiên cứu hiệu quả nhất quá trình phát sinh hình thái ở nhiều loài thực vật. Phương pháp này giúp mở ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: Cơ chế sinh tổng hợp các chất, sinh lý phân tử - đột biến, sinh lý dinh dưỡng ở tế bào thực vật,…[21]. Đặc biệt nuôi cây mô tế bào thực vật còn được xem là bước không thể thiếu trong kỹ thuật tạo cây trồng chuyển gen. Một hệ thống tái sinh tối ưu sẽ cho phép tạo ra các cây chuyển gen có khả năng sinh sản bình thường và duy trì tính trạng được chuyển nạp cho thế hệ sau một cách hiệu quả. 1.2.2. Tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen So với các phương pháp lai tạo và chọn giống cổ điển, kỹ thuật chuyển gen có một số ưu thế: Nó cho phép đưa vào thực vật một gen lạ thậm chí không hề có nguồn gốc thực vật, nó còn cho phép sản xuất với hàm lượng cao một protein chủ yếu của tế bào có cấu trúc và đặc tính hoàn toàn thay đổi, điều không bao giờ xảy ra trong tự nhiên [4]. ưu điểm của hệ thống chuyển gen thực vật là không những toàn bộ các tế bào của cây tái sinh đều mang gen tái tổ hợp mà kể cả những hạt sinh ra từ cây này. Hơn nữa, việc bổ sung các tính trạng quan trọng bằng kỹ thuật gen không làm ảnh hưởng tới kiểu hình của cây, trong khi lai tạo truyền thống thường phải chuyển toàn bộ genome của cây cho vào cây nhận nên rất khó tách riêng các gen có lợi khỏi các gen không cần thiết, nhất là khi chúng liên kết với nhau dẫn đến việc tạo ra kiểu hình không mong đợi [14]. Chuyển gen được hiểu là quá trình gắn một hay nhiều đoạn DNA mã hoá cho một thông tin di truyền nhất định vào một cơ thể sinh vật mới. Đoạn DNA lạ này có thể được tách từ thực vật, vi khuẩn, động vật hoặc được tổng hợp bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. Trong tế bào chủ, gen lạ hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng, từ đó xuất hiện đặc tính mới của cơ thể mang gen chuyển. Muốn chuyển gen lạ vào tế bào chủ phải gắn gen mong muốn chuyển vào vector. Các vector chuyển gen càng nhỏ càng tốt vì chúng dễ xâm nhập vào tế bào. Vector phải có khả năng tự sao chép nhờ đó gen lạ cũng được sao chép cùng với DNA vector. Đồng thời, vector phải được gắn gen chỉ thị chọn lọc. Ví dụ: Gen kháng kháng sinh, gen chỉ thị màu,...và phải có vị trí nhận biết của enzyme giới hạn. Các vector thường dùng để chuyển gen ở thực vật gồm có các plasmid của vi khuẩn hoặc một số loại virus thực vật. Quá trình này phải trải qua một số giai đoạn nhất định đó là lồng ghép, kết gắn, tạo biểu hiện và di truyền đoạn gen mới đó cho các thế hệ sau [18]. Hiện nay, có nhiều phương pháp được sử dụng để chuyển gen vào cây trồng. Căn cứ vào cách thức đưa gen vào tế bào thực vật mà người ta chia ra hai phương pháp là: chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp. Chuyển gen trực tiếp là việc sử dụng các biện pháp cơ học, vật lý hoặc hoá học để chuyển trực tiếp các gen vào tế bào thực vật. Đó là phương pháp vi tiêm, phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen, bằng xung điện, qua ống phấn, chuyển gen bằng siêu âm, chuyển gen bằng phương pháp hoá học. Chuyển gen gián tiếp là phương pháp chuyển gen thông qua các vi sinh vật trung gian như virus, vi khuẩn (tiêu biểu là vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens). Đây là phương pháp hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay nhờ vào khả năng gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật một cách chính xác và ổn định [5]. Cho dù lựa chọn phương pháp nào thì để chuyển gen vào thực vật cũng cần phải trải qua các bước cơ bản là: Chọn lọc và phân lập gen; chuyển gen vào tế bào thực vật; nuôi tế bào thực vật để tạo cây hoàn chỉnh. Như vậy, nuôi cấy mô tế bào thực vật là khâu quan trọng không thể thiếu trong quy trình tạo thực vật chuyển gen. Vì thế một hệ thống tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh với tần số tái sinh cao giữ vai trò quan trọng trong nghiên cứu chuyển nạp gen và hệ thống tái sinh này cần thực hiện trước khi tiến hành quá trình chuyển gen. Kể từ khi những thí nghệm chuyển gen đầu tiên được tiến hành đến nay đã có hơn 50 loại gen được chuyển vào cây trồng và ít nhất khoảng 400 loài đã được kiểm tra ngoài đồng ruộng [1]. Trong đó có một số cây quan trọng như ngô, cà chua, đậu tương, khoai tây, bông, lúa, thuốc lá,...và một số loài hoa. Theo thống kê của ISAAA năm 2006, diện tích trồng cây chuyển gen trên toàn cầu đã lên tới 102 triệu ha mà đứng đầu là hoa kỳ với 54,6 triệu ha (chiếm 53%). Trong số các cây trồng chuyển gen được thương mại hoá thì đậu tương chuyển gen là loại cây trồng có diện tích gieo trồng lớn nhất 58,6 triệu ha (chiếm 57% diện tích trồng cây chuyển gen trên toàn cầu), tiếp theo là ngô với 25,2 triệu ha (chiếm 25%), bông 13,4 triệu ha (chiếm 13%) và cải dầu canola 4,8 triệu ha (chiếm 5%) [10]. 1.2.3. Một số thành tựu chuyển gen ở cà chua Ngày nay nhờ thành quả của phương pháp nuôi cấy mô, kết hợp với nhiều phương pháp chuyển gen tiên tiến có hiệu quả, chúng ta đã tạo ra được trên 45 loài cây tái tổ hợp khác nhau như lúa mì, lúa, ngô, khoai tây, bông, cà chua, cải dầu, đậu tương,…[18]. Với nhiều tính trạng được chuyển gen ở thực vật. Đa phần các thực vật chuyển gen nhận được các gen đề kháng thuốc diệt cỏ (56%), kháng virus (15%), kháng côn trùng (10%),…[11]. Riêng đối với cà chua, kể từ năm 1994 khi cà chua trở thành sản phẩm chuyển gen đầu tiên được thương mại hoá [5] cho đến nay người ta đã tạo ra được nhiều giống cà chua mới mang các đặc tính mong muốn như kháng sâu, kháng virus, cho quả chín chậm, chống chịu điều kiện bất lợi,… Cà chua là loại cây dễ trồng, không yêu cầu cao về kỹ thuật chăm sóc. Tuy nhiên năng suất cà chua thường bị giảm đáng kể do cà chua là loại cây dễ bị sâu bệnh phá hại. Để khắc phục điều này, người ta đã tạo ra được giống cà chua có khả năng kháng sâu đục quả rất hiệu quả bằng cách chuyển gen Cry vào cà chua. Gen Cry là gen tổng hợp protein nội độc tố của vi khuẩn Bacillus (Bt) đã cắt ngắn phần phụ (gen Cry). Gen Cry đã cắt ngắn này được chuyển vào cà chua tạo ra giống cà chua có khả năng kháng sâu đục quả rất hiệu quả Để kháng lại virus khảm thuốc lá, người ta đã chuyển gen CP-TMV vào cà chua tạo ra cây cà chua chuyển gen có khả năng kháng lại virus khảm thuốc lá. Cà chua sau thu hoạch thường chín nhanh và dễ bị thối hỏng do đó làm ảnh hưởng đến khả năng vận chuyển và bảo quản. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã chuyển một gen vào cây cà chua, gen này làm cho cà chua sản xuất ra một loại enzyme làm thoái hoá thành phần tiền chất hình thành ethylen và như vậy sẽ làm cho cà chua chậm chín và ít bị hư hại. Ngày nay, để bảo quản cho cà chua khỏi bị thối hỏng, người ta đã chuyển vào cà chua một gen của vi khuẩn, gen này sản sinh ra một chất gọi là chitinase tiêu diệt các tế bào nấm. Do đó có thể bảo quản được cà chua lâu hơn sau khi thu hoạch [16]. Từ năm 1994, giống cà chua chín chậm chuyển gen đã được thương mại hoá rộng rãi trên thị trường ở Mỹ. Giống này có ưu điểm là quả không bị dập khi vận chuyển[9]. Như vậy, từ khi cà chua chính thức được trồng làm rau màu cho đến nay. Quá trình cải tiến giống được các nhà chọn tạo giống cà chua thực hiện liên tục. Do đó, năng suất và chất lượng cà chua không ngừng được cải thiện nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng. Bên cạnh các hướng nghiên cứu nâng cao năng suất và chất lượng cà chua bằng việc chuyển các gen kháng sâu bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, chín chậm,…Ngày nay, một hướng nghiên cứu mới được ứng dụng đối với cà chua là tạo cây cà chua với mục đích làm thực phẩm chức năng. Tuy chưa được thương mại hoá nhưng đây là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng và bước đầu thu được thành công ở một số nước. ở ấn độ các nhà khoa học thuộc viện nghiên cứu thực vật quốc gia đã phát triển dòng cà chua chuyển gen có chức năng antitrypsin của người. Cà chua chuyển gen có khả năng sản xuất ra loại protein chức năng “ human alpha - 1- antitrypsin” (AAT). Protein AAT là chất ức chế phổ biến nhất với enzyme “ serine protease” trong huyết tương người. Thiếu AAT sẽ dẫn tới bệnh ung thư gan, viêm khí quản, viêm khớp và viêm da. Người ta nhận thấy protein AAT của cà chua chuyển gen thể hiện hoạt tính rất cao. Trung bình 1kg lá cà chua có thể cho 195mg AAT [28]. Chương2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng hạt giống của giống cà chua bi (hay còn gọi là cà chua ta hay cà chua kiu) (Lycopersicum esculentum Mill var . Cerasiforme Alef) [15]. Cà chua bi có lá mỏng, quả hình cầu bé, mọc thành chùm, mỗi chùm 3 - 5 quả hoặc hơn. Lúc chín có màu đỏ, vị chua hơn so với các giống cà chua khác . Hình 2.1. Cây cà chua dùng trong thí nghiệm 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thu và xử lý mẫu - Chọn những quả cà chua chín đỏ, không bị sâu bệnh. Lọc lấy hạt, loại bỏ những hạt nổi, phơi khô. - Trước khi cấy hạt vào môi trường chúng tôi tiến hành khử trùng hạt như sau: Tiến hành khử trùng bằng cồn 700 trong một phút, rửa bằng nước cất. Tiếp tục khử trùng bằng javen 60 % trong 20 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng. - Cấy hạt vào môi trường nảy mầm, mật độ 15 hạt / 1 bình môi trường. - Tái sinh từ thân mầm: Khi hạt nảy mầm được 10 ngày tuổi chưa xuất hiện lá đầu tiên, thân mầm được cắt và chỉ sử dụng hai đoạn liên tiếp dưới lá mầm dài khoảng 1 cm. Sau đó cấy thân mầm vào môi trường tái sinh, mật độ là 6 mẫu/1 bình môi trường. Các thao tác được tiến hành trong Box cấy vô trùng. 2.2.2. Môi trường nuôi cấy - Môi trường chúng tôi sử dụng trong quá trình nuôi cấy là môi trường MS ( Murashige and Skoog 1962 ) (xem bảng phụ lục 1) có bổ sung: Đường sucrose: 15 g / l đối với môi trường nảy mầm 30 g / l đối với môi trường tái sinh cây Agar: 9 g / l Nồng độ của các chất kích thích sinh trưởng thay đổi tuỳ mục đích thí nghiệm - Để nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng lên khả năng nảy mầm của hạt và khả năng tái sinh của thân mầm, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm sau. * Thí nghiệm 1: ảnh hưởng của BAP lên khả năng nảy mầm của hạt. Bổ sung BAP với các nồng độ: 0 mg / l; 1 mg / l; 2 mg / l; 3 mg / l; 4 mg/ l; 5 mg/ l * Thí nghiệm 2: ảnh hưởng phối hợp của BAP và kinetin lên khả năng nảy mầm của hạt. Bổ sung BAP 0.2 mg/ l và kinetin với các nồng độ: 0 mg/l; 0.5 mg/l; 1 mg/l; 1.5 mg/l; 2 mg/l; 2.5 mg/l; 3 mg/l * Thí nghiệm 3: ảnh hưởng phối hợp của BAP và α-NAA lên khả năng nảy mầm của hạt. Bổ sung α-NAA 0.2 mg/l và BAP với các nồng độ: 1 mg/l; 2 mg/l; 3 mg/l; 4 mg/l; 5 mg/l * Thí nghiệm 4: ảnh hưởng của BAP lên khả năng tái sinh từ thân mầm. Bổ sung BAP vơí các nồng độ: 0 mg/l; 0.25 mg/l; 0.5 mg/l; 0.75 mg/l; 1 mg/l Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH ở 5.6 - 5.8 bằng HCl 0.1N hoặc NaOH 0.1N. 2.2.3. Điều kiện thí nghiệm Quá trình nuôi cấy được tiến hành trong điều kiện có chiếu sáng 10h/ngày, nhiệt độ nuôi cấy khoảng 25 - 30 0C. 2.2.4. Chỉ tiêu đánh giá Tổng số hạt nảy mầm Tỷ lệ nảy mầm = * 100% Tổng số hạt cấy vào môi trường Tổng số mẫu tạo chồi Tỷ lệ tạo chồi = * 100% Tổng số mẫu cấy vào môi trường Chương 3. Kết quả và thảo luận 3.1. ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng lên khả năng nảy mầm của hạt 3.1.1. ảnh hưởng của BAP Để tiến hành theo dõi ảnh hưởng của BAP lên quá trình nảy mầm của hạt, chúng tôi tiến hành cấy hạt trên môi trường MS có bổ sung đường sucrose 15 g/l; agar 9g/l và BAP với nồng độ thay đổi: 0; 1; 2; 3; 4; 5mg/l. Các mẫu được nuôi trong điều kiện có chiếu sáng 10h/ngày, nhiệt độ từ 25 - 300C. Sau 10 ngày quan sát ảnh hưởng của BAP lên tỉ lệ nảy mầm của hạt chúng tôi thấy ở tất cả các môi trường đều có hạt nảy mầm với tỉ lệ khá cao. Trong đó ở môi trường có bổ sung 3 mg/l BAP (C1-3) có tỉ lệ hạt nảy mầm cao nhất (77.8%). Tuy nhiên, trên môi trường không bổ sung BAP (C1-0) mặc dù tỉ lệ nảy mầm chỉ đứng thứ hai (60%) nhưng cây mọc trên môi trường này có độ đồng đều cao và phát triển tốt nhất. Chiều dài cây mầm đạt từ 5 - 6 cm, lá mầm cân đối, thân mập. Trong khi ở các môi trường khác chiều dài cây mầm chỉ khoảng 2- 4 cm, lá mầm bé, thân mảnh. Như vậy, nồng độ BAP ở mức vừa phải (3mg/l) có thể thúc đẩy khả năng nảy mầm của hạt và cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất. Tuy nhiên, để tạo nguyên liệu cho nuôi cấy sau này chúng tôi lựa chọn môi trường C1-0 (môi trường không bổ sung BAP) vì khi cấy hạt ở môi trường này cho cây mầm có các đặc điểm thích hợp cho việc nuôi cấy sau này. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1 và biểu đồ 3.1 Bảng 3.1. ảnh hưởng của BAP lên khả năng nảy mầm của hạt Kí hiệu Nồng độ BAP (mg/l) Số hạt cấy vào Số hạt nảy mầm tỉ lệ(%) C1-0 0 45 27 60 C1-1 1 45 26 57.8 C1-2 2 45 23 51.1 C1-3 3 45 35 77.8 C1-4 4 45 24 53.3 C1-5 5 45 26 57.8 Biểu đồ 3.1. ảnh hưởng của BAP lên khả năng nảy mầm của hạt Hình 3.1. Hạt nảy mầm ở môi trường C1-0 3.1.2. ảnh hưởng phối hợp của BAP và kinetin Để tiến hành theo dõi ảnh hưởng phối hợp của BAP và kinetin lên khả năng nảy mầm của hạt chúng tôi tiến hành tương tự thí nghiệm 1 có bổ sung BAP 0.2 mg/l và kinetin với các nồng độ: 0; 0.5; 1; 1.5; 2; 2.5; 3 mg/l. Sau 10 ngày quan sát thấy ảnh hưởng phối hợp của BAP và kinetin lên tỉ lệ nảy mầm của hạt như sau: ở tất cả các môi trường có tỉ lệ nảy mầm khá đồng đều, sự chênh lệch tỉ lệ nảy mầm giữa các môi trường không cao. Tỉ lệ nảy mầm cao nhất là 64.4% ở môi trường có bổ sung BAP 0.2 mg/l và kinetin 1 mg/l (C2-2). Từ đó rút ra kết luận: Sự phối hợp của BAP và kinetin có tác động khá tốt lên khả năng nảy mầm của hạt. Có thể sử dụng môi trường C2-2 (môi trường có bổ sung 0.2mg/l BAP và 1mg/l kinetin) vào việc tạo nguồn nguyên liệu từ hạt cho nuôi cấy sau này. Kết quả thu được ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.2 Bảng 3.2. ảnh hưởng phối hợp của BAP và kinetin lên khả năng nảy mầm của hạt Kí hệu Nồng độ BAP(mg/l) Nồng độ kinetin(mg/l) Số hạt cấy vào Số hạt nảy mầm Tỉ lệ (%) C2-0 0.2 0 45 25 55.6 C2-1 0.2 0.5 45 26 57.8 C2-2 0.2 1 45 29 64.4 C2-3 0.2 1.5 45 23 51.1 C2-4 0.2 2 45 24 53.3 C2-5 0.2 2.5 45 24 53.3 C2-6 0.2 3 45 17 37.8 Biểu đồ 3.2. ảnh hưởng phối hợp của BAP và kinetin lên khả năng nảy mầm của hạt Hình3.2. Hạt nảy mầm ở các môi trường C2 3.1.3. ảnh hưởng phối hợp của BAP và α-NAA Để tiến hành theo dõi ảnh hưởng phối hợp của BAP và α-Naa lên khả năng nảy mầm của hạt chúng tôi bổ sung α-NAA 0,2mg/l và BAP với nồng độ thay đổi: 0mg/l; 1mg/l; 2mg/l; 3mg/l; 4mg/l; 5mg/l. Sau 10 ngày quan sát chúng tôi thấy ảnh hưởng phối hợp của BAP và α-NAA lên tỷ lệ nảy mầm của hạt như sau: Tỷ lệ nảy mầm ở các môi trường tương đối đồng đều, tỷ lệ nảy mầm đạt cao nhất trên môi trường có bổ sung 0,2 mg/l α-NAA và 2mg/l BAP (57,8%). Còn ở các môi trường không bổ sung BAP (C3-0) hoặc có bổ sung BAP ở nồng độ cao 5mg/l (C3-5) chúng tôi đều thấy tỷ lệ nảy mầm thấp chỉ đạt 37.8%. Mặt khác, chúng tôi nhận thấy ở tất cả các môi trường C3, cây con thu được đều có thân ngắn, lá nhỏ, rễ không phát triển. Do đó, không thích hợp để sử dụng làm nguyên liệu cho việc tái sinh sau này. Như vậy, sự phối hợp của BAP và α-NAA có tác động rõ rệt lên sự nảy mầm của hạt. Và môi trường C3 không thích hợp cho việc tạo nguyên liệu tái sinh từ hạt cà chua. Bảng 3.3. ảnh hưởng phối hợp của BAP và α-NAA lên khả năng nảy mầm của hạt Ký hiệu Nồng độ α- NAA (mg/l) Nồng độ BAP (mg/l) Số hạt cấy vào Số hạt nảy mầm Tỷ lệ(%) C3-0 0.2 0 45 17 37.8 C3-1 0.2 1 45 23 51.1 C3-2 0.2 2 45 26 57.8 C3-3 0.2 3 45 24 53.3 C3-4 0.2 4 45 21 46.7 C3-5 0.2 5 45 17 37.8 Biểu đồ 3.3. ảnh hưởng phối hợp của BAP và α-NAA lên khả năng nảy mầm của hạt Hình 3.3. Hạt nảy mầm ở các môi trường C3 3.2. ảnh hưởng của kích thích sinh trưởng lên khả năng tái sinh cây Để tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của BAP lên khả năng tái sinh cây, chúng tôi cắt những đoạn thân dưới lá mầm thành những mẩu ngắn khoảng 1cm sau đó cấy mẫu thân mầm trên môi trường MS có bổ sung sucrose 30g/l; agar 9g/l và BAP với các nồng độ thay đổi 0 mg/l; 0.25 mg/l; 0.5 mg/l; 0.75 mg/l; 1 mg/l. Qua đó, chúng tôi muốn tìm hiểu ảnh hưởng của BAP lên khả năng tái sinh cây từ thân mầm. Sau ba tuần nuôi cấy chúng tôi thu được kết quả (được thể hiện ở bảng 3.4 và biểu đồ 3.4) như sau: Tỷ lệ tạo chồi và số chồi được tạo thành ở các môi trường có sự sai khác đáng kể. Trong đó, tỷ lệ mẫu tạo chồi đạt giá trị cao nhất ở môi trường MS có bổ sung 0.5mg/l BAP( 86.6%) và thấp nhất ở môi trường MS có bổ sung 1mg/l BAP . Từ kết quả, đó chúng tôi kết luận môi trường thích hợp nhất để tái sinh chồi từ thân mầm là môi trường R3 ( môi trường có bổ sung 0.5mg/l BAP). Bảng 3.4. ảnh hưởng của BAP lên khả năng tái sinh cây Kí hiệu Nồng độ BAP (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi được tạo thành R1 0 80,0 19 R2 0,25 55,5 15 R3 0,5 86,6 18 R4 0,75 80,0 27 R5 1 50,0 15 Biểu đồ 3.4. ảnh hưởng của BAP lên khả năng tái sinh cây Hình 3.4. Các mẫu tái sinh từ môi trường R3 Kết luận và đề nghị Kết luận Dựa vào số liệu thu được và kết quả phân tích ở trên, chúng tôi rút ra những kết luận sau: Các nồng độ BAP khác nhau trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng khác nhau lên tỷ lệ nảy mầm của hạt cà chua. Trong đó, ở nồng độ 3mg/l BAP trong môi trường MS cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất (77.8%). Sự phối hợp của BAP và kinetin ở các nồng độ khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt lên tỷ lệ nảy mầm của hạt. Trong đó ở nồng độ phối hợp 0.2 mg/l BAP và 1mg/l kinetin trong môi trường MS cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất (64.4%). Sự phối hợp của BAP và α -NAA ở nồng độ 0.2 mg/l α -NAA và 2 mg/l BAP trong môi trường MS cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất (57.8%). Môi trường R3 ( MS + 0.5mg/l BAP) là môi trường thích hợp cho tái sinh chồi từ thân mầm cà chua. Đề nghị Do còn hạn chế về thời gian và điều kiện thí nghiệm, chúng tôi đưa ra một số kiến nghị sau: + Khảo sát khả năng tái sinh từ lá mầm. + Tìm hiểu ảnh hưởng của tuổi thân mầm và lá mầm lên khả năng tái sinh. + Tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện quy trình tái sinh thành cây hoàn chỉnh để phục vụ cho việc chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumfaciens sau này. Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt 1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp, 1997. 2. Tạ Thu Cúc, Kỹ thuật trồng cà chua, NXB Nông nghiệp, 2002. 3. Đường Hồng Dật, Sổ tay người trồng rau, NXB Hà Nội, 2002. 4. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, 2005. 5. Trịnh Đình Đạt, Công nghệ sinh học, tập 4, công nghệ di truyền , NXB Giáo dục 2006. 6. Lê Trần Đức, Cây thuốc Việt Nam, NXB Nông nghiệp, 1997. 7. Phạm Thị Hạnh, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hồ, Nguyễn Văn Uyển, Khảo sát khả năng tái sinh in vitro cây cải ngọt (Brassica integrifolia) từ lá mầm và trụ mầm phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 2005, trang 498 - 500. 8. Nguyễn Như Hiền, Công nghệ sinh học, tập 1, Sinh học phân tử và tế bào- cơ sở khoa học của công nghệ sinh học, NXB Giáo dục, 2007. 9. Phạm Thành Hổ, Di truyền học, NXB Giáo dục, 2006. 10. James Clive (2006), Tóm tắt báo cáo đánh giá về tình trạng cây trồng công nghệ sinh học, cây trồng chuyển gen được đưa vào canh tác với mục đích thương mại trên thế giới trong năm 2006, Cơ quan dịch vụ quốc tế về tiếp thu các ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp ISAAA. 11. Nguyễn Trọng Lạng, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Tâm, Sinh học tế bào, NXB Nông nghiệp, 2005. 12. Hoàng Minh, Kỹ thuật trồng và chăm sóc dưa hấu, bí ngồi, cà chua, ngô, NXB Lao động Xã hội, 2005. 13. Trương Thị Bích Phượng, Hồ Thị Kim Khánh, Nguyễn Hữu Đổng, ảnh hưởng của Mannitol đến tích luỹ prolin và glucose liên quan đến khả năng điều chỉnh thẩm thấu trong nuôi cấy callus cà chua, Tạp chí di truyền học và ứng dụng, số 1 , 2003. 14. Nguyễn Đức Thành, Chuyển gen ở thực vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 2003. 15. Trần Khắc Thi, Kỹ thuật trồng rau sạch - Rau an toàn và chế biến rau xuất khẩu, NXB Thanh Hoá, 2005. 16. Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó, ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất và đời sống , NXB Lao động, 2006. 17. Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hà, Phạm Minh Thơi, Đỗ Năng Vịnh, Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh sử dụng cho biến nạp gen ở ngô, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 2003, trang 820- 824. 18. Phan Hữu Tôn, Giáo trình công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng, Trường ĐH Nông nghiệp I, 2005. 19. Nguyễn Văn Viên, Đỗ Tấn Dũng, Bệnh hại cà chua do nấm, vi khẩn và biện pháp phòng chống, NXB Nông nghiệp, 2004. 20. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, Công nghệ sinh học, tập 2, Công nghệ sinh học tế bào, NXB Giáo dục, 2006. 21. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn, Sinh lý học thực vật, NXB Giáo dục,2007. 22. Nguyễn Thị Hải Yến, Nghiên cứu hoàn thiện hệ thống chuyển gen ở lúa, Luận văn thạc sĩ Khoa học Sinh học, 2004. 23. Sổ tay kỹ thuật thâm canh rau ở Việt Nam, NXB Văn hoá Dân tộc, 2005. Tài liệu tiếng Anh và Internet 24. Haiyan Yu, Reserch on ABT and GGR International Application and Cooperation, China Forestry Publishing House Beijing, 2002. 25. Naroyanaswamys, Plant cell and tissue culture, Tataca Mc. Graw Hill. Publishing company limited, New Delhi, 1994. 26. Pierick R.L.M, In vitro Culture of highter plant, 1998. 27. Smith R.H, Plant tissue culture. Departmen of soil and Crop Science, 1992. 28. http:// www.springerlink.com/content/053336v077647j05