Đề tài Nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayenne bằng phƣơng pháp marker phân tử

1 PHẦN I: GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay dứa là một trong 3 loại cây ăn quả hàng đầu của nước ta (chuối, dứa, cam quýt), chiếm vị trí quan trọng trong nền sản xuất rau quả. Cây dứa với ưu thế chống chịu được đều kiện ngoại cảnh, phẩm chất cao, sớm thu hồi vốn nên đang là một trong những chiến lược nhằm nâng cao đời sống cho người lao động và nền kinh tế xã hội. Với tiềm năng kinh tế cao, diện tích dứa đang được mở rộng trên phạm vi cả nước (36.541 ha năm 2002) (Tuấn và Tiến, 2002) nhằm tăng sản lượng cho tiêu dùng và nguyên liệu cho các nhà máy chế biến ở các tỉnh như: Tiền Giang, Kiên Giang, Long An, Hậu Giang, Thành Phố Hồ Chí Minh, Đồng Nai.. Trước đây, dứa Queen được trồng phổ biến ở nước ta nhưng có nhiều nhược điểm không phù hợp với công nghệ cơ giới và tỉ lệ thành phần trong chế biến thấp. Chính vì thế, dứa Cayenne đang là giống được quan tâm với nhiều đặc điểm tốt và diện tích trồng đạt 3600 ha năm 2002 ở các tỉnh phía Bắc và Đông Nam Bộ (Tuấn và Tiến, 2002). Tuy nhiên, diện tích trồng mới nguồn vật liệu này vẫn còn thấp do nhu cầu giống chưa đủ và phần lớn giống là nhập ngoại. Vì vậy, trước hết cần phải tìm hiểu tính đa dạng di truyền của giống dứa Cayenne, trên cơ sở đó để thực hiện có hiệu quả việc nhân và tạo giống đồng thời xây dựng các định hướng về kiểm tra, quản lý và bảo vệ nguồn gen các giống cây trồng sẵn có trong nước cũng như du nhập từ nước ngoài. Do đó, chúng tôi đã tiến hành đề tài “nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayenne bằng phƣơng pháp marker phân tử”. Để nghiên cứu đa dạng di truyền người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp sử dụng các chỉ thị hình thái, chỉ thị isozyme hay chỉ thị (marker) DNA (RFLP, RAPD, AFLP, SSR..). Tuỳ vào đối tượng, điều kiện và mục đích nghiên cứu mà người ta lựa chọn phương pháp phù hợp nhất. Trong đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tính đa dạng về di truyền của dứa Cayenne bằng marker RAPD. Hy vọng kết quả của đề tài này sẽ đóng góp một phần nhất định vào tiền đề của công tác chọn tạo giống dứa ở Việt Nam. 2 1.2. Mục tiêu và yêu cầu 1.2.1. Mục tiêu - Tìm hiểu và sưu tầm nguồn gen của cây dứa Cayene bằng phương pháp chỉ thị (marker) phân tử. - Tìm hiểu sự đa dạng về kiểu hình của các dòng dứa từ giống Cayenne. - Đề xuất vật liệu lai ban đầu cho công tác chọn và tạo giống dứa Cayenne. 1.2.2. Yêu cầu - Thành thạo thao tác ly trích DNA. - Nắm vững kỹ thuật PCR, hạn chế sai sót trong quá trình thực hiện. - Nắm vững các kỹ thuật sử dụng chỉ thị RAPD - Hiểu rõ về các phần mềm xử lý thống kê sinh học như NTSYS-pc, Excel, IRRISTAT ... 3 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Một số khái niệm về đa dạng sinh học 2.1.1. Đa dạng sinh học Theo quỹ quốc tế về bảo tồn thiên nhiên-WWF (Word Wildlife fund) (1989), đa dạng sinh học được định nghĩa như sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là các gen chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp tồn tại trong môi trường”. Do vậy đa dạng sinh học được xem xét theo 3 mức độ: - Đa dạng sinh học ở cấp độ loài bao gồm toàn bộ các sinh vật sống trên trái đất, từ vi khuẩn đến các loài thực vật, động vật và các loài nấm. - Đa dạng sinh học ở mức độ gen là sự khác biệt gen giữa các loài, giữa các quần thể sống cách ly về địa lý cũng như các cá thể cùng chung sống trong một quần thể. - Đa dạng sinh học còn bao gồm sự khác biệt giữa các quần xã mà trong đó các loài sinh sống và các hệ sinh thái, nơi mà các loài cũng như các quần xã sinh vật tồn tại và cả sự khác biệt của mối tương quan giữa chúng với nhau (Phạm Bình Quyền, 2002). - Ngoài ra đa dạng sinh học còn liên quan đến việc phân bố địa lý. Đây là sự phân biệt có tầm rộng và là chiến lược nghiên cứu của nhiều nước trên thế giới . 2.1.2. Đa dạng di truyền Các cá thể trong một quần thể thường có genome khác nhau. Sự đa dạng về genome được biểu hiện qua sự khác nhau về gen giữa các cá thể. Những alen khác nhau của cùng một gen có thể làm cho sự phát triển các đặc điểm sinh lý ở mỗi cá thể khác nhau là khác nhau. Những cây trồng được trồng lai ghép hay những động vật được lai tạo từ những genome khác nhau có thể tạo ra những giống cây trồng, vật nuôi cho năng suất cao, khả năng chống chịu sâu bệnh tốt (Richard B. Primack, 1999). Trong quá trình sinh sản hữu tính, kiểu gen của các cá thể trong quần thể sẽ tăng lên do kết quả tái tổ hợp do đột biến. 4 Các gen đa hình là nguyên nhân dẫn đến sự tồn tại các kiểu gen dị hợp trong quần thể. Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thể trong quần thể cho phép các quần thể này thích nghi hơn với những thay đổi môi trường (Richard B. Primack, 1999). 2.1.3. Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên và nó cũng quan trọng đối với con người. Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì nòi giống, kháng với các loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trường. Sự đa dạng di truyền của cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ lợi ích của con người. 2.2. Giới thiệu chung về dứa Cayene 2.2.1. Nguồn gốc và phân loại Cây dứa có tên khoa học Ananas comosus L. (Merrill), thuộc họ Bromeliaceae, chi Ananas , trong chi này có 6 loài, trong đó loài Ananas comosus là có giá trị kinh tế hơn cả. Dứa có nguồn gốc từ Nam Mỹ, theo K.F Baker và J.L.Collin thấy xuất hiện ở miền nam Braxin, bắc Achentina và Paragoay. Theo Hume và Miller, các giống dứa đang trồng hiện nay được chia làm 3 nhóm: Cayene, Queen (hay còn gọi là Nữ hoàng), Spanish (hay Tây Ban Nha). Trong đó nhóm Cayene được chia làm các giống như Smooth Cayene, Sarawak (giống có khả năng chịu ẩm, úng và chống bệnh héo), Enville, Baron roth schild, Typhone, Smooth Guatemalan... Ở Việt Nam, theo đều tra nghiên cứu của viện nghiên cứu rau quả đã tập hợp được 3 giống Cayenne được trồng ở nước ta gồm: Cayenne chân mộng trồng ở Vĩnh Phú, Cayenne Phủ Quỳ trồng ở Nghĩa Đàn - Nghệ An, Cayenne Đức Trọng trồng ở Lâm Đồng và ở Nam Bộ chủ yếu là Cayenne trơn nguồn gốc từ Pháp. Nguồn gốc của các giống Cayene trồng ở nước ta thường nhập từ nước ngoài và qua tiến hành lai tạo (Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2002). 5 2.2.2. Giá trị kinh tế Về mặt dinh dưỡng, dứa được xem là “hoàng hậu” trong các loại quả vì hương vị thơm ngon và giàu các chất dinh dưỡng. Wooster và Blank (1950) đã phân tích thành phần dinh dưỡng của quả dứa Cayenne ở Hawaii cho kết quả sau: - Đường 11 - 15 %, saccharose chiếm 1/3, còn lại là glucose và fructose - Acid: 0,6 % gồm 78 % acid citric, còn lại là acid malic và acid khác - Hàm lượng các loại vitamin: vitamin A - 130 đơn vị quốc tế, vitamin B1 - 0,02 mg, vitamin C - 4,2 mg / 100 g - Các chất khoáng: Ca - 16 mg, P - 11 mg, Fe - 0,3mg, Cu - 0,07 mg - Protein - 0,4 g và lipit - 0,2 g - Hydratcacbon - 13,7 g, nước 85,5 g và xenlulose - 1,4 g Ngoài ra trong quả dứa còn có men bromelin giúp cho việc tiêu hoá rất tốt. Nó được dùng trong công nghiệp thực phẩm, thuộc da, vật liệu làm phim... Về hiệu quả kinh tế: Cayenne cho quả to, sản lượng cao, có thể đạt trên diện tích lớn ở HaWaii 80 – 100 tấn / ha. Aubert cho rằng sản lượng Cayenne có thể gấp đôi dứa Queen. Đồng thời, ưu điểm lớn của Cayenne là vỏ mỏng, nước nhiều, quả hình ống, là loại hình lý tưởng để chế biến đồ hộp, dù là dứa khoanh hay nước dứa.Về mặt canh tác, nhờ quả không có gai nên thao tác thuận lợi, hiệu suất lao động tăng lên nhiều. Hiện nay ngành nông nghiệp nước ta đang có kế hoạch phát triển và mở rộng diện tích dứa nhằm tăng sản lượng cho các nhà máy chế biến (Vũ Công Hậu, 1999). 2.2.3. Đặc điểm hình thái của dứa Cayenne Dứa là một loại cây thảo lâu năm: sau khi thu hoạch quả các mầm nách ở thân tiếp tục phát triển và hình thành một cây mới giống như cây trước, cũng cho một quả; quả thứ hai thường bé hơn quả trước. Các mầm nách của cây con lại cho phát triển và cho một quả thứ ba. Cây dứa trưởng thành cao 1,0 - 1,2 m và có hình dạng như một con cù (cù- thứ đồ chơi của trẻ em) có đường kính khoảng từ 1,3 - 1,5 m, có đáy bẹt, tán cây xoè rộng. Cấu tạo của dứa (Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2002) gồm có các thành phần sau: 6 2.2.3.1. Rễ Rễ thường là bất định và mọc ngang mặt đất. Dựa vào nguồn gốc phát sinh chia thành các dạng: rễ cái, rễ nhánh và rễ bất định. Rễ dứa thuộc loại ăn nông, phần lớn do nhân giống bằng chồi (nhân giống vô tính) nên mọc từ thân ra, nhỏ và phân nhiều nhánh. Ở tầng đất dày rễ có thể ăn sâu 0,9 m. Nhưng bộ rễ dứa thường tập trung ở tầng đất 10 - 26 cm và phát triển rộng đến 1 m. Rễ dứa thuộc loại háo khí ưa xốp và thoáng nên trồng tốt nhất trên đất đồi feralit đỏ vàng và kém phát triển trên đất cát, đất sét. Đồng thời rễ dứa phát triển tốt trong đất có hàm lượng nước từ 10 – 20 %, độ pH thích hợp nhất từ 4.0 - 5.5, giới hạn 3.5 - 6.0. Để cho bộ rễ phát triển bình thường cần cung cấp dinh dưỡng N, P, K, Ca, Fe, Mg, S…trong đó N, P có vai trò quan trọng. Thiếu N, P rễ phát triển kém, không ra quả. Sinh trưởng và phát triển của rễ bị ảnh hưởng trực tiếp bởi nhiệt độ. Trong phạm vi 12 - 300C, nhiệt độ càng tăng bộ rễ phát triển càng mạnh và ngược lại. Nhiệt độ giới hạn 5 - 430C nếu cao hay thấp hơn trong nhiều ngày bộ rễ sẽ chết. Theo Mao Tác nghiên cứu 3 giống dứa Cayenne ở Philippin, Đài Loan và Nam Ninh năm 1960 cho biết hoạt động của bộ rễ đạt đỉnh cao vào tháng 5 và tháng 10 do nhiệt độ các tháng này tăng cao. Các nguyên liệu chồi khác nhau đem trồng đều có ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển bộ rễ dứa. 2.2.3.2. Thân Thân cây dứa chia làm hai phần: một phần trên mặt đất và một phần ở dưới đất. Hình dạng của thân biểu hiện tình trạng của cây như thân ngắn, bặm chứng tỏ cây khỏe, ngược lại thân dài bé là cây yếu. Thân cây dứa trưởng thành dài 20 - 30 cm, đường kính 3 – 7 cm, trọng lượng 200 – 400 g. Ở trung tâm thân là một mô rỗng, mềm, chứa các chất dinh dưỡng chứa nhiều tinh bột ở giữa, nối tiếp là một lớp bó mạch có nhiều xơ, và ngoài cùng được bao bọc bởi một lớp biểu bì và gốc lá. Thân mọc khỏe trong đều kiện nhiệt độ 250C trở lên, nếu dưới 50C thì ở đỉnh thân và gốc lá bị những vết cháy do rét. Nếu vừa lạnh vừa mưa kéo dài thì đỉnh thân sẽ bị thối. Trường hợp ngập nước thì cả rễ và thân đều bị thối. 7 2.2.3.3. Lá Lá mọc trên thân cây theo hình xoắn ốc. Lá thường dày, không có cuống, hẹp ngang và dài. Mặt lá và lưng lá thường có một lớp phấn trắng hoặc một lớp sáp có tác dụng làm giảm độ bốc hơi nước cho lá. Hình dạng lá không có gai, trừ một vài cái gai ở ngọn, màu xanh thẩm với đốm nâu đỏ, lá dài từ 80 – 100 cm, rộng 5 – 8 cm, khi trưởng thành có khoảng 60 - 80 lá. Hình dạng lá thay đổi tuỳ theo vị trí, tuổi của chúng từ đó dẫn đến việc sắp xếp chúng thành nhiều loại khác nhau. Diện tích lá lớn thì quả thường to và ngược lại cho nên cần phải tìm cách tác động cho cây đạt được số lá tối đa. Nhiệt độ giới hạn của dứa là 5 - 400C. Trên 400C cây ngừng hoạt động, ở 80C cây cũng ngừng ra lá, 50C các hoạt động ngừng và dưới 00C cây chết rét. Sinh trưởng của lá còn bị ảnh hưởng bởi độ phì của đất. Bón phân bổ sung một cách hợp lý làm cho cây sinh trưởng khỏe, bộ lá sum xuê. Vì vậy, ta cần phải cung cấp đủ lượng dinh dưỡng và cân đối giữa NPK cùng các nguyên tố khác để đảm bảo cho bộ lá sinh trưởng tốt. 2.2.3.4. Hoa, quả, hạt Dứa trung bình có 150 hoa ,với lá bắc dưới hoa gồm có 3 lá đài, 3 cánh hoa, 6 nhị đực xếp thành 2 vòng, 1 nhị cái có 3 tâm bì và bầu hạ. Cánh hoa màu xanh mờ với biến sắc màu đỏ tía, gốc có màu trắng nhạt và trên mặt cánh hoa có những vảy. Trong một năm dứa ra hoa nhiều vụ thường vào tháng 2 – tháng 3 và thu hoạch quả vào tháng 6 – tháng 7. Cuống quả của dứa có chiều dài so với chiều dài quả tương đối ngắn, trọng lượng quả trung bình cao từ 2 - 4 kg / trái, hình trụ, mắt to và dẹt, màu đỏ da cam, khi chín ở giữa mắt hơi nhô lên. Thịt quả khi chín ít nhiều trong, không xơ, màu vàng nhạt. Vị ngọt và chua, đường kính lõi trung bình khoảng 2,5 cm.Trên ngọn quả dứa là một chồi ngọn thường to và đơn độc. Theo Cl.Py và Tissesau (1960) nhiệt độ thích hợp cho quả chín là 250C nếu quá cao sẽ làm tăng độ chua trong quả và phẩm chất kém. Dứa không có hạt nếu để tự do. Nếu đem lai các giống khác nhau thì có thể có hạt. Hạt dứa rất bé, có màu tím đen, hình trứng tròn chỉ dài độ 3 mm, mỗi quả con chỉ có vài hạt. Hạt dứa nảy mầm rất yếu cần phải xử lý mới có tỷ lệ nảy mầm cao. 8 2.2.4. Đặc tính di truyền học Năm 1931, J.L Collins và K.R.Kern đã xác định số nhiễm sắc thể của Ananas Comosus và các loài lân cận là 2n = 50. Ở tất cả các loài A.comosus thì nhiễm sắc thể đều nhỏ và hình cầu. Một trong những đặc trưng di truyền thể hiện ở dứa là hình thái lá. Nó được phân biệt thành 3 dạng: - Lá chỉ có gai ở ngọn, đặc trưng cho Smooth Cayenne. - Lá hoàn toàn có gai, trường hợp xuất hiện hầu hết ở các loài. - Lá hoàn toàn không gai hay còn gọi với tên lá viền. Tính trạng chỉ có gai ở ngọn và gai là những đôi tính trạng trong đó chỉ có gai ở ngọn là tính trạng trội (S) và có gai là tính trạng lặn (s). Đều này chứng minh rằng Cayenne là dị hợp tử và tất cả các loại có gai là đồng hợp tử với tính (s). Mặt khác, tính trạng lá viền hay không viền là cặp tính trạng độc lập (P) và cân đối hơn với tính trạng (S) (s). Đồng thời Collins đã chứng minh sự tồn tại của những gen khác, tất cả những gen này hình như là những đôi tính trạng đối với gen „có gai‟. Số lượng trung bình của chồi cuống trên một cây cũng là một đặc trưng di truyền nhưng lại ảnh hưởng ngoại cảnh và sự phát triển sinh trưởng của dứa khi phân hoá hoa tự. Đây là một đặc trưng quan trọng cần theo dõi bởi nó là vật liệu tốt để trồng sau này và dễ xảy ra nhiều biến dị trong quá trình phát triển. Một số biến dị di truyền thường xảy ra ở dứa ảnh hưởng về phương diện kinh tế như: biến dị kéo dài ở quả, với hình dạng dài ra và đường kính bé; biến dị “quả khô” tất cả bộ phận hoa đều không đậu, trừ các lá bắc, và trở thành biến dị “cổ chai” khi cho các bộ phận hoa ở phần trên hoa tự không đậu; hay là những biến dị biểu hiện bằng những lá sinh sôi nảy nở quanh các mắt hay tại mắt (Claude Py và m.A.tisseau, 1993). 2.2.5. Tình hình sản xuất và tiêu thụ trong nƣớc và thế giới 2.2.5.1. Thế giới Theo số liệu thống kê (Anon., 2002) thu thập từ FAO (Food and Agriculture Organisation) của Hoa Kỳ, sản lượng dứa thế giới 1999 - 2001 là 13.527.149 triệu tấn và ước tính sẽ ổn định trong 3 năm. Sản lượng trên thế giới đã tăng gấp 3 lần trong 30 năm qua (3.833.137 năm 1961 đến 13.738.735 năm 2001). Những nước đứng đầu về sản lượng năm 2001 bao gồm Thái Lan (2.300.000 tấn), Philippine (1.571.904 tấn), 9 Brazil (1.442.300 tấn), Trung Quốc (1.284.000 tấn).. Những nước chiếm ưu thế về thị trường dứa tươi (khoảng 670.000 tấn) như Costa Rica, Philippine và Cote d‟Ivoire; về dứa đông lạnh là Thái Lan và Philippine (Rohrbach và ctv, 2003). Mỹ là nước nhập khẩu dứa lớn nhất từ năm 1998 - 2000 bình quân 552597 ngàn USD / năm ở các dạng dứa đóng hộp, tươi và cô đặc. Theo thống kê, sản lượng giống dứa Smooth Cayene chiếm 70 % sản lượng thế giới và hầu hết ở dạng đóng hộp (khoảng 95 %). Tuy nhiên giống này sản xuất ở dạng dứa tươi chất lượng chưa tốt nên đã trở thành áp lực cho các nhà đầu tư đòi hỏi phải cải thiện giống Cayenne để cung cấp dạng tươi tốt hơn (Sanewski and Scott, 2000). Hiện nay, một số nước đang cố gắng phát triển giống Cayenne như Đài Loan, Malaysia, Cuba, Brazil và Pháp. 2.2.5.2. Trong nƣớc Theo số liệu điều tra của viện quy hoạch và thống kê nông nghiệp, diện tích dứa Cayenne năm 2002 là 3.641 ha trồng ở 18 tỉnh, thành phố và con số này đã được gia tăng trong những năm gần đây. Các tỉnh có diện tích dứa Cayenne nhiều như Ninh Bình (700 ha), Nghệ An (695 ha), Hà Tỉnh (438 ha),(Tuấn và Tiến, 2002). Sản lượng dứa tươi sản xuất cả nước theo tổng cục thống kê Nông-Lâm-Ngư dao dộng từ 263 – 316 ngàn tấn / năm trong đó Đồng Bằng Sông Cửu Long chiếm gần 71 %. Nguyên liệu cung cấp cho các nhà máy chế biến đang trong tình trạng cung chưa đủ cầu do sự ra đời của nhiều nhà máy chế biến dứa với công suất cao và kỹ thuật hiện đại như Đồng Giao ở Tiền Giang, An Giang hay nhiều nhà máy nhỏ công suất nhỏ ở Hà Tỉnh, Hồ Chí Minh, Cần Thơ.. 2.3. Nguyên tắc và ứng dụng của một số phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng di truyền nhờ vào chỉ thị (marker) 2.3.1. Phƣơng pháp sử dụng các chỉ thị hình thái Về mặt nguyên tắc, một tính trạng hình thái nào đó do một locus kiểm soát mà sự biểu hiện của nó không bị ảnh hưởng do tác động của môi trường, có thể được dùng làm chỉ thị hình thái trong quá trình chọn lọc (Lê Duy Thành, 2000). Chỉ thị hình thái đã được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu về đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng khác nhau. Trong đó, có nhiều thành công trên thực vật như: ở 10 dứa, Duval và d‟Eeckenbrugge., (1993) đã phân tích 5 nhóm dứa trồng với 18 tính trạng chất lượng và 27 tính trạng số lượng bao gồm đặc tính thực vật, hoa và trái. Kết quả đã cho thấy sự tương đồng giữa các giống Cayenne, Queen và Pernambuco, trong khi Mordilona và Spanish nằm trong nhóm khác. Ngoài ra ở lúa, Kato và cs., (1928, 1930) bằng chỉ thị hình thái đã chia lúa trồng thành 2 loài phụ Indica và Japonica. Sau này cũng bằng chỉ thị hình thái Morinaga (1954) chia thêm một loài phụ thứ 3, Javanica. Mặc dù chỉ thị hình thái rất tiện lợi, dễ xác định do đo trực tiếp trên kiểu hình nhưng chúng lại có những hạn chế nhất định: ảnh hưởng rất nhiều do tương tác kiểu gen với môi trường, số lượng marker có giới hạn chỉ ở qui mô hình thái và chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). 2.3.2. Phƣơng pháp sử dụng các chỉ thị izozyme Isoenzyme hay isozyme là một nhóm enzyme xúc tác cùng một phản ứng, nhưng bị ức chế bởi những phân tử khác nhau do đó có nhiều dạng và hiệu quả xúc tác khác nhau. Isozyme có bản chất protein và là chất đa điện ly, nên trong dung dịch nó ở trạng thái phân cực. Dưới tác dụng của dòng điện một chiều, các phân tử protein khác nhau về kích thước, trọng lượng phân tử, lực tích điện..sẽ chuyển động với tốc độ khác nhau và sẽ phân bố ở vị trí khác nhau trên gel sau khi điện di. Các phân tử protein enzyme là do gen quy định. Trong quá trình tiến hoá, dưới tác động của môi trường bên ngoài và bên trong cơ thể, các gen biến đổi hình thành các allen khác nhau và nó mã hoá cho quá trình tổng hợp các phân tử protein khác nhau về trong lượng, kích thước, lực tích điện..Vì vậy, dùng phương pháp điện di có thể tách được các loại protein khác nhau. Trong nghiên cứu đa dạng di truyền sự khác nhau của các protein phản ánh sự khác nhau về đặc điểm di truyền giữa các cá thể. Chính vì vậy isozyme được dùng làm marker trong phân tích mức độ đa dạng về di truyền của loài. Phân tích isozyme nhìn chung là phương pháp khả thi, đồng tính trội và tương đối rẻ tiền. Khoảng 90 isozyme đã được sử sụng trên thực vật, với những vị trí (loci) isozyme đang được lập bản đồ trong nhiều lĩnh vực (Tanksley và ctv, 1991). Tuy 11 nhiên số lượng marker isozyme ít do đó không đủ để nghiên cứu toàn vẹn sự đa dạng di truyền, phân tích dựa trên kiểu hình nên dễ bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường. Ứng dụng của marker isozyme đã được sử dụng thành công để nhận diện giống ở một số loài cây ăn trái như bơ ( Goldring và ctv, 1985), táo (Weeden và Lamb, 1985), xoài (Chemda Degani và Ruth EI-Batsri, 1990 - 1992). Đối với dứa, marker isozyme cũng đã được sử dụng để phân nhóm 161 dòng dứa dựa vào 6 enzyme (Aradhya M.K. và ctv, 1994). 2.3.3. Phƣơng pháp dùng chỉ thị (marker) phân tử Chỉ thị phân tử là những đặc điểm thể hiện ở khía cạnh hoá học hay cấu trúc phân tử di truyền lại cho đời sau, giống như các nhân tố di truyền Meldel, nhưng lại có thể định lượng được. Về nguyên tắc, bất cứ đoạn DNA nào phân biệt được hai cá thể, hai dòng hoặc các giống khác nhau thì có thể xem như là một marker DNA. Marker DNA có nhiều ưu điểm hơn so với marker hình thái và isozyme vì sản phẩm thể hiện tính đa hình cao, tính đồng trội, tính ổn định không phụ thuộc vào yếu tố môi trường. Các chỉ thị di truyền phân tử được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, là cơ sở cho việc phân loại dưới loài (thứ), phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hoá giữa loài (Ahn et al., 1993; Dunforal et al., 1995). Chúng có thể được dùng để chọn các tổ hợp lai (Nair et al., 1995; Zhang et al., 1995). Các chỉ thị DNA có thể chia thành 2 nhóm sau (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004): - Chỉ thị dựa trên cơ sở chuỗi phản ứng polymerase (PCR - Polymerase Chain Reaction) (PCR-based): có các RAPD, AFLP, SSR, SSCP, STS - Chỉ thị trên cơ sở đánh dấu thăm dò và lai DNA (DNA / DNA hydridization- based): RFLP, minisatellite. 12 Bảng 2.1: Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) Chỉ thị (marker) Tên đầy đủ RAPD Random amplified polymorphic DNA AP-PCR Arbitrary primer-PCR DAF DNA amplification fingerprinting AFLP Amplified fragment length polymorphism ALP Amplicon length polymorphism SSR Simple sequence repeat (microsatellite) SSCP Single strand conformation polymorphism RFLP Restriction fragment length polymorphism STS Sequence-tagged sites Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là một chiến lược được thế giới ủng hộ từ năm 1995, là phương pháp tác động mạnh đến hiệu quả chọn giống với các marker có kết quả kỹ thuật cao trên cơ sở PCR để đánh giá kiểu gen của tính trạng mục tiêu. Sau khi đánh giá kiểu gen chúng ta so sánh với đánh giá kiểu hình để tìm ra mức độ chính xác của phương pháp (Bùi Chí Bửu, 2002). 2.3.3.1. Chỉ thị RFLP (RFLP marker) Phương pháp RFLP (Retriction fragment length polymorphism) - đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên bởi enzyme giới hạn, do Botstein và ctv phát minh năm 1980. Nguyên lý này dựa vào các đặc tính sau: - Tính chất đặc trưng của các enzyme giới hạn (Restriction enzyme - RE), có nghĩa là mỗi loại enzyme giới hạn chỉ cắt ở những trình tự nucleotide nhất định của DNA (loại enzyme 6 cắt và 4 cắt). Như vậy DNA của genome sẽ bị enzyme cắt ở những trình tự nucleotide đặc trưng và tạo thành những đoạn có kích thước khác nhau. - Tính chất bắt cặp tương đồng giữa các chuỗi DNA theo nguyên tắc bổ sung, có ý nghĩa là chuỗi DNA mẫu dò sẽ bắt cặp (lai) với chuỗi có trình tự nucleotide tương đồng với nó trên DNA genome. 13 Cụ thể nguyên lý của phương pháp này: DNA của genome sẽ được xử lý bởi cùng enzyme giới hạn tạo ra những đoạn có kích thước khác nhau biểu hiện nhờ điện di trên gel, qua biến tính các đoạn này trở thành những sợi đơn và được chuyển lên màng lai cellulose hoặc nylon. Quá trình lai diễn ra giữa DNA mục tiêu với các đoạn DNA thăm dò trên màng lai (probe) có gắn đồng vị phóng xạ. Kết quả của quá trình này được phát hiện nhờ những chất phát quang (fluorescens). Khi phân tích đa dạng di truyền, sự đa dạng của cá thể sẽ thể hiện qua sự khác nhau của các băng lai trên màng. Chỉ thị RFLP đã được ứng dụng nhiều trong chọn giống và đa dạng di truyền ở thực vật. Chẳng hạn, Takashige Ishii và cs (1995) đã phân tích sự đa dạng di truyền của 112 giống lúa ở Châu Á qua sử dụng 12 probe DNA có kích thước từ 0,8 - 3,4 kb liên kết với các vùng của các nhiễm sắc thể từ số 1 - 12. Tương tự, Qifa Zang và cộng sự (1992) đã xác định được sự đa dạng di truyền giữa các giống lúa indica (12 dòng) và japonica (14 dòng) qua sử dụng 49 probe RFLP. Ở Việt Nam, RFLP được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng quần thể nấm đạo ôn miền bắc và miền trung Việt Nam ( Lã Tuấn Nghĩa và ctv, 1997) và còn được dùng trong phân tích đa hình DNA các giống lúa kháng, nhiễm bệnh đạo ôn (Nguyễn Trịnh Toàn và cs, 1997). Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng phương pháp này đòi hỏi số lượng và chất lượng DNA phải cao, tốn nhiều công sức, thời gian và đắt tiền (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). 2.3.3.2. Nguyên tắc cơ bản và ứng dụng PCR Phản ứng chuỗi polymerase thường được viết tắt là PCR (polymerase chain reaction). Đây là một kỹ thuật ra đời từ đầu thập niên 1990 cho phép chúng ta ứng dụng chỉ thị phân tử theo hướng đơn giản và hiệu quả hơn. Phương pháp PCR tạo nên ALP ( amplicon length polymorphism) phản ánh DNA có tính đa hình giữa các cá thể, các dòng lai và các giống trên cơ sở điện di. Ưu điểm của ALP so với RFLP là kết quả nhanh, không đòi hỏi sử dụng đồng vị phóng xạ, giá thành thấp, số lượng DNA ít. Tuy nhiên, khuyết điểm của phương pháp này đòi hỏi phải tổng hợp primer và Taq polymerase. Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzyme DNA polymerase để khuếch đại một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotid (primer) tương hợp với hai đầu 3‟ ở 14 cả hai mạch của DNA mục tiêu (target sequence). Để primer được gắn vào DNA mục tiêu, trước tiên hai mạch của chuỗi xoắn kép phải được tách ra nhờ nhiệt độ cao, sau đó nhiệt độ giảm xuống để cho primer liên kết vào các mạch DNA mục tiêu theo nguyên tắc bổ sung, cuối cùng phản ứng polymer hoá được thực hiện nhờ DNA polymerase để kéo dài mạch bổ sung ra. Đó là một chu kỳ của PCR. Do các sản phẩm mới được tổng hợp lại được dùng làm khuôn cho primer khác, nên sau mỗi chu kỳ số bản sao của DNA lại được tăng gấp đôi so với chu kỳ trước đó. Chu kỳ gồm ba bước như trên được lập lại nhiều lần và tạo ra hàng triệu DNA trong vài giờ (Khuất Hữu Thành, 2003). Quy trình chuẩn của PCR được tiến hành như sau: - Bước 1:Giai đoạn biến tính (Denaturation) thường là 940C - 960C trong vòng 30 giây -1phút (tuỳ thuộc vào vật liệu) - Bước 2: Giai đoạn bắt cặp (Annealing) thường nhiệt độ dao động khoảng 40 - 72 0C thường là 550C và kéo dài từ 30 giây - 1 phút. - Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (Extension) lúc này nhiệt độ tăng lên đến 72 0C, đây là nhiệt độ tối ưu cho nhiều DNA polymerase chịu nhiệt (Chien và ctv, 1976) và kéo dài từ 1 phút đến nhiều phút tuỳ vào độ dài DNA cần khuếch đại. Chu kỳ gồm 3 bước này sẽ được lập lại nhiều lần khoảng 25 - 40 (tuỳ vào ứng dụng chuyên biệt). Cuối cùng được kết thúc bằng một “extension” ở 720C trong 5 phút, sau đó cho dừng hẳn bằng cách tồn trữ sản phẩm PCR ở nhiệt độ phòng hoặc ở 4 0C (tuỳ vào loại máy Thermal cycler được sử dụng) (Bùi Chí Bửu-Nguyễn Thị Lang, 2004). Số bản sao DNA được tạo ra nhờ kỹ thuật PCR được tính như sau: Tổng số khuếch đại = m x 2n Trong đó n là số chu kỳ, m là số copy của chuổi mã hoá cần nghiên cứu. Giả sử chúng ta đạt hiệu quả là 100 %, sau 30 chu kỳ chúng ta sẽ có tổng số sản phẩm khuếch đại là 1,07*109. Một số thành phần chủ yếu trong hỗn hợp phản ứng PCR: - DNA polymerase: được dùng phổ biến là Taq polymerase, lấy từ Themus aquticus, có tính ổn định nhiệt rất cao. Trong hầu hết các protocol, người ta khuyến cáo nồng độ Taq sử dụng là 0,5 U / 25 µl. Nếu nồng độ Taq quá cao (> 1,25 U / 25 µl, 15 những sản phẩm không chuyên tính có thể nhảy vào làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ số lượng men xúc tác tạo ra sản phẩm PCR mong muốn (Bùi Chí Bửu-Nguyễn Thị Lang, 2004). - Primer và dNTP Dung dịch dNTP làm stock phải được trung tính ở pH=7.0 và tồn trữ ở -200C. Stock được dùng nên có nồng độ dNTP là 1mM. Sự ổn định của dNTP trong suốt các chu kỳ lập lại ước còn khoảng 50 % sau 50 chu kỳ (Innis và ctv, 1990). Hàm lượng dNTP trong khoảng 20 – 200 µM cho kết quả ổn định, trung thực và chuyên tính. Bốn dNTP được xử lý sao cho nồng độ chúng tương đương nhau, để giảm thiểu tối đa hiện tượng sai biệt do kết hợp sai mã di truyền nào đó. Sự khuếch đại chuyên biệt đối với DNA cần nghiên cứu, đều phải tuỳ thuộc các primer tương xứng. Do vậy, chiều dài primer và thành phần G+C đều có ảnh hưởng quan trọng đối với nhiệt độ trong quá trình tác động ở đầu dây đơn. Nếu có 50 % G+C, thì chiều dài của primer phải có kích thước tương ứng là 18 - 20 nucleotide và có tính đặc hiệu hơn, còn đối với primer chứa một đoạn lớn hơn 4 nucleotide liên tục thì nó sẽ làm mất tính đặc hiệu. - DNA mục tiêu Người ta cần phải có những đoạn DNA mang mật mã biết trước, được gọi với thuật ngữ “ target DNA” (DNA mục tiêu) trong kỹ thuật PCR. Kết quả thu nhận sẽ tốt nhất, nếu DNA thật sự thuần khiết, DNA từ các mô lá. Số lượng DNA cần cho một phản ứng không nhiều lắm, chỉ cần 5 – 10 ng DNA thuần khiết, đối với RAPD thì lượng này là 5 – 25 ng DNA.  Chỉ thị RAPD (RAPD marker) Một trong những giới hạn của PCR chuẩn đối với ALP marker là mọi thông tin về chuỗi mã di truyền đầu tiên phải được biết rõ trước khi chuẩn bị các primer tương ứng. Vì thế, việc áp dụng nó để nghiên cứu DNA genome của một giống cây trồng mới sẽ gặp nhiều khó khăn. Vào đầu thập kỹ 90, một kỹ thuật phân tử mới dựa trên nguyên tắc PCR với tên gọi là RAPD (Random amplified polymorphic DNA) đã ra đời một cách độc lập tại hai phòng thí nghiệm khác nhau (William, 1990 và Welsh et al., 1991). Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính đa hình các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc dùng 16 một primer chứa một trật tự nucleotide ngẫu nhiên. Thường primer này chứa từ 9-12 oligonucleotit, tối thiểu là 4 bp. Có ngàn hàng loại primer chứa khoảng 10 bp nhưng số lượng primer dùng trong nghiên cứu này rất hạn chế. Trong phản ứng này, các primer đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai mạch đơn đối diện của DNA khuôn. Nếu các điểm gắn primer nằm trong khoảng có thể nhân bản được (thường 200 - 2000 nucleotide) thì đoạn DNA sẽ được nhân lên. Sự có mặt của sản phẩm này được quan sát thông qua điện di trên gel agarose hoặc polyacrylmide đã chứng tỏ có sự tương đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA genome với các primer oligonucleotide. Các primer dùng trong RAPD có kích thước ngắn nên dễ tìm được các đoạn tương đồng trên các mạch đơn DNA trong genome. Vì thế, nó là một phương pháp có hiệu quả để xác định tính đa hình về trật tự nucleotide giữa các cá thể. Ví dụ, tần số tìm thấy sự đa hình RAPD là 0.3 / 1 primer ở cây Arabidopsis thaliana, là 0.5 / 1primer ở cây đậu tương, 1 / 1 primer ở ngô (Lê Duy Thành, 2000). Các ưu điểm chính của chỉ thị RAPD không cần biết trước trình tự nuleotide của đoạn DNA cần khuếch đại, quy trình tiến hành nhanh, dễ làm, ít tốn kém, cho đa hình cao, tiến hành chỉ với một lượng nhỏ DNA tính bằng nanogam và trên một số lượng mẫu thí nghiệm lớn. Đồng thời RAPD không dùng chất phóng xạ để phát hiện đa hình. Do đó RAPD thường dùng trong phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể để phục vụ công tác lai tạo hoặc phân loại. Để nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD có thể tiến hành với các bước như sau: - Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR. - Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid. - Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYS-pc, UPGMA cluster.)., lập dendrogam. Các số liệu thu được cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu. Ngoài những ứng dụng trong nghiên cứu sự đa đạng sinh học và nguồn gốc di truyền của các loài động vật, thực vật và vi sinh vật, chỉ thị RAPD cũng được sử dụng cho những mục đích sau: 17 - Lập bản đồ liên kết, xác định những gen liên kết với một tính trạng nào đó như tính trạng chất lượng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virus ở cà chua (Tatieni et al., 1996; Winter et al., 1995). - Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể. - In dấu vân tay (DNA fingerprinting). - Phát hiện sự khác biệt trong các dòng soma (Somaclonal variation). Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng chỉ thị RAPD cũng có một số hạn chế như sau: - Có tính trội (dominant) do đó khó phân biệt được những gen lặn hay cá thể dị hợp tử - Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thường không thống nhất - Cần phải có các thiết bị điện toán để xử lý số liệu. - Độ tin cậy còn tuỳ thuộc vào kỹ thuật cá nhân. Hình 2.1: Nguyên lý phân tích chỉ thị RAPD trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền.  Marker AFLP AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) – đa dạng chiều dài các đoạn DNA được nhân bản chọn lọc, là phương pháp dựa trên nguyên tắc PCR. Ở đây sản phẩm PCR là kết quả của quá trình nhân bội các đoạn DNA sau khi đã được cắt bằng enzyme giới hạn (Zabow M. Và Vos P.,1993). Nguyên lý của kỹ thuật này như sau: trước khi làm phản ứng PCR người ta gắn các đoạn DNA ngắn (adaptor) vào hai 18 đầu của mảnh DNA đã được cắt bằng enzyme giới hạn sau đó thiết kế các primer theo các đoạn DNA ngắn có gắn thêm một hoặc một số nucleotide và tiến hành phản ứng PCR. Khi thay đổi số lượng và trật tự các oligonucleotid được chọn lọc ở các đầu nối ta có thể nhận được những đoạn DNA được nhân bản khác nhau. Sản phẩm được phân tích trên gel polyacrymide, kết quả thu được thường là 50 - 100 băng DNA trên mẫu thí nghiệm. Kỹ thuật AFLP là phương pháp xác định đa hình cao, tiết kiệm thời gian, dễ dàng lập lại và có thể sử dụng để phân tích DNA ở bất kỳ mức độ nào (Zabeau, 1993) do đó được đánh giá là nhanh chóng và có hiệu quả trong việc xác định tính đa dạng di truyền ở cây trồng như lúa, lạc..(Redona et al., 1998; He et al., 1997). Tuy nhiên, AFLP là loại chỉ thị di truyền trội, giá thành đắt nên phần nào hạn chế sử dụng.  Marker SSR ( Microsatellite marker) Marker microsatellite bao gồm một chuỗi mã gốc (core sequence) được lập lại nhiều lần, và phân tán rộng khắp trong genome, trên nhiều loci, mỗi locus chứa alen thích ứng với mỗi dạng khác nhau về số lần lập lại của nó (core repeat), và nó rất nhạy cảm (Ramakrishna và ctv, 1995). Được gọi với thuật ngữ chuỗi mã đơn giản lập lại nhiều lần (Simple sequence repeats= SSR) chiều dài thường 1 – 100 bp. Do đó SSR có thể khuếch đại trong ống nghiệm bằng phương pháp PCR với phát triển của primer theo miền của 2 bên trên một locus. Kết quả dựa vào độ dài và số lượng của các đoạn lập lại DNA khác nhau giữa các động vật, thực vật và vi sinh vật để xác định được mức độ đa dạng di truyền của các mẫu so sánh. Chỉ thị SSR là chỉ thị đồng trội (codominant) có khả năng phát hiện đa hình rất cao và có khả năng tự động hoá trong quá trình thực nghiệm. Tuy nhược điểm của chỉ thị này là quá trình thiết kế primer quá đắt, mỗi loại primer chỉ đặc trưng cho một loài. Nhưng marker SSR là công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoá về các vật liệu di truyền và dùng trong thiết lập bản đồ di truyền. Chẳng hạn, Parasnis (1998) phát hiện đoạn lập lại GATA kích thước 5 kb chỉ có ở cây đu đủ đực không có ở cây đu đủ cái bằng marker SSR. Ngoài ra, microsattelitte marker cũng được dùng để phân tích tính đa dạng nguồn gen cây có múi (Trần thị Oanh Yến và ctv, 2003). 19 2.4. Một số nghiên cứu ứng dụng marker phân tử trong phân tích đa dạng di truyền trên Thế Giới và Việt Nam 2.4.1. Nghiên cứu trên Thế Giới Hiện nay, nhu cầu sản lượng dứa trên thế giới dùng cho chế biến ngày càng tăng đòi hỏi các nhà chọn giống phải tạo ra những giống có chất lượng phù hợp với nhu cầu thị trường. Vì thế, nhiều nghiên cứu về sự đa dạng di truyền trên dứa đã được thực hiện và thành công với sự đóng góp của các loại chỉ thị phân tử nhằm cung cấp những thông tin về di truyền để chọn giống chính xác hơn. Những thành công được thể hiện qua những nghiên cứu sau: - Nghiên cứu sự đa dạng di truyền dứa bằng marker AFLP ( Cecilia Y. Kato và ctv, 1992). Sự đa dạng di truyền được tiến hành trên 70 giống dứa (Ananas comosus L) và 3 họ có liên quan (Ananas ananassoidies, Ananas bracteatus và Ananas erctifolius). Kết quả cho thấy việc lai khác loài giữa A. comonus và A. ananassoidies với mức tương quan của A. comonus (0.398) và A.ananassoidies (0.381). Qua đó cho thấy sự khác biệt di truyền trong số các giống dứa phần lớn có thể do đột biến. - Phân tích đa dạng di truyền phân tử dứa bằng marker RFLP (Duval và ctv, 2001) đã cho thấy được sự giống nhau giữa Ananas comosus và Pseudananas comosus là 58,7% qua sử dụng 18 probe tương đồng để lai. - Xác định đặc tính của phôi dứa (Ananas spp) bằng marker AFLP: 40 giống (dòng) dứa được thu thập và xác định mức độ đa hình giữa các giống, đặc tính của chúng. Sự phân nhóm di truyền đã chỉ rõ mối liên quan giữa các nhóm và sự khác biệt với các loài hoang dại. Sự khác biệt này do tự bản thân giống hoặc do yếu tố môi trường, tỉ lệ đột biến và sự khác biệt dòng soma. - Xác định độ tin cậy kiểu gen của cây dứa vi nhân giống liên quan đến marker isozyme và RAPD (Sergio Feuse và ctv, 2003). - Đánh giá sự liên quan di truyền của giống dứa Ananas và Pseudananas bằng marker RAPD (Claudete de Fátima Ruas1và ctv, 2001). - Ngoài ra, các nghiên cứu về sử dụng RAPD trong phân tích đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng khác như cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, dâu tây, khoai tây, cà chua cũng đã có nhiều báo cáo thành công. 20 2.4.2. Nghiên cứu ở Việt Nam Ở nước ta, hiện nay đã có một số viện nghiên cứu và các trường đại học đã tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền và lập bản đồ gen.., sử dụng kỹ thuật RAPD, AFLP, SSR… Tuy số lượng của các nghiên cứu này chưa nhiều nhưng đã cho thấy chúng ta có khả năng thực hiện những nghiên cứu sử dụng công nghệ tiên tiến nhằm đẩy mạnh công tác chọn tạo giống, vật nuôi, cây trồng. Dưới đây là một số nghiên cứu đã ứng dụng thành công trên nhiều loại cây trồng như: - Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các giống (dòng) dứa bằng chỉ thị RAPD (Hoàng Thị Bích Thuỷ và Ctv, 2004). Kết quả nghiên cứu này đã phân nhóm được 7 giống (dòng) qua sử dụng 9 loại primer đã xác định được các quần thể Trung Quốc 220 và Trung Quốc 250; Đắc Lắc và Thái Lan có cùng nguồn gốc và quần thể dứa Lâm Đồng và Đắc Lắc; Lâm Đồng và Thái Lan là các quần thể xa nhau về mặt nguồn gốc. - Khảo sát tính đa hình trên cây cà chua bằng chỉ thị RAPD (Thái kỳ Tài và ctv, 2004). - Phân biệt các giống và phân tích nhóm / loài thuộc chi Citrus ở Việt Nam bằng chỉ thị RAPD (Nguyễn Thanh Nhàn và ctv, 2003). - Phân tích sự đa dạng di truyền của giống đậu nành bằng marker phân tử (Phạm Thị Bé Tư, Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2003). Kết quả 50 giống đậu nành đã được phân thành 5 nhóm chính thông qua 17 primer và phân tích dựa trên UPGMA . - Sử dụng chỉ thị phân tử RAPD trong nghiên cứu đa dạng di truyền trên cây lúa (Bùi chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999; Nguyễn Đức thành và ctv, 1999). - Nghiên cứu sự đa hình di truyền của một số dòng, giống lúa phục vụ công tác chọn giống dựa trên chỉ thị phân tử (Đỗ Đức Tuyến, 2000). - Nghiên cứu tính đa dạng di truyền trên 17 giống dưa leo dựa vào kỹ thuật RAPD (Phan Lê Diệu Phương, 2003). 21 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài Đề tài được thực hiện từ ngày 1 tháng 3 năm 2005 đến ngày 1tháng 8 năm 2005 tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử thuộc Bộ Môn Di truyền và Chọn giống ở Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Ô Môn, TP. Cần Thơ. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Nguồn gốc mẫu Bảng 3.1: Danh sách các giống Cayenne đƣợc sử dụng trong đề tài STT Tên dòng Nguồn gốc Cơ quan cung cấp STT Tên dòng Nguồn gốc Cơ quan cung cấp 1 OMK5 Nhật Long Định 26 OMK47 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 2 OMK12 Úc Long Định 27 OMK52 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 3 OMK19 Khóm Tây Ninh VLĐBSCL 28 OMK49 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 4 OMK10 Úc Long Định 29 OMK50 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 5 OMK17 Codevoire (Pháp) Long Định 30 OMK51 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 6 OMK2 Đài Loan-BL Long Định 31 OMK61 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 7 OMK7 MontiqueI (Pháp) Long Định 32 OMK66 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 8 OMK15 Thơm Phụng Long Định 33 OMK67 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 9 OMK29 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 34 OMK64 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 10 OMK18 Khóm Hà Nội VLĐBSCL 35 OMK65 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 11 OMK20 Thơm Tây Ninh VLĐBSCL 36 OMK71 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 12 OMK4 Thơm Thái Lan Long Định 37 OMK72 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 13 OMK11 Đài Loan Long Định 38 OMK73 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 14 OMK1 Đài Loan Long Định 39 OMK74 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 15 OMK8 Thơm Lâm Đồng Long Định 40 OMK75 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 16 OMK9 Thái Lan-MC Long Định 41 OMK56 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 17 OMK3 Thơm Trung An Long Định 42 OMK76 Thơm Cần Thơ VLĐBSCL 18 OMK59 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 43 OMK77 Phụng Hiệp VLĐBSCL 19 OMK16 Thơm Kiên Giang Long Định 44 OMK40 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 20 OMK44 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 45 OMK13 Trung Quốc Long Định 21 OMK48 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 46 OMK62 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 22 OMK42 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 47 OMK63 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 23 OMK43 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 48 OMK68 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 24 OMK45 Thơm Bến Tre VLĐBSCL 49 OMK69 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 25 OMK6 Thom Bến Lức Long Định 50 OMK70 Thơm Hà Nội VLĐBSCL 22 Mẫu dùng để nghiên cứu trong đề tài này gồm 50 dòng dứa từ giống Cayenne trong đó có một số ít dòng dứa thuộc giống Queen để làm đối chứng. Những dòng dứa này được thu thập từ nhiều vùng khác nhau và trồng tại Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Ô Môn , TP Cần Thơ. Danh sách được trình bày ở bảng 3.1. Trong tập đoàn dứa khảo sát thì các dòng dứa có nguồn gốc từ Hà Nội được xử lý đồng loạt và đem ra trồng từ dạng nuôi cấy mô, các dòng dứa còn lại được trồng ở dạng hom có chiều dài khoảng 15 cm. 3.2.2. Dụng cụ và hóa chất - Máy thanh trùng (autoclave), máy Waterbath, lò vi sóng - Tủ lạnh 40C và - 200C - Tủ sấy 370C - Cân, máy đo pH 3.2.2.1. Dụng cụ và hóa chất ly trích DNA - Đĩa nghiền: phá vỡ màng tế bào, tube 1,5 ml, micropipet: 1 µl – 1000 µl - Máy li tâm (Biofuge pico - Heraeus) - Chloroform : iso amylalcohol (24:1) (Đức) - Isopropanol (Đức) - Ethanol 100 % và 70 % (Đức) - Dung dịch đệm ly trích DNA Bảng 3.2: Thành phần dung dịch đệm ly trích DNA Thành phần Nồng độ stock Nồng độ cuối Thể tích Tris (pH8.0) 1 M 100 mM 5 ml EDTA 0,5 M 20 mM 2 ml NaCl 5 M 500 mM 5 ml Nuớc cất 38 ml Tổng cộng 50 ml Tris (trisma bazơ): chất đệm, giữ ổn định pH tránh tổn hại DNA EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) (Mỹ): tạo phức Mg++, gây bất hoạt enzyme phân hủy DNA trong quá trình tách chiết 23 SDS: (sodium dodecy sulphate) 20 % (Đức): phá vỡ và tẩy sạch màng tế bào, màng nhân để phóng thích DNA - Dung dịch CTAB (Cetultrimethylammonium bromide): dùng để kết tủa polysaccharide và tạp chất khác. 10 g CTAB (Cetultrimethylammonium bromide) (Mỹ) 100 ml NaCl 0,5 M - Dung dịch đệm TE (Tris-EDTA) pH 8.0 (Mỹ) Bảng 3.3: Thành phần dung dịch đệm TE Thành phần Nồng độ stock Nồng độ Thể tích Tris (pH 8.0) 1 M 10 mM 0,5ml EDTA 0,5 M 0,5 mM O,1ml Nước cất 49,4ml Tổng cộng 50,0ml 3.2.2.2. Dụng cụ và hóa chất để thực hiện điện di trên gel agarose - Máy điện di loại nằm ngang (Gibco BRL model 4001 - Life technologies) - Máy chụp hình gel bằng tia UV - Agarose (Mỹ) - Dung dịch TAE 50X Bảng 3.4: Thành phần dung dịch TAE 50X Thành phần Thể tích 1 lít Tris base 2M 242 g Glacial acetic acid 57,1 ml EDTA 0,5 M, pH 8.0 100 ml - Ethidium bromide - DNA ladder làm thang chuẩn - DNA loading buffer 24 Bảng 3.5: Thành phần dung dịch loading buffer Thành phần Thể tích Tris 1 M (pH=8.0) 0,5 M Glycerol 5,0 ml EDTA 0,5 M (pH=8.0) 100 l Xylen Cyanol 0,2 % 15 mg Bromophenol blue 0,2 % 15 mg Nước cất 4,5 ml Tổng cộng 50 ml 3.2.2.3. Dụng cụ và hóa chất để thực hiện phản ứng chuỗi PCR - Máy thermal cycler (Biorad) - Mẫu DNA ly trích - Dung dịch stock của dNTPs (5 mM). - Dung dịch stock của PCR buffer (10X). Bảng 3.6: Thành phần dung dịch đệm PCR 10X Thành phần Nồng độ Nồng độ cuối Thể tích Tris (pH 8.3) 1 M 200 mM 1,0 ml KCl 1 M 500 mM 2,5 ml MgCl2 150 mM 15 mM 0,5 ml Gelatin 0,01 % 0,5 ml Nước cất 1,0 ml Tổng cộng 5,0 ml - Primer: 13 primer được sử dụng để khảo sát tính đa dạng di truyền của dứa có kích thước 10 nucleotide từ các bộ kit của hãng Operon tổng hợp từ Nhật, pha dung dịch kit tại Viện Lúa ĐBSCL. - Taq polymerase tổng hợp : sản xuất tại Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long . 25 3.3. Phƣơng Pháp 3.3.1. Đánh giá kiểu hình Tập đoàn 50 dòng dứa Cayenne được trồng trong đều kiện tự nhiên, không xử lý ra hoa và tiến hành đo các đặc tính nông học trong cùng thời gian ở giai đoạn các cây trưởng thành và bắt đầu cho hoa. Thí nghiệm được bố trí ngẩu nhiên hai lần lập lại, cách đo được tiến hành như sau: - Chiều cao cây (cm) đo từ mặt đất đến đỉnh của lá. - Chiều rộng cây (cm) đo khoảng cách lá vươn rộng ra hai bên. - Chiều dài lá (cm) đo ngẫu nhiên 3 lá trên / 1 cây, chiều rộng lá đo phần rộng của lá. - Số lá: thiết lập đo và điếm từng lá trên một cây. - Ngày trổ hoa: tính từ ngày trồng cho đến khi cây có hoa và nhú trái. - Trọng lượng trái (kg) đo lúc trái được thu hoạch. - Quan sát hình dạng lá có gai, không gai hay lá viền (chỉ có gai một phần hoặc ở một số vị trí trên lá như ngọn, gốc hoặc giữa lá) và màu sắc lá ghi nhận ở những mức độ màu khác nhau. Phân tích số liệu thu thập thông qua phần mềm IRRISTAT vesion 3.0 và sau đó phân tích nhóm dựa vào chương trình NTSYS (Numercial Taxonomy System) version 2.1. Để phân tích nhóm dựa vào số liệu (numercial classficatory analysis), ta sử dụng hệ số CORR (Pearson product-moment correlation coefficient) như là đơn vị để tính sự tương quan giữa các dòng dứa dựa vào tính trạng hình thái và giá trị CORR được tính toán theo Sneath và Sokal (1973). Dựa trên ma trận tương quan (Correlation matrix), sơ đồ hình cây thể hiện mối tương quan được xây dựng theo phương pháp UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic average), một trong những mô hình phân tích nhóm SAHN (sequential, agglom-erative, hierarchic, non- overlapping) (Sneath và Sokal, 1973). 3.3.2. Đánh giá kiểu gen 3.3.2.1. Tách chiết DNA DNA của dứa được tách chiết theo quy trình CTAB (Cetultrimethylammonium bromide) cải tiến (Nguyễn Thị Lang, 2002). Phương pháp này đặc biệt ổn định cho ly trích DNA từ mô thực vật giàu polysaccharide (Sun và ctv, 1994), cho DNA chất 26 lượng cao, tốn nhiều thời gian nhưng rẻ tiền hơn so với nhiều phương pháp khác (Henry T Nguyen, 1998). Quy trình gồm những bước sau: - Bước 1: Chọn và thu mẫu lá dứa (50 mẫu), chọn lá khỏe, non (2 cm) đặt vào ống tube và ghi nhãn cẩn thận. Ống tube chứa mẫu được giữ trong thùng đá lạnh. - Bước 2: Lá sẽ được rửa sạch, cắt nhỏ và đặt vào đĩa (spot test plate). - Bước 3:Thêm vào đĩa 660 µl dung dịch đệm ly trích DNA (DNA extraction buffer) (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM EDTA, 500 mM NaCl ). Nghiền các mô lá với chài (dụng cụ này phải được khử trùng bằng cồn và lau sạch trước khi sử dụng). - Bước 4: Tiếp tục nghiền đến khi dung dịch có màu xanh đó là dấu hiệu tế bào bị phá vỡ và phóng thích diệp lục. Dung dịch nghiền xong phải đặt vào đá khoảng 30 phút. - Bước 5: Thêm vào 660 l dung dịch tách chiết, trộn đều và chuyển 660 l dịch nghiền vào một tube sạch với thể tích là 1,5 – 2 ml đã được ghi nhãn cẩn thận. - Bước 6: Thêm 40 l SDS 20 % trộn đều và khéo léo, sau đó ủ trong water bath và lắc đều 10 phút ở nhiệt độ 650C. - Bước 7: Thêm vào dung dịch 100 l NaCl 5M và trộn thật kỹ. Thêm tiếp 100 l CTAB. Ủ dung dịch 10 phút ở nhiệt dộ 650C. - Bước 8: Thêm 900 l Chlorofom: iso amylalcohol (24:1) trộn đều và đem ly tâm trong 3 phút với tốc độ 13.000 vòng / phút. - Bước 9: Chuyển dịch nổi vào một tube mới 1,5 – 2 ml và thêm vào 600 l isopropanol trộn đều, tiếp tục ly tâm trong 5 phút với tốc độ 12000 vòng / phút. Sau khi ly tâm, đổ bỏ phần dung dịch phía trên. - Bước 10: Rửa phần kết tủa còn lại với cồn 70 % và phơi khô. - Bước11: Hòa tan DNA với 50 l TE . Giữ ở nhiệt độ -200C. 3.3.2.2. Kiểm tra chất lƣợng DNA Kiểm tra chất lượng DNA đã ly trích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 0.8 % trong dung dịch TAE 1X. Nhuộm gel với Ethidium bromide và chụp hình qua hệ thống gel document.  Chuẩn bị gel agarose để điện di DNA - Chuẩn bị dung dịch TAE 1X, cho dung dịch TAE 1X vào hộp điện di. 27 - Pha dung dịch agarose 0,8 %, gồm agarose và dung dịch TAE 1X - Đun sôi dung dịch agarose trên lò viba đến khi agarose tan hoàn toàn. Nếu quá trình đun mất nhiều nước thì cần bổ dung thêm dung dịch TAE 1X cho đủ nồng độ yêu cầu. - Để lên máy lắc cho dung dịch tan đều. Đợi đến khi nhiệt độ dung dịch agarose xuống còn 550C thì đổ vào khai điện di có cài sẳn lược. Chiều dày gel khoảng 5 mm là thích hợp (Nguyễn Thị Lang, 1999). - Sau khi gel cứng, di chuyển lược ra khỏi gel và đặt khai vào bể điện di chứa TAE 1X sau cho gel ngập trong dung dịch. Chú ý nhẹ tay tránh bọt khí.  Tiến hành chạy điện di - Lấy một mẫu giấy parafilm, nhỏ những giọt loading buffer lên (mỗi giọt có thể tích khoảng 2 l). Cho thêm 10 l DNA lên mỗi giọt loading buffer và trộn đều. Dùng pipetman hút hỗn hợp DNA cho vào giếng của khai điện di. - Đậy nắp gel và cho chạy điện di, dòng điện cung cấp: 100 vol, 100 mA, định thời gian cho gel chạy (tùy vào sự duy chuyển của băng). - Tắt điện, đem gel nhuộm Ethidium bromide và mang gel đi chụp ảnh với tia UV. Chú ý thao tác này phải thật cẩn thận bởi hoá chất nhuộm rất độc, dễ gây ung thư. 3.3.2.3. Tiến hành PCR cho phản ứng RAPD  Trộn dung dịch PCR Cho các thành phần dung dịch sau vào các tube PCR đã được đánh mã số: - DNA 1,0 l (tuỳ thuộc vào nồng độ DNA). - Dung dịch đệm PCR 10X 2,0 l. - dNTP 2,0 l. - Primer cần sử dụng trong mỗi phản ứng 1,0 l. - Taq polymerase 0,5 l. - Thêm nước cất 2 lần cho đủ 20,0 l. Trộn đều, thêm giọt dầu (mineral oil) để tránh bay hơi, đậy nắp tube lại và cho vào máy PCR đã cài sẳn chu trình nhiệt. 28 Bảng 3.7: Thành phần hỗn hợp dung dịch chạy PCR Thành phần Nồng độ Nồng độ sau cùng Thể tích ( l) PCR buffer 10X 1X 2 dNTP 1 mM 100 M 2 Primer 5 M 0,25 M 1 Taq polymerase 5 unit / l 0,1 unit / l 0,5 DNA 25 ng / l 1,25 ng / l 1 H2O 13.5 Tổng cộng 20,0  Chạy chương trình PCR Sau khi lấy đủ các thành phần vào tube PCR, ta tiến hành chạy phản ứng với các bước tiến hành (Nguyễn Thị Lang, 2002) như sau: - Bước 1: Làm biến tính DNA ban đầu ở 940C trong 5 phút. - Bước 2: Biến tính DNA tiếp theo ở 940C trong 30 giây - Bước 3: Tiến hành lai primer và DNA ở 370C trong 30 giây - Bước 4: Tổng hợp ở 720C trong 1 phút. - Bước 5: Lặp lại bước 2 - 4 trong 36 lần. - Bước 6: Tổng hợp lần cuối ở 720C trong 5 phút. - Bước 7: Giữ lạnh ở 40C. Bảng 3.8: Chƣơng trình chạy PCR cho RAPD marker Chƣơng trình Kiểu Giai đoạn1 Giai đoạn 2 Giai đoạn 3 Số chu kì Nhiệt độ Thời gian Nhiệt độ Thời gian Nhiệt độ Thời gian 1 Chu kỳ 940C 5 phút 1 2 94 0 C 30 giây 370C 30 giây 720C 1 phút 35-36 3 72 0 C 5 phút 1 4 4 0 C 29  Kiểm tra và phân tích sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1.5 % Hút 10 l sản phẩm PCR và tiến hành chạy điện di trên gel agarose 1.5 % để kiểm tra sản phẩm. Trong khi cho sản phẩm PCR vào, ta nên để lại một giếng trên bản gel để nạp DNA ladder vào với số lượng là 3 l. Phương pháp tiến hành giống như kiểm tra sản phẩm DNA . Sản phẩm PCR sau khi điện di sẽ được chụp trên hệ thống gel document, những băng DNA có khuếch đại sẽ hiện lên trên bản gel nhờ nhuộm với ethiumbromide. Ta sẽ ghi nhận lại những băng DNA và đem xử lý trên chương trình NTSYSpc. 3.3.2.4. Phân tích dữ liệu PCR bằng phần mềm NTSYSpc (Rolfh) Phân tích đa dạng nguồn gen theo phần mềm NTSYSpc là chương trình phần mềm do Rohlf (1992) thiết kế dùng để tìm kiếm và thành lập kiến trúc những dữ liệu có nhiều biến. NTSYS (Numercial Taxonomy System) là hệ thống phân loại số trong nghiên cứu đa dạng quần thể ở mức độ DNA, dựa vào kết quả từ phương pháp in dấu vân tay DNA (DNA fingerpringting). Các băng được nhập vào chương trình theo quy tắc: nếu không có băng DNA sẽ ghi 0, nếu có băng ghi 1. Số liệu này sẽ được sử dụng để xây ma trận tương đồng (Similarity matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix). Các ma trận này biểu hiện cho mối quan hệ xa gần về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích và được xây dựng trên công thức toán học của Nei và Li (1979): Sxy=2 xy / x + y - Xy: số băng giữa hai mẫu. - X: số băng của mẫu x. - Y: Số băng của mẫu y. - Sxy: Hệ số tương đồng giữa 2 mẫu x và y. Từ Sxy ta tính được khoảng cách di truyền giữa x và y Dxy= 1 - Sxy Trên cơ sở toán học này, các nhà toán học đã xây dựng các phần mềm WINDIST và NTSYS cho máy tính. Chương trình WINDIST tạo ra ma trận tương đồng từ bộ dữ liệu nhập sẵn. Chương trình NTSYS version 2.1 tạo ra sơ đồ hình cây phản ánh mối quan hệ di truyền giữa các cá thể nghiên cứu (Kangle Zheng và ctv, 30 1995). Hiện nay 2 chương trình WINDIST và NTSYS được gộp lại thành chương trình package-NTSYS để tiện dụng hơn.  Cách nhập số liệu Dữ liệu thu được từ sản phẩm PCR sẽ nhập vào excell theo những qui định chung. Nếu như sản phẩm có băng hiện diện thì ta sẽ nhập là 1 và 0 nếu không hiện diện băng. Sau khi nhập số liệu, ở hàng đầu tiên chúng ta ký hiệu là 1 (đối với ma trận hình chữ nhật), cột thứ hai ghi số hàng, cột thứ ba ghi số cột, và cột thứ tư ghi số 0 nếu không có số liệu thiếu. Sau đó, bản số liệu trong excell sẽ được dùng để xây dựng ma trận tương đồng trong phần mềm NTSYS-pc version 2.1. 3.3.3. Ƣớc đoán độ chính xác giữa phân nhóm di truyền dựa vào dữ liệu kiểu hình và kiểu gen Độ chính xác trong phân nhóm dựa trên kiểu hình và kiểu gen được đánh giá thông qua kiểm tra ManTel (Mantel, 1967) với phương pháp Mxcomp (Matrix comparison) từ chương trình xử lý NTSYSpc version 2.1. PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Đánh giá đa dạng nguồn gen dựa vào dữ liệu kiểu hình Qua quan sát và ghi nhận những đặc tính nông học bao gồm chiều cao cây, chiều rộng tán, chiều rộng lá, chiều dài lá, số lá trên bụi, hình dạng lá, màu sắc lá, thời gian trổ hoa và năng suất trái của tập đoàn dứa Cayenne với 50 dòng khác nhau về đều kiện địa lý đã cho thấy sự đa dạng về kiểu hình giữa các dòng dứa trong cùng một giống với nhau. Những số liệu thu nhận được từ những chỉ tiêu hình thái đều khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa 1 % (phụ lục I). Độ đa hình giữa các nhóm trong giống được đánh giá theo phân tích nhiều biến (Multivariate analysis) và phân tích phân biệt (Discriminant analysis). Kết quả phân tích này được trình bày trong bảng 4.1, trong đó chỉ tiêu ngày trổ hoa và năng suất chỉ tính trên những dòng cho trái và thu hoạch trái vào thời điểm khảo sát. 31 Bảng 4.1: Đặc tính nông học của 50 dòng dứa từ Cayenne Tên dòng Cao cây (cm) Rộng tán (cm) Dài lá (cm) Rộng lá (cm) Số lá / bụi Tg trổ hoa (tháng) Năng suất (kg) OMK5 101ab 104 ab 71 a 4,6 ab 62 abc 16 1,2 OMK12 109 a-g 102,5 a 81,5 g-j 4,8 a-e 61,5 ab 17 3.2 OMK19 102 abc 102,5 a 80,5 e-j 4,75 a-d 62,5 a-d 15 1.1 OMK10 105.5 a-e 104 ab 82,5 hij 5,7 b-h 61 a Chưa trổ 0 OMK17 103.5 a-d 107,5 abc 82 gj 5 a-f 65 a-f Chưa trổ 0 OMK2 116.5 fgh 102,5 a 72,5 a-d 5,45 a-g 61,5 ab Chưa trổ 0 OMK7 118 h 105 ab 74 a-f 5,6 a-g 64 a-e Chưa trổ 0 OMK15 101 ab 108,5 a-d 71,5 ab 5,2 a-g 63 a-d Chưa trổ 0 OMK29 102 abc 104 ab 72 abc 5,1 a-f 64 a-e Chưa trổ 0 OMK18 100.5 a 107,5 abc 72,5 a-d 4,75 a-d 73,5 ij 16 2,4 OMK20 106 a-e 103 a 76 a-i 5,5 a-g 63 a-d 15 2.1 OMK4 105 a-e 105,5 ab 72 abc 5,45 a-g 61 a Chưa trổ 0 OMK11 108 a-f 103 a 82,5 hij 5,65 a-h 61 a 16 1.9 OMK1 101.5 ab 112 a-e 73,5 a-e 4,7 abc 66,5 a-h 16 1.1 OMK8 102.5 abc 102,5 a 72,5 a-d 5,25 a-g 62,5 a-d 16 2.5 OMK9 109 a-g 109 a-d 77,5 a-j 5,75 c-h 66 a-g 16 3 OMK3 103 a-d 119 d-h 73 a-d 5,55 a-g 68,5 c-i 16 1,3 OMK59 110 b-h 110 a-d 81 f-j 5,35 a-g 67,5 a-i 15 2.2 OMK16 103 a-d 112 a-e 72,5 a-d 4,6 ab 61,5 ab 17 1.3 OMK44 112 d-h 113,5 a-g 76 a-i 5,5 a-g 63 a-d 15 2.3 OMK48 114 e-h 102,5 a 71,5 ab 5,3 a-g 65,5 a-g 15 2 OMK42 111c-h 122,5 e-h 81 f-j 5,4 a-g 66,5 a-h 15 2.9 OMK43 103 a-d 109 a-d 77 a-j 5,6 a-g 62,5 a-d 16 1.6 OMK45 105 a-e 108 a-d 71,5 ab 4,95 a-f 76,5 j 17 2.6 OMK6 103 a-d 108,5 a-d 74 a-f 5,5 a-g 64 a-e Chưa trổ 0 OMK47 102.5 abc 105,5 ab 71,5 ab 4,55 a 63,5 a-d Chưa trổ 0 OMK52 104.5 a-d 105 ab 84 j 5,45 a-g 67,5 a-i Chưa trổ 0 OMK49 103.5 a-d 122,5 e-h 83,5 j 6,25 gh 62,5 a-d Chưa trổ 0 OMK50 107.5 a-e 107 ab 76 a-i 5,2 a-g 66,5 a-h Chưa trổ 0 OMK51 111 c-h 107,5 abc 70,5 a 5,55 a-g 65 a-f Chưa trổ 0 OMK61 101.5 ab 103 a 79,5 d-j 5,7 b-h 68 b-i Chưa trổ 0 OMK66 100.5 a 124 gh 74 a-f 5,1 a-f 71 f-j Chưa trổ 0 OMK67 107 a-e 122,5 e-h 77,5 a-j 6 fgh 71,5 f-j 17 2.85 OMK64 102 abc 123 fgh 71,5 ab 6 fgh 64 a-e Chưa trổ 0 OMK65 106 a-e 112,5 a-f 75 a-g 5,25 a-g 71 f-j 17 2.8 OMK71 112 d-h 122 e-h 73 a-d 5,1 a-f 71,5 f-j Chưa trổ 0 OMK72 102.5 abc 118,5 c-h 75,5 a-h 5 a-f 66,5 a-h Chưa trổ 0 OMK73 103.5 a-d 125 h 73 a-d 5,9 e-h 71,5 f-j Chưa trổ 0 OMK74 101 ab 125 h 83 ij 5,75 c-h 65,5 a-g Chưa trổ 0 OMK75 105.5 a-e 115 b-h 77,5 a-j 5,65 a-h 65,5 a-g Chưa trổ 2.3 OMK56 106 a-e 122 e-h 79 c-j 5,85 d-h 64 a-e 16 3.2 OMK76 102 abc 125 h 81 f-j 6,7 h 61,5 ab 16 2.9 OMK77 111 c-h 122 e-h 71 a 5,85 d-h 61,5 ab 16 1 OMK40 110 b-h 110,5 a-d 72 abc 5 a-f 69 d-i 15 2.4 OMK13 103 a-d 112,5 a-f 71,5 ab 5,3 a-g 62,5 a-d Chưa trổ 0 OMK62 106.5 a-e 123,5 gh 75,5 a-h 5,8 c-h 65,5 a-g Chưa trổ 0 OMK63 112 d-h 102,5 a 82,5 hij 6 fgh 64 a-e 17 3.5 OMK68 117.5 gh 121,5 e-h 78,5 b-j 5,6 a-g 70,5 e-j 17 2.75 OMK69 102.5 abc 124,5 gh 75 a-g 5 a-f 73 hij Chưa trổ 0 OMK70 102 abc 103 a 72,5 a-d 4,75 a-d 72 g-j Chưa trổ 0 Mean 105,7 111,86 75,9 5,38 65,76 2,2 Cv(%) 3,6 4,2 4 8,5 4,3 32 Giá trị trung bình theo sau những chữ số trong một cột có cùng mẫu tự khác biệt nhau không có ý nghĩa ở mức 5 % Từ kết quả bảng 4.1, sự đa dạng của 50 dòng dứa Cayenne về mặt kiểu hình được thể hiện như sau: - Chiều cao cây giữa các dòng trong giống có sự khác biệt với nhau về thống kê ở mức ý nghĩa 5 % và hệ số biến động 3,6 %. Chiều cao trung bình của giống biến động từ 100 – 118 cm và trung bình là 107,5 cm. Trong đó cao nhất là dòng OMK7 có nguồn gốc từ pháp (118 cm) và thấp nhất là những dòng dứa OMK18, OMK66 có nguồn gốc từ Bến Tre và Hà Nội (100 cm). Dựa vào biểu đồ 4.1 cho thấy những dòng dứa trồng từ nuôi cấy mô và dạng hom thì khác biệt không lớn bởi dù trồng ở những hình thức khác nhau nhưng chúng đều cùng một giống. 118 101 106.35 105.15 100.5 117.5 90 95 100 105 110 115 120 Min Max Trung bình Ca o câ y Dạng hom Nuôi cấy mô Biểu đồ 4.1: Chiều cao cây của những dòng dứa trồng từ nuôi cấy mô và dạng hom - Chiều rộng của tán cây cũng dao động từ 102,5 cm – 125 cm và trung bình 111,86 cm. Dòng có chiều rộng lớn nhất có nguồn gốc từ Hà Nội và sự khác biệt về chiều rộng tán của dòng này cũng có ý nghĩa so với các dòng dứa khác. - Chiều dài lá trung bình dao động từ 73,5 cm – 84 cm và chiều rộng lá trung bình khoảng 4,55 cm – 6,7 cm với hệ số biến động lần lượt là 4 % và 8,5 %. Một số dòng có cùng nguồn gốc nhưng lại khác biệt có ý nghĩa đối với hai tính trạng này như OMK12 và OMK10; OMK11 và OMK1. 33 - Số lá trên bụi giữa các dòng trong giống Cayenne cũng có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê với số lá trung bình giữa các dòng dao động trong khoảng 61 – 76,5 lá và hệ số biến động 4,3 %. Kết quả từ biểu đồ 4.3 cũng cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa về số lá giữa dòng trồng từ nuôi cấy mô và những dòng trồng từ dạng hom. Đều này cho thấy sự đa dạng trong giống Cayenne với tính trạng này. 61 76.5 61.22 73.5 6964 0 20 40 60 80 100 Min Max Trung bình Số lá / b ụi Dạng hom Nuôi cấy mô Biểu đồ 4.2: Số lá / bụi của các dòng dứa trồng từ nuôi cấy mô và dạng hom - Trong 50 dòng dứa khảo sát thì có 25 dòng cho thu hoạch trái chiếm 50%, thời gian trổ vào khoảng tháng 2 – tháng 4 và bắt đầu thu hoạch từ tháng 6 – tháng 7. Những dòng OMK63, OMK65, OMK67, OMK68 có nguồn gốc từ Hà Nội cho hoa muộn hơn so với các dòng khác (tháng 4). Thời gian ra hoa không đồng đều giữa các giống do không có xử lý ra hoa đồng loạt để ra hoa tự nhiên nhằm xét mức độ thích nghi đối với từng dòng trong giống. - Năng suất trái giữa các dòng trong giống cũng khác nhau, dòng OMK63 có khối lượng trái trung bình lớn nhất (3,5 kg) và nhỏ nhất 1 kg ở dòng OMK77, đối với các dòng nuôi cấy mô thì khối lượng trái trung bình lớn hơn so với các dòng trồng từ dạng hom (biểu đồ 4.3) nhưng độ ngọt của trái thì thấp hơn. Hình dạng trái và kích thước trái của giống Cayenne cũng có sự đa dạng giữa các dòng (hình 4.3). 34 3.2 2.84 1 2.09 2.85 2.3 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 Min Max Trung bình Nă ng su ất trá i Dạng hom Nuôi cấy mô Biểu đồ 4.3: Năng suất trái của những dòng dứa trồng từ nuôi cấy mô và dạng hom. Hình 4.1: A: hình cây Thơm Trung An, B: hình cây Thơm Hà Nội Hình 4.2: Hình dạng và màu sắc lá với A: xanh đậm không gai, B: xanh đốm nâu không có gai, C: xanh đốm đỏ tía có gai, D: xanh có gai E: xanh đốm nâu gai viền. 35 Hình 4.3: A: Thơm Cần Thơ, B: Thơm Hà Nội Hình dạng và màu sắc lá của giống Cayenne cũng phân ly thành nhiều dạng khác nhau: - Màu sắc lá của giống đa dạng với 3 màu: xanh, xanh có đốm nâu và xanh có đốm đỏ tía (hình 4.1 và 4.2) đều này cho thấy có sự phân ly đối với tính trạng này giữa các dòng trong giống. Sự khác biệt này còn thể hiện ở những dòng dứa có cùng nguồn gốc như dòng OMK44 có màu xanh, OMK48 có màu xanh đốm nâu (Phụ lục II). - Hình dạng lá của giống Cayenne thường không có gai hoặc rất ít ở ngọn nhưng qua khảo sát cho thấy có sự khác biệt giữa các dòng trong giống (biểu đồ 4.4) với số dòng có hình dạng lá không có gai chiếm 60 %, có gai chiếm 20 % và lá viền (có gai nhưng chỉ ở một khoảng của lá như giữa, ngọn hoặc gốc lá) chiếm 20 %. Kết quả này đã chứng tỏ trong cùng một giống nhưng có sự phân ly về tính trạng được thể hiện qua kiểu hình. Đều này cho thấy có sự đa dạng nguồn gen giữa các dòng dứa từ Cayenne và sẽ là yếu tố góp phần phân loại làm cơ sở cho lai tạo giống. Đồng thời, tính trạng này khá ổn định, do vậy cần xét sự khác biệt về kiểu gen giữa các dòng dứa để tìm mối quan hệ liên kết giữa gen và tính trạng. A 36 Hình dạng lá 60%20% 20% không có gai Có gai Viền Biểu đồ 4.4: Sự đa dạng về hình dạng lá của 50 dòng Cayenne Dựa trên sự khác biệt có ý nghĩa về đặc tính nông học chiều cao cây, số lá trên bụi, chiều rộng tán, dài lá và rộng lá của 50 dòng dứa Cayenne, phân nhóm di truyền bằng phương pháp SAHN ( Sneath và Sokal, 1973) được thiết lập nhằm sắp xếp các dòng dứa thành những nhóm có mức độ tương quan gần nhau về mặt di truyền trên cơ sở biểu hiện kiểu hình. 37 PHAN NHOM KIEU HINH DUA CORR Coefficient -0.23 0.01 0.26 0.50 0.75 1.00 OMK12 OMK5 OMK47 OMK71 OMK40 OMK68 OMK16 OMK42 OMK29 OMK18 OMK70 OMK45 OMK65 OMK1 OMK66 OMK69 OMK72 OMK15 OMK64 OMK13 OMK62 OMK3 OMK73 OMK67 OMK43 OMK49 OMK75 OMK76 OMK56 OMK74 OMK6 OMK12 OMK59 OMK19 OMK17 OMK52 OMK50 OMK10 OMK11 OMK20 OMK63 OMK9 OMK8 OMK61 OMK2 OMK7 OMK48 OMK51 OMK44 OMK4 OMK77 Hình 4.4: Sơ đồ hình cây thể hiện mối tƣơng quan giữa 50 dòng dứa Cayenne trên cơ sở kiểu hình. Bảng 4.2: Kết quả phân nhóm 50 dòng dứa cayenne dựa trên đặc tính kiểu hình Nhóm Tên dòng Số dòng I OMK5, OMK47, OMK71, OMK40, OMK68, OMK16, OMK42, OMK29, OMK18, OMK70, OMK45, OMK65, OMK1, OMK66, OMK69, OMK72. 16 II OMK15, OMK64, OMK13, OMK62, OMK3, OMK73, OMK67, OMK43, OMK49, OMK75, OMK76, OMK56, OMK74, OMK6 8 III OMK12, OMK59, OMK19, OMK17, OMK52, OMK50, OMK10, OMK11, OMK20, OMK63, OMK9, OMK8, OMK61 13 IV OMK2, OMK7, OMK48, OMK51, OMK44, OMK4, OMK77 7 38 Kết quả ở hình 4.4 và bảng 4.2 cho thấy 50 dòng dứa Cayenne được phân thành 4 nhóm chính ở mức tương quan 26 % về kiểu hình như sau: - Nhóm I và nhóm II có ít có sự tương quan, nhóm III và nhóm IV tương quan chỉ 2%. - Những dòng trong cùng một nhóm thì có sự tương quan chặt với nhau cho thấy chúng có thể xuất phát từ những quần thể có quan hệ với nhau về mặt di truyền như dòng dứa OMK1, OMK66, OMK69, OMK72 trong nhóm I hay các dòng OMK43, OMK49, OMK75, OMK76, OMK74 trong nhóm II. Qua kết quả nghiên cứu trên từng tính trạng và phân nhóm dựa vào đặc tính hình thái của 50 dòng dứa Cayennne cho thấy giữa các nhóm dòng có sự khác biệt về kiểu hình và chứng tỏ có sự đa dạng nguồn gen trong cùng một giống. Tuy nhiên, sự phân nhóm dựa vào kiểu hình ảnh hưởng nhiều bởi yếu tố môi trường. Sự khác biệt và đa dạng của những tính trạng sinh trưởng như chiều cao cây, chiều dài lá, số lá trên bụi giữa các dòng dứa có thể không quy định bởi kiểu gen mà tùy theo đều kiện môi trường, đất đai, bóng rợp để cây phát triển. Do đó sự đa dạng nguồn gen của giống Cayenne cần phải được tiến hành dựa vào kiểu gen để xác định mức độ chính xác của việc phân nhóm. 4.2. Đánh giá đa dạng nguồn gen bằng kiểu gen 4.2.1. Kết quả kiểm tra chất lƣợng DNA Để thực hiện phản ứng PCR-RAPD nồng độ DNA được pha loãng từ 20 – 50 ng / µl cho phù hợp với lượng DNA cần thiết để thực hiện phản ứng PCR. Theo Antoni Raflski và một số tác giả khác thì nồng độ DNA thích hợp để chạy phản ứng PCR-RAPD từ 5 – 50 ng / 1 phản ứng (Antoni Rafalski và ctv, 1994). Các mẫu DNA của 50 dòng dứa sẽ được kiểm tra chất lượng trên môi trường agarose gel 0,8 % trong TAE 1X. Nếu DNA hiện diện trên gel không rõ và bị đứt đoạn thì cần phải tiến hành ly trích lại. DNA tốt khi xuất hiện những vạch sáng và mỏng. Kết quả kiểm tra được thể hiện trong hình 4.5. 39 Hình 4.5: Chất lƣợng DNA của các dòng dứa Cayenne trên gel agarose 0.8 %. 4.2.2. Sản phẩm phản ứng PCR với marker RAPD Để phát hiện sự đa hình, 13 primer đã được sử dụng trong phản ứng PCR trên DNA genome thu được từ các mẫu lá của 50 dòng dứa Cayenne. Sản phẩm khuếch đại tạo ra từ những primer này được quan sát trên gel agarose 1.5%. Kết quả quan sát cho thấy chỉ có 9 primer cho sản phẩm khuếch đại, với 38 allen đa hình được tạo ra trung bình 4,28 allen / 1 primer, sản phẩm khuếch đại có kích thước từ 0,3 – 3 kb (bảng 4.3). Dựa vào sự khác biệt giữa các allen thể hiện qua các băng trên gel ta có thể xác định được sự khác nhau giữa các dòng dứa về mặt di truyền. Bảng 4.3: Danh sách các primer sử dụng trong phân tích đa dạng di truyền của dứa Cayenne STT Ký hiệu Trình tự 5 ’ ..................................... 3 ’ Số băng phát hiện Kích thƣớc (kb) Ghi chú 1 OPD 02 GGACCCAACC 4 0,3 – 1,3 Primer từ bộ kit 2 OPA10 GTGATCGCAG 4 0,2 – 1,5 Primer từ bộ kit 3 RAPD3 GTAGACCCGT 4 0,2 – 3 Primer viện thiết kế 4 OPC15 GACGGATCAG 4 0,3 – 2,5 Primer từ bộ kit 5 RAPD2 GTTTCGCTCC 5 0,7 – 1,6 Primer viện thiết kế 6 RAPD4 AAGAGCCCGT 6 0,75 – 1,5 Primer viện thiết kế 7 RAPD6 CCCGTCAGCA 3 1,1 – 2,5 Primer viện thiết kế 8 AJ01 ACGGGTCAGA 3 0,4 – 1,018 Primer từ bộ kit 9 OPA04 AATCGGGCTG 5 0,3 – 2,5 Primer từ bộ kit 40 - Primer RAPD3: Sản phẩm khuếch đại được tạo ra với primer này là 4 và cả 4 sản phẩm đều đa hình, có kích thước từ 0,2 – 3 kb (hình 4.6a). Trong đó có duy nhất 3 băng có kích thước 3 kb ở các dòng Cayenne như OMK20 (11), OMK11 (13), OMK16 (19). Đều này có thể cho thấy sự khác biệt về di truyền của các dòng dứa này so với những dòng khác. Đối với primer này thì có 50 % số dòng dứa tạo sản phẩm khuếch đại, trong đó phần lớn các dòng dứa Hà Nội đều không tạo sản phẩm. - Với primer RAPD4 số lượng băng tạo ra là 6, có kích thước từ 0,75 – 1,5 kb, và đều là băng đa hình, có một vị trí băng duy nhất ở mẫu số 20: OMK44 có kích thước 1,05 kb (hình 4.6b). Primer RAPD4 cũng ít có sản phẩm với dòng dứa Hà Nội và có 48 % số dòng dứa cho sản phẩm với các băng đa hình thể hiện rỏ trên gel. Hình 4.6: Kết quả điện di sản phẩm PCR với primer RAPD3 và RAPD4 trên gel agarose 1,5 % Chú thích : số 1 - 25 tương ứng với danh sách giống ở bảng 3.1, a: sản phẩm với primer RAPD3, b: sản phẩm với primer RAPD4. - Với primer OPC15 có 4 sản phẩm khuếch đại được tạo ra có kích thước từ 0,3 – 2,5 kb, số băng đa hình là 4 và có một băng duy nhất xuất hiện ở mẫu 19: OMK16 do đó có thể phân biệt được dòng này với các dòng dứa khác (hình 4.7). Số dòng cho sản phẩm khuếch đại là 25 chiếm 50 % tổng số và sản phẩm dễ nhận biết trên gel. Những dòng OMK61 – OMK75 không có sản phẩm với primer này. 41 Hình 4.7: kết quả điện di sản phẩm PCR với primer OPC15 trên gel agarose 1,5% - Primer RAPD2: số lượng dòng dứa cho sản phẩm khuếch đại ít chiếm 36%, với 5 băng đa hình được tạo ra có kích thước từ 0,7- 1,6 kb. Primer này cũng không cho sản phẩm khuếch đại với các dòng dứa Hà Nội (hình 4.8). Hình 4.8: kết quả điện di sản phẩm PCR với primer RAPD2 trên gel agarose 1,5%. - Tương tự đối với primer OPA04 tạo ra 5 băng đa hình có kích thước từ 0,3 – 2,5 kb (hình 4.9) và OPA10 có 4 băng đa hình có kích thước từ 0,2 – 1,5 kb (hình 4.10) cũng cho thấy sự đa dạng về nguồn gen giữa những dòng trong cùng một giống. Cả hai marker này cũng ít có sản phẩm với những dòng dứa có nguồn gốc từ Hà Nội và không có sản phẩm duy nhất. Các băng đa hình tạo ra rõ và dể dàng thấy được sự khác biệt giữa các dòng. 42 Hình 4.9: kết quả điện di sản phẩm PCR với primer OPA04 trên gel agarose 1,5% Hình 4.10: kết quả điện di sản phẩm PCR với primer OPA10 trên gel agarose 1,5%. - Ngoài ra, primer RAPD6 với 3 sản phẩm khuếch đại có kích thước từ 1,1 – 2,5 kb, primer OPD02 với 4 sản phẩm đa hình được tạo ra có kích thước từ 0,3 – 1,3 kb cũng cho thấy sự khác biệt về di truyền giữa các dòng dứa Cayenne. Trong tổng số những primer khảo sát thì primer AJ01 có số lượng dòng dứa có sản phẩm khuếch đại PCR thấp nhất chỉ chiếm 18 % trên tổng số dòng thí nghiệm và số băng đa hình được tạo ra là 3 băng với kích thước từ 0,4 – 1,018 kb. Đối với primer này thì các dòng dứa Hà Nội có sản phẩm khuếch đại. Hiệu quả tạo sản phẩm PCR của primer này không cao so với các primer khác có thể do bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố trong phản ứng PCR như lượng DNA, nồng độ Taq polymerase, đều này đã được chứng minh bởi Boonsermuk và ctv (1997). 43 Từ kết quả phân tích sản phẩm PCR với 9 primer cho thấy các primer đều tạo ra các băng đa hình có thể phân biệt được sự khác biệt về di truyền giữa các dòng dứa trong cùng một giống và số lượng dòng dứa có đa hình cũng khác nhau ở từng primer (bảng 4.4). Primer OPA10 cho đa hình với số lượng dòng cao nhất (58 %) và thấp nhất là AJ01 (18 %), RAPD4 có số lượng allen tạo ra trên một dòng cao nhất. Trong 50 dòng dứa Cayenne nghiên cứu thì các dòng có nguồn gốc từ Hà Nội ít có sản phẩm khuếch đại. Do vậy, đối với các dòng dứa này cần phải tiếp tục chọn lựa các marker khác để kiểm tra thêm. Số lượng sản phẩm PCR tạo ra đối với những primer thì còn phụ thuộc nhiều vào đều kiện phản ứng PCR (Ellsworth và ctv, 1993) cho nên chỉ có một số primer cho ra các băng đa hình. Bên cạnh đó, một số sản phẩm PCR khó nhận diện trên gel có thể do số lượng sản phẩm khuếch đại ít nên băng bị mờ hoặc thời gian nhuộm với ethiumbromide ít vì vậy việc thu thập các dữ liệu để phân nhóm cần tiến hành cẩn thận. Bảng 4.4: Sự đa hình của 9 primer với 50 dòng dứa Cayenne Primer Cấu trúc primer Vị trí allen Số dòng tạo băng Tỉ lệ (%) OPD 02 Đa hình A, B, C,D 21 42 % OPA10 Đa hình A, B, C, D 28 56 % RAPD3 Đa hình A, B, C, D 25 50 % OPC15 Đa hình A, B, C, D 25 50 % RAPD2 Đa hình A, B, C, D, E 18 36 % RAPD4 Đa hình A, B, C, D, E, F 24 48 % RAPD6 Đa hình A, B, C 23 46 % AJ01 Đa hình A, B, C 9 18 % OPA04 Đa hình A, B, C, D, E 23 46 % Bên cạnh đó, có một đều lý thú khi phát hiện đa hình trên các primer kết hợp với xem xét kiểu hình cho thấy những primer trong nghiên cứu này có thể tách được hai nhóm dứa với hình dạng lá có gai và không có gai dựa trên những băng đa hình khác nhau trên từng primer (bảng 4.5). 44 Bảng 4.5: Sự khác biệt về kiểu gen giữa dòng dứa có gai và không có gai dựa vào sự đa hình của các primer Tên dòng OPD02 OPA10 RAPD3 OPC15 RAPD2 RAPD4 RAPD6 OPA04 OMK44* OMK19 C No D A, B B, C, D No C, D B, C, D D, E No D, E A, C, D No A, B, C A, B, C, D, E No OMK8* OMK36 A, D C C, D B, C, D B, C, D A, B, D B, C, D A, C, D D, E D B, C, E E A, B, C A A, B, C A, B, C, D, E Chú thích: *: dòng dứa không có gai, No: không có sản phẩm khuếch đại. A, B, C, D, E: các vị trí của allen. Qua sự đa hình khác nhau chứng tỏ rằng những primer này có thể sử dụng trong nghiên cứu thiết lập bản đồ phân nhóm của gen qui định tính trạng về hình dạng lá có gai và không có gai trên cây dứa. Đồng thời, kết quả này cũng xác định rằng dòng OMK19 có nguồn gốc từ Tây Ninh thuộc nhóm giống đối chứng Queen. Qua đó, cũng có thể xác định được dòng OMK36 có nguồn gốc từ Kiên Giang là dòng dứa bị phân ly trong quá trình tiến hóa của giống Cayenne bởi bản chất của giống này là không có gai hoặc rất ít nhưng chúng thì có kiểu hình gai và khác nhau về kiểu gen so với những dòng khác trong giống Cayenne. Như vậy, đối với dòng OMK36 cần phải kiểm tra và xác định lại nguồn gốc giống nhằm góp phần phân nhóm giống Cayenne một cách chính xác hơn cũng như tránh nhầm lẫn giống trong lai tạo và chọn lọc. Kết quả khác biệt này cũng sẽ được biểu hiện trong sơ đồ phân nhóm dựa vào phần mềm NTSYS theo phương pháp phân tích nhóm UPGMA . 4.2.3. Phân tích nhóm của 50 dòng dứa Cayenne dựa trên dữ liệu RAPD Những dữ liệu thu thập từ việc mã hoá sản phẩm PCR theo quy tắc có băng ghi 1 và không có băng ghi 0 sẽ được dùng để tạo ra ma trận khoảng cách của 50 dòng dứa Cayenne sử dụng chỉ số tương ứng giản đơn SM (simple coefficient), từ đó xây dựng sơ đồ phân nhóm hình cây biểu diễn mối quan hệ về di truyền giữa các dòng trong cùng một giống thông qua phần mềm NTSYS-pc. 45 Hình 4.11: Sơ đồ hình cây thể hiện mối tƣơng quan về di truyền giữa 50 dòng dứa Cayenne trên cơ sở kiểu gen. Kết quả thu được ở hình 4.11 cho thấy nếu xét mức độ tương đồng di truyền của 50 dòng Cayenne ở 66 % thì sẽ được chia thành 3 nhóm chính sau:  Nhóm I Nhóm này gồm 20 dòng Cayenne có mức độ tương đồng di truyền nằm trong khoảng 0,66 – 0,74. Các giống thuộc nhóm này phần lớn là các dòng nhập ngoại 9 / 20 dòng. Nhóm I được chia thành 2 nhóm phụ với khoảng cách di truyền gần hơn như sau: - Nhóm Ia: có mức độ tương đồng di truyền nằm trong khoảng 0,74 – 0,83 gồm các dòng dứa nhập ngoại: OMK5, OMK7, OMK2, OMK9, OMK11, OMK1 và các dòng PHAN NHOM DI TRUYEN DUA SM Coefficient 0.49 0.57 0.66 0.74 0.83 0.91 1.00 OMK12 OMK5 OMK11 OMK1 OMK9 OMK20 OMK8 OMK2 OMK7 OMK29 OMK12 OMK10 OMK51 OMK6 OMK50 OMK17 OMK3 OMK15 OMK48 OMK42 OMK45 OMK16 OMK44 OMK52 OMK19 OMK18 OMK4 OMK43 OMK66 OMK71 OMK70 OMK68 OMK62 OMK69 OMK73 OMK76 OMK13 OMK47 OMK64 OMK63 OMK40 OMK67 OMK72 OMK77 OMK65 OMK74 OMK56 OMK75 OMK49 OMK59 OMK61 46 dứa nhập nội: OMK20, OMK59, OMK8. Trong đó, OMK8 có mức độ tương đồng thấp 0,73 nhất nghĩa là có sự khác biệt nhiều về di truyền so với các dòng dứa còn lại trong nhóm. Đồng thời, OMK1 với OMK9 có quan hệ gần nhau về di truyền trên 90 % mặc dù chúng có nguồn gốc khác nhau. Tuy nhiên, OMK11, OMK1 với OMK5 có cùng nguồn gốc nhưng lại nằm khác nhánh với nhau chứng tỏ về nguồn gen có sự đa dạng. Qua phân tích các dòng trong nhóm Ia cho thấy có sự giống nhau về di truyền giữa các dòng dứa Cayenne nhập ngoại với nhau và dòng nhập nội với dòng nhập ngoại. Sự khác nhau giữa dòng dứa OMK8 và OMK9 chứng tỏ chúng là các quần thề xa nhau về nguồn gốc di truyền. Kết quả này cũng đã được xác nhận trong nghiên cứu về đa dạng di truyền trên dứa (Hoàng Thị Bích Thuỷ và ctv, 2004). - Nhóm Ib: nằm trong khoảng tương đồng từ 0,74 – 0,91 bao gồm 11 dòng và phân thành 2 nhóm phụ với mức tương quan di truyền 70 %. Nhóm Ib1: chứa 5 dòng OMK10, OMK12, OMK50, OMK51 và OMK6. Trong đó, OMK10 và OMK12 nằm cùng nhánh bởi chúng xuất phát từ một quần thể và cùng tương quan đến 80 % vớI OMK50. Ngoài ra, OMK51 và OMK6 có thể xuất phát từ cùng một quần thể bởi tương đồng 80 % về di truyền. Nhóm Ib2: gồm những dòng dứa OMK17, OMK3, OMK15, OMK42, OMK45, OMK48 với mức tương đồng di truyền trên 80 %, trừ dòng OMK45 có sự khác biệt di truyền cao với hệ số tương đồng thấp 0,63. Trong nhóm này còn cho biết dòng OMK3 có thể cùng quần thể với OMK17, và sự khác biệt về di truyền giữa dòng OMK45 với OMK42 và OMK48 mặc dù chúng có cùng nguồn gốc từ Bến Tre.  Nhóm II Nhóm II chỉ có 3 dòng OMK16, OMK52 và OMK44 với mức tương đồng về di truyền đối với các nhóm khác nằm trong khoảng 0,66 – 0,83. Trong nhóm này, dòng OMK16 và OMK44 cùng nhánh chứng tỏ chúng có thể xuất phát từ cùng một quần thể.  Nhóm III Với 27 dòng dứa còn lại, nhóm III có hệ số tương đồng giữa các dòng dứa nằm trong khoảng từ 0,66 – 1,0, các dòng dứa trong nhóm này hầu hết là dòng nhập nội như có nguồn gốc từ Hà Nội, Bến Tre và chỉ có 2 dòng nhập ngoại là OMK4 và OMK13. Nhóm III được phân thành 2 nhóm khác biệt: 47 - Nhóm IIIa: chỉ duy nhất dòng OMK19 với mức độ tương đồng là 67 %. - Nhóm IIIb: gồm 26 dòng dứa với khoảng cách tương đồng từ 0,75 – 1,0. Có thể chia nhóm này thành 2 nhóm phụ nhỏ sau: Nhóm IIIb1: chỉ gồm OMK18 với độ tương đồng là 70% so với nhóm. Nhóm IIIb2: gồm 25 dòng còn lại với hệ số tương đồng rất cao nằm trong khoảng 0,85 – 1,0. Bao gồm các dòng: OMK4, OMK40, OMK49, OMK47, OMK56, OMK59, OMK77, OMK13, OMK76 và các dòng OMK61 – OMK75. Các dòng dứa từ Hà Nội phần lớn không có sự khác biệt về di truyền bởi có mức độ tương đồng cao trên 90 % và cùng tương quan gần về di truyền với dòng có nguồn gốc từ Trung Quốc, Cần Thơ và Bến Tre. Đều này cho biết chúng có thể xuất phát từ các quần thể có quan hệ gần nhau. Đây sẽ là yếu tố quan trọng góp phần vào công tác chọn giống nhằm hạn chế việc chọn những giống ít có sự khác biệt di truyền. Kết quả thu được từ phân tích nhóm III cho thấy một số dòng gần như giống nhau hoàn toàn về mặt di truyền bởi chúng đều xuất phát từ một giống. Tuy nhiên đây chỉ là phân tích bước đầu do số lượng primer dùng để phân tích chưa đủ lớn và còn nhiều vấn đề xảy ra trong lúc tiến hành phản ứng mà chưa thể kiểm soát triệt để do đó chưa phân nhóm một cách chi tiết hơn đối với những dòng này. Như vậy, với 9 marker RAPD được sử dụng, 50 dòng dứa từ Cayenne được phân thành 3 nhóm chính (bảng 4.6) với mức độ tương đồng về di truyền giữa các nhóm được thể hiện trong bảng 4.7. Khoảng cách di truyền giữa các dòng dứa Cayenne dao động lớn từ 0,27 – 1,0 (phụ lục III) chứng tỏ có sự đa dạng về mặt di truyền cao. Qua phân nhóm, những dòng dứa thuộc các nhóm khác nhau có thể được sử dụng để làm vật liệu lai tạo trong chọn giống, cụ thể nhóm I, nhóm II có thể lai tạo với nhóm III sẽ tạo ra những quần thể đa dạng về nguồn gen bởi những nhóm có khoảng cách di truyền càng xa thì khả năng cho con lai có nhiều tính trạng càng cao (Bùi Chí Bửu, 2002). 48 Bảng 4.6: Kết quả phân tích nhóm của 50 dòng dứa Cayenne STT Tên dòng Nguồn gốc Phân nhóm STT Tên dòng Nguồn gốc Phân nhóm 1 OMK5 Nhật I 26 OMK47 Thơm Bến Tre III 2 OMK12 Úc I 27 OMK52 Thơm Bến Tre II 3 OMK19 Khóm Tây Ninh III 28 OMK49 Thơm Bến Tre III 4 OMK10 Úc I 29 OMK50 Thơm Bến Tre I 5 OMK17 Codevoire (Pháp) I 30 OMK51 Thơm Bến Tre I 6 OMK2 Đài Loan-BL I 31 OMK61 Thơm Hà Nội III 7 OMK7 MontiqueI (Pháp) I 32 OMK66 Thơm Hà Nội III 8 OMK15 Thơm Phụng I 33 OMK67 Thơm Hà Nội III 9 OMK29 ThomBT9 I 34 OMK64 Thơm Hà Nội III 10 OMK18 Khóm Hà Nội III 35 OMK65 Thơm Hà Nội III 11 OMK20 Thơm Tây Ninh I 36 OMK71 Thơm Hà Nội III 12 OMK4 Thơm Thái Lan III 37 OMK72 Thơm Hà Nội III 13 OMK11 Đài Loan I 38 OMK73 Thơm Hà Nội III 14 OMK1 Đài Loan I 39 OMK74 Thơm Hà Nội III 15 OMK8 Thơm Lâm Đồng I 40 OMK75 Thơm Hà Nội III 16 OMK9 Thái Lan-MC I 41 OMK56 Thơm Bến Tre III 17 OMK3 Thơm Trung An I 42 OMK76 Thơm Cần Thơ III 18 OMK59 Thơm Bến Tre III 43 OMK77 Phụng Hiệp III 19 OMK16 Thơm Kiên Giang II 44 OMK40 Thơm Bến Tre III 20 OMK44 Thơm Bến Tre II 45 OMK13 Trung Quốc III 21 OMK48 Thơm Bến Tre I 46 OMK62 Thơm Hà Nội III 22 OMK42 Thơm Bến Tre I 47 OMK63 Thơm Hà Nội III 23 OMK43 Thơm Bến Tre III 48 OMK68 Thơm Hà Nội III 24 OMK45 Thơm Bến Tre I 49 OMK69 Thơm Hà Nội III 25 OMK6 Thom Bến Lức I 50 OMK70 Thơm Hà Nội III Bảng 4.7: Mối tƣơng quan về di truyền giữa các nhóm Nhóm I II III I 0,67 II 0,63 0,71 III 0,49 0,49 0,69 49 4.3. Ƣớc đoán độ chính xác giữa phân nhóm dựa trên đặc tính kiểu hình và chỉ thị RAPD Qua phân nhóm của 50 dòng dứa Cayenne dựa trên kiểu hình (bảng 4.2) và kiểu gen (bảng 4.6) cho thấy về mặt kiểu hình những dòng dứa có nguồn gốc từ Hà Nội nằm trong 3 nhóm khác nhau, về mặt kiểu gen chúng nằm trong cùng một nhóm với mức tương quan gần với nhau. Tương tự, về kiểu hình OMK16 và OMK44 khác nhau về chiều cao, số lá / bụi, màu sắc, hình dạng lá nhưng trong phân tích kiểu gen thì tương đồng 86 %. Đều này cho thấy sự đa dạng kiểu hình chưa thể nói lên được sự khác biệt về di truyền, kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Bachmann (1992). Dựa trên phần mềm NTSYS-pc, độ tin cậy trong phân nhóm dựa vào kiểu hình và chỉ thị RAPD được đánh giá thông qua kiểm tra Mantel (Mantel, 1967) với kết quả hệ số tương quan trong phân nhóm dựa vào kiểu hình r = 0,66 (p = 1) và phân nhóm dựa trên kiểu gen r = 0,9 (p = 1). Hệ số tương quan càng lớn chứng tỏ độ tin cậy của phương pháp càng cao, đều này cho thấy đánh giá sự đa dạng nguồn gen dứa bằng chỉ thị RAPD chính xác hơn so với kiểu hình, kết quả này cũng đã được báo cáo trong nghiên cứu của Phạm Trung Nghĩa và ctv (1999). Khi so sánh hai ma trận khoảng cách giữa hai phương pháp, kết quả với giá trị tương quan r = 0,073 (p = 0,99) có thể thấy những tính trạng hình thái đang nghiên cứu bị tác động nhiều bởi môi trường nên hệ số tương quan chưa cao. Hệ số này có thể cải tiến nếu như nhiều dữ liệu hình thái được nghiên cứu và nhiều primer được sử dụng để đánh giá sự đa hình hơn nữa ( Martínez de Toda và Sahcha, 1997a). Tóm lại, nghiên cứu và phân nhóm dựa vào đặc tính kiểu hình và kiểu gen có thể giúp đoán được sự tương quan di truyền giữa những dòng dứa có nguồn gốc khác nhau từ giống Cayenne, từ đó giúp cho các nhà chọn giống định hướng sơ khởi về những vật liệu lai tạo, dự kiến các qui trình chọn lọc sao cho đạt hiệu quả cao nhất và rút ngắn thời gian. 50 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Dựa vào kiểu hình 50 dòng dứa từ giống Cayenne thuộc 4 nhóm khác nhau, có sự tương quan giữa các giống nhập nội với các giống có nguồn gốc nhập ngoại. Những dòng có cùng nguồn gốc nhưng vẫn có sự đa dạng về kiểu hình. - Trong tổng số 13 primer tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền thì chỉ có 9 primer cho sản phẩm khuếch đại. - Qua phương pháp RAPD đã cho thấy được sự đa dạng và phân nhóm khác nhau trong tập đoàn dứa Cayenne gồm 50 dòng có nguồn gốc khác nhau. - Tập đoàn dứa Cayenne khảo sát được phân thành 3 nhóm chính thông qua 9 marker RAPD ở mức độ tương đồng về di truyền là 66%. Trong đó, những dòng dứa trong nhóm II có khác biệt về di truyền cao hơn so với nhóm I và nhóm III. - Xác định được dòng OMK19 không phải giống Cayenne mà thuộc giống Queen. Một số dòng bị phân ly và lai tạp giữa giống Queen và Cayenne như OMK36, OMK1.. - Sử dụng phương pháp marker phân tử có thể dự đoán những cá thể có khả năng tạo ưu thế lai trong chọn tạo giống - Phương pháp phân nhóm di truyền dựa trên marker RAPD thì tương đối chính xác hơn kiểu hình. Dựa vào marker phân tử có thể đánh giá gián tiếp sự hiện diện hay không hiện diện của gen chọn lọc nhờ marker mà không bị ảnh hưởng của môi trường. - Ứng dụng các phương pháp marker phân tử trong phân tích đa dạng di truyền đòi hỏi có sự đầu tư lớn về trang thiết bị, máy móc cũng như sự kiên trì và lâu dài. 5.2. Đề nghị - Nghiên cứu và phân tích sự đa dạng trên nhiều tính trạng hình thái để có sự phân nhóm chính xác hơn về kiểu hình. Từ đó tìm hiểu những tính trạng có đóng góp nhiều trong sự khác biệt di truyền để kiểm soát và khai thác dễ dàng hơn. - Tiếp tục thử nghiệm, phân tích để tìm ra nhiều primer khác phân biệt những dòng dứa từ Cayenne một cách chi tiết hơn, tạo cơ sở cho việc xây dựng hoàn chỉnh sơ đồ phân nhóm di truyền dứa. - Tiếp tục ứng dụng marker RAPD để tìm sự liên kết với những gen quy định về tính trạng hình thái như năng suất, thời gian sinh trưởng, hình dạng trái, hình dạng lá.. 51 - Tiếp tục ứng dụng phương pháp marker phân tử trên nhiều giống khác để nghiên cứu sự đa dạng di truyền và nhận diện giống. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004. Di truyền phân tử. NXB Nông Nghiệp TP Hồ Chí Minh. 2. Bùi Chí Bửu, 2002. Cơ sở di truyền tính kháng sâu bệnh hại cây trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Tp.Hồ Chí Minh, trang: 11-53, 89-108, 183-195. 3. Claude Py và M. A. tisseau., 1993. Cây dứa (Ưng Định dịch). Nhà xuất bản nông thôn. 4. Trịnh Đình Đạt, Nguyễn Văn Niệm, Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Lê Trung Kiên, 1998. Nghiên cứu một số enzyme của Ong nội (Apis cerana) ở bốn địa phương khác nhau. Báo Cáo khoa học. 5. Nguyễn Thị Thu Đông, 1998. Khảo sát tính đa dạng di truyền của hai tập đoàn giống xoài (Mangifera indica) bằng phương pháp điện di Isozyme. Luận án thạc sĩ khoa học nông học, Đại Học Cần Thơ, Tp. Cần Thơ, trang 14 - 15. 6. Vũ Công Hậu, 1999. Trồng cây ăn quả ở Việt Nam. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, trang 185 – 212. 7. Nguyễn Văn Kế, 2001. Cây ăn quả nhiệt đới. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Thành Phố Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Thị Lang, 1999. Những phương pháp cơ bản trong nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Tp.Hồ Chí Minh. 9. Nguyễn Thanh Nhàn và ctv, 2003. Phân biệt các giống và phân tích nhóm / loài thuộc chi Citrus ở Việt Nam bằng chỉ thị RAPD. Kết quả nghiên cứu công nghệ rau quả, 2002-2003, Viện nghiên cứu cây ăn quả miền nam. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Tp.Hồ Chí Minh, trang 48 - 56. 10. Phan Lê Diệu Phương, 2003. So sánh đặc điểm nông học và bước đầu tìm hiểu tính đa dạng di truyền của một số giống dưa leo được ưa chuộng. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Nông Học, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, 55 trang. 11. Phạm Bình Quyền, 2002. Đa dạng sinh học. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia, Hà Nội. 52 12. Richard B. Primack, 1999. Cơ sở sinh học bảo tồn. Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật. 13. Khuất Hữu Thành, 2003. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, trang 151 – 157. 14. Lê Duy Thành, 2000. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, Hà Nội, trang 139 – 154. 15. Hoàng Thị Bích Thuỷ , 2004. Nghiên cứu đa dạng di truyền của các giống (dòng) dứa bằng chỉ thị RAPD. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. 16. Đoàn Hữu Tuấn và Tạ Minh Tiến, 2003. Khảo sát thị trường dứa thế giới và nhu cầu dứa tươi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ rau quả 2001-200, Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh. 17. Trần Thế Tục, Vũ Mạnh Hải, 2002. Kỹ thuật trồng dứa. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội. 257 trang. 18. Đỗ Đức Tuyến, 2000. Nghiên cứu sự đa hình di truyền của một số dòng, giống lúa phục vụ công tác chọn giống. Khoá luận tốt nghiệp hệ đại học chính quy nghành Sinh Học. 19. Trần Thị Oanh Yến, Luro Francosis và Nguyễn Ngọc Thi, 2003. Phân tích tính đa dạng di truyền nguồn gen cây có múi ở Việt Nam bằng microsattelitte marker. Kết quả nghiên cứu công nghệ rau quả, 2002-2003, Viện nghiên cứu cây ăn quả miền nam. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Tp.Hồ Chí Minh, trang 57 - 66. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 20. Anon, 2002. FAOSTAT Database. Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Rome, Italy. 21. Antoni Rafalski, Scott Tingey and Jonhn G.K. Williams, 1994. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Plant molecular biology manual / H4, p.1 - 8. 22. Aradhya M.K., Zee F. and Manshardt R.M. 1994. Isozyme variation in cultivated sand wild pineapple. Euphytica 79: 87–99. 23. Bachmann K., 1992. Phenotypic similarity and genetic relationship among populations of Microseris bigelovi (Aster-aceae: Lactuceae). Bot. Acta, 105: 337- 342 53 24. Boonsermsuk, S., T. Anai, K. Hasegawa, and S. Hisajima, 1997. Variation in Random Amplified Polymorphic DNA of sago palm (Metroxylon Spp.) in ThaiLand. Japan. J. Trop. Agr. 41 (2): 89 – 92. 25. Duval M.F., and d‟Eeckenbrugge G., 1993. Genetic variability in the genus Ananas. Acta Hort 334: 27 – 32. 26. Duval M-F., J-L. Noyer., X. Perrier., G. Coppens d'Eeckenbrugge and P. Hamon., 2001. Molecular diversity in pineapple assessed by RFLP markers. Theoretical and Applied Genetics 102: 83 - 90. 27. Ellsworth, D.L., D. Rittenhouse, and R.L Honeycutt. 1993. Artifactual variation in random amplified polymorphic DNA banding patterns. Bio Techniques 14: 214 – 217. 28. Henry T Nguyen, 1998. Molecular Marker Protocol. Section III, Texas Technology University plant molecular genetics laboratory. 29. Kangle Zheng, Ning Huang, John Bennett and Gurdev S. Khush,1995. PCR- bases marker-assisted selection in rice breeding. IRRI discation paper series No. 12. 30. Martínez de Toada, F. and Sancha, J.C Ampelographical characterization of red Vitis vinifera L. cultivars preserved in Rioja. Bulletin de l`OIV, Mars-Avril 1997a, vol. 70, no. 793 - 794, p. 220 – 234. 31. Nguyen Thi Lang, 2002. Protocol for molecular biotechnology. Ed. Nong Nghiep Publisher, Ho Chi Minh City. 32. Phạm Thi Be Tu, Nguyen Thi Lang và Bui Chi Buu, 2003. Soybean genetic diversity analysis. OmonRice 11: 138 - 141. Agricultural Publishing House, Ho Chi Minh City. 33. Pham Trung Nghia, JPS. Malik, Mp.Paamdeey and NR.Singh, 1999. Genetic distance analysis ò hydrids parental line based on morphological raits and markers. OmonRice, Journ Cuu Long Delta Rice Research Insitute Vietnam, p 49 – 59. Agricultural Publishing House, Ho Chi Minh City. 34. Rohfl FJ, 1992. NTSYSpc: Numercial taxonomy and multivariate analysis system. New York: Exeter Software. 35. Rohrbach, KG, Leal, F., and Coppens d‟Eeckenbrugge, G., 2003. History, distribution and world production. The Pineapple:Botany, Production and Uses (Eds. Bartholomew, DP, Paull, RE and Rohrbach, KG) . CABI Publishing, Oxon, UK, p 1- 12. 36. Sanewski, G and Scott, C., 2000. The Australian pineapple industry. In: Proceedings of the Third International Pineapple Symposium (Eds. 54 Subhadrabandhu, Sand Chairidchai P.). International Society for Horticultural Science, Pattaya, Thailand, p 53 - 55. 37. Sergio Feuse, Kelin Meler, Marcos Daquinta, Miguel P. Guerra and Rubens O. Nordari, 2003. Plantcell, Tissue and Organ Culture, 72: 221 - 227). 38. Sneath, P. H. A. and R. R. Sokal., 1973. Numerical Taxonomy. Freeman, San Francisco. 573 pages. 39. Sun, Samuel S.M., 1994. Methods in plant molecular biology and agricultural biotechnology: a laboratory training manual. Asian Vegetable Research and Development Center: Shahua, Tainan, Taiwan (ROC), p – 41. 40. Tanksley, S.D., N.Ahn, M.Cause, R.Coffman, T.Fulton, S.R.McCouch, G.Sencond, T.Tai, Z.Wang, K.Wu, Z.Yu. 1991. RFLP mapping of rice genome. Rice genetics. Vol II: 435 - 449. Intenational Rice Research Institute. 55 PHỤ LỤC Phụ lục I: Bảng Anova Phân tích Anova về chiều cao cây của 50 dòng dứa Cayenne. ============================================================ SV DF SS MS F ============================================================= LL (R) 1 18.490000 18.490000 1.27 ns NT (T) 49 2123.410000 43.334898 2.97 ** ERROR 49 715.010000 14.592041 ------------------------------------------------------------------------------- TOTAL 99 2856.910000 ============================================================= cv = 3.6% ** = significant at 1% level; ns = not significant. Phân tích Anova về chiều rộng tán của 50 dòng dứa Cayenne. ============================================================ SV DF SS MS F ============================================================= LL (R) 1 1.000000 1.000000 <1 NT (T) 49 6548.040000 133.633469 6.18 ** ERROR 49 1059.000000 21.612245 ------------------------------------------------------------------------------- TOTAL 99 7608.040000 ============================================================= cv = 4.2% ** = significant at 1% level Phân tích Anova về chiều dài lá của 50 dòng dứa Cayenne. ============================================================= SV DF SS MS F ============================================================= LL (R) 1 2.560000 2.560000 <1 NT (T) 49 1702.000000 34.734694 3.81 ** ERROR 49 446.440000 9.111020 ------------------------------------------------------------------------------- TOTAL 99 2151.000000 ============================================================= 56 cv = 4.0% ** = significant at 1% level Phân tích Anova về chiều rộng lá của 50 dòng dứa Cayenne. ============================================================ SV DF SS MS F =========================================================== LL (R) 1 0.64000000 0.64000000 3.07 ns NT (T) 49 20.86040000 0.42572245 2.04 ** ERROR 49 10.22000000 0.20857143 ------------------------------------------------------------------------------- TOTAL 99 31.72040000 ============================================================ cv = 8.5% ** = significant at 1% level; ns = not significant Phân tích Anova về số lá trên bụi của 50 dòng dứa Cayenne. =========================================================== SV DF SS MS F ============================================================= LL (R) 1 40.960000 40.960000 5.03 * NT (T) 49 1496.240000 30.535510 3.75 ** ERROR 49 399.040000 8.143673 ------------------------------------------------------------------------------- TOTAL 99 1936.240000 ============================================================ cv = 4.3% ** = significant at 1% level; * = significant at 5% level Phụ lục II: Hình dạng và màu sắc lá của 50 giống Cayenne. Tên giống Màu sắc Hình dạng Tên giống Màu sắc Hình dạng OMK5 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK47 Xanh đậm Không gai OMK12 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK52 Xanh đậm Không gai OMK19 Xanh đỏ tía Có gai OMK49 Xanh với đốm nâu đỏ Không gai OMK10 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK50 Xanh nhạt Không gai OMK17 Xanh đậm Không có gai OMK51 Xanh với đốm nâu đỏ Có viền OMK2 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK61 Xanh đỏ tía Có gai OMK7 Xanh với đốm nâu đỏ Có gai OMK66 Xanh với đốm nâu đỏ Không gai OMK15 Xanh nhạt Có gai OMK67 Xanh với đốm nâu đỏ Không gai OMK29 Xanh nhạt Có viền OMK64 Xanh với đốm nâu đỏ Có viền OMK18 Xanh đậm Có gai OMK65 Xanh với đốm nâu đậm Có gai OMK20 Xanh đậm Có viền OMK71 Xanh đậm Không gai 57 OMK4 Xanh với đốm nâu đỏ Có viền OMK72 Xanh đậm Có viền OMK11 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK73 Xanh với đốm nâu đỏ Không gai OMK1 Xanh với đốm nâu đỏ có gai OMK74 Xanh đốm nâu đỏ nhạt Không gai OMK8 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK75 Xanh đậm Không gai OMK9 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK56 Xanh đậm Không gai OMK3 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK76 Xanh đậm Có viền OMK59 Xanh đậm Không có gai OMK77 Xanh với đốm nâu đỏ Có gai OMK16 Xanh đỏ tía Có gai OMK40 Xanh đậm Có viền OMK44 Xanh đậm Không có gai OMK13 Xanh nhạt Có gai OMK48 Xanh với đốm nâu nhạt Không có gai OMK62 Xanh với đốm nâu đỏ Không gai OMK42 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK63 Xanh với đốm nâu đỏ Có viền OMK43 Xanh với đốm nâu đậm Không có gai OMK68 Xanh với đốm nâu đỏ Không gai OMK45 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK69 Xanh đỏ tía Có viền OMK6 Xanh với đốm nâu đỏ Không có gai OMK70 Xanh với đốm nâu đỏ Không gai Phụ lục III: Ma trận tƣơng đồng của 50 dòng)Cayenne dựa trên dữ liệu RAPD " SIMQUAL: input=E:\tuyen\de tai\XU LY THONG KE\xuly NTSYS\tuyen.xls, coeff=SM " by Cols 3 50L 50 0 ThomNhat UcI KhomTayNinh UcII Codevoire DailoanBL Montique Thomphung ThomBT9 KhomHaNoi ThomTayNinh ThomThaiLan DailoanII DailoanI ThomLamDong ThomThailanMC ThomTrungAn ThomBT39 ThomKienGiang ThomBT24 ThomBT28 ThomBT22 ThomBT23 ThomBT25 ThomBenLuc ThomBT27 ThomBT32 ThomBT29 ThomBT30 ThomBT31 HaNoi1 HaNoi6 HaNoi7 HaNoi4 HaNoi5 HaNoi11 HaNoi12 HaNoi13 HaNoi14 HaNoi15 ThomBT36 ThomCanTho PhungHiep ThomBT20 TrungQuoc HaNoi2 HaNoi3 HaNoi8 HaNoi9 HaNoi10 1.0000000 0.7297297 1.0000000 0.6216216 0.6756757 1.0000000 0.7297297 0.8378378 0.7297297 1.0000000 0.7027027 0.6486486 0.4324324 0.7027027 1.0000000 0.7567568 0.6486486 0.5405405 0.8108108 0.7837838 1.0000000 58 0.7837838 0.6216216 0.5135135 0.6756757 0.7567568 0.8648649 1.0000000 0.7837838 0.6756757 0.5675676 0.7837838 0.8108108 0.7567568 0.6756757 1.0000000 0.6756757 0.6216216 0.5675676 0.6756757 0.6486486 0.8648649 0.7297297 0.6216216 1.0000000 0.5405405 0.5945946 0.5945946 0.4864865 0.5675676 0.5135135 0.4324324 0.4864865 0.6486486 1.0000000 0.7567568 0.7567568 0.4864865 0.7027027 0.6756757 0.7297297 0.7027027 0.7567568 0.7027027 0.5135135 1.0000000 0.4594595 0.5135135 0.6756757 0.4054054 0.3783784 0.3243243 0.2972973 0.5135135 0.4594595 0.7027027 0.4324324 1.0000000 0.8648649 0.7027027 0.5405405 0.7567568 0.7297297 0.7837838 0.8108108 0.7567568 0.6486486 0.4054054 0.8918919 0.3243243 1.0000000 0.8918919 0.7297297 0.5675676 0.7837838 0.7567568 0.8108108 0.7837838 0.8378378 0.6756757 0.4324324 0.8108108 0.4054054 0.9189189 1.0000000 0.7837838 0.6756757 0.4594595 0.6756757 0.5945946 0.7027027 0.6756757 0.6756757 0.7297297 0.4864865 0.7567568 0.3513514 0.7567568 0.7837838 1.0000000 0.8378378 0.7297297 0.5675676 0.7297297 0.7027027 0.7567568 0.7837838 0.7837838 0.6756757 0.4324324 0.8108108 0.4594595 0.8648649 0.9459459 0.7837838 1.0000000 0.7837838 0.7837838 0.6216216 0.7297297 0.8108108 0.6486486 0.7297297 0.7837838 0.5135135 0.5405405 0.7027027 0.5675676 0.7567568 0.7837838 0.5675676 0.7837838 1.0000000 0.5405405 0.4864865 0.7027027 0.4864865 0.4594595 0.4054054 0.3783784 0.5945946 0.4324324 0.6756757 0.4054054 0.9189189 0.4054054 0.4864865 0.3243243 0.4864865 0.6486486 1.0000000 0.6486486 0.7027027 0.3783784 0.5405405 0.6756757 0.5135135 0.5405405 0.6486486 0.4864865 0.4594595 0.7297297 0.5945946 0.6756757 0.6486486 0.5405405 0.6486486 0.7567568 0.5675676 1.0000000 0.6486486 0.7027027 0.4324324 0.5945946 0.6756757 0.5135135 0.5945946 0.7027027 0.4864865 0.4054054 0.7297297 0.5945946 0.6756757 0.7027027 59 0.5945946 0.7567568 0.7567568 0.5675676 0.8378378 1.0000000 0.6486486 0.5945946 0.5405405 0.6486486 0.7297297 0.6216216 0.5945946 0.8108108 0.4864865 0.5135135 0.6756757 0.6486486 0.6756757 0.7027027 0.4864865 0.7027027 0.8108108 0.7297297 0.6756757 0.7297297 1.0000000 0.7297297 0.6756757 0.5675676 0.7297297 0.8108108 0.7027027 0.6216216 0.8918919 0.5675676 0.5405405 0.7567568 0.5675676 0.7567568 0.7837838 0.5675676 0.7297297 0.8378378 0.6486486 0.7027027 0.7027027 0.9189189 1.0000000 0.4864865 0.5405405 0.7027027 0.4324324 0.3513514 0.3513514 0.32