Đề tài Nghiên cứu đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn bạc lá lúa Xanthomonas oryzae pv. oryzae ở miền Bắc Việt Nam

Phần 1 MỞ ĐẦU I. Đặt vấn đề Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra, là một trong những bệnh nhiệt đới điển hình gây hại đối với nhiều vùng trồng lúa khác nhau trên thế giới. Đối với miền Bắc nước ta, bệnh gây hại ở cả vụ xuân lẫn vụ mùa và hại trên nhiều giống khác nhau, đặc biệt đối với vụ mùa và trên các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc. Để phòng trừ người ta sử dụng nhiều biện pháp khác nhau, như áp dụng các biện pháp kỹ thuật canh tác, bón phân sớm, cân đối, vệ sinh đồng ruộng, mật độ gieo trồng hợp lý và dùng giống kháng bệnh, trong đó chọn tạo giống kháng bệnh có ý nghĩa kinh tế nhiều mặt, không gây ô nhiễm môi trường và tạo được nông sản sạch. Để tạo giống kháng bệnh bạc lá bền vững thì trước hết phải có nguồn gen kháng bệnh, sau đó phải xác định chính xác được số và thành phần các chủng hiện có ở mỗi vùng, nghiên cứu xác định gen kháng bệnh hữu hiệu rồi quy tụ nhiều gen kháng vào một giống. Hiện người ta đã xác định được 29 gen kháng bệnh bạc lá khác nhau trên thế giới, tương ứng đã xác định được mỗi nước có một số chủng gây bệnh nhất định như ở Philippin có 6 chủng, Ấn độ 9 chủng, Nhật Bản có 12 chủng. Ở Việt Nam, theo Phan Hữu Tôn và cộng sự, 2002 trên cơ sở lây nhiễm các dòng đẳng gen, dựa vào phổ kháng nhiễm đã tạm thời phân ra ở miền Bắc tồn tại 10 chủng. Đồng thời đã xác định được 4 gen kháng hữu hiệu là Xa4, xa5, Xa7 và Xa21, kháng mạnh và kháng được hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập. Tuy nhiên, do phương pháp lây nhiễm nhân tạo có một số nhược điểm như phụ thuộc vào môi trường, tốn thời gian, nhiều khi kết quả thu được chưa thật chính xác. Để khắc phục nhược điểm trên thì cần thiết phải xác định một cách chính xác sự đa dạng di truyền giữa các chủng ở mức phân tử DNA. Trên thế giới có khá nhiều công trình nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử DNA trong việc phân lập và xác định các chủng vi sinh vật gây bệnh. Lee và cộng sự, 2005 đã lần đầu tiên công bố đã xác định được trình tự DNA của genom vi khuẩn Xoo, vòng genom dài 4,9 triệu bp, trong đó đã xác định được một số vùng bảo thủ và những vùng dễ biến động, đây có thể là cơ sở phân tử để phân ra các chủng khác nhau. Sau đó Tika và cộng sự, 1999 đã sử dụng phương pháp rep-PCR và IS-PCR để nghiên cứu đa dạng di truyền của 171 chủng vi khuẩn Xoo phân lập ở Nepal và đã phân ra được 31 nhóm chủng khác nhau. Tuy nhiên, ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng chỉ thị phân tử DNA để xác định một cách chính xác các chủng vi khuẩn bệnh bạc lá lúa vẫn chưa được tiến hành. Vì vậy, được sự phân công và hướng dẫn chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn bạc lá lúa Xanthomonas oryzae pv. oryzae ở miền Bắc Việt Nam”. II. Mục đích và yêu cầu 1. Mục đích Nghiên cứu xác định đa dạng di truyền ở mức phân tử DNA các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá sử dụng kỹ thuật rep – PCR và IS-PCR, phục vụ công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bền vững. 2. Yêu cầu - Nuôi cấy, phân lập thành công và xác định chính xác các mẫu vi khuẩn Xoo. - Lây nhiễm các dòng đẳng đơn gen, xác định tính độc của mẫu vi khuẩn và phổ kháng nhiễm. - Sử dụng kỹ thuật rep – PCR và IS-PCR theo phương pháp của Tika và cộng sự, 1999 xác định đa dạng di truyền các mẫu vi khuẩn Xoo, trên cơ sở đó phân chia ra các chủng. Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU I. Tổng quan về bệnh bạc lá và vi khuẩn Xoo 1. Tổng quan bệnh bạc lá lúa 1.1. Lịch sử phát hiện bệnh Bệnh bạc lá lúa được phát hiện đầu tiên ở Fukuoka - Nhật Bản vào năm 1884. Ban đầu người ta lầm tưởng nguyên nhân gây nên triệu chứng bệnh là do acid đất (Bokura, 1911). Nhưng không lâu sau đó, người ta đã công nhận nguyên nhân của nó là do vi khuẩn gây nên và theo Ishiyama,1922 thuộc loại Bacillus oryzae. Vi khuẩn này sau đó được Tagami, Mizukami, 1962 và Mizukami, Wakimoto, 1969 đặt tên là Pseudomonas oryzae, cuối cùng Oku, 1972 đã xác định là do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây nên. Bệnh bạc lá lúa trở nên phổ biến ở tất cả các vùng trồng lúa trên khắp thế giới vào cuối thập kỉ 60 đến đầu thập kỉ 80 của thế kỉ XX, đặc biệt trên các nước trồng lúa ở Châu Á như: Ấn Độ (1990), Philippin (1957), Indonexia (1950), Trung Quốc (1957). Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện từ sau hòa bình lập lại (1945) trên các giống lúa địa phương cao cây. Sau đó, do phong trào thâm canh lúa tăng cao đã làm bệnh bạc lá lúa phát triển mạnh trên diện rộng và phức tạp, khó phòng trừ và thường xuyên gây hại nặng ở vụ mùa. Bệnh đã phát triển thành dịch lớn ở một số tỉnh Đồng bằng sông Hồng trong vòng từ năm 1968 – 1975. Trong những năm gần đây, ở miền Bắc thiệt hại do bệnh bạc lá lúa có xu hướng tăng trở lại và gây hại cả ở vụ xuân. 1.2. Tác hại do bệnh bạc lá lúa gây ra Bệnh bạc lá do vi khuẩn Xoo được tìm thấy ở tất cả các vùng trồng lúa trên thế giới. Hàng năm, theo thống kê năng suất lúa toàn thế giới giảm từ 10-20% do các bệnh vi khuẩn, trong đó 50% là do bệnh bạc lá gây nên (Mew, 1989). Ở Việt Nam bệnh đã được phát hiện từ lâu trên các giống lúa mùa cũ. Hiện nay, bệnh gây hại trên cả lúa lai và lúa thuần, đặc biệt gây hại nặng trên các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc. Tác hại của bệnh nặng hay nhẹ tuỳ thuộc vào giống lúa, thời điểm cây bị nhiễm bệnh và mức độ nhiễm nặng hay nhẹ. Tác hại của bệnh chủ yếu là làm cho lá đòng sớm tàn khô xác, giảm quang hợp, tăng lượng hạt lép, dẫn đến giảm năng suất lúa. Theo nghiên cứu của Tika, Mew & cộng sự, 1999 năng suất giảm chủ yếu do sự thay đổi về số nhánh, số hạt chắc trên bông và khối lượng 1000 hạt. 1.3. Triệu chứng bệnh Vi khuẩn Xoo gây ra 3 triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa là: bạc lá, vàng nhợt, héo xanh (còn được gọi là Kresek). Cho đến nay mối quan hệ giữa 3 triệu chứng này vẫn chưa được làm sáng tỏ, nhiều thí nghiệm trong nhà lưới đã chứng minh hiện tượng Kresek và bạc lá khác nhau rõ rệt mặc dù chúng đều là triệu chứng ban đầu của sự nhiễm bệnh. Các giống lúa khác nhau có thể biểu hiện triệu chứng nhiễm Kresek hoặc bạc lá. Triệu chứng vàng nhợt là ảnh hưởng sau, là hậu quả của sự bạc lá hay Kresek gây nên hoặc cũng có thể là do độc tố (toxin) của vi khuẩn sản sinh ra. Bệnh gây hại từ thời kỳ mạ đến khi lúa chín, triệu chứng bệnh biểu hiện rõ nhất vào giai đoạn lúa trỗ, chín. Khi bị bệnh, trên lá vết bệnh lan dần từ mép lá vào phiến lá, kéo dài theo gân chính, có khi vết bệnh từ ngay giữa phiến lá lan rộng ra. Vết bệnh lan từ mép ngoài vào gân lá theo đường gợn sóng. Vào lúc trời ẩm hoặc buổi sáng sớm, đầu hoặc mép lá có dạng giọt vi khuẩn dịch màu vàng, gặp trời nắng tạo thành dạng hạt keo vi khuẩn màu hổ phách. Hiện nay có hai dạng triệu chứng là bạc lá gợn vàng và bạc lá tái xanh. Trong đó, dạng bạc lá gợn vàng phổ biến hơn. 1.4. Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh 1.4.1. Quy luật phát sinh, phát triển Bệnh bạc lá phát sinh phát triển mạnh ở vụ mùa các tỉnh phía Bắc. Bệnh phát triển, lây lan nhanh trong điều kiện nhiệt độ 26-29°C, ẩm độ 90 %, đặc biệt khi có mưa to và gió lớn làm rập nát lá lúa tạo thuận lợi cho bệnh truyền lan. Vì thế vụ mùa bệnh thường gây tác hại nặng hơn vụ xuân. Vụ chiêm xuân bệnh phát triển mạnh vào tháng 5-6, còn vụ mùa là tháng 8-9 khi có nhiều mưa bão gây tổn thương cho lá lúa. Nhìn chung, bệnh phát triển mạnh nhất vào giai đoạn lúa làm đòng đến chín sữa vì đây là giai đoạn lúa mẫn cảm nhất với bệnh bạc lá. Từ các nghiên cứu gần đây về vi khuẩn bạc lá Xoo cho thấy ở mỗi vùng, lãnh thổ lại có một số chủng vi khuẩn bạc lá đặc trưng. Sự có mặt của các chủng vi khuẩn bạc lá phụ thuộc vào cơ cấu các giống lúa và điều kiện tự nhiên của mỗi vùng. Như ở Philipin tồn tại 6 chủng, Nhật Bản 12 chủng, Ấn Độ 9 chủng (Tika B. Adhikari và cộng sự, 1999). Còn ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Phan Hữu Tôn và cộng sự năm 2002 đã phân lập và xác định được ở miền Bắc Việt Nam có 10 chủng đang tồn tại. Gần đây, trong nghiên cứu về bệnh bạc lá ở 15 tỉnh miền Bắc, Nguyễn Văn Viết và cộng sự, 2005 đã nhận thấy các nhóm chủng Xoo thường xuất hiện đan xen, ở một địa phương có thể xuất hiện nhiều nhóm chủng, trái lại một nhóm chủng có thể hiện diện ở nhiều địa phương. Trên một vết bệnh đôi khi có thể tồn tại một hoặc một số chủng vi khuẩn nhất định. 1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển bệnh Có nhiều yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển của bệnh. Ẩm độ và lượng mưa là hai yếu tố quyết định cho sự phát sinh phát triển của bệnh bạc lá, lượng mưa lớn và nhiều kèm theo gió bão không những làm tổn thương đến lá khiến vi khuẩn dễ dàng xâm nhập mà còn tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh sản nhanh, tạo nhiều giọt dịch vi khuẩn và lây lan nhanh chóng. Phân bón và thời kỳ bón cũng là yếu tố ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát sinh phát triển của bệnh. Lượng đạm bón lớn làm thân lá phát triển mạnh, cây mềm yếu và dễ bị tổn thương nên dễ bị nhiễm bệnh. Bón sớm, tập trung sẽ giảm khả năng bị bệnh hơn so với bón muộn, rải rác. Bón đạm cân đối với lân và kali cũng làm giảm khả năng nhiễm bệnh. Tuy nhiên, nếu bón quá nhiều đạm (>120 kg N/ ha) thì bón thêm lân và kali cũng không còn tác dụng. Đất màu mỡ nhiều chất hữu cơ thì bệnh phát triển hơn ở chân đất cằn cỗi. Những nơi đất chua, ngập úng, nhiều mùn, lúa bị che bóng bệnh cũng phát triển mạnh hơn. Giống cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển của bệnh bạc lá. Các giống lúa cũ, lúa địa phương nhiễm bệnh nhẹ hơn so với các giống lúa nhập nội có thời gian sinh trưởng ngắn, phàm ăn. Theo điều tra của Viện bảo vệ thực vật thì các giống lúa lai Trung Quốc nhập nội từ năm 1993 – 1997 hầu hết đều bị nhiễm bệnh bạc lá với mức tỷ lệ bệnh 50-80%, cấp phổ biến là 5-7, nếu bệnh nặng năng suất giảm 20-50%. 1.5. Nghiên cứu về cách chẩn đoán bệnh bạc lá. Hiện nay đã có nhiều phương pháp khác nhau để chẩn đoán bệnh bạc lá. Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng của mình. Có thể kể ra ở đây một vài phương pháp và kỹ thuật chẩn đoán phổ biến như sau: - Phương pháp giọt dịch. - Phương pháp ELISA. - Phương pháp thấm hút tế bào trực tiếp (Direct tissue blotting). - Sử dụng que DNA/RNA. - Phương pháp thấm hút nén (Squash blot method). - Phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi XOR theo Adachi và cộng sự, 1990. Trong số các phương pháp kể trên thì phương pháp của Adachi, 2000 là tiên tiến và cho kết quả chính xác nhất. Phương pháp này khắc phục được những nhược điểm của các phương pháp khác và là phương pháp thích hợp được sử dụng trong điều kiện nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Các bước thực hiện phương pháp này như sau: thu thập mẫu bệnh, phân lập, chiết tách DNA của chúng và tiến hành PCR nhân đoạn DNA bảo thủ nằm giữa 2 gen tổng hợp cấu tử rDNA 16S và 23S của vi khuẩn Xoo với chu trình nhiệt độ và thành phần phản ứng PCR thích hợp. Sử dụng 2 đọan mồi có trình tự: XOR-F: 5'- GCA TGA CGT CAT CGT CCT GT-3' XOR-R2: 5'- CTC GGA GCT ATA TGC CGT GC-3' 1.6. Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá Các biện pháp canh tác bao gồm vệ sinh đồng ruộng, diệt trừ cỏ dại, phun thuốc trừ bệnh, tăng cường chăm sóc bón phân đúng cách, thích hợp và điều chỉnh mực nước hợp lý và trồng giống kháng bệnh. Ngoài ra còn có biện pháp xử lý hạt giống trước khi gieo. Cho đến nay, biện pháp sử dụng giống kháng bệnh vẫn được coi là biện pháp có hiệu quả và khả thi nhất. 2. Vi khuẩn Xoo 2.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc Vi khuẩn Xoo thuộc họ Pseudomonadaceae, có dạng hình gậy hai đầu hơi tròn, có một lông roi ở một đầu, kích thước 1-2 x 0,5-0,9 µm. Trên môi trường nhân tạo khuẩn lạc cầu vi khuẩn có dạng hình tròn, màu vàng sáp, rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt, háo khí, nhuộm Gram âm. Vi khuẩn không có khả năng phân giải nitrat, không dịch hoá gelatin, không tạo NH3, nhưng tạo H2S, tạo khí nhưng không tạo axít trong môi trường có đường. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng từ 26 - 300C, nhiệt độ tối thiểu 0 - 50C, tối đa 400C nếu cao hơn 530C sẽ làm vi khuẩn chết. Vi khuẩn có thể sống trong phạm vi pH khá rộng từ 5,7 - 8,5 thích hợp nhất ở pH 6,8 - 7,2. Hình 1. Ảnh hiển vi điện tử quét tế bào vi khuẩn Xoo trong mạch dẫn của lá lúa . Hình 2. Hình dạng tế bào vi khuẩn bệnh bạc lá lúa (Anna Maselli, 1999). 2.2. Nghiên cứu đặc điểm bộ genom Xoo Hiện đã có một số nghiên cứu về trình tự genom của các chủng vi khuẩn Xoo, trong đó gần đây nhất phải kể đến là công trình nghiên cứu về cấu trúc genom của hai chủng phổ biến nhất hiện nay là: MAF311018 (Nhật Bản) và KACC10331 (Hàn Quốc), được công bố trên website: 2.2.1. Bộ genome Xoo chủng MAFF311018 Hinh 3. Bản đồ genom vi khuẩn Xoo chủng MAFF311018. Hình phía trên trình bầy cấu trúc genom nhiễm sắc thể vi khuẩn Xoo chủng MAFF311018 biểu hiện bằng tám vòng tròn. Vòng ngoài cùng biểu hiện chiều dài của mỗi vùng gen bằng đơn vị 100 kb, vòng thứ 2 và 3 biểu hiện vị trí của các gen theo các hướng phiên mã khác nhau tương ứng. Những gen đã xác định rõ chức năng được ký hiệu màu vàng, gen chưa xác định rõ chức năng được ký hiệu màu xanh. Vòng tròn thứ tư biểu hiện vị trí tụ tập của các gen hrp và những gen gây độc avr ký hiệu màu xanh. Vòng tròn thứ năm biểu hiện vị trí của các trình tự gắn chèn. Vòng thứ sáu biểu thị hàm lượng C + G của mỗi trung bình 20 kb của mỗi đoạn. Vòng số bẩy biểu hiện vị trí của các gen mã hóa tạo ra tRNA và rRNA của vi khuẩn. Cuối cùng là vòng số tám biểu hiện vị trí của các prophage cùng các gen của phage. Theo đó genom của Xoo chủng MAFF 311018 gồm một nhiễm sắc thể vòng dài 4.940.217 bp, với hàm lượng G+C trung bình chiếm 63,7%. Bên trong không phát hiện thấy có chứa một thể plasmid nào. Trong đó phát hiện thấy có hai bản copy của operon rrn và thứ tự liền kề một số gen như sau: 16S-tRNAAla -tRNAIle -23S-5S. Genom chứa tổng số 53 gen mã hóa tạo thành các tRNAs đại diện cho 43 loại tRNA khác nhau. Trong tổng số 4.372 khung đọc mở được phát hiện (ORFs) trong genom chủng MAFF311018 thì có 2.799 (64%) gen đã xác định được chức năng, 1.383 (32%) proteins được xác định tương đồng với nhiều protein điển hình của vi khuẩn Xoo nhưng chưa biết rõ chức năng. Có 190 gen (4%) được xác định là không tương đồng rõ rệt với những gen đã được xác định và công bố trước đó của vi khuẩn. 2.2.2. Cấu trúc genom chủng KACC10331 Theo Lee và cộng sự, 2008 thì genom vi khuẩn Xoo chủng KACC10331 có cấu trúc như sau: Tổng genom nhiễm sắc thể vòng dài 4.941.439 bp, với hàm lượng C + G chiếm 63.7%. Genom có 4637 khung đọc mở, trong đó có 3340 (72.0%) có thể xác định được chức năng. Khoảng 80% số gen trong đó được phát hiện thấy trong các loài vi khuẩn X. axonopodis pv. citri (Xac) và X.campestris pv. campestris (Xcc). Tuy nhiên, 245 gen được xác định là chỉ đặc thù đối với Xoo, trong đó có 8 gen gây độc. Đồng thời nhóm tác giả còn xác định được vị trí của cả những gen tạo phản ứng siêu mẫn (hrp), những gen sinh ra vỏ polysaccharide, gen mã hóa tạo enzyme phân rã màng tế bào thực vật. Điều này giúp chúng ta hiểu rõ được cơ chế tương tác giữa vi khuẩn Xoo gây bệnh đối với ký chủ họ hòa thảo. 2.2.3. Nghiên cứu trình tự chèn trên bộ genom Xoo Hiện đã xác định được tất cả có 611 trình tự chèn IS, chúng thuộc 25 kiểu chèn xen khác nhau trong bộ genom Xoo, chiếm sấp xỉ 10% tổng chiều dài của genom vi khuẩn. Tỷ lệ này là khá cao nếu so sánh với các loài vi khuẩn gây bệnh thực vật khác, đây có thể là một đặc điểm của vi khuẩn Xoo. Bảng 1. Liệt kê các yếu tố IS có mặt trong genom vi khuẩn Xoo chủng MAFF 311018. IS của vi khuẩn Xoo phân bố khắp genom, chúng lặp lại liên tục trong nhiều locus. Có một số vùng chứa nhiều IS có thể dài tới 30 kb. Người ta đã xác định được đầy đủ trình tự của 386 IS và còn lại 225 IS đang được tiếp tục nghiên cứu. Theo số liệu trình tự, người ta chia chúng ra thành 7 nhóm khác nhau, trong đó nhóm IS5 và ISNCY phổ biến hơn cả, mỗi IS có lần lượt từ 110 đến 63 bản copy. Trong đó có 6 trình tự đặc thù là: ISXoo11, ISXoo12, ISXoo13, ISXoo14, ISXoo15 và ISXoo16.  2.2.3. Những gen quy định tính độc của vi khuẩn Xoo (Pathogenicity-related genes) - Nhóm gen hrp Trong số các vi khuẩn gây bệnh cho thực vật thì những gen hrp mã hóa cho hệ thống tiết dịch loại III (TTSS) là đóng vai trò quan trọng nhất. Những gen này thường ổn định trong các vi sinh vật gây bệnh ở động vật và thực vật, chúng tiêm những protein hữu hiệu vào tế bào kí chủ. Nhóm gen hrp tìm thấy trong genom Xoo gồm 27 gen kí hiệu từ hpa2 đến hpaF và chúng có cấu trúc giống với cấu trúc của những gen này ở những vi khuẩn thuộc loài Xanthomonas, loại trừ trường hợp ở vùng hrpE2 của gen hpaB và vùng hrpF. Trong genom vi khuẩn Xoo, thấy có 3 gen đặc thù được phát hiện giữa gen hpaB và hrpF. Một gen định vị tại phần sau của gen hpaB (hrpE2) và có cùng hướng phiên mã với operon hrpE. Hai gen còn lại cũng nằm ở vùng sau của hpaB (hrpE2), nhưng hướng phiên mã theo chiều ngược lại. Theo sơ đồ này có 4 tương đồng chuyển vị liên tục nằm ở vùng giữa hpaB và hrpF là ISXo8, ISXo1, ISXo8 và ISXoo6. Hình 4. So sánh tổ chức di truyền nhóm gen hrp của 3 loài vi khuẩn Xoo, Xcc và Xac. A. Tổ chức di truyền của những gen bình thường. B. Những vùng biến động của nhóm gen hrp. Mỗi một gen có tên nằm trên hoặc dưới các mũi tên. Bản đồ được biểu diễn dựa trên số liệu trình tự các Nucleotit được xác định trong ngân hang gen (GenBankdatabase). Trình tự được xác định trên cơ sở sử dụng các gen của chủng X.axonpodis pv.citri 306 (kí hiệu AE008923) và gen của chủng X.campestris pv.campestris ATCC 33913 (kí hiệu AE008922). - Nhóm gen avr. Protein không gây độc là một trong những chất hiệu ứng loại III, chúng kích thích khả năng kháng bệnh trong cây tương ứng có những gen kháng bởi vậy chức năng của nó được xác định mang tính đặc thù theo giống lúa và chủng gây bệnh. Chủng MAFF 311018 biểu hiện mức độ đặc thù theo kí chủ giống lúa rất cao. Nó chứa một số các gen không gây độc. Vi khuẩn Xoo chứa rất nhiều bản copy các thành viên trong gia đình gen không gây độc avrBs3/pth, đây là một trong những nhóm gen không độc avr. Trong genom vi khuẩn Xoo, nhóm tác giả đã phát hiện có 17 bản copy phân bố và tụ tập tại 7 vùng genom khác nhau, được trình bày ở bảng dưới đây: Bảng 2. Bản liệt kê 17 bản copy các thành viên trong gia đình avrBs3/pth Mặc dù chúng có trình tự rất khá giống nhau nhưng chúng hoàn toàn phân biệt được với nhau bởi sự khác nhau chủ yếu ở số lượng các đoạn lặp lại nằm ở vùng trung tâm. Số lần lặp lại biến động từ 12,5 đến 31,5 và từ 2 đến 4 gen avr hầu hết nằm ở những vùng không gây độc, và những yếu tố di động như ISs và những gen có lien quan đến phage được định vị ở những vùng bên cạnh. Vị trí của những gen không gây độc này được trình bày ở hình dưới. Riêng vùng avr V, chúng bị ngắt quãng bởi một gen di động là ISXoo9 nằm ở đầu 3’. Hướng phiên mã của gen không độc avr ở vùng I, II và III là sợi anti-sense, nhưng đối với vùng IV, VI và VII thì là sợi sense theo hướng ngược lại. Hình 5. Bản đồ vị trí các gen không độc avr/pth của vi khuẩn Xoo. Vị trí tương đối của mỗi vùng và chiều dài của mỗi gen nh ư sau: v ùng I dài 1,228,783-1,246,335bp; II, 2,201,149-2,216,771 bp; III, 2,352,186-2,360,329 bp; IV, 2,383,115-2,392,653 bp; V, 2,999,333-3,001,924 bp; VI, 3,213,703-3,234,123 bp; và vùng VII dài 4,525,416-4,529,345 bp. - Gen điều hòa HrpX Trong vi khuẩn Xanthomonads, sự biểu hiện của một số gen cấu trúc TTSS và một số gen hiệu ứng được điều hòa bởi sản phẩm của các gen hrpG v à hrpX, các gen sản phẩm này đều có mặt ở cả 2 loại vi khuẩn Xac và Xcc. Một số gen hoạt động phụ thuộc vào gen HrpX đều cùng chứa một trình tự giống nhau là : TTCGC…N15…TTCGC, gọi là hộp PIP (PIP box). Hộp PIP này là một chỉ tiêu để phán đoán liệu gen nào đó có bị điều khiển bởi gen HrpX hay không, Đặc biệt đối với những gen mã hóa tạo ra các protein hiệu ứng. Trong vi khuẩn Xoo, người ta đã phát hiện có 37 bản copy hộp PIP hoàn chỉnh hoặc gần hoàn chỉnh có trình tự: TTCGN…N15…TTCGN, nằm ở vùng điều khiển của gen. Năm trong số đó nằm ở cụm tụ điểm của các gen hrp, số còn lại nằm rải rác ở vùng khác trong genom. Bảng 3. Danh sách các gen chịu sự điều hòa bởi gen HrpX trong genom Xoo Bottom of Form II. Đa dạng các chủng vi khuẩn Xoo 2.1. Tổng quan đa dạng sinh học Theo Công ước Đa dạng sinh học, khái niệm "Đa dạng sinh học" (biodiversity, biological diversity) có nghĩa là: Sự khác nhau giữa các sinh vật sống ở tất cả mọi nơi, bao gồm: các hệ sinh thái trên cạn, trong đại dương và các hệ sinh thái thuỷ vực khác, cũng như các phức hệ sinh thái mà các sinh vật là một thành phần; thuật ngữ này bao hàm sự khác nhau trong một loài, giữa các loài và giữa các hệ sinh thái . Có thể coi, thuật ngữ "đa dạng sinh học" lần đầu tiên được Norse and McManus, 1980 định nghĩa, bao hàm hai khái niệm có liên quan với nhau là: đa dạng di truyền (tính đa dạng về mặt di truyền trong một loài) và đa dạng sinh thái (số lượng các loài trong một quần xã sinh vật). Hiện nay có ít nhất 25 định nghĩa nữa cho thuật ngữ "đa dạng sinh học. Định nghĩa được đưa ở trên là định nghĩa được dùng trong Công ước Đa dạng sinh học. 2.2. Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng sinh học Nhìn chung, việc nghiên cứu đa dạng sinh học có ý nghĩa hết sức quan trọng trong việc phân lập và sử dụng một cách hiệu quả nhất các nguồn tài nguyên sinh học có lợi cũng như có được những biện pháp phòng tránh hữu hiệu nhất đối với các nguồn tài nguyên sinh học có hại trong sản xuất và đời sống của con người. Đối với vi sinh vật gây bệnh, việc xác định chính xác thành phần và số lượng các chủng ở một vùng sinh thái nhất định có một ý nghĩa đặc biệt quan trọng. Vì có xác định được đúng chủng loại mới xác định được khả năng kháng hữu hiệu của từng gen kháng đối với mỗi chủng, từ đó có chiến lược quy tụ nhiều gen kháng hữu hiệu vào một giống nhằm tạo ra tính kháng bền vững trong tương lai đối với từng vùng sinh thái nhất định. Ngoài ra việc xác định đúng thành phần chủng còn giúp công tác kiểm dịch thực vật ngăn chặn chủng ngoại xâm nhập vào và có thể mỗi chủng bị tiêu diệt bởi một số thuốc nhất định từ đó giúp nhà bảo vệ thực vật sử dụng thuốc hóa học để phòng trừ bệnh một cách hợp lý. 2.3. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng sinh học của vi khuẩn Xoo hiện nay trên thế giới Tháng 3 năm 1997, J.Yashitola, D. Krishnaveni, A.P.K.Reddy và R.V.Sonti đã thu thập 67 isolate từ năm 1994 đến 1995 trên 18 vùng của Ấn Độ. Sử dụng phương pháp DNA (RFLP) với hai mẫu dò (probe) là các trình tự lặp lại riêng biệt: Probe dựa vào trình tự gen avrXa10 Probe dựa vào trình tự yếu tố chèn IS1112 Kết quả, với Probe avrXa10 từ 67 Isolate tác giả đã phân ra 9 kiểu sai khác phân tử dựa vào enzyme cắt giới hạn BamHI. Probe IS 1112 phân ra 11 kiểu sai khác phân tử dựa vào enzyme cắt giới hạn EcoRI. Cuối cùng, các tác giả tổng hợp cả hai Probe avrXa10 và Probe IS 1112 thu được 15 kiểu sai khác phân tử. Năm 1999, Tika B.Adhikari, T.W.Mew, và Jan E. Leach sử dụng 2 phương pháp rep-PCR và IS-PCR để tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền đối với 171 Isolate phân lập được ở 8 vùng sinh thái khác nhau tại Nepal. Trong đó tác giả sử dụng 3 mồi ERIC1R, ERIC2 (trong cùng một phản ứng) cho rep-PCR và mồi J3 cho IS-PCR. Mồi ERIC1R và ERIC2 được thiết kế trên cơ sở những các chuỗi lặp bảo thủ vùng liên gen (enterobacterial repetitive intergenic consensus) có kích thước 124 - 127 bp. Còn mồi J3 được thiết kế trên cơ sở hai đoạn chèn ở trình tự IS1112, IS1113. Kết quả phân lập được 31 haplotype (kiểu sai khác phân tử) từ 171 Isolate nghiên cứu. ERIC1R: 5’ – ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC – 3’ ERIC2 : 5’ – AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG – 3’ J3: 5’ – GCTCAGGTCAGGTCGCCTGG – 3’ Năm 2000, Edmilson R. Gonc: alves và Yoko B. Rosato sử dụng mồi BOXA1R với trình tự: 5’- CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’ cho phản ứng rep-PCR. Kết quả từ 55 Isolate thu thập được đã phân lập thành 16 species (loài) Xanthomonas and Pseudomonas syringae pv. Passiorae Tiếp nối thành công của Tika B.Adhikari(1999), tháng 6 năm 2007, Jiajian và cộng sự đã sử dụng phương pháp IS-PCR với mồi J3 trên 7 chủng vi khuẩn Xoo tồn tại tại Trung Quốc. Khi so sánh với DNA ladder và so sánh với trình tự genome của 2 chủng KACC10331 (Hàn Quốc) và MAFF311018 (Nhật Bản), các tác giả đã phát hiện ra 3 locus mới trên trình tự chèn IS1112: (A) IS1112d GATATCGATATGGGT GGCGAATT…//…AAGCCGCC GGTGGATTCTTCCGGCG GATATCGATATGGGT GGATTCTTCCGGCG 405 (B) IS1112a TGAGCCAGTGTTTTG GGCGGCTT…//…AATTCGCC ACAGAAAACGCGGGT TGAGCCAGTGTTTTG ACAGAAAACGCGGGT (C) IS1112b GCTTCAACCGCCGATTCGACC GGCGGCTTCAACTCTGGAT…… GCTTCAACCGCCGATTCGACCTGAAACAGATGCTGCCGCG…… ISXo2 957 Hình 6: ba trình tự locus mới trên trình tự chèn IS1112 được phát hiện tại Trung Quốc (2007) 2.5. Nghiên cứu đa dạng vi khuẩn Xoo tại Việt Nam. Những nghiên cứu rề đa dạng vi khuẩn Xoo tại miền Bắc Việt Nam cho đến nay vẫn thường chỉ sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên các dòng lúa đẳng đơn gen (gen kháng bệnh bạc lá). Kết quả là có thể thiết lập được một phổ kháng nhiễm và dựa vào đây, các tác giả phân tích sự đa hình của các mẫu vi khuẩn, phân lập chúng vào những nhóm chủng có biểu hiện kháng nhiễm khác nhau đối với các dòng đẳng đơn gen. Còn những nghiên cứu về đa dạng vi khuẩn Xoo ứng dụng chỉ thị phân tử ADN thực thụ thì gần như chưa được tiến hành hoặc mới chỉ sử dụng chỉ thị phân tử để xác định vi khuẩn Xoo mà thôi. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, vào thập kỷ 90 có 4 nòi sinh lý phổ biến ở miền Bắc nước ta (Nguyễn Văn Viết, 2005). Nhưng nghiên cứu gần đây của Phan Hữu Tôn và cộng sự, 2002 thì trên các mẫu bệnh thu thập được ở các tỉnh miền Bắc phân biệt được 154 isolate trong đó 64 isolate thuộc 16 chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhau. Tuy trong kết quả nghiên cứu của tác giả có kết luận là tồn tại 2 chủng phổ biến kí hiệu là chủng 2 và chủng 3 ở vùng Đồng bằng sông Hồng. Song những chủng còn lại vẫn có tiềm năng gây nguy hiểm vì dù xuất hiện với tần xuất thấp hơn nhưng chúng vẫn có khả năng gây bệnh với các giống lúa. Điều này cho thấy số lượng các chủng bạc lá ở miền Bắc nước ta đang tăng lên nhanh chóng và đa dạng, đòi hỏi cần phải có những nghiên cứu chính xác các chủng vi khuẩn Xoo đang tồn tại để lựa chọn được những gen kháng hữu hiệu, và từ đó có kế hoạch chọn tạo giống kháng bệnh bền vững. Phần 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu sử dụng 11 mẫu vi khuẩn Xoo là các chủng vi khuẩn đã được Phan Hữu Tôn và cộng sự phân lập năm 2002 bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo (Bảng 1). Bên cạnh đó còn sử dụng 9 mẫu vi khuẩn Xoo (kí hiệu bằng số 1,2,4,…) mới được tiến hành thu thập và phân lập ở một số huyện ngoại thành Hà Nội trong vụ mùa 2007 (Bảng 2). Các mẫu vi khuẩn đều được bảo quản tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử trực thuộc Khoa Công nghệ sinh học – trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội. Bảng 4. Danh sách và nguồn gốc của 11 chủng vi khuẩn phân lập năm 2002 (Phan Hữu Tôn và cộng sự, 2002) STT Kí hiệu Tên mẫu Tên giống thu thập Địa điểm thu thập 1 R1 HAU 01043 TN 13-4 Hà Nội 2 R2 HAU 020361 Nếp Tân Thuận Châu, Sơn La 3 R3 HAU 020083 Nhị ưu - 838 Quỳnh Lưu, Nghệ An 4 R5 HAU 020131 Khang Dân Diễn Châu, Nghệ An 5 R6 HAU 020346 Nhị ưu – 838 Yên Bình, Yên Bái 6 R7 HAU 020191 Q5 Bình Giang, Hải Dương 7 R8 HAU 020201 Nếp Thơm Bình Giang, Hải Dương 8 R9 HAU 020371 IR 64 Thuận Châu, Sơn La 9 R10 HAU 020321 Hybrid rice Yên Bình, Yên Bái 10 R11 HAU 020081 Nhị ưu – 838 Quỳnh Lưu, Nghệ An 11 R12 HAU 010081 Tẻ đỏ Hải Dương Dùng 9 dòng đẳng đơn gen (dòng chỉ thị) là: IRBB1, IRBB2, IRBB3, IRBB4, IRBB5, IRBB7, IRBB10, IRBB14, IRBB21 chứa lần lượt các gen kháng bệnh là: Xa-1, Xa-2, Xa-3, Xa-4, xa-5, Xa-7, Xa-10, Xa-14, Xa-21. Đối chứng là giống IR24 mẫn cảm với bệnh bạc lá (không chứa một gen kháng bệnh bạc lá nào). Bảng 5. Danh sách và địa điểm các mẫu bệnh thu thập STT Kí hiệu Tên giống thu thập Địa điểm thu thập Thời gian 1 1 Tẻ thơm (BT7) Cổ Loa, Đông Anh, Hà Nội 8/9/2007 2 2 Khang dân Cổ Loa, Đông Anh, Hà Nội 8/9/2007 3 4 Khang dân Tiên Dược, Sóc Sơn, Hà Nội 8/9/2007 4 5 Tẻ thơm (BT7) Tiên Dược, Sóc Sơn, Hà Nội 8/9/2007 5 8 Tẻ Thơm2 (BT7) Tiên Dược, Sóc Sơn, Hà Nội 8/9/2007 6 12 Q5 An Bình, Nam Sách, Hải Dương 9/9/2007 7 15 Tẻ Thơm (BT7) Cộng Hoà, Chí Linh, Hải Dương 9/9/2007 8 36 Q5 Thanh Trì, Hà Nội 16/9/2007 9 70 TH3-3 Thanh Trì, Hà Nội 19/9/2007 3.4. Nội dung nghiên cứu - Thu thập, phân lập và xác định chính xác các chủng vi khuẩn Xoo từ một số mẫu vi khuẩn mới thu thập ở Hà Nội và lặp lại ở 11 mẫu vi khuẩn Xoo theo Phan Hữu Tôn và cộng sự, 2002. Phân chủng bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo dòng đẳng gen. - Xác định đa dạng di truyền ở mức phân tử DNA trên cơ sở sử dụng và phân tích những trình tự lặp lại và trình tự chèn IS1112, IS1113 của 20 mẫu vi khuẩn Xoo nghiên cứu. - Thiết lập cây phân loại thể hiện mối tương quan về mặt di truyền giữa các mẫu vi khuẩn Xoo, xác định rồi phân nhóm ra các chủng. 3.5. Phương pháp nghiên cứu Nội dung và phương pháp nghiên cứu của đề tài được tóm tắt như sau: Phân lập, nuôi cấy vi khuẩn Xác định vi khuẩn Xoo bằng PCR Nghiên cứu đa dạng di truyền các mẫu vi khuẩn bằng phương pháp rep-PCR và IS-PCR Nghiên cứu đa hình các mẫu vi khuẩn bằng lây nhiễm nhân tạo 3.5.1. Phân lập và nuôi cấy các mẫu vi khuẩn. - Phương pháp tiến hành theo N. Furuya và cộng sự, 2003: Các mẫu vi khuẩn được phân lập bằng phương pháp nuôi cấy đơn tế bào trên môi trường đặc hiệu Wakimoto. Công việc được thực hiện trên đĩa petri trong điều kiên vô trùng trong buồng cấy sau đó mẫu vi khuẩn được lưu giữ trong ống nghiệm. - Chuẩn bị môi trường Wakimoto: Thành phần môi trường (tính trên 500ml môi trường): + Khoai tây gọt vỏ 150g + Đường Saccarose 7,5g + NaHPO4.12H2O 1g + Agar 7,5g + Ca(NO3)2.4H2O 0,25g + Nước cất 500ml + Peptone 2,5g + pH 7,0 (Công thức môi trường theo Wakimoto,1995) + Khoai tây gọt vỏ, cho vào nồi, thêm 700ml nước cất và đun sôi trong 15-20 phút sau đó thu lấy dịch. + Hòa tan dịch khoai tây với đầy đủ hóa chất và thêm nước cất cho đủ 500ml, dùng khuấy từ khuấy đều và chuẩn độ cho pH = 7,0 + Đem hấp khử trùng ở 121oC; 1,5atm; trong vòng 20’. - Phân lập bằng phương pháp đơn tế bào: + Từ mẫu bệnh thu được cắt thành những đoạn nhỏ 5 x 5 mm phần tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khoẻ của vết bệnh đang phát triển. + Ngâm các đoạn cắt trong cồn 70% trong 10 giây. + Chuyển sang ngâm trong nước Javen trong 5 phút. + Rửa sạch trong nước vô trùng 2 – 3 lần. + Thực hiện cắt nhỏ và dùng chày nghiền mẫu với 1 ml nước cất vô trùng đến khi được dung dịch đồng nhất. + Hút 1ml dung dịch thu đựơc cho vào 9 ml nước cất, thực hiện 3 lần. + Hút 1 ml từ dung dich đã pha loãng ở cả 3 nồng độ pha loãng 10, 100, 1000 lần trải đều trên mặt các đĩa petri. + Sau 2 – 3 ngày xuất hiện khuẩn lạc. Quan sát và chọn các khuẩn lạc có hình dạng tròn, nhẵn bóng, lồi lên, màu vàng chanh nổi trên bề mặt thạch. Dùng que cấy vô trùng tách 4 đơn khuẩn lạc riêng rẽ ra 1 đĩa môi trường, cấy theo đường ziczăc. Sau đó cho vào tủ định ôn ở nhiệt độ 25.5oC khoảng 1-2 ngày. Nuôi cấy và được bảo quản trong môi trường Skim milk - Môi trường bảo quản vi khuẩn: Các mẫu vi khuẩn sau phân lập được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ là – 80oC trong môi trường Skim milk. Thành phần môi trường Skim milk: + Skim-milk:10 g + L-glutamic:1.5 g + Nước cất :100ml 3.5.2. Sử dụng PCR để xác định chính xác vi khuẩn Xoo Trong một vết bệnh bạc lá đang phát triển, bên cạnh vi khuẩn Xoo có thể tồn tại nhiều loại vi khuẩn khác. Những loại vi khuẩn này có thể cũng có khả năng tạo khuẩn lạc màu vàng, nhẵn bóng giống như vi khuẩn Xoo khi nuôi cấy, do đó khi phân lập chúng ta khó có thể phân biệt được chúng. Chúng tôi đã tiến hành phương pháp sử dụng PCR được đề xuất bởi Adachi, 1990 để nhận biết các vi khuẩn Xoo dựa trên trình tự bảo thủ giữa 2 đoạn tổng hợp rDNA 16s và 23s của chúng. Đầu tiên, chúng tôi sử dụng dung dịch protease K để tiến hành chiết tách DNA tổng số của các mẫu vi khuẩn đã phân lập. Sau khi đã kiểm tra kết quả chiết tách trên gel agarose 1%, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi XOR-R2, XOR-F với thành phần phản ứng PCR và chu kì nhiệt độ thích hợp. Sản phẩm PCR được điện di và so sánh kích thước với DNA ladder 1kb để đưa ra kết luận cuối cùng. - Chiết tách DNA tổng số của vi khuẩn Xoo + Hòa tan 1-2 vòng que cấy vi khuẩn trong 200µl hỗn hợp dung dịch Protease K và giữ ở 56oC trong 15 phút. + Đột ngột tăng nhiệt độ lên 800C trong 15 phút để làm biến tính Protease K sau đó ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút + Cuối cùng hút lớp dịch lỏng phía trên (DNA) và loại bỏ phần cặn phía dưới sang một ống eppendoff mới và bảo quản ở 4oC. - Điện di kiểm tra kết quả chiết tách: + Tiến hành điện di điện di sản phẩm chiết tách trên gel agarose 1%, sử dụng nguồn điện 1 chiều có U = 65V, trong khoảng 45 à 60 phút. + Nhuộm bản gel trong dung dịch ethilium bromide và kiểm tra kết quả trong buồng chụp UV. Những mẫu chiết tách thành công sẽ xuất hiện vạch màu sang, rõ nét trên bản gel. - Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi XOR-R2, XOR-F: + Các mẫu DNA chiết tách thành công sẽ được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR. Cặp mồi sử dụng: Tên mồi Trình tự mồi XOR – R2 5’ – CTCGGAGCTATATGCCGTGC – 3’ XOR – F 5’ – GCATGACGTCATCGTCCTGT – 3’ + Thành phần phản ứng PCR: 1x Taq buffer; 2.5 mM MgCl2; 0.2 mM dNTPs; 0.2 µM Primer XOR – R2 và Primer XOR – F; 1.25U Taq DNA polymerase; 2 µl DNA khuôn còn lại là water PCR, tổng cộng là 25µl. + Tiến hành chạy PCR theo chu trình nhiệt: nâng lên 94oC trong 30s, hoàn thành 30 chu kì với 94oC trong 1 phút – 60oC trong 30s – 72oC trong 1 phút, sau đó giữ ở 72oC trong 7 phút và cuối cùng là bảo quản sản phẩm PCR ở 4oC. - Điện di kiểm tra kết quả PCR: + Tiến hành điện di điện di sản phẩm PCR có kèm DNA ladder 1Kb để so sánh kích thước trên gel agarose 2%, sử dụng nguồn điện 1 chiều có U = 80V, trong khoảng 60 à 90 phút. + Nhuộm bản gel trong dung dịch ethilium bromide và kiểm tra kết quả trong buồng chụp UV. Những mẫu chính xác là vi khuẩn Xoo sẽ cho hiện 1 vạch băng sáng có kích thước 470 bp trên bản gel. Những mẫu không phải là Xoo sẽ không cho hiện vạch băng hoặc vạch băng không đúng kích thước. 3.5.3. Xác định đa dạng di truyền DNA của các mẫu vi khuẩn Xoo bằng pháp rep PCR và IS-PCR - Phương pháp rep-PCR (repetitive sequence-based PCR): + Theo Tika B. Adhikari và cộng sự,1999 rep-PCR là phương pháp sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên sự đa hình về các trình tự lặp lại trong bộ genome của vi khuẩn nghiên cứu, những trình tự này là bảo thủ giữa các chủng vi khuẩn nên có thể sử dụng chúng để nghiên cứu sự đa dạng của các chủng trong cùng một loài. Sử dụng mồi đơn ERIC2F (Vera Cruz, 2003) và mồi BOXA1RF (Adhikari, 1999) với trình tự như sau: Tên mồi Trình tự ERIC2F 5’ – AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG – 3’ BOXA1RF 5’- CTACGGCAAGGCGACGCTGACG - 3’ + Thành phần phản ứng PCR : : 1x Taq buffer; 1.5 mM MgCl2; 0.2 mM dNTPs; 0.2 µM primer ERIC2F ( và primer BOXA1RF); 1.25U Taq DNA polymerase; 2 µl DNA tempale solution còn lại là water PCR, tổng cộng là 25µl. + Chu trình nhiệt độ trong PCR: nâng lên 95oC trong 7phút, hoàn thành 35 chu kì với 94oC trong 1 phút – 48oC (với ERIC2F) và 53oC (với mồi BOXA1RF) trong 2 phút – 72oC trong 1 phút, sau đó giữ ở 72oC trong 7 phút và cuối cùng là bảo quản ở 4oC. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%. Số đoạn băng nhân lên của từng mẫu được thống kê dưới dạng nhị thức và sử dụng phần mềm NTSYSpc2.0 để phân tích, đánh giá sự đa dạng của các mẫu vi khuẩn. - Phương pháp IS-PCR (insertiton sequence-based PCR) + Cũng theo nghiên cứu của Adhikari, 1999 thì trong bộ genome của vi khuẩn Xoo có nhiều nhóm các trình tự chèn với kích thước, số lượng khác nhau. Ông đã chỉ ra rằng 2 trình tự IS1112 và IS1113 sẽ thể hiện tốt nhất sự đa dạng giữa các chủng Xoo. Sử dụng kỹ thuật IS-PCR với mồi đơn J3F [5’ – GCTCAGGTCAGGTCGCCTGG – 3’] cho phép nghiên cứu 2 trình tự đó. + Thành phần phản ứng PCR: 1x Taq buffer; 1.5 mM MgCl2; 0.2 mM dNTPs; 0.2 µM primer J3F; 1.25U Taq DNA polymerase; 2 µl DNA tempale solution còn lại là water PCR, tổng cộng là 25µl. + Chu trình nhiệt độ trong PCR: nâng lên 95oC trong 7phút, hoàn thành 30 chu kì tại 94oC trong 1 phút – 48oC trong 2 phút – 72oC trong 1 phút, sau đó giữ ở 72oC trong 7 phút và cuối cùng là bảo quản ở 4oC. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%. Số đoạn băng nhân lên của từng mẫu cũng được thống kê dưới dạng nhị thức và sử dụng phần mềm NTSYSpc2.0 để phân tích, đánh giá sự đa dạng của các mẫu vi khuẩn. 3.5.4. Nghiên cứu đa hình các mẫu vi khuẩn bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo Phương pháp tiến hành theo đề xuất của Taura và cộng sự, 2000: - Chọn thời điểm lây nhiễm: Lây nhiễm lúc trên mặt lá lúa không đọng sương hay nước mưa, thời tiết thoáng mát, khô ráo. Đảm bảo sau khi lây nhiễm ít nhất 3h trời không mưa to. Tiến hành lây nhiễm vào cuối của giai đoạn đẻ nhánh đến giai đoạn lúa bắt đầu phân hóa đòng. - Cách thức tiến hành lây nhiễm: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Wakimoto trong khoảng từ 72 – 96 tiếng (3 - 4 ngày). Trộn đều 4 que cấy vi khuẩn trong 10ml nước cất đã được hấp khử trùng, sau đó dùng kéo đã được rửa sạch bằng cồn và hấp khử trùng ở 121oC; 1,5atm; 20’ tiến hành lây nhiễm. Mỗi mẫu vi khuẩn dùng một kéo khác nhau. Cắt 2–3 cm đầu lá, cắt ít nhất 5/mẫu vi khuẩn/dòng đẳng đơn gen. - Kiểm tra kết quả lây nhiễm: Sau 18 ngày kể từ ngày lây nhiễm, tiến hành đo chiều dài vết. Dùng thước đo chiều dài vết bệnh tính từ vết cắt lây nhiễm cho đến vị trí giữa vết chết hoại và vết lan. Ghi chép số liệu, xử lí số liệu, lập bảng kháng nhiễm và phân tích sự đa hình các mẫu vi khuẩn cần phân lập dựa vào bảng kháng nhiễm theo chương trình NTSYSpc2.0. 3.5.5. Cách thức phân tích số liệu Số liệu được phân tích, đánh giá bằng phần mềm NTSYSpc2.0, xây dựng theo công thức tính hệ số đồng dạng di truyền của M.Nei và Li, 1979: Sij = 2Nij/(Ni + Nj) Trong đó: Ni: vạch của giống i Nj: vạch của giống j Nij: vạch chung của hai giống i và j. Kết quả số vạch nhân lên trong rep-PCR, IS-PCR sẽ được chuyển sang dạng nhị thức. Cách đánh giá: có vạch = 1, không có vạch = 0. Sử dụng phần mềm NTSYSpc2.0 sẽ thu được hệ số tương đồng giữa các mẫu vi khuẩn, xây dựng được cây phân loại và xác định được hệ số tương đồng có ý nghĩa (kí hiệu r) để phân loại các mẫu vi khuẩn vào các chủng khác nhau. Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập và Nuôi cấy các mẫu vi khuẩn Chúng tôi đã nuôi cấy thành công 20/20 mẫu vi khuẩn trên môi trường nhân tạo Wakimoto. Sau 2 ngày nuôi cấy, các mẫu vi khuẩn đều tạo khuẩn lạc màu vàng, nhẵn, bóng, ăn lan 2/3 diện tích bề mặt môi trường nuôi cấy đặc nghiêng. Sau khi phân lập, các mẫu vi khuẩn được cấy chuyển sang ống nghiệm để bảo quản mẫu phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo. Hình 7. Các mẫu vi khuẩn được nuôi cấy trong ống nghiệm Như vậy có thể khằng định mẫu vi khuẩn bảo quản tại phòng thí nghiệm vẫn có khả năng sống tốt và phương pháp dùng môi trường Wakimoto là phù hợp với nuôi cấy vi khuẩn Xoo. 4.2. Sử dụng PCR để xác định chính xác vi khuẩn Xoo. - Kết quả chiết tách DNA: chúng tôi đã tiến hành chiết tách DNA tổng số đối với tất cả 20 mẫu vi khuẩn Xoo, điện di kiểm tra sản phẩm chiết tách, kết quả các mẫu vi khuẩn đều cho hiện 1 vạch băng sáng, rõ nét trên bản gel agarose. Điều này chứng tỏ 20 mẫu vi khuẩn đều đã được chiết tách DNA thành công (Hình 8). Chúng tôi nhận thấy tiến hành chiết tách DNA theo phương pháp của N. Furuya và cộng sự, 2003 cho kết quả thành công cao khi áp dụng với vi khuẩn Xoo (thành công 20/20 mẫu vi khuẩn tiến hành chiết tách). - Kết quả xác định vi khuẩn Xoo bằngPCR: Những mẫu DNA đã được kiểm tra là chiết tách thành công sẽ được sử dụng tham gia vào phản ứng PCR với cặp mồi XOR-R2 và XOR-F để xác định chính xác vi khuẩn Xoo. Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 2% và sử dụng DNA ladder 1kb để so sánh kích thước, chúng tôi đã thu được 17/20 mẫu vi khuẩn (với mẫu DNA tương ứng) cho hiện vạch băng sáng, rõ nét có kích thước 470 bp trên bản gel, những mẫu còn lại không cho hiện vạch băng (Hình 9). Như vậy, đã xác định được chính xác 17/20 mẫu vi khuẩn nghiên cứu là vi khuẩn Xoo. Những mẫu này sẽ được tiếp tục sử dụng trong những nghiên cứu tiếp theo của đề tài, những mẫu không phải là vi khuẩn Xoo sẽ được loại bỏ. Hình 8. Kiểm tra ADN tổng số trên gel agarose 1%. Giếng 1-7 lần lượt là các mẫu 2, 4, 5, 8, 12, R1, R2 Hình 9. Xác định Xoo bằng PCR với mồi XOR. Giếng 1 : DNA ladder. Giếng 2 : R1 Giếng 3: R2 Giếng 4: mẫu 1 Giếng 5: mẫu 36 Giếng 6: mẫu 4 Giếng 7: mẫu 5 Giếng 8: mẫu 12 Trong hình 9, các mẫu R1, R2, 4, 5, 12 cho hiện vạch băng sáng, rõ nét kích thước 470 bp trên bản gel điện di chứng tỏ các mẫu này chính xác là vi khuẩn Xoo (kích thước được so sánh với DNA ladder ở giếng 1). Các mẫu 1 và mẫu 36 không cho hiện vạch băng có kích thước 470 bp nên chúng tôi kết luận không phải là vi khuẩn Xoo. Những mẫu này có thể là một loại vi khuẩn xanthomonas nào đó sống cộng sinh với vi khuẩn Xoo trong cùng vết bệnh hoặc thậm trí là các loài khác trong cùng họ vi khuẩn Xanthomonas như X. campestris pv. citri, pv, incanae và pv. zinniae. Bảng 6. Kết quả phân lập và xác định vi khuẩn bạc lá bằng kỹ thuật PCR STT Mẫu Phân lập Kiểm tra bằng PCR STT Mẫu Phân lập Kiểm tra bằng PCR 1 R1 + + 11 R12 + + 2 R2 + + 12 1 + - 3 R3 + + 13 2 + + 4 R5 + + 14 4 + + 5 R6 + + 15 5 + + 6 R7 + + 16 8 + + 7 R8 + + 17 12 + + 8 R9 + + 18 15 + + 9 R10 + + 19 36 + - 10 R11 + + 20 70 + - Chú thích: (+) Phân lập thành công hoặc kiểm tra PCR đúng là vi khuẩn Xoo (-) Phân lập không thành công hoặc kiểm tra PCR không phải là vi khuẩn Xoo. 4.3. Kết quả xác định đa dạng di truyền DNA của các mẫu vi khuẩn Xoo bằng phương pháp rep PCR và IS-PCR Chúng tôi đã tiến hành thực hiện phản ứng rep-PCR và IS-PCR đối với 17 mẫu vi khuẩn đã được kiểm tra chính xác là Xoo bằng kĩ thuật PCR. Khi nhuộm bản gel điện di và kiểm tra trong buồng chụp UV, chúng tôi đã thu được số vạch băng nhân lên khá cao đối với 3 mồi đơn ở cả 2 phương pháp nghiên cứu được trình bầy ở các hình 10, 11 và 12. + Rep-PCR nhân lên được 14 vạch băng có kích thước khác nhau với mồi ERIC2F và 12 vạch băng có kích thước khác nhau với mồi BOXA1RF. + IS-PCR nhân lên được 22 vạch băng có kích thước khác nhau với mồi J3F. Như vậy khi sử dụng 3 mồi với 2 phương pháp rep-PCR và IS-PCR chúng tôi đã nhân lên được tổng cộng 48 vạch với kích thước khác nhau hiện lên trên bản gel điện di tương ứng với 48 vùng gen khác nhau trên bộ genome của vi khuẩn Xoo. Mặt khác những vùng gen này lại phân bố rải rác khắp bộ genome của vi khuẩn Xoo do đó việc phân tích đa dạng các mẫu vi khuẩn đã phủ được một vùng DNA genom rộng lớn, đây có thể là cơ sỏ phân tử để xác định và phân nhóm các mẫu vi khuẩn một các chính xác hơn. R1 R2 R3 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 2 4 5 8 12 15 Hình 10. Ảnh điện di sản phẩm rep-PCR với mồi ERIC2F (12 vạch) R1 R2 R3 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 2 4 5 8 12 15 Hình 11. Ảnh điện di sản phẩm rep-PCR với mồi BOXA1RF (14 vạch) R1 R2 R3 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 2 4 5 8 12 15 Hình 12. Ảnh điện di sản phẩm IS-PCR với mồi J3F (22 vạch) Từ những kết quả điện di sản phẩm rep-PCR và IS-PCR, chúng tôi đã tiến hành thống kê số vạch nhân lên của từng mẫu vi khuẩn đối với từng loại mồi dưới dạng nhị thức. Kết quả được biểu diễn ở các bảng 1, 2 và 3 trong phần phụ lục bảng. Khi đã có được những thống kê trên, chúng tôi đã sử dụng phần mềm chuyên dụng NTSYSpc2.0 để xác định hệ số đồng dạng về mặt di truyền giữa các mẫu vi khẩn nghiên cứu (bảng 4, phần phụ lục bảng). Đồng thời chúng tôi cũng đã xây dựng được cây phân loại biểu diễn mỗi quan hệ về mặt di truyền giữa các mẫu vi khuẩn. (Hình 13). 0.95 Hình 13. Cây phân loại của mồi BOXA1RF, J3 và ERIC2F theo chương trình NTSYSpc2.0 Phần mềm NTSYSpc2.0 được xây dựng dựa trên công thức tính hệ số tương quan về mặt di truyền của M.Nei và Li, 1979. Phần mềm này cho phép chúng tôi xác định được hệ số tương đồng di truyền có ý nghĩa là r = 0,95 và trong đề tài này chúng tôi đã chọn hệ số tương đồng di truyền 0,95 để phân loại các mẫu vi khuẩn Xoo vào các nhóm chủng khác nhau. Từ cây phân loại với thước đo hệ số đồng dạng phía dưới, chúng tôi nhận thấy các mẫu R2 với R3; mẫu 5 và 15; mẫu R6 với các mẫu R7, R8 có hệ số đồng dạng về mặt di truyền cao ( > 0,95) nên chúng tôi đã xếp các mẫu vi khuẩn này thuộc vào cùng một nhóm chủng. Những mẫu còn lại có hệ số tương đồng di truyền < 0,95 sẽ được phân vào những nhóm chủng riêng biệt. Như vậy, bằng phương pháp rep-PCR và IS-PCR, từ 17 mẫu vi khuẩn nghiên cứu chúng tôi đã phân lập được 13 chủng khác nhau tại hệ số tương đồng có ý nghĩa về mặt di truyền là r = 0,95. Các nhóm đó là: - Nhóm 1: mẫu R1. - Nhóm 6: mẫu R6, R7, R8. - Nhóm 11:mẫu 2 - Nhóm 2: mẫu R2, R3. - Nhóm 7: mẫu 8. - Nhóm 12: mẫu 4 - Nhóm 3: mẫu R11. - Nhóm 8: mẫu R9. - Nhóm 13: mẫu 12 - Nhóm 4: mẫu R5, 15. - Nhóm 9: mẫu R12 - Nhóm 5: mẫu 10 - Nhóm 10: mẫu 5 4.4. Kết quả xác định đa dạng các mẫu vi khuẩn Xoo bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên các dòng đẳng đơn gen Quá trình bảo quản và cấy chuyển các mẫu vi khuẩn có thể làm cho hoạt tính của các mẫu vi khuẩn bị giảm hoặc mất đi. Điều này sẽ ảnh hưởng đến kết quả của phương pháp. Để kiểm nghiệm, chúng tôi đã tiến hành lây nhiễm các mẫu vi khuẩn trên cả giống đối chứng mẫn cảm IR24 và các dòng đẳng đơn gen. Những mẫu Xoo cho kết quả nhiễm với IR24 thì được xác định là độc tính vẫn ổn định. Kết quả lây nhiễm được biểu diễn ở bảng 5, phần phụ lục bảng. Với d (cm) là chiều dài trung bình của vết bệnh thì: d < 8 = kháng, kí hiệu R 8 < d < 12 = kháng TB hoặc nhiễm TB, kí hiệu M. d > 12 = nhiễm S Bảng 7. kết quả đánh giá lây nhiễm nhân tạo – phổ kháng nhiễm BB1 BB2 BB3 BB4 BB5 BB7 BB10 BB14 BB21 IR24 R 1 S S R S R R S S R S 4R/6S R 2 R R R R R R R R R S 9R/1S R 3 R R R R R R R R R S 9R/1S R 5 S M R S R R S M R S 4R/2M/4S R 6 S M M M R R M R R S 4R/4M/2S R 7 S S R M R R S S R S 4R/1M/5S R 8 S S R M R R S M R S 4R/2M/4S R 9 S S S S R S S S M S 1R/1M/8S R 10 S S R S R R S S R S 4R/6S R 11 S S S S R R S S R S 3R/7S R 12 R M R R R R S R R S 7R/1M/2S 2 S S R S R R S S R S 4R/6S 4 S R R R R R R R R S 8R/2S 5 S S R S R R S S R S 4R/6S 8 S S R R R R S S R S 5R/5S 12 R R R R R R R R R S 9R/1S 15 S S R S R R S S R S 4R/6S 4R/13S 4R/3M/10S 14R/1M/2S 6R/3M/8S 17R 16R/1S 4R/1M/12S 6R/2M/9S 16R/1M 17S Trong đó: S: Nhiễm M: kháng TB R: kháng Từ kết quả đánh giá ở phổ kháng nhiễm (bảng 7), chúng tôi nhận thấy: - Ba dòng đẳng đơn gen BB5, BB7, BB21 tương ứng chứa các gen kháng bạc lá xa5, Xa7, Xa21 cho kết quả kháng cao đối với các chủng vi khuẩn Xoo: + BB5 kháng được 17/17 chủng vi khuẩn nghiên cứu à kháng 100 %. + BB7 kháng được 16/17 chủng vi khuẩn nghiên cứu à kháng 94 %. + BB21 kháng được 16/17 chủng vi khuẩn nghiên cứu à kháng 94 %. - Dòng đẳng đơn gen BB14 tương ứng chứa gen kháng Xa14 cho kết quả kháng kém với các mẫu vi khuẩn Xoo. BB14 kháng được 8/17 mẫu vi khuẩn (trong đó kháng trung bình với 2 mẫu vi khuẩn) đạt tỉ lệ kháng là 47 %. - Các mẫu vi khuẩn nhiễm được nhiều dòng đẳng gen nhất là R9 và mẫu R11. + Mẫu R9 nhiễm được 7/9 dòng đẳng đơn gen, tỉ lệ nhiễm là 78 %. Nguồn gốc thu thập: trên giống IR 64 tại Thuận Châu, Sơn La. + Mẫu R11 nhiễm được 6/9 dòng đẳng đơn gen, tỉ lệ nhiễm 67%. Nguồn gốc thu thập: trên giống Nhị ưu – 838 tại Quỳnh Lưu, Nghệ An. NTSYSpc2.0 là phần mềm chuyên dụng trong việc phân tích đa dạng di truyền, thường được sử dụng trong những phương pháp đánh giá trên bộ genome như RFLP, RAPD,... Trong đề tài này, vì mục đích có được sự so sánh giữa 2 phương pháp nghiên cứu đa dạng: phương pháp lây nhiễm nhân tạo và phương pháp nghiên cứu với rep-PCR, IS-PCR chúng tôi đã sử dụng phần mềm này để phân tích đối với cả kết quả của phương pháp lây nhiễm nhân tạo. Để thuận tiện cho việc đánh giá đa dạng trên phần mềm NTSYSpc2.0, từ phổ kháng nhiễm chúng tôi đã tiến hành cho điểm như sau: Nhiễm và kháng trung bình (S và M) = 1; Kháng (R) = 0. Kết quả đánh giá dưới dạng nhị thức được thể hiện tại bảng 6, phần phụ lục bảng. Xử lí kết quả đánh giá này trên phần mềm NTSYSpc2.0, chúng tôi đã xác định được hệ số tương đồng giữa các mẫu vi khuẩn nghiên cứu (bảng 7, phần phụ lục bảng) và cũng xây dựng được cây phân loại biểu diễn mỗi quan hệ về mặt kiểu hình giữa các mẫu vi khuẩn. (Hình 14). 0.95 Hình 14. Cây phân loại theo phổ kháng nhiễm, phân tích bằng NTSYSpc2.0. Để tiến hành so sánh với kết quả phân loại của phương pháp phân tích đa dạng sử dụng rep-PCR và IS-PCR, chúng tôi đã chọn cùng hệ số tương đồng là 0,95 để có được sự đồng nhất trong tiến hành 2 phương pháp. Như vậy, bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên các dòng đẳng gen, chúng tôi đã phân lập 17 mẫu vi khuẩn Xoo nghiên cứu thành 8 nhóm khác nhau tại hệ số tương đồng là 0,95. Đó là các nhóm: - Nhóm 1: gồm các mẫu R1, R5, R7, R8, R10, 2, 5. - Nhóm 2: mẫu R11. - Nhóm 6: R2, R3, 12. - Nhóm 3: mẫu 8 - Nhóm 7: mẫu 4 - Nhóm 4: mẫu R6 - Nhóm 8: mẫu R12 - Nhóm 5: mẫu R9. 4.5. Kết quả so sánh 2 phương pháp nghiên cứu đa dạng các mẫu Xoo Khi so sánh ở cùng mức độ tương đồng là 0,95 chúng tôi nhận thấy: phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng rep-PCR và IS-PCR phân lập được nhiều chủng nhóm hơn (13 nhóm chủng so với 8 nhóm chủng theo phương pháp lây nhiễm nhân tạo). Điều này chứng tỏ mức độ phân lập của phương pháp này sâu hơn và chính xác hơn so với phương pháp lây nhiễm nhân tạo truyền thống. Lây nhiễm nhân tạo rep-PCR và IS-PCR Hình 15. So sánh cây phân loại của 2 phương pháp nghiên cứu ở cùng hệ số tương đồng là 0,95. Bên cạnh đó chúng tôi cũng thấy có nhiều sự khác biệt về kết quả các nhóm phân loại khi phân tích đa dạng Xoo bằng 2 phương pháp này: rep-PCR và IS-PCR Lây nhiễm nhân tạo - Nhóm 1: mẫu R1. - Nhóm 7: mẫu 8. - Nhóm 2: mẫu R2, R3. - Nhóm 8: mẫu R9. - Nhóm 3: mẫu R11. - Nhóm 9: mẫu R12 - Nhóm 4: mẫu R5, 15. - Nhóm 10: mẫu 5 - Nhóm 5: mẫu 10 - Nhóm 11:mẫu 2 - Nhóm 6: mẫu R6, R7, R8. - Nhóm 12: mẫu 4 - Nhóm 13: mẫu 12 - Nhóm 1: gồm các mẫu R1, R5, R7, R8, R10, 2, 5. - Nhóm 2: mẫu R11. - Nhóm 6: R2, R3, 12. - Nhóm 3: mẫu 8 - Nhóm 7: mẫu 4 - Nhóm 4: mẫu R6 - Nhóm 8: mẫu R12 - Nhóm 5: mẫu R9. Giải thích cho sự sai khác này, theo chúng tôi là có những nguyên nhân sau: - Thứ nhất, đó là do nguyên lý của 2 phương pháp khác nhau: Phương pháp lây nhiễm nhân tạo là phương pháp là nghiên cứu đa dạng về kiểu hình còn phương pháp sử dụng rep-PCR và IS-PCR lại là một phương pháp là nghiên cứu đa dạng kiểu gen. Để có sự đồng nhất giữa kiểu gen và kiểu hình thì còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kiểu gen, sự biểu hiện của kiểu gen, môi trường, sự tương tác giữa kiểu gen - môi trường. Đây cũng chính là những yếu tố có khả năng tạo nên sự sai khác giữa kết quả của 2 phương pháp. - Thứ hai, một lí do nữa là phương pháp lây nhiễm nhân tạo có nhược điểm là chịu nhiều ảnh hưởng của điều kiện môi trường do đó có thể dẫn đến những kết quả thiếu chính xác. Nhận xét: - Kết quả của phương pháp phân tích đa dạng bằng rep-PCR và IS-PCR có độ tin cậy cao hơn vì nó dựa trên các phân tích genome của vi khuẩn bạc lá, đặc biệt là các trình tự lặp lại và các trình tự chèn. Do đó có ý nghĩa hơn trong việc định loại các chủng vi khuẩn. - Tuy nhiên, kết quả phân tích phổ kháng nhiễm cũng mang ý nghĩa quan trọng đối với các nhà chọn tạo giống kháng bệnh bền vững vì độc tính của các chủng vi khuẩn Xoo mới là yếu tố được quan tâm nhất. Kết quả phân nhóm dựa trên phân tích đa dạng di truyền phân tử đối với 11 mẫu vi khuẩn (R1, R2, ....) có khác so với kết quả nghiên cứu của Phan Hữu Tôn và cộng sự, 2002. Chúng tôi đã xác định được trong 11 mẫu vi khuẩn phân lập có mẫu R2, R3 và R6, R7, R8 chia làm 2 nhóm có mức độ tương đồng di truyền > 0,95. Do đó chúng tôi đã xếp các mẫu này vào 2 nhóm khác nhau dựa theo kết quả nghiên cứu đa hình các trình tự lặp lại và trình tự chèn của chúng. 0.62 0.46 0.75 0.78 Hình 16. Cây phân loại của mồi BOXA1RF, J3 và ERIC2F theo chương trình NTSYSpc2.0 Dựa trên kết quả nghiên cứu đa hình các trình tự lặp lại và trình tự chèn (IS1112 và IS1113) trên bộ genome của Xoo, chúng tôi đã xác định được 4 mẫu vi khuẩn có hệ số sai di truyền khác > 0.5 (> 5%) đối với 11 chủng vi khuẩn đã được phân lập bởi Phan Hữu Tôn và cộng sự, 2002. Đó là các mẫu: - Mẫu 2: hệ số sai khác di truyền là 0.25 (25%). - Mẫu 4: hệ số sai khác di truyền là 0.38 (38%). - Mẫu 5: hệ số sai khác di truyền là 0.22 (22%). - Mẫu 12: hệ số sai khác di truyền là 0.54 (54%). Chúng tôi đã bổ xung 4 chủng vi khuẩn Xoo nêu trên và đề nghị những chủng này cần phải được nghiên cứu thêm. Đặc biệt là 2 chủng 2 và chủng 5 có độc tính khá cao (nhiễm 5/9 dòng đẳng đơn gen, tương đương 56%). Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Chúng tôi đã thu thập, nuôi cấy và phân lập thành công các mẫu vi khuẩn mới thu thập vụ mùa 2007 và các mẫu vi khuẩn theo Phan Hữu Tôn, 2002. - Đã xác định chính xác vi khuẩn Xoo ở các mẫu bằng môi trường chọn lọc đặc hiệu và kiểm tra bằng kỹ thuật PCR nhân đoạn gen đặc trưng cho Xoo - Sử dụng phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền bằng rep-PCR và IS-PCR, chúng tôi đã xác định và phân lập được từ 17 mẫu vi khuẩn Xoo ban đầu thành 13 nhóm vi khuẩn khác nhau ở hệ số tương đồng di truyền là 0,95: Nhóm Tên các chủng trong nhóm Nguồn gốc thu thập Nhóm 1 Mẫu R1: HAU - 01043 Hà Nội Nhóm 2 Mẫu R2: HAU 020361 Mẫu R3: HAU 020083 Thuận Châu, Sơn La Quỳnh Lưu, Nghệ An Nhóm 3 Mẫu R5: HAU 020131 Mẫu 15 Diễn Châu, Nghệ An Chí Linh, Hải Dương Nhóm 4 Mẫu R6: HAU 020346 Mẫu R7: HAU 020191 Mẫu R8: HAU 020201 Yên Bình, Yên Bái Bình Giang, Hải Dương Bình Giang, Hải Dương Nhóm 5 Mẫu R9: HAU 020371 Thuận Châu, Sơn La Nhóm 6 Mẫu R10: HAU 020321 Yên Bình, Yên Bái Nhóm 7 Mẫu R11: HAU 020081 Quỳnh Lưu, Nghệ An Nhóm 8 Mẫu R12: HAU 010081 Hải Dương Nhóm 9 Mẫu 2 Cổ Loa, Đông Anh, Hà Nội Nhóm 10 Mẫu 4 Sóc Sơn, Hà Nội Nhóm 11 Mẫu 5 Sóc Sơn, Hà Nội Nhóm 12 Mẫu 8 Sóc Sơn, Hà Nội Nhóm 13 Mẫu 12 Nam Sách, Hải Dương - Chúng tôi đã xây dựng được phổ kháng nhiễm và cây phân loại các chủng nghiên cứu với các dòng đẳng gen kháng bạc lá của 17 mẫu nghiên cứu. - Qua quá trình lẫy nhiễm nhân tạo, chúng tôi khẳng định lại ngoài gen Xa21 là một gen kháng ổn định đã được sử dụng rộng rãi thì còn có gen lặn xa5 và gen trội Xa7 cũng là 2 gen kháng hữu hiệu đối với hầu hết các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa ở miền Bắc Việt Nam. Điều này rất có ý nghĩa thực tiễn đối với các nhà chọn tạo giống lúa kháng bệnh bền vững tại miền Bắc Việt Nam. 5.2. Đề nghị - Ứng dụng phương pháp nghiên cứu đa dạng rep-PCR và IS-PCR với các vùng sinh thái khác nhau tại Việt Nam: miền duyên hải Trung bộ, vùng Đồng bằng sông Cửu Long,... - Đề nghị tiếp tục nghiên cứu bộ genome của vi khuẩn và vị trí bắt cặp của các primer trong rep-PCR và IS-PCR để tìm được mồi đặc hiệu nhằm phân lập tính độc của các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá tại Việt Nam. Phần 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 6.1. Tài liệu tiếng Việt. 1. Lê Lương Tề, 1980. Bệnh bạc lá ở vùng đồng bằng sông Hồng. Tuyển tập các công trình nghiên cứu KHKTNN, nxb NN, Hà Nội, tr. 184-197. 2. Lê Lương Tề, 1998. Các chủng sinh lý (race) của vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá lúa ở vùng Đông Nam Á. Tạp chí Bảo vệ thực vật, tr 41 – 42. 3. Bùi Trọng Thủy, Furuya, N., Taura, S., Yoshimura, A., Lê Lương Tề; Phan Hữu Tôn. 2007. Một số nhận xét về sự đa dạng của các nhóm nòi vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá lúa ở miền bắc Việt Nam (2001-2005). Tạp chí BVTV, ISSN 0868-2801, số 3(213)-2007. Trang 19-26 4. Bùi Trọng Thuỷ, Phan Hữu Tôn, 2004. Khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng chỉ thị ( Tester ) chứa đa gen kháng với một số chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá lúa phổ biến ở miền Bắc Việt Nam. 5. Hà Bích Thu, Ngô Vĩnh Viễn, Vũ Thị Hợi, Đinh Thị Thanh, Nguyễn Thị Thuý, 2002. Kết quả điều ta bệnh hại trên các giống lúa Trung Quốc 1993 – 1997. Hội thảo bệnh cây và sinh học phân tử 21-6-2002. 6. Nguyễn Công Khoái, 2002. Nghiên cứu bệnh bạc lá lúa (Xanthomonas oryzae. Pv. oryzae ) hại trên một số giống lúa lai, lúa thuần tại tỉnh Nam Định 2001 – 2002. Luận án thạc sĩ nông nghiệp. 8. Phan Hữu Tôn, 2004. Chiến lược chọn tạo giống lúa chống bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam. 9. Phan Hữu Tôn, 2005. Phân bố, đặc điểm gây bệnh các chủng vi khuẩn bệnh bạc lá lúa và phát hiện nguồn gen kháng bằng kĩ thuật PCR. Khoa học nông nghiệp và phát triển nông thôn 20 năm đổi mới, tập 1. 10. Phan Hữu Tôn, 2004. Nghiên cứu chỉ thị phân tử phục vụ chọn tạo giống lúa năng suất cao, chất lượng tốt, kháng bệnh bạc lá ở Đồng Bằng Bắc Bộ. Báo cáo hội thảo khoa học công nghệ quản lý nông học vì sự phát triển Nông nghiệp bền vững Việt Nam. 6.2. Tài liệu tiếng Anh. 1. A.C sanchez et al, 2000. Sequence Tagged site marker assistance selection for three Bacterial Blingt genes in rice. Crop science, vol 40, p792-797. 2. Devadath S, 1985. Managenment of bacterial blight and bacterial and bacterial leaf steak of rice. Central Raice Insuttute, Cuttack, Orrisa, Indica. 3. Fang C.T, Lin C.F, Chu C.L, Shu T.K, 1963. Studies on the dissease resistance of rice. Ibid.6, 107 – 112. 4. K.S Lee, S. Rasabandidth, E.R Angeles and G.S. Khush, 2003. Inheritance of Resistance to bacterial blight in 21 cultivars of rice. Phytopathology, Vol 193, No2. 5. Khush G.S, 1977. Disease and insect resistance in rice. Adv. Agron. 29: 268 – 341. 6. Kiryu T, Mizuta H, 1955. On the relation between habits of rice and resistance of bacterial leaf blight. Kyushu Agricultural reseach, 54- 56. 7. Mizukami T, Murayama y, 1960. Studies on the bacterial blight resistance of rice plant. Agricultural Bulletin, Saga University 11, 75 – 82. 8. Misawa T, Miyazaki E, 1972. Studies on the bacterial blight resistance of rice plant. Annals of the Phytopathological Society of Japan, 375 – 380. 9. Nakanishi K, Watanabe M, 1977. Studies on the mechanism of Resistance of rice plant aganst Xanthomonas oryzae. Annals of the Phytopathological Society of Japan 265 – 268, 449 – 454. 10. NiveditamNayak et al, 2002. Biological control of Bacterial leaf blight of rice by Bdellovibrio Bacterivorus – Plant – Disease – Research, 381 -383. 11. Nguyen Vinh Phuc, Nguyen Thi Lang, Bui Chi Buu, 2005. STS and microsatellite marker assisted selection for bacterial blight in rice, Oryzae sativa L. Omonrice No13, p18 - 25. 12. Reimers P.J, Leach J.E, 1991. Race – specific Resistance to Xanthomonas oryzae pv oryzae conferrend by bacterial blight resistance gene Xa10 in rice (Oryza sativa) involves accumulation of lignin – like substance in host tissuses. Physiol. Mol. Plant Pathol, 39 – 55. 13. Tika B. A dhikari, Anil Shrestha, Ram Chandra Basnnyat, T.W.Mew, 1999. Use of Partial host resistance in the management of Bacterial blingt of rice. Plant disease Vol 83, p896 – 901. 14. Tika B. A dhikari, Ram Chandra Basnnyat, T.W.Mew, 1999. Viruslence of Xanthomonas oryzae pv - Oryzae on rice lines containing single resistance genes and gene combination. Plant disease vol 83, p46 – 50. 15. Tika B. A dhikari, Ram Chandra Basnnyat, T.W.Mew, 1999. Viruslence of Xanthomonas oryzae pv. Oryzae on rice lines containing single resistance genes and gene combination. Plant disease vol 83, p46 – 50. 16. Wakimoto, 1955. Multipulication of OP1 phage (Xanthomonas oryzae bacteriophage). 1. One-step growth experiment under various condition. Sci. Bull. Fac. Agric. Kuyshu Univ. 15: 151-160 (in Japanese with English summary) 6.2. Tài liệu trên internet. 1. 2. 3. PHẦN PHỤ LỤC BẢNG Bảng 1. Số vạch nhân lên trong rep-PCR với mồi ERIC2F V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 V13 V14 R1 1 1  0  0  0  0  0  0  0  0 1  0  0  0 R2 1 1  0  0 1  0 1  0  0  0 1  0 1  0 R3 1 1  0  0 1  0 1  0  0  0 1  0 1 1 R5  0 1 1 1  0  0  0  0 1  0 1 1  0  0 R6  0 1 1 1  0  0  0  0 1  0 1 1  0  0 R7  0 1 1 1  0  0  0  0 1  0 1 1  0  0 R8  0 1 1 1  0  0  0  0 1  0 1 1  0  0 R9  0 1 1 1  0  0  0  0 1  0 1 1  0  0 R10  0 1 1 1  0  0  0  0 1  0 1 1  0  0 R11 1 1  0  0 1  0 1 1  0  0 1  0 1  0 R12  0 1 1 1  0  0  0  0 1  0 1 1  0  0 2 1 1  0  0  0  0  0  0 1  0 1  0  0  0 4  0  0  0 1  0  0  0  0 1  0 1 1  0  0 5 1 1 1 1  0  0  0  0 1  0 1 1  0  0 8  0 1 1 1  0  0  0  0 1  0 1 1  0  0 12  0 1  0  0 1 1 1  0  0 1  0  0  0  0 15  0 1 1 1  0  0  0  0 1  0 1 1  0  0 Kết quả số vạch nhân lên trong rep-PCR với mồi ERIC2F như sau: - Mẫu R1: 3/14 vạch - Mẫu R8: 6/14 vạch - Mẫu 4: 4/14 vạch - Mẫu R2: 6/14 vạch - Mẫu R9: 6/14 vạch - Mẫu 5: 7/14 vạch - Mẫu R3: 7/14 vạch - Mẫu R10: 6/14 vạch - Mẫu 8: 6/14 vạch - Mẫu R5: 6/14 vạch - Mẫu R11: 7/14 vạch - Mẫu 12 5/14 vạch - Mẫu R6: 6/14 vạch - Mẫu R12: 6/14 vạch - Mẫu 15: 6/14 vạch - Mẫu R7: 6/14 vạch - Mẫu 2: 4/14 vạch Bảng 2. Số vạch nhân lên trong rep-PCR với mồi BOXA1RF V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 R1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 R2  0 1 1 1 1 1 1 1  0  0 1 1 R3  0 1 1 1 1 1 1 1  0  0 1 1 R5 1 1 1 1 1 1 1 1  0  0 1 1 R6  0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 R7  0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 R8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 R9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 R10 1 1 1 1 1 1 1 1 1  0 1 1 R11  0 1 1 1 1 1 1 1 1  0 1 1 R12 1 1 1  0 1 1 1 1 1  0 1  0 2  0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4  0 0  1 1 0  0  1 1 0  0 1 1 5 1 1 1 1 1 1 1 1 0  0 1 1 8  0 1 1 1 1 1 1 1 1  0 1 1 12  0 1 1  0 1 1 1 1 0  0  0  0 15 1 1 1 1 1 1 1 1 1  0 1 1 Kết quả số vạch nhân lên trong rep-PCR với mồi BOXA1RF như sau: - Mẫu R1: 3/14 vạch - Mẫu R8: 6/14 vạch - Mẫu 4: 4/14 vạch - Mẫu R2: 6/14 vạch - Mẫu R9: 6/14 vạch - Mẫu 5: 7/14 vạch - Mẫu R3: 7/14 vạch - Mẫu R10: 6/14 vạch - Mẫu 8: 6/14 vạch - Mẫu R5: 6/14 vạch - Mẫu R11: 7/14 vạch - Mẫu 12 5/14 vạch - Mẫu R6: 6/14 vạch - Mẫu R12: 6/14 vạch - Mẫu 15: 6/14 vạch - Mẫu R7: 6/14 vạch - Mẫu 2: 4/14 vạch Bảng 3. Số vạch nhân lên trong IS-PCR với mồi J3F V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 V13 V14 V15 V16 V17 V18 V19 V20 V21 V22 R1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 R2 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 R3 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 R5 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 R6 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 R7 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 R8 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 R9 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 R10 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 R11 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 R12 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 2 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 5 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 8 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 15 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 Kết quả số vạch nhân lên trong IS-PCR với mồi J3F như sau: - Mẫu R1: 17/22 vạch - Mẫu R7: 16/22 vạch - Mẫu R12: 15/22 vạch - Mẫu 12: 2/22 vạch - Mẫu R2: 13/22 vạch - Mẫu R8: 16/22 vạch - Mẫu 2: 13/22 vạch - Mẫu 15: 15/22 vạch - Mẫu R3: 13/22 vạch - Mẫu R9: 16/22 vạch - Mẫu 4: 7/22 vạch - Mẫu R5: 16/22 vạch - Mẫu R10: 15/22 vạch - Mẫu 5: 11/22 vạch - Mẫu R6: 15/22 vạch - Mẫu R11: 9/22 vạch - Mẫu 8: 14/22 vạch Bảng 4. Hệ số tương đồng di truyền di truyền của các mẫu vi khuẩn R1 R2 R3 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 2 4 5 8 12 15 R1 R2 R3 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 2 4 5 8 12 15 1,00 0,83 1,00 0,81 0,97 1,00 0,83 0,66 0,64 1,00 0,75 0,66 0,64 0,91 1,00 0,77 0,68 0,66 0,89 0,97 1,00 0,79 0,66 0,64 0,91 0,95 0,97 1,00 0,70 0,58 0,56 0,83 0,87 0,89 0,91 1,00 0,75 0,62 0,60 0,91 0,91 0,89 0,91 0,91 1,00 0,66 0,83 0,81 0,54 0,58 0,56 0,54 0,50 0,58 1,00 0,66 0,54 0,52 0,83 0,83 0,81 0,83 0,87 0,91 0,50 1,00 0,70 0,70 0,68 0,70 0,79 0,77 0,75 0,75 0,75 0,66 0,75 1,00 0,54 0,58 0,56 0,62 0,62 0,60 0,58 0,62 0,66 0,54 0,66 0,66 1,00 0,70 0,62 0,60 0,79 0,75 0,72 0,75 0,83 0,83 0,54 0,83 0,75 0,75 1,00 0,75 0,70 0,68 0,91 0,95 0,93 0,91 0,83 0,91 0,62 0,83 0,79 0,66 0,79 1,00 0,47 0,60 0,58 0,39 0,39 0,37 0,35 0,35 0,39 0,60 0,43 0,47 0,52 0,47 0,43 1,00 0,79 0,66 0,64 0,95 0,95 0,93 0,95 0,87 0,95 0,58 0,87 0,75 0,62 0,79 0,95 0,39 1,00 Bảng 5. Chiều dài vết bệnh lây nhiễm nhân tạo trên các dòng đẳng đơn gen và IR24 (cm) Mẫu BB1 BB2 BB3 BB4 BB5 BB7 BB10 BB14 BB21 IR24 R1 18,84 15,52 0,26 17,76 2,88 4,20 19,10 16,24 4,06 19.94 R2 2,44 6,82 0,66 2,22 0,48 2,20 2,44 2,92 1,32 17.00 R3 3,92 3,02 0,24 2,60 1,38 1,22 2,32 3,38 1,32 16.75 R5 16,06 10,52 2,30 15,44 1,56 0,38 14,02 8,48 0,92 15.92 R6 13,78 11,42 10,8 11,86 1,12 0,86 8,64 7,04 0,98 18.90 R7 23,84 28,86 5,68 9,10 2,86 0,76 25,50 25,67 4,00 24.08 R8 18,28 18,36 1,94 11,58 1,48 2,80 13,08 9,98 1,68 12.20 R9 24,93 27,20 14,80 27,04 1,73 12,20 21,42 25,46 8,66 24.70 R10 14,36 21,46 6,20 19,08 0,46 0,52 20,00 17,76 1,20 17.22 R11 14,50 24,48 14,64 20,98 2,00 6,48 14,88 14,68 1,20 15.78 R12 7,08 10,38 0,34 7,44 0,34 0,92 13,30 3,76 2,34 15.28 2 24,02 21,75 0,68 20,28 1,64 1,56 23,16 19,32 1,44 14.75  4 12,46 2,20 1,28 2,60 0,44 1,06 2,78 2,98 1,50 15,26  5 26,14 19,80 3,58 18,94 1,24 0,60 25,98 16,36 1,48 19,88  8 26,06 23,94 0,60 1,90 0,36 0,14 21,36 17,88 0,58 20,34  12 3,30 5,13 0,54 1,00 0,16 0,14 6,36 1,82 4,70 13,78  15 19,68 21,4 0,92 15,52 1,66 0,94 17,10 23,38 1,32 19,20  Bảng 6. Kết quả đánh giá cho điểm từ phổ kháng nhiễm BB1 BB2 BB3 BB4 BB5 BB7 BB10 BB14 BB21 IR24 R 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 R 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 R 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 R 5 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 R 6 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 R 7 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 R 8 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 R 9 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 R 10 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 R 11 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 R 12 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 2 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 4 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 5 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 8 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 15 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 Bảng 7. Hệ số tương đồng giữa các mẫu vi khuẩn Xoo theo phổ kháng nhiễm R1 R2 R3 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 2 4 5 8 12 15 R1 R2 R3 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 2 4 5 8 12 15 1,00 0,50 1,00 0,50 1,00 1,00 1,00 0,50 0,50 1,00 0,80 0,50 0,50 0,80 1,00 1,00 0,50 0,50 1,00 0,80 1,00 1,00 0,50 0,50 1,00 0,80 1,00 1,00 0,70 0,20 0,20 0,70 0,70 0,70 0,70 1,00 1,00 0,50 0,50 1,00 0,80 1,00 1,00 0,70 1,00 0,90 0,40 0,40 0,90 0,90 0,90 0,90 0,80 0,90 1,00 0,70 0,80 0,80 0,70 0,70 0,70 0,70 0,40 0,70 0,60 1,00 1,00 0,50 0,50 1,00 0,80 1,00 1,00 0,70 1,00 0,90 0,70 1,00 0,60 0,90 0,90 0,60 0,60 0,60 0,60 0,30 0,60 0,50 0,70 0,60 1,00 1,00 0,50 0,50 1,00 0,80 1,00 1,00 0,70 1,00 0,90 0,70 1,00 0,60 1,00 0,90 0,60 0,60 0,90 0,70 0,90 0,90 0,60 0,90 0,80 0,80 0,90 0,70 0,90 1,00 0,50 1,00 1,00 0,50 0,50 0,50 0,50 0,20 0,50 0,40 0,80 0,50 0,90 0,50 0,60 1,00 1,00 0,50 0,50 1,00 0,80 1,00 1,00 0,70 1,00 0,90 0,70 1,00 0,60 1,00 0,90 0,50 1,00