Đề tài Nghiên cứu chế tạo kháng thể qua lòng đỏ trứng gà để phòng chống tiêu chảy và sưng phù đầu do E. coli ở lợn

Mở đầu Theo số liệu từ Tổng cục Thống kê năm 2008, cả nước có 26,7 triệu con lợn, sản lượng thịt lợn hơi đạt 2.771.000 tấn, chiếm tỷ lệ 73,9% tổng sản lượng thịt gia súc, gia cầm [20]. Ngành chăn nuôi lợn ở nước ta đã khẳng định được tầm quan trọng và đòi hỏi sự phát triển mạnh mẽ trong tương lai. Xuất phát từ nhu cầu ấy, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã đề ra kế hoạch đến năm 2010 phải đạt bình quân đầu người 35 kg thịt lợn hơi. Cả nước sẽ có 30 triệu con lợn với chất lượng đàn lợn thịt có tỷ lệ nạc cao đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu [20]. Tuy nhiên, việc phát triển đàn lợn cũng làm xuất hiện các loại bệnh, ảnh hưởng không nhỏ tới năng suất và hiệu quả chăn nuôi. Trở ngại lớn nhất hiện nay, đặc biệt trong các cơ sở chăn nuôi lợn sinh sản là bệnh tiêu chảy ở lợn từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi và phù đầu ở lợn từ 22 đến 60 ngày tuổi. Bệnh không chỉ phổ biến ở nước ta mà còn xuất hiện khắp thế giới, gây thiệt hại kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi lợn sinh sản. Bệnh xuất hiện lúc ồ ạt, lúc lẻ tẻ tùy thuộc vào thời tiết, khí hậu, điều kiện chăm sóc, quản lý. Tỷ lệ lợn mắc bệnh cao, từ 70 - 85%, có những nơi 100%, tỷ lệ chết tới 18 - 20% [3]. Đặc biệt, tại các trại chăn nuôi lợn tập trung, bệnh càng gây thiệt hại đáng kể [21]. Để chống lại bệnh do E. coli, các nhà chăn nuôi đã sử dụng nhiều phương thuốc, từ cổ truyền đông y đến các liệu pháp kháng sinh hiện đại, kể cả các phương pháp hoá sinh hay dinh dưỡng kỹ thuật cao, nhưng cũng chỉ khống chế được một phần. ở Việt Nam nhiều biện pháp áp dụng đã mang lại kết quả, trong đó tác dụng cao nhất là dùng thuốc kháng sinh. Mấy thập kỷ qua, thuốc kháng sinh đã giảm bớt đáng kể tổn thất do dịch bệnh. Tuy nhiên, các nhà khoa học trong nước khẳng định E. coli đã kháng thuốc với tỷ lệ cao và kháng nhiều loại thuốc kháng sinh khác nhau [8], [19]. Bên cạnh đó mặt trái của thuốc kháng sinh ngày càng lộ rõ, việc dùng thuốc kháng sinh kéo dài đã tiêu diệt cả vi khuẩn có lợi trong đường ruột. Hậu quả là lợn con còi cọc, chậm lớn, lông xù, thịt lợn bị tồn dư kháng sinh, ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ cộng đồng và giảm giá trị thịt lợn xuất khẩu. Xu hướng dùng các chế phẩm sinh học trong chăn nuôi là liệu pháp đúng đắn mà thế giới đang yêu cầu và phát triển. Không chỉ giới hạn trong mục đích phòng trị bệnh, nâng cao năng suất chăn nuôi, việc sử dụng chế phẩm sinh học còn có ý nghĩa quan trọng đối với môi trường và sức khoẻ cộng đồng vì nó tạo ra một nền sản xuất thực phẩm an toàn, đảm bảo sự ổn định trạng thái cân bằng của môi trường sinh thái. Muốn đạt được yêu cầu đó, việc nghiên cứu chế tạo các chế phẩm sinh học an toàn để phòng và chữa bệnh cho vật nuôi đang đòi hỏi cấp bách. Dựa trên cơ sở miễn dịch học và phản ứng kháng nguyên - kháng thể người ta đã sản xuất được nhiều loại kháng thể đặc hiệu từ huyết thanh động vật để chữa bệnh, nhưng giá thành cao, khi dùng dễ gây phản ứng huyết thanh nên ít được sử dụng rộng rãi. Gần đây người ta phát hiện ra rằng, khi gà được tiêm kháng nguyên, kháng thể ở máu được truyền sang lòng đỏ trứng tới 80%, đặc biệt là thành phần IgG. Kháng thể đặc hiệu chế từ lòng đỏ trứng gà được miễn dịch sẽ có nhiều ưu thế hơn hẳn so với kháng thể đặc hiệu chế từ huyết thanh động vật, vì khi ứng dụng vào sản xuất nó có thể sản xuất với số lượng lớn, giá thành sản xuất thấp, không phải giết động vật và khi dùng không xảy ra phản ứng phụ. Cho đến nay đã có nhiều công trình ở các nước như: Đức, Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc công bố về việc chế tạo và sử dụng kháng thể ở lòng đỏ để điều trị và phòng nhiều bệnh vật nuôi có hiệu quả cao. Qua gà, người ta đã thu được nhiều loại kháng thể chống lại các vi rút, vi khuẩn, độc tố, nọc rắn, các hoá chất... để dùng cho các xét nghiệm chẩn đoán y học [36]. Để có thể sớm tạo ra một loại thuốc phòng và chữa trị hiệu quả, an toàn bệnh tiêu chảy và sưng phù đầu do E. coli gây ra ở lợn, chúng tôi tiến hành đề tài: "Nghiên cứu chế tạo kháng thể qua lòng đỏ trứng gà để phòng chống tiêu chảy và sưng phù đầu do E. coli ở lợn", với hai mục tiêu sau: Phân lập, tuyển chọn và xác định các chủng E. coli gây bệnh điển hình có độc lực, có tính kháng nguyên mạnh để làm giống. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học đặc hiệu – kháng thể phòng và chữa bệnh tiêu chảy và sưng phù đầu của lợn do E. coli. Chương 1: Tổng Quan 1.1. Tình hình nghiên cứu về E. coli gây bệnh tiêu chảy và phù đầu ở lợn 1.1.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Hiện tượng vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) gây bệnh tiêu chảy và phù đầu ở lợn con đã có từ rất lâu và ngày càng phổ biến ở các trại chăn nuôi tập trung và trong nông hộ. Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, bệnh tiêu chảy và phù đầu ở lợn con đã được khống chế phần nào, nhưng việc loại trừ nó trong chăn nuôi thì hầu hết các nhà nghiên cứu đều cho rằng còn rất nhiều khó khăn không những ở nước ta mà còn ở cả các nước có trình độ khoa học tiên tiến trên thế giới [2], [5], [9]. Chính vì vậy mà nhiều nhà khoa học vẫn quan tâm nghiên cứu. Cù Hữu Phú và cs [13] đã phân lập được 60 chủng vi khuẩn E. coli ở lợn mắc bệnh tiêu chảy từ 35 ngày đến 4 tháng tuổi, trong đó có 42 chủng gây dung huyết. Lý Liên Khai [9] khi phân lập E. coli từ phân lợn con bị tiêu chảy và phân lợn con khỏe mạnh đã cho biết: Các chủng E. coli mang K88, K99 và 987P là nguyên nhân chính gây tiêu chảy cho lợn con từ 1 đến 2 tuần tuổi. Vi khuẩn E. coli thường xuyên cư trú trong ruột lợn và chúng chỉ gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi như: tác động stress làm giảm sức đề kháng của lợn, làm tăng số lượng vi khuẩn và sinh độc tố. Nguyễn Khả Ngự và cs [12] xác định khả năng dung huyết và kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn con trước và sau cai sữa bị phù đầu ở đồng bằng sông Cửu Long. Với 21 chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn chết, tác giả cho biết 100% số chủng ngưng kết với kháng huyết thanh K88, 40% gây dung huyết mạnh, các chủng này đều có khả năng kháng nhiều loại thuốc kháng sinh thông thường. Cũng nghiên cứu về khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy trên lợn, Bùi Thị Tho và cs [8] sau khi kiểm tra khả năng kháng thuốc kháng sinh của 183 chủng E. coli phân lập từ phân của lợn con bị phân trắng, đã nhận định: tính kháng thuốc của E. coli ở mỗi cơ sở có sự khác biệt rõ rệt tùy theo quá trình sử dụng và có sự khác biệt về chủng E. coli gây bệnh ở các lứa tuổi lợn khác nhau. Các chủng E. coli tạo khuẩn lạc dạng nhám có tính kháng thuốc cao hơn các chủng tạo khuẩn lạc trơn. Qua 20 năm kiểm tra tính kháng thuốc kháng sinh của E. coli phân lập từ lợn con bị bệnh phân trắng, các tác giả nhận thấy tính kháng thuốc của chúng đối với một số thuốc kháng sinh thường dùng tăng lên rất nhanh. Tỷ lệ các chủng kháng nhiều loại thuốc kháng sinh cũng phát triển nhanh, một số chủng đã kháng với hầu hết các loại thuốc thường dùng [8]. Đỗ Ngọc Thúy và cs [19] cho biết tỷ lệ kháng kháng sinh của 106 chủng E. coli được phân lập từ lợn con theo mẹ bị tiêu chảy có xu hướng kháng mạnh với các loại thuốc kháng sinh thường dùng để điều trị bệnh như amoxicillin, cloramphenicol, streptomycin. Đỗ Trung Cứ và cs [4] khi sử dụng chế phẩm Biosubtyl để phòng bệnh tiêu chảy cho lợn con đã làm giảm được 42% số lợn tiêu chảy ở lợn con giai đoạn từ 1 đến 60 ngày tuổi. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài Cox và cs [34] cho rằng, E. coli cộng sinh có mặt thường trực trong đường ruột của người và động vật, trong quá trình sống vi khuẩn có khả năng tiếp nhận các yếu tố gây bệnh như yếu tố bám dính (K88, K99), yếu tố dung huyết (Hly), yếu tố cạnh tranh (Colv), yếu tố kháng thuốc kháng sinh và độc tố đường ruột. Các yếu tố gây bệnh này không được di truyền qua ADN của nhiễm sắc thể mà được di truyền qua ADN nằm trên plasmid. Những yếu tố gây bệnh này giúp cho E coli bám dính vào tế bào nhung mao ruột non, xâm nhập vào thành ruột, phát triển với số lượng lớn. Sau đó vi khuẩn thực hiện quá trình gây bệnh bằng cách sản sinh độc tố, gây triệu chứng tiêu chảy, phá hủy tế bào niêm mạc ruột và tế bào nhung mao ruột non. Fairbrother và cs [37] khi nghiên cứu các yếu tố gây bệnh ở từng chủng E. coli phân lập được từ các thể bệnh khác nhau, đã đặt tên vi khuẩn theo những yếu tố gây bệnh mà chúng có khả năng sinh ra như: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC), Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), Verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) và Adherencia Enteropathogenic Escherichia coli (AEEC). E. coli gây bệnh tiêu chảy và phù đầu ở lợn con có mặt ở hầu hết các nước trên thế giới nên đã có nhiều tác giả nghiên cứu về chúng. Simon và cs [62] đã làm rõ vai trò của ba loại kháng nguyên bám dính K88 trong E. coli là K88ab, K88ac và K88ad và cho biết: các chủng E. coli sản sinh độc tố đường ruột (ETEC) mang những kháng nguyên bám dính này đều gây tiêu chảy nặng dẫn đến tử vong ở một số lợn con. Sự cảm nhiễm bệnh tiêu chảy và phù đầu ở lợn con có liên quan mật thiết đến khả năng bám dính của E. coli. Smith thông báo có hai loại độc tố là thành phần chính của Enterotoxin được tìm thấy ở các chủng E. coli gây bệnh tiêu chảy. Sự khác biệt của hai loại độc tố này nằm ở khả năng chịu nhiệt. Độc tố chịu nhiệt (Heat stable toxin -ST) chịu được nhiệt độ 1000C trong 15 phút, độc tố không chịu nhiệt (Heat labile toxin -LT) bị bất hoạt ở 600C trong vòng 15 phút [63]. Cùng với việc phân lập và nghiên cứu các yếu tố gây bệnh của E. coli, việc nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm phòng bệnh tiêu chảy ở lợn cũng đã được các nhà khoa học trên thế giới đặc biệt quan tâm. 1.2. Vi khuẩn Escherichia coli Trực khuẩn ruột già Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaceae. Trong các vi khuẩn đường ruột, E. coli là loài phổ biến nhất. E. coli còn có tên là Bacterium coli commune, Bacillus coli communis do Escherich phân lập năm 1885 từ phân trẻ em. E. coli thường xuất hiện rất sớm ở đường ruột người và động vật, ngay sau khi đẻ hai giờ và tồn tại cho đến khi vật chủ chết. Chúng thường định cư ở phần sau của ruột, ít khi gặp ở dạ dày hay ruột non. Trong nhiều trường hợp còn tìm thấy chúng ở niêm mạc của nhiều bộ phận khác trong cơ thể. Từ đường tiêu hóa, E. coli được thải theo phân ra môi trường ngoài. Việc tìm chỉ số E. coli ở môi trường giúp đánh giá môi trường đó tốt hay xấu về mặt vệ sinh [6], [18]. ở điều kiện bình thường, các chủng E. coli không gây bệnh, khi các điều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng, vệ sinh thú y kém, điều kiện ngoại cảnh bất lợi dẫn đến sức chống đỡ của con vật suy giảm thì E. coli trở nên độc và có khả năng gây bệnh [18]. 1.2.1. Đặc tính sinh vật hóa học của E. coli 1.2.1.1. Đặc tính hình thái E. coli là trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, kích thước 2-3 x 0,6 mm. Trên tiêu bản nhuộm Gram, vi khuẩn bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu, đứng tụ lại thành từng đám, đôi khi xếp 2 - 3 vi khuẩn thành một chuỗi dài. Trong môi trường nuôi cấy lâu ngày có khi thấy những trực khuẩn dài 4 - 8 mm. E. coli di động nhờ có lông ở xung quanh thân, nhưng khi nuôi cấy trong điều kiện bất lợi sẽ mất lông, không di động. Vi khuẩn không sinh bào tử, nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhày để nhuộm có thể thấy màng giáp, còn khi soi tươi sẽ không thấy được [39]. Dưới kính hiển vi điện tử, còn phát hiện được các pili, yếu tố bám dính của E. coli [18]. 1.2.1.2. Đặc tính nuôi cấy E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 5 - 400C, nhiệt độ thích hợp là 370C, pH thích hợp là 7,2 - 7,4, nhưng có thể phát triển được ở pH từ 5,5 – 8,0 [18]. E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản [13]. - Trên môi trường thạch thường: Sau khi nuôi cấy 370C/24 giờ, E. coli hình thành khuẩn lạc tròn ướt, bóng láng, màu tro nhạt, hơi lồi, đường kính 2-3 mm. Có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng nhày (mucous) và dạng nhám (rough). - Trong môi trường nước thịt: Sau khi nuôi cấy 370C/24 giờ, E. coli phát triển rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống đáy, đôi khi hình thành màng mỏng xám nhạt trên bề mặt môi trường, môi trường có mùi phân thối. - Trên môi trường thạch máu: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C hình thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu sáng, kích thước từ 1 -2 mm. Có khi gây dung huyết. - Trên môi trường thạch Mac Conkey: Sau khi nuôi cấy 24 giờ ở 370C hình thành khuẩn lạc màu đỏ cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhày, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường. - Trên môi trường Endo: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đỏ mận chín, có ánh kim hoặc không có ánh kim. - Trên môi trường EMB (Eosin Methyl Blue): Hình thành khuẩn lạc màu tím đen có ánh kim. Không mọc trên các môi trường lục Malachite và Miiller Kauffmann. Bị ức chế khi nuôi trong các môi trường Wilson Blair. 1.2.1.3. Đặc tính hóa sinh - Lên men sinh hơi các loại đường: E. coli có khả năng lên men sinh hơi các loại đường glucose, fructose, galactose, lactose, maniton, mannit, levulose, xylose, không lên men andonit và innozit, lên men không ổn định các loại đường dulciton, saccarose, salixin [18]. E. coli lên men sinh hơi nhanh đường lactose, còn Salmonella spp thì không có đặc tính này, đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt E. coli với Salmonella spp. - Các phản ứng khác: Sữa Đông sau 24 giờ đến 72 giờ ở 370C Genlatin Không tan chảy Indol + Catalase + Oxidase - Urease - Di động + MR + VP - H2S - 1.2.1.4. Sức đề kháng E. coli có sức đề kháng yếu, bị diệt ở nhiệt độ 550C trong 1 giờ hoặc 600C trong 30 phút, đun sôi 1000C thì chết ngay. Những chủng E. coli trong phân có xu hướng đề kháng với nhiệt cao hơn những chủng phân lập ở môi trường bên ngoài. ở môi trường bên ngoài các chủng E. coli gây bệnh có thể tồn tại đến 4 tháng. Các chất sát trùng như axit phenic 3%, clorua thủy ngân (HgCl2) 0,1%, formol 0,2% có thể diệt E. coli sau 5 phút. E. coli đề kháng với điều kiện khô và hun khói [18] . 1.2.2. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli E. coli được chia thành các nhóm huyết thanh (serogroup) và kiểu huyết thanh (serotype) khác nhau dựa theo cấu trúc kháng nguyên O, K, H và F. Theo phản ứng ngưng kết có 250 kiểu kháng nguyên O, 89 kháng nguyên K, 56 kháng nguyên H và một số kháng nguyên F [17], [25]. 1.2.2.1. Kháng nguyên O (Kháng nguyên thân - Ohne Hauch) Kháng nguyên O của E. coli có bản chất lipopolysaccharide, rất độc. Chỉ cần 1/20 mg kháng nguyên O đủ giết chết chuột bạch sau 24 giờ. Kháng nguyên O được coi như một yếu tố độc lực có thể tìm thấy ở thành tế bào vi khuẩn. Cấu trúc phân tử polysaccharide của kháng nguyên O gồm hai phần: phần polysaccharide nằm ngoài chứa nhóm hydro có chức năng tạo ra tính đặc trưng về serogroup. Phần polysaccharide ở bên trong không chứa nhóm hydro có chức năng phân biệt giữa các dạng khuẩn lạc: dạng S (Smooth), dạng R (Rough), dạng M (Mucous). Khi làm mất dần từng đơn vị đường của các chuỗi polisaccharide hoặc làm thay đổi vị trí ở các đơn vị này sẽ dẫn đến thay đổi độc lực của các vi khuẩn. Kháng nguyên O chịu được nhiệt, không bị phá hủy khi đun nóng ở 1000C trong 2 giờ. Dưới tác động của cồn, axít HCl nồng độ 1N vi khuẩn chịu được trong 20 giờ, nhưng lại bị phá hủy bởi formol 0,5%. Kháng nguyên O được cấu trúc bởi các phân tử lớn, thành phần các phân tử gồm có: + Polyosit: tạo ra tính đặc hiệu của kháng nguyên. + Protein: làm cho phức hợp có tính kháng nguyên. + Lipit: kết hợp với polyosit và là cơ sở của độc tính. Tất cả kháng nguyên O đều cư trú ở bề mặt, do đó nó liên hệ trực tiếp với hệ thống miễn dịch. Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết. Phản ứng ngưng kết kháng nguyên O tạo thành những hạt nhỏ, khi lắc rất khó tan. 1.2.2.2. Kháng nguyên H (kháng nguyên lông - Hauch) Kháng nguyên H là thành phần lông của vi khuẩn, có bản chất protein, rất kém bền vững so với kháng nguyên O. Kháng nguyên H không chịu nhiệt, bị phá hủy ở 600C trong 1 giờ. Bị cồn 50% và các enzym phân giải protein phá hủy. Kháng nguyên H tồn tại được khi xử lý bằng formol 0,5%. Kháng nguyên H khi gặp kháng thể H tương ứng sẽ tạo ra hiện tượng ngưng kết H, trong đó các vi khuẩn được ngưng kết lại với nhau nhờ các lông vì các kháng thể H khi cố định trên lông sẽ là cầu nối với các lông bên cạnh. Phản ứng xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O và các hạt ngưng kết cũng lớn hơn, giống như những cụm bông rất dễ tan khi lắc vì lông của vi khuẩn rất nhỏ và dễ đứt. Vi khuẩn di động khi tiếp xúc với kháng thể H tương ứng sẽ trở thành không di động. Kháng nguyên H của E. coli không có tính độc và cũng không có ý nghĩa trong đáp ứng miễn dịch phòng vệ nên ít được quan tâm nghiên cứu, nhưng nó có ý nghĩa rất lớn trong việc xác định tên vi khuẩn [51]. Các nhà khoa học đã dùng những chủng E. coli có lông và không có lông của cùng một serogroup O để gây cảm nhiễm cho chuột bằng đường miệng với lượng vi khuẩn bằng nhau. Kết quả cho thấy khả năng gây bệnh cho chuột thí nghiệm hoàn toàn giống nhau. Kháng nguyên H bảo vệ cho vi khuẩn khỏi bị tiêu diệt trong tế bào đại thực bào, từ đó giúp vi khuẩn sống lâu và tồn tại lâu hơn trong đại thực bào. 1.2.2.3. Kháng nguyên K (Kháng nguyên vỏ - Capsular) Kháng nguyên K còn được gọi là kháng nguyên vỏ (Capsular), chúng bao quanh tế bào vi khuẩn và có bản chất hóa học là polysaccharide. Kháng nguyên này ngăn cản sự ngưng kết của vi khuẩn trong huyết thanh "O" tương ứng. Khi đun nóng 100 - 1210C kháng nguyên sẽ mất tác dụng ngăn cản. Vai trò của kháng nguyên K chưa được thống nhất lắm. Có nhiều ý kiến cho rằng, nó không có ý nghĩa về độc lực của vi khuẩn, vì thấy độc lực của chủng E. coli có kháng nguyên K cũng giống độc lực của chủng không có kháng nguyên K [33]. Có ý kiến khác cho rằng, nó có ý nghĩa về độc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trước những yếu tố phòng vệ của vật chủ [47]. Tuy vậy, phần lớn các ý kiến đều thống nhất kháng nguyên K có hai nhiệm vụ sau: - Hỗ trợ trong phản ứng ngưng kết của kháng nguyên O nên thường ghi liền công thức serotype của vi khuẩn là Ox: Ky như E. coli O139: K88, O149: K88... - Tạo ra hàng rào bảo vệ cho cho vi khuẩn chống lại tác động của ngoại cảnh và hiện tượng thực bào, yếu tố phòng vệ của vật chủ. 1.2.2.4. Kháng nguyên F (Kháng nguyên Fimbriae- Kháng nguyên bám dính) Hầu hết các chủng E. coli gây bệnh đều sản sinh ra một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính. Các chủng không gây bệnh không có kháng nguyên bám dính. Kháng nguyên bám dính giúp vi khuẩn bám vào các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu mô ruột và trên lớp màng nhày, giúp vi khuẩn chống lại khả năng đào thải của nhu động ruột. Kháng nguyên bám dính của E. coli nằm trên cấu trúc pili (fimbriae), một cấu trúc ngắn thẳng, xuất phát từ một đĩa gốc trong màng nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn. Fimbriae có bản chất là protein mọc trên bề mặt tế bào vi khuẩn với số lượng từ 10 - 40 fimbriae trên một tế bào vi khuẩn. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử, chúng giống như một chiếc áo lông bao bọc xung quanh vi khuẩn. Fimbriae của vi E. coli khác lông ở chỗ cứng hơn, không lượn sóng và không liên quan đến chuyển động. Kháng nguyên bám dính được phân loại bởi phản ứng huyết thanh, thụ thể đặc hiệu hoặc bằng khả năng ngưng kết với hồng cầu của các loài động vật khác nhau và bằng phản ứng PCR [17], [51]. Kháng nguyên có chức năng bám dính đặc trưng của ETEC (Enterotoxigenic E. coli) gây bệnh cho lợn chủ yếu là F4 (K88); F6 (987P); F107 và đôi khi có cả F5 (K99). Kháng nguyên có chức năng bám dính của ETEC gây tiêu chảy nguyên phát ở trâu bò là F5 (K99) đôi khi thấy cả F4 (K88) với tỷ lệ ít hơn. E. coli gây bệnh cho trẻ em thường có kháng nguyên bám dính F41 [51], [67]. 1.3. Các yếu tố gây bệnh của E. coli 1.3.1. Yếu tố bám dính của E. coli Để gây bệnh, các chủng ETEC phải bám dính được lên tế bào biểu mô của ruột non. Quá trình bám dính được thực hiện qua ba giai đoạn: hấp thụ, gắn kết và bám dính. Hai quá trình trước được thực hiện nhờ các tác động vật lý, hóa học, bước bám dính được thực hiện bởi các sợi bám dính chuyên biệt (pili) trên bề mặt vi khuẩn đảm nhiệm, đó là quá trình liên kết giữa kháng nguyên tại yếu tố bám dính với các receptor tương ứng trên bề mặt của các tế bào biểu mô. Hầu hết các chủng ETEC đều có các yếu tố bám dính bao gồm: K88 (F4), K99 (F5), 987P (F6), F17, F18, F41, F42 và F165. Fimbriae là sự tập hợp của các đơn vị protein nhỏ, được sắp xếp thành những sợi dây nhỏ gắn vào tế bào và có tính miễn dịch cao. Các sợi bám dính và độc tố đường ruột của các chủng ETEC nhìn chung được di truyền bởi plasmid ngoại trừ F41 và F17 [51], [61], [67]. Về mặt hình thái học, những sợi fimbriae này là những phần protein gắn vào, có đoạn thẳng, có đoạn hơi cong hoặc xoắn, có nguồn gốc từ màng ngoài của các tế bào vi khuẩn. Chúng có khối lượng phân tử khác nhau, từ 15 - 25 KDa [51], [61]. Mặc dù các thuật ngữ fimbriae và pili trước kia được sử dụng như những từ đồng nghĩa, nhưng ngày nay thuật ngữ fimbriae được dùng để chỉ nhóm protein bề mặt gắn vào màng tế bào, trái lại pili lại dùng để chỉ một đặc tính hình thái chuyên biệt của fimbriae. Pili có cấu trúc cứng có đường kính từ 7 - 8 nm và có một lỗ ở trục (nhóm 1), trái lại fimbriae thì khá mảnh và linh hoạt với đường kính không ổn định từ 2 - 4 nm (nhóm 2). Có thể thấy rõ là F1 và F6 thuộc vào nhóm 1 có cấu trúc giống như pili, trái lại F4 và F5 thuộc nhóm thứ 2 có cấu trúc giống fimbriae [51]. Nhìn chung, các fimbriae bao gồm các đơn vị cấu trúc nhỏ được điều khiển và tập hợp dưới sự hoạt động của các gen cấu trúc, được gọi là sợi bám dính. ETEC gây bệnh tiêu chảy cho lợn thường mang các yếu tố bám dính sau đây: - F4 (K88) F4 hay còn gọi là K88 đầu tiên được mô tả bởi Orskov và cs (1961), là một kháng nguyên không chịu nhiệt, không được sản sinh ở nhiệt độ 180C. Theo nghiên cứu trước kia của Kauffman (1947) thì kháng nguyên bề mặt này được cho là kháng nguyên vỏ (K) có bản chất là polysacharide vì thế chúng được cho là K88. Các nghiên cứu sau này đã chỉ ra rằng K88 không phải là polysacharide mà có bản chất là protein, nó không phải là kháng nguyên vỏ như đã được xác nhận trước đây mà là fimbriae hay pili. Tuy nhiên, thuật ngữ này vẫn được dùng cho đến năm 1983 khi Orskov đề nghị sử dụng kháng nguyên F (fimbriae) thay cho kháng nguyên K (capsular). Bằng việc sử dụng các kháng huyết thanh đặc hiệu, Orskov và cs (1964) đã phân biệt được hai loại khác nhau của F4 là F4ab và F4ac. Vào năm 1979, loại thứ 3 được phát hiện bởi Guinee và Jansen được đặt tên là F4ad [17]. Rõ ràng là sợi F4 có chứa một vùng cố định hình thành loại "a" và các vùng khác nhau, hình thành loại "b", "c", "d". Về mặt hình thái, F4 có các cấu trúc khác nhau, từ mảnh, linh hoạt và kéo dài cho tới dạng cứng. Sự khác nhau này phần lớn phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy [61]. Thành phần chính của F4 đã được mô tả đầu tiên bởi Mooi và cs [54]. Phân tích F4 tinh khiết trong hỗn dịch gel dodecyl sulfate polyacrylamide cho thấy một dải protein đơn lẻ với khối lượng phân tử từ 23.500 đến 26.000 Da, tuỳ thuộc vào các loại F4 phân lập được [54]. F4 có hàng trăm các đơn vị protein nhỏ giống nhau, các đơn vị này tạo thành sợi fimbriae. Sợi F4 giúp cho vi khuẩn bám được vào thụ thể tương ứng của nó trên tế bào biểu mô của lông nhung ruột non từ đó vi khuẩn có thể xâm nhập, cố định và phát triển được ở thành ruột non. - F5 (K99) F5 trước kia được cho là kháng nguyên bám dính của E. coli chỉ gây bệnh ở bê, nghé và cừu. Tuy nhiên, hiện nay chúng cũng được tìm thấy với tỷ lệ thấp ở các chủng ETEC phân lập từ lợn tiêu chảy [46]. Sự sản sinh F5 phụ thuộc vào nhiều yếu tố của vi khuẩn như tốc độ sinh trưởng, pha sinh trưởng, nhiệt độ và alanine trong môi trường [51]. Các gen mã hóa cho sự tổng hợp K99 nằm trong ADN của plasmid. Plasmid này có khối lượng phân tử là 87,8 KDa [46]. - F6 (987P) F6 nằm trong số các fimbriae phát hiện thường xuyên nhất, nó được sản xuất bởi ETEC ở lợn. Fimbriae này đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh của ETEC nhờ việc gắn kết vi khuẩn với các tế bào biểu mô ruột và cải thiện sự bám dính ở màng nhầy để đưa lượng độc tố đường ruột tối đa đến vật chủ [49]. Cấu trúc F6 bao gồm sự sắp xếp xoắn ốc của 3 protein: đơn vị chính FaeA, đơn vị phụ FaeF và FaeG nằm ở đỉnh và các vị trí khác nhau dọc theo sợi fimbriae. Các protein này có vai trò gắn kết F6 với thụ thể glycoprotein [34], [35]. F6 của ETEC ở lợn có thể giúp vi khuẩn bám vào cả các thụ thể được cấu tạo bởi glycoprotein và glycolipid trên riềm bàn chải của các tế bào biểu mô ruột lợn [34]. - F41 Những nghiên cứu đầu tiên về K99 cho rằng, đây là kháng nguyên gồm 1 đơn vị, nhưng gần đây khi điện phân thấy rằng nó có 2 đơn vị nhỏ, 1 đi về cực dương và 1 đi về cực âm. Đơn vị đi về cực dương được cho là 1 fimbriae riêng biệt có tên là F41. Khối lượng phân tử của F41 là 30,5 KDa [33]. Các đặc điểm của F41 được thể hiện khác nhau phụ thuộc vào thành phần của môi trường nuôi cấy. F41 nguyên thể có cấu trúc sợi với đường kính là 3,2 nm [47]. ox và cs đã nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về khả năng mẫn cảm và sức đề kháng của lợn đối với E. coli có mang F41. Kết quả cho thấy các chủng có F41 bám vào lông nhung (với số lượng thấp) của 23 trong số 30 lợn được kiểm tra ở độ tuổi 4 đến 5 tuần. Ngoài ra, những lợn lớn tuổi hơn có sức đề kháng cao hơn với sự bám dính của các chủng E. coli có F41 do các thụ thể tương ứng với F41 bị giảm đi. - F17 F17 chủ yếu được phát hiện ở chủng E. coli gây tiêu chảy hay nhiễm trùng máu trên bò. Một vài nghiên cứu cũng cho thấy sự xuất hiện của F17 ở các chủng E. coli phân lập từ bò tiêu chảy ở Pháp và Bỉ (chiếm tới 46%) [57]. Các chủng E. coli có F17 được phân lập từ các chất trong ruột bò cũng được gọi là chủng ETEC, khi F41, F5 hoặc cả hai cùng xuất hiện ở trên bề mặt tế bào vi khuẩn. F17 cũng được tìm thấy ở các chủng E. coli gây tiêu chảy ở lợn [57]. - F18 F18 không làm ngưng kết hồng cầu, sản sinh rất ít khi vi khuẩn được nuôi cấy trong các môi trường thông thường [51]. F18 được chia làm hai loại là F18ab và F18ac [67]. Các nghiên cứu cho thấy rằng F18ab và F18ac khác nhau về mặt sinh học. F18ab ít thấy thể hiện ở trong điều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm. Chúng thường thấy cùng với việc sản xuất SLT-2e ở các chủng VTEC, trong khi F18ac thể hiện rất rõ ở cả trong thực tế và trong phòng thí nghiệm, chúng mang các đặc tính của các chủng ETEC. Một đặc điểm đáng chú ý ở F18ac là chúng không bám vào riềm bàn chải của lợn sơ sinh trong điều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm [67], cũng không tập trung ở lớp màng nhầy ruột của lợn con mới sinh. Điều này ngược với F5 và F6, chúng bám vào các tế bào biểu mô ruột. Khả năng bám này ở lợn con nhiều hơn so với lợn lớn. Lý do xác đáng để giải thích về việc tăng sự mẫn cảm với bám dính của F18ab và F18ac theo tuổi của lợn vẫn chưa được làm rõ, nhưng có thể là do sự tăng dần các thụ thể đặc hiệu ở lông nhung ruột của lợn từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi. Sự thiếu hụt các thụ thể của F18ab và F18ac ở lợn sơ sinh có thể giải thích cho lý do vì sao chỉ thấy các chủng VTEC và ETEC ở lợn cai sữa [61], [61]. 1.3.2. Yếu tố xâm nhập của E. coli Yếu tố xâm nhập của E. coli là một khái niệm đựơc dùng để chỉ quá trình chưa được hiểu rõ, nhờ quá trình này mà E. coli qua được hàng rào bảo vệ của lớp nhầy trên bề mặt niêm mạc để xâm nhập vào tế bào biểu mô, đồng thời sinh sản và phát triển trong lớp tế bào này. Trong khi đó những vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập, không thể qua được hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy hoặc khi qua được hàng rào này sẽ bị bắt bởi đại thực bào của tổ chức hạ niêm mạc [2], [6]. 1.3.3. Vai trò gây bệnh của các loại kháng nguyên Theo ý kiến của nhiều tác giả, mặc dù E. coli có nhiều loại kháng nguyên, trong đó có loại tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ, có loại không tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ nhưng đều tham gia vào quá trình gây bệnh bằng cách tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào vật chủ và tham gia vào quá trình kháng lại các yếu tố phòng vệ tự nhiên của vật chủ. Các kháng nguyên tham gia quá trình trên phải kể đến là kháng nguyên O, kháng nguyên K và kháng nguyên F [17]. 1.3.4. Yếu tố dung huyết (Hly) của E. coli Khi E. coli phát triển trong tổ chức cơ quan, sắt được cung cấp phụ thuộc vào chất siderofor do vi khuẩn sản sinh ra. Chất này có khả năng phân hủy sắt liên kết trong tổ chức vật chủ thông qua sự phá vỡ hồng cầu giải phóng sắt dưới dạng hợp chất HEM để vi khuẩn sử dụng. Sự phân hủy hồng cầu chủ yếu là do enzum heamolyzin của vi khuẩn tiết ra vì thế có thể coi nó là một yếu tố độc lực gây bệnh của vi khuẩn [16]. Khả năng dung huyết là yếu tố độc lực quan trọng của E. coli gây bệnh đường tiết niệu. E. coli phân lập từ cơ quan cảm nhiễm ngoài đường ruột thường có khả năng dung huyết cao hơn nhiều so với E. coli phân lập từ phân. Có 4 kiểu dung huyết của E. coli: a-haemolysin, b-haemolysin, g-haemolysin, e-haemolysin nhưng quan trọng nhất là kiểu a-haemolysin và b-haemolysin [16], [63]. Heamolyzin do E. coli sinh ra có thể gây chết chuột, phôi trứng, tế bào phôi gà, tế bào thận chuột và gây hoại tử da thỏ. Khối lượng phân tử của heamolyzin khoảng 300.000 Da, được cấu tạo chủ yếu từ protein, ngoài ra còn có hydratcacbon [63]. Theo Smith [63] E. coli gây bệnh cho lợn có khả năng sản sinh heamolyzin, thường thấy chủ yếu ở các serotgroup O như: O8, O138, O141, O147. Đa số E. coli gây bệnh đường ruột cho lợn con theo mẹ đều gây dung huyết, đặc tính này không bền vững khi nuôi cấy nhiều đời qua môi trường nhân tạo. 1.3.5. Yếu tố kháng khuẩn Colicin V của E. coli (ColV) Trong quá trình phát triển và cư trú ở đường ruột, E. coli phát triển và tồn tại cộng sinh với nhiều loại vi khuẩn đường ruột khác: Salmonella spp, Staphylococcus spp, Clostridium, Vibrio cholera. Để tạo điều kiện cho quá trình phát triển của mình và trở thành vi khuẩn chiếm ưu thế trong đường ruột, E. coli sản sinh ra chất kháng khuẩn có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác, được gọi là ColV. Vì vậy, yếu tố này cũng được coi là yếu tố độc lực của E. coli gây bệnh [5]. Khả năng sản sinh Colv của E. coli được di truyền qua plasmid, ColV plasmid được tìm thấy không chỉ ở E. coli gây bệnh mà còn tìm thấy ở các loại vi khuẩn đường ruột khác. Yếu tố ColV lần đầu tiên được tìm thấy năm 1936, nhưng ColV plasmid thì mới phân lập được trong thời gian gần đây. Người ta cho rằng việc di truyền ColV thường gắn liền với việc di truyền serotype O18:K9:H7. Nhiều tác giả cho ColV là một chất kháng sinh có hiệu quả, có thể tác dụng với tất cả các loại vi khuẩn đường ruột trừ vi khuẩn sinh ra nó. Họ mong muốn rằng trong thời gian tới ColV được sử dụng rộng rãi như một chất kháng sinh để ức chế hay tiêu diệt các loại vi khuẩn đường ruột khác. 1.3.6. Tính kháng thuốc kháng sinh của E. coli Để điều trị bệnh đường ruột người ta sử dụng nhiều loại thuốc kháng sinh, ngoài ra còn trộn chúng vào thức ăn với tỷ lệ thấp để phòng bệnh và kích thích tăng trọng. Vì vậy, khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn đường ruột nói chung và E. coli nói riêng đang ngày một tăng làm cho hiệu quả điều trị giảm, thậm chí nhiều loại thuốc kháng sinh còn bị vô hiệu hóa hoàn toàn. Phạm Khắc Hiếu và cs [8] đã tìm thấy chủng E. coli kháng lại 11 loại kháng sinh đồng thời chứng minh khả năng di truyền tính kháng thuốc giữa E. coli và Salmonella spp qua plasmid. Sở dĩ khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn nói chung và E. coli nói riêng tăng nhanh, lan rộng vì gen sản sinh yếu tố kháng thuốc kháng sinh nằm trong plasmid R (Resistance). Plasmid này có thể di truyền dọc và di truyền ngang cho tất cả quần thể vi khuẩn thích hợp [19]. Với những ý nghĩa trên, ngày nay việc nghiên cứu khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn không còn đơn thuần là việc lựa chọn thuốc kháng sinh mẫn cảm để điều trị bệnh do E. coli gây ra mà là nghiên cứu một yếu tố gây bệnh của vi khuẩn này. 1.3.7. Độc tố của E. coli E. coli bám dính, xâm nhập vào niêm mạc ruột và sản sinh ra các loại độc tố đường ruột. Các độc tố này làm thay đổi quá trình trao đổi nước và điện giải ở ruột non và dẫn tới tiêu chảy do dịch tiết ra quá nhiều ở ruột non, không được hấp thu lại ở ruột già [5], [9]. Sự sản sinh độc tố được xem là một yếu quan trọng của E. coli. Độc tố và yếu tố bám dính được coi là những yếu tố độc lực vô cùng quan trọng đã và đang được nhiều tác giả quan tâm và đề cập đến trong các nghiên cứu về E. coli. E. coli sản sinh nhiều loại độc tố: enterotoxin, verotoxin, neurotoxin. Mỗi loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra. - Nhóm độc tố đường ruột (Enterotoxin) Fairbrother và cs [37] cho biết độc tố đường ruột do E. coli tạo ra (ETEC) gây tiêu chảy trầm trọng cho lợn sơ sinh từ 1 - 4 ngày tuổi. E. coli xâm nhập vào tế bào biểu mô ruột bằng một hoặc nhiều yếu tố bám dính F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) và F41 rồi xâm nhập vào thành ruột. Tại đó chúng sản sinh ra độc tố đường ruột gồm hai loại: + Độc tố chịu nhiệt (Heat stable toxin - ST) Độc tố này chịu được nhiệt độ 1000C trong 15 phút. Độc tố ST được chia thành hai nhóm STa và STb dựa trên đặc tính sinh học và khả năng hòa tan trong methanol. STa là một protein không có tính kháng nguyên, có phân tử lượng gần 2.000 Da, STa kích thích sản sinh cGMP mức cao trong tế bào, ngăn trở hệ thống chuyển Na+ và Cl-, làm giảm khả năng hấp thu chất điện giải và nước ở ruột. STa thường thấy ở ETEC gây bệnh ở lợn dưới hai tuần tuổi và ở lợn lớn [39]. STb là một protein có tính kháng nguyên yếu, có phân tử lượng gần 5.000 Da, STb kích thích tiết dịch độc lập ở ruột, phương thức tác dụng của nó chưa được hiểu rõ. STb hoạt động ở ruột non lợn, nhưng không hoạt động ở ruột non chuột, bê và bị vô hoạt bởi trypsin. STb được tìm thấy ở 75% các chủng E. coli phân lập từ lợn con, 33% phân lập từ lợn lớn [39]. Vai trò của STb trong tiêu chảy chưa được biết đến, mặc dù ETEC sản sinh STb có thể kích thích gây tiêu chảy và làm teo lông nhung ruột ở lợn con trong điều kiện thực nghiệm [52]. Cả STa và STb đều có vai trò quan trọng trong việc gây tiêu chảy của các chủng E. coli gây bệnh ở bê, nghé, dê, cừu, lợn con và trẻ sơ sinh. + Độc tố không chịu nhiệt (Heat labile toxin - LT): Độc tố này bị bất hoạt ở nhiệt độ 600C trong vòng 15 phút. LT là độc tố phức tạp có khối lượng phân tử cao, gồm 5 nhóm trong đó nhóm B có thể gắn với thụ thể trên bề mặt tế bào biểu mô, còn nhóm A có hoạt tính sinh học cao. Nhóm A kích thích sản sinh cAMP ở mức cao trong tế bào, dẫn đến tăng tiết Cl-, Na+, HCO3- và nước vào trong ruột [56]. Sự tiết nước quá mức sẽ dẫn đến sự mất nước nặng và rối loạn trao đổi chất, có thể dẫn đến chết gia súc. LT cũng có hai nhóm phụ LT1 và LT2, chỉ có LT1 bị trung hòa bởi anticholerae toxin. LT được sinh ra bởi các chủng E. coli ở lợn thuộc nhóm phụ LT1, còn LT2 được sinh ra bởi ETEC phân lập từ lợn và người. LT là một trong những yếu tố quan trọng gây triệu chứng tiêu chảy [64]. Cả hai loại độc tố ST và LT đều bền vững ở nhiệt độ âm, thậm chí cả ở nhiệt độ âm 200C. Cơ chế tác động gây tiêu chảy của LT: tiểu phần B của phân tử LT gắn lên các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng tế bào biểu mô nhung mao ruột non, đoạn A1 được vận chuyển vào màng tế bào. Tại đây đoạn A1 tương tác với hệ thống enzym adenylate cyclase. Enzym này có ít nhất ba thành phần: phần thứ nhất đảm bảo chức năng chuyển ATP thành cAMP, phần thứ hai thực hiện chức năng enzym điều khiển GTP, phần thứ ba là thụ thể cho hormone. Trong điều kiện bình thường hệ thống trên hoạt động khi hormone gắn lên các thụ thể của hệ thống này, do vậy GTP được nối với điểm hoạt động của protein điều khiển adenylate cyclase, làm thành tổ hợp GTP và protein điều khiển. Khi GTP chuyển thành GDP bởi enzym GDP-ase, hệ thống này ở trạng thái không hoạt động. Đoạn A1 của LT là một adenylase diphosphate tranferase, chuyển ADP ribosom từ nicotinamide dinucleotile (NDA) đến protein điều khiển. ADP-ribosom vừa được chuyển đến ức chế GTP-ase dẫn đến mất chức năng kiểm soát hệ thống trên. Hiện tượng trên làm cho hệ thống adenylate cyclase thường xuyên hoạt động, gây tăng cAMP hơn mức bình thường dẫn đến bài xuất các ion Na+, Cl+ và nước từ tế bào vào xoang ruột gây hiện tượng tiêu chảy [64]. - Nhóm độc tố tế bào (Shiga /Verotoxin) Năm 1977, Konowalchuck và cs [50] đã phát hiện một loại độc tố hoạt động trong môi trường nuôi cấy tế bào Vero (do đó được đặt tên là độc tố tế bào Vero), được sinh ra bởi E. coli gây bệnh tiêu chảy ở người, tiêu chảy và bệnh phù đầu ở lợn con. Tác động gây bệnh ở tế bào của độc tố Vero rất khác so với tác động của độc tố đường ruột không chịu nhiệt cổ điển thuộc nhóm E. coli gây bệnh đường ruột (ETEC). Cũng trong năm đó, Konowalchuck và cs tìm thấy một số chủng E. coli, bao gồm cả chủng H30 ở người, có độc tố tế bào trong môi trường nuôi cấy tế bào Hela. Độc tố tế bào này được trung hòa bởi kháng thể đặc hiệu cho độc tố Shiga (Stx) của vi khuẩn gây bệnh lỵ, do đó nó còn được gọi là độc tố giống như Shiga (SLT). Sự phát hiện của các nhóm nghiên cứu khác nhau về các loại độc tố tế bào này đã đưa ra nhiều thuật ngữ tương đồng. Thuật ngữ độc tố Vero (VTs) hay độc tố giống như Shiga (SLTs) được sử dụng trong nhiều năm bởi các nhà nghiên cứu ở Canada và Anh, nhưng nhóm nghiên cứu ở Mỹ lại thường dùng thuật ngữ E. coli sản sinh độc tố Vero (VTEC) hay vi khuẩn E. coli sản sinh độc tố giống như Shiga, mặc dù chúng là những từ để chỉ một khái niệm như nhau. Stx được sản sinh bởi E. coli bao gồm 2 nhóm: Stx1 là nhóm độc tố giống như Stx của vi khuẩn gây bệnh lỵ và Stx2 là nhóm độc tố có liên hệ với Stx. Loại Stx1 được sản sinh từ chủng E. coli H19, H30, và 933 [31], [41]. Các loại độc tố khác nhau trong nhóm Stx1 chỉ khác nhau ở một axit amin và không gây khác biệt ở tính độc tố hay tính kháng nguyên. Stx2 được sản sinh bởi E. coli chủng 933 và E32511 [41], [51]. Độc tố Stx2e được sản sinh bởi E. coli chủng E57, S1191 và 412, độc tố này xuất hiện ở bệnh phù đầu của lợn sau cai sữa [51]. Các loại độc tố khác của Stx2 cũng được mô tả bởi Konowalchuck và cs [50] khi phát hiện ở chủng E. coli H.I.8 trên người. Nó có mối liên hệ gần với Stx2e hơn Stx2 và được đặt tên là Stx2ev sau loại gây bệnh phù đầu (Stx2va), hay (Stx2vh) sau loại gây bệnh ở người. Stx có cấu trúc đơn vị nhỏ A-B bao gồm một đơn vị A có kích thước khoảng 33 KDa và 5 đơn vị B, mỗi đơn vị có kích thước 7,5 KDa. Đơn vị A là phần hoạt hóa của độc tố, còn các đơn vị B gắn kết độc tố với thụ thể ở màng tế bào. Sự chuyên hóa của thụ thể dựa trên một vài axit amin ở đơn vị B [50]. - Độc tố Stx2e (Vt2e) Độc tố Shiga ở lợn là một loại trong nhóm độc tố Stx2 với một số khác biệt trong đặc tính sinh học. Stx1 và Stx2 gây độc cho các tế bào Hela. Stx2e kém độc hơn so với các loại độc tố Stx2 khác. Stx2e độc hơn đối với tế bào Vero, từ 10-100 lần so với tế bào Hela. Các quan sát này có liên quan tới lượng thụ thể chuyên biệt có mặt trên các loại tế bào [50]. Stx2e được mô tả là độc tố trong nhóm đồng hợp và với rất ít ngoại lệ là đặc hiệu trên lợn [55]. Ngoài Stx2e, các độc tố Stx khác (Stx1, Stx2) hiếm khi được phát hiện ở các chủng E. coli gây bệnh phù đầu [41]. Stx2e đóng vai trò quan trọng trong nguyên nhân gây bệnh và sự xuất hiện các triệu chứng của bệnh phù đầu. Sau khi tụ đám và phát triển ở ruột, E. coli sinh độc tố Shiga (STEC) sản sinh ra Stx2e, độc tố này đi qua tế bào biểu mô ruột vào máu. Từ đó Stx2e gắn kết với các thụ thể có mặt ở các tế bào màng trong của động mạch, các tiểu động mạch ở các mô và cơ quan khác nhau gây ra các tổn thương vi thể. Đó cũng là cơ sở của những tổn thương đại thể và triệu chứng lâm sàng. Triệu chứng cũng có thể thấy khi tiêm tĩnh mạch độc tố Stx2e tinh lọc [41]. E. coli sinh độc tố Shiga (STEC) cũng gây ra bệnh tiêu chảy cho lợn sau cai sữa, nhưng Stx2e không có vai trò trong việc xuất hiện tiêu chảy, đó là do các độc tố đường ruột cổ điển (STEC/ETEC) [31]. 1.4. Bệnh tiêu chảy và phù đầu ở lợn do E. coli gây ra 1.4.1. Bệnh tiêu chảy do E. coli ở lợn Bệnh tiêu chảy ở lợn con đã trở thành một bệnh gây thiệt hại lớn về mặt kinh tế. Nó có thể chia làm ba loại bệnh viêm ruột chính như: tiêu chảy ở lợn sơ sinh (một vài ngày đầu sau khi sinh), tiêu chảy ở lợn con theo mẹ (từ tuần đầu cho đến lúc cai sữa) và tiêu chảy ở lợn sau cai sữa. Có nhiều nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy ở lợn con bao gồm: virut gây viêm dạ dày ruột (Transmissible gastroenteritis virut-TGE), Rotavirut, Coccidia. Trong đó, E. coli là nguyên nhân quan trọng nhất trong bệnh tiêu chảy của lợn mới sinh và sau cai sữa [2], [6]. E. coli gây bệnh thường có khả năng sản sinh một hay nhiều yếu tố gây bệnh, ở những chủng E. coli không gây bệnh không tìm thấy những yếu tố này. 1.4.1.1. Mầm bệnh Tiêu chảy ở lợn con do E. coli thường thấy ở lợn từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi. Các chủng gây bệnh đều sản sinh độc tố đường ruột nên được gọi là ETEC (Enterotoxigenic E. coli). ETEC bám vào màng nhày ruột non của lợn con bằng một hay nhiều kháng nguyên bám dính F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) hoặc F41. Chúng phát triển ở tế bào biểu mô ruột non và sản xuất một hay nhiều loại độc tố đường ruột: STa (ST1), STb (ST2) hoặc LT. Nhiều tác giả cho rằng hầu hết các chủng ETEC gây bệnh tiêu chảy ở lợn con thuộc nhóm O149, O8, O147, O157 và sản sinh độc tố LT và STb [27], [40]. Ngoài ra, còn có các chủng ETEC thuộc các nhóm O8, O9, O64, O101 ngày càng tăng lên. Các chủng này có F5, F6 hoặc F41 và chủ yếu sản sinh độc tố STa, ít thấy sản sinh STb. Những chủng ETEC này gây bệnh chủ yếu ở lợn từ sơ sinh đến 6 ngày tuổi, ít thấy ở lợn lớn hơn. Trái lại ETEC có F4 thường phân lập được ở lợn từ sơ sinh đến cai sữa. 1.4.1.2. Dịch tễ học Sự xuất hiện của bệnh tiêu chảy do E. coli phụ thuộc vào sự tương tác giữa vi khuẩn gây bệnh với điều kiện môi trường và các yếu tố từ bản thân vật chủ. Chỉ có E. coli mang các yếu tố gây bệnh tăng sinh với số lượng lớn thì mới gây tiêu chảy. Lợn con khi mới sinh, trước khi bú mẹ đã tiếp xúc với môi trường bị ô nhiễm nặng ở chuồng đẻ, da của lợn mẹ và hệ vi sinh vật trong phân lợn mẹ. Do vậy, trong điều kiện vệ sinh kém hay trong chuồng đẻ dùng liên tục không có thời gian sát trùng và để trống chuồng thì sự lây nhiễm E. coli gây bệnh ở môi trường cao, khả năng bội nhiễm cao dẫn đến xuất hiện dịch tiêu chảy do E. coli ở lợn con. Sữa đầu có chứa kháng thể đặc hiệu IgA có thể ngăn ngừa sự bám dính của E. coli trong đường ruột của lợn con. Nếu lợn mẹ không tiếp xúc với E. coli gây bệnh trong môi trường, kháng thể đặc hiệu không có trong sữa đầu, lợn con sẽ rất mẫn cảm với mầm bệnh [11], [21]. 1.4.1.3. Triệu chứng Sự lây nhiễm E. coli thường gây ra tiêu chảy ở mức độ nặng nhẹ khác nhau phụ thuộc vào các yếu tố gây bệnh của E. coli, tuổi và khả năng miễn dịch của lợn con. Trong trường hợp nặng, triệu chứng lâm sàng là mất nước, rối loạn trao đổi chất và chết. Trong vài trường hợp, đặc biệt là ở lợn con, sự lây nhiễm rất nhanh và lợn chết trước khi xuất hiện tiêu chảy. Triệu chứng tiêu chảy ở lợn con có thể quan sát thấy đầu tiên lúc 2 - 3 giờ sau khi sinh và có thể thấy ở một vài lợn con hay toàn ổ. Lợn con của những lợn nái hậu bị thường có tỷ lệ nhiễm bệnh tiêu chảy cao hơn so với những lợn con của lợn nái đẻ ở những lứa sau. Phần lớn lợn con trong chuồng đều bị nhiễm bệnh và tỷ lệ chết rất cao trong vài ngày đầu sau khi sinh. Tiêu chảy có thể ở mức độ nhẹ, lợn không có biểu hiện mất nước hoặc tiêu chảy nặng với phân toàn nước. Phân lợn có màu khác nhau từ trắng sang nâu, phân có thể chảy tự do từ hậu môn xuống sàn và chỉ phát hiện thấy khi quan sát gần. Trong những ổ dịch nặng, một số lợn có thể nôn. Khối lượng cơ thể bị giảm sút 30 - 40% do mất nước. Cơ bụng hóp lại, lợn gầy, suy kiệt và xiêu vẹo, mắt trũng sâu, da tái xám và nhợt nhạt. Sự mất nước và giảm khối lượng cơ thể làm cho lợn bị suy sụp nhanh, những lợn con này thường chết. Trong trường hợp mãn tính hay bệnh ít nghiêm trọng, da quanh hậu môn và vùng háng có thể đỏ lên do tiếp xúc với phân kiềm tính, lợn ít bị mất nước và nếu được điều trị tích cực có thể khỏi bệnh. 1.4.1.4. Phòng bệnh Phòng bệnh tiêu chảy cho lợn con nên tập trung vào việc giảm số mầm bệnh E. coli trong môi trường bằng vệ sinh tốt, duy trì các điều kiện môi trường thích hợp và tạo miễn dịch ổn định. Một điều quan trọng là lợn được nuôi trong môi trường có nhiệt độ ổn định ở 32 - 340C đối với lợn con theo mẹ, 30 - 320C đối với lợn con cai sữa, lợn con được nuôi trong môi trường thông thoáng, không có rác bẩn, nền chuồng có độ dẫn nhiệt thấp. Lợn nái nên nuôi ở môi trường 220C, vì vậy trong chuồng lợn đẻ cần có ổ có nhiệt độ cao hơn cho lợn con [11]. Độ ẩm trong chuồng nuôi cũng ảnh hưởng không nhỏ tới bệnh tiêu chảy ở lợn con. Độ ẩm càng cao thì lợn con mắc tiêu chảy càng nhiều. Độ ẩm thích hợp cho lợn con được khuyến cáo là 70 - 85% [21]. Thiết kế chuồng đẻ cũng rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến vị trí thải phân của lợn nái. Khi chuồng quá dài, phân rải rác trong diện tích chuồng do đó làm tăng khả năng ô nhiễm. Tốt nhất là dùng cũi đẻ có thể điều chỉnh được, ngắn cho lợn cái hậu bị, dài hơn cho lợn nái. Chuồng đẻ thường cao trên mặt đất, nền chuồng bằng sàn nhựa để hổng có lỗ cho phân rơi xuống. Nuôi trong những ổ đẻ như vậy lợn con ít tiêu chảy hơn những ổ đẻ có nền chuồng bằng xi măng. Chuồng đẻ nên được rửa sạch và sát trùng giữa các lứa đẻ. Một hệ thống chuồng đẻ cùng vào cùng ra và được sát trùng toàn bộ chuồng đẻ giữa các đợt sẽ làm giảm mật độ của E. coli ở môi trường [22]. Khẩu phần ăn cho lợn có thể được điều chỉnh để làm giảm sự phát triển của E. coli trong ruột [66]. - Phòng bệnh bằng miễn dịch Khả năng miễn dịch chống bệnh tiêu chảy ở lợn con trước tiên được cung cấp thông qua sữa đầu của con mẹ, sau đó là sự đáp ứng miễn dịch tại ruột non. Những kháng thể đặc hiệu trong sữa đầu hoặc ở niêm mạc ruột ngăn cản sự bám dính của vi khuẩn vào các thụ thể trên tế bào biểu mô ruột non và trung hòa hoạt động của độc tố đường ruột, độc tố tế bào của E. coli. Sữa đầu của lợn nái có chứa hàm lượng kháng thể IgG cao và nó giảm rất nhanh trong quá trình tiết sữa, sau đó IgA trở thành globulin miễn dịch chính [1]. IgA bảo vệ ruột chống lại sự xâm nhập của E. coli. Hầu hết IgA, IgM và IgG trong sữa của lợn nái được sản xuất trong tuyến vú. Lợn con mới sinh bắt đầu tổng hợp kháng thể đặc hiệu và phát triển hệ miễn dịch ở ruột non trong tuần đầu tiên sau khi sinh [1], [30]. Trước hết IgM thịnh hành ở 2 - 3 tuần đầu, sau đó nó được thay thế bởi IgA, đây là một kháng thể quan trọng nhất ở trong ruột non. Do vậy, trong tuần đầu tiên sau khi sinh thì sữa đầu là nguồn miễn dịch bảo vệ chính cho lợn con [1]. 1.4.1.5. Điều trị Điều trị bệnh tiêu chảy do E. coli ở lợn con cần được tập trung vào việc loại bỏ các yếu tố gây bệnh, khắc phục những ảnh hưởng độc hại của chúng, bổ sung nước và điện giải đã mất và tạo môi trường sống tối ưu cho lợn. Các liệu pháp điều trị càng áp dụng nhanh, đồng bộ càng có hiệu quả. Để loại bỏ nguyên nhân gây bệnh, trước tiên cần sử dụng thuốc kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng để điều trị, đến khi biết được kết quả của kháng sinh đồ thì dùng thuốc có độ mẫn cảm mạnh với E. coli để điều trị. Liệu pháp bổ sung dung dịch điện giải có đường glucose để chống mất nước và rối loạn điện giải đem lại hiệu quả cao trong điều trị bệnh tiêu chảy. Một số thuốc cản trở sự tiết dịch do độc tố đường ruột có tác dụng tốt trong điều trị tiêu chảy. Việc sử dụng các loại thuốc chống tiết dịch như bencetimide và loperamide đơn thuần hay kết hợp với thuốc kháng khuẩn cũng đã được khuyến cáo sử dụng [22]. 1.4.2. Bệnh phù đầu do E. coli gây ra ở lợn 1.4.2.1. Mầm bệnh Bệnh phù đầu (Edema Disease) là bệnh gây ra bởi E. coli mang yếu tố bám dính F18, F6, độc tố vero và khả năng dung huyết. Chúng sản xuất verotoxin đi vào máu và làm tổn thương thành mạch. Các khái niệm bệnh phù đầu, phù thũng, phù ruột được coi là một bệnh, bởi vì phù ở lớp dưới màng nhầy của dạ dày và ở giữa ruột kết đều là những đặc điểm nổi bật của bệnh. Bệnh phù đầu do các chủng E. coli gây ra hầu hết thuộc một số serotype rất hạn chế trong một vùng nào đó, những serotype này thường gắn với một số yếu tố bám dính và độc tố ổn định. Serotype O139 được tìm thấy trên khắp thế giới và có F18ab. Những chủng thuộc serotype này ở úc lại thường gây bệnh tiêu chảy ở lợn sau cai sữa. Trái lại, những chủng của nhóm này ở châu Âu thì thường gây bệnh phù đầu [139]. Loại F18 (trước kia gọi là F107, 2134P, 8813, Av24) và F4 (K88) được phát hiện với tỷ lệ tương ứng là 44% và 36% trong các chủng sản sinh độc tố. Trong khoảng 24% các chủng có F4 không phát hiện thấy các gen mã hóa cho những loại fimbriae đã biết khác. F6 (987P) thường có mặt cùng với F4 hoặc F18 [63]. 1.4.2.2. Dịch tễ học Nhóm tuổi bị nhiễm bệnh phù đầu phụ thuộc vào tuổi cai sữa. Lợn con chưa cai sữa cũng có thể bị mắc phù đầu và mức độ trầm trọng phụ thuộc vào kháng thể trong sữa của lợn mẹ. ở lợn trưởng thành, phù đầu thường là nguyên nhân của triệu chứng thần kinh và là nguyên nhân gây chết đáng kể [7]. Tỷ lệ nhiễm bệnh trong các đàn rất khác nhau, có thể lên tới 80%, nhưng trung bình là 30 - 40%. Với bệnh phù đầu, tỷ lệ chết từ 50 đến trên 90%. Thời gian bệnh kéo dài trong một đàn cũng khác nhau từ 4 - 14 ngày, trung bình là dưới 1 tuần. Bệnh biến mất cũng đột ngột như khi nó xuất hiện. Sự tái diễn cũng có thể xảy ra tại chuồng đó [7]. Môi trường ở chuồng cai sữa có thể là nguồn lây nhiễm các chủng E. coli gây bệnh phù đầu. Lợn chưa cai sữa có thể nhiễm trong chuồng đẻ và mang nó đến chuồng cai sữa. Thường xuyên rửa và sát trùng chuồng cũng chưa đủ để cắt đứt chu kỳ lưu truyền mầm bệnh [13]. Sự lan truyền của các chủng E. coli gây bệnh có thể qua đường không khí, thức ăn, phương tiện vận chuyển, qua lợn hoặc các dụng cụ chăn nuôi [14]. 1.4.2.3. Cơ chế gây bệnh Bước đầu tiên của quá trình gây bệnh phù đầu ở lợn con sau cai sữa cũng giống như ở lợn con theo mẹ, đó là sự bám dính và phát triển trong ruột non, sản sinh độc tố. Nhưng để có được sự bám dính, E. coli phải tập trung thành đám ở lớp màng nhầy của riềm bàn chải. Mức độ tập trung này quyết định liệu có gây ra bệnh hay không và phụ thuộc vào nhiều nhân tố, không chỉ dựa vào khả năng sinh sản của vi khuẩn. Vi khuẩn tập trung ở màng nhầy sẽ bám dính vào thụ thể nằm ở riềm bàn chải đặc thù cho từng loại kháng nguyên bám dính và không phải có ở tất cả các lợn. Sau khi bám dính, vi khuẩn xâm nhập vào lớp tế bào biểu mô rồi nhân lên, sản sinh độc tố đường ruột gây tiêu chảy. Từ lớp tế bào biểu mô E. coli xâm nhập vào hệ lâm ba, vào hệ tuần hoàn gây dung huyết, theo máu đến các cơ quan nội tạng, phát triển nhân lên phá hủy tế bào tổ chức, sản sinh verotoxin, neurotoxin làm tăng tính thấm thành mạch gây phù, tác động vào tế bào thần kinh gây các biểu hiện thần kinh [6]. 1.4.2.4. Triệu chứng Biểu hiện đầu tiên là biếng ăn, bệnh nặng trong một thời gian ngắn. Triệu chứng thần kinh xuất hiện vào ngày thứ 6 sau khi mắc bệnh. Sưng mí mắt cũng xuất hiện vào thời điểm đó. Liệt (mất chức năng điều khiển) kết hợp với rối loạn thần kinh thường thấy rất rõ. Những lợn bị bệnh thường nằm nghiêng sang một bên. Nhiệt độ cơ thể luôn trong giới hạn bình thường, ở một vài cá thể trước khi chết thân nhiệt có thể hạ xuống dưới mức bình thường [11], [27]. Bệnh phù đầu mãn tính cũng xuất hiện với tỷ lệ khác nhau (nhưng thường là thấp) từ những lợn mắc bệnh phù đầu cấp tính đã hồi phục. Bệnh xảy ra sau vài ngày đến vài tuần khi có viêm nhiễm ở ruột, sinh trưởng của lợn ngừng lại, những lợn ốm thường có những triệu chứng bất thường về thần kinh như đi vòng tròn, ngoẹo đầu hay liệt chân, phù dưới da rất ít thấy, những lợn bị nhiễm bệnh thế này thường bị chết [5]. 1.4.2.5. Phòng bệnh - Chọn những giống lợn có khả năng kháng bệnh Đây là một biện pháp phòng bệnh hữu hiệu và kinh tế nhất trong tương lai xa. Hiện tại, nếu lựa chọn những đàn giống theo hướng này vẫn chưa khả thi bởi các công cụ để xác định kiểu gen ở lợn khỏe vẫn chưa phổ biến. Phòng bệnh theo hướng này vẫn đang là thăm dò. Tránh lựa chọn các tính trạng không mong muốn có liên quan gần với loại mã hóa cho thụ thể của F4 và F18. - Hạn chế sự lây nhiễm Đặc tính lây lan của bệnh phù đầu đã rõ. ở Đan Mạch, hầu hết sự lây lan của bệnh phù đầu đều theo đường buôn bán, vận chuyển lợn. Giảm mật độ lợn ở các trại bị nhiễm bệnh và sát trùng toàn bộ chuồng nuôi, vệ sinh tiêu độc thường xuyên là biện pháp tốt làm cho chuồng nuôi giảm nguy cơ tiềm tàng mầm bệnh, nhưng cần chú ý E. coli có khả năng tồn tại rất lâu trong môi trường [14]. - Các liệu pháp miễn dịch Miễn dịch của cơ thể là sự bảo vệ tốt nhất chống lại sự bám dính và các tác động của độc tố. Lợn cai sữa có thể được bảo vệ nhờ miễn dịch chủ động hay bị động. + Miễn dịch bị động Cho lợn cai sữa ăn hàng ngày 525 ml sữa của lợn nái trong giai đoạn cuối của thời kỳ tiết sữa sẽ ngăn được sự bám dính của vi khuẩn, trong khi nếu cho lợn ăn một lượng tương tự sữa bò thì số lượng vi khuẩn ETEC sẽ tăng cao. Cho lợn ăn bột máu lợn sấy khô với liều 90g cho một lợn một ngày có tác dụng ngăn cản sự bám dính, tác động này chỉ kéo dài trong thời gian cho ăn bột máu [60]. Tác động ngăn cản sự bám dính cũng được cải thiện nếu dùng vacxin cho lợn mẹ [47]. Miễn dịch chống lại sự bám dính của E. coli có F4 và F18 cũng có thể có được bằng cách cho lợn ăn bột lòng đỏ trứng gà đã được tiêm phòng vacxin [47]. + Miễn dịch chủ động Miễn dịch chủ động chống lại sự gây bệnh bằng độc tố SLT-2e (Shiga like toxin- 2e) đã đạt được ở những lợn con tiêm phòng vacxin giải độc tố. Vacxin này được sản xuất từ độc tố SLT-2e đã qua xử lý bằng glucotaldehyde [15], [56]. Vacxin giải độc tố tương tự cũng đã được sử dụng cho lợn trước khi cai sữa 1 tuần tuổi. Vacxin cũng có tác dụng bảo hộ đáng kể chống lại phù đầu khi lợn bị gây nhiễm bằng chủng ETEC thuộc nhóm O139:K12. Tuy nhiên, hiệu quả của các vacxin này chưa cao, sự đáp ứng miễn dịch của lợn con với các loại vacxin này không cao [15]. - Liệu pháp hóa học Hiện tại, phòng bệnh bằng trộn thuốc vào thức ăn là liệu pháp chính đối với những cơ sở bị lây nhiễm ở hầu hết các nước trên thế giới, mặc dù có rất nhiều phản đối từ người tiêu dùng, nó có thể làm suy giảm miễn dịch và gây ra kháng thuốc. Các chủng E. coli phân lập từ bệnh phù đầu có tỷ lệ kháng thuốc cao nhất trong các chủng gây bệnh ở lợn. Thức ăn có chứa 2.400 - 3.000 ppm kẽm làm giảm tiêu chảy, giảm tỷ lệ chết và cải thiện sự tăng trưởng của lợn [43]. - Liệu pháp điều chỉnh khẩu phần ăn Hạn chế lượng thức ăn sử dụng, tăng khẩu phần có hàm lượng chất xơ cao hoặc cho ăn tự do chất xơ đã được coi là phương pháp hiệu quả hạn chế xuất hiện bệnh phù đầu [43]. Để phòng bệnh, giá trị dinh dưỡng của thức ăn có thể được giảm bớt nhờ tăng hàm lượng chất xơ lên 15- 20%, giảm protein thô và năng lượng tiêu hóa còn một nửa giá trị trong khẩu phần bình thường, cung cấp mức dinh dưỡng thấp chỉ đủ để duy trì tăng trọng hàng ngày nhỏ hơn 1% khối lượng cơ thể trong 2 tuần sau cai sữa. Những khẩu phần như vậy ngăn cản sự tụ bám của vi khuẩn và ngăn cản sự phát triển của E. coli [55]. Ngoài việc hạn chế cho ăn thức ăn giàu đạm, sinh năng lượng cao, có thể kết hợp cho ăn thêm một số sản phẩm có chứa men tiêu hóa để hạn chế phát triển các loại vi khuẩn gây bệnh. 1.4.2.6. Điều trị - Liệu pháp hỗ trợ chống mất nước và điện giải Lợn sau cai sữa mắc bệnh phù đầu nếu kết hợp với tiêu chảy thì việc cung cấp dung dịch điện giải rất quan trọng. Dung dịch chống mất nước phải được cho uống liên tục hoặc tiêm thẳng vào khoang bụng nếu lợn bỏ ăn và mất nước. Dung dịch này cần chứa glucose, glycerin, axit citric và dung dịch muối phot phat. Lượng dịch tiếp bù đắp bằng với lượng mất đi, có thể tới 25% khối lượng cơ thể [21], [27]. - Liệu pháp kháng sinh Liệu pháp dùng thuốc kháng sinh để kiểm soát sự nhân lên của vi khuẩn có hiệu quả hơn ở bệnh tiêu chảy sau cai sữa so với bệnh phù đầu, bởi vì ở bệnh phù đầu độc tố được sản sinh ở ruột gần như cao nhất khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng. Việc xuất hiện sự kháng thuốc của vi khuẩn cho tới nay là không tránh khỏi. Không thể đưa ra con số đồng nhất về sự kháng thuốc bởi vì nó rất khác nhau ở những đàn lợn khác nhau và phụ thuộc vào loại thuốc nào hay được sử dụng. Thuốc phải được chọn lọc và đưa vào tới khoang ruột. Làm kháng sinh đồ để chọn thuốc kháng sinh mẫn cảm dùng điều trị là tốt nhất. Điều trị không có nhiều kết quả khi lợn xuất hiện có các triệu chứng như phù nặng dưới da, thở khó, không còn khả năng đứng lên được. Rất nhiều phương pháp điều trị đã được đưa ra trong thời gian qua, nhưng việc điều trị bệnh hiện nay ở các trại chăn nuôi tập trung còn gặp nhiều khó khăn. 1.5. Kháng thể 1.5.1. Khái niệm - Kháng thể (tiếng Anh: antibody): là các phân tử immunoglobulin (có bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho B cũng như các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virut. Mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện một epitop kháng nguyên duy nhất [30]. - Kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng: + Kháng thể đơn dòng: là kháng thể chỉ nhận biết một epitop trên một kháng nguyên cho sẵn. Theo định nghĩa, tất cả các kháng thể đơn dòng cùng một dòng thì giống hệt nhau và được sản xuất bởi cùng một dòng tương bào. Kháng thể đơn dòng được sử dụng rộng rãi trong sinh học và y học, chúng vừa là phương tiện chẩn đoán, vừa là công cụ điều trị. Thí dụ, chúng được ứng dụng trong một phương pháp phát hiện có thai được sử dụng phổ biến hiện nay [30]. Trước đây, việc sản xuất kháng thể đơn dòng in vitro rất khó khăn do đời sống ngắn ngủi của các tương bào. Kháng thể chỉ thu được in vivo bằng cách tiêm một kháng nguyên cụ thể vào một động vật rồi chiết lấy kháng thể trong máu. Phương pháp này rất tốn kém nhưng chỉ thu được lượng kháng thể rất ít, không thuần nhất và bị ô nhiễm [30], [36]. + Kháng thể đa dòng: là một tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitop khác nhau trên một kháng nguyên cho trước. Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể tổng hợp nhiều kháng thể tương ứng với các epitop của cùng một kháng nguyên: đáp ứng như vậy gọi là đa dòng. 1.5.2. Đặc tính và ứng dụng Kháng thể là một protein sinh học đặc thù, có cấu tạo phức tạp và có tác dụng đặc hiệu, do động vật cấp cao sản sinh ra. Nó là “chất miễn dịch” giúp cho cơ thể không mắc bệnh đối với tác nhân gây ra nó (kháng nguyên). Đối với động vật máu nóng, khoa học đã nghiên cứu về kháng thể từ rất lâu cùng với hỗ trợ của các tiến bộ sinh học phân tử, tuy nhiên vẫn còn nhiều câu hỏi chưa giải đáp được. Các nghiên cứu tập trung nhiều vào y học, thú y và đã có những thành tựu rực rỡ trong phòng bệnh và chữa bệnh cho người và gia súc [22]. Cơ thể động vật chỉ sinh ra kháng thể khi được tiếp xúc với kháng nguyên, mà các kháng nguyên ta đang quan tâm ở đây là các mầm bệnh như vi khuẩn, virut gây bệnh cho gia súc. Nếu chưa từng tiếp xúc với kháng nguyên thì cơ thể không sản sinh kháng thể, nghĩa là động vật chưa có miễn dịch và có thể bị mầm bệnh tấn công. Muốn phòng được bệnh, cơ thể cần có kháng thể, dựa trên cơ sở đó, khoa học đã dùng kháng thể để phòng bệnh và chữa bệnh [30]. Kháng thể thường lấy từ máu động vật đã được miễn dịch với kháng nguyên (mầm bệnh, vi khuẩn, virut,...) theo mục đích đã định. Kháng thể hòa tan trong phần dịch thể của máu động vật (trong huyết thanh). Người ta đã chế được huyết thanh có chứa kháng thể (kháng huyết thanh). Trong thú y, người ta đã chế tạo kháng huyết thanh chống bệnh tụ huyết trùng, bệnh đóng dấu lợn, bệnh dịch tả trâu bò, bệnh dịch tả lợn.... được dùng để chữa bệnh và phòng bệnh rất tốt [30]. Tính ưu việt của kháng thể so với chất kháng sinh là: Kháng thể chống được virut, chống được cả độc tố (chất kháng sinh không làm được). Kháng thể thụ động có tác dụng kéo dài tới 2 tuần lễ (chất kháng sinh chỉ có tác dụng từ 6 -24 giờ). Kháng thể tác động đặc hiệu mầm bệnh, không tác động tràn lan ngoài ý muốn. Kháng thể không gây “kháng thuốc” nên không gây hậu quả cho sinh thái môi trường. Kháng thể cung cấp miễn dịch nhanh chóng trong vài giờ, được dùng phòng bệnh khẩn cấp khi cần qua lại vùng đang có dịch, điều trị bệnh cấp tính có hiệu quả tức thì. Kháng thể ngoài tác dụng phòng trị bệnh đặc hiệu, nó còn có tác dụng như một protein liệu pháp, giúp con vật sau khi sử dụng tăng trưởng tốt hơn. Rõ ràng kháng thể có tính ưu việt nổi trội về nhiều mặt trong phòng và chữa bệnh, đặc biệt với các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho gia súc và cả con người. Tuy nhiên chế tạo kháng thể vô cùng phức tạp, có giá thành cao, khó ứng dụng mở rộng được vì lý do kinh tế. Những năm cuối tập kỷ 60 của thế kỷ 20, khoa học đã chú ý tới một vấn đề hấp dẫn về kháng thể đó là: gà là động vật có đáp ứng miễn dịch với nhiều loại kháng nguyên, với nhiều loại mầm bệnh khác nhau, nghĩa là gà có thể sản sinh kháng thể ở trong máu để chống lại các mầm bệnh đó. Tuy nhiên, ta không thể có đủ lượng máu gà miễn dịch này để phục vụ sản xuất kháng thể, nhưng có một điều thú vị là kháng thể trong huyết thanh gà lại được truyền và tích lũy ở trong lòng đỏ trứng gà [36], [42], chính các kháng thể này bảo vệ cho gà con nở ra tránh được các bệnh tật. Vậy ta có thể sản xuất kháng thể từ lòng đỏ trứng gà không?. Các thí nghiệm đã chứng minh: trứng của gà được miễn dịch có chứa kháng thể chống lại các vi khuẩn, virut, độc tố mà người ta đã tiêm để gây miễn dịch cho gà. Kháng thể trong lòng đỏ cũng kết hợp đặc hiệu với các mầm bệnh tương ứng [42], [45]. Thời cổ xưa, con người cũng đã biết dùng lòng đỏ trứng gà để chống các bệnh do vi khuẩn, virut ở đường ruột, xoang miệng và dùng ngoài da, đó chính là ứng dụng phương pháp miễn dịch thu động. Lòng đỏ trứng gà có thành phần: 48% là nước, 17,8% protein và 30,5% lipid. Hầu hết (mỡ) lipid trong lòng đỏ trứng được kết hợp với protein (lipoprotein) hơn là ở dạng lipid tự do. Protein trong lòng đỏ trứng cũng có dạng không kết hợp với lipid, mà ở dạng protein hòa tan được trong nước. Kháng thể trong lòng đỏ trứng là loại protein hòa tan trong nước và cùng với lipoprotein tạo thành dạng nhũ dịch trong lòng đỏ [45]. Ngày nay, người ta đã chứng minh và có nhiều bằng sáng chế về sản xuất kháng thể trong lòng đỏ trứng, cho đến nay người ta đã được xác định được bản chất của kháng thể đó là IgY do các tài liệu khác còn gọi là: IgG gà (chicken IgG), IgG lòng đỏ trứng (Egg yolk IgG), hoặc 7S IgG. IgY - globulin miễn dịch có trong lòng đỏ trứng có thể có hàm lượng khoảng từ 5 đến 20 mg/trong 1 ml. Hàng loạt kháng nguyên đã được dùng để sản xuất kháng thể IgY và cho kết quả tốt như với Newcastle, E. coli, liên cầu khuẩn, nọc rắn v.v... IGY có khối lượng phân tử khoảng 180 kDa, mỗi chuỗi nhẹ khoảng 25 kDa, mỗi chuỗi nặng khoảng 65 - 68 kDa. Điểm đẳng điện 5,7 - 7,6 (6,6 ± 0,9). Gà mái có thể sinh ra các kháng thể nhận biết nhiều epitop khác nhau hơn so với các kháng thể do động vật có vú sinh ra [45]. IgY có chức năng tương tự như kháng thể của thỏ và động vật có vú khác, do đó nó có giá trị kinh tế hơn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực (đặc biệt với việc sản xuất các kháng thể đơn dòng). 12 quả trứng gà chứa khoảng 1 gam kháng thể IgY, tương đương tổng số kháng thể IgG có trong 100ml huyết thanh, vì vậy 1 con gà mái có thể thay thế 12 con thỏ dùng sản xuất kháng thể trong 1 năm. Mỗi gà mái, một tháng có thể sản xuất 2,5 g IgY. Kháng thể đặc hiệu có thể chiếm từ 0,5 đến 10% tổng số IgY tùy theo việc sử dụng kháng nguyên miễn dịch [36]. Chương 2: Vật liệu và phương pháp 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu 2.1.1. Mẫu thí nghiệm Mẫu phân, bệnh phẩm: phân lợn con bị tiêu chảy ở giai đoạn từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi. Phân và bệnh phẩm lợn từ 22 đến 60 ngày tuổi mắc bệnh phù đầu đã chết hoặc gần chết gồm: máu, dịch ruột, hạch ruột, gan, lách, phổi, phân trong trực tràng. 2.1.2. Động vật thí nghiệm Chuột bạch: 18 - 20 gam, khỏe mạnh; chuột lang trưởng thành; thỏ: 2,5-3,0 kg, khỏe mạnh, không mắc bệnh ngoài da; gà đẻ giống siêu trứng (Hyline, Leghorn): trung bình 2,5-3 kg/con. 2.1.3. Các loại hóa chất, môi trường, kháng huyết thanh 2.1.3.1. Các loại môi trường Bao gồm: thạch máu, thạch Mac Conkey, NB (nutrient broth), NA (nutrient agar), môi trường BHI, môi trường do hãng Oxoid (Anh) sản xuất. 2.1.3.2. Các loại hóa chất Các loại đường: lactose, sucrose, dulcitol, salicin, sorbitol, arabinose, raffnose, mannitol, rhamnose, xylose, maltose, trehalose. Thuốc nhuộm Gram, dung dịch PBS, dung dịch Kowacs, dung dịch Andrader do hãng Oxoid sản xuất. 2.1.3.3 Các loại huyết thanh chuẩn để định type E. coli Kháng huyết thanh chuẩn xác định nhóm huyết thanh (serogroup) và kiểu huyết thanh (serotype) của E. coli (Nhật Bản). 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ Máy móc, thiết bị: máy ly tâm (Eppendorf), máy lắc (Nhật), cân vi lượng (Sartorius, Đức), lò vi sóng, máy Vortex, nồi lên men (Trung Quốc), máy đo pH (Mỹ), máy đo OD, v.v... Dụng cụ: pipetman (Eppendorf), đầu côn 1000ml, 200ml (Greiner Bio-one), ống ly tâm kích cỡ 15ml, 50ml, phiến kính, bình tam giác thủy tinh các cỡ, v.v... Các dụng cụ phải được sấy hoặc hấp vô trùng. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu Mẫu phân được lấy từ trực tràng lợn con bị tiêu chảy cho vào ống nghiệm vô trùng đem về phòng thí nghiệm trong vòng 6 giờ để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn. Bệnh phẩm là phủ tạng lợn được lấy bằng cách đưa cả con lợn bị phù đầu đã chết hoặc gần chết về phòng thí nghiệm, mổ lấy bệnh phẩm gồm: máu, dịch ruột, hạch ruột, ruột, gan, lách, phổi trong trực tràng để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn. 2.2.2. Phân lập, giám định và xác định các yếu tố gây bệnh của E. coli 2.2.2.1. Phương pháp phân lập và giám định E.coli Quy trình phân lập và giám định E. coli được trình bày theo sơ đồ 1. Cấy 0,2 ml huyễn dịch phân, bệnh phẩm ở độ pha loãng 10-5 trên thạch Istrati. Sau khi cấy và bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ đếm khuẩn lạc. Chọn khuẩn lạc có dạng S, có màu vàng đặc trưng trên môi trường thạch Istrati cấy sang môi trường Mac Conkey và môi trường Brilliant green agar bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ lấy ra quan sát tính chất mọc, màu sắc khuẩn lạc, độ tinh khiết. Nếu thuần khiết, cấy giữ giống trên thạch máu để tiến hành kiểm tra hình thái và giám định các tiêu chuẩn khác. Sơ đồ 1: Phân lập và giám định E. coli từ phân và bệnh phẩm Phân hoặc bệnh phẩm lợn bị tiêu chảy, phù đầu Brilliant green agar (Khuẩn lạc màu vàng chanh) Istrati(Khuẩn lạc thuần khiết dạng S, màu vàng) Mac Conkey (Khuẩn lạc màu đỏ cánh sen) Khuẩn lạc thuần khiết Giữ trên thạch máu Tính chất sinh học Nhuộm Gram và kiểm tra hình thái Cấy trên các môi trường sinh hóa KIA, Mannitol, Ureindol, Simon Citrate pha loãng 10-5 2.2.2.2. Giám định một số đặc tính sinh vật hóa học của các chủng E. coli phân lập được bằng phương pháp thường quy Từ các giống E. coli phân lập đã được thuần khiết, tiến hành giám định một số đặc tính sinh vật hóa học cơ bản như đặc tính hình thái, tính chất nuôi cấy và các phản ứng lên men đường. - Kiểm tra hình thái học: từ giống phân lập giữ trên thạch máu cấy chuyển ra nước thịt hoặc thạch nghiêng, làm tiêu bản nhuộm Gram để kiểm tra. - Kiểm tra khả năng di động: cấy chích sâu vi khuẩn vào thạch mềm hoặc xem di động của vi khuẩn trực tiếp trên kính hiển vi bằng tiêu bản giọt treo. - Kiểm tra tính chất mọc bằng cách nuôi cấy trên các môi trường: nước thịt, thạch thường, thạch máu, các môi trường đặc biệt như: Istrati, Mac Conkey, Brilliant green agar. Quan sát tính chất mọc, hình thái, kích thước và màu sắc khuẩn lạc. - Kiểm tra các đặc tính lên men đường của E. coli: Trên môi trường thạch nghiêng KIA (Kligler Iron Agar) Kỹ thuật cấy: Dùng que cấy vô trùng chấm vào khuẩn lạc định kiểm tra, ria một đường ở phần thạch nghiêng và cắm que cấy thẳng xuống phần thẳng đứng nhưng không chạm vào đáy ống, bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ. Đọc kết quả (chậm nhất là 48 giờ). Môi trường KIA cho phép đọc các tính chất: Khả năng lên men đường lactose: Vi khuẩn có khả năng lên men đường lactose làm cho phần thạch nghiêng chuyển sang màu vàng, ngược lại thì giữ nguyên màu. Khả năng lên men đường glucose: Vi khuẩn có khả năng lên men đường glucose thì chuyển phần thạch đứng từ màu hồng sang màu vàng rõ, vi khuẩn không lên men đường glucose thì giữ nguyên màu. Nếu sinh hơi thì phần thạch đứng bị nứt hoặc tạo thành bọt khí bên trong thạch đứng, có thể đẩy toàn bộ phần thạch lên cao, ở dưới là hơi. Khả năng lên men các loại đường khác Trong môi trường dinh dưỡng Nutrient Broth đã bổ sung thêm 1,5 ml xanh Bromothymol 1,5% trong cồn và các loại dung dịch đường cần kiểm tra, cấy vi khuẩn vào, bồi dưỡng trong tủ ấm 370C/24 giờ đọc kết quả. Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển màu hồng, âm tính khi môi trường vẫn giữ nguyên màu sắc ban đầu. Phản ứng sinh Indol Trong môi trường dinh dưỡng Nutrient Broth, cấy E. coli cần kiểm tra, bồi dưỡng ở điều kiện nhiệt độ 43 - 470C/24 giờ, nhỏ thuốc thử Kowacs vào. Phản ứng dương tính khi một vòng tròn đỏ xuất hiện ở trên cùng ống môi trường nuôi cấy. Phản ứng âm tính khi vòng tròn đỏ không xuất hiện. 2.2.2.3. Xác định serotype của E. coli bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính theo phương pháp thường quy - Vật liệu dùng xác định: Các chủng E. coli được lưu giữ trên thạch máu. Kháng huyết thanh chuẩn (nhóm và đơn giá), nước muối sinh lý 0,85%, phiến kính sạch. - E. coli có nhiều serotype, vì vậy để xác định serotype E. coli, tiến hành làm phản ứng với kháng huyết thanh nhóm (serogroup), sau đó mới tiến hành xác định serotype với kháng huyết thanh đơn giá thuộc nhóm kháng huyết thanh đã ngưng kết. Cách tiến hành như sau: Trên một phiến kính sạch, ở hai đầu nhỏ hai giọt nước sinh lý. Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc E. coli cần xác định serotype mọc trên thạch Mac Conkey hoặc thạch máu hòa tan vào hai giọt nước muối sinh lý ở hai đầu của phiến kính. Dùng que cấy vô trùng lấy một vòng que cấy kháng huyết thanh nhóm trộn đều vào một bên huyễn dịch vi khuẩn, huyễn dịch vi khuẩn bên kia phiến kính không trộn huyết thanh đa giá nhóm (đối chứng âm). Để yên từ 1-2 phút ở nhiệt độ phòng, đọc kết quả phản ứng. Phản ứng dương tính khi trong giọt huyễn dịch kháng huyết thanh và vi khuẩn xuất hiện những hạt ngưng kết lấm chấm, mức độ ngưng kết được đánh giá theo thang bậc: +, ++, +++, ++++. Phản ứng âm tính khi huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh vẫn đục đều không có hạt ngưng kết xuất hiện như bên đối chứng âm. Chọn những khuẩn lạc có ngưng kết với kháng huyết thanh nhóm, tiến hành làm ngưng kết với từng kháng huyết thanh đơn giá thuộc nhóm như đã tiến hành với nhóm. Nhận xét kết quả như đối với kháng huyết thanh nhóm. Nếu một vi khuẩn ngưng kết chéo với nhiều nhóm, hoặc nhiều kháng huyết thanh đơn giá thì phải tiến hành pha loãng kháng huyết thanh thành các độ pha loãng khác nhau theo hệ số 2 (1/2, 1/4, 1/8, 1/16,...), rồi làm phản ứng với từng độ pha loãng. Serotype nào ngưng kết ở hiệu giá pha loãng kháng huyết thanh cao nhất thì đó là serotype của vi khuẩn. 2.2.2.4. Xác định độc lực của E. coli theo phương pháp của Cater (1984) [64] Mỗi chủng vi khuẩn được tiêm cho 2 chuột, liều 0,2 ml dịch nuôi cấy 24giờ/370C vào phúc xoang. Theo dõi số chuột chết và thời gian giết chết chuột của vi khuẩn trong 7 ngày. Chuột chết được mổ kiểm tra bệnh tích và lấy máu tim, phủ tạng nuôi cấy phân lập vi khuẩn. 2.2.2.5. Xác định khả năng dung huyết của E. coli bằng phản ứng gây dung huyết trên thạch máu bê 10% Giống E. coli thuần khiết được ria cấy trên môi trường thạch máu bê 10%, bồi dưỡng ở tủ ấm 370C trong 24 giờ. Đánh giá kết quả: Dung huyết hoàn toàn (b-haemolysin): xung quanh khuẩn lạc có vòng tan máu to, rõ, có thể nhìn qua được môi trường. Dung huyết không hoàn toàn (a-haemolysin): xung quanh khuẩn lạc có vòng tan máu nhỏ, có ánh xanh. Không dung huyết (g-haemolysin): xung quanh khuẩn lạc không có vòng tan máu. 2.2.2.6. Xác định các gen độc tố (LT, STa, STb và VT2e) bằng phương pháp PCR Hiện nay người ta dùng phương pháp PCR để xác định các gen độc tố của E. coli, đây là phương pháp ưu việt nhất về độ nhạy và tính chính xác của nó. - Cách tiến hành: ADN mẫu: khuẩn lạc E. coli mọc trên môi trường thạch máu ở 370C/24h. Hỗn hợp phản ứng PCR: Primers: 1 ml mỗi loại Dung dịch đệm (5 X): 5,0 ml Enzym (Taq polymerase): 0,5 ml Nước khử ion vừa đủ để đạt được thể tích cuối cùng là 25ml cho 1 phản ứng. Chu trình của một phản ứng PCR (Amplification): phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước và được thực hiện trong máy nhân gen tự động Perkin Elmer, theo bảng 1. Chạy điện di: sản phẩm PCR thu được sau chu trình phản ứng được nhuộm với chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye), được trộn vào mẫu theo tỷ lệ 1: 5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 1%, trong dung dịch đệm TAE (Tris - agartate - EDTA) với hiệu điện thế 100V trong vòng 40 phút. Nhuộm: gel thạch sau khi chạy điện di được nhuộm màu bằng chất nhuộm màu huỳnh quang Ethidium bromide (1ml/ml) trong vòng 15 phút đọc kết quả. Bảng 1: Chu trình của phản ứng PCR Thành phần Chu trình thứ nhất 30 chu trình tiếp theo Chu trình cuối Biến tính (0C/phút) Biến tính (0C/phút) Gắn mồi (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) ADN khuôn, primer, Taq polymerase, dNTP 94/5 94/0,5 55/0,5 72/0,5 72/7 - Đọc kết quả: Đọc kết quả bằng cách quan sát dưới ánh đèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống Polaroid camera. Trên ảnh chụp nền đen, các đoạn axit nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng và có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại. Kích thước các băng ADN được so sánh với ADN chuẩn (ADN marker). 2.2.3. Phương pháp chế tạo kháng nguyên Dùng các chủng E. coli đã lựa chọn nuôi cấy trên các môi trường dinh dưỡng riêng từng chủng ở 37oC/24 giờ, kiểm tra đậm độ vi khuẩn, kiểm tra thuần khiết, bất hoạt bằng nhiệt độ hoặc hóa chất, kiểm tra vô trùng, chia lọ để sử dụng. 2.2.4. Nghiên cứu qui trình miễn dịch để đạt hiệu giá kháng thể trong huyết thanh gà cao nhất Chúng tôi tiến hành thử nghiệm tiêm miễn dịch cho 3 đàn gà thí nghiệm, mỗi đàn theo một qui trình khác nhau, sau đó định kỳ hàng tuần kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu gà để tìm ra qui trình hợp lý, cho hiệu giá kháng thể trong máu gà cao nhất, ổn định nhất. 2.2.5. Phương pháp định tính hàm lượng kháng thể trong sản phẩm bằng khả năng bảo hộ của kháng thể chống lại E. coli trên động vật thí nghiệm Dùng chuột bạch thể trọng mỗi con 18 - 20g, khoẻ mạnh. Chia làm 2 nhóm: Nhóm 1: Mỗi con tiêm 0,4 ml kháng thể vào phúc xoang; sau 24 giờ tiêm lần hai cùng liều. Nhóm 2: Không tiêm, làm đối chứng. Sau 48 giờ kể từ khi tiêm kháng thể lần hai, công cường độc cho cả hai nhóm chuột với liều tiêm dưới da mỗi chuột 0,2 ml canh trùng 24 giờ của các chủng E. coli. Theo dõi chuột trong 7 ngày sau đánh giá kết quả. Tính hiệu số của số lượng chuột sống sót của nhóm 1 (nhóm được tiêm miễn dịch bằng kháng thể) và số lượng chuột sống sót của nhóm 2 (nhóm đối chứng). 2.2.6. Phương pháp định lượng hàm lượng kháng thể trong sản phẩm bằng phản ứng ngưng kết giữa kháng thể trong sản phẩm với kháng nguyên E. coli tương ứng Có thể thực hiện phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính hay ngưng kết chậm trong ống nghiệm theo thường qui. Pha loãng kháng thể bằng nước muối sinh lý theo các độ pha loãng khác nhau (theo cấp số 2). Lấy một lượng kháng thể đã pha ở mỗi hiệu giá và một lượng kháng nguyên E. coli bằng nhau, trộn đều, để ở nhiệt độ khoảng 250C. Nếu là ngưng kết nhanh trên phiến kính thì đọc kết quả sau 3-5 phút, nếu là ngưng kết chậm trong ống nghiệm thì đọc kết quả sau 6-12 giờ bằng mắt thường. Đối chứng âm làm tương tự bước trên nhưng thay thế kháng thể bằng nước sinh lý. Đối chứng dương làm tương tự bước trên nhưng thay thế kháng thể trong sản phẩm bằng kháng thể E. coli đã biết. 2.2.7. Phương pháp chế tạo kháng thể Thu hoạch trứng, tách lòng đỏ, cho vào làm đồng nhất bằng máy, bổ sung dung môi và chất bảo quản, ra chai, bảo quản. Chương 3: Kết quả và bàn luận 3.1. Phân lập E. coli, chọn E. coli có độc lực, có tính kháng nguyên 3.1.1. Thu thập mẫu bệnh phẩm lợn ốm tiêu chảy và sưng phù đầu Các mẫu được thu thập ở 8 huyện của 5 tỉnh đại diện cho 3 miền Bắc - Trung - Nam, chúng tôi đã tiến hành thu thập được tổng số 340 mẫu bệnh phẩm ở lợn ốm có triệu chứng mắc bệnh sưng phù đầu và tiêu chảy do E. coli gây nên. Các loại mẫu bệnh phẩm chúng tôi thu thập là: phân, lợn nguyên con, tim, gan, ruột và hạch ruột của lợn bệnh. Kết quả cụ thể trong bảng 2. Bảng 2: Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm lợn ốm tiêu chảy và sưng phù đầu Địa điểm Số cơ sở lấy mẫu Lợn nguyên con Phân Tim Gan Ruột, hạch ruột Tổng số mẫu Miền Nam 40 5 15 20 18 22 80 Miền Trung 40 14 20 21 22 23 100 Miền Bắc 80 30 35 37 30 28 160 Tổng cộng 160 49 70 78 70 73 340 3.1.2. Nuôi cấy đặc hiệu cho E. coli, sàng lọc vi khuẩn tạp Từ 340 mẫu bệnh phẩm thu thập được ở các vùng, miền trên cả nước, bước đầu chọn lọc E. coli, chúng tôi dùng môi trường đặc hiệu cho E. coli là môi trường Mac Conkey. Kết hợp với các môi trường khác như là môi trường thạch máu, môi trường nước thịt, môi trường thạch thường, môi trường yếm khí để chọn ra những chủng có đặc điểm giống với E. coli, loại được những vi khuẩn tạp (không phải là E. coli). Kết quả cụ thể được thống kê ở bảng 3. Qua bảng 3 thấy rằng: từ 340 mẫu bệnh phẩm ở lợn có dấu hiệu mắc bệnh sưng phù đầu và ỉa chảy do E. coli gây nên, trên môi trường Mac Conkey phân lập được 266 mẫu vi khuẩn có đặc điểm hình thái khuẩn lạc giống với hình thái khuẩn lạc E. coli (màu hồng cánh sen), chiếm tới 78,24%. Trong đó cao nhất là ở Đồng Nai có tỷ lệ 85% và thấp nhất là Nghệ An có tỷ lệ 68,0% mẫu vi khuẩn có đặc điểm hình thái khuẩn lạc giống với E. coli. Bảng 3: Kết quả phân lập E. coli từ các mẫu bệnh phẩm STT Địa điểm lấy mẫu Số lượng mẫu Số lượng mẫu có E. coli Tỷ lệ % 1 Đồng Nai 80 68 85,0 2 Bình Định 50 37 74,0 3 Nghệ An 50 34 68,0 4 Hưng Yên 80 65 81,25 5 Hà Tây 80 62 77,5 Tổng 340 266 78,24 Kiểm tra hình thái vi khuẩn trên tiêu bản khi nhuộm Gram: vi khuẩn có dạng trực khuẩn, hai đầu tròn, bắt màu Gram âm, đứng riêng rẽ. Từ 266 mẫu vi khuẩn thu được ở trên, chúng tôi chọn ra được 135 mẫu vi khuẩn để làm các công việc tiếp theo trong quá trình chọn lọc giống E. coli. Do tính chất rất hay thay đổi của E. coli, chúng tôi tiến hành đông khô ngay các chủng đã phân lập được để đảm bảo tính nguyên vẹn của vi khuẩn, tránh những biến đổi trong quá trình cấy chuyển gây nên. 3.1.3. Tiến hành các phản ứng sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn phân lập được 3.1.3.1. Kết quả kiểm tra đặc tính lên men các loại đường và khả năng sinh hơi Sau khi sơ bộ phân lập được 135 chủng vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm. Chúng tôi xác định đặc tính lên men các loại đường: sorbitol, arabinose, galactose, maltose, salicin, lactose, mannit, glucose, fructose, raffinose, saccharose, mannose. Đồng thời cũng xác định khả năng sinh hơi của 135 chủng vi khuẩn phân lập được. Kết quả cụ thể như sau: Bảng 4: Khả năng lên men các loại đường của 135 chủng vi khuẩn phân lập được Số mẫu N=135 Sor Ara Gal Mal Sal Lac Mat Glu Fru Raf Sac Man Gas Kết quả + + + + - + + + + + - + + Số mẫu 101 135 135 135 135 135 135 135 135 120 135 135 135 *Sor: Sorbitol Ara: Arabinose Gal: Galactose Mal: Maltose Sal: Salicin Lac: Lactose Mat: Mannit Glu: Glucose Fru: Fructose Raf: Raffinose Sac: Saccharose Man: Mannose Gas: Phản ứng sinh hơi (+): Phản ứng dương tính (-): Phản ứng âm tính Đặc điểm sinh hoá của E. coli là có khả năng lên men các loại đường glucose, đường lactose và một số đường khác, nhưng không có khả năng lên men đường saccharose cũng như đường salicin. Qua bảng 4, ta thấy tất cả các chủng phân lập được đều có đầy đủ các tính chất sinh hoá đặc trưng của E. coli, do đó các chủng này tiếp tục được xác định khả năng dung huyết trên môi trường thạch máu. 3.1.3.2. Kết quả xác định đặc tính dung huyết của các chủng Chúng tôi tiến hành xác định khả năng dung huyết của các chủng theo phương pháp sau: các chủng E. coli được ria cấy trên môi trường Blood Agar Base có bổ sung 10% máu bê, nuôi cấy ở điều kiện 37oC/18 - 24giờ, đọc kết quả. Khả năng gây dung huyết được đánh giá theo 3 kiểu là a-haemolysin (ký hiệu: a) ; b-haemolysin (ký hiệu: b) và âm tính (ký hiệu: -). Kết quả cụ thể được trình bày ở bảng 5. Bảng 5 cho thấy, trong 135 chủng E. coli đã được chọn lọc ở trên chỉ có 50 chủng có khả năng dung huyết chiếm 37%, còn lại 85 chủng không có khả năng dung huyết (chiếm 63%). Theo các tài liệu nghiên cứu trước đây, các chủng có khả năng dung huyết là các chủng có độc tính, có khả năng gây bệnh trên lợn cao hơn so với các chủng không dung huyết (theo tài liệu nghiên cứu của: Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Vũ Bình Minh và Đỗ Ngọc Thuý về kết quả phân lập E. coli và Salmonella ở lợn mắc bệnh tiêu chảy, xác định một số đặc tính sinh vật hoá học của các chủng vi khuẩn phân lập được và biện pháp phòng trị). Vì vậy chúng tôi đã chọn 50 chủng dung huyết trên để thực hiện các bước tiếp theo trong quá trình chọn lọc E. coli Bảng 5: Đặc tính dung huyết của các chủng E. coli phân lập được STT Địa phương lấy mẫu Số mẫu kiểm tra Số mẫu dung huyết Tổng số mẫu dung huyết Tỷ lệ dung huyết (%) Dạng a Dạng b 1 Đồng Nai 30 6 8 14 47 2 Bình Định 25 4 5 9 36 3 Nghệ An 28 5 4 9 32 4 Hưng Yên 27 4 6 10 37 5 Hà Tây 25 3 5 8 32 Tổng 135 22 28 50 37 Hình 1: Hình ảnh dung huyết của E. coli 3.1.3.3. Kiểm tra đặc tính di động Sau khi xác định khả năng dung huyết của các chủng, chúng tôi cấy 50 chủng này vào môi trường thạch bán lỏng trong ống nghiệm chữ U (cấy ở một đầu ống nghiệm) nuôi ở điều kiện 37oC, cứ sau 6 tiếng đọc kết quả 1 lần. Kết quả được đánh giá dựa vào khả năng phát triển của vi khuẩn trong môi trường (có thể thấy rõ bằng mắt thường). Mẫu dương tính là mẫu mà vi khuẩn có khả năng phát triển ra môi trường xung quanh và phát triển sang nhánh bên của ống nghiệm chữ U. Còn mẫu âm tính là mẫu mà vi khuẩn không có khả năng phát triển ra môi trường xung quanh, chúng chỉ có thể phát triển tại vị trí cấy giống, sau đây là kết quả cụ thể. Bảng 6: Khả năng di động của các chủng E. coli phân lập được STT Địa điểm lấy mẫu Số mẫu kiểm tra Số mẫu di động Số mẫu không di động 1 Đồng Nai 14 9 5 2 Bình Định 9 5 4 3 Nghệ An 9 6 3 4 Hưng Yên 10 7 3 5 Hà Tây 8 5 3 Tổng 50 32 18 Hình 2: Tính di động của E. coli Sau khi tiến hành xác định khả năng di động của các chủng E. coli phân lập được, bộ sưu tập E. coli phân lập được được chia thành 2 nhóm: + Nhóm có khả năng di động có 32 chủng. + Nhóm không có khả năng di động có 18 chủng. 3.1.4. Định typ huyết thanh của các chủng vi khuẩn phân lập được Các chủng E. coli được giữ bằng đông khô, chúng được hoàn nguyên và nuôi cấy trên môi trường thạch máu, sau đó dùng kháng huyết thanh chuẩn để xác định bằng phản ứng ngưng kết huyết thanh học để xác định các chủng có mang kháng nguyên quan trọng là các kháng nguyên pili như K88, K99, K987p,.... Kết quả chi tiết được thống kê ở bảng 7. Bảng 7: Kết quả định typ huyết thanh của các chủng vi khuẩn phân lập Địa điểm Số lượng K99 (F5) K88 (F4) 987P (F6) K30 K98 O141 K85ab O149 K91 O8 K87 + + + + + + + + Đồng Nai 14 1 1 1 2 1 1 Bình Định 9 1 1 1 1 1 Nghệ An 9 1 1 1 1 Hưng Yên 10 1 1 1 3 1 Hà Tây 8 1 1 2 1 Tổng 50 3 2 5 3 4 7 2 3 Từ kết quả định typ huyết thanh trong bảng 7, xác định được 29 chủng E. coli dương tính với bộ kháng huyết thanh chuẩn. 3.1.5. Xác định độc lực của từng chủng E. coli đã phân lập Chúng tôi tiến hành thử độc lực của 29 chủng này trên chuột bạch 18 - 20 gam theo phương pháp sau: tiêm dịch nuôi cấy sống (nuôi cấy 370C/24 giờ) của từng chủng theo hai đường là tiêm dưới da và phúc xoang, theo dõi trong vòng 7 ngày. Kết quả được trình bày ở bảng 8. Tiêu chuẩn đánh giá đối với một chủng E. coli có độc lực hay không của chúng tôi đưa ra là: phải có khả năng gây chết chuột tối thiểu là 1ml/con với liều tiêm theo đường dưới da, còn tiêm theo đường tiêm phúc xoang thì tối thiểu là 0,2 ml/con. Dựa vào tiêu chuẩn trên chúng tôi lựa chọn ra được 13 chủng có độc lực trên chuột đó là: E3, E7, E9, E12, E14, E15, E19, E20, E22, E24, E25, E27, E28. Bảng 8: Kết quả thử nghiệm độc lực của từng chủng đã phân lập trên chuột Chủng Số chuột chết/tiêm Ghi chú Đường tiêm dưới da (ml) Đường tiêm phúc xoang (ml) Liều 0,2 Liều 0,4 Liều 0,6 Liều 1,0 Liều 0,025 Liều 0,05 Liều 0,1 Liều 0,2 E1 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 E2 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 E3 2/4 3/4 4/4 4/4 0/4 2/4 4/4 4/4 E4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 E5 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 E6 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 E7 1/4 3/4 4/4 4/4 0/4 1/4 3/4 4/4 E8 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 E9 1/4 3/4 4/4 4/4 0/4 1/4 3/4 4/4 * E10 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 E11 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 E12 0/4 0/4 3/4 4/4 0/4 0/4 2/4 4/4 E13 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 E14 0/4 0/4 4/4 4/4 0/4 0/4 3/4 4/4 * E15 0/4 0/4 2/4 3/4 0/4 1/4 3/4 4/4 E16 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 E17 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 E18 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 E19 1/4 2/4 4/4 4/4 0/4 0/4 1/4 3/4 * E20 0/4 0/4 2/4 4/4 0/4 1/4 3/4 4/4 * E21 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 E22 0/4 0/4 0/4 2/4 0/4 2/4 3/4 4/4 * E23 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 E24 0/4 0/4 0/4 2/4 0/4 0/4 2/4 4/4 * E25 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 3/4 * E26 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 E27 0/4 0/4 0/4 2/4 0/4 0/4 3/4 4/4 * E28 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 3/4 * E29 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 * Chuột tiêm theo đường dưới da đều còn sống nhưng bị loét da nặng Ngoài ra, kết hợp với Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, sử dụng kỹ thuật PCR, chúng tôi còn xác định được sự có mặt của các gen độc tố của E. coli như độc tố LT, ST (STa, STb) và VT (VT2e) trong các chủng này. Kết quả xác định gen độc tố theo phiếu xét nghiệm (phụ lục 03) Như vậy, từ 29 chủng đã phân lập được, qua việc xác định độc lực của từng chủng. Chúng tôi đã chọn lọc ra được 13 chủng có độc lực, tiếp theo chúng tôi đi sâu vào nghiên cứu tính kháng nguyên của các chủng này. 3.1.6. Xác định tính kháng nguyên của từng chủng E. coli đã phân lập Trước tiên, với từng chủng, chúng tôi chế tạo kháng nguyên để tiêm miễn dịch cho chuột bạch với liều 0,5ml/con theo đường tiêm dưới da, mỗi chủng 4 con. Sau 21 ngày tiến hành lấy máu các chuột đã tiêm và xác định hiệu giá ngưng kết của huyết thanh bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính với kháng nguyên chính nó. Kết quả của phản ứng định lượng huyết thanh được thống kê ở bảng 9. Bảng 9: Kết quả xác định tính kháng nguyên của các chủng Huyết thanh Hiệu giá phản ứng ngưng kết Từng con Trung bình Chuột tiêm E3 1/128, 1/64, 1/64, 1/128 1/96 Chuột tiêm E7 1/128, 1/256, 1/512, 1/512 1/352 Chuột tiêm E9 1/32, 1/64, 1/64, 1/32 1/48 Chuột tiêm E12 1/128, 1/64, 1/64, 1/64 1/80 Chuột tiêm E14 1/128, 1/128, 1/64, 1/128 1/112 Chuột tiêm E15 1/4, 1/4, 1/8, 1/8 1/6 Chuột tiêm E19 1/512, 1/256, 1/512, 1/512 1/448 Chuột tiêm E20 1/4, 1/4, 1/2, 1/8 1/4,5 Chuột tiêm E22 1/128, 1/128, 1/64, 1/128 1/112 Chuột tiêm E24 1/4, 1/4, 1/2, 1/8 1/4,5 Chuột tiêm E25 1/256, 1/128, 1/64, 1/256 1/176 Chuột tiêm E27 1/32, 1/64, 1/64, 1/128 1/72 Chuột tiêm E28 1/128, 1/256, 1/256, 1/128 1/192 Chuột ĐC 1/2, 1/4, 1/2, âm, N 1/1,8 * Chuột đối chứng tiêm môi trường nuôi cấy vi khuẩn Qua bảng số liệu trên ta thấy: Có 10 chủng/13 chủng gây cho chuột có hàm lượng kháng thể khá cao (hiệu giá kháng thể từ 1/48 trở lên), thể hiện tính kháng nguyên tốt của các chủng E. coli này. Trong số 13 chủng này chỉ có 3 chủng có tính kháng nguyên rất yếu, thể hiện qua hiệu giá kháng thể trong huyết thanh chuột không cao hơn nhiều so với huyết thanh của chuột đối chứng, đó là các chủng E15, E20, E24, do đó chúng tôi tạm thời loại bỏ chủng này. Qua việc xác định tính kháng nguyên của từng chủng E. coli phân lập được, chúng tôi đã chọn được 10 chủng E. coli đảm bảo được các đặc tính sau: là E. coli gây bệnh cho lợn, có độc tính cao và có tính kháng nguyên tốt. Để tiện cho việc theo dõi, chúng tôi đặt tên cho các chủng là Hanco 1, Hanco 2, Hanco 3, Hanco 4, Hanco 5, Hanco 6, Hanco 7, Hanco 8, Hanco 9, Hanco 10. Đặc điểm kháng nguyên và độc lực của 10 chủng được tổng kết trong bảng 10. Bảng 10: Đặc điểm kháng nguyên và độc lực của bộ giống E. coli phân lập được STT Tên giống Kháng nguyên Đặc điểm Ghi chú MC Dung huyết Độc lực (liều giết chuột bạch) 1 Hanco 1 K98 Đặc trưng + 2,4.108CFU/dd (~0,2ml) 2 Hanco 2 987P Đặc trưng + 1,2.108CFU/dd (~0,2ml) 3 Hanco 3 O141 K85ab Đặc trưng + 1,8.108CFU/dd (~0,2ml) 4 Hanco 4 O149 K91 Đặc trưng + 5,9.108CFU/FX (~0,6ml) 5 Hanco 5 O8 K87 Đặc trưng ++ 2,8.108CFU/dd (~0,6ml) 6 Hanco 6 K99 Đặc trưng ++ 1,66.108CFU/dd (~0,2ml) 7 Hanco 7 K88 Đặc trưng + 7,9.108CFU/dd (~1ml) 3,16.108CFU/fx (~0,4ml) 8 Hanco 8 F4, Sta, Stb Đặc trưng +++ 3,4.108CFU/FX (~0,2ml) 9 Hanco 9 Vt2e, F18 Đặc trưng +++ 1.109CFU/dd (~1ml) 1.108CFU/FX (~0,1ml) 10 Hanco 10 Vt2e, F18,LT Đặc trưng +++ 1.108CFU/FX (~0,2ml) 3.2. Nghiên cứu khả năng sản sinh độc tố Của các chủng E. coli Như ở trên đã trình bày, độc tố của E. coli cũng là một trong những thành phần chính gây bệnh tiêu chảy và sưng phù đầu ở lợn. Vì vậy, mục tiêu của chúng tôi trong nghiên cứu này ngoài việc chế tạo kháng thể chống lại các kháng nguyên thân của vi khuẩn, còn phải chế tạo được các kháng thể đặc hiệu để trung hòa độc tố của vi khuẩn. Để có thể chế tạo được kháng thể kháng độc tố, bước đầu tiên là chế tạo được kháng nguyên độc tố an toàn để miễn dịch cho động vật thí nghiệm. 3.2.1. Nghiên cứu động thái sinh trưởng của E. coli Từ bộ giống gồm 10 chủng E. coli phân lập được, chúng tôi tiến hành nghiên cứu động thái sinh trưởng của vi khuẩn trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo. Chúng tôi nuôi cấy 10 chủng E. coli ở điều kiện 370C, sau đó theo dõi sự biến động về số lượng vi khuẩn và pH sau 24, 48 và 72 giờ nuôi cấy. Kết quả được trình bày ở bảng 11. Bảng 11: Động thái sinh trưởng của các chủng E. coli trong bộ giống đã chọn Chủng E. coli Thời gian nuôi cấy (điểm khảo sát)T 0h (1) 24h (2) 48h (3) 72h (4) Hanco 1 CFU(107/ml) 0 142.0 85.5 52.25 pH 7.2 5.62 7.01 7.31 Hanco 2 CFU(107/ml) 0 115 83.5 52 pH 5.76 6.46 7.73 Hanco 3 CFU(107/ml) 0 129.5 75.5 22.6 pH 7.2 5.72 6.01 7.81 Hanco 4 CFU(107/ml) 0 103.5 73.9 32.5 pH 7,2 5.61 6.03 6.21 Hanco 5 CFU(107/ml) 0 107 74.9 40 pH 7,2 5.66 5.98 6.39 Hanco 6 CFU(107/ml) 0 108 74.6 39 pH 7,2 5.73 6.95 7.48 Hanco 7 CFU(107/ml) 0 26.5 18.7 16 pH 7,2 5.88 6.52 7.17 Hanco 8 CFU(107/ml) 0 141 98.5 64 pH 7,2 5.96 6.58 7.77 Hanco 9 CFU(107/ml) 0 129.5 62.1 35.7 pH 7,2 5.65 6.25 7.12 Hanco 10 CFU(107/ml) 0 132 68.5 24 pH 7,2 5.74 6.72 7.30 3.2.2. Nghiên cứu môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp để sản sinh độc tố E. coli. Song song với nghiên cứu động thái sinh trưởng của vi khuẩn, chúng tôi đã tiến hành thử độc lực của dịch nuôi cấy theo từng công thức và môi trường khác nhau bằng cách tiêm cho chuột bạch. Chúng tôi đã chế tạo 9 loại môi trường với các chỉ tiêu dinh dưỡng khác nhau (phù hợp với yêu cầu dinh dưỡng của E. coli trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo) nhằm tìm kiếm một môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và sản sinh độc tố của E. coli. Chỉ tiêu dinh dưỡng của các loại môi trường được trình bày ở bảng 12. Bảng 12: Chỉ tiêu dinh dưỡng của các môi trường nuôi cấy Môi trường Đạm amin (mg/ml) Tryptophan (mg%) Pepton (gr%) NaCl (%) pH MT1 1.297 17.5 2.1 0.351 7.15 MT2 2.330 50.0 2.8 1.390 7.00 MT3 1.760 25.0 2.2 0.769 7.13 MT4 0.440 11.0 2.4 0.910 7.26 MT5 1.205 34.0 2.6 0.806 7.40 MT6 2.160 20.0 3.0 0.720 7.22 MT7 2.820 15.0 3.0 0.860 6.97 MT8 1.650 24.0 3.0 0.430 7.04 MT9 1.360 20.9 2.07 0.183 7.27 Với 9 loại môi trường ở trên, chúng tôi nuôi cấy chủng Hanco 3 với các công thức nuôi cấy khác nhau để theo dõi sự liên quan giữa động thái sinh trưởng với độc lực của nước lọc canh trùng (độc tố) trên động vật thí nghiệm Sau khi nuôi cấy trên các môi trường có các công thức nuôi cấy khác nhau, dịch nuôi cấy sống được ly tâm ở 7000g/15 phút, thu phần nước trong, lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,2 μm, dung dịch thu được sau khi lọc gọi là dịch chứa độc tố, ký hiệu là T2, chúng tôi tiến hành tiêm dịch qua lọc T2 cho chuột bạch 18 – 20 gam. Kết quả xác định độc lực giết chuột được trình bày ở bảng 13. Bảng 13: Độc lực của dịch nuôi cấy được xác định bằng cách tiêm dịch qua lọc T2 Môi trường Tỷ lệ chết/ tiêm Đường tiêm CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 MT1 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 1/4 1/4 0/4 1/4 MT2 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 1/4 1/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 1/4 0/4 1/4 0/4 MT3 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 MT4 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 1/4 0/4 1/4 0/4 MT5 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 1/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 1/4 1/4 0/4 MT6 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 1/4 1/4 0/4 1/4 MT7 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 MT8 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 1/4 1/4 0/4 1/4 MT9 DD 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 FX 0/4 0/4 0/4 0/4 2/4 1/4 1/4 1/4 1/4 TM 0/4 0/4 0/4 0/4 2/4 2/4 2/4 1/4 2/4 Qua bảng 13 chúng tôi thấy độc tố này yếu, tiêm dưới da không phát hiện được (chuột không chết) mà chỉ phát hiện được bằng tiêm phúc xoang hoặc tĩnh mạch. Cũng từ kết quả trên, chúng tôi thấy môi trường 9 là môi trường mà E. coli sản sinh độc tố mạnh nhất. Các công thức nuôi cấy 5, 6, 7, 8, 9 là những công thức nuôi cấy mà E. coli có thể sản sinh độc tố. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm lặp lại những công thức này trên môi trường 9. Kết quả được trình bày ở bảng 14. Bảng 14: Độc lực được xác định với liều tiêm và đường tiêm khác nhau Tỷ lệ chuột chết Công thức Tiêm phúc xoang Tiêm tĩnh mạch ∑số chuột chết /chuột tiêm 0,2ml 0,4ml 0,2ml 0,4ml CT5 1/4 2/4 1/4 3/4 7/12 CT6 0/4 1/4 0/4 2/4 3/12 CT7 0/4 1/4 1/4 2/4 4/12 CT8 0/4 1/4 0/4 1/4 2/12 CT9 0/4 1/4 0/4 2/4 3/12 ĐC 0/4 0/4 0/4 0/4 0/16 Ghi chú: ĐC - Đối chứng là môi trường vô trùng Qua bảng 14 chúng tôi thấy với công thức 5 E. coli sản sinh độc tố mạnh nhất. Lặp lại và mở rộng, chúng tôi chế tạo dịch nuôi cấy độc tố với từng chủng E. coli bằng môi trường 9 và nuôi cấy theo công thức 5, sau đó kiểm tra độc lực dịch nuôi cấy với từng chủng và đa chủng (trộn 10 chủng) bằng cách: tiêm 0,4 ml/con dịch qua lọc T2 vào tĩnh mạch chuột bạch, theo dõi tỷ lệ chuột chết/tiêm. Kết quả được trình bày ở bảng 15. Bảng 15: Độc lực của độc tố T2 do các chủng E. coli riêng rẽ và kết hợp tạo ra Giống Hanco Đường tiêm/ liều tiêm (ml) Số chuột TN (con) Số chuột ốm/tiêm Tỷ lệ ốm (%) Số chuột chết/tiêm Tỷ lệ chết (%) Hanco 1 TM/0.4 5 4/5 80 0/5 0 Hanco 2 TM/0.4 5 5/5 100 0/5 0 Hanco 3 TM/0.4 5 5/5 100 1/5 20 Hanco 4 TM/0.4 5 5/5 100 2/5 40 Hanco 5 TM/0.4 5 5/5 100 2/5 40 Hanco 6 TM/0.4 5 5/5 100 5/5 100 Hanco 7 TM/0.4 5 5/5 100 2/5 40 Hanco 8 TM/0.4 5 5/5 100 2/5 40 Hanco 9 TM/0.4 5 5/5 100 2/5 40 Hanco 10 TM/0.4 5 4/5 80 0/5 0 Poly (Đa giá) TM/0.4 5 5/5 100 4/5 80 Đối chứng TM/0.4 5 0/5 0 0/5 0 Ghi chú: ĐC - Đối chứng là môi trường vô trùng “chuột ốm” là chuột sau khi tiêm rất mệt, thở mạnh, thở dốc, lông dựng lên, nằm gục, không muốn hoạt động, tụ thành từng đám, bỏ ăn. Có con thỉnh thoảng bị co dật, có con điên cuồng, chạy lung tung, có con liệt chân sau, đi kéo lê trên sàn. Trước khi chuột chết có thể co dật hoặc không; cũng có trường hợp chuột chết nhanh, co dật mấy lần rồi chết, sau 48 giờ con nào không chết thì hồi phục dần. Kết quả cho thấy từng chủng có độc lực của độc tố khác nhau, từng chủng có thể làm chuột chết hoặc ốm khác nhau (chuột đối chứng không có hiện tượng này). Nhưng ở độc tố poly (trộn nhiều chủng) thì độc lực thể hiện rõ rệt. Đó là sự cộng hưởng của các độc tố. Vì vậy, mục tiêu của chúng tôi là chế tạo kháng nguyên có chứa hỗn hợp độc tố của nhiều chủng E. coli, để kháng thể thu được có thể đối phó với tính phức tạp của E. coli và tính đa dạng bệnh của nó gây ra cũng như dịch tễ học của các bệnh này trong thực tế chăn nuôi. 3.3. Nghiên cứu phương pháp bất hoạt và giải độc kháng nguyên 3.3.1. Nghiên cứu phương pháp làm bất hoạt và giải độc Kế thừa những nghiên cứu trước đây về E. coli và độc tố E. coli, chúng tôi tiến hành thử nghiệm bất hoạt và giải độc kháng nguyên bằng các phương pháp sau: + Bất hoạt và giải độc ở nhiệt độ 700C trong 30 phút. + Bất hoạt và giải độc bằng formol 3 0/00. + Bất hoạt và giải độc bằng phenol 5 0/00. + Bất hoạt và giải độc bằng thiomersal 0,40/00. Môi trường sau khi nuôi cấy đạt tiêu chuẩn được gọi là dịch nuôi chứa độc tố, được bất hoạt và giải độc bằng các phương pháp trên. Dịch nuôi sau khi xử lý, được đặt trong tủ ấm 370C trong 24h. Sau đó chúng tôi tiến hành kiểm tra vô trùng theo thường quy trên các môi trường khác nhau để xem ở điều kiện đó có bất hoạt được vi khuẩn hay không. Kết quả được trình bày ở bảng 16. Bảng 16: Kết quả kiểm tra vô trùng dịch nuôi chứa độc tố sau khi bất hoạt Canh trùng xử lý Kết quả kiểm tra trên môi trường Kết quả NA NB BA SA Thio 700C/30 phút - - - - - Đạt Formol 3 0/00 - - - - - Đạt Phenol 5 0/00 - - - - - Đạt Thiomersal 0.4 0/00 - - - - - Đạt (-): không có vi khuẩn mọc (+): có vi khuẩn mọc Bằng kết quả kiểm tra vô trùng chúng tôi nhận thấy cả 4 phương pháp vô hoạt và giải độc trên đều có khả năng bất hoạt E. coli. Tiếp theo chúng tôi kiểm tra hiệu quả giải độc của các phương pháp trên bằng cách ly tâm dịch nuôi cấy sau khi bất hoạt, lấy nước trong lọc qua màng 0,2 mm thu được dịch lọc gọi là “giải độc tố”, sau đó tiêm giải độc tố đó cho chuột bạch 18 - 20 gam với liều tiêm 0,4 ml vào tĩnh mạch và so sánh với tiêu chuẩn độc tố ở trên (tiêu chuẩn để đánh giá độc tố E. coli đó là cứ 0,4ml độc tố khi tiêm tĩnh mạch cho chuột 18 – 20g, phải gây chết ít nhất là 40% tổng số chuột được tiêm). Nếu giải độc tố gây chết tới 40% số chuột thí nghiệm thì độc tố đó chưa được giải độc, tức là phương pháp giải độc đó không đạt và ngược lại. Kết quả được trình bày ở bảng 17. Bảng 17: Tính an toàn của dịch nuôi chứa độc tố sau khi bất hoạt và giải độc Phương pháp bất hoạt Liều tiêm (ml) Đường tiêm Tỷ lệ chuột chết/chuột tiêm % chuột chết Hiệu quả giải độc 700C/30 phút 0,4 TM 2/10 20% Đạt Formol 3 0/00 0,4 TM 1/10 10% Đạt Phenol 5 0/00 0,4 TM 6/10 60% Không đạt Thiomersal 0,40/00 0,4 TM 10/10 100% Không đạt Kết quả trên cho thấy: Phương pháp giải độc bằng phenol và thiomersal không những không mang lại hiệu quả giải độc mà còn làm tăng tính độc của độc tố, do đó không thể dùng hai hóa chất này để giải độc được. Phương pháp giải độc bằng formol 30/00 và 700C/30 phút có hiệu quả giải độc tương đối tốt. 3.3.2. Kiểm tra tính kháng nguyên của dịch nuôi cấy sau khi bất hoạt Tiếp theo chúng tôi kiểm tra tính kháng nguyên của dịch nuôi chứa độc tố sau khi bất hoạt và giải độc bằng formol 30/00 và 700C/30 phút. Chúng tôi dùng dịch nuôi chứa độc tố đã đựơc bất hoạt và giải độc để tiêm miễn dịch cho chuột bạc