Đề tài Nghiên cứu cây cà chua

I. M Đ UỞ Ầ 1.1. Đ t v n đặ ấ ề Cây cà chua b t n công b i r t nhi u loài virus. Trong s b nh virus h i cà chua vùngị ấ ở ấ ề ố ệ ạ ở nhi t đ i và c n nhi t đ i, b nh xoăn vàng lá đ c xem là b nh quan tr ng nh t (Pico et al.,ệ ớ ậ ệ ớ ệ ượ ệ ọ ấ 1996). Nguyên nhân gây b nh xoăn vàng lá cà chua khá ph c t p. B nh đ c xem là m t b nhệ ứ ạ ệ ượ ộ ệ ph c, có nghĩa là m t b nh nh ng do nhi u virus thu c chi ứ ộ ệ ư ề ộ Begomovirus, h ọ Geminiviridae gây ra (Moriones & Navas-Castillo, 2000). Các begomovirus có hình thái phân t d ng hình c uử ạ ầ kép (hình chuỳ), không truy n qua h t gi ng nh ng lan truy n trên đ ng ru ng b ng b ph nề ạ ố ư ề ồ ộ ằ ọ ấ (Bemisia tabaci) theo ki u b n v ng tu n hoàn (Pico et al., 1996).ể ề ữ ầ Begomovirus là các virus có b gien DNA s i vòng đ n, kích th c kho ng 2.6 – 2.8 kb.ộ ợ ơ ướ ả Begomovirus có th có b gien đ n (ể ộ ơ g m m t phân t DNA-A) ho c có b gen kép (g m haiồ ộ ử ặ ộ ồ phân t DNA-A và DNA-B). ử C u trúc c a m t phân t DNA-A đi n hình g m có 6 gien đ cấ ủ ộ ử ể ồ ượ s p x p theo hai chi u ng c nhau (Hình 1). Theo chi u kim đ ng h có hai gien AV1 vàắ ế ề ượ ề ồ ồ AV2. Gen AV1(CP) mã hóa v protein, qui đ nh tính đ c hi u vector và nh p nhân t bào. Genỏ ị ặ ệ ậ ế AV2 mã hóa 1 protein có ch c năng c m ng tri u ch ng, di chuy n h th ng và tích lũy DNAứ ả ứ ệ ứ ể ệ ố c a virus. Ng c chi u kim đ ng h có 4 gien AC1, AC2, AC3 và AC4. Gien AC1 (Rep) mãủ ượ ề ồ ồ hóa 1 protein có vai trò quan tr ng trong quá trình tái sinh virus và t ng tác v i các protein kýọ ươ ớ ch đi u khi n chu kỳ t bào. Gien AC2 (TrAP) mã hóa 1 protein ho t hóa phiên mã và c chủ ề ể ế ạ ứ ế ph n ng phòng th c a cây. Gien AC4 (REn) mã hóa 1 protein tăng c ng s tái sinh virus vàả ứ ủ ủ ườ ự t ng tác v i các protein ký ch đi u khi n chu kỳ t bào. Gien AC4 mã hóa 1 protein có ch cươ ớ ủ ề ể ế ứ năng c m ng tri u ch ng và di chuy n h th ng (Stanley ả ứ ệ ứ ể ệ ố et al., 2005) Hi n nay, có t i h n 50 begomovirus phân l p t cà chua (có t tomato đ u tên virus) đãệ ớ ơ ậ ừ ừ ở ầ đ c công b trên th gi i (Fauquet et al., 2008). Trên cây cà chua, các begomovirus t o tri uượ ố ế ớ ạ ệ ch ng gi ng nhau, đi n hình là: cu n lá (cong l i hình thìa); mép lá (đ c bi t lá non) bi nứ ố ể ố ạ ặ ệ ở ế vàng; lá nh h p; cây nhi m s m còi c c v i t l đ u qu r t th p. Danh tính virus gây b nhỏ ẹ ễ ớ ọ ớ ỷ ệ ậ ả ấ ấ ệ ch có th bi t đ c d a vào các phân tích phân t (Moriones & Navas-Castillo, 2000). ỉ ể ế ượ ự ử T i Vi t Nam, b nh xoăn vàng lá đ c xem là b nh virus quan tr ng nh t trên cà chua v iạ ệ ệ ượ ệ ọ ấ ớ t l nhi m b nh trên các ru ng tr ng cà chua th ng r t cao, có khi t i 100 %. B nh đã đ cỉ ệ ễ ệ ộ ồ ườ ấ ớ ệ ượ phát hi n th y trên cà chua t nh ng năm 80. M t s nghiên c u v t o kháng huy t thanhệ ấ ừ ữ ộ ố ứ ề ạ ế ch n đoán, lây nhi m nhân t o đã đ c th c hi n trong th i gian này nh ng b n ch t th t sẩ ễ ạ ượ ự ệ ờ ư ả ấ ậ ự c a virus v n ch a rõ. G n đây, d a vào các phân tích phân t , có ít nh t 3 begomovirus đ củ ẫ ư ầ ự ử ấ ượ phát hi n gây ra b nh xoăn vàng lá cà chua Vi t Nam g m tomato leaf curl Vietnam virusệ ệ ở ệ ồ DNA-A ~2.7kb AC4 AC2 (TrAP) AC1 (Rep) (Rep) AV1 (CP) AC3 (REn) AV2 1 Hình 1. T ch c b gien phân tổ ứ ộ ử DNA-A c a begomovirusủ . CP = coat protein. REn = replication enhancer. TrAP = transcriptional activator protein. Rep = replication associated protein. (ToLCVV) (Green et al. 2001), tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV) và tomato yellow leaf curl Kanchanaburi (TYLCKaV) (Hà et al. 2008). Trong s 3 virus trên, 2 virus đ cố ượ phân l p trên m u cà chua gây b nh xoăn vàng lá mi n B c là ToLCVV và TLCVNV.ậ ẫ ệ ở ề ắ Cũng d a trên các phân tích phân t , Vi t Nam d ng nh là trung tâm đa d ng c aự ử ệ ườ ư ạ ủ begomovirus (Ha et al. 2006, 2008). M c dù v y s l ng begomovirus đ c xác đ nh trênặ ậ ố ượ ượ ị th c v t c a Vi t Nam v n còn ít, ch g m 19 virus đ c phân l p t nhi u loài cây, trong đóự ậ ủ ệ ẫ ỉ ồ ượ ậ ừ ề nhi u loài là cây d i (Green et al., 2001; Revill et al., 2003; Ha et al., 2006, 2008). K t qu trênề ạ ế ả g i ý r ng nhi u begomovirus n a đang gây h i trên cà chua và các cây tr ng khác Viêt Namợ ằ ề ữ ạ ồ ở và c n ph i đ c xác đ nh.ầ ả ượ ị Vi c phòng tr begomovirus trên cà chua nhìn chung là khó và ch y u hi n nay d a vàoệ ừ ủ ế ệ ự các chi n l c sau: (i) t o gi ng kháng b nh d a vào ngu n gen kháng b nh có ngu n g c tế ượ ạ ố ệ ự ồ ệ ồ ố ừ cà chua d i; (ii) t o gi ng kháng b nh d a vào gen c a tác nhân gây b nh, trong đó gen c aạ ạ ố ệ ự ủ ệ ủ begomovirus đ c chuy n vào cây và thông qua c ch siRNA đ t o tính kháng; và (iii)ượ ể ơ ế ể ạ phòng ch ng t ng h p, trong đó thành ph n ch ch t là tiêu di t b ph n, c t ngu n ký chố ổ ợ ầ ủ ố ệ ọ ấ ắ ồ ủ c a virus, nh b cây b nh, s d ng gi ng kháng (Czosnek, 2007).ủ ổ ỏ ệ ử ụ ố Vi c xác đ nh đ yệ ị ầ đ thành ph n begomovirus trên cà chua luôn c n thi t cho b t c chi n l c phòng ch ngủ ầ ầ ế ấ ứ ế ượ ố nào 1.2. M c đích và yêu c uụ ầ M c đích:ụ Xác đ nh thành ph n loài Begomovirus h i cà chua t i Hà N i và ph c n.ị ầ ạ ạ ộ ụ ậ Yêu c u:ầ − Thu m u và x lý m u cà chua b b nh xoăn vàng lá.ẫ ử ẫ ị ệ − Xác đ nh s có m t c a các begomovirus b ng PCR dùng m i chung (degenerate primers)ị ự ặ ủ ằ ồ đ c hi u cho DNA-A c a virus .ặ ệ ủ − Xác đ nh thành ph n begomovirus t i các đi m đi u tra dùng c p m i đ c hi u v i 2 loàiị ầ ạ ể ể ặ ồ ặ ệ ớ virus đã đ c xác đ nh tr c t i mi n B c là tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) vàượ ị ướ ạ ề ắ tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV). − Gi i trình t s n ph m PCR c a các m u virus có kh năng là loài m iả ự ả ẩ ủ ẫ ả ớ . II. V T LI U VÀ PH NG PHÁPẬ Ệ ƯƠ 2.1. Thu m u và x lý m uẫ ử ẫ M u b nh cây cà chua có tri u ch ng đi n hình c a b nh xoăn vàng lá đ c thu th p t iẫ ệ ệ ứ ể ủ ệ ượ ậ ạ các ru ng tr ng thu c Hà N i và ph c n.ộ ồ ộ ộ ụ ậ M u sau khi thu th p đ c s li u hóa và x lý khô b ng silicagel ho c s y 37 ẫ ậ ượ ố ệ ử ằ ặ ấ ở OC. M uẫ sau khi x lý khô đ c b o qu n lâu dài trong l ch a silicagel 4 ử ượ ả ả ọ ứ ở OC. 2.2. Th i gian và đ a đi m nghiên c u.ờ ị ể ứ Nghiên c u đ c th c hi n tứ ượ ự ệ ừ 24/06/2008 đ n 15/01/2009 t i TT BCNĐ, ĐHNNHNế ạ 2.3. Chi t DNA t mô lá cà chuaế ừ DNA t ng s t mô lá đ c chi t theo 2 ph ng pháp:ổ ố ừ ượ ế ươ Ph ng pháp chi t nhanh nhanh b ng NaOH (Wang et al., 1993): Cho kho ng 50 mg mô láươ ế ằ ả cà chua vào tube 1,5 mL. Cho 0,5 mL dung dich NaOH 0,5 M vào tube. Dùng chày nh a chuyênự d ng đ nghi n nhuy n m u lá. Hòa loãng d ch nghi n 50 - 100 l n v i đ m Tris 0,1 M, pH =ụ ể ề ễ ẫ ị ề ầ ớ ệ 8 (5 μL d ch nghi n hòa loãng v i 495 ị ề ớ μL đ m Tris). D ch hòa loãng này đ c dùng đ ch yệ ị ượ ể ạ PCR. 2 Ph ng pháp chi t dùng CTAB (Doyle & Doyle (1987). Kho ng 100 mg mô lá b nh t iươ ế ả ệ ươ (ho c 20 mg mô lá b nh khô) đ c nghi n v i 1 mL đ m CTAB. DNA đ c chi t 2 l n v iặ ệ ượ ề ớ ệ ượ ế ầ ớ Chloroform: isoamyl alcohol (24:1). Căn DNA đ c r a 2 l n b ng ethanol 70% và hòa trongượ ử ầ ằ 50 uL n c c t 2 l n vô trùng. D ch chi t DNA đ c gi -20OCướ ấ ầ ị ế ượ ữ ở 2.4. PCR (Polymerase Chain Reaction) Các ph n ng PCR đ c th c hi n trong tube 0.5 mL v i t ng th tích ph n ng 25 ả ứ ượ ự ệ ớ ổ ể ả ứ μL ch a 2.5 ứ μL dung d ch đ m PCR X10 (Fermantas), 0.5 ị ệ μL dNTPS (10 mM môi lo i A, T, G, C,ạ Roche), 0.5 μL m i lo i m i đ c hi u xuôi dòng và ng c dòng ho c 1 ỗ ạ ồ ặ ệ ượ ặ μL cho m i m i chungỗ ồ (đ u đ c chu n b n ng đ 20 ề ươ ẩ ị ở ồ ộ μM), 1.5 µL MgCl2, 0.25 µL Taq polymerase (Fermentas) và 0.5 μL DNA. Ph n ng PCR đ c th c hi n trên máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc.) v i đi u ki nả ứ ượ ự ệ ớ ề ệ sau: kh i đ u bi n tính 94 ở ầ ế ở OC trong 5 phút; ti p theo là 35 chu trình PCR (bi n tính 94 ế ế ở OC 30 - 40 giây, g n m i 50 ắ ồ ở OC 35 - 45 giây và t ng h p s i 72 ổ ợ ợ ở OC 1 – 1.5 phút). Ph n ngả ứ đ c k t thúc v i 5 phút 72 ượ ế ớ ở OC. S n ph m PCR đ c đi n di trên gel agarose 1 % đ c chu n b b ng đ m TAE và ch aả ẩ ượ ệ ươ ẩ ị ằ ệ ứ 0.5 mg/mL ethidium bromide. Gel đ c ch y trên thi t b đi n di là Mini-Sub Cell (Biorad) v iượ ạ ế ị ệ ớ đ m TAE đi n th 100 V trong 30 - 40 phút. B n gel đ c ki m tra d i ánh sáng t ngo iệ ở ệ ế ả ượ ể ướ ử ạ và đ c chup b ng máy nh s .ượ ằ ả ố 2.5. M i PCRồ Ba c p m i đã đ c s d ng trong nghiên c u. Chi ti t c a các m i đ c trình bày ặ ồ ượ ử ụ ứ ế ủ ồ ượ ở B ng 1 và Hình 2.ả Căp m i th nh t là c p m i chung (universal/degenerate primers) BegoAFor1 /ồ ứ ấ ặ ồ BegoARev1. C p m i này đ c thi t k trên vùng b o th c a gien CP và Rep và đã đ cặ ồ ượ ế ế ả ủ ủ ượ ch ng minh có kh năng phát hi n DNA-A c a nhi u begomovirus (Ha et al., 2006, 2008)ứ ả ệ ủ ề Hai c p m i còn l i là các m i đ c hi u cho TYLCVNV (TYLCVNV-sp-Fặ ồ ạ ồ ặ ệ 1 / TYLCVNV- sp-R1) và ToLCVV (ToLCVV-sp-F2 / ToLCVV-sp-R2). Các m i này đã đ c thi t k d a trênồ ượ ế ế ự trình t chu i gien đã công b c a 2 virus này.ự ỗ ố ủ B ng 1. Các m i đ c s d ng trong nghiên c uả ồ ượ ử ụ ứ M iồ Trình t (5’ – 3’)ự V tríị Kích th cướ (bp) Tham kh oả TYLCVNV-Sp- F1 TGTGTTACATATTCTGTGTTTTC C 1094-1117 1386 Mã GeneBank DQ641697TYLCVNV-Sp- R1 AAATACATCAAAATCTGCAGAG AGC 2456-2480 ToLCVV-Sp-F2 GACCAGTCTGAAGGTGTGAGTTC 1254-1276 454 Mã GeneBank DQ641705ToLCVV-Sp-R2 ACTCAAGCTATAAAGAATACCTAGAC 1683-1708 BegoAFor1 TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC* Hình 2 ~1200 Ha et al., 2006 BegoARev1 ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC* * Y (C / T), R (G / A), H (A / C / T), M (A / C), B (C / G / T), D (A / G / T), K (G / T) và i = 3 inosine 2.6. Gi i trình tả ự S n ph m PCR đ c tinh chi t t gel agarose dùng kít tinh chi t PureLinkả ẩ ượ ế ừ ế TM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo h ng d n c a nhà s n xu t. Hàm l ng DNA đ c cướ ẫ ủ ả ấ ượ ượ ướ l ng b ng đi n di agarose v i l ng DNA tham kh o là 2µl, 1µl, 0.5µl t ng ng v i 1µg,ượ ằ ệ ớ ượ ả ươ ứ ớ 0.5 µg, 0.25 µg DNA (marker GeneRuler, Fermantas). S n ph m PCR tinh chi t đ c gi i trình t tr c ti p c 2 chi u b ng m i PCR t i Vi nả ẩ ế ượ ả ự ự ế ả ề ằ ồ ạ ệ Công ngh sinh h c (Hà N i)ệ ọ ộ 2.7. Phân tích trình t và xây d ng cây ph h .ự ự ả ệ Các chu i m u đ c xác đ nh danh tính khi so sánh v i các chu i đã công b t tr c nhỗ ẫ ượ ị ớ ỗ ố ừ ướ ờ ph n m m tìm ki m BLAST t i NCBI (the National Center for Biotechnology Informationầ ề ế ạ ( Phân tích chu i và xây d ng cây ph h đ c th c hi n v i các ph n m m mi n phíỗ ự ả ệ ượ ự ệ ớ ầ ề ễ BioEdit 7.0, ClustalX1.83, Mega 4.0 và gói ph n m m th ng m i DNASTAR.ầ ề ươ ạ III. K T QU NGHIÊN C UẾ Ả Ứ 3.1. Đi u tra thu th p m u b nhề ậ ẫ ệ Chúng tôi đã ti n hành đi u tra b nh xoăn vàng lá trên các ru ng tr ng cà chua thu c Hàế ề ệ ộ ồ ộ N i, B c Ninh và H ng Yên. T ng s 50 m u cà chua đã đ c thu th p, s li u hóa và x lýộ ắ ư ổ ố ẫ ượ ậ ố ệ ử khô đ b o qu n lâu dài. Các m u này đ u t o tri u ch ng đ c tr ng c a b nh xoăn vàng lá. ể ả ả ẫ ề ạ ệ ứ ặ ư ủ ệ 3.2. Ki m tra PCR dùng m i đ c hi u begomovirrusể ồ ặ ệ Do s l ng m u thu th p khá l n nên chúng tôi đã ch n 19 m u b nh đ i di n cho cácố ượ ẫ ậ ớ ọ ẫ ệ ạ ệ đ a đi m khác nhau đ ki m tra PCR. Đ u tiên, chúng tôi s d ng c p m i chung đ c hi uị ể ể ể ầ ử ụ ặ ồ ặ ệ cho DNA-A c a nhi u loài begomovirus (BegoaFor1/BegoARev1) nh m phát hi n s có m tủ ề ằ ệ ự ặ c a virus trong m u cây b nh. Ph n ng PCR đ u t o ra 1 s n ph m có kích th c kho ngủ ẫ ệ ả ứ ề ạ ả ẩ ướ ả 1200 bp trên t t c 19 m u th , ch ng t s có m t c a begomovirus trong m u (Hình 3A,ấ ả ẫ ử ứ ỏ ự ặ ủ ẫ B ng 2)ả 3.3. Ki m tra PCR dùng m i đ c hi u ToLCVV và TYLCVNV ể ồ ặ ệ Hi n nay, t i mi n B c Vi t Nam m i ch công b s có m t c a 2 begomovirus gây b nhệ ạ ề ắ ệ ớ ỉ ố ự ặ ủ ệ xoăn vàng lá cà chua là ToLCVV và TYLCVNV. Đ ki m tra s có m t c a 2 virus này trên 19ể ể ự ặ ủ (CEGPCKVQS) (IPT/A/SIF/VLCNP) AV1 AV2 AC3 AC2 AC1 AC4 BegoAFor1 BegoARev1~ 1.2 kb DNA-A Hình 2. S đ t ch c b gien DNA-A (bi u di n d i d ng m ch th ng) ơ ồ ổ ứ ộ ể ễ ướ ạ ạ ẳ c a begomovirus và v trí t ng đ i c a c p m i BegoAFor1 và ủ ị ươ ố ủ ặ ồ BegoARev1. Mũi tên d ng h p bi u di n v trí và h ng c a các ORF. Dãy ch ạ ộ ể ễ ị ướ ủ ữ trong 2 ngo c kép là các chu i axit amin b o th t ng ng v i 2 m i ặ ỗ ả ủ ươ ứ ớ ồ BegoAFor1 và BegoARev1. 4 m u cà chua nhi m begomovirus, chúng tôi đã s d ng 2 c p m i đ c hi u cho m i virusẫ ễ ử ụ ặ ồ ặ ệ ỗ (ph n 2.5). ầ Ki m tra PCR v i ể ớ c p m i ToLCVV-sp-F2 / ToLCVV-sp-R2 (đ c hi u ToLCVV) cho th yặ ồ ặ ệ ấ 10/19 m u th t o các băng đ n và rõ v i kích th c kho ng 450 bp (Hình 3B, B ng 2), xác nh nẫ ử ạ ơ ớ ướ ả ả ậ s có m t c a ToLCVV.ự ặ ủ Ki m tra PCR v i c p m i TYLCVNV-sp-R1 / TYLCVNV-sp-F1 (đ c hi u TYLCVNV) choể ớ ặ ồ ặ ệ th y ấ 8/19 m u t o ra ẫ ạ t o các băng đ n và rõ v i kích th c kho ng 1386 bp (Hình 3C, B ng 2),ạ ơ ớ ướ ả ả xác nh n sậ có m t c a TYLCVNVự ặ ủ . Ki m tra PCR đã phát hi n th y m u s 12 (m u thu t i Yên M - Thanh Trì - Hà N i) có k tể ệ ấ ẫ ố ẫ ạ ỹ ộ ế qu (+) v i c hai c p m i ch ng t m u này đã nhi m c 2 virus ToLCVV và TYLCVNV.ả ớ ả ặ ồ ứ ỏ ẫ ễ ả Quan tr ng nh t là chúng tôi đã phát hi n 2 m u (mọ ấ ệ ẫ u s 9, thu t i Đa T n – Gia Lâm – Hàẫ ố ạ ố N i và m u s 14, thu t i Yênộ ẫ ố ạ M – Thanh Trì – Hà N i) có ph n ng PCR (–) v i c hai c pỹ ộ ả ứ ớ ả ặ m i. K t qu này g i ý r ng các begomovirus nhi m trên 2 m u này có th không ph i làồ ế ả ợ ằ ễ ẫ ể ả ToLCVV hay TYLCVNV. Tuy nhiên danh tính c a chúng ch th đ c xác đ nh d a trên phânủ ỉ ể ượ ị ự tích trình t chu i gien virus.ự ỗ B ng ả 2. Ki m tra PCR các m u cà chua b b nh xoăn vàng láể ẫ ị ệ TT * Mã m uẫ Đ a đi m thu m uị ể ẫ PCR đ c hi u ặ ệ Begomoviru s ToLCVV TYLCVNV 1 CC1 Nam H ng – Đông Anh – Hà N i.ồ ộ + – + 2 CC2 Nam H ng – Đông Anh – Hà N i.ồ ộ + + – 3 CC 3 C Bi – Gia Lâm – Hà N i.ổ ộ + + – 4 CC 4 C Bi – Gia Lâm – Hà N i.ổ ộ + + – 5 CC 5 C Bi – Gia Lâm – Hà N i.ổ ộ + + – 6 CC 6 T S n – B c Ninh.ừ ơ ắ + + – 5 1200 bp 454 bp 1386 bp A B C M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Hình 3. K t qu đi n di s n ph m PCR c a các m u cà chua b b nh xoăn vàng lá thu th pế ả ệ ả ẩ ủ ẫ ị ệ ậ đ cượ . A) PCR v i c p m i chung đ c hi u DNA-A c a begomovirus. ớ ặ ồ ặ ệ ủ B) PCR v i c p m i đ cớ ặ ồ ặ hi u DNA-A c a ToLCVV. ệ ủ C) PCR v i c p m i đ c hi u DNA-A c a TYLCVNV. M là thangớ ặ ồ ặ ệ ủ DNA (GeneRuler 1 kb, Fermentas). Các s t 1 đ n 19 là các m u cà chua (danh tính m u đ cố ừ ế ẫ ẫ ượ trình bày b ng 2). Kích th c s n ph m PCR cũng đ c ch rõ.ở ả ướ ả ẩ ượ ỉ 7 CC 7 T S n – B c Ninh.ừ ơ ắ + + – 8 CC 8 Đa T n – Gia Lâm – Hà N iố ộ + + – 9 CC 9 Đa T n – Gia Lâm – Hà N iố ộ + – – 10 CC 10 Đa T n – Gia Lâm – Hà N iố ộ + + – 11 CC 11 Duyên Hà – Thanh Trì – Hà N i.ộ + – + 12 CC 12 Yên M – Thanh Trì – Hà N i.ỹ ộ + + + 13 CC 13 Yên M ỹ – Thanh Trì – Hà N i.ộ + – + 14 CC 14 Yên M – Thanh Trì – Hà N iỹ ộ + – – 15 CC 15 Yên Phú – Yên M ỹ – H ng Yên.ư + – + 16 CC 16 Yên Phú – Yên M ỹ – H ng Yên.ư + – + 17 CC 17 Yên Phú – Yên M ỹ – H ng Yên.ư + – + 18 CC 18 Ngô Xuyên – Nh Quỳnh – H ngư ư Yên + + – 19 CC 19 Đ i h c Nông nghi p Hà N iạ ọ ệ ộ + - + * S th t trong b ng này cũng là s th t các m u Hình 3ố ứ ự ả ố ứ ự ẫ ở 3.4. K t qu gi i trình t m u PCRế ả ả ự ẫ Vì danh tính c a begomovirus ch có th đ c xác đ nh chính xác d a trên phân tích trình tủ ỉ ể ượ ị ự ự gien nên đ i v i 2 m u có PCR (-) đ i v i ToLCVV và TYLCVNV (m u s 9 và 14, Hình 3B,ố ớ ẫ ố ớ ẫ ố 3C, B ng 2) chúng tôi đã gi i trình t tr c ti p s n ph m PCR đ c khuy ch đ i b ng c pả ả ự ự ế ả ẩ ượ ế ạ ằ ặ m i BegoAFor1/BegoARev1. S n ph m PCR đ c tinh chi t t gel agarose dùng kít tinh chi tồ ả ẩ ượ ế ừ ế (PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit, Invitrogen) và đ c c l ng n ng đ b ng đi n diượ ướ ượ ồ ộ ằ ệ agarose tr c khi đ c gi i trình t c 2 chi u b ng m i PCR t i Vi n Công ngh sinh h cướ ượ ả ự ả ề ằ ồ ạ ệ ệ ọ t i Hà N i.ạ ộ K t qu cho th y t t c 4 s n ph m gi i trình t đ u có ch t l ng t t, không b nhi u,ế ả ấ ấ ả ả ẩ ả ự ề ấ ượ ố ị ễ các dâu hi u nucleotide đ u rõ ràng (ngo i tr ph n 2 đ u m i s n ph m). Các trình tệ ề ạ ừ ầ ở ầ ỗ ả ẩ ự đ c l p ráp, biên t p và lo i b các đo n có ch t l ng kém 2 đ u (do gi i trình t tr cượ ắ ậ ạ ỏ ạ ấ ượ ở ầ ả ự ự ti p) dùng ph n m m BioEdit và SeqMan (DNASTAR).Cu i cùng chúng tôi thu đ c đo nế ầ ề ố ượ ạ trình t c a 2 m u v i chi u dài m i đo n là 819 nts. C 2 đo n này này đ u ch a toàn bự ủ ẫ ớ ề ỗ ạ ả ạ ề ứ ộ ORF AC3 v i kích th c 402 nts (Hình 4).ớ ướ M u s 9 (Đa T n – Gia Lâm – Hà N i)ẫ ố ố ộ 5’CACAGGATTTTGGTCAGGTGTTTAACATGTATGATAACGAGCCAAGTACAGCCAC AGTGAAGAACGATAACAGAGATCGCTTTCAAGTTCTACGGCGTTTTCAGGCGACTG TTACTGGTGGTCAGTATGCAAGTAAGGAGCAAGCAATAGTTAGGAAGTTTATGAA GGTGAACAACCATGTGACGTATAATCATCAAGAAGCTGCGAAGTATGACAATCAC ACAGAGAATGCTCTTTTGTTGTATATGGCATGTACTCATGCTAGTAATCCTGTGTAT GCTACTTTGAAAATCAGAATCTATTTCTATGATTCTGTTCAGAATTAATAAAGATTG AATTTTATTATATTTGAATGTGTTACATATTCTGTCTTTTCCAATACATCCCATAATA CATGATCACATGCTCTAATTACATTGTTAATACTAATTACACCCAAATTATCTAAAT ATTTCATACATTGAACCCTAAATACTCTTAAGAAACGCCAAGTCTGAGGACGTAAA CGAGTCCAGATTTGGAATATTAGAAAACATTGGTGTATTCCCAACGCTTTCCTCAG GTTGTAATTGAATTGGACTTGTATTGTGATGATGTCGTTGTTCATCAGAAATGGTCT CTCGTCGTGGCTGATTATCTTGAAATATAGGGGATTTTTGACCGTCCAGATATATAC 6 GCCACTCTCTGCTTGAGCTGCAGTGATAGCTTCCCCTGTGCGAGAATCCATGATTGT GACAGCCTAGTGCAATGAAGTATGAACAGCCACAAGGAAGATCAACTCTCCGTCT CCTCGTTGCTTTCTTGGCGTTGCGGTGTTGC 3’ M u s 14 (Yên M - Thanh Trì – Hà N i)ẫ ố ỹ ộ 5’CCCAGGATTTTGGCCAGGTGTTTAACATGTATGATAATGAGCCGAGTACAGCTAC TGTGAAGAATGACAACAGGGATCGTTTTCAAGTTCTCCGCCGTTTTCAAGCCACTG TTACTGGTGGCCAGTATGCAAGTAAGGAGCAAGCAATAGTCAGGAAATTCATGAA GGTGAATAACCATGTAACTTATAACCATCAAGAGGCTGCGAAGTATGATAACCAC ACAGAAAATGCTTTGTTATTGTATATGGCATGTACTCATGCTAGTAATCCAGTGTAT GCTACTTTGAAGATCAGGATCTATTTCTACGATTCTGTTCAGAATTAATAAAGATTA AATTTTATTATACTTGAATCTTCTGTATCAATTGTGCCTTCTAATACATTGTACAAT ACATGAGACATTGCTCTAATTACATTATTGATGCTAATAACTCCTAAATTGTCTAAA TACTTAATACATTGATATTTAAATACTCTTAAGAAACGCGAGGTCTGAGGATGTAA ACGAGTCCAAACTCGGCAGATTAGAAAACATTGGTGTATCCCCAATGCTTTCCTCA GGTTGTAATTGAATTGGACTTGTATTGTGATGATGTCGTGGTTCGTCAGAAATGGT CTCTCGTCGTGGCTGGTTATCTTGAAATATAGGGGATTTTTGACCGTCCAGATATAT ACGCCACTCTCTGCTTGAGCTGCAGTGATAGCTTCCCCTGTGCGAGAATCCATGATT GTGACAGCCTAGTGCAATGAAGTATGAACATCCACAAGGGAGATCAACTCTCCGTC TCCTCGTAGCTTTCTTGGCGTTGCGGTGTTGC 3’ Hình 4. Trình t nucleotide c a s n ph m PCR dùng m i BegoAFor1/BegoARev1 sau khiự ủ ả ẩ ồ đ c biên t pượ ậ . Đo n ORF AC3 mã hóa protein REn đ c bôi đ m v i v trí kh i đ u d ch mãạ ượ ậ ớ ị ở ầ ị cũng nh h ng d ch mã đ c ch b ng mũi tên vuông.ư ướ ị ượ ỉ ằ 3.5. K t qu tìm ki m các trình t t ng đ ng trên GeneBankế ả ế ự ươ ồ S d ng công c tìm ki m tr c tuy n BLAST trên NCBI, chúng tôi đã tìm các chu i gienử ụ ụ ế ự ế ỗ có quan h v i các chu i s 9 và s 14. K t qu tìm ki m d a trên toàn b trình t chu i (819ệ ớ ỗ ố ố ế ả ế ự ộ ự ỗ nts) cho th y chu i trên GeneBank g n gũi nh t v i chu i s 9 là m t isolate c a pấ ỗ ầ ấ ớ ỗ ố ộ ủ apaya leaf curl China virus (PaLCuCNV, isolate FQ1, có ngu n g c t Trung Qu c, mã s ồ ố ừ ố ố AM691554). T ng t , chu i ươ ự ỗ trên GeneBank g n gũi nh t v i chu i s 14 là m t isolate c a ầ ấ ớ ỗ ố ộ ủ Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV, ngu n g c Vi t Nam, mã s DQ641697). ồ ố ệ ố K t qu tìm ki m d a trên trình t gien AC3 cho th y, virus trên GeneBank g n gũi nh tế ả ế ự ự ấ ầ ấ v i c 2 chu i s 9 và 14 đ u là PaLCuCNV.ớ ả ỗ ố ề 3.6. K t qu so sánh m c đ t ng đ ng trình t nucleotideế ả ứ ộ ươ ồ ự Đ đánh giá m c đ t ng đ ng, trình t nucleotide c a 2 m u virus trong nghiên c u nàyể ứ ộ ươ ồ ự ủ ẫ ứ đ c so sánh v i trình t nucleotide c a nhi u virus trên GeneBank. Các chu i virus trênượ ớ ự ủ ề ỗ GeneBank bao g m (i) 5 chu i (không tính cùng hay khác virus) có quan h g n gũi nh t t tìmồ ỗ ệ ầ ấ ừ ki m BLAST, (ii) các virus đ c phân l p t tr c t i Vi t Nam, (iii) nhi u m u virus phânế ượ ậ ừ ướ ạ ệ ề ẫ l p t cà chua thu c c u th gi i và (iv) m t virus đ i di n nhóm tân th gi i (sweet potatoậ ừ ộ ự ế ớ ộ ạ ệ ế ớ leaf curl virus, SPLCV). Ngoài ra, đ đánh giá m c đ t ng đ ng gi a các isolate khác nhauể ứ ộ ươ ồ ữ c a cùng 1 virus, 11 chu i papaya leaf curl China virus (PaLCuCNV) cũng đ c so sánh. Đ uủ ỗ ượ ầ tiên, các chu i đ c “n n” (aligned) dùng ph n m m Clustal X; ti p theo ph n trăm t ngỗ ượ ắ ầ ề ế ầ ươ đ ng nucleotide c a các chu i đ c tính t l nh “sequence identity matrix” c a ph n m mồ ủ ỗ ượ ừ ệ ủ ầ ề Bioedit. Danh tính virus, mã GeneBank, ngu n g c c a 41 chu i virus trên GeneBank đ cồ ố ủ ỗ ượ trình bày B ng 3.ở ả K t qu so sánh d a trên đo n 819 nts cho th y m u virus s 14 có m c t ng đ ng caoế ả ự ạ ấ ẫ ố ứ ươ ồ nh t v i Ageratum leaf curl virus (ALCV, AJ851005, ngu n g c Trung Qu c) v i ph n trămấ ớ ồ ố ố ớ ầ t ng đ ng là 97 % (B ng 3).ươ ồ ả 7 Trong khi đó, m u virus s 9 có m c t ng đ ng cao nh t v i 2 isolate c a PaLCuCNVẫ ố ứ ươ ồ ấ ớ ủ (AM691554, AM691552) có ngu n g c t Trung Qu c và v i TYLCVNV (DQ641697) c aồ ố ừ ố ớ ủ Vi t Nam. Tuy nhiên, ph n trăm t ng đ ng c a m u virus s 9 th p h n nhi u và đ u b ngệ ầ ươ ồ ủ ẫ ố ấ ơ ề ề ằ 89.7 % đ i v i c 3 chu i trên (B ng 3).ố ớ ả ỗ ả C 2 m u virus, s 9 và 14, đ u chia s m c t ng đ ng nucleotide khá th p đ i v i m uả ẫ ố ề ẻ ứ ươ ồ ấ ố ớ ẫ SPLCV, m t đ i di n c a nhóm Tân th gi i (ph n trăm t ng đ ng l n l t là 0.52 và 0.508ộ ạ ệ ủ ế ớ ầ ươ ồ ầ ượ (B ng 3).ả 3.7. K t qu phân tích ph hế ả ả ệ Đ đánh giá m i quan h ph h c a 2 m u begomovirus t nghiên c u này v i cácể ố ệ ả ệ ủ ẫ ừ ứ ớ begomovirus khác, ph n m m MEGA đã đ c s d ng đ tính kho ng cách di truy n và xâyầ ề ượ ử ụ ể ả ề d ng cây ph h d a trên các chu i đã đ c n n tr c b ng ph n m m ClustalX. ự ả ệ ự ỗ ượ ắ ướ ằ ầ ề T ng t nh k t qu so sánh chu i, cây ph h (Hình 5) cho th y virus m u s 14 vàươ ự ư ế ả ỗ ả ệ ấ ẫ ố ALCV hình thành m t c m riêng r v i giá tr boostrap t i 100 % ph n ánh m c đ t ngộ ụ ẽ ớ ị ớ ả ứ ộ ươ đ ng trình t nucleotide r t cao gi a chúng.ồ ự ấ ữ Trái l i m u virus s 9 hình thành m t c m riêng r so v i các chu i ho c c m chu i khácạ ẫ ố ộ ụ ẽ ớ ỗ ặ ụ ỗ (Hình 5) 8 B ng 3. M c t ng đ ng nucleotide d a trên so sánh đo n 819 nts c a 2 m uả ứ ươ ồ ự ạ ủ ẫ begomovirus t nghiên c u này v i đo n t ng ng c a 41 chu i virus trên GeneBankừ ứ ớ ạ ươ ứ ủ ỗ Stt Mã Genbank Tên virus Ký hi uệ Ngu nồ g cố Mẫ u 9 Mẫ u 14 1 AM691554 Papaya leaf curl China virus [FQ1] PaLCuCNV- FQ1 Trung Qu cố 0.89 7 0.83 3 2 AM691552 Papaya leaf curl China virus [F25] PaLCuCNV- F25 Trung Qu cố 0.89 7 0.83 3 3 EU874386 Papaya leaf curl China virus [ ZM1] PaLCuCNV- ZM1 Trung Qu cố 0.89 4 0.83 3 4 AJ558123 Papaya leaf curl China virus [G2] PaLCuCNV-G2 Trung Qu cố 0.89 4 0.82 9 5 AJ558117 Papaya leaf curl China virus [G30] PaLCuCNV- G30 Trung Qu cố 0.89 4 0.83 3 6 AJ811914 Papaya leaf curl China virus [G4] PaLCuCNV-G4 Trung Qu cố 0.89 4 0.82 9 7 AM691553 Papaya leaf curl China virus [LC1-2] PaLCuCNV- LC1-2 Trung Qu cố 0.89 2 0.83 0 8 AJ704604 Papaya leaf curl China virus [G22] PaLCuCNV- G22 Trung Qu cố 0.88 8 0.82 7 9 AJ558125 Papaya leaf curl China virus [G10] PaLCuCNV- G10 Trung Qu cố 0.88 3 0.83 5 10 AJ558124 Papaya leaf curl China virus [G8] PaLCuCNV-G8 Trung Qu cố 0.87 9 0.84 0 11 DQ641700 Papaya leaf curl China virus [VN] PaLCuCNV- VN Vi t Namệ 0.87 9 0.84 7 12 DQ641697 Tomato yellow leaf curl Vietnam virus TYLCVNV Vi t Namệ 0.89 7 0.82 6 13 AJ851005 Ageratum leaf curl virus ALCV Trung Qu cố 0.89 3 0.97 0 14 DQ641698 Erectites yellow mosaic virus EYMV Vi t Namệ 0.84 5 0.86 0 15 AY602166 Tomato yellow leaf curl Guangdong virus TYLCGDV Trung Qu cố 0.83 8 0.85 7 16 AJ810156 Stachytarpheta leaf curl virus SLCV Trung Qu cố 0.83 6 0.84 7 17 AJ437618 Ageratum enation virus AEV Nepal 0.756 0.74 3 9 18 X74516 Ageratum yellow vein virus AYVV Singapo 0.827 0.77 4 19 AF363011 Cotton leaf curl Rajasthan virus CLCuRV n ĐẤ ộ 0.696 0.69 5 20 AJ438936 Eupatorium yellow vein virus EpYVV Nh t B nậ ả 0.711 0.71 1 21 AJ314739 Indian cassava mosaic virus ICMV n ĐẤ ộ 0.712 0.70 1 22 AF126406 Mungbean yellow mosaic India virus MYMIV n ĐẤ ộ 0.62 5 0.62 9 23 AF509739 Luffa yellow mosaic virus LYMV Vi t Namệ 0.677 0.67 0 24 D14703 Mungbean yellow mosaic virus MYMV Thái Lan 0.630 0.62 1 25 AF314531 Pepper leaf curl Bangladesh virus PepLCBV Banglades h 0.76 0 0.74 5 26 AB050781 Soybean crinkle leaf virus SCLV Nh t B nậ ả 0.81 7 0.77 4 27 AF509743 Squash leaf curl China virus SLCCNV Vi t Namệ 0.690 0.68 9 28 AJ566744 Tobacco leaf curl Yunnan virus TbLCuYNV Trung Qu cố 0.80 0 0.75 6 29 AF195782 Tomato leaf curl Laos virus ToLCLV Lào 0.805 0.81 6 30 AF264063 Tomato leaf curl Vietnam virus ToLCVNV Vi t Namệ 0.813 0.78 2 31 AF189018 Tomato yellow leaf curl Indonesia virus ToLCInV Indonesia 0.73 4 0.72 3 32 AY514630 Tomato yellow leaf curl Thailand virus TYLCTHV Thái Lan 0.78 5 0.80 2 33 AF327436 Tomato leaf curl Malaysia virus TLCMaLV Malaysia 0.785 0.79 1 34 AF414287 Pepper leaf curl virus PepLCV Malaysia 0.829 0.84 1 35 EU487040 Tomato leaf curl Philippines virus ToLCPV Philippin 0.80 2 0.80 5 36 DQ641701 Lindernia anagallis yellow vein virus LaYVV Vi t Namệ 0.70 3 0.70 0 37 AM050736 Alternanthera yellow vein virus isolate AlYVV Trung qu cố 0.73 7 0.72 3 38 AF104036 Sweet potato leaf curl virus SPLCV Mỹ 0.524 0.50 8 39 AJ223191 Chayote yellow mosaic virus CYMV Nigeria 0.686 0.67 2 40 AM980509 Tomato yellow leaf curl China virus-[Y278] TYLCuCNV- Y278 Trung Qu cố 0.76 2 0.78 5 10 41 AM181683 Tomato yellow leaf curl China virus-[Y322] TYLCuCNV- Y322 Trung Qu cố 0.77 4 0.77 8 Hình 5. Cây ph h d a trên phân tích đo n 819 nts c a 2 m u virus phân l p t nghiênả ệ ự ạ ủ ẫ ậ ừ c u này và đo n t ng ng c a 41 chu i virus trên GenBankứ ạ ươ ứ ủ ỗ . Các chu i đ c n n b ngỗ ượ ắ ằ ph n m m Clustal X. Kho ng cách di truy n và cây ph h đ c xây d ng dùng ph n m mầ ề ả ề ả ệ ượ ự ầ ề PaLCuCNV.LC1-2.TrungQuoc PaLCuCNV.G4.TrungQuoc PaLCuCNV.F25.TrungQuoc PaLCuCNV.FQ1.TrungQuoc PaLCuCNV.G2.TrungQuoc PaLCuCNV.G22.TrungQuoc PaLCuCNV.ZM1.TrungQuoc PaLCuCNV.G30.TrungQuoc PaLCuCNV.VietNam PaLCuCNV.G8.TrungQuoc PaLCuCNV.G10.TrungQuoc TbLCuYNV.Y61.TrungQuoc AYVV.Singapo SCLV.NhatBan TYLCVNV.VietNam ►m u s 9ẫ ố ToYLCV.VietNam TYLCGDV.G3.TrungQuoc TLCPV.P118.Philippines ToLCLV.Lao TLCMaLV.Malaysia SLCV.Hn30.TrungQuoc ALCV.G52.TrungQuoc ►m u s 14ẫ ố EYMV.VietNam PLCV-MaL.Malaysia TYLCThLV.ThaiLan TYLCuCNV.Y278.TrungQuoc TYLCuCNV.Y322.TrungQuoc MYMIV.Ando MYMV.ThaiLan TYLCInV.LB.Iandonexia CYMV.nigeria ICMV.AnDo AEV.Nelpan PepLCBV.Bangladesh CLCuRV.Ando LYMV.VietNam SLCCNV.Vi tNamệ LiAYVV.VietNam AlYVV.VietNam EpYVV.NhatBan SPLCV.My 100 100 100 92 83 100 54 78 61 96 23 39 28 37 99 24 94 94 55 55 99 2659 9 12 46 8071 100 60 77 84 40 57 98 77 100 73 0.05 11 MEGA. Giá tr bootraps (%) v i 1000 l n l p l i đ c ch rõ g c các nhánh. Thanh bar thị ớ ầ ặ ạ ượ ỉ ở ố ể hi n kho ng cách di truy n b ng 0.05. Danh tính virus đ c trình bày B ng 3.ệ ả ề ằ ượ ở ả 4. TH O LU NẢ Ậ 4.1. Tính đ c hi u c a c p m i đ c hi u ToLCVV và TYLCVVặ ệ ủ ặ ồ ặ ệ C 2 c p m i đ c hi u đã ch ng t kh năng phát hi n và phân bi t 2 virus ToLCVV vàả ặ ồ ặ ệ ứ ỏ ả ệ ệ TYLCVNV gây b nh xoăn vàng lá cà chua. K t qu PCR v i 2 c p m i đ c hi u đã cho th yệ ế ả ớ ặ ồ ặ ệ ấ c 2 virus đ u khá ph bi n t i đ a bàn đi u tra (10/19 m u nhi m ToLCVV và 8/19 m uả ề ổ ế ạ ị ề ẫ ễ ẫ nhi m TYLCVNV). ễ Đáng chú ý là dùng 2 c p m i này, chúng tôi đã phát hi n m t m u nhi m c 2 virus. K tặ ồ ệ ộ ẫ ễ ả ế qu này không ng c nhiên vì nhi m b nh h n h p 2 hay nhi u begomovirus trên cùng m t câyả ạ ễ ệ ỗ ợ ề ộ là hi n t ng khá ph bi n đ i v i begomovirus (Fauquet et al., 2005). Nhi m b nh h n h pệ ượ ổ ế ố ớ ễ ệ ỗ ợ có th gây h u qu l n v ti n hóa c a begomovirus vì chúng có th tái sinh thông qua c chể ậ ả ớ ề ế ủ ể ơ ế tái t h p (Jeske et al., 2001) d n t i hình thành các loài begomovirrus m i. Th c t là virusổ ợ ẫ ớ ớ ự ế TYLCVNV đã đ c phân l p t m t cây cà chua nhi m h n h p v i c ToLCVV và c 2ượ ậ ừ ộ ễ ỗ ợ ớ ả ả virus này chia s m t vùng g n nh đ ng nh t kho ng 1000 nts vùng bên ph i c a b gienẻ ộ ầ ư ồ ấ ả ở ả ủ ộ (Ha et al., 2008). 4.2. Đã l n đ u tiên phát hi n đ c s có m t c a Ageratum leaf curl virus (ALCV) trênầ ầ ệ ượ ự ặ ủ cà chua t i Vi t Namạ ệ K t qu so sánh trình t nucleotide và phân tích ph h d a trên đo n 819 nts cho th yế ả ự ả ệ ự ạ ấ begomovirus nhi m trên m u cà chua s 14 có l là m t isolate c a ALCV. ALCV là m t virusễ ẫ ố ẽ ộ ủ ộ đ c phân l p trên cây ageratum (hoa ngũ s c) t nh Qu ng Tây – Trung Qu c, m t t nh giápượ ậ ắ ở ỉ ả ố ộ ỉ v i Vi t Nam, vào năm 2003 (AJ851005). Cây ageratum là m t cây ký ch a thích c a nhi uớ ệ ộ ủ ư ủ ề begomovirus. Cho t i nay (2008), 5 begomovirus đã đ c công b là phân l p đ u tiên trên câyớ ượ ố ậ ầ ageratum (có t đ u tiên c a tên virus là ageratum) (Fauquet et al., 2008).ừ ầ ủ Cũng c n chú ý r ng gi thi t trên ch có th đ c kh ng đ nh ch c ch n khi toàn b bầ ằ ả ế ỉ ể ượ ẳ ị ắ ắ ộ ộ gien c a virus m u s 14 đ c gi i mã toàn b vì begomovirus có kh năng tái t h p r t cao,ủ ẫ ố ượ ả ộ ả ổ ợ ấ th m chí 2 virus thu c 2 loài khác nhau có th chia s đo n tái t h p có kích th c r t l nậ ộ ể ẻ ạ ổ ợ ướ ấ ớ nh đã đ c ch ng minh TYLCVNV và ToLCVV (Ha et al., 2008).ư ượ ứ ở 4.3. Đã phát hi n đ c m t loài begomovirus m i trên cà chuaệ ượ ộ ớ Cũng t k t qu so sánh trình t nucleotide và phân tích ph h d a trên đo n 819 nts,ừ ế ả ự ả ệ ự ạ chúng tôi đã phát hi n đ c m t begomovirus m i trên cà chua (virus nhi m m u s 9). K tệ ượ ộ ớ ễ ẫ ố ế lu n này d a trên 2 b ng ch ng sau đây.ậ ự ằ ứ Th nh t, m c đ t ng đ ng trình t nucleotide (đo n 819 nts) c a virus m u s 9 v i 2ứ ấ ứ ộ ươ ồ ự ạ ủ ẫ ố ớ virus g n gũi nh t trên GeneBank (PaLCuCNV và TYLCVNV) khá th p, t i đa ch 89.7%ầ ấ ấ ố ỉ (B ng 2). Vì không có m t ng ng phân bi t loài d a trên đo n 819 nts nên chúng tôi đã soả ộ ưỡ ệ ự ạ sánh m c t ng đ ng trình t nucleotide c a đo n này trong s 11 isolate khác nhau c a cùngứ ươ ồ ự ủ ạ ố ủ m t loài PaLCuCNV (danh tính c a các virus này trình bày B ng 3). K t qu so sánh choộ ủ ở ả ế ả th y 11 isolate này có m c t ng đ ng nucleotide d a trên đo n 819 nts trung bình 96.2 %,ấ ứ ươ ồ ự ạ th p nh t 93.7 % và cao nh t 99.7 % (s li u không trình bày trong báo cáo này). Rõ ràng m cấ ấ ấ ố ệ ứ t ng đ ng t i đa gi a virus m u s 9 v i PaLCuCNV (89.7 %) còn th p h n m c t ngươ ồ ố ữ ẫ ố ớ ấ ơ ứ ươ đ ng gi a 2 isolate cách xa nhau nh t c a PaLCuCNV (93.7 %).ồ ữ ấ ủ Th hai, trên cây ph h , virus m u s 9 t o thành m t nhánh đ c l p v i TYLCVNV vàứ ả ệ ẫ ố ạ ộ ộ ậ ớ c m PaLCuCNV (2 virus g n gũi nh t khi so sánh trình t nucleotide). So sánh kho ng cách diụ ầ ấ ự ả truy n t ng đ i cũng cho th y rõ ràng virus m u s 9 khác bi t hoàn toàn v i 2 virus trên.ề ươ ố ấ ẫ ố ệ ớ 12 D a vào tri u ch ng đi n hình c a cây nhi m virus và đ a đi m thu th p m u, theo h ngự ệ ứ ể ủ ễ ị ể ậ ẫ ướ d n cách đ t tên virus thu c h ẫ ặ ộ ọ Geminiviridae c a ICTV (Fauquet & Stanley (2005)), chúng tôiủ đ t tên virus là ặ tomato leaf curl Gialam virus vi t t t là (ToLCGLV).ế ắ 13