Đề tài Liệu pháp gen

Chủ đề: LIỆU PHÁP GEN Nhóm thực hiện:16 Nguyễn Thị Thu Thanh Lê Thị Như Thảo Phạm Thị Huyền Trang Phan Thị Anh Văn NHỮNG NỘI DUNG CHÍNH GIỚI THIỆU CHUNG. LIỆU PHÁP GEN VÀ CÁC BƯỚC CƠ BẢN CỦA LIỆU PHÁP GEN. CÁC YẾU TỐ TRONG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN. ỨNG DỤNG VÀ TRIỂN VỌNG. GIỚI THIỆU CHUNG: Vào ngày 14-9-1990, nhóm nghiên cứu tại học viện sức khoẻ quốc gia Mỹ(U.S.National Instituse ò Helth) đã tiến hành chuỗi thử nghiệm liệu phấp gen đầu tiên cho bé Ashanti Desilva 4 tuổi. Sinh ra với căn bệnh di truyền hiểm nghèo có tên là severe combined immune deficiency (SCDI), cô bé thiếu hệ thống miễn dịch và có thể bị tổn thưong khi mắt phải bất kì mầm bệnh nào. trẻ em mắc bệnh này thuờng không chống lại đuợc sự lây nhiễm của bệnh tật và rất khó sống đến tuổi trưởng thành, tuổi thơ của chúng luôn mắc bệnh tật.Ashanti được lập một hành lang bảo vệ xung quanh, không tiếp xúc với những người ngoài gia đình, trong môi trường vô trùng tại nhà và được điều trị thường xuyên với kháng sinh liều cao. Trong thủ tục liệu pháp gen của Ashanti, bác sĩ đã tách các tế bào máu trắng ra khỏi cơ thể cô ta, cho chúng phát triển trong phòng thí nghiệm, gắn gen thiếu vào các tế bào này và sau đó chuyển các tế bào đã được biến đổi di truyền trở lại máu của bệnh nhân. Những kiểm tra trong phòng thí nghiệm đã cho thấy liệu pháp này đã làm tăng hệ thống miễn dịch của Ashanti, cô ta không bị cảm lạnh trở lại, có thể đến trường và đã miễn dịch với chứng ho. Thủ tục này không phải là một phương thuốc, những tế bào máu trắng được xử lý về mặt di truyền chỉ làm việc trong một vài tháng và quá trình này phải lặp lại. Mặc dù sự giải thích đơn giản về liệu pháp gen này dường như có kết quả khả quan, nhưng nó mở đầu cho một cuộc tranh luận kéo dài; con đường để liệu pháp gen được chấp nhận chứa đầy những cuộc tranh luận. Liệu pháp gen sinh học ở người là rất phức tạp, một số công nghệ cần được phát triển và những căn bệnh cần được hiểu biết cặn kẽ hơn trước khi liệu pháp gen có thể được sử đụng một cách thích đáng. Tuy nhiên, không thể phủ nhận rằng, ngày nay liệu pháp gen là một lĩnh vực khổng lồ với cơ hội sinh lời lớn cho các nhà đầu tư có hiểu biết. Bằng chứng là sự phát triển của các nghiên cứu về liệu pháp gen trong hơn một thập kỷ qua. Lĩnh vực này có tiềm năng vô cùng to lớn, một số người đã so sánh tiềm năng đầu tư trong công nghệ sinh học đặc biệt là liệu pháp gen với kinh nghiệm về công nghệ những năm 1980. LIỆU PHÁP GENE VẤ CÁC BƯỚC CƠ BẢN TRONG LIỆU PHÁP GENE. 1, Định nghĩa: Trong các ứng dụng của sinh học phân tử vào y học, liệu pháp gen đối với các rối loạn di truyền mở ra nhiều triển vọng nhất, đồng thời cũng là hướng ứng dụng khó thực hiện nhất. Các định nghĩa về liệu pháp gen được thay đổi theo thời gian, ngày nay không có định nghĩa chung nào được chấp nhận cho khái niệm này. Song định nghĩa sau đây được sử dụng rộng rãi nhất trong các diễn đàn Quốc tế. Liệu pháp gen là kĩ thuật đưa gen lành vào cơ thể để thay thế cho gene bệnh hay đưa gene cần thiết nào đó thay vào vị trí gene bị sai hỏng để đạt được mục tiêu của liệu pháp 2, Các loại gene trị liệu: - Liệu pháp gene tế bào soma( Somatic Gene Therapy): là phương pháp điều trị thay hoặc sửa chữa các gen hỏng, gen gây bệnh của các tế bào soma trong cơ thể bệnh nhân. Liệu pháp gen soma có thể sử dụng một số loại tế bào như tế bào lympho, nguyên bào sợi, tế bào gốc (stem cell), tế bào máu... - Liệu pháp gen tế bào mầm (Germline Gene therapy): là phương pháp điều trị, sửa chữa hay thay thế các gen hỏng cho giao tử (tinh trùng hoặc tế bào trứng) đưa các tế bào mầm trở lại trạng thái sinh lý bình thường. 3. Các bước thực hiện - Tách dòng gen trị liệu (tạo ra các đoạn DNA) - Chọn vector chuyển gen phù hợp với gen trị liệu và nối chúng lại với nhau. - Tạo các vectơ tái tổ hợp và đưa các vectơ mang gen trị liệu vào tế bào chủ và nhân lên. - Chọn lọc các trình tự quan tâm, theo dõi sự hoạt động và những biểu hiện của gen trị liệu. + Ưu điểm Mở ra một hướng mới để điều trị các bệnh nan y, mà không dùng hoá chất để trị liệu nên không gây độc cho cơ thể. + Nhược điểm Khó thực hiện CÁC YẾU TỐ KỸ THUẬT TRONG CHUYỂN GEN Tổng quan: Liệu pháp gen tiêu biểu cho sự mở rộng hợp lý của y sinh (Bio-medicine). Một ví dụ thường gặp là sử dụng ADN tái tổ hợp sản xuất các phân tử có hoạt tính sinh học (như insulin) để chữa trị và kiềm chế bệnh tật. Sự thành công của sinh học phân tử và các dự án về bộ gen người đã tạo bước đột phá trong việc tìm ra các gen liên quan đến bệnh, liệu pháp gen từ lý thuyết trở thành thực tiễn. Ngày nay, có trên 533 thử nghiệm y học tập trung vào liệu pháp gen với hơn 8.000 người bệnh tham gia. Một số hãng công nghệ sinh học nổi bật có các sản phẩm trong các thử nghiệm y học rất sớm, và một vài dự đoán phân tích rằng liệu pháp gen, như một lĩnh vực, có thể đem lại lợi nhuận trước năm 2005. Tuy nhiên, các yếu tố tích cực này cũng ngang bằng với sự không hiểu biết sinh học của chuyển gen (nhân tố phức tạp và không được biết đến hoàn toàn) và ảnh hưởng của các sự kiện hiện tại trong ý kiến cộng đồng về y học phân tử. 2. Cơ sở của sinh học phân tử Thông tin di truyền dưới dạng DNA tồn tại trong mỗi tế bào của cơ thể (trừ các tế bào máu). Mỗi tế bào chứa đựng các thông tin để xây dựng bất cứ dạng tế bào hay mô đặc hiệu nào của sinh vật. Vì các tế bào và mô khác nhau quy định sự sản xuất của các khối cấu trúc (building block) khác nhau nên DNA chứa đựng thông tin liên quan đến khối các cấu trúc để sản xuất các mô đặc hiệu. Sự tiến hoá đã cung cấp một giải pháp tuyệt vời cho vấn đề này. DNA được tạo nên từ một chuỗi bốn phân tử khác nhau: adenine, guanine, cytosine và thymine. Sự kết hợp của các phân tử này tạo nên “ngôn ngữ” của DNA. Gen, được tạo nên từ DNA mã hoá tất cả các protein, là khối cấu trúc của tế bào. Các promoter cho phép hoạt hoá của các gen và qua đó các protein đặc hiệu được biểu hiện. Các vùng khác của DNA không mang mã và là phần quan trọng để bảo tồn cấu trúc nhiễm sắc thể. Thành phần này của của DNA vô cùng quan trọng trong các dự án về bộ gen, tính tuần hoàn đoạn của DNA trong các vùng không mang mã có thể được kết hợp với các gen đã biểu hiện, cho chúng ta phương pháp tìm kiếm các gen chưa biết.       Tự nhiên đã phát triển một cách thức rất thông minh mà qua đó các protein đặc hiệu chỉ được biểu hiện trong các mô dặc hiệu. DNA sắp thành các sợi dài gọi là nhiễm sắc thể. Có hai bản sao của mỗi gen tồn tại trong tế bào. Tuy nhiên có một số trường hợp ngoại lệ, các gen tồn tại trong các nhiễm sắc thể X và Y (nhân tố quyết định giới tính) có thể chỉ có duy nhất một bản sao.       Thông tin được truyền từ DNA đến các cơ quan phức tạp hơn. Quá trình phiên mã được bắt đầu bởi các phân tử nhận biết đặc hiệu có tên là các nhân tố phiên mã (nhân tố gắn với các chuỗi điều hoà của gen và cho phép sự sao chép được tiến hành). Bản sao được tạo thành từ phân tử ban đầu gọi là RNA trong nhân tế bào. Bản sao sau đó ra khỏi nhân tế bào, chuyển đến lưới nội chất, nơi mà nó sẽ được dịch mã tổng hợp thành protein. 3. Cơ sở của liệu pháp gen: Để chuyển gen, cần hội đủ một số điều kiện sau đây:      - Đầu tiên, phải có bản sao đầy đủ của gen thích hợp với những trình tự điều hoà thích hợp (trình tự khởi động), trình tự khởi động có thể là duy nhất đối với gen đặc hiệu, bằng cách này cho phép gen chỉ biều hiện trong các mô mà thông thường chúng được biểu hiện. Lần lượt, các gen có thể được kết nối với các trình tự khởi động, hoạt hoá trong tất cả các mô (phương pháp chung nhất được sử dụng ngày nay) hoặc có thể kết nối với các trình tự có thể hoạt hoá hay bất hoạt như một công tắc. Những thao tác như vậy có thể đạt được bằng công nghệ DNA tái tổ hợp.       - Thứ hai, phải lựa chọn kỹ thuật đích. DNA cần kỹ thuật này để có thể tiếp cận với tế bào. Ba kỹ thuật cơ bản được sử dụng để làm điều này:        + DNA có thể được gắn trực tiếp với các tế bào hoặc cấy vào mô. Gọi là chuyển DNA trần (nacked DNA transfer)        + DNA có thể được sử dụng dể tạo nên con thoi dịch chuyển virus (viral transfer shuttle). Đây là phương pháp chuyển DNA hầu như chắc chắn nhất. DNA xâm nhập không hiệu quả vào tế bào vì nó khó có thể xuyên qua lớp màng lipit kép, nhưng vector virus dễ dàng làm việc này.       + DNA cũng có thể phối hợp với các phức hệ hoá học khác nhau để khuếch đại khả năng chuyển dịch qua màng tế bào của nó.     -   Thứ ba, có hai phương pháp ứng dụng liệu pháp gen: liệu pháp gen có thể ứng dụng trực tiếp với bệnh nhân hoặc trên các tế bào đã tách ra khỏi người bệnh (như tế bào . tuỷ xương) sau đó cấy trở lại người bệnh. Trong tương lai, các thao tác liệu pháp gen của tế bào gốc phát triển trên môi trường mô tế bào và sau đó cấy lên người bệnh sẽ là tiến triển tột cùng. Mỗi kỹ thuật trên đều có những thuận lợi và khó khăn riêng. Khi chọn phương pháp phân phối gen, một số nhân tố cần được cân nhắc:      + Hiệu quả của liệu pháp phải được đặt lên hàng đầu. + Sau đó, gen chuyển đổi phải được điều hoà đúng đắn. Nó phải được hoạt hoá đúng lúc, với độ dài thời gian chính xác và đúng số lượng. Những vấn đề này là rào cản to lớn cho sự phát triển và phổ biến của liệu pháp gen. Hiện nay đích ứng dụng quan trọng nhất của liệu pháp gen là các bệnh hiểm nghèo, ở đó mô bệnh dễ dàng bị ảnh hưởng và những bệnh mà sự điều hoà chính xác của gen được chuyển là không cần thiết. Đúng như mong muốn, hiệu quả của liệu pháp trong các trường hợp này dễ dàng quản lý. Sự tinh vi của chúng ta trong thiết kế vector và promotor ngày càng tăng, mở ra nhiều triển vọng mới cho những ứng dụng điều trị các bệnh hiểm nghèo (như bệnh đái đường) thông qua sự tập hợp thông tin của các dự án về bộ gen người mà ở đó sự điều hoà gen là phức tạp hơn. Để chuyển gen, trong các nghiên cứu sử dụng các vector có hoặc không có bản chất virus nhằm đưa gen mục tiêu đến các tế bào. Hiện nay, các nghiên cứu phân phối gen nhờ retrovirus diễn ra nhiều nhất sau đó đến adenovirus. 4. Vector chuyển gen có nguồn gốc virut a. Các bước quan trọng để hoạt hóa thành công virus và chức năng của nó. Sự sử dụng virus trong liệu pháp gen dựa trên các chức năng cơ bản của nó:      - Chuyển đặc hiệu vật chất di truyền đến tế bào. Virus chứa vật chất di truyền được bao quanh bởi lớp màng protein. Đầu tiên, virus gắn tới các tế bào riêng biệt bằng sự tương tác với thụ thể (hay một chuỗi các điểm thụ thể) trên bề mặt tế bào. Tiếp đó, virus vào tế bào bởi sự tương tác với các phân tử bề mặt đặc hiệu trên tế bào, bằng cách này nó dễ dàng đi xuyên qua lớp rào chắn màng tế bào.      - Sự phụ thuộc vào dạng của vector virus được sử dụng, những gen được mang bởi virus hoặc được nhân bản sử dụng nguyên liệu của chính các tế bào hoặc được tiếp hợp tới nhân của tế bào, nơi mà các nhiễm sắc thể và DNA nhân tồn tại. Các gen đặc hiệu được mang và được tiếp hợp bởi virus sẽ phiên mã tổng hợp RNA và dịch mã tạo thành protein để tạo nên chức năng mong muốn hay sản phẩm của liệu pháp.      - Các virus khác nhau có mức độ khác nhau trên phương diện chuyển gen của chúng tới các tế bào và tạo ra các sản phẩm gen. Hơn nữa, hiệu quả cuối cùng của chúng đối với các gen chức năng trong tế bào không giống nhau và có thể khác nhau từ tế bào này đến tế bào khác hoặc mô của cơ quan này đên mô cơ quan khác. Những vấn đề này hưởng lớn tới thuận lợi y học và thành công của chiến lược liệu pháp gen dựa trên vector virus.       Tất cả các vector được sản xuất từ các virus tái tổ hợp kiểu hoang dại đã được xác định. Nói chung, các gen có vai trò trong tái bản virus được loại bỏ để ngăn cản sự truyền đi không mong muốn của vector virus và để ngăn cản các vector virus gây bệnh.       Hiện tại, có 4 dạng chính của vector virus đang được sử dụng trong nghiên cứu và ứng dụng: adenovirus, adeno-associate virus (AAV), retrovirus và herpes Simplex. Bảng 2: So sánh đặc điểm của các hệ thống chuyển gen virus b. Vector Adenovirus: Một trong những vector liệu pháp gen chung nhất hiện đang sử dụng là vector có cơ sở adenovirus. Adenovirus gây bệnh khó thở ở người (cảm lạnh, nhiễm trùng dạ dày) và có 47 dạng khác nhau (gọi là kiểu huyết thanh) được tìm thấy ở người. Kiểu 2 và 5 được sử dụng chung nhất cho các ứng dụng liệu pháp gen. Hình 1: Adenovirus có cấu trúc chung chứa capsid hai mươi mặt bao quanh bộ gen dsDNA dài xấp xỉ 36kbp. Vỏ capsid của virus chứa ba protein: hexon, fiber và base penton. Hexon là thành phần cấu trúc quan trọng, tạo thành bề mặt hai mươi mặt, trong khi các penton tạo thành phức hệ với fiber cho kết quả là 12 “chóp” ngoài vỏ virus đóng vai trò quan trọng trong việc gắn với các phối tử. Điểm đầu tiên trong sản xuất vector liệu pháp gen là lấy đi gen điều khiển tái bản (sự phát triển) của virus trong mô. Sự sinh sản và phát triển của một lượng nhỏ virus mới là nguyên nhân chung cho những hiệu ứng độc do nhiễm virus. Bộ gen của adenovirus đã được nghiên cứu khá kỹ, chứa DNA xoắn kép gồm 50 gen, dài 36 kilobase (KB). Gen E1 điều hoà phiên mã trong khi gen E2 và E3 điều hoà quá trình dịch mã của bộ gen. Các vector đã tách gen này cho phép mang gen dài 8kb. Trước đây, sự phát triển của các vector này dựa trên việc sử dụng virus giúp đỡ (helper virus) để cung cấp các chức năng của gen bị huỷ. Tuy nhiên, ngày nay một dòng tế bào có giá trị thương mại đã được tạo ra để mang các gen bị xoá dạng vector. Sự phát triển của các dòng tế bào này có thể làm adenovirus có giá trị thương mại và an toàn hơn. Khi đó rủi ro của việc sử dụng virus kiểu hoang dại được giảm bớt. Trên hết, sản phẩm vector này có hiệu quả, với nồng độ 1x1012 đoạn virus/ml đang được sản xuất. Phép đo hoạt tính vector thực tế rất quan trọng trong liệu pháp gen. Việc đo các phần tử vector đơn độc không bao hàm rằng tất cả các đoạn là nhiễm và do đó, có hoạt tính. Hiện nay, có những cố gắng tiêu chuẩn hóa liều lượng và hoạt tính của các vector virus. Thật không may, hệ thống vector adenovirus đã xuất hiện một vài bất cập. Sự sản xuất của liệu pháp gen là giới hạn cho một chu kỳ thời gian ngắn và DNA đã được chuyển không trở thành một phần của DNA trên tế bào chủ. Các tác động trở lại của vector adenovirus cũng có thể gây ra đáp ứng miễn dịch mạnh trên vật chủ, có nguy cơ dẫn tới các biến chứng nghiêm trọng. Trọng tâm nghiên cứu hiện nay nhằm cải tiến vector adenovirus đích và giảm các phản ứng miễn dịch do virus gây ra, mang tới thành công đầy hứa hẹn trong việc sự sử dụng các vector phá huỷ bên trong (gutted vector) chỉ sử dụng vỏ ngoài của adenovirus. Sự phát triển thú vị khác là khả năng điều khiển vector adenovirus đích tới các nhóm tế bào đặc hiệu. Công nghệ “retargeting” bao gồm việc sản xuất kháng thể cho protein thụ thể có vỏ adenovirus, nhân tố được sử dụng để gắn kết và gia nhập tế bào. Kháng thể này được hợp nhất với kháng thể đơn dòng (monoclonal) chống lại protein đặc hiệu tồn tại trên bề mặt của tế bào. Vector sau đó hoà trộn với kháng thể dung hợp. Khi được sử dụng, chỉ những tế bào biểu hiện protein đặc hiệu được chữa trị bằng vector này. Một số công ty (ví dụ: GenVec) sản xuất vector adenovirus đã biến đổi bề mặt điểm thụ cảm, điểm sẽ kết hợp với các tế bào khác nhau. Việc phân loại của các vector khác nhau này cho phép adenovirus đích tới những mô khác nhau khi sử dụng các kháng thể. Hình 2: Sơ đồ cấu trúc của vector adenovirus hiệu năng cao (high-capacity adenoviral) HC-Ad. Tất cả các gen của virus HC-Ad bị xoá, chỉ còn đầu bên trái và phải của Ad5 và DNA thêm vào (stuffer DNA) thu được từ gen C346 và HPRT. AdSTK109 chứa bộ gen hAAT bao gồm liver và promoter macrophage đặc hiệu, trong AdGS85, hAAT cDNA được biểu hiện từ promoter cytomegalovirus của người ((hCMV promoter). AdSTK129 chỉ chứa DNA thêm vào và không biểu hiện bất cứ gen chuyển nào. c.Vector Adeno-associated Virus (AAV): AAV là một parvovirus không xuất hiện trong các bệnh do vi sinh vật ở người. Virus này có thể chuyển DNA tới các tế bào không phân chia và hoà nhập với DNA của tế bào chủ. Điều này mở ra khả năng ứng dụng của một vector chống lại các bệnh kinh niên. Trong dài hạn, sự biểu hiện của liệu pháp gen đã được chứng minh. Virus này nhỏ do đó chỉ có thể mang những gen có kích thước giới hạn. Nó cũng khó sản xuất hơn các vector khác nên tính thương mại hiện nay bị hạn chế. Có 6 kiểu huyết thanh (serotype) của AAV, kiểu 2 thường được sử dụng trong các ứng dụng của liệu pháp gen. Do kích thước nhỏ, vector này chỉ mang được gen có kích thước lớn nhất là 5 kB. Như vậy, không thể chuyển được các gen phức tạp với kích thước lớn. Một số phương thức được đề ra để giải quyết vấn đề này. Một trong số đó là kỹ thuật liên kết bộ gen vector để phân cắt một số gen hợp nhất (cooperating gene) và phân phối chúng tới đích, sử dụng hai vector phân cắt. Một cách trung gian là sự nhân bản của các vector dung hợp sử dụng lớp vỏ của adenovirus kết hợp với bộ gen của vector AAV. Điều không thuận lợi của phương pháp là vector này đòi hỏi sự giứp đỡ của adenovirus để được tổng hợp. Điều này có thể dẫn đến sự hợp tác mạo hiểm với vector adenovirus (phản ứng miễn dịch). Gần đây, 3 plasmid, hệ thống virus giúp đỡ đa năng (helper virus free system) đã phát triển  cho phép sản xuất các thể giúp đỡ đa năng của vector này. Hình 3: cấu trúc bộ gen của kiểu hoang dại (wild-type) và của vectorAAV.      - (A) bản đồ bộ gen của AAV hoang dại chứa các khung đọc (reading frames) Rep và Cap, các promoter (p5, p19, và p40), polyadenylation site (pA), và inverted terminal repeats (ITR). Quá trình phiên mã của virus mã hoá các protein Rep và Cap (VP1-3) khác nhau được vẽ dưới bộ gen. Các protein Rep nhỏ hơn được dịch mã từ các điểm khởi đầu nội tại (internal initiation sites).     - (B) bản đồ của vector AAV, cho thấy sự thay thế các gen Rep và Cap của virus với băng chuyển gen (promoter, transgene cDNA và polyadenylation site).    - (C) Cấu trúc bậc hai của AAV ITR, với các vùng gắn Rep (RBS) và vùng tiêu tan cuối cùng (TRS) (terminal resolution site) Thuận lợi chính của hệ thống vector AAV là nó hoà nhập với nhiễm sắc thể của tế bào chủ. Điều này cho phép các vector được chuyển biểu hiện một cách ổn định và lâu hơn. Nhưng thật không may, nếu AAV kiểu hoang dại hoà nhập tại điểm đặc hiệu trong nhiễm sắc thể 19 thì các vector tái tổ hợp lại mất tính đặc hiệu này và hoà nhập tuỳ tiện. Cho dù vậy, một vài thành công trong nghiên cứu trên động vật và người đã cho thấy rằng, sự biểu hiện ổn định có thể đạt được với vector này. Hình 4: Quá trình phiên mã của vector AAV. Các bước khác nhau cần cho quá trình phiên mã của vector AAV bao gồm: đầu tiên AAV tương tác với các receptor  đa dạng và các phân tử coreceptor trên bền mặt tế bào, sự tiếp thu virion, nhân vào trong tế bào và giải phóng bộ gen mạch đơn vủa vector, sự lai của bộ gen đưa vào bổ sung (complementary input genomes) và sự hoà nhập nhiễm sắc thể trước biểu hiện gen có thể xảy ra từ khuôn xoắn kép DNA. Cấu trúc bậc hai tiềm tàng của bộ gen vector bổ sung (episomal) xuất hịên như các phân tử vector RNA đã được mã hoá. Ngoài ra còn có thể sử dụng DNA trần hay gói trong liposome (màng bao lipid) để thực hiện chuyển gen. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐƯA GEN VÀO NGƯỜI BỆNH: In situ (chữa tại chỗ) bơm vector mang gen lành vào thẳng phần cơ quan cần chữa trị. In vivo (trong cơ thể): bơm vector mang gen lành vào cơ thể như chữa bệnh sơ nguyên bào bằng đưa virut vào phổi qua bơm hơi. Ex vivo( ngoài cơ thể) gồm các bước: - Tách các tế bào của người bệnh. Tách gen bình thường gấn vào virut và cho nhiễm vào tế bào người bệnh. Chọn lọc dòng tế bào tốt đưa dòng tế bào chon lọc trở lại vào cơ thể. Do gen chữa trị được phống thích ở dạng DNA nên có thể được hấp thu bởi các tế bào không phải mục tiêu và phản ung của cơ thể khó dự đoán, nên phương pháp Ex vivo là tốt và an toàn hơn. Kỹ thuật đưa DNA vào cơ thể: 1.Kỹ thuật vi tiêm ( Microinjection) Kỹ thuật vi tiêm trong liệu pháp gene soma để đưa vector liệu pháp vào cơ thể 2. Kỹ thuật xung tiêm (electroprotein) Kỹ thuật xung tiêm thường dùng trong liệu phấp gene khi đưa gene liệu pháp vào tế bào nằm ngoài cơ thể sống (exvitro). Nhờ kỹ thuật xung điện có thể thay thế gene hỏng bằng gene lành, sau đó nhân nuôi tế bào lành để tạo số lượng lớn, rồi chuyển vào cơ thể người bệnh. 3.Kỹ thuật dùng súng bắn gene (gene gun) Kỹ thuật bắn gene bằng súng bắn gene để chuyển gene liệu pháp vào tế báo đích thường đạt kết quả cao. Thực hiện kỹ thuật bắn gene phải có thiết bị bắn gene, các vi đạn có bọc gene liệu pháp để đưa gene liệu pháp vào tế bào đích. Gene liệu pháp dùng trong kỹ thuật này là DNA trần hoặc phức hợp DNA- liposom và được thực hiện theo hình thức ngoài cơ thể sống (exvitro) 4.Kỹ thuật Liposom (Liposom technique) Liposom mang gene liệu pháp có khả năng chui qua màng tế bào để đưa gene liệu pháp vào bên trong tế bào. Thực hiện kỹ thuật Liposom cần chú ý chọn tế bào đích thích hợp để nâng cao hiệu quả của liệu pháp gene. Ngoài ra còn có một số kỹ thuật khác để chuyển gene liệu pháp như kỹ thuật viên gene, kỹ thuật canxiphosphot… ỨNG DỤNG VÀ TRIỂN VỌNG CỦA LIỆU PHÁP GEN: Ứng dụng gen trị liệu trong lâm sàng gen trị liệu trong chống ung thư: Người ta đề cập tới việc rút các tế bào lympho khỏi bệnh nhân ung thư ra và cài vào các tế bào đó gen kháng ung thư. Các tế bào đã được thiết kế lại này sau đó lại được đưa trở lại cho bậnh nhân với hi vọng là tác nhân kháng ung thư có thể viết một cách chọn lọc các tế bào ung thư. Nhóm khoa học này đựoc dẫn đầu bởi Sterven Rosenberg thuộc NIH cùng các đồng nghiệp, W.French Andersan( người đã tham gia thí nghiệm ADA).Trong quy trình thí nghiệm này các nhà khoa học đã sử dụng một loại tế bào lympho là lympho bào thâm nhập khối u (TIL) đó lad những tees bào đặc biệt của hệ miễn dịch. Dưới các điều kiện bình thường, TIL được kích thích bởi các yếu tố hoá học của các tế bào ung thư rồi đi vào khối u rắn chắc và phá huỷ các tế bào khối u. Một vũ khí phụ trợ quan trọng là các yếu tố hoại tử khối u (TNF) được gắn vào các tác nhân kháng ung thư. TFN là một sản phẩm của protein đại thực bào - các tế bào của mô giống như amip sẽ tham gia vào việc phá huỷ các tế bào ung thư. Gene Therapy Suppresses Lung Cancer Điếu trị bệnh thiếu hụt miễn dịch tổ hợp trầm trọng(SCID): Hàng năm tại Hoa Kỳ có khoảngt 40 trẻ em mắc bệnh thiếu hụt miễn dịch tổ hợp trầm trọng (SCID). Một nửa số bệnh nhân SCID được nghiên cứu tyhấy có một gen khiếm khuyết trong tế bào, vì thê nó không mã hoá đươch cho một enzyme đặc hiệu. nêu thiếu gen bình thường thì enzyme khong được tổng hợp. enzyme đó là Adenosine desaminase(ADA). Enzyme này giúp cho việc phân giải các sản phẩm acid nucleic của tế bào nếu không có ADA trong lympho T thì enzyme kinase sẽ chuyển đổi sản phẩm chuyển hoá thành độc tố và độc toó này sẽ phá huỷ lympho T. vì thiếu hụt ADA sẽ làm cho cơ thể mất cơ chế bỏ vệ của cả hai loại tế bào lympho. Mùa hè 1990 các nhà nghiên cứu thuộc viện quốc gia y tế Hoa Kỳ đã nhận thử ứng dụng gen trị liệu đối với bệnh thiếu hụt ADA. Các nhà nghiên cứu đã đưa gen ADA vào các tế bào lympho của các bệnh nhân SCID đã được chọn lọc. đẻ thực hiện việc đó các nhà nghiên cứu phải rút hết các tế bào lympnho ra khỏi bệnh nhân và bộc lộ các tế bào có hàng tỉ retrovirut mang các gen sản xuất ADA. Sau khi các gen ADA đã được đưa vào nhiễm sắc thể của tế bào lympho thì các tế bào này sẽ được đưa trở lại cho bệnh nhân. nếu mọi việc hoàn tất các gen ADA sẽ mã hoá cho enzyme ADA và loại trừ sự thiếu hụt của enzyme này. Sau vài tuần lặp lại quy trình này bởi vì các tế bào lympho chỉ tồn tại trong cơ thể vài tháng. Những nổ lực hiện tại và tương lai: Ngay khi các thí nghiệm đầu tiên về gen trị liệu được thực hiện thì các nhà khoa học đã công thức hoá các tét sắp tới với sự tiếp cận mới trong y học. Một trong số những dự kiến là: Thay thế gen khiếm khuyết trong bệnh sơ nang . Hướng tới các bệnh di truyền hiếm gặp, đó là bệnh tăng cholesterol huyết có tính chất gia đình. Gen trị liệu liên quan tới các tế bào gan. Gen trị liệu cũng làm giảm nhẹ các tác động của hội chứng thiếu hụt miễn dịch mắc phải(AIDS). Không ngừng lại ở đó, trong các thí nghiệm với các tế bào ở phòng thí nghiệm, các nhà nghiên cứu ở trường Đại học North Carolina đã thành công trong việc dùng một gen bình thường thay cho gen thiếu máu hồng cầu liềm. Một ứng cử viên khác của gen trị liệu là bệnh Léch-Nyhan và bệnh Gaucher và bệnh ưa chảy máu. TÀI LIỆU THAM KHẢO: GEN TRỊ LIỆU – PGS.TS. NGUYỄN VĂN KÌNH SINH HỌC PHÂN TỬ HÓA SINH DƯỢC LÝ PHÂN TỬ- PGS,TS. NGUYỄN XUÂN THẮNG CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KĨ THUẬT GEN – PGS,TS. KHUẤT HỮU THANH – Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Website : http:www//sinhhocvietnam.com.vn